Efecto de la temperatura en la velocidad de...

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Efecto de la temperatura en la velocidad de reacción

Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa



TermodinámicaEl estudio de la trasformación de la energía como una regla general en todos los

sistemas fisico-químicos incluyendo los biológicos.

Energía libre:

Es la energía para realizar trabajo; frecuentemente representada por el símbolo G

(Energía libre de Gibb’)

Primera ley de la termodinámica:

La transformación de la energía no crea o destruye energía, resulta simplemente

una interconversión de una forma a otra

Segunda ley de la termodinámica:

Toda transformación de energía resulta en un incremento en desorden; la entropía

es un término el cual es una medida de la extensión del desorden en un sistema

Así, la segunda ley puede ser re-escrita diciendo que toda transformación de

energía resulta en un incremento de entropía en el sistema



• El concepto de energía libre provee un criterio para medir

la espontaneidad de un sistema.

• Energía libre es la porción de energía del sistema que es

capaz de realizar trabajo cuando la temperatura es

uniforme a través del sistema.



• La energía libre (G) en un sistema está

relacionada a la energía total (H) y a su entropía

(S) por esta relación:

�G = H - TS, donde T es la temperatura en grados

Kelvin.

�Incrementos en temperatura amplifican el término de

entropía.

�No toda la energía en un sistema está disponible para

trabajo porque el componente de entropía (TS) debe

ser sustraido de la capacidad máxima (H).

�Lo que permanece es energía libre (G).



Aplicando las dos leyes para ver si las reacciones son espontáneas o no

Donde: Gi y Gf son las energías libres del estado inicial (i) y final (f)

∆G = Gf – Gi

y Si y Sf son las entropias del estado inicial (i) y final (f)

∆S = Sf - Si

Reacción exergónca (espontánea)

∆G < 0 (negativa) y ∆S > 0 (positiva)

Reacción endergónica (no espontánea)

∆G > 0 (positiva) y ∆S < 0 (negativa)

DCBA +⇒+

Gi Gf

Si Sf



• Una reacción exergónica procede con una liberación neta de energía libre y ∆G es negativa.

� Alta energía

de reactantes

� Baja energía

de productos

Las reacciones químicas pueden clasificarse como exergónicas o endergónicas basadas en la energía libre.



• Una reacción endergónica es una que absorbe energía libre de

sus alrededores.

� Las reacciones Endergónicas almacenan energía,

� ∆G es positiva, y

� Las reacciones no

son espontáneas.

� Alta energía de

productos

� Baja energía de

reactantes



• Energía de activación (EA) es la cantidad de energía

necesaria para empujar a los reactantes sobre una

barrera de energía.

� En el pico las moléculas

están en un punto inestable,

el estado de transcisión

� ∆G es todavía

sólo la diferencia

entre sustratos y productos



Sin enzima Con enzima



• Velocidad de reacción enzimática disminuyendo EA

– El estado de transcisión puede ser alcanzado aún a

temperaturas moderadas.

• Las enzimas no cambian ∆G

� Aumentan la velocidad de reacción que podría ocurrir eventualmente

� Debido a que las enzimas

son tan selectivas,

ellas determinan

cual proceso químico

ocurrirá en cualquier

momento

� Usualmente muy

específicas al sustrato y

tipo de enlace

actuán y reaccionan



El ciclo del ATP

Energía de las

reacciones

exergónicas

Deh

yd

rati

on

syn

thesis

Hydrolysis

Energía para

las reacciones

endergónicas



La temperatura tiene un gran impacto sobre la tasa de reacción

– Incrementos de temperatura, incrementan las coalisiones entre moléculas

– Sin embargo, en algún punto incrementos en temperatura inician la ruptura de enlaces débiles que estabilizan la conformación activa de la proteína y la proteína se desnaturaliza

– Cada enzima tiene una temperatura óptima



Cálculo de energía de activación

RT

E

cat

a

Aek−

=

TR

EAk

a

cat

1lnln −=

Energía de activación es la cantidad

de energía necesaria para empujar a

los reactantes sobre una barrera de

energía

Ea

= energía de activación

R = constante de la ley de los gases

A = factor de frecuencia

T = temperatura absoluta

Ecuación de Arrhenius



Ho-Shing Wu, Ming-Ju Tsai. 2004. Kinetics of

tributyrin hydrolysis by lipase. Enzyme and

Microbial Technology 35: 488–493.



Desactivación enzimática

Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa



Mecanismo de inactivación enzimática a 100ºC

(Ahern y Klibanov, 1985)

El proceso de inactivación irreversible de lisosima de

huevo de gallina a 100 ºC incluye:

• deamidación de residuos de Asparagina

• hidrólisis de enlaces peptídicos de residuos de

ácido aspártico

• destrucción de enlaces disulfuro

• y formación de estructuras incorrectas

Nota: Su contribución relativa depende del pH



Mecanismos de inactivación térmica irreversible de α-amilasas de Bacillus

(Tomazic y Klibanov, 1988)



Mecanismos de inactivación térmica irreversible de α-amilasas de Bacillus(Tomazic y Klibanov, 1988)



¿Por qué es una enzima α-amilasa de Bacillus más resistente

contra la termoinactivación irreversible que otras? (Tomazic y Klibanov, 1988)

La estabilización se alcanza bajando la tasa de desarreglo

conformacional monomolecular, la cual es la causa de

termoinactivación irreversible

Otro proceso es la deamidación de residuos de Asparagina

(Asn)/Glutamina(Gln)

Se encontró que la extra termoestabilidad de la enzima termofílica se

debió principalmente a puentes salinos adicionales en algunos

residuos de lisina específicos



Alteraciones en la estructura de proteínas que

causan su inactivación irreversible

(Volkin y Klibanov, 1987)

Reacciones químicas que contribuyen a la termo-inactivación de las

enzimas:

• destrucción de cisteína

• intercambio de disulfuros tiol-catalizados

• oxidación de residuos de cisteína

• deamidación de residuos de asparagina y glutamina

• e hidrólisis de enlaces peptídicos en residuos de ácido aspártico



Alteraciones en la estructura de proteínas que causan su

inactivación irreversible(Volkin y Klibanov, 1987)



Alteraciones en la estructura de proteínas que causan su inactivación

irreversible(Volkin y Klibanov, 1987)



Diseño de reactores enzimáticos bajo

condiciones de inactivación térmica(Illanes y Wilson, 2004)

El carácter lábil de las enzimas como biocatalizadores de proceso,

hacen que el fenómeno de inactivación térmica durante la operación

del reactor sea de gran relevancia tecnológica en biocatálisis.

Por lo tanto, el diseño de reactores debe necesariamente considerar

dicho efecto



Modelo Inactivación

E = f(t,T)

Modelo Cinético

v = f(E,X)

Restricciones

Difusionales

η = f(s0, φ)

Balance Materia

)X,f(s KF

)t(Eki

=⋅

⋅η

Modelo de Comportamiento



E E*k

D

e k dt

de -

D⋅=

t) k exp(- e eD0⋅=

Inactivación térmica monofásica de

primer orden(Illanes y Wilson, 2004)



Simulación de la operación de un reactor por lotes bajo distintos escenarios de estabilidad del

biocatalizador. La cinética de reacción es del tipo Michaelis-Menten con Cs,i/KM=10. La cantidad

de enzima en el reactor fue calculada para obtener un 90% al cabo de 10 horas en el escenario

KD=0.

(Illanes y Wilson, 2004)



( ) ( )tk- expkk

kA tk exp

kk

kA1

e

e2

12

1

1

12

1

0

⋅⋅

−⋅−⋅−⋅

−⋅+=

( ) ( )tk- expkk

k'AAk tk exp

kk

k'AAk1 A'

e

e2

12

21

1

12

21

0

⋅⋅

−

−−⋅−⋅

−

−++=

Mecanismo Tipo Serie Bifásico

E

k1

E2E1

k2



Inmovilización en un sitio específico y aleatorio

reflejado en las cinéticas de inactivación térmica(Mansfeld y Ulbrich-Hofmann, 2000)



(Mansfeld y Ulbrich-Hofmann, 2000)



200 400 600 800 1000 1200 1400

0

Tiempo (horas)

Cinética de inactivación de lactasa inmovilizada en quitina en buffer de fosfatos 0.1 M a

diferentes temperaturas. Las líneas contínuas representan los datos calculados con un modelo

de inactivación tipo serie bifásico

(Illanes y Wilson, 2004)



Mecanismo Paralelo Dos Especies

E1 E1*k1

E2*E2

k2

)texp(-kA')texp(-kAe

e21

0

⋅⋅+⋅⋅=

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