Laboratorio de Biorreactores“Práctica No. 8:

Esterilización de medios de cultivo”5BM1

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALUnidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería Campus

Guanajuato

Semestre Enero-Junio 2015

ProfesoresJuan Antonio PaniaguaManuel Salgado RománMa. Lourdes Mejía Farfán

EQUIPO 3

¿Qué es esterilización?

❖ Es un proceso cuyo objetivo consiste en destruir o eliminar microorganismos presentes en un objeto o en una preparación (Gennaro, 2003).

❖ En las fermentaciones comerciales se necesitan generalmente miles de litros de medio de cultivo líquido y millones de litros de aire, por lo que se requiere que estén libres de organismos contaminantes, para ello se emplean distintos métodos de esterilización (Doran, 1998).

Introducción

Para llevar a cabo un bioproceso es de suma importancia la esterilización del medio de cultivo que se va a utilizar, esto para evitar la competencia por los nutrientes en un medio de fermentación y así permitir el desarrollo específico del microorganismo de interés industrial, ya sea por ellos mismos o por el producto generado por ellos (UNQ, s/a).

❖ Objetivo: maximizar el rendimiento del producto y evitar pérdidas a causa de una contaminación.

Esterilización en bioprocesos

Existen diversos métodos para llevar a cabo este proceso, entre ellos: calor (seco o húmedo), filtración (para sustancias termolábiles y aire), radiaciones y aplicación de gas de óxido de etileno (para jeringas y cajas de plástico).

Métodos de esterilización

Métodos Físicos Métodos Químicos

Calor seco o húmedo

Filtración Radiación

Agentes químicos

Óxido de etileno*

Peróxido de hidrógeno

*No apto para medios de cultivo

❖ El medio líquido se esteriliza normalmente en el reactor donde se va a realizar la operación en discontinuo (o por lote). El líquido es calentado hasta la temperatura de esterilización introduciendo vapor en los serpentines o la camisa del reactor (Doran, 1998).

❖ Otro método consiste en introducir vapor directamente en el reactor o calentar el recipiente utilizando energía eléctrica (Doran, 1998).

Esterilización discontinua

-Calentamiento: depende de la velocidad de transmisión de calor desde el vapor o elemento eléctrico.

-Mantenimiento: una vez que se alcanza la temperatura de esterilización deseada, ésta se mantiene cte durante un tiempo thd

-Enfriamiento: el agua de refrigeración existente en los serpentines o en la camisa del fermentador se utiliza para enfriar el medio a un valor deseado (Doran, 1998).

Etapas de esterilización por lote

Figura 1. Variación de la temperatura respecto al tiempo para la esterilización discontinua del medio líquido.

Consideraciones que se deben tomar en cuenta:

❖ Se debe poder calcular el tiempo que es necesario mantener el reactor a temperatura cte para alcanzar el nivel de destrucción celular deseado.

❖ Los tiempos durante los que se mantiene el medio a la temperatura de esterilización deben ser los más cortos posibles, debido a que el calor también destruye los nutrientes del medio de cultivo.

❖ La muerte celular tiene lugar en todo el proceso de esterilización discontinua (incluyendo periodos de calentamiento y enfriamiento) (Doran, 1998).

Sistemas de esterilización discontinuos

Si N0= número de contaminantes en el medio.Durante el calentamiento, este número se reduce a N1. Al final de la isoterma, el número de células es N2 y al final del enfriamiento es Nf.

Idealmente Nf =0, ya que al final de la esterilización no deben existir contaminantes.

No es posible alcanzar teóricamente la esterilización absoluta ya que se necesitaría de un tiempo muy largo.

El nivel de contaminación deseado se expresa como la fracción de célula, que está relacionado con la probabilidad de contaminación.

Si se conocen N0 y Nf, el tiempo a temperatura constante thd necesario para reducir N1 a N2, puede calcularse teniendo en cuenta la cinética de muerte celular (Doran, 1998).

Contaminantes en el medio

Figura 2. Reducción de células viables durante esterilización discontinua.

Para una cinética de muerte celular de primer orden en un reactor operando en discontinuo donde la muerte celular es el único proceso que afecta al número de células viables, se tiene que:

(1)

donde:N = número de células viablest = tiempokd = constante específica de muerte celular

Cinética de muerte térmica

La ecuación anterior puede aplicarse a cada uno de los periodos del ciclo de esterilización discontinua.

kd depende de la temperatura así que la integración directa de la ecuación es válida sólo a T cte:

ln (N1/N2) = (2)

Dondethd= tiempo a T cte

N1= células viables al comienzo de la isoterma

N2 = células viables al final de dicho periodo

kd se calcula en función de la temperatura mediante Arrhenius (3)

Esta cinética hace que se produzca un descenso exponencial del número de microorganismos, mostrado en la siguiente figura, y líneas rectas cuando se representa una gráfica logarítmica:

Figura 3. Gráficas de la proporción de los microorganismos sobrevivientes al ser sometidos a temperaturas letales (izq.) y su logaritmo natural (der.), con respecto al tiempo. (con pendiente -kd)

Para utilizar la ecuación 2 deben conocerse N1 y N2. Estos pueden ser calculados teniendo en cuenta la muerte celular en todos los periodos de esterilización (calentamiento, enfriamiento y mantenimiento), combinando ambas ecuaciones (2 y 3):

Integrando la ecuación:

a. periodo de calentamiento

b. periodo de mantenimiento c. periodo de enfriamiento

Criterio total de diseño →

Criterios de diseño

(Doran, 1998)

Temperatura no uniformeFigura 4. Ecuaciones generales para la temperatura en función del tiempo durante los periodos de calentamiento y enfriamiento de una esterilización discontinua (Doran, 1998).

❖ Método de cálculo rápido, evitando consumo de tiempo en la integración gráfica

❖ Se asume que la destrucción total de las esporas ocurre a una temperatura de 100°C

❖ Las curvas de calentamiento y enfriamiento alrededor de esta temperatura son lineales (Murrieta, 2009)

Método de Richards

Es una bacteria Gram positiva, una de sus características es su capacidad para formar esporas en diversas condiciones de estrés, crece en un intervalo amplio de temperaturas (15-55°C) (Espinosa, 2005)

Este tipo de bacterias son útiles y eficaces para establecer la capacidad del ciclo de esterilización pues se sabe que son más resistentes al proceso que se esta probando.

Bacillus subtilis

Realizar esterilización en biorreactor utilizando B. subtillis como indicador biológico, al aumentar la temperatura durante periodos de tiempo determinados.

Objetivos particulares➔ Graficar los perfiles para etapas de calentamiento, mantenimiento y enfriamiento.➔ Determinar el número de colonias de cada muestra a diferentes temperaturas.➔ Determinar el valor de la energía de activación conociendo el valor de la constante

de Arrhenius.➔ Determinar grados de destrucción en que cada una de las etapas (calentamiento,

mantenimiento enfriamiento).

Objetivo general

El sistema consta de una autoclave conectada a una tubería que sirve de alimentación de vapor al reactor tipo tanque agitado (capacidad de 7 L) para las etapas de calentamiento y mantenimiento; cumplidas dichas etapas, el reactor se conectó a un intercambiador de calor el cual se utiliza para alimentar agua al reactor en la fase de enfriamiento. En la Figura 4, se muestra el biorreactor utilizado. El reactor se llenó con 1.5L de agua destilada estéril y 1 L de medio

inoculado con B. subtilis.

Descripción del sistema

Figura 4. Reactor tipo tanque agitado, conectado a autoclave e intercambiador de calor

Metodología

Durante la práctica se realizó la medición de los cambios de temperatura con ayuda de un termómetro y mediante un cronómetro se obtuvieron los tiempos en los cuales se dieron estos cambios, los resultados se muestran en la Tabla 1.

Las muestras se tomaron a las temperaturas 25, 23, 62, 70, 87, 95, 98 y 50 °C.

Resultados

En la siguiente gráfica (Fig 5), se muestran los perfiles de las etapas del ciclo de esterilización (calentamiento, mantenimiento y enfriamiento):

Resultados

Fig 5. Perfiles del ciclo de esterilización de B. subtilis.

Tman=98°Cthd= 10 min

Resultados

RESULTADOS: Muerte celular

RESULTADOS: Muerte celular 

RESULTADOS: Muerte celularTabla 3. Concentración celular (UFC/mL) para

cada temperatura analizada.

Muestra T(°C) UFC/mL

N0 25 1E+11

N1 23 14285714286

N2 62 14285714286

N3 70 14285714286

N4 80 0.005407407

N5 87 0.002592593

N6 95 0.000592593

N7 98 0.005185185

N8 50 0.003185185 FIGURA 6. Diagrama de muerte celular (UFC/mL) al aumentar la temperatura T(°C).

Criterios de diseño

 

Criterios de diseño

 

Criterios de diseño

 

Grado total de destrucción. Según la ecuación:

Se calculará el grado total de destrucción, teniendo anteriormente que:

= 32.75 - 2.16 + 0.4872 = 31.077

El será la fracción de organismos viables que sobreviven después del tratamiento por calor (Richards, 1968)

Para calcular la energía de activación, se utilizaron las siguientes ecuaciones:

La constante específica de muerte celular (k) se calcula para el período de mantenimiento, teniendo un tiempo de mantenimiento de 10 min:

Una vez obtenida la k, se despeja la energía de activación de la ecuación 2, quedando:

Energía de activación

(1) (2)

(3)

Para un valor de 9.5x1037 min-1 de la constante de Arrhenius (A). (Goldberg,1997). Tomando la constante de los gases (R) como 1.9872 cal/(mol K) y la temperatura de calentamiento (T) igual a 371.15K, sustituimos en la ecuación 3:

Comparándolo con la energía de activación para B. subtilis de acuerdo a (Jímenez, 2001) con un valor de 75.66 Kcal/mol, se obtiene un error del 13.26%

Se utiliza una temperatura de mantenimiento de 121°C con N0=106 UFC/mL y N=10-3UFC/mL. Con los datos

anteriores se puede calcular .

Y sabemos que:

Determinación de criterio de calentamineto

Para poder determinarlo, es necesario conocer la velocidad con la que aumenta la temperatura en el biorreactor en la etapa del calentamiento, se tomaron las temperaturas registradas en la Tabla I desde 0 min hasta 35 min, realizando la Gráfica 2.

Cálculo de los tiempos del ciclo de esterilización

Debido a que necesita conocer la velocidad con la que disminuye la temperatura en el biorreactor en la etapa de enfriamiento se realiza una regresión lineal de los datos registrados en la Tabla I para la etapa de enfriamiento (A partir de 52 minutos hasta 70 minutos). Generando la Gráfica .

Gráfica 3. Regresión lineal en el calentamiento. Regresión lineal donde representa el tiempo y representa el valor de la temperatura y la pendiente (2.0817 K/min) representa la velocidad con la que aumenta la temperatura.

Utilizando la pendiente de la Gráfica 3 se calcula el tiempo necesario para llegar a 121°C (394.15°K), iniciando a una temperatura de 23 °C (296.15°K).

Empleando la ecuación para el método Richards (Stanbury et. al. ,2003)

Gráfica 4. Regresión lineal para la obtención de la velocidad de disminución de la temperatura en la etapa de enfriamiento. Regresión lineal donde

representa el tiempo y representa el valor de la temperatura y la pendiente (-2.2619 K/min) representa la velocidad con la que disminuye la temperatura.

Utilizando la pendiente de la Gráfica 4 se calcula el tiempo necesario para disminuir la temperatura necesaria para llegar a 23 °C (296.15°K) a partir de 121°C (394.15°K), considerando que el tiempo inicial es 0 en lugar de 52 min.

Geobacillus stearothermophilus ha demostrado ser muy resistente a ciclos de vapor a 121ºC y a ciertos vapores químicos. Por lo tanto, este bacilo es la mejor opción como especie para ser usada en indicadores para procesos por vapor. Por otra parte, el Bacillus subtilis ha demostrado ser el más resistente a ciclos por calor seco y óxido de etileno, por lo que se propone aumentar la T de mantenimiento a 100°C o más (Raben Biological Laboratorios, s/a).

Método de extensión en placa.

Fundamento.La técnica de extensión en placa se basa en contar las “unidades formadoras de colonias” o UFC presentes en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que desarrolla en el medio de cultivo de elección después de un cierto tiempo de incubación a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de un agregado de ellos, de la muestra bajo estudio; este microorganismo o microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir una UFC. Las colonias pueden contarse de manera confiable, se hacen las diluciones decimales necesarias de la muestra, antes de colocarlo en el medio de cultivo. (Camacho, 2009).

● El medio de cultivo no debe fundirse más de una vez, y debe mantenerse en baño de agua regulado a 45°C, durante el tiempo suficiente para que alcance esa temperatura y hasta su utilización.

● El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente, hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.

Discusión

Debido a la alta concentración de microorganismos en las muestras iniciales, no fue posible hacer un conteo celular ni por el método de la cámara de Neubauer, así como tampoco por conteo de UFC en cajas Petri.

ddDiscusión

DISCUSIÓN: Grados de destrucción

• Calentamiento: Al tratarse de un proceso de calentamiento por inyección (Método hiperbólico).

 

To: temperatura absoluta inicial del medio [K]

c: calor específico del medio [J/Kg K]

H: Entalpía del vapor relativa a la temperatura del medio

ms : Flujo másico de vapor [kg/s]

M: Masa inicial de medio a esterilizar [kg]

(Universidad del Norte de Barranquilla, 2009).

Conclusiones

Se realizó una esterilización de un biorreactor tipo tanque agitado (planta piloto) determinando que el valor de total de 31.077 con un tiempo de esterilización de ∇10 min y una temperatura de mantenimiento de 98°C. Obteniendo una esterilización ineficiente para Bacillus subtilis.

[1] Gennaro, A. (2003) Remington Farmacia: Volumen 1. Ed. Médica Panamericana.[2] Doran, P. (1998) Principios de ingeniería de los bioprocesos. Editorial Acribia S. A.[3] Universidad Nacional de Quilmes (s/a) Bioprocesos II: esterilización. Departamento de ciencia y tecnología.[4] Murrieta M. (2009) Esterilización de medios de cultivo para procesos de fermentación (Tesis doctoral). Capítulo 13-34. Universidad de Sonora.[5] Espinosa J. (2005) Caracterización del proceso de crecimiento de Bacillus subtilis bajo condiciones anaerobias. (Tesis doctoral) Universidad Nacional Autónoma de México.[6]Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México. [7]Goldberg, E.Handbook Of Downstream Processing. 1997. Blackie Academic & Professional

Referencias

Referencias

[8]Universidad del Norte de Barranquilla. (2009). “Esterilización de Medios Líquidos”. Curso de Ingeniería. Colombia.[9]Pirt, S., Blackwell, I. (1975). “Principles of Microbe and Cell Cultivation”. Scientific Publications. Vol. 12. 54-62.[10]Richards, J. (1968). “Introduction to Industrial Sterilization”. Academic Press. Vol. 3. 25-29.[11] Jiménez B. (2001) Estudio de mecanismos para la viabilidad de esporas de Trichoderma harzianum para el proceso de secado. Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis, Instituto de Biotecnología, UNAM[12] Mejía,M. (2008). “Efecto de la relación carbono-nitrógeno sobre la producción de lipopéptidos por Bacillus subtillis”. CIBA-Tlaxcala. México.[13] Raben Biological Laboratorios (s/a) INFORMACIÓN GENERAL SOBRE INDICADORES BIOLÓGICOS .