ESTUDIO DE AGENTES ESTUDIO DE AGENTES PRODUCTORES DE DIARREA PRODUCTORES DE DIARREA

Dra. Elena Campos ChacónCentro Nacional de Referencia en

Bacteriología - INCIENSA

ESTUDIO DE AGENTES PRODUCTORES DE DIARREAIMPORTANCIA

• Variedad de agentes que se transmiten por alimentos

• Variedad de signos y síntomas inespecíficos– Gastroenteritis (diarrea)– Enfermedades febriles– Otros síntomas de intoxicación (vómitos, neurológicos. ..)

• Entre las ETAS las enfermedades diarreicas son problema de salud pública – Morbilidad– Secuelas – Mortalidad – Brotes, epidemias o pandemias

• Para la prevención y control de estas enfermedades es indispensable conocer

– Agentes etiológicos causantes de las enfermedades diarreicas – En cada contexto en particular (local, regional, nacional, internacional etc.) – Identificar de la manera más precisa posible los vehículos de

transmisión (aguas, alimentos, directa) – Causas y fuentes de su contaminación

DiarreaDiarreaCCááncerncer

ParParáálisislisis

ArtritisArtritis

Falla mFalla múúltiple deltiple deóórganosrganos Meningitis

Meningitis

HepatitisHepatitis

UlceraUlcerappéépticaptica

VIGILANCIA DE LAS ETAS

CampyloacterCampyloacterRotavirusRotavirusHepatitis

HepatitisVibrioVibrio choleraecholerae

NorovirusNorovirus

ShigellaShigella

SalmonellaSalmonella

InfeccionesShigellaEscherichia coliSalmonellaAeromonasPlesiomonas shigelloidesVibrio cholerae Vibrio mimicusVibrio parahaemolyticusOtros vibriosCampylobacterYersinia enterocolitica(Listeria monocitogenes)

AGENTES CAUSANTES DE ETAS / DIARREABACTERIAS

Toxi-infeccionesClostridium perfringens

IntoxicacionesStaphylococcus aureus

Bacillus cereus

VIRUS: Hepatitis, Rota, Noro y Adenovirus……PARASITOS: Cyclospora, Microsporidium…………..

VARIEDADE DE ALIMENTOS Y LASMULTIPLES FORMAS DE CONTAMINARLOS

Demostración de la transmisión fecal realizada por Taylor, epidemiólogo de Londres

ACTIVIDADES DE LOS LABORATORIOS CUANDO HAY UN BROTE O EPIDEMIA

Laboratorio nivel local

• Procesamiento iniciales

• Comunicación con las autoridades de salud del nivel local y el CNRB

• Recolección de muestras e información para procesar localmente y para enviar al CNRB

• Preparación y empaque de las muestras que se transportaran al CNRB

• Coordinación con el CNRB para el envío de las muestras

• Coordinación con el CNRB para la devolución de resultados al expediente clínico

Laboratorio nivel localLaboratorio nivel local

• Procesamiento iniciales

• Comunicación con las autoridades de salud del nivel local y el CNRB

• Recolección de muestras e información para procesar localmente y para enviar al CNRB

• Preparación y empaque de las muestras que se transportaran al CNRB

• Coordinación con el CNRB para el envío de las muestras

• Coordinación con el CNRB para la devolución de resultados al expediente clínico

Centro Nacional de Referencia (CNRB)

• Apoyo diagnóstico al nivel local

• Investigación por otros patógenos

• Confirmación y tipificación de patógenos

• Vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos

• Apoyo logístico

Centro Nacional de Referencia Centro Nacional de Referencia (CNRB)(CNRB)

• Apoyo diagnóstico al nivel local

• Investigación por otros patógenos

• Confirmación y tipificación de patógenos

• Vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos

• Apoyo logístico

Centro Nacional de Referencia en BacteriologCentro Nacional de Referencia en Bacteriologííaa

Red Nacional de Laboratorios de BacteriologRed Nacional de Laboratorios de Bacteriologííaa

PPúúblicos ................63blicos ................63CCSS (humanos) ..........58AyA (aguas) ..................1MAG (alimentos) ............1MAG (animales) ………....1ITCR (alimentos) .............1UNA (veterinaria) .……....1Morgue Judicial OIJ

Privados Privados ...................8.................8

NicaraguaNicaragua

Panamá

Panamá

Costa RicaCosta Rica

TOTAL RNLB : 71TOTAL RNLB : 71

CNRBCNRB

IDENTIFICACION DE PATOGENOS SEGUN TIPO DE MUESTRAS

– Clínicas humanas

– Clínicas animales (ídem. anterior )

– Ambiente (aguas y alimentos, superficies)

• Para el Aislamiento primario se deben seguir los métodos aprobados USDA, AOAC, ISO, FDA,(Curso Nicaragua)

• Dependen de tipo y estado del alimento (matriz)

• Cantidad y condición del patógeno y flora contaminante y tipo de alimento dificulta la recuperación de patógenos como Salmonella, Shigella y Vibrio

BUSQUEDA DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS

Dificultades • Consume más tiempo

• Más difícil la recuperación del patógeno

• Matrices complejas

• Flora bacteriana normal competitiva

• Procesamiento del alimento (stress)

• Volumen de materiales

• Volumen de trabajo

• Encontrar restos del alimento implicado

• Selección de muestras y patógenos a analizar

Datos Datos DemogrDemográáficosficos

Signos Signos SSííntomasntomas

BroteBrote

FechasFechas

AntibiAntibióóticosticos

Boleta de Diagnóstico

• Nombre del paciente• Edad• Signos y síntomas• Fecha y hora de inicio de síntomas • Antibiótico terapia previa a la toma de muestra• Alimento sospechoso• Lugar de consumo de alimentos• Dirección vivienda • Casos asociados• Nombre y teléfono del que solicita el análisis• Permita el uso racional de los recursos

de laboratorio y emitir un reporte de utilidad para el epidemiólogo

BOLETA DE DIAGNOSTICO

BOLETA DE SOLICITUD DE EXAMEN

CONSIDERACIONES GENERALES

• Gran variedad de agentes que pueden ocasionar enfermedad diarreica

• Que investigarsa partir de una muestra de heces?

• Laboratorios CLINICO O DE SALUD PUBLICA

• Uso de los resultados

• Establecer protocolo de análisis

– Los signos y síntomas clínicos del paciente

– Características de las heces

– El contexto epidemiológico en que se presenta la enfermedad

– Administración de antibióticos o antidiarreicos previo a la obtención de la muestra

– Recursos con que cuenta el laboratorio para investigar patógenos

CONSIDERACIONES GENERALES

• Basado en el protocolo y acorde a lo investigado el microbiólogo debe establecer las hojas de

– “Solicitud de Examen por Enfermedad Diarreica”

– Formato para rechazo de muestras

– Registro “Resultados de las pruebas de laboratorio”

– “Resultados del Diagnóstico de Laboratorio”.

• Comentarios o sugerencias acordes al mismo, las cuales podrían servir de mecanismo de actualización y divulgación de la información afín al hallazgo.

• Se deben reportar resultados negativos y positivos según lo investigado

• Se deben aclarar imitaciones del resultado ej. calidad de la muestra,…

• los diagnósticos positivos por enteropatógenos, no sólo son de importancia para el clínico, sino

también para alertar los sistemas de vigilancia epidemiológica

TIPOS DE MUESTRA PARA ESTUDIO DE BROTES

Origen de Origen de muestramuestra

Tipo de muestraTipo de muestra TransporteTransporte

Pacientes con diarrea

• Heces frescas, hisopado fecal o rectal en Medio Cary Blair

• Sangre (por solicitud del

laboratorio)

• Post-mortem: contenido intestinal, hisopado rectal, sangre

• Cada muestra identificada con el nombre y fecha de recolección y con su respectiva boleta

• Transportar al laboratorio lo más pronto posible en nevera con gel refrigerante, asegurando que no se congelen

Manipuladores de alimentos

• Heces, hisopado fecal o rectal en Medio Cary Blair

• Frotis faríngeo, lesiones de piel, uñas

• Sangre (a solicitud del

laboratorio)

• La muestra para cultivo debe ser recolectada:

– A partir del sitio infectado (heces, vómito, sangre)

– En la etapa aguda de la enfermedad

– Previo al inicio de antibióticos

– En cantidad suficiente y evitando la contaminación

• Con etiquetado apropiado: nombre, tipo de muestra, fecha de recolección, iniciales de quien recolectó la muestra

• Debe ser transportada al laboratorio en el menor tiempo posible, en condiciones de que garanticen la integridad de la muestra y del que la manipula

CARACTERISTICAS DE LA MUESTRA CLINICAS

Equipo básico para recolección de muestras clínicas

• Sangre

– Tubos vacutainer (tapón rojo)

– Agujas para vacutainer

– Torniquete

– Gradilla para tubos

– Algodón

– Alcohol 70°C

• Heces

–Frascos estériles, boca ancha, con tapa hermética

–Hisopos estériles

–Medio de transporte Cary Blair

•Boletas de solicitud de análisis

EC CNRB 20 04 2009

Paciente con diarrea muestra óptima(1 semana, sin tratamiento, recién recolectada)

Paciente con diarrea muestra no óptima

Paciente sin diarrea muestra no óptima(portadores asintomático etc.)

MUESTRAS CLINICAS

5/5/2009

Diagnóstico de laboratorio

Humanos(pruebas febriles)

Enfermos

Portadores?

Suero agudo

Suero convaleciente

MUESTRAS PARA SEROLOGMUESTRAS PARA SEROLOGÍÍAA

Suero día 1

Suero día 15

Interpretación:•De utilidad en el diagnóstico de fiebre tifoidea y paratifoidea, no en salmonelosis. •Basada en la seroconversión y/o puntos de corte de la población

PROCESAMIENTO INICIAL

• Normas laboratorio de Bioseguridad Nivel II.

– Incluyendo bata de laboratorio, guantes y lentes

– Atención al destapar por primera vez una muestra clínica

• Antes de iniciar el procesamiento de la muestra

– Leer la información clínico-epidemiológica que la acompaña (especialmente edad, días de evolución, la presencia o no de signos como la fiebre y/o vómito, el volumen y consistencia de las heces, otros enfermos asociados, viajes, etc.)

– Determinar la calidad y tipo de muestra

ANALISIS MACRO Y MICROSCOPICO

• Observar y anotar las características macroscópicas de la muestra (por ej. consistencia, color, olor así como la presencia de sangre, moco o de formas adultas de helmintos)

• Preparaciones para observar directamente “al fresco” la presencia de quistes y huevecillos de parásitos (obj. 10x y 40X) y empleando el 100X buscar la presencia de leucocitos, eritrocitos y la cantidad, morfología y tipo de motilidad de la flora bacteriana presente.

• Gram (100 x)

– morfología y características tintoriales de las bacterias

– proporción entre la flora Gram positiva y Gram negativa

– Búsqueda de morfotipos característicos de Campylobacter, Serpulina, esporulados, etc.

• Ziehl Nielsen (100 x)

– estructuras semejantes a Cryptosporidium y Cyclospora

• Con base a los resultados e información antes mencionada, el microbiólogo debe valorar los resultados obtenidos y determinar si la diarrea puede ser o no de origen parasitaria (mixtos).

• Valorar emitir reporte preliminar o definitivo

Centro Nacional de Referencia en BacteriologCentro Nacional de Referencia en Bacteriologííaa

TTóóxicoxico--infecciinfeccióón por n por C. perfringens C. perfringens (tipo A)(tipo A)

• Segunda causa de enfermedad asociada a alimentos en USA Sólo precedida por Salmonella

• Aparición repentina de cólicos, diarrea y náusea (generalmente sin vómitos ni fiebre)

• PI: 7 a 15 hr.

• Corta duración (menos de 24 hr)

• Productos cárnicos

• Aislamiento de al menos 105 cél/g alimento o 106/g en heces

• Enterotoxina en heces o en cepas aisladas

• Toxinas: 13 toxinas diferentes* (tox A)

• Enterotoxina se libera cuando las bacterias se lisan durante la esporulación en el intestino

5/5/2009

Diagnóstico de laboratorio

Humanos(previo al inicio de la antibioticoterapia)

Alimentos, ambiente(cantidad suficiente)

Enfermos

PortadoresHeces

Enjuagues de manos

Heces, hisopados rectales*

Sangre (durante pico febril),

Tejidos, orina, LCR, bilis, pus de abscesos

Agua

Utensilios

Materias primas

Alimentos preparados

MUESTRAS PARA CULTIVOMUESTRAS PARA CULTIVO

* Transporte en medio Cary Blair

Coprocultivo

• Diferencias en cuanto al número y tipo de patógenos que se investigan

• “Coprocultivo Básico” aquel en el que al menos se investigó la presencia de Salmonella, Shigellay Vibrio cholerae

• Incorporación progresiva de nuevos patógenos en los laboratorios, dependiendo de su nivel de complejidad, disponibilidad de recursos y características epidemiológicas propias del nivel y área respectiva de atención

• De acuerdo a las consideraciones anteriores en esta primera versión de los procedimientos de laboratorio, estaremos dando el énfasis al aislamiento y caracterización para Salmonella, Shigella y Vibrio cholerae. (Literatura adicional

Coprocultivo básicoAislamiento primario

• Primera fase del coprocultivo

Recuperar los componentes que conforman la flora bacteriana de la muestra de heces, especialmente aquellos que presenten características semejantes a los enteropatógenos más reconocidos

Coprocultivo básicoAislamiento primario

• Obtener cultivos puros de cada uno de los organismos sospechosos

– enriquecimiento selectivo tiempos y temperaturas estrictas

– dilución por rayado

– recuperación de Salmonella, Shigella y Vibrio cholerae.

– medios adicionales para la recuperación de otros patógenos dependiendo de información

• Escherichia. coli enterohemorrágica (McConkey Sorbitol)

• Campylobacter (Skirrow) (Manual incluido en el CD)

• Salmonella Typhi (Agar Ssulfito Bismuto)

• Asigne a cada colonia aislada , además del código de muestra, un código de cepa en forma consecutiva (cepa 1,cepa 2,cepa 3,etc) que le permita reconocerla

1R e s u lta d o p re l im in a r

H IS O P A D O R E C T A LO

H E C E S F O R M A D A S

E X A M E N D IR E C T O“ F R O T IS ”

S A L IN A

G R A M

Z IE H L -N E E L S E N

L U G O L

E N R IQ U E C IM IE N T O

A P A 6 -1 8 H

T E T R A T IO N A T O 1 8 H .

G N 4 -6 H

A IS L A M IE N T OP R IM A R IO

T C B S

A . S A N G R E

M A C -L A C T O S A

M A C -S O R B I T O L

T E R G IT O L -7

IN C U B A R3 5 -3 7 °C /1 8 -2 4 H

2P ru e b a s B Q .

E X A M IN A R C R E C IM IE N T O E N P L A C A S

T C B S A . S A N G R E M A C -L A C T O S A M A C -S O R B IT O LT E R G IT O L -- 77

P U R IF IC A R C O L O N IA S E N B H I ó A T S

FF RR OO TT IISS YY CC OO PP RR OO CC UU LL TT IIVV OO BB AA SS IICC OORR EE DD NN AA CC IIOO NN AA LL DD EE LL AA BB OO RR AA TT OO RR IIOO SS PP AA RR AA EE LL DD II AA GG NN OO SS TT IICC OO DD EE LL AA SS EE DD AA SS // CC OO LL EE RR AA ..

H E C E SL IQ U ID A S

S M A R T

M O T IL ID A D C N R E C - In c ie n sa , C .R . 0 1 /0 5 /0 0

* O P C IO N A L

*

*

*

P R U E B A SA D I C I O N A L E S

A T S

O X ID A S A

C O R D O N

T S I / K IA

T N -0 % N a C l

T N -1 % N a C l

O R N IT IN A

L IS IN A

A R G IN IN A

IN D O L

M O T IL ID A D

R .M .

V .P .

C IT R A T O

U R E A

O N P G

V ib r io v u ln i f ic u sV . m e ts c h n ik o v i iT a b la s 1 y 2

V ib r io c h o le r a eV m im ic u sV . m e ts c h n ik o v i iV . c in c in a t ie n s isV . h o l l is a eV . d a m s e laV . f lu v ia lisV . fu r n is s i iV . a lg in o ly t ic u sV . p a r a h a e m o ly t ic u sV . c a r c h a r ia eT a b la s 1 y 2

A e r o m o n a s c a v ia eA . h y d r o p h i laT a b la 3

P le s io m o n a ss h ig e l lo id e s

T a b la 3

A e r o m o n a s s o b r iaA . s c h u b e r t i iA . v e r o n i iA . c a v ia eA . h y d r o p h i laT a b la 3

S h ig e l la s p .E s c h e r ic h ia s p .S a lm o n e l la s p .C i t r o b a c te r s p .K le b s ie l la s p .Y e r s in ia s p .E d w a r d s ie l la s p .P r o te u s s p .M o r g a n e l la m o r g a n i iO tr o s , T a b la s 4 y 5

E s c h e r ic h ia c o l iC i t r o b a c te r s p .E n te r o b a c te r s p .K le b s ie l la s p .S a lm o n e l la a r iz o n a

T a b la s 4 y 5

L I A

T N -8 % N a C l

A C E T A T O

M A C L A C T O S A

C N R E C - In c ie n s a , C .R 2 0 0 0 -0 5 -0 1

A IS L A M IE N T O Y P R U E B A S B IO Q U IM IC A S B A S IC A S P A R A L A ID E N T IF IC A C IO N D ES A L M O N E L L A , S H IG E L L A , E S C H E R IC H IA C O L I Y Y E R S IN IA

Sacarosa (-)V. mimicusV. parahaemolyticus

Sacarosa (-)V. mimicusV. parahaemolyticus

Agar TCBSAgar TCBS

Sacarosa (+)V. cholerae

Sacarosa (+)V. cholerae

• Bacilos Gram negativos

• Oxidasa positivos

• Géneros:

– Vibrio

– Aeromonas

– Plesiomonas

C N R EC -Inciensa

TER G ITO L-7+ TTC

ATS

ShigellaSalm onella

Tablas 4 y 5

P R U E B ASB IO Q U IM IC AS

O XID AS A

TSI / K IA

IN D O L

M OTIL ID A D

R .M .

V .P .

C IT R AT O

U R E A

O N PG

LIA

AISL AM IENTO E IDENTIFICACIO N BIO Q UIM IC A B ASIC A P AR AS ALM O NELL A , SHIG ELLA Y ESCHERIC HIA CO LI

- SER O TIPIFICA CIÓ N- B IOT IPIF IC AC ION- FAC TOR ES D E VIR U LEN CIA- R ESISTEN CIA AN TIB IOTIC O S

E. co li

Tablas 4 y 5

Ferm entadorasde lactosa

diferentes aE. co li

Tablas 4 y 5

AC ET AT O

C NREC- Inc iensa, C .R 2000-05-01

5/5/2009

Diagnóstico de laboratorio

Pruebas bioquPruebas bioquíímicas bmicas báásicas para la sicas para la identificaciidentificacióón del Gn del Gééneronero

ConvencionalConvencional

Laboratorios Nivel 1

5/5/2009

Diagnóstico de laboratorio

IdentificaciIdentificacióón del Gn del Gééneronero

ConfirmaciConfirmacióón seroln serolóógicagica

• Salmonella O antisera poly A-I y Vi

• Otros serogrupos “O”(no comprendidos en el polivalente anterior)

API

VITEK

Convencionales

SEROTIPIFICACIÓNSEROTIPIFICACISEROTIPIFICACIÓÓNN

CAMPYLOBACTER

Medio de SkirrowMedio de Skirrow

Medio de ButzlerMedio de Butzler

CampyCampy-- bapbap

Medio de Skirrow Medio de Skirrow modificadomodificado

48 h, 42-43 ºC

48 h, 42-43 ºC

Medio selectivo

Campy thio u otro(4 ºC, 18 h) – (42ºC)

Feca

s

Examen directo AA22

indirectoindirecto

AA11directodirecto

MMéétodo de filtracitodo de filtracióón en sangren en sangre

CAMPYLOBACTER: FILTRACICAMPYLOBACTER: FILTRACIÓÓNN

CampylobacterColonias en Agar Sangre

Escherichia coli enteropatógena asociada

a cuadros diarreicos, Costa Rica, 2004

Fuente:Fuente: Centro Nacional de Referencia en BacteriologCentro Nacional de Referencia en Bacteriologííaa--INCIENSA yINCIENSA y

Red Nacional de Laboratorios de BacteriologRed Nacional de Laboratorios de Bacteriologííaa

Virotipos de Escherichia coli Positivas / total %

Enterotoxigénica (ETEC-ST, ETEC-LT) 118 / 205 58

Enteroinvasiva (EIEC) 4 / 108 37

Enteropatógena (EPEC) 2 / 32 6

Enterohemorrágica (EHEC) 0 / 49 -

Enteroagregativa (EAggEC) 0 / 13 -

Diarreas por Escherichia coli enteropatógena*,confirmadas en el CNRB, 2004

CONSIDERACIONES GENERALES

• Gran variedad de agentes que pueden ocasionar enfermedad diarreica

• Que investigar a partir de una muestra de heces

• Laboratorios CLINICO O DE SALUD PUBLICA

• Uso de los resultados

• Establecer protocolo de análisis

– Los signos y síntomas clínicos del paciente

– Características de las heces

– El contexto epidemiológico en que se presenta la enfermedad

– Administración de antibióticos o antidiarreicos previo a la obtención de la muestra

– Recursos con que cuenta el laboratorio para investigar patógenos.

ComunicaciComunicacióón de resultadosn de resultados

•• NotificaciNotificacióón obligatoria de la n obligatoria de la ““enfermedad diarreicaenfermedad diarreica”

• Reportes colectivos por semana epidemiológica de los episodios de diarrea

• Responsable de notificación: médico

•• NotificaciNotificacióón de casos de diarrea por agentes de notificacin de casos de diarrea por agentes de notificacióón n obligatoriaobligatoria (ej. cólera, salmonelosis, shigelosis)

• Reporte individual inmediato

• Responsable de notificación: microbiólogo, médico

ParticipaciParticipacióón del CNRB en Evaluaciones Externas n del CNRB en Evaluaciones Externas InternacionalesInternacionales

EQASEQASMALBRANMALBRAN

RIILARIILA

EC CNRB 20 04 2009

Ganadería

Acuacultura

Transporte y distribución

Servicios de alimentación al

público

Hogar

Entrega

CONSUMIDORDetallistas

Transporte

Agricultura

Malas prácticas agrícolas. Emisiones de vehículos y fábricas, aguas negras

Fallas en Buenas Prácticas de Manufactura (BPM),

Fallas en el control de puntos críticos (HACCP)

La contaminaciLa contaminacióón del alimento puede ocurrir en n del alimento puede ocurrir en cualquier punto de la cadenacualquier punto de la cadena

Proceso

BROTES DE FUENTE COMUN

TIPOS DE ALIMENTOS A RECOLECTAR EN BROTES ETA

Origen de muestra

Tipo de muestra Transporte

Alimentos • Sobras de los alimentos servidos (mínimo 100g)

• Sobras del alimento en su envase original

Alimentos líquidos

Mezcle para homogenizar

Transfiera una porción a un envase estéril

Alimentos sólidas

Transfiera porciones de diferentes sitios para asegurar una muestra representativa

Alimentos congelados

No los descongele

• Muestra rotulada, sellada y empacada individualmente de manera que el envase no se abra e introduzca contaminación externa

• Transportar en frío (4 °C, gel refrigerante), lo más pronto posible al laboratorio

• Cada muestra requiere de una boleta

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

Lavado de manos con Lavado de manos con agua, jabagua, jabóón y alcohol 70n y alcohol 70°°

Guantes

Gabacha bozal

Bolsas para material

contaminado

• Usar guantes, gabacha u otros implementos necesarios, dependiendo del agente sospechoso y del cuadro clínico

• Usar tubos o frascos con tapas herméticas irrompibles

• No enviar elementos punzantes o cortantes

• No envolver los frascos de las muestras en las boletas de solicitud de análisis