*E-mail: virgivr2005@gmail.com

BIODIVERSIDAD EDFICA COMO BIOINDICADOR DE LA SALUD DEL

SUELO MEDIANTE MTODOS MOLECULARES

Vallejo Rojas Virginia a,*, Mijangos Iker b, Garbisu Carlos a,b

a Masterado en Biodiversidad, Funcionamiento y Gestin de Ecosistemas. Departamento de Biologa Vegetal y Ecologa / Departamento de Zoologa y Biologa Celular Animal. Facultad de Ciencia y Tecnologa. Universidad del Pas Vasco, Espaa. b Departamento de Ecosistemas. Instituto Vasco de Investigacin y Desarrollo Agrario, Neiker-Tecnalia. Pas Vasco, Espaa.

RESUMEN

Los indicadores de la salud del suelo basados en el anlisis de la comunidad microbiana tienen la ventaja de ser ms dinmicos e integradores que aquellos basados en el estudio de propiedades fsicas y qumicas. Recientes avances en tcnicas de biologa molecular han proporcionado herramientas fiables y rpidas para caracterizar la estructura de la comunidad microbiana del suelo. El objetivo de la presente investigacin fue estudiar los efectos que producen sobre la biodiversidad y abundancia microbiana edfica la aplicacin continuada de diferentes prcticas agrcolas [no-laboreo (NL) vs. laboreo convencional (LC); abonado orgnico (O) vs. abonado inorgnico (I)] para el cultivo de maz forrajero, utilizando la tcnica denominada DGGE. El ensayo se realiz en una finca experimental y dur 5 aos. Se cuantific la biomasa microbiana [DNA], y a partir de los perfiles de bandas de los geles DGGE se determin la riqueza especfica y la diversidad bacteriana del suelo, expresadas con el nmero de bandas (S) y el ndice de Shannon (H), respectivamente. Los resultados del estudio indican que la biomasa microbiana y la diversidad de la comunidad bacteriana edfica se ven afectadas por la fertilizacin inorgnica, observndose descensos significativos (P

2

homogneos. Por otra parte, el suelo tiene tasas ms lentas de formacin, crecimiento

y renovacin (tan lentas que a nuestra escala temporal, se considera un recurso no

renovable), que contrastan con su rpida cintica de degradacin bajo manejos

inadecuados (Doran & Parkin, 1996). De hecho, en la segunda mitad del siglo XX, la

superficie de tierra cultivable por habitante se ha reducido aproximadamente en un

50% debido fundamentalmente al aumento de la poblacin y la degradacin de los

suelos agrcolas. Este problema afecta actualmente a casi todas las reas habitadas del

planeta alcanzando, en algunos casos, unos niveles de degradacin irreversibles (ISRIC,

2004).

A medida que se ha ido tomando consciencia de la progresiva degradacin del

suelo, han surgido conceptos como la calidad y salud del suelo. Segn Carter et al

(1997) la calidad del suelo es el grado de aptitud de un suelo para desempear una

funcin determinada, por lo tanto la calidad puede variar cuando se pretende un uso

diferente. Por el contrario, el trmino salud del suelo incorpora las caractersticas o

atributos ecolgicos de un suelo que tienen implicaciones ms all de su calidad o

capacidad para cumplir una determinada funcin. Estas caractersticas son aquellas

que estn estrechamente relacionadas con la biota del suelo, su biodiversidad,

actividad, la estructura de la red trfica, etc. Por ejemplo, la biodiversidad no es una

propiedad del suelo crtica per se para la produccin de una cosecha, pero s que es

una propiedad que puede ser de importancia para el mantenimiento de la capacidad

que tiene ese suelo para producir dicha cosecha. Por otra parte, sin el mantenimiento

de la biodiversidad, la capacidad del suelo para recuperarse en respuesta a las

perturbaciones naturales o antropognicas (su resiliencia) puede verse reducida de

manera significativa.

Tradicionalmente, la salud del suelo se ha venido determinando en base a la

cuantificacin de diversas propiedades fsico-qumicas, debido a que se consideraba

que los bioindicadores trmino definido como un organismo, parte de un

organismo, producto de un organismo (e.g., enzima), grupo de organismos o procesos

biolgicos que pueden ser utilizados para obtener informacin sobre todo o parte del

3

medio ambiente (Wittig, 1993) eran ms difciles de medir e interpretar. En los

ltimos aos, especialmente a partir de la incorporacin del concepto salud del suelo,

existe un enorme inters por estudiar los indicadores biolgicos. Entre sus ventajas se

destacan: (i) su carcter integrador de la totalidad de las propiedades fsicas, qumicas

y biolgicas que definen el ecosistema suelo en el tiempo y en el espacio; y (ii) su

capacidad para responder con gran sensibilidad y rapidez a los cambios y

perturbaciones introducidas en el ecosistema suelo, proporcionando una especie de

seal de alarma de un posible colapso del sistema, de forma que los gestores y

agricultores puedan reaccionar con la antelacin requerida antes de que se originen

(Pankhurst, 1997).

En el suelo la actividad biolgica se asocia a procesos reguladores del reciclaje

de nutrientes (mineralizacin, desnitrificacin, fijacin de N2, etc.) y a la

descomposicin de residuos orgnicos. Esta actividad se encuentra concentrada en la

parte superior del suelo, desde la superficie hasta unos 30 cm (Pankhurst et al., 1997).

En esta zona superficial, el componente vivo del suelo est compuesto por un 85-95%

de races de plantas y un 5-15% de organismos del suelo. Dentro de estos organismos,

generalmente un 15-30% pertenecen a lo que se ha dado en llamar macro- y

mesofauna, mientras que el restante 70-85% son microorganismos (mayoritariamente,

bacterias y hongos), los cuales son responsables del 80-90% de la actividad biolgica

de los suelos (Reichle, 1977).

Una de las principales dificultades que presenta el estudio de los

microorganismos del suelo, es que a pesar de ser potencialmente viables y

metablicamente activos, solamente el 0,3% son cultivables (Amann et al., 1995). Con

la finalidad de superar esta limitacin para representar la mayor proporcin posible de

la diversidad microbiana existente en una muestra ambiental se han desarrollado una

serie de metodologas, que prescinden de pasos previos de cultivo (Amann et al., 1995;

Head et al., 1998). Estas metodologas se basan en tcnicas moleculares que analizan

los cidos nucleicos existentes en la comunidad microbiana. Una de estas tcnicas es la

electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE: denaturing gradient gel

4

electrophoresis), cuyo empleo para monitorear la diversidad estructural de la

comunidad microbiana fue introducido por Muyzer et al (1993). La DGGE se basa en la

separacin de las secuencias del gen ribosomal, que han sido amplificadas a partir del

DNA de la muestra con primers universales o especficos de un grupo taxonmico,

sobre un gel de poliacrilamida con un gradiente qumico de formamida y urea, en

concentraciones crecientes en el sentido de la migracin electrofortica. Se pueden

estudiar molculas de DNA de hasta 700 pares de bases de longitud, con la

caracterstica de llevar acoplada una secuencia artificial muy rica en GC (aadida a uno

de los primers en posicin 5) en uno de los extremos, para evitar la desnaturalizacin

completa del DNA (Muyzer et al., 1993). Las bandas individuales representan aquellas

secuencias que han frenado su migracin a una altura especfica del gel al

desnaturalizarse por completo (excepto la secuencia rica en GC), de modo que,

idealmente, cada banda correspondera a una especie diferente.

El objetivo de la presente investigacin fue estudiar los efectos que producen

sobre la biodiversidad y abundancia microbiana edfica la aplicacin continuada de

diferentes tcnicas de laboreo (laboreo convencional versus no laboreo) y fertilizacin

(fertilizacin inorgnica versus fertilizacin con purn vacuno fresco) para el cultivo de

maz forrajero, utilizando DGGE.

2. MATERIALES Y MTODOS

2.1. Zona de estudio

Los trabajos de campo y laboratorio se desarrollaron en el Instituto Vasco de

Investigacin y Desarrollo Agrario, Neiker-Tecnalia, en la sede situada en la Parcela

812. C/Berreaga 1. E-48160 del Parque Tecnolgico de Zamudio, municipio de Derio,

provincia de Bizkaia, Pas Vasco. El ensayo de campo se realiz en una finca

experimental de Neiker-Tecnalia, en una parcela situada en las coordenadas UTM 30T

509341; 4794914, a una altitud de 60 msnm y con una leve pendiente descendente

con orientacin NE. El clima es templado y hmedo, la temperatura media de esta

zona es de 13.5 C y la precipitacin anual media es de 1200 mm (Mijangos et al.,

2010). El ensayo de campo inici en mayo de 2005 y finaliz en mayo de 2010. La fase

5

de laboratorio se desarroll en las instalaciones de I+D del Departamento de

Ecosistemas del Instituto Vasco de Investigacin y Desarrollo Agrario, Neiker-Tecnalia.

2.2. Diseo estadstico

El ensayo consisti en el estudio de dos factores: el laboreo [no laboreo (NL)

versus laboreo convencional (LC)] y la fertilizacin [orgnica con purn (O) versus

inorgnica con fertilizantes (I)], sobre un sistema de rotacin forrajera anual, formado

por cultijuhyvo de maz forrajero (Zea mays L. cv. Moncada) durante el verano (mayo -

octubre) y raigrs italiano (Lolium multiflorum L. cv. Nival) como cultivo de invierno

(octubre - mayo). Los cuatro tratamientos resultantes (NL+O, NL+I, LC+O y LC+I) sobre

el cultivo de verano fueron estudiados durante cinco aos.

Tabla 2.1. Diseo del ensayo en la finca experimental de Neiker-Tecnalia. NL: no laboreo; LC: laboreo convencional; O: abono orgnico; I: abono inorgnico.

TRATAMIENTOS

Bloque I LC O NL I LC O NL O NL O NL I LC I NL O

Bloque II LC I NL I NL O NL I LC O LC I NL O LC O

Bloque III LC O LC O LC I LC I NL I NL O NL- O NL I

Los tratamientos de fertilizacin consistieron en 140 kg N ha-1, 90 kg P2O5 ha-1 y

190 kg K2O ha-1. Los minerales N, P y K+ fueron aplicados en forma de grnulos de

NH4NO3 al 33,5%, P2O5 al 18%, y KCl al 60%. Se usaron dosis similares para el

tratamiento con purn vacuno (~10% de materia seca). Los fertilizantes se aplicaron

manualmente y antes del laboreo. Para el laboreo convencional el suelo fue arado a

20cm con una mquina de arado de vertedera. Para la siembra directa se utiliz una

mquina Semeato. La densidad de siembra de maz fue 100.000 plantas ha-1, con una

distancia entre surcos de 70 cm (Mijangos et al., 2010). Se realizaron seis rplicas para

cada tratamiento, distribuidas en bloques al azar (Tabla 2.1), dando un total 24

parcelas. Las dimensiones de cada parcela fueron 5 m x 3.5 m, con una distancia de 5.5

m entre bloques. Como control se us el suelo de una pradera natural contigua e

inalterada durante los ltimos 20 aos.

6

2.3. Recoleccin de la muestras

Se tomaron las muestras de suelo al inicio de la fase mximo crecimiento del

maz, aproximadamente 4 6 semanas despus de la aplicacin de las prcticas

agrcolas (fertilizacin, laboreo y siembra). De tal forma que se efectu un muestreo

por ao.

Los muestreos de suelo se realizaron con la ayuda de una sonda de 20 cm de

profundidad y 3 cm de dimetro. Se recogieron al azar quince muestras de cada

parcela, las cuales se mezclaron para dar una muestra compuesta. Las muestras de

suelo fueron tamizadas a < 2mm y almacenadas a -20 C, para su posterior anlisis.

2.4. Extraccin del material gentico

El DNA de la biomasa microbiana fue extrado a partir de 0,25 g de cada

muestra de suelo, usando un kit comercial, PowerSoil DNA Isolation Kit (Mo Bio

Laboratories Inc., California, USA) siguiendo las instrucciones de la manufactura. Antes

de la extraccin del DNA, las muestras se lavaron dos veces con 120 mM K2HPO4 (pH

8,0), con la finalidad de eliminar el DNA extracelular del suelo, de tal forma que el DNA

que se obtuvo fue mayormente proveniente de clulas bacterianas viables (Kowalchuk

et al., 1997). Todos los procesos de extraccin del DNA se realizaron en una zona de

PRE PCR acondicionada para el efecto.

El DNA se cuantific por espectrofotometra (Nano Drop , Spectrophotometer

ND-1000) y usando un programa de cmputo (ND_1000 V3.5.2, Nano Drop

Technologies Inc., Wilmington, USA) se determin la concentracin y la pureza del

DNA. De tal forma que la cantidad de DNA extrado se correlaciona con la biomasa

microbiana (Kowalchuk et al., 2003) presente en la muestra de suelo.

2.5. Reaccin en cadena de polimerasa (PCR)

Secuencias del 16S rDNA bacteriano fueron amplificadas usando un par de

primer universales F984-GC y R1378 (Heuer et al., 1997) (Cuadro 2.1). La reaccin se

7

realiz con un volumen total de 25 l en un termociclador iCycler (BioRad, USA). La

mezcla de reaccin consisti en: 0,2 mM de dNTPs (2,5 mM de cada dNTP) (Takara Bio

Inc, Japan), 2,5 l de buffer 10X (100 mM Tris-HCl (pH8,3), 500 mM KCl, 15 mM MgCl2)

(Takara Bio Inc, Japan), 0,6 M de cada primer (Sigma), 0,28 l de Ex - Taq polimerasa

(5U/ l) (Takara Bio Inc, Japan), 1 l de la muestra de DNA y agua MilliQ hasta obtener

el volumen final. Las condiciones de reaccin fueron: una desnaturalizacin inicial a

94C por 15 min; 35 ciclos de desnaturalizacin a 92C por 30 s, alineamiento a 55C

por 1 min, y extensin a 68C por 45 s; y una extensin final a 68C por 5 min. Al

mismo tiempo, por cada PCR, se realiz un blanco donde la muestra de DNA fue

reemplazada con agua MilliQ.

Cuadro 2.1. Primers usados en la PCR para amplificar secuencias del 16S rDNA bacteriano

Primera Secuencia (5 3)

F984GC gc.-AACGCGAAGAACCTTAC

R1378 CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG

gc. 5-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3

a F, primer forward; R, primer reverse; GC, secuencia rica en G+C (gc.) unida al extremo 5

Fuente: Heuer et al., 1997

2.6. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE)

Para el anlisis de los diferentes fragmentos de genes 16S rDNA amplificados se

utiliz la tcnica de DGGE, usando geles de acrilamida al 6% (acrylamide/bis solution,

37,5/1) con un gradiente desnaturalizante de 35% a 60% (donde el 100% de

desnaturalizante corresponde a 7 mol/l de urea y 40% de formamida). Una mezcla de

25 l del resultado de la PCR con 5 l de buffer de carga (0,25% (p/v) Bromofenol,

0,25% (p/v), Xilene-cianol, y 30% (p/v) Glicerol), fue cargada en el gel desnaturalizante,

y se coloc un blanco por cada gel. La DGGE se realiz en un buffer TAE 1X (Tris -

acetato - EDTA) (BioRad) a condiciones constantes de 60 C y 170 V por 3,5 h (Bio-Rad

DcodeTM Systems, Richmond, USA). Posterior a la electroforesis, para la visualizacin,

los geles se incubaron en una solucin de SYBR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen), con

agitacin (Heidolph PROMAX 2020) de 50 rpm por 30 min, a temperatura ambiente en

8

oscuridad. Se obtuvo las imgenes de los geles usando un transiluminador (G:Box

Syngene) de luz UV, los resultados se documentaron y analizaron usando el software

Gene Sanp versin 7.05 (Syngene, England). La posicin e intensidad de cada banda en

los perfiles de la DGGE fueron determinadas con el software automticamente.

2.7. Anlisis de datos y estadstica

Con los datos obtenidos a partir de los perfiles de la DGGE, se determin el

ndice de diversidad de Shannon [ ]. Para esto se calcul los

valores S y pi, donde, S = nmero de bandas en cada carril y pi = proporcin entre la

intensidad de una banda especfica y la suma de la intensidades de todas las bandas de

un mismo carril, luego de haber restado el ruido de fondo de cada carril (Qu & Wang,

2008). De este modo, el nmero de bandas por carril, S, corresponde a la riqueza

especfica, y la intensidad de cada banda a la abundancia de individuos por especie.

Para determinar diferencias estadsticamente significativas (P

9

(abundancia) bajo los distintos tratamientos en el cultivo de verano durante todo el

perodo que dur el ensayo. A pesar que desde el inicio del ensayo hasta el verano del

2008 no se observan diferencias estadsticas entre los tratamientos, hay una ligera

tendencia hacia el aumento de la biomasa, en general. En el verano del 2009, al

finalizar el ensayo, se observa una diferencia significativa (P

10

ejemplo ilustrativo, se muestra el gel correspondiente al muestreo de 2007) ya que

muestran un gran nmero de bandas que estn presentes en todos los tratamientos y

controles, lo cual sugiere que los microorganismos que poseen aquellas bandas son

estables y su presencia no est determinada por los tratamientos de fertilizacin

(Wang et al, 2008) ni de laboreo. No obstante, unas pocas bandas aparecen

desaparecen bajo un tratamiento especfico, as como la intensidad de bandas

similares tambin difiere entre los perfiles de cada tratamiento, sugiriendo que en

funcin del tratamiento se favorece el desarrollo de determinadas especies (Wang et

al, 2008).

Figura 3.2. Visualizacin del perfil de bandas utilizando DGGE (35-60% de formamida:urea) para los productos de amplificacin de las secuencias del gen 16S rDNA de las muestras de suelo sometidas a los diferentes tratamientos (n = 6). Tratamientos: 1 = NL+O; 2 = NL+I; 3 = LC+O y 4 = LC+I. C = control. B = blanco.

Esto se muestra en las Figuras 3.3 y 3.4, en las cuales se representan los valores

de S y H como porcentajes de los valores medios obtenidos en las muestras control en

cada muestreo (que constituyen el 100% de referencia), con el objetivo de poder

comparar diferentes muestreos entre s y limitar la variabilidad interanual. Los valores

medios de [DNA], S y H de las muestras control para cada muestreo se indican en el

Anexo 7.1.

En general, la diversidad bacteriana, expresada mediante la riqueza especfica

(S, Figura 3.3) y el ndice de Shannon (H, Figura 3.4) no mostraron diferencias

estadsticas entre los tratamientos dentro de cada muestreo. La heterogeneidad tpica

tratamientos C B tratamientos C

Bloque 2 Bloque 3

4 2 1 2 3 4 1 3 3 3 4 4 2 1 1 2

11

del medio edfico (mayo 2005, Figura 3.4) sin duda dificult el establecimiento de

diferencias estadsticamente significativas. A esto tambin contribuy el hecho de que

las parcelas orgnicas partieran de una diversidad bacteriana menor (mayo 2005,

Figura 3.4). Tras los tratamientos, parecieron revertir en parte esta situacin, siendo

significativamente superiores sus indicadores de diversidad (S y H) en el muestreo del

verano de 2006.

Figura 3.3. Evolucin de la diversidad bacteriana edfica expresada por su riqueza especfica (nmero de bandas-S, en % respecto al control) por efecto de los tratamientos. Diferentes letras en cada muestreo indican diferencias significativas (P

12

mineral. Este descenso fue menos acusado en trminos de riqueza especfica (S), lo

que parece indicar que el abonado mineral afect en mayor medida a las abundancias

relativas de las especies dentro de la comunidad bacteriana (alterando as la estructura

de la comunidad) que a la propia riqueza especfica.

Sin embargo, para las parcelas orgnicas, la riqueza (S) y diversidad (H) de la

comunidad bacteriana edfica no presentaron diferencias estadsticamente

significativas tras 5 aos (Tabla 3.2). A este respecto, varios estudios de campo a largo

plazo, que han utilizado DGGE, s han reportado cambios en la estructura de la

comunidad bacteriana de suelos sometidos a fertilizacin orgnica. Segn estos

trabajos, su aplicacin incrementa la diversidad microbiana (Marschner et al, 2003;

Sun et al., 2004). En nuestro caso, posiblemente fuese necesario ms tiempo y/o dosis

ms altas para comprobar estos cambios.

Tabla 3.2. Efecto de los tratamientos sobre la biomasa microbiana [DNA] y diversidad bacteriana edfica (S y H). Diferentes letras en cada fila indican diferencias significativas (P

13

varias especies con idnticas secuencias de rDNA (Amann et al., 1995; Vallaeys et al.,

1997) lo que condiciona los resultados cuantitativos. Por lo tanto, las fluctuaciones

poblacionales deben analizarse de forma semi-cuantitativa (cantidades relativas

dentro de una misma muestra). Adems, los perfiles de las bandas estn sujetos a las

restricciones inherentes a las tcnicas basadas en PCR (Wintzingerode et al, 1997), por

ejemplo en una mezcla compleja de rDNAs target, las secuencias menos abundantes

no son amplificadas lo suficientemente como para ser visualizadas en bandas, por lo

que el perfil de bandas refleja los tipos de rDNA ms abundantes de la comunidad

microbiana. El ndice de diversidad calculado a partir del perfil de bandas de la DGGE

de las secuencias amplificadas del 16S rDNA es por consiguiente un valor relativo.

Sin embargo, la DGGE es una tcnica relativamente rpida, independiente de

cultivo, no requiere informacin previa acerca de la composicin de especies de la

comunidad analizada, muestra resultados en forma cualitativa y semicuantitativa, y

permite analizar varias muestras simultneamente, lo que la hace til para examinar

series temporales y dinmicas de las poblaciones microbianas (Muyzer et al., 1993).

En futuros ensayos se pretende secuenciar e identificar las bandas

caractersticas de cada tratamiento, para utilizarlas como marcadores de los cambios

originados en la poblacin microbiana edfica sometida a prcticas agrcolas

continuadas.

4. CONCLUSIONES

Los resultados del estudio muestran que la abundancia y la diversidad de la comunidad

microbiana en suelos agrcolas se ven afectadas por la fertilizacin inorgnica, al

disminuir sus valores en comparacin a suelos bajo fertilizacin orgnica. La aplicacin

durante 5 aos consecutivos de purn fresco de vacuno, en combinacin con no-

laboreo (NL+O) produjo un incremento significativo de la abundancia microbiana, sin

afectar a la diversidad bacteriana.

La DGGE presenta una visin completa de la composicin y diversidad de la comunidad

microbiana. Result ser una tcnica molecular til para analizar series temporales de

14

muestras de suelo sometidas a diversos tratamientos. Sin embargo, la heterogeneidad

propia del sistema suelo hace necesario analizar un elevado nmero de rplicas a fin

de extraer conclusiones significativas.

5. AGRADECIMIENTOS

A Iker Mijangos del Instituto Vasco de Investigacin y Desarrollo Agrario, Neiker-

Tecnalia, por su excelente gua y aporte en la realizacin del presente estudio.

6. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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7. ANEXOS

Anexo 7.1. Valores medios de la biomasa, riqueza y diversidad microbiana edfica, expresadas con la *DNA+, el nmero de bandas (S) y con el ndice de Shannon (H), respectivamente, en la parcela control a lo largo de todo el ensayo.

Muestreo Biomasa

[DNA] (ng/ml) Nmero de bandas

S ndice de diversidad

H

mayo 2005 7,8 24,0 1,7 verano 2005 9,8 23,7 1,8

verano 2006 15,4 27,3 2,0

verano 2007 13,8 30,0 2,2

verano 2008 9,8 28,7 2,0

verano 2009 9,8 27,0 1,9

Firma del director de tesis:

Dr. Carlos Garbisu