ESTUDIOS DE POBLACIONES Y SUBPOBLACIONES...
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ESTUDIOS DE POBLACIONES Y SUBPOBLACIONES
LINFOCITARIAS POR CMF
Dra. Mónica Saracco
Instituto de Investigaciones
Biomédicas en Retrovirus y SIDA (ex CNRS)
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Aplicaciones Clínicas•• AnalisisAnalisis de subpoblaciones Linfocitariasde subpoblaciones Linfocitarias
Inmunodeficiencias congénitasInmunodeficiencias Adquiridas (HIV,farmacológica)
•• OncohematologOncohematologííaa: Fenotipos de leucemias y linfomas, EMR.•• TransplantesTransplantes: Cross Match, reconstitución, inmunosupresión,•• RecuentoRecuento de de celulascelulas progenitorasprogenitoras•• AnAnáálisislisis de de CicloCiclo CelularCelular y ploidías en tumores.•• RecuentoRecuento de de reticulocitosreticulocitos.•• ActivacionesActivaciones plaquetariasplaquetarias..•• ApoptosisApoptosis•• Sorting: Sorting: Separaciónes célulares
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Morfología y Citometría
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LINFOCITOS TLINFOCITOS T LINFOCITOS BLINFOCITOS B
CCÉÉLULAS NKLULAS NK CITOQUINASCITOQUINAS
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Ciclo de multiplicación
El virus utiliza la molécula CD4 para entrar a la célula.Inserta su información genética y utiliza la maquinaria genética celular para multiplicarse y diseminar a otras células. LAS CÉLULAS SUSCEPTIBLES PERTENECEN AL SISTEMA INMUNOLÓGICO
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Desrregulación Inmune
• Alteraciones funcionales de célulasCD4
• Cambios en el Inmunofenotipo de células HIV infectadas.
• Disminución progresiva de Linfocitos T CD4+
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Pruebas de laboratorioDiagnóstico: Detección de anticuerposELISA Y WESTERN BLOT (WB)Cuando un ELISA es positivo debe confirmarse por WB
2 A 6 SEMANAS
Anticuerpos
CD4
Virus
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Paciente HIV positivo:• Carga viral en sangre • Recuento de linfocitos TCD4(ambos sirven para decisiones terapéuticas)
• Estudios de resistencia al tratamiento
Pruebas de laboratorio
CD4
Virus
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Requerimientos en Laboratorios
• Bioseguridad para el procesamiento de muestras• Contador hematológico• Citómetro de flujo• Equipos para lisis automática (no indispensable)
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FACS Count
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PIMA
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FACSCanto II
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FACSCalibur
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BD FACSAriaTM Cell Sorter : Nuevo Concepto
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Recolección de las Muestras
• Tubos Vacutainer, con K3EDTA, 5ml de sangre
• Temperatura Ambiente• Procesamiento dentro de las 48hs de la
extracción• Marcación 50 ul de sangre con 5ul MoAb,
incubación 15 minutos• Lisado de Glóbulos Rojos
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CONCEPTO DE CONCEPTO DE CUANTIFICACICUANTIFICACIÓÓNN
• Medición de células presentes en el organismo normalmente, cuyo valor relativo y/o absoluto tendrá suma importancia para la toma de decisiones diagnósticas y/o terapéuticas
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Metodologías • Plataforma Única• Puede utilizar uno o dos
tubos de marcación• Gate en Linfocitos o
CD45 vs. SSC• Utiliza Beads (10000)
permite realizar el cálculo matemático de valor absoluto
• Plataforma Doble• Puede utilizar uno o dos
tubos de marcación• Gate en Linfocitos o
CD45 vs. SSC• Siempre debe realizarse
el Hemograma para poder informar los valores absolutos
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Subpoblaciones Linfocitarias CMF
• Selección de eventos
R1
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LINFOCITOS T (CD3+) vs. LINFOCITOS B (CD19+)
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LINFOCITOS T (CD3+) vs. CELULAS NK
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Análisis de 3 colores
R1
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Density Dot Plot Contour Plot
Los colores informan la Identificación de las frecuencia de los eventos poblaciones mediante
líneas de contorno
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Recomendaciones de la CDC
• Plataforma Única• Doble Plataforma con gate en CD45• Repetición de por lo menos un MoAb• Controles Internos de Calidad• Controles Externos de Calidad• Coherencia interna de los resultados
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Porcentaje y Variabilidad en los Resultados
• Gate de Linfocitos Recuperación 95%, Pureza >90% (mínima 85%)
• La suma de CD3/CD4 y CD3/CD8 variabilidad +/- 5% máximo <10%
• Las muestras con aumento de Linfocitos (Τγδ) presentan la mayor variabilidad
• La sumatoria de poblaciones B, T, NK deberá estar entre el 95%-105% (mínimo 90%-110%)
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OBTENCIÓN DE BUENOS RESULTADOS
• CD3 menor de 50%
• CD3/CD4 + CD3/CD8menor o mayor a valores de CD3
• Evaluar estado de la muestra
• Evaluar metodología de marcación y de lisis
• Evaluar presencia de dobles positivas o dobles negativas
• Continuar estudio con CD19/ CD56+/16+
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VALORES DE REFERENCIA• VALORES EN ADULTOS
SEXO, EDAD• VALORES PEDIATRICOS desde
el nacimiento a los12 años
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Control de Calidad I
• Empleo de ensayos validados y estandarizados para obtener resultados reproducibles intra e inter-ensayo
• Manuales de procedimientos (GLP): procedimientos escritos para uso universal en los distintos laboratorios integrantes de la Red
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CONTROLES DE CALIDAD II
• INTERNOS• Flow-check CMF
• 4CL para Contador Hematológico
• Frecuencia: 3 veces por semana
• EXTERNOS• Q-ASI Program
(Canadiense)• NE-QAS (Reino Unido)• CAP (USA)• GRCF (Argentina-
Uruguay)• Frecuencia: 4 anuales
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PLATAFORMA ÚNICA
• Menos Tubos
• Mayor objetividad en la medición
• Utilización de un solo equipo
• Encarece el estudio
• Menor reproducibilidad
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DOBLE PLATAFORMA
• Requiere Hemograma
• Requiere CMF
• Controles para ambos equipos
• N° de Tubos depende del protocolo utilizado
• Mas Económico
• Mayor reproducibilidad
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PROTOCOLOS DE ANÁLISIS
• Región MorfológicaFSC vs. SSC
• Región en base a MoAb (CD45) vs, SSC
• TRI-Test CD8/CD4/CD3
• CD3/CD4/CD45• CD3/CD8/CD45
• Multi-ChekCD3/CD8/CD45/CD4
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COMPARACIÓN DE CMF Y SOFTWARE
420 (312-625)837 (650-1076)1327 (1058-1658)CLTT
182 (154-280)236 (164-330)413 (307-623)894 (677-1076)1367 (1080-1691)CL45
195 (143-302)229 (157-341)408 (315-601)883 (654-1122)1375 (1057-1724)BDDP
187 (148-299)234 (175-323)437 (298-670)898 (662-1042)1361 (1038-1717)BDSP
CD56CD19CD8CD4CD3 CMFSOFT
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TEST ESTADÍSTICO
• Los valores de correlación (Rho de Spearman) entre los distintos métodos para todos los tipos celulares oscilaron entre 0.902 y 0.987
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Muchas Gracias