Universidad Autónoma de Yucatán

Facultad de Química-Ingeniería Química

Licenciatura en Química Aplicada

Quinto Semestre

PRÁCTICA 6: “Evaluación de la eficacia de los agentes

antimicrobianos”

Asignatura:

MicrobiologíaProfesor:

Fecha de entrega: 17 de noviembre de 2016

Introducción

La prueba de sensibilidad antimicrobiana es una de las tantas armas con las que contamos en el laboratorio para ayudar a los profesionales en medicina controlar los procesos infecciosos que se desarrolla en los pacientes1.

Como un comentario adicional, hay que recordar que muchas veces, lo que se observa in vitro no correspondiente a lo observado in vivo, razón por la cual, los señores clínicos deben poner especial atención en el seguimiento clínico de su paciente. La no concordancia entre los hallazgos en el laboratorio y la respuesta del paciente a la terapia antimicrobiana, tiene diferentes explicaciones, algunas de las cuales tienen relación con el comportamiento de los microorganismos y otras con el comportamiento individual de cada paciente.

La razón fundamental de una prueba de sensibilidad es la de realizar una predicción a través de una prueba in vitro, observar la respuesta del paciente a un determinado antibiótico, la evolución de la infección y detectar una resistencia relevante del organismo que está causando este proceso infeccioso1.

Hay aún muchos agentes microbianos para los cuales la escogencia de una terapia antimicrobiana continúa siendo empírica, porque estos agentes no han desarrollado resistencia contra los antibióticos2.

Por esta razón, la prueba de sensibilidad adquiere una mayor importancia para algunas especies     bacterianas que no tienen una sensibilidad predecible. Ejemplos claros de este último tipo de microorganismos son: Staphylococcus sp., Enterococcus sp., Pseudomonas sp. y los miembros de la familia Enterobacteriaceae1.Otros organismos donde la prueba de sensibilidad, sobre todo en los últimos años, ha adquirido una gran importancia son: Streptococus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae y Mycobacterium tuberculosis3.

La técnica de difusión en agar4, es cualitativa y sus resultados se pueden interpretar únicamente como sensible, intermedio o resistente, y está diseñada específicamente para bacterias de crecimiento rápido domo los Staphylococcus sp. O los integrantes de la familia Enterobacteriaceae.

Esta técnica, el inóculo bacteriano llevado a una concentración igual a la del estándar 0,5 de McFarlane, se aplica sobre la superficie de una placa seca de agar Müeller-Hinton que tenga un pH entre 7, 2 y 7,4 medido a temperatura ambiente y una vez solidificado el medio de cultivo. La cepa se debe rayar sobre la superficie del medio de solidificado el medio de cultivo. La cepa se debe rayar sobre la superficie del medio de forma tal que se logre un crecimiento confluente4.Una vez realizado esto, en un plazo no mayor de 15 minutos, se procede a colocar los discos o las pastillas con el antibiótico. Si se emplean placas de petri de 100 mm de diámetro, el número máximo de discos a colocar es de 52.

Luego, la placa se incuba a 35ºC en aire ambiente y por un periodo no mayor a las 18 horas excepto para los aislamientos deStaphylococus sp y Enterococcus sp, para los cuales se recomienda una incubación de 24 horas, principalmente para lograr una mejor detección de la resistencia a la oxacilina y a la vancomicina4. Cada plato es observado en una luz indirecta y cada halo de inhibición es medido utilizando un caliper o en su defecto una regla

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graduada en la forma adecuada. En el caso de que no se presente un halo, no se debe reportar Omm, se debe reportar 6 mm, ya que ese es el diámetro del disco.

Los diámetros alrededor de cada disco son medidos y su interpretación se basa en guías publicadas cada cierto tiempo, por la NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) y el organismo es reportado como sensible, intermedio o resistente al antibiótico testado (2,  3 , 4). Cada antibiótico tiene su halo de inhibición específico y éste depende del tamaño de la molécula del     antibiótico y su polaridad; de esta manera, un antibiótico con un peso molecular bajo como la penicilina, tendrá mucha capacidad para migrar, por lo tanto su halo, en el caso de una cepa sensible tendrá un diámetro muy amplio. En el caso de la vancomicina, que tiene una molécula muy grande y muy hidrofóbica, su halo de inhibición será muy pequeño. De esta manera, no se puede afirmar, que para una cepa determinada, ésta es más sensible a la penicilina que a la vancomicina, sólo porque el primero tenga un halo de inhibición mucho mayor4.

La técnica de difusión en agar, presenta varias ventajas: es fácil de efectuar y de gran reproducibilidad, posee bajo precio y no requiere equipo especial1. Dentro de sus desventajas está el hecho de que brinda sólo información  cualitativa. Otra desventaja y la más importante, es que esta técnica debe ser modificada para poderla emplear en organismos fastidiosos o de crecimiento lento3.

Organismos con Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoecae, Streptococcus pneumoniae y Moraxella catarrhalis, necesitan de una técnica de difusión modifica, modificación que se hace principalmente en el periodo de incubación, en el medio de cultivo a emplear, en la atmósfera de incubación y en la preparación del inóculo1. Para Haemophilus influenzae, lo recomendado es poner a crecer al organismo en un agar chocolate suplementado, preparar el inóculo en un caldo de Müeller-Hinton o solución salina estéril al 0,9%, realizar la prueba de sensibilidad sobre el agar HTM e incubarlo a 35ºC por 16 a 18 horas en una atmósfera de 5 a 7% de CO21.

Para Neisseria gonorrhoecae se debe utilizar agar base GC suplementado (4) y para Streptococcus pneumoniae agar sangre al 5% y que tenga Müeller-Hinton como base. Para ambos, la incubación debe ser un poco más prolongada que para H. Influenzae (20 a 24 horas), manteniendo el resto de condiciones igual (35ºC y 5 a 7% de CO2)1. Para estos agentes fastidiosos, existen guías propias de la NCCLS que se emplean para conocer si las cepas se reportan como sensible, intermedio o resistente4.

En especial, para el caso del Streptococcus pneumoniae, lo recomendado es el empleo de un disco de oxacilina de 1 ug de potencia. Una vez incubado por 24 horas, si el halo encontrado es menor de 20 mm, la cepa se considera resistente y debe ser confirmado realizando una prueba más específica que nos informe hasta dónde llega esa concentración1. Para esto se hace una CMI, ya sea por microtitulación o por la técnica del E test1.

Por el contrario, si el halo de inhibición es mayor de 20 mm, se considera que la cepa es sensible a la penicilina, con una concentración mínima inhibidoria menor de 0,006 g/ml1.

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Objetivos:

Identifica las técnicas microbiológicas comúnmente utilizadas en la evaluación de agentes antimicrobianos sobre cepas bacterianas y observa la respuesta frente a diferentes tipos de compuestos.

Materiales y métodos:

Lista de materiales

Puntas estériles para micropipeta de 1000 µLPuntas estériles para micropipeta de 100 µL8 tubos con 9 mL de solución salina isotónica estérilPapel estraza, Algodón BenzalMarcador indelebleCultivos de 12 h de los siguientes microorganismos: Salmonella enteritidis, Candida albicans.

Equipo Mechero bunsen

Incubadora a 37 ºCSoluciones de: ampicilina y ketoconazol con 100, 1500 y 5000 μg/mL.Soluciones de desinfectante comercial de verduras o para limpieza: 1:10, 1:100 y 1:1000

Diagrama ecológico

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Resiudos

Guantes de nitrilo, cubrebocas

Residuos Biológicos

Peligrosos e Infecciosos

Sanitas, papeles de limpeza

Residuos Inorgánicos

Metodología

En condiciones asépticas, se prepararon dos cajas de Petri con 20 -25 mL de AN en Agar Müeller-Hinton, con cepas de Salmonella enteriditis y un agar de papa dextrosa con una cepa de Candida albicans. Se dividió la base de cada caja en cuatro cuadrantes para identificar las concentraciones a probar. Se introdujo un hisopo estéril en la suspensión de la cepa correspondiente y se sembraron las placas mediante la técnica de estriado continuo. Tras hacer este, mediante pinzas esterilizadas, se tomó un disco de papel filtro que se sumergió en agua destilada estéril y se deja escurrir. Se colocó en el centro del cuadrante “control”, asegurando el contacto del disco sobre el agar. Se sumergieron otros discos de papel en las diferentes concentraciones de los antibióticos el mismo procedimiento para cada una de las cepas y diluciones correspondientes de cada agente. Se incubaron las placas a 37°C durante 24 horas. Después de ese tiempo, se sacaron las cajas Petri, y se observaron los resultados. Se retiraron con la pinza de disección los discos y se el diámetro (mm) de las zonas de inhibición del crecimiento microbiano en relación al control.

Resultados y discusiones

En total se realizaron tres experimentos con tres muestras de cajas Petri debido a la falta de tiempo. Las pruebas que se realizaron, así como el tipo de microorganismo y el agar en que se cultivó, se enlistan a continuación:

En Agar Müeller-Hinton, se cultivó una muestra de Salmonella enteriditis, en esta prueba se utilizó desinfectante como agente microbiano.

En otro Agar Müeller-Hinton, se cultivó otra muestra de Salmonella enteriditis, para esta prueba se utilizó ampicilina como agente microbiano.

En agar papa dextrosa, se cultivó una muestra de Candida albicans, para esta prueba se utilizó ketoconazol como agente microbiano

No se obtuvieron en el experimento los resultados deseados, esto se debe a que durante el procesos de colocación de los discos, éstos no se agitaron mientras estaban sumergidos en los agente. Esto provocó que algunos diámetros halos de inhibición no tuvieran un diámetro, distinguiéndose más en las pruebas con desinfectante y ampicilina. Por lo que los resultados obtenidos, no necesariamente reflejarían el comportamiento de estos agentes con respecto a las cepas en donde se colocaron.

Cantidad de agente antimicrobiano (desinfectante)

Diámetro de inhibición

1:10 4 cm

1:100 3 cm

1:1000 2.8 cm

Tabla 1. Medidas de diámetro de inhibición por cantidad de desinfectante

En la Tabla 1, se observa que los resultados de los diámetros de inhibición del dsinfectante 5

fueron concordes a lo que se estimaba, siendo más grande aquél a una concentración mayor de desinfectante. En la Figura 1, se observa la muestra trabajada con el desinfectante, y es posible notar un halo de inhibición, en los cuadrantes respectivos, sin embargo, estos halos no se encuentran completamente libres de microorganismos. En base a estas observaciones, se puede concluir que la cepa tuvo un comportamiento intermedio de resistencia.

Figura 1. Halos de inhibición del desinfectante en agar Müeller-Hinton en una cepa de Salmonella entérica.

Se comparó el experimento con un estudio de la calidad sanitaria del pollo crudo que caracterizaba fenotípicamente las cepas aisladas de Salmonella enterica. Los resultados de este estudio permitieron evidenciar que todas las cepas de Salmonella aisladas fueron inhibidas por los tres desinfectantes probados (hipoclorito de sodio, bromuro de lauril-dimetil-bencilamonio y ácido acético), incluso a diluciones mayores a las utilizadas rutinariamente. Por lo tanto, la utilización de estos desinfectantes a las concentraciones adecuadas, conjuntamente con buenas prácticas en la manufactura de los productos avícolas, podrían disminuir la carga microbiana y, eventualmente, evitar los problemas de contaminación cruzada con Salmonella spp., entre otros enteropatógenos5. Esto evidenció que  la utilización de desinfectantes en los protocolos de higiene y saneamiento en las industrias o comercio de alimentos, ayudarán a contener y minimizar la selección, transmisión y diseminación de genes de resistencia en la población bacteriana6.

Cantidad de agente antimicrobiano (ampicilina)

Diámetro de inhibición

100 2 cm

1500 3.4 cm

5000 3.7 cm

Tabla 2. Medidas de diámetro de inhibición por cantidad de ampicilina

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En la prueba con ampicilina, los resultados no fueron tan claros como en el anterior experimento. En este caso, en la Tabla 2 se nota la escasa variación de los diámetros, sobre todo entre 1500 y 5000 g/ml. En la figura 2 se observa la presencia de halos, pero no son tan visibles como en la prueba con desinfectante. Cabe resaltar el halo de 100 g/ml, en el que apenas se logró distinguir la silueta del halo. Con estas observaciones, se concluye que la cepa tuvo un comportamiento resistente a la adición de ampicilina.

Figura 2. Halos de inhibición de la ampicilina en agar Müeller-Hinton en una cepa de Salmonella entérica.

Se comparó el experimento con un estudio en el que se obtuvieron un total de 68 aislados de Salmonella entérica provenientes de bovinos, equinos, cerdos, gaviotas y alimentos, de los que se puso a prueba la ampicilina entre otras técnicas. Los resultados fueron de alta resistencia a dichos agentes microbianos. Algunos de estos compuestos, junto a las tetraciclinas, han sido utilizados por décadas en la producción animal, ya sea como profilaxis o con fines terapéuticos, y en tratamiento de infecciones humanas por lo que su resistencia está ampliamente difundida7. Es por esto que estos tratamientos en la actualidad son poco efectivos, como por ejemplo el uso de amoxicilina en personas8.

Cantidad de agente antimicrobiano (ketoconazol)

Diámetro de inhibición

100 No se detectó halo.

1500 No se detectó halo

5000 2 cm

Tabla 3. Medidas de diámetro de inhibición por cantidad de ketoconazol

La prueba con ketoconazol en agar papa dextrosa arrojó resultado negativos. En la Tabla 3 se indica la presencia de un solo halo en el cuadrante con mayor concentración (5000

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g/ml). Estos datos se confirman analizando la muestra que se presenta en la Figura 3, donde apenas se aprecia la presencia de un solo halo en el cuadrante que indica la tabla. Con estos datos (se considera el factor anteriormente mencionando que afecto el rendimiento del agente), se establece que la cepa fue resistente ante el ketoconazol.

Figura 3. Halos de inhibición del ketoconazol en agar papa dextrosa en una cepa de Candida albicans.

Se comparó con un estudio de Candida, cultivada en Sabouraud 0.5 %, a 37 ºC por 24 horas, con Micostatin a una concentración de 5000 mg/l como control positivo, El crecimiento de C. albicans en las diferentes cajas de agar pasada la exposición al extracto es en algunos casos nulo, mientras en otro a pesar de ser visualmente perceptible la disminución en el crecimiento, son aún incontables el numero de colonias presentes, lo cual el porcentaje de inhibición presentado es un estimativo próximo al valor real, tras el recuento de las cajas. Se realizaron pruebas de actividad antifúngica realizadas a través diferentes especies de melastomatáceas y una especie de rubiácea concluyéndose que había actividad antifúngica comparada con Micostatin al 2% contra Candida albicans9.

Conclusión

Debido al factor que afectó la prueba, ninguno de las tres pruebas fue capaz de actuar efectivamente sobre la cepa del microoganismo, sin embargo, eso no significa que los agentes estudiados sean ineficaces. Un mejor procedimiento posiblemente permitirá la obtención de resultados más eficientes, que permitan entender de manera más acertada, el comportamiento de estos agentes microbianos sobre las cepas de distintos microorganismos.

Referencias

1. Jorgensen J. & Sahm D. Antimicrobial Susceptibility Testing: General Considerations. In: Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. Eds: Murray P., Baron E., Pfaller M et al.: American Society of Microbiology. Washington D.C., 1995.        

2. Doern G.: Susceptibility tests of fastidious bacteria. In: Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. Eds: Murray P., Baron E., Pfaller M. et al.: American Society of Microbiology. Washington D. C., 1995

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3. Jorgensen J. & Sahm D. Antimicrobial Susceptibility Testing: General Considerations. In: Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. Eds: Murray P., Baron E., Pfaller M et al.: American Society of Microbiology. Washington D.C., 1995.        

4. Woods G. & Washington J.: Antibacterial Susceptibility Tests: Dilution and Disk Diffusion Methods. In Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. Eds: Murray P., Baron E., Pfaller M. et al.: American Society of Microbiology, Washington D.C., 1995.    

5. Boscán L, Arzálluz A, Ugarte C, Sánchez D, Díaz D, Wittum T, et al. Aislamiento de salmonellas de importancia zoonótica en vísceras de pollo beneficiados en el estado Zulia, Venezuela. Rev Cientif FCV-LUZ. 2005;15:576-82.

6. 4. Organización para la Agricultura y la Alimentación. FAO. Inocuidad y calidad de los alimentos. Buenas prácticas y garantía de calidad. 2008. Fecha de consulta: 21 de febrero de 2009. Disponible en: http://www.fao.org/ag/agn/agns.        

7. Breuil J, Brisabois A, Casin I, Armand-Lefevre L, Frémy S, Collatz E. Antibiotic resistance in Salmonellaeisolates from humans and animáis in France: comparative data from 1994 and 1997. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2000; 46: 965-71.

8. Gebreyes WA, Altiera C. Molecular Characterization of Multidrug-Resistant Salmonella entérica subsp. entérica Serovar Typhimurium Isolates from Swine. Journal Of Clinical Microbiolog 2002; 40 (8): 2813-22.      

9. Catalán, Alfonso; Pacheco, Juan G.; Martínez, Alejandra; and Mondaca, Maria A. In vitro and In vivo activity of Melaleuca alternifolia mixed with tissue conditioner on Candida albicans. En: Catalán et al; March 2008; Concepción, Chile   

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