Trabajo Práctico Nº IV:

ENZIMAS: ENSAYO CUANTITATIVO

OBJETIVOS

Analizar la variación de la actividad enzimática de lafosfatasa alcalina de suero sanguíneo en función de laconcentración de sustrato.

Establecer las condiciones adecuadas para que ladeterminación de la velocidad de reacción seaproporcional a la concentración de enzima.

Determinar la actividad enzimática específica.

Afianzar los conceptos sobre condiciones óptimas demedida de la actividad enzimática en fluidos biológicos otejidos como herramienta para el diagnóstico de muchasenfermedades.

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v = - [S] = [P] ; unidades: moles [S] o [P]

t t min

Ensayo cualitativo: Indica presencia o no de Ez. Se verifica la

aparición de P ó desaparición de S.

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Ensayo cuantitativo: Generalmente imposible determinar cantidad

absoluta de Ez (mg o moles). Depende del grado de pureza. Se mide la

velocidad de reacción que será proporcional a [Ez], si [S] saturante.

Unidad Internacional Enzima: cantidad de enzima capaz de

transformar 1 mmol S / min

Actividad Específica: Actividad enzimática (medida en condiciones

de Vmax) en relación al contenido de proteínas. Depende del grado de

purificación de una enzima.

Se expresa en: Unidades Enzimáticas / mg proteína

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Cuando la enzima actúa a su máxima velocidad.

Optimizando condiciones del medio

pH, temperatura, cofactores y …

[S] saturantes

La medida de la actividad enzimática se refiere a la capacidad de la catálisis en condiciones óptimas…?

Cuando la [S] no es saturante …?

la velocidad de la reacción enzimática V0 depende de la [S] cinética de saturación

Para enzimas Michaelianas: ecuación de Michaelis-Menten:

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Vmax[S]

Km + [S]V0 =

Constantes cinéticasKm (constante para cada enzima): Es la [S] en la que la V0 = ½ Vmax. Medida inversa de la afinidad del enzima por S. Vmax (constante para cada concentración de enzima): Se alcanza cuando todos los centros activos están ocupados con sustrato.

Los valores de Km y Vmax

se pueden estimar a partir

del gráfico de V0 vs. [S],

aunque calcularlos a partir

de este gráfico no es fácil.

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Una forma más exacta para calcular las constantes cinéticas es utilizar la transformación lineal de Lineweaver-Burk: 1/V0 vs. 1/[S]

Se obtiene una recta en la cual:

La pendiente es Km/Vmax

La abscisa al origen es - 1/Km

La ordenada al origen es1/Vmax

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Determinación cuantitativa de la actividad fosfatasa alcalina

La fosfatasa alcalina tiene una baja especificidad de sustrato porlo que es capaz de hidrolizar una amplia variedad de fosfoésteresorgánicos.

El aceptor del fosfato liberado por acción de la enzima puede sercualquier solvente que contenga un grupo –OH, habitualmente unamolécula de agua:

R-O-PO32- + H-O-H R-O-H + H-O-PO3

2-

Fosfatasa alcalina:

pH óptimo altamente básico.

Múltiples isoformas

Presente en muchos tejidos

Valores sanguíneos se alteran fundamentalmente en procesos que afectan el sistema hepatobiliar o el tejido óseo

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FUNDAMENTOS DEL MÉTODO

La fosfatasa alcalina desdobla al fenilfosfato de sodio en medio alcalino tamponado con aminometil propanol (AMP).

El fenol liberado se determina por reacción con 4-amino-antipirina y ferricianuro como agente oxidante.

El color desarrollado es directamente proporcional a la actividad enzimática y se mide a 520 nm.

H

+ PO4HNa2

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H2O

4-amino-antipirina ferricianuro

520 nm

Procedimiento Experimental

a) Curva de calibración

Standard solución de fenol: 50 ml equivalente a 200 UI/L.

1UI = Cantidad de enzima que cataliza la formación de

1 mmol de Producto/min

TuboEstandar,

mL

Buffer,

mL

Reactivo

color, mL

Absorbancia

520 nm

Abs.

corregida

UI/L

1 0 500 2,5 0,004 0 0

2 10 490 2,5 0,149 0,145 40

3 25 475 2,5 0,187 0,183 100

4 50 450 2,5 0,265 0,261 200

5 75 425 2,5 0,342 0,338 300

6 100 400 2,5 0,411 0,407 400

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Calcular el factor como la inversa de la pendiente de la recta de calibración

Curva de calibrado

y = 0,0007x + 0,1131

R2 = 0,9993

y = 0,0009x + 0,0662

R2 = 0,929

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 50 100 150 200 250 300 350 400

U I / L

Ab

s c

orr

eg

ida

sin 0 con 0 Lineal (sin 0) Lineal (con 0)

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b) Variación de la actividad enzimática en función de la [S]

Tubo Sustrato Buffer Suero Absorbancia

mM ml ml

Preincubar

en baño de

agua a 37°C

unos

minutos.

Luego

agregar:

ml

1A 0 0 0,5 0

2B 0 0 0,5 50

3 2.8 0,5 0 50

4 5.6 0,5 0 50

5 11.2 0,5 0 50

6 16.8 0,5 0 50

7 22.4 0,5 0 50

8 25.2 0,5 0 50

9 28 0,5 0 50

10C 5.6 0,5 0 0

11C 28 0,5 0 0

- Iniciar la reacción con el agregado de enzima en forma secuencial.

- Incubar a 37ºC durante 10 minutos exactos (usar cronómetro).

- Agregar 2,5 ml reactivo de color, retirar del baño termostatizado y agitar.

- Leer Absorbancia 520 nm frente a blanco de agua destilada (color de la

reacción estable 30 minutos).Explicación TP IV Química Biológica Pag. 12

TuboSustrato,

mM

Absorbancia

520 nm

Absorbancia

corregida

Formación de

producto total, UI/l

Activ. fosfatasa

alcalina, UI/l

1A 0

2B 0

3 2.8

4 5.6

5 11.2

6 16.8

7 22.4

8 25.2

9 28

10C 5.6

11C 28

1 Abs. corregida = Abs. muestra – (Abs. blanco reactivos + Abs. blanco muestra)

2 Formación Producto total = P formado por hidrólisis química + P formado por

hidrólisis enzimática)

3 Activ. Fosfatasa = Formación Producto total - P formado por hidrólisis química (para

cada concentración de sustrato)

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Blanco de reactivos

Blanco de muestra

Blancos de reacción, para descontar hidrólisis

química (no enzimática) del sustrato

Formación de producto (UI/L) = factor x Abs. corregida

10C y 11C Para descontar la hidrólisis química (no enzimática,

blanco de reacción) del sustrato.

Como la [S] varía entre tubos, se procede a realizar una curva

de velocidad de hidrólisis química con ambos valores más el

cero y se interpola el valor para cada concentración de sustrato

S

P

P

+ EES

Velocidad de

hidrólisis química

Hidrólisis total

Actividad fosfatasa alcalina

0

40

80

120

160

200

240

280

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

[FFNa], mM

Acti

v.

UI/

l

Representar en un mismo gráfico:

- hidrólisis química

- hidrólisis total: hidrólisis química + hidrólisis enzimática

En función de la [S], especificar unidades

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Transformación lineal

y = 0,0105x + 0,003

R2 = 0,9935

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0,014

0,016

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

1/[S] mM-1

1/V

(U

I/l)

-1

con S 28 mM sin S 28 mM Lineal (sin S 28 mM)

Calcular a partir del gráfico: Km y Vmax

Con valor de [proteínas]/ml suero calcular Actividad específica….?

Explicación TP VI Química Biológica Pag. 16