Presentacin de PowerPoint

UNIVERSIDAD ALAS PERUANAS - FILIAL CUSCO FACULTAD DE MEDICINA Y CIENCIAS DE LA SALUDESCUELA DE TECNOLOGIA MEDICA

CURSO: CITOGENETICA CLINICA

DOCENTE: Blgo. Benjamn Cceres Cusi

INTEGRANTESZANDRA YANETH ROMERO CUYSOMARIA LUISA ARIZABALCYNTIA RONDAN RODRIGUEZ

HISTORIA

Ya desde principios del 1900 se aceptaba la idea de que el material hereditario estaba contenido en los cromosomas; hiptesis que fue confirmada por los experimentos de Boveri en erizo de mar y de Sutton en saltamontes en 1902.Hacia mediados del siglo XX diversas publicaciones pretendan demostrar que la especie humana contiene 48 cromosomas en sus clulas somticas y muchas ms basaban sus experiencias en dicha afirmacin que era universalmente aceptada. Durante tres dcadas la comunidad cientfica persever en el error hasta que en 1956 Tjio y Levan demostraron sin ambigedad que las clulas somticas humanas normales contienen 46 cromosomas. Independientemente, en el mismo aoCITOGENTICALa citogentica es el campo de la gentica que comprende el estudio de la estructura, funcin y comportamiento de los cromosomas. Incluye anlisis de bandeado G en cromosomas, otras tcnicas de bandeado citogentica, y tambin la citogentica molecular de hibridacin por fluorescencia in situ (FISH) e hibridacin por genmica comparativa (CGH).

Tcnicas en citogenticaCitogentica Convencional

Estudio citogentica convencional de las neoplasias hematolgicasEn SP y MOCitogentica: Estudio de los cromosomas de las clulas hematopoyticas en su fase de mxima concentracin (metafase)Cariotipo: Ordenacin de los cromosomas en 22 parejas de cromosomas autosmicos y una pareja de cromosomas sexuales.

VentajasEn un solo experimento, analizamos todo el genoma celular, con informacin de todos los cromosomasBajo coste econmicoDisponibilidadAlteraciones cromosmicas numricas y estructuralesSignificacin clnica establecidaInconvenientesRequiere cultivo de tejido frescoAnaliza clulas slo en divisinLenta en tumores slidos (2 semanas), aunque en neos hematolgicas, se puede en 24-72hPrecisa personal experimentadoBaja sensibilidadPoco poder de resolucin en alteraciones cromosmicas complejas, microdelecciones, MuestrasMdula sea extrada mediante puncin esternal o de cresta ilaca, en un tubo estril de heparina sdicaSangre Perifrica extrada en un tubo de 10ml de heparina sdicaBiopsia ganglionar guardada en un tubo con medio de cultivoIntentar mximas condiciones de asepsia!

SiembraEn primer lugar, se realiza la siembra de los cultivos en condiciones estriles en la cmara de flujo laminarSe siembran 0.5 ml en dos Falcons de cultivo estril (preparados con 10ml de caldo de cultivo a -20C)Segn dx de la muestra, se cultiva 24-72h, con o sin TPA

TPA: Phorbol 12-myristate 13-acetate, mitogeno q estimula el crecimiento celularCamaras con aire libre de particulas y de contaminantes

8Orientacin DiagnsticaTipo de MuestraTipo de CultivoMitgenos[ ] y tiempo de ColcemidSMDM o SP24/48h24h + MTX____________(0,1g/ml)30SMPCM o SP24/48h24h + MTX____________

(0,1g/ml)30LAMM o SP24/48h24h + MTX____________

(0,1g/ml)30LALM o SPDirecto/24h____________ (0,1g/ml)2 hSLPC/LNHSP o M72hTPA (estimulacin de lnea B)PHA (estimulacin de lnea T)(0,15g/ml) 2hSLPC/LNHGanglio/bazo/ exudado/masa tumoral24h: Sin estimulacin celular48/72h: Con mitgenoTPA/PHA(0,1g/ml)20 (sin estimular)(0,15g/ml) 2h (estimulado)MMM48/72h: Sin estimulacin120h: ConIL-4(0,1g/ml)20El MTX es un antagonista del cido flico que bloquea la sntesis de ADN en la fase S, bloqueando por tanto el ciclo celular.9Sacrificio de los cultivosAadir 0.1 ml del antimittico Colcemid y se deja en estufa de CO2 a 37C durante30 las mieloblsticas (LAM, LMC, SMD, SMPC)2 las linfoblsticas (SLPC, LNH)Pasamos el contenido a un tubo de centrfuga, y lo centrifugamos 10 a 1200 rpmPosteriormente, decantamos el sobrenadante, dejando el botn (pellet) y resuspendemosChoque Osmtico: 8 ml de ClK 0.075M gota a gota, agitando, y lo dejamos 30 al bao mara (37C)Las condiciones del cultivo : temperatura, humedad atmosfrica y niveles de CO2 son caractersticos de cada lnea celular. El nivel de CO2 se establece para mantener el equilibrio carbonato-bicarbonato en el medio de cultivo, habitualmente al 5%.Las metafases se obtienen utilizando colcemid, que acta sobre el citoesqueleto, impidiendo que polimericen, por lo que no se forma el huso mittico, y este es el motivo por el cual las clulas permanecen en metafase10Sacrificio de los cultivosCentrifugamos, decantamos, y se aaden 5ml del fijador Carnoy (metanol:cido actico 3:1) agitando. 10 a temperatura ambienteRepetimos el paso anterior, dejando 30 en neveraCentrifugamos, decantamos, y aadimos 1ml de Carnoy Resuspendemos y pasamos a un tubo NUPEl Carnoy tiene que estar recin preparado11PortaobjetosPorta previamente guardado a 4C con metanol. Secamos, cubrimos con fijador (Carnoy) y mientras decantamos se tiran 1 2 gotas de la preparacin. Se flamea y se deja secarMiramos en microscopio invertido para ver la densidad celular y la extensin de los cromosomasSe hacen 4 extensiones de cada cultivo24h en estufa de desecacin a 60C, para envejecer

El metanol es para desengrasar.12PortaobjetosPara la tincinSolucin de tripsina 12 segundosLavamos con PBS 2 segundosGiemsa al 5% 5 minutosLavar y mirar al microscopioSe cubrenTripsina: Proteasa que rompe las uniones intercelularesBuscas una metafase, miras como estn los cromosomas y ves si tienen bandas y no estn deflecados.Si ok, hacer el resto, y dejar secar al aire. Si deflecados, reducir el tiempo de tripsina 1 segundo cada vez.Si no se ven las bandas, aumentar el tiempo de Giemsa 1 minuto cada vez.*2 Eliminando burbujas con la punta de una pipeta13

Leucemias agudasMomentoCultivoCariotipoFISHLAMDx2x24h + ADN + ARN + Criopreserv.SCYTOCELLEvolucin2x24hSConsultarPre/Post Tx2x24hSConsultarLAM INFANTILDx2x24hS7, 8, MLLLAM (da sig.)Dx24h + 48hSCYTOCELLLAPDx1x24h + 1x48hSPML/RARRecada1x24h + 1x48hSPML/RAREvolucin1x24h + 1x48hConsultarConsultarLALDx - Adultos2x24hSBCR/ABL + MLLDx - Nios2x24hSBCR/ABL + MLL + TEL/AML1 + E2AEvolucin2x24hSConsultarPre/Post Tx2x24hConsultarConsultarTodo en Mdula sea15SMD y SMPCMomentoCultivoCariotipoFISHSMD *Dx2x24hS5q-Evolucin2x24hSConsultarPre/Post Tx2x24hSConsultarSMPCDx2x24hSBCR-ABL (SP)Evolucin2x24hSConsultarLMCDx2x24hSBCR-ABL (SP)Evolucin2x24hSBCR-ABL (SP)LMMCDx2x24h + ADN + ARNSPDGFR y * + BCR-ABLEvolucin2x24hSNoO pancitopenia, o bicitopenia, o displasia*(5q32)* Receptor alfa/beta del factor de crecimiento derivado de las plaquetas16SLPCMomentoCultivoCariotipoFISHSLPC-BDx2x72h + TPANoFISH LLC + IgHLLCDx2x72h + TPANoFISH LLC + IgHSLPC-TDx2x72h + PHANoFISH LLC + IgHLINFOMASMomentoCultivoCariotipoFISHMantoDx2x72h + TPANoBCL-1FolicularDx2x72h + TPANoBCL-2No definidoDx2x72h + PHANoIgHHodkingNoNoNoOTROSMomentoCultivoCariotipoFISHAnemia AplsicaDx2x24hS7q-Fragilidad CromsomicaDx2x72h + PHA2x72h + DPB2x72h + 10 MTC2x72h + 40 MTCSNoFish LLC: CEP12, ATM, D13S319/S25, p53, IgHO pancitopenia, o bicitopenia, o displasia* (5q32)17Tcnica de fishFISHComplemento de la tcnica de citogenticaHibridacin in situ: Marcar o identificar una secuencia de ADN con una sonda especfica que reconoce dicha secuenciaSonda: Secuencia de ADN marcadas con un fluorocromo, especficas, que reconocen una determinada secuencia del genomaFISHAlteraciones cromosmicas numricas y estructurales tanto en clulas que no entran en divisin (interfase) como en clulas en divisin (metafase)La mayora de los dx hematolgicos se asocian a una alteracin citogentica determinadaConfirmacin de dx clnicos, caracterizar grupos pronsticos y realizar monitorizacin de EMRValoracin del quimerismo hematopoytico tras el trasplante de mdula sea alognico cuando existe discrepancia de sexo entre donante y receptorEl estudio cromosmico de las neoplasias hematolgicas aporta informacin necesaria para caracterizar determinados casos clnicos. 20FISHMenor S que otras tcnicas molecularesIdentificacin de anomalas cromosmicas crpticas o difciles de detectar para la citogentica convencionalPor el hecho de permitir identificar mutaciones en interfase, simplifica el procesamiento de la muestra al no requerirse cultivoTcnica sencilla y rpidaEn determinados casos, en 4-5h se puede tener un dxUna clula normal puede mostrar el patrn de hibridacin de una clula tumoral. Por ello hay q calcular el error intrnseco, con 10-20 muestras de individuos sanos. Se ve el patrn d ehibridacin que genere la sonda utilizada en clulas normales y anormales. Cuanto ms complejor es el patrn de la clula afecta, ms improbable ser que se produzca por azar en una clula normal.21FISHPuede aplicarse en clulas depositadas en un portaobjetos de microscopia (frotis convencional, impronta de tejido, citocentrifugacin) hasta cortes de tejido incluidos en parafinaSe ha usado esta tcnica para muestras en parafina almacenadas durante aos (hasta 12) a t ambienteTcnica de eleccin (por delante de la PCR) para bsqueda de translocaciones que involucran a genes promiscuos, y para delecciones en MM, LLC Reordenar con varios genes, Como MLL o IgH22VariantesVariantes tecnolgicasHibridacin genmica comparada (CGH)Cariotipo espectral (SKY-FISH)Multiplex FISH (M-FISH)

Aplicaciones crecientes

Variantes (M-FISH y SKY-FISH)Consisten en marcar el ADN de cada cromosoma con un fluorocromo con espectro de emisin nico y diferenciable de lo demsSe pinta a cada cromosoma de un colorLos cromosomas anmalos aparecern no uniformestil en neos hematolgicasCaracteriza correctamente translocaciones complejas y crpticas

Ventajas (M-FISH y SKY-FISH) Permiten analizar todo el genomaEnorme poder de resolucinIdentificacin de segmentos cromosmicos no identificados (gran avance en el conocimiento de los genes implicados en patologas)Inconvenientes (M-FISH y SKY-FISH)Requieren cultivo de tejido frescoAnalizan slo clulas en divisinPersonal experimentado tanto en la realizacin como en la interpretacinSensibilidad similar al cariotipo, aunque la informacin sea ms concluyenteNo detectan delecciones, inversiones o duplicaciones dentro de un cromosomaElevado coste econmicoEquipo informtico sofisticadoPor el momento, slo se usa en investigacin26MuestrasPreparaciones de citogentica convencional tras cultivo de mdula sea, sangre perifrica, ganglio u otros tejidosLa muestra obtenida de estos cultivos se conserva en solucin CarnoyTambin es aplicable a extensiones en fresco de muestras biolgicasPreparacin Da 1Extensiones: Eppendorf (donde se ha guardado el material de citogentica convencional) del congelador a -20C, se centrifuga, se decanta, y se resuspende con fijador nuevoUna gota en un porta previamente tratado con metanol y secar a la llama o con plancha a 40-50CObservar extensiones en microscopio invertido a x10 aumentos para ver la distribucin de ncleos y el secadoGuardar a T ambiente 24hSi la muestra es urgente, se puede hibridar en el mismo da, dejando al menos 1h en temperatura ambiente* Rotular siempre en la banda esmerilada las iniciales del paciente y la sonda que se hibrida28Hibridacin - Da 2En oscuridad7 l de tampn1 l de sonda2 l de agua destilada

Se colocan en el porta, tapar con un cubre y colocar en el Hybrite e incubar segn cada sonda (24h normalmente)T ambienteEppendorf estril

Antes de comenzar, Sacar del congelador los tubos de las sondas y el buffer que vayan a emplearseDar un golpe de centrfuga a los tubos de la sonda y el buffer. Encender el cohibridador (Hybrite, Vysis) y seleccionar el programa adecuado. Aadir tiras de papel secante humedecidas.29Lavado y contratincin - Da 3En oscuridadLavado post-hibridacinRetiramos cubre, lavamos 2 en un bao a 74C con una solucin de lavadoPosteriomente, lavamos 1 en una solucin de lavado a distinta concentracin y a temperatura ambienteContratincinPoner 10 l de DAPI II y cubrirPoner a -20C en una caja oscura, envueltas en papel de aluminio, como mnimo 30-1

Microscopio de FluorescenciaSondas centromricas: Mnimo de 200 ncleos, con los ncleos con 1, 2, 3 4 seales de hibridacinTrisoma: Si >5% de clulas con 3 sealesMonosoma: Si >15% con 1 sealSondas de locus especficos: Valorar mnimo de 100 ncleos o de 20 metafasesValorable si >5% de clulas alteradas

Estos resultados varan segn S y E de la sonda empleada31

T(9;22)32GRACIAS