Genética y genómica de los desórdenes hematológicos

Índice Leucemias

Clasificación Aberraciones cromosómicas

Rearreglos cromosómicos Desregulación génica

Desequilibrios cromosómicos Ganancia de función Pérdida de función

Herramientas genómicas Perfil de expresión génica Microarreglos

Aplicaciones Diagnóstico Pronóstico

Genómica

cancers are typically initiated by acquired alterations to the genome of the cancer cell, such as chromosomal translocations, mutations, and deletions.

The diagnosis of the hematologic cancers is commonly based on morphologic evaluation supplemented by analysis of a few molecular markers.

Leucemias Grupo heterogéneo de desórdenes

neoplásicos de los leucocitos. De acuerdo a su origen se clasifican en:

Mieloides Linfoides

De acuerdo a su evolución (sin Tx.) Agudas Crónicas

Leucemias Leucemia linfocítica crónica (LLC): expansión monoclonas

de linfocitos (95% linfos B).

Leucemia linfoblástica aguda (LLA): Desorden monoclonal

maligno de los precursores linfopoyéticos.

Leucemia mieloide crónica (LMC): proliferación no

controlada de granulocitos

Leucemia mieloide aguda (LMA): Trastorno de los

precursores de celulas hematopoyéticas. De acuerdo al

sistema francés- americano-británico se sub-dividen en 6

grupos.

Etiología

La causa de la expansión clonal no se conoce

totalmente.

Involucra algunos re-arreglos de ADN. Factores externos: agentes alquilantes, medicamentos,

radiaciones ionizantes y substancias químicas.

Factores internos: Anormalidades cromosómicas que

dan lugar a cambios en el ADN.

Etiología

Sd. de inestabilidad cromosómica Anemia de Fanconi

• Sd. mielodisplásico• Leucemia mieloide aguda

Sd. de Bloom

Agentes que producen Aberraciones cromosómicas

Tx con agentes alquilantes: Se asocian a anomalías cromosómicas No

balanceadas. Pérdidas o deleción de Cr. 5 o 7 o ambos. Síndrome mielodisplásico y leucemia mieloide aguda.

Tx con inhibidores de Topoisomerasa II: Se asocian a anomalías balanceadas Traslocaciones 11q23.1 (gen MLL) LLA.

Anormalidades cromosómicas Los rearreglos cromosómicos pueden dar lugar a

alteración en la estructura o regulación de oncogenes.

Se consideran eventos iniciales en la carcinogénesis Principales clases de anomalías cromosómicas: Rearreglos cromosómicos balanceados Rearreglos No balanceados

Translocaciones recíprocas Inversiones Inserciones

Rearreglos cromosómicos Balanceados

Re-arreglos cromosómicos balanceados dan lugar a:

Formación de quimeras por fusión génica. Resulta en la expresión de una proteína quimérica con

una actividad nueva o alterada. Cambios cromosómicos que producen

desregulación de un gen estructuralmente normal. Da lugar a la expresión des-regulada de una proteína

normal.

Chromosomal Abnormalities in Human Cancer

Rearreglos y genes Algunas translocaciones asociadas a leucemia

en la infancia aparecen in útero. Los re-arreglos Cr. están asociados a genes

específicos (MLL, ETV6, y NUP98) que se encuentran en estados patológiocs específicos.

BCR-ABL1 es un gen resultado de una fusión que sirve para evaluar respuesta a Tx. de cáncer.

Fusión quimérica de genes

Genes que participan en la formación de una quimera Tirosin quinasas Factores de trascripción.

El cromosoma Filadelfia resulta de la formación de un gen fusionado quimérico.

El cromosoma 22 truncado está presente en: Casi todos los pacientes con leucemia mieloide

crónica (LMC). 20% de los pacientes con leucemia linfoblástica

aguda (LLA). Raros casos de leucemia mieloide aguda (LMA).

Cromosoma Filadelfia

Translocación recíproca t(9;22)(q34.1;q11.23)

Las secuencias del gen BCR en la banda 22q11.23, se unen a las porciones del gen que codifica para la tirosin quinasa citoplásmica ABL1 en la banda 9q34.1

CR Filadelfia En1973 Rowley observó que el cromosoma Ph era el

resultado de una traslocación recíproca que involucraba también el cromosoma 9.

La anormalidad se conoce como t(9;22)(q34;q11). En 1980 se demostró que el cromosoma Ph tenía un

gen con una fusión denominada BCR-ABL. Se piensa que esta es la principal causa de la fase

crónica de la LMC.

Rearreglos en Leucemias. Cr Filadelfia

Leucemia mieloide crónica (LMC) y Leucemia linfoblástica aguda (LLA): El rearreglo t(9;22)(q34.1;q11.23) da lugar a la

expresión de una proteína quimérica con actividad de tirosin quinasa, en ausencia de las señales fisiológicas de activación.

El cromosoma Filadelfia es el resulatdo de esta translocación.

Las secuencias de BCR en el gen de la banda 22q11.23 se fusiona a la parte del gen que codifica a la tirosin quinasa citoplásmica localizado en la banda 9q34.1.

The t(9;22) Translocation and Its Products: the BCR-ABL Oncogene on the Ph Chromosome and the Reciprocal ABL-BCR on the Derivative 9q+ Chromosome

Functional Consequences of Balanced Chromosomal Rearrangements

Aberraciones cromosómicas: Aplicación de su conocimiento Demuestran que los cánceres en humanos pueden

aparecer por alteraciones genéticas adquiridas en las células somáticas

La señal de tirosin-quinasa aberrante en la LMC dio lugar a el uso de inhibidores selectivos: Imatinib mesilato.

Las mutaciones de los dominios de quinasa resistentes a imatinib son responsables de la mayor parte de los casos de recaída.

Una nueva generación de medicamentos ha sido desarrollada (dasatinib and nilotinib).

Moléculas blanco: ImatinibBCRABL Leucemia mieloide crónica

BCR-ABL es una tirosin quinasa funcional autónoma

Proloferación irregular

Imatinib se une a los sitios ATPy evita la fosforilación de la proteína

CONSTITUCION CROMOSOMICA CONSTITUCION CROMOSOMICA NORMALNORMAL

Paciente femenina de 64 años con Dx. de LMCPrimera muestra

Paciente femenina de 64 años con Dx. de LMCPrimera muestra

46,XX,t(9:22)(q34;q11.2 [14]/ Hiperdiploidía mayor de 90 cromosomas [6]

Importancia de los estudios

Utilidad del análisis cromosómico convencional para el desarrollo de nuevos Tx antineoplásicos.

Citogenética molecular (FISH) permite la ID de rearreglos genómicos que ayuda al desarrollo de nuevos medicamentos.

Selected Examples of Chromosomal Rearrangements

Genes de Factores de Transcripción

Los rearreglos cromosómicos que alteran los genes de F. de T dan por resultado: Proteínas de fusión con actividad

transcripcional aberrante o aumentada.• En LMA La proteína quimérica PML-RARA

Proteínas de fusión que median la represión transcripcional.

Genes de Factores de Transcripción

Chromosomal rearrangements that entail aberrant transcriptional repression occur in a substantial proportion of patients with acute myeloid leukemia.38 For example, the chimeric proteins resulting from fusion genes such as PML-RARA

Las proteínas de fusión asociadas a represión transcripcional son blanco Tx.

El ácido retinóico y el trióxido de arsénico revierten la represión transcripcional causada por la proteína de fusión PML-RARA

Ambos medicamentos son efectivos en el Tx de leucema promielocítica.

Cytogenetic Abnormalities Leading to the Expression of Deregulated Tyrosine Kinases in Chronic Myeloproliferative Disorders

Estudio citogenético

Citogenética Molecular: FISH

Citogenética/ Molecular Ha permitido la ID de la fusión del gen

ABL1 al gen NUP214 en la banda 9q34. Presente en el 5% de adultos con Leucemia

linfoblástica aguda de células T Sensible a Imatinib La fusión es episomal.

(elementos extracromsómicos no detectables por análisis citogenético convencional.

Desequilibrios Cromosómicos

Pueden ser por ganancia o pérdida de material genético:Las ganancias genómicas incluyen: Trisomías: parciales o incompletas Amplificaciones

• Intracromosómicas (regiones homogéneamente teñidas sin patrones de bandeo)

• Extracromosómicas (cromosomas double-minute, ADN autónomo, acéntrico de tamaño variable).

Desequilibrios Cromosómicos. Las pérdidas genómicas incluyen:

Monosomías Deleciones

• Grandes • Sub-microscópicas

La causa de anomalías cromosómicas no es conocida.

Estudios en varios tipos de leucemias han demostrado que exposiciones ambientales y ocupacionales y Tx con medicamentos citotóxicos pueden inducir aberraciones cromosómicas.

Utilidad de los marcadores citogenéticos.

Diagnóstico: Anormalidades cromosómicas asociadas a

ciertos tipos de leucemias Respuesta al tratamiento:

Rearreglos cromosómicos como el gen fusión BCR-ABL1 son indicadores sensibles en la evaluación de la evolución del cáncer.

Aplicaciones

El análisis de las anormalidades cromosómicas se puede utilizar para identificar sub-poblaciones de pacientes con un mayor beneficio de un Tx particular.

Desregulación de expresión

Los rearreglos que se yuxtaponen a elementos regulatorios tejido específicos (genes promotores o secuencias aumentadoras) en la secuencia codificante de un proto-oncogen desregulan su expresión.

Desequilibrios cromosómicos

Pueden ser: Alteraciones en todo el gen Duplicaciones o deleciones intragénicas A diferencia de los rearreglos, las

consecuencias funcionales de los desequilibrios no se conocen.

Las consecuencias de los rearreglos pueden ser identificados por sus sitios de ruptura.

Técnicas de estudio Desequilibrio de regiones cromosómicas

grandes contienen muchos genes. Tumores presentan anomalías cr

desbalanceadas La integración de estudios genómcios

completos, perfil de expresión génica, técnicas de genómica funcional permiten la id de genes importantes dentro de regiones genómicas afectadas por anomalías cromosómicas.

Ganancias genómicas

Contribuyen a la genesis del cáncer Incrementan la actividad de genes especiçíficos en

las regiones cromosómicas afectadas. Algunos genes codifican para proteínas que pueden

ser blanco de nuevos esquemas terapéuticos. 30% de las mujeres con Ca de mama presentan

amplificación del gen ERBB2 (receptor de tirosisn cinasa) ubicado en la banda 17q21.1

Esta molécula es blanco del trastuzumab, anticuerpo monoclonal utilizado en el Tx.

Ganancias genómicas a gran escala

Aparecen por no disyunción o por traslocaciones desbalanceadas, generando trisomías compleats o parciales, por eventos de amlificación afctando segmentos de DNA de tamaño diverso

Ha permitido descubrir nuevos oncogenes.

Pérdidas genómicas a gran escala

Deleciones extensas afectan múltiples genes. Se dificulta Id cual pérdida génica se asocia

al desarrollo de la neoplasia Genes candidatos de dichas regiones son

analizados para deleciones, mutaciones, o modificaciones epigenéticas que inactivan el alelo restante.

Ganancias focales

Variaciones en el número de copias se han identificado por tamizaje de genomas tumorales.

Métodos de alta resolución Hibridación genómica comparativa (CGH) Polimorfimos de un solo nucleótido (SNP) Arreglos de CGH y de SNP

Pérdidas genómicas Van desde alteraciones visibles por citogenética

(monosomías parciales o completas) hasta deleciones intragénicas o de un solo gen.

Su contribución a la transformación maligna puede ser por la reducción de la función de genes específicos en las regiones cromosómicas afectadas.

Las técnicas genómicas modernas han permitido la identificación de nuevos genes supresores tumorales que actúan a través de insuficiecia alélica y el descubrimiento de genes no codificantes

Pérdidas genómicas

Deleciones con valor pronóstico y decisión Tx.

del(5q) en LMA del(11q), del(13q), y del (17p) en LLC

Arreglos de SNP

Útiles en el descubriemiento de genes asociados a pérdidas genómicas.

Aprox. 30% de niños con LLA (células B) del (9p13) PAX5

Más del 80% de pacientes con LLA BCR-ABL positivos del(7p13-p11.1) IKZF1

Pérdidas genómicas con insuficiencia alélica

Se utiliza el RNA de interferencia ID de gen causal de síndrome mielodisplásico

(5q menos) RPS14 . Pérdida de 1.5-Mb en 5q32. Estos pacientes responden muy bien a un

derivado de talidomida (lenalidomide).

Pérdidas genómicas de genes no codificantes

Pérdidas cromosómicas asociadas a cáncer que actúan mediante la inactivación de genes no codificantes de proteínas

Contienen genes de microRNAs asociados a regulación pos transcripcional de la expresión génica.

Micro RNAs con actividad suresora tumoral.

Pérdidas genómicas de genes no codificantes

50% de los pacientes con LLC tienen deleción de un segmento en 13q14.3.

Este contiene los genes MIRN15A y MIRN16-1 Los genes MIRN15A y MIRN16-1 regulan

negativamente la expresión de la proteína BCL2.93 (apoptótica).

Proteína quimérica aberrante

Los rearreglos que dan lugar a la expresión de una proteína quimérica con actividad aberrantemente aumentada están representados por la traslocación t(11;22)(q24.1-q24.3;q12.2) asociada al sarcoma de Ewing

Prónostico Transplante de células madre es importante en el Tx

de LMA. Se debe evitar si se tiene un patrón citogenético

asociad a buen pronóstico Traslocaciones: t(8;21) y t(16:16) Inversiones: inv(16)

Se debe considerar el transplante en pacientes con anomalías citogenéticas asociadas a recaídas después de quimioterapia.

Pronóstico Genotipos de bajo riesgo, asociados a recaída en el

35% de los casos, en pacientes con citogenético normal.

Presencia de mutaciones favorables Gen del F. de T. CEBPA Gen de nucleofosomina (NPM1)

Ausencia de duplicaciones en tandem internas desfavorables en el gen tirocin cinasa 3 asociado a fms (FLT3-ITD).

Micro RNAs en LMA Los microRNA son pequeós segmentos de RNA de

una sola cadena (19-25 nucleótidos) . Hay estudios que muestran perfiles de expresión de

microRNAs característicos en sub tipos de LMA citogenética y molecularmente definidos.

Los perfiles de expresión de microRNAs tienen valor pronóstico independiente de la influencia de la mutación de FLT3-ITD.

MicroRNAs Hay un grupo de 12 secencias de microRNAs que

distinguen 2 subgrupos de LMA citogenéticamente normal.

Uno con probabilidad de sobrevida libre de enfermedad de 11% y otro con 36% de probabilidad.

LMA con genotipo FLT3-ITD y NPM1 silvestre y ausencia de FLT3-ITD.

Ambos fenotipos comstituyen el 60% de los casos de LMA.

Pui C et al. N Engl J Med 2004;350:1535-1548

Estimated Frequency of Specific Genotypes of ALL in Children and Adults

Lowenberg B et al. N Engl J Med 1999;341:1051-1062

The AML1-CBF{beta} Transcription Factor

Desequilibrio cromosómico Leucemia mieloide aguda

amp(13) (q12.3) CDX2 amp(21)(q22.3) ERG del(5q)? del(7q)? del(20q)? del(12)(p13) EPV6

Leucemia mielocítica crónica del(7)(p13-p11.1) fase blástica

Leucemia linfoblástica aguda del(12)(p13) EPV6 del(7)(p13-p11.1) (BCR/ABL1 pos)

Dohner H et al. N Engl J Med 2000;343:1910-1916

Probability of Survival from the Date of Diagnosis among the Patients in the Five Genetic Categories

Perfiles de expresió

Gene-expression profiling is a genomics technique that has proved effective in deciphering this biologic and clinical diversity. The approach relies on the fact that only a

CGH

Examples of Chromosome Banding, Interphase Fluorescence in Situ Hybridization, Spectral Karyotyping, and Array-Based Comparative Genomic Hybridization

Because we know more specific information, we can…

Diagnose more precisely Provide more effective treatment.

Select specific treatment that best

fits disease

Target the medication to the disorder. Avoid adverse drug reactions. Avoid delay from false starts.

Predict risk before symptoms occur Provide earlier treatment. Take preventive action.

Manage disease more effectively

Eliminate unnecessary treatment. Provide better timing. Adjust treatment as disease changes.

AND…

AND…

AND…

AND…

LLA es la más común en niños.

Las pruebas genéticas permiten la ID de subtipos y permiten la admon. De Tx específicos

Actulmente la tasa de curación es mayor del 80% contra 4% en los años 60s. 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1962 2007

Impacto de las pruebas genéticas y Tx basados en el genoma en la

sobrevida de niños con leucemia

Source: New England Journal of Medicine, 2006, 200l; Personalized Medicine Coalition, 2006.

Diagnóstico

Las pruebas genéticas que ID mutaciones del DNA en leucemias infantiles permiten la selección de tratamientos más específicos

Courtesy of Signature Genomics

Comparative Genomic Hybridization

Selección de Tx específicos

La traslocación 9; 22 que da por resultado el gen fusión de BCR/ABL se conoce como Cromosoma Filadelfia el cual es carácterístico de la Leucemia mieloide aguda.

Today, Cancer is experiencing a shift toward precision medicine

1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000 2010

Disease of the blood

2 types: leukemia & lymphoma

Farber develops 1st chemotherapy

for leukemia

3 types of leukemia (acute, chronic, preleukemia) and 2 types of lymphoma (indolent,

aggressive)

Novartis launches Gleevec, the 1st molecular targeted drug, to

treat myeloid leukemia

38 types of leukemia; 51 types

of lymphoma

Source: Mara Aspinall, Genzyme

Genetic tests identify variations in the BRCA 1 and BRCA 2 genes that increase risks for breast and ovarian cancer.

Genetic tests identify greatly increased hereditary risk for breast and ovarian cancer

Knowledge of increased risk allows preventive measures, such as closer monitoring, risk avoidance, and preventive surgery or chemotherapy

Predict Risk of Disease Before Symptoms

…with BRCA 1 and 2 = 50% - 85%

….without = 13%

Lifetime risk of developing breast cancer…

Lifetime risk of developing ovarian cancer……with BRCA 1 and 2 = 10% - 45%

…without = 1.7%

Molecular diagnostics is at the core of the personalized medicine vision

Diseases will be diagnosed long before the patient begins to manifest any evidence using traditional tools

In vitro Laboratory

Tests

In vitro Laboratory

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In vivo Imaging

Techniques

In vivo Imaging

Techniques

Signs & SymptomsSigns & Symptoms

Molecular DiagnosticsMolecular

Diagnostics