Heterohibridoma Cruz Leon

7/25/2019 Heterohibridoma Cruz Leon

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Obtencin de heterohibridoma productorde anticuerpos monoclonales de tipo IgMcontra el antgeno D del sistema Rh.

Graciela Len-Gonzlez y Carlos Cruz.

Banco Municipal de Sangre del Distrito Capital, Esquina de Pirineos San Jos, Caracas,Venezuela. Correo electrnico: [email protected]

Palabras clave: Heterohibridoma, anticuerpos monoclonales, especificidad anti-D.

Resumen. El objetivo de este trabajo fue obtener un heterohibridoma ca-paz de producir anticuerpo monoclonal con especificidad anti-D (Sistema Rh)de tipo IgM, que pueda ser utilizado como reactivo en la hemoclasificacin. Lasclulas mononucleares (CMN) se extrajeron de una muestra de sangre de mujeraltamente sensibilizada, al 5to da del post parto de RN Rh positivo. Fueron so-metidas a proceso de transformacin con sobrenadante de cultivo (SNC) de c-lulas B95.8 rico en viriones de Epstein Barr (VEB). Una vez transformadas y encrecimiento exponencial se fusionaron con clulas de la lnea K6H6/B5, utili-zando como agente fusgeno el PEG 4.000 en una proporcin 1:1. Luego de lafusin se sembraron en placas de cultivo para posteriormente evaluar en losSNC de cada pozo, la formacin de hbridos y la secrecin de anticuerpos espe-

cficos. La eficiencia de fu sin fue de 1,8 106, logrndose obtener una clonaproductora de anti-D IgM a la que denominamos BMS-9, la cual se pudo mante-ner en cultivo continuo por 3 meses produciendo anticuerpos a una concentra-cin de 4 g/mL en sobrenadante de cultivo (SNC). Tambin se logr obteneranticuerpos en Sistema Capilar Artificial (SCA) alcanzando una concentracinde 24 g/mL. La potencia se determin utilizando clulas Ror: En SNC a cen-trifugacin inmediata (CI): 1 32, score 52; a 15de incubacin a TA: 1 1024score105; y a 37C: 1 1024 score105. Con el producto del SCA, a CI:1 32 score54; a 15de in cu ba cin a TA: 1 8192 score136; y a 37C: 1 8192 score136. Se detect reactividad con eritrocitos DIIIa, DIV, DVa, DVItipo IV,DVII, DFR, DNU, STEM+, DAR y DAU. No hubo reactividad con eritrocitos DIIIc,

DIVa

, DV

tipo II, DVI

tipo I, II y III, RoHAR

, DOL y D dbil tipo II. En estudio decampo, no se detectaron reacciones falsas negativas ni falsas positivas. Se obtu-vo un heterohibridoma estable, productor de anti-D de tipo IgM, con cualidadessuficientes para ser utilizado en la tipificacin sangunea. Dadas las excelentescualidades del anticuerpo, estamos realizando evaluaciones con diferentes me-dios de dilucin y con adicin de an ticuerpos tipo IgG, con el fin de fabricarun reactivo para uso en la hemoclasificacin.

Invest Clin 48(1): 57- 67, 2007

Autor de correspondencia: Graciela Len-Gonzlez. Banco Municipal de Sangre del Distrito Capital, Esquina dePirineos San Jos. Caracas, Venezuela. Correo electrnico: [email protected]


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Obtention of a heterohybridoma for production of type IgMmonoclonal antibodies against the D antigen of the Rh system.

Invest Cln 2007; 48(1): 57- 67

Key words: Heterohybridoma, monoclonal antibodies, anti-D specificity.

Abstract. The objective was to obtain a heterohybridoma capable of pro-duc ing a monoclonal antibody with IgM type anti-D specificity (Rh system),that could be used as a reactive for hemoclasification. Mononuclear cells(MNC) were ex tracted from a blood sample of a highly sensitized woman, fivedays after giv ing birth to an Rh positive child. These were then transformed

with the culture supernatant (CSN) of B05.8 cells, rich in Epstein Barr virus(EBV). Once transformed and in exponential growth, they were fused withK6H6/B5 line cells us ing PEG 4.000 as a fus ing agent in a 1:1 proportion. Af-

ter fusion, they were seeded in culture plates in order to evaluate the forma-tion of hybrids and the secretion of specific antibodies in the CSN of each

well. The ef ficiency of the fusion was 1.8 106, making it possible to obtainan anti-D IgM producing clone, which we named BMS-9. This clone could bemaintained in constant culture for three months, produc ing antibodies in aconcentration of 4 g/mL in de CSN. It was also possible to obtain antibodies

with an Artificial Capilar System (ACS) reaching a concen tration of 24g/mL. Potency was determined using Ror cells. In CSN at immediatecentrifugation (IC): 1 32, score 52; 15from incubation at room tempera-ture (RT): 1 1,024 score 105. With that ACS prod uct at IC: 1 32 score54; 15from incu ba tion at RT: 1 8.192 score 136; and a 37C: 1 8,192score 136. Reactivity was detected with red cells DIIIa, DIV, DVa, DVItype IV, DVII,DFR, DNU, STEM+, DAR y DAU. There was no reac tivity with red cells DIIIc,DIVa, DVtype II, DVItypes I, II y III, RoHAR, DOL and weak D type II. During fieldstudy, no false negative or false positive reactions were detected. A stableheterohybridoma was obtained, pro ducer of IgM type anti-D, with enoughqualities to be used in blood typing. Given the excellent qualities of the anti-body, we are evaluating di lution media and the addition of type IgG antibodiesin order to manufacture a re ac tive for use in hemoclassification.

Recibido: 16-01-2006. Aceptado: 06-07-2006.

INTRODUCCINDesde hace casi 20 aos los reactivos

utilizados en la tipificacin sangunea sonde tipo monoclonal (1). Para el reconoci-miento de antgenos eritrocitarios confor-ma dos por carbohidra tos, como los del sis-tema ABO, los anticuerpos monoclonales seobtienen a travs de hibridomas logrados

de la fusin de clulas linfoides B de ratnsensibilizado y lneas celulares especiales demieloma de ratn (P3-X63.Ag8.653) (2-4).Sin embargo, la produccin de anticuerposcontra los antgenos del sistema Rh no pue-de ser obtenida por esta va, porque el ra-tn no es capaz de discriminar los eptopesespecficos de dicho sistema (5). De all queinicialmente se fue incursionando en la in-

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mortalizacin de linfocitos B de individuossensibilizados mediante la transformacinpor el virus de Epstein Barr (VEB), con elfin de obtener clonas linfoides secretoras deanticuerpos en forma continua por ciertotiempo (6-7). Esta experiencia no fue exito-sa para algunos investigadores (8-9). Por talmotivo se hicieron ensayos para lograr laobtencin de clonas estables a travs de laformacin de heterohbridos mediante lafusin de linfocitos B de humanos previa-mente sensibilizados inmortalizados otransforma dos con VEB (10-12), con l-neas celulares de mieloma de ratn o con

heteromielomas ratn-humano.Mediante esta metodologa se han lo-grado obtener no slo anticuerpos con es-pecificidad anti-D, sino tambin contra losotros antgenos del sistema Rh (13-15).

El objetivo de este trabajo fue obtenerun heterohibridoma capaz de producir anti-cuerpo monoclonal con especificidad anti-D(Sistema Rh) de tipo IgM, que pueda serutilizado como reactivo en la hemoclasifica-cin.

MATERIALES Y METODOS

Fuente de linfocitos B sensibilizadosSe obtu vieron de una muestra de 20

mL de sangre perifrica de una mujer D- ne-gativo previamente sensibilizada, con ttulode anti-D en 1 2,048, extrada al 5to dadel post parto de un RN D-positivo. Dichamuestra permaneci a temperatura am-biente (TA) por 12 horas aproximadamentepara luego ser diluida v/v en PBS pH 7,2. La

sangre diluda se coloc sobre una solucincomercial de Ficoll Isopred d: 1,077 (Rob-bins Scientific Corporation), contenida entubos plsticos estriles de 15 mL (GreinerCat N 188261) en una pro porcin 2:1. Lostubos se centrifugaron a 500 g durante 15minutos, con el fin de obtener en la interfa-se ficoll - plasma diluido, el anillo de clulasmononucleares (CMN). Dicho anillo se ex-

trajo cuidadosamente utilizando para ellouna pipeta Pasteur estril. Las CMN se lava-ron 3 veces con medio de cultivo RPMI1640 1X (Sig ma Cat N R-5382) cen trifu-gando a 400 g durante 7 minutos. Por lti-mo las clulas se contaron en cmara deNeubauer obtenindose la cantidad de 20 106 clulas.

Transformacin de las CMN con VEBComo agente transformador se utiliz

el sobrenadante de cultivo de las clulasB95.8 (lnea celular linfoblastoide que pro-

viene de los monos marmoset, las cuales es-

tn infectadas con el VEB por lo que produ-cen y se cretan virio nes) (16). Este sobrena-dante se mezcl con las CMN a razn de 1mL por cada 1 106 clulas y se incub a37C por 2 horas. Poste riormente se le aa-di medio RPMI 1640 con 10% de SFB y2 mM de L-glutamina (Sigma, G-7513) masfitohemaglutinina (PHA) a 4g/mL, en un

volumen igual al triple del sobrenadante declulas B95.8 aadido previamente. El volu-men total de 80 mL se sembr en un frascoplstico de 162 cm2 (Costar Cat N 3151),

se incub en incubadora de CO2al 5% y lue-go de 15 das, se proce di a la fusin.

FusinComo pareja de fusin se utilizaron c-

lulas de heteromieloma de la lneaK6H6/B5 (ATCC CRL 183), las cuales sonmantenidos bajo congelacin. Esta lnea fuelograda mediante la fusin de clulas demieloma de ratn balb/c denominadaN5-1-Ag4 y clulas de linfoma nodular hu-

mano. Despus de descongeladas, se sus-pendieron en medio de cultivo RPMI 1640,con SFB al 10% y gentamicina 50 g/mL.Se contaron en cmara de Neubauer y se lescheque su viabilidad (la cual deba ser ma-

yor al 90%) con azul tripano al 0,4% a par-tes iguales. Se mantuvieron en cultivo hastaalcanzar la fase exponencial de crecimien-to, prerequisito para la fusin.

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Luego se procedi a unir la lnea celu-lar K6H6/B5 con las clu las linfoides Btransformadas en una proporcin 1:1. Secentrifugaron a 400 g por 5 minutos entubo plstico estril de 50mL (Grei ner, CatN 227270). Se descart el sobrenadantecon cuidado, asegurando que el pellet que-dara lo ms seco posible y se mezcl vigoro-samente en mezclador elctricopara asegu-rar una buena suspensin celular. Posterior-mente, se aadi 1 mL de polientilenglicol(PEG) de PM 4.000 (Merck, Cat N1.097727) al 45% gota a gota du rante unminuto, mezclndose continuamente. La

mezcla se incub en bao de Maria a 37Cen movimiento suave y constante por 90 se-gundos. Luego se aadieron 2 mL de PBSdu rante 1 minuto, seguido de 2 mL en 2minutos y 5 mL en 2 minutos ms. Se com-plet el volumen hasta 20 mL con PBS aa-dindolo lentamente y mezclando continua-mente. El tubo se mantuvo en reposo a TApor 15 minutos. Se centrifu g a 400 g por 5minutos y se removi el sobrenadante. Seaadi medio de crecimiento compuestopor medio de cultivo RPMI 1640 con 10%

de SFB, 2mM de L-glutamina (Sigma,G-7513), 1mM de piruvato de sodio (SigmaS-8636), 104M de hipoxantina, 1,6 105

de timidina, 4 105de aminopterina (Sig-ma H-0262) y 10mM de ouaba na (Sig maO-5754).Se sembraron 2 106 clulas/mL,a razn de 100 L/pozo en placas (GreinerCat N 655180) de 96 pozos fondo plano.

Despus de 7 das en incu bacin, sereemplaz el medio, eliminando la aminop-terina y la ouabana, luego se aadi sobre-

nadante de cultivo de la lnea J744-2 (lneatumoral macrofgica de ratn, productorade sustancias que favorecen el crecimientocelular) al 10% y gentamicina a 50 g/mL.

A los 14 das post fusin los po zos fueronevaluados.

La eficiencia de fusin se calcul me-diante el logaritmo neperiano del nmerototal de pozos sembrados entre el nmero

de pozos sin crecimiento de hbridos, multi-plicado por 1/nmero de clulas sembradasen cada pozo (EF = Ln (Wt/Wn) 1/N)(17).

Evaluacin de los sobrenadantes decultivo (SNC)

Se tomaron alcuotas de 50 L de SNCde cada pozo y se colocaron en placas de 96pozos para hacerlos reaccionar con eritroci-tos D-positivo papainizados. Se le aadi acada pozo 25 L de la suspensin de eritro-citos al 1%, se mezclaron y se incubaron aTA por 30 minutos. Luego se ley cada pla-

ca inclinndola en un ngulo de 45 y obser-vando el fon do de los pozos. Se consi derreaccin positiva cuando se evidenci, en elfondo del pozo, disper sin de las clulas opresencia de un botn firme, indicando pre-sencia de anticuer pos de tipo IgM o IgGaglutinantes directos. Se consider reac-cin negativa cuado se observ corrimientodel botn en el fondo del pozo. A los pozosnegativos, previo lavado con solucin salina0,9%, se les aadi 50 L de antiglobulinahumana (AGH) y se reevalu la reactividad

con el fin de detectar presencia de anti-Dde tipo IgG no aglutinantes directos.

Las clulas contenidas en los pozoscon seal positiva se expandieron y se clo-naron cuatro veces por procedimiento dedilucin lmite (a razn de 1, 0,5 y 0,25 c-lulas por pozo), para asegurar la monoclo-nalidad.

Caracterizacin y cuantificacin delanticuerpo

La caracterizacin de la clase de inmu-noglobiulina fue realizada mediante la im-plementacin de un inmunoensayo enzim-tico (ELISA) de captura. El tipo de cadenaliviana se determin mediante el mtodo dedoble difusin en gel de agarosa (Ouchter-lony) (18-19).

Para la cuantificacin de los anticuer-pos se utiliz un estuche diagnstico co-




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mercial Tina-quantde laboratorios Roche,(mtodo turbidimtrico). Se siguieron lasinstrucciones del fabricante.

Produccin de anticuerpos a mayor escalaSe utiliz el Sistema Capilar Artificial

CellmaxR (Cellco, Spectrum Company) si-guiendo las instrucciones del fabricante.

Evaluacin InmunohematolgicaSe realiz la evaluacin tanto en SNC

como en el producto de las cosechas obte-nidas con el Sistema Capilar Artificial(SCA) (20).

Especificidad: se evalu utilizando unpanel de clulas comercial (Resolve RA445 Ortho) que inclua clulas Ror,R1R1, R2R2, rr, rr, rr, as como conclulas A1 y B D-negativo. Se incluye-ron clulas de fenotipos ra ros: Varian-tes D-dbiles y D-parciales.

Potencia: se determin realizando titu-laciones al medio con solucin de alb-mina bovina al 2-3%, utilizando eritro-citos R0r en suspensin al 3-5%. La po-tencia fue considerada como la rec-

proca de la ma yor dilucin del SNC odel producto del SCA, en la que lareaccin result positiva 1+. Las lec-turas de las reacciones se realizaron acentrifugacin inmediata (CI), y des-pus de incu bar a TA por 15 y a 37Cpor 20. A las reacciones se les dio un

valor de score: 4+ = 12; 3+ = 10; 2+= 8; 1+ = 5 (21).

Avidez: Se evalu en lmina utilizandoel SNC no diluido. Se utilizaron clulas

R1r al 50%. Se mezclaron 50 L de lasuspensin celular y 50 L del SNC yse ley sobre lmpara de luz incandes-cente en movimiento constante. Lasaglutinaciones se registraron comomayores o menores a 1 mm desde elmomento en que comenz la aglutina-cin hasta el final del tiempo de eva-

luacin correspondiente a la estabiliza-cin de los aglu tinados.

Aglutinacin espontnea: Se utilizaroneritrocitos O rr, fuertemente sensibili-zados con reactivo anti c, los cualesautoaglutinaban en medio de alta pro-tena.

Evaluacin de efecto prozona:Se utili-zaron tres clulasR1rdiferentes y cadauna se incu b a TA por 15, 30 y 60respectivamente. A cada tubo se leaadi una gota del reactivo y unagota de la suspensin de eritrocitos, semezcl e incub, se centrifug y se

ley por aglutinacin. Si el grado deaglutinacin permanece igual o se in-crementa en los diferentes tiempos deincubacin, no existe fenmeno deprozona. Si decrece con la incubacinsi hay prozona. Debe obtenerse al me-nos 2+ de aglutinacin en todos lostiempos.

Evaluacin de campo: Se realizaronevaluaciones en donantes de sangre alazar, D-positivo y D-negativo en formaparalela con el reactivo comercial en

uso por el banco de sangre (Bioschile).

RESULTADOS

De las 20 placas sembradas, se obtuvocrecimiento de clulas hbridas en 602 po-zos. Inicialmente se detectaron 06 pozoscon seal positiva: uno reaccion directa-mente y los otros cin co por AGH. Se ex pan-dieron los po zos de los cuales slo perma-neci la seal positiva en el que result con

aglutinacin directa y en uno que aglutinpor AGH. La eficiencia de fu sin fue de 1,8 106(17).

Luego de clonar y reclonar al pozo ini-cialmente positivo por aglutinacin directamediante el procedimiento de dilucin lmi-te, se obtuvo una clona nica productora deanti-D.

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El isotipo del anticuerpo result serIgM-kappa. Al cuantificar el anticuerpo, seobtuvieron concentraciones de 4 g/mL enSNC y de 24 g/mL del SCA. A esta clonase le denomin BMS-9.

La clona se mantuvo en cultivo conti-nuo produciendo anticuerpos por 3 meses yen el SCA por 45 das, logrndose obtener12 cosechas de 10 mL cada una.

Evaluacin InmunohematolgicaLa especificidad se determin evaluan-

do el SNC con un panel de clulas comer-cial, con fenotipos normales positivos y ne-

gativos (Tabla I).Se apreci clara reactividad con las c-lulas D-positivo y ausencia de reactividadcon las D-negativo. Tambin se obtuvieronresultados negativos al hacer reaccionar elSNC con clulas A1y B D-negativo.

En la Tabla II se seala la potencia delanticuerpo. Los ttulos detectados en elSNC y en el SCA se incrementaron al incu-bar a TA y mantuvieron su reactividad des-pus de incubar a 37C. En los anticuerposproducidos a travs del SCA, se apreci un

incremento del ttulo despus de incubar aTA, con respecto a los obtenidos en SNC, lo

cual per mitir su dilucin en caso de pro-ducir reactivos.

En la Tabla III se puede apreciar elcomportamiento de los anticuerpos secreta-dos por la clona BMS-9, demostrando reac-tividad con algunas variantes parciales y d-biles del antgeno D y ausencia de reactivi-dad con clulas con muy poca expresin an-tignica como lo son las variantes DVItipo I,II y III y la va riante R0HAR.

Al evaluar la avi dez del anticuer po pro-ducido en SNC se obtuvo aglutinacin deme nos de 1mm a los 18 de observacin yde ms de 1 mm a los 25. Se compar con

la avidez demostrada por un reactivo co-mercial (Bioschi leR): aglutinacin de menosde 1mm en 4 y en ms de 1 mm en 10.Cabe sealar que los anticuerpos del SNCestn diluidos en medio de cultivo y no con-tienen potenciadores que usualmenteacompaan a los reactivos comerciales.

Al hacer reaccionar el SNC con clulasD-negativo fuertemente sensibilizadas con-tra el antgeno c, el resultado como erade esperar fue negativo ya que el medio desuspensin de los anticuerpos es muy bajo

en protenas. No se detect presencia de fe-nmeno de prozona.



TABLA IREACTIVIDAD DEL SNC DE LA CLONA BMS-9 CON PANEL COMERCIAL

R1wR1 R1R1 R2R2 R0r rr rr rr rr rr rr R 1R1

2+ 3+ 3+ 2+ 0 0 0 0 0 0 3+

3+ 4+ 4+ 3+ 0 0 0 0 0 0 4+

3+ 4+ 4+ 3+ 0 0 0 0 0 0 4+

TABLA IIPOTENCIA MEDIDA EN SNC Y EN SCA DE LA CLONA BMS-9 EN SOLUCIN DE ALBMINA BOVINA

AL 3%

Centrifugacin inmediata TA por 15 37C por 20

SNC-Ttulo 1 32 1 1024 1 1024

SNC-Score 52 105 105

SCA-Ttulo 1 32 1 8192 1 8192

SCA-Score 54 136 136


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Se realizaron 209 determinaciones endonantes de sangre D-positivo y 20 en do-nantes D-negativo en paralelo con el reacti-

vo comercial BioschileR (Tabla IV).De las 209 muestras D-positivo, el

99,5% demostr reactividad fuerte 3+ y 4+con ambos reactivos. Se evidenci una soladiferencia en cuanto a la fuerza de la reac-cin (de 4+ vs2+), lo cual est permitidopara validar un anticuerpo para uso en la he-moclasificacin (20). Las 20 muestras D-ne-

gativo resultaron igualmente negativas.

DISCUSIN

En este trabajo se describe un mtodoprctico para obtener heterohbridos pro-ductores de anticuerpos contra antgenosdel sistema Rh, fusionando clulas linfoidesde una mujer previamente sensibilizada des-pus del parto y clulas de heteromieloma.Previamente en el laboratorio se habanrealizado varios experimentos utilizando c-lulas de mieloma de ratn P3-X63.Ag8.653as como otra lnea de heteromieloma(SMH-D33, ATCC CRL 1668) pero los resul-tados fueron pobres, obtenindose hete-rohbridos muy inestables que dejaron deproducir anticuerpos al poco tiempo de for-mados, por presentarse el fenmeno de se-gregacin cromosmica (22). Tambin se

haban utilizado diferentes mecanismos defusin: qumica con PEG de PM 1.300-1.400(5-7) y por medio elctrico o electrofusin(17). Con este ltimo mtodo se obtuvomejor eficien cia de fusin (1-3 106) quecon la qumica (1-5 107), pero el resul-tado final fue el mismo, clonas instables ode baja capacidad secretora aunque se lo-gr obtener una productora de anti-D IgGde bajo ttulo (datos no mostrados). Igual-mente se hicieron experiencias utilizando

linfocitos congelados y linfocitos frescos,obtenindose mejor eficiencia de fusincon los ltimos. En el presente in forme,utilizando PEG 4.000, la eficien cia de fu-sin fue de 1,8 106y de una sola fusinse logr obtener dos clonas, una IgG (cuyaevaluacin no fue objeto de presente traba-

jo) y otra IgM.La capacidad de producir anticuerpos

monoclonales a travs de heterohibridomasdepende de muchos factores, como porejemplo del estado de la respuesta inmuno-lgica del donante, el cual va variar segnhaya ocurrido o no una estimulacin recien-te. Se ha podido demostrar (y es nuestra ex-periencia) que la posibilidad de obtener h-bridos productores es mayor, mientras masprecoz sea la toma de la muestra despusdel re-estmulo (menos de 7 das posterioral reestmulo) (23). En el presente estudio

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TABLA IIIEVALUACIN DEL SNC DE LA CLONA BMS-9 CON VARIANTES D-DBILES Y D-PARCIALES

DIIIa

DIIIc

DIV

DIV

tipo IV DIVa

DVa

DV

tipo II DVI

tipo I DVI

tipo II DVI

tipo III

+ 0 + + 0 + 0 0 0 0

S:8 S:0 S:9 S:4 S:0 S:7 S:0 S:0 S:0 S:0

DVII DFR DNU R 0 HAR STEM+ DAR DOL DIM DAU D dbiltipo 2

+ + + 0 + + 0 0 + 0

S:6 S:5 S:4 S:0 S:8 S:4 S:0 S:0 S:9 S:0


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se utilizaron linfocitos B de una mujer sen-sibilizada con alto ttulo (1 2048) obteni-dos a los 5 das del post parto de RN D-posi-tivo, los cuales fueron rpidamente inmor-talizados con el VEB y sometidos poste-riormente a la PHA con el fin de eli minar oinactivar a las clulas citotxicas especfi-cas para el virus.

La ausencia de una eficiente pareja defusin, aunado a artefactos tcnicos intro-ducidos por el VEB que reducen la eficien-cia de fusin, han hecho que la obtencinde heterohibridomas sea un proceso, largo,laborioso, costoso y de resultados imprede-cibles (24). Se sabe que el VEB solo puedeinmortalizar poblaciones de linfocitos B enre poso; por ello los hibridomas son el refle-

jo de linfocitos B activados pero no total-mente diferenciados en clulas plasmticas.Estas ltimas clulas son ricas en ARNmpero lamentablemente incapaces de fusio-narse (25). La utilizacin de la lneaK6H6/B5 como pare ja de fu sin fue tam-bin un factor determinante en la consecu-cin de nuestro objetivo ya que utilizandolas lneas P3-X63.Ag8.653 y SMH-D33 losresultados fueron desalentadores por lainestabilidad de las clonas.

Debido a lo difcil que resulta obtenerheterohbridos estables productores de an-ticuer pos, en los ltimos aos ha ha bido unintenso desarrollo de las tcnicas recombi-nantes, que ofrecen mayor rendimiento encalidad de anticuerpo, en tiempo de pro-duccin y en costos (26-28).

Tanto los ttulos alcanzados por anti-

cuerpos generados por la clona BSM-9como la concentracin de los anticuerpos,estn dentro de lo reportado en la literatu-ra (6-8, 14).

El hecho de haber logrado una clonaestable productora de anticuerpos anti-D detipo IgM con las caractersticas sealadas,ha sido una experiencia exi tosa no solo porlo difcil de obtener una clona estable sinopor el comportamiento de los anticuerposque esta genera, demostrando su potencia-lidad para uso como reactivo en la hemocla-sificacin. Esta potencialidad est avaladapor los resultados en el estudio de campoen el que no se evidenciaron reacciones fal-sas negativas. Se logr evaluar 209 mues-tras de donantes de sangre D-positivo y 20muestras de donantes D-negativo, sin detec-cin de discre pancias en cuanto a la positi-

vidad o negatividad de las reacciones, al



TABLA IVREACTIVIDAD DE LOS ANTICUERPOS DE LA CLONA BMS-9 PRODUCIDOS EN SCA VSREACTIVO

COMERCIAL

Acs de la clona BMS-9 Reactivo Comercial Total de pruebas

4+ 4+ 184 (88,0%)

3+ 3+ 08 (3,8%)

3+ 4+ 13 (6,2%)

4+ 3+ 03 (1,4%)

2+ 4+ 01 (0,5%)

0 0 20 (100%)Se ha trabajado en la obtencin de heterohbridos productores de anti-D, de manera que puedan ser utilizados enla produccin de reactivos de hemoclasificacin. Despus de utilizar diferentes protocolos de fusin (10-12), ob-tuvimos un heterohbrido estable productor de anti-D de tipo IgM al fusionar linfocitos B humanos con clulas deheteromieloma de la lnea K6H6/B5. Luego de caracterizar el anticuerpo en sobrenadante de cultivo, se hicieronlas evaluaciones correspondientes para determinar su potencialidad como reactivo en la hemoclasificacin.


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compararlos con los resultados obtenidoscon el reactivo comercial.

La capacidad de un anticuerpo IgMpara detectar antgenos D-dbiles, dependede la avidez del anticuerpo. Por tal motivo,al producir un reactivo para la hemoclasifi-cacin, se recomienda realizar mezclas oli-goclonales de IgM monoclonal de alta avi-dez con IgG mono o policlo nal. Los anti-cuerpos IgG permitirn la deteccin de di-cho antgeno utilizando el reactivo de AGH,en caso de que no pudiera ser detec tadopor el IgM (29). La capacidad de un mono-clonal para detectar D-parciales depende de

la especificidad fina del anticuerpo. El ant-geno D est constituido por un mosaico deeptopes, algunos de los cuales no existenen individuos D-parciales. En los cuatro

workshops internacionales para el estudiode los anticuerpos monoclonales, estas ca-ractersticas han sido estudiadas exhausti-

vamente (30-32). En estas evaluaciones sepudo evidenciar que no existe ningn mo-noclonal anti-D que reconozca todas las va-riantes.

En el banco de sangre, para el tipeaje

de donantes se requiere que el reactivo em-pleado reconozca todas las variantes, con elfin de limitar la posibilidad de sensibiliza-cin en individuos D-negativo a travs de latransfusin, aunque sea controversial la ca-pacidad inmunizante de estas variantes(33-34). De all que la estrategia mas fre-cuentemente utilizada es la de combinar unanti-D IgM de alta avidez que reaccione con

variantes DIV y DV pero que no reaccionecon las variantes DVI, junto a un policlonal o

monoclonal de tipo IgG que pueda detectara estas variantes y otros D-dbiles. Sin em-bargo, para la tipificacin de pacientes, conel IgM de alta avidez podra ser suficiente

ya que la no deteccin de ciertas variantesD-parciales, como la DVI (que es mas fre-cuente en caucsicos), podra catalogar adicho paciente como D-negativo y ser trans-fundido con sangre D-negativo, lo cual lo

protegera de una sensibilizacin futuracontra los eptopes que no posee.

De cualquier manera, las caractersti-cas finales del reactivo en produccin debe-rn estar bien especificadas en el instructi-

vo que lo acompa e.Dada la buena calidad del anticuerpo

obtenido en el presente estudio, se ha pen-sando en su produccin a mayor escala, afin de utilizarlos como reactivo en el bancode sangre para la hemoclasificacin en pa-cientes, por lo que siguiendo las recomen-daciones internacionales se est evaluandoel comportamiento de los anticuerpos: 1)

Utilizando diferentes medios de dilucin, amanera de obtener la mejor reactividad enel trabajo de rutina y 2) Haciendo mezclasoligoclonales tanto con anticuerpos IgGmonoclonales obtenidos en nuestro labora -torio, como con anti-D policlonales parautilizacin en donantes.

Adems, estos anticuerpos pueden serpotencialmente utilizables para otros desa-rrollos tecnolgicos con el fin de producirrecombinantes de utilidad mltiple (26-28),o para conjugarlos y utilizarlos en ensayos

para la deteccin de hemorragia maternofetal (en proyecto por nuestro laboratorio).

AGRADECIMIENTO

Nuestro especial agradecimiento al Dr.Ramn Montao, investigador del laborato-rio de Biologa Ce lu lar del IVIC por su apo -

yo al proporcionarnos las lneas celularesem pleadas en el trabajo y al Dr Gre goryHalverson investigador del Departamento

de Inmunoqu mica del New York BloodCenter por su asesora y ayuda en la evalua-cin de los anticuerpos con clulas de feno-tipos D-dbiles y D-parciales.

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