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1. Información Establecimiento Educacional

Nombre

Instituto Linares

Comuna

Linares

Región

Del Maule

Dirección

Chacabuco 566

Director

Ricardo Cáceres Guzmán

2. Información Estudiante N°1 (Máximo 2 participantes)

Nombres y

Apellidos

Fernanda Cifuentes Mondaca

3. Información Estudiante N°2 (Máximo 2 participantes)

Nombres y

Apellidos

Camila Guajardo Medina

4. Información Docente Guía

Nombres y

Apellidos

Héctor Parada Parada

5. Información Asesor(a) Científico(a) Externo(a)

Nombres y

Apellidos

Raúl Herrera Faúndez

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Declaración Asesoría Otorgada

Quien suscribe Dr. Raúl Herrera Faundez, profesor titular de la Universidad de Talca. Bioquímico PhD. certifica haber colaborado en esta investigación enseñándoles a las estudiantes las técnicas de laboratorio necesarias y además asesorando los análisis de la investigación.

TÍTULO DE LA INVESTIGACIÓN RESPUESTA TRANSCRIPCIONAL DE Fragaria chiloensis FRENTE A ESTRÉS HÍDRICO.

6. Resumen Investigación (4 líneas)

La presente investigación, es un estudio experimental, que permite analizar la respuesta transcripcional de las plantas de Fragaria chiloensis frente a condiciones de estrés hídrico.. Comprender como este tipo de plantas regula el déficit de agua, permitirá a futuro realizar cruzamientos mendeluianos con otras plantas, para que las futuras generaciones de plantas soporten de mejor manera los déficit de agua.

7. RESUMEN EJECUTIVO (2 PÁGINAS MÁXIMO)

La frutilla chilena, Fragaria chiloensis, posee excelente calidad organoléptica, sabor y aroma agradable y además, presenta resistencia a plagas y a diferentes factores de estrés. Lamentablemente esta frutilla ha sido incrementalmente desplazada por la frutilla comercial F. x ananassa. Sin embargo, esta última, presenta susceptibilidad a distintos patógenos, especialmente virus y diferentes tipos de estrés. (Retamales y col., 2005). La investigación tiene como objetivo evaluar la respuesta de las plantas de Fragaria chiloensis frente a condiciones de estrés hídrico, lo que permitirá identificar la expresión de genes relacionados con la respuesta al estrés y el control de la pérdida de agua celular. Identificar estos genes, posibilitara a futuro mejorar genéticamente la frutilla comercial seleccionando individuos que expresen constitutivamente los genes identificados en frutilla chilena y por ende, que resista de mejor manera a las condiciones de estrés hídrico. Los resultados indican que el gen Fc PR5 relacionado con la presencia del hongo Botrytis cinerea también se expresan en condiciones de estrés hídrico, mientras que genes que codifican para canales transportadores de agua en membrana celular, FcPIP1 Y FcPIP2, a medida que aumenta el periodo de sequía en la Fragaria chiloensis, estos disminuyen su expresión. Por lo tanto, se valida la hipótesis de trabajo propuesta.

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8. ÍNDICE

RESUMEN 4

INTRODUCCIÓN 6

DESARROLLO 7

RESULTADOS 9

CONCLUSIONES 13

BIBLIOGRAFIA 13

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9. ANTECEDENTES E INTRODUCCIÓN

La F. chiloensis proveniente de distintas condiciones climáticas, presenta resistencia a escarabajos, ácaros y tolerancia a virus (Retamales y col., 2005). Esto es una característica muy positiva debido a que últimamente el mercado internacional está incrementando la demanda de productos exóticos con bajos niveles de agroquímicos. Por esto se requiere disponer de plantas resistentes a varios patógenos, así como a diferentes factores de estrés (Retamales y col., 2005). Cabe destacar que las exportaciones chilenas de frutilla correspondieron a 28,831 millones de dólares1 en el periodo Enero-Diciembre del año 2009. De esta forma se propone que la frutilla nativa chilena (F. chiloensis) es un buen candidato a transformarse en una nueva especie comercial de fruta exótica que se puede agregar a la diversidad de frutos que Chile puede exportar (Figueroa y col. 2008). En los últimos 50 años la frutilla chilena ha sido incrementalmente desplazada por la frutilla comercial, F. x ananassa, debido principalmente a un mayor rendimiento por hectárea de esta última. www.aduana.cl/prontus_aduana/site/artic/. Figura N°1. Exportaciones de Frutilla comercial

Sin embargo F. x ananassa presenta susceptibilidad a distintos patógenos, especialmente a distintos virus y producto del exhaustivo mejoramiento genético ha perdido una serie de atributos sensoriales, como el sabor y aroma (referencia). Hongo Botrytis cinerea Botrytis cinerea

Precisamente, F. chiloensis se caracteriza por su excelente calidad organoléptica con un muy agradable sabor y aroma, además de gran variabilidad genética, que la hace adaptarse a diversos ambientes, desde los subárticos y subtropicales a las zonas cálidas desérticas y desde el nivel del mar a las elevadas latitudes del continente americano. www.puntovital.cl/alimentacion/sana/nutricion/frutilla.htm Estudios realizados (Herrera 2010) ha encontrado que la frutilla chilena, precursora de la comercial, expresa genes Fc PR5, que la hacen más resistentes al hongo de la Botrytis con respecto a la frutilla comercial. Por otro lado una investigación realizada por las autoras de esta investigación, revela que en la zona

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central cada año disminuyen la frecuencia de las lluvias y considerando que los transportadores de agua de membrana celular (acuoporinas) son los encargados en parte de mantener un status hídrico óptimo para el desarrollo normal de planta, es que se hace necesario investigar como la F. chiloensis regula este proceso. Basado en la información anterior, comprender cómo responde la F. chiloensis en condiciones de estrés, permitirá mejorar genéticamente la frutilla comercial, permitiendo que esta tipo de plantas puedan resistir en mejor forma a los déficit de agua que cada temporada es más escaso. 10. DESARROLLO

) HIPÓTESIS: Plantas de Fragaria chiloensis poseen una regulación diferencial en la expresión de los genes PR5, PIP1 y PIP2 cuando son sometidas a estrés hídrico.

OBJETIVO GENERAL: Evaluar la respuesta fenotípica y caracterizar transcripcionalmente genes relacionados a la perdida de agua celular en plantas de Fragaria chiloensis (frutilla chilena) frente a condiciones de estrés hídrico.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS: Determinar cambios fenotípicos de plantas de Fragaria chiloensis expuestas a estrés hídrico.

Evaluar la expresión de genes relacionados con la respuesta al estrés y genes relacionados con el control del contenido de agua celular.

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MÉTODO Y/O MATERIALES Por intermedio de la Universidad de Talca se obtienen 17 plantas de Fragaria chiloensis, las cuales se ubican en un lugar soleado del laboratorio del colegio Instituto Linares. Como parte del proceso de aclimatación se procede a regar todas las plantas cada cinco días con 100 ml de agua, completando un tiempo de quince días. Transcurrido este periodo, se agrupan las plantas al azar en cinco grupos, y cada grupo formado por tres plantas. A continuación se procede con la parte experimental, que consiste en regar el grupo control cada cinco días, el resto de las plantas se someten a un estrés hídrico (sin regar). Tabla 1. Las hojas de las plantas sometidas al estrés hídrico se van cortando a los 10, 20, 30 y 52 días después de su último riego. Transcurrido el periodo de experimentación, se procede mediante la técnica molecular RT-PCR a evaluar la expresión de genes relacionados con la respuesta al estrés. DISEÑO EXPERIMENTAL Tabla N° 1. Periodo de corte y riego de hojas de Fragaria chiloensis sometidas a estrés hídrico.

Periodo de a climatización 27 abril- 11 mayo

Corte 1

Corte 2

Corte 3

Corte 4

Corte 4 Control

27 mayo

6 junio

17 julio

9 julio

9 julio

Riego cada cinco días

10 días

sin regar

20 días

sin regar

30 días sin

regar

52 días

sin regar

Riego cada

cinco días

Una vez realizado los cortes de hojas de las plantas tratadas y control, se congelan y son trasladas al Laboratorio de Biología Vegetal de la Universidad de Talca, donde se procede con el siguiente Protocolo: 1. Extracción de ARN total (método CTAB) 2. Concentración de ARN 3. Aplicar la enzima DNA asa para eliminar el ADN. 4. Visualización del ARN a través de electroforesis en gel de agarosa. 5. Concentración ARN sin contaminación 6. Realizar transcripción reversa (ADNc) 7. Partidores específicos RESULTADOS

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RESULTADOS FENOTIPICOS Plantas de Fragaria chiloensis sometidas a estrés hídrico

Grupo Control 10 días sin regar 20 días sin regar

30 días sin regar 52 días sin regar

Al comparar las hojas de las plantas de Fragaria chiloensis, no se observan diferencias fenotípicas entre el control y las plantas sometidas al estrés hídrico. Todas las hojas mantienen sus pigmentos característicos y no se ven marchitas. Estos resultados fenotípicos, evidencian la resistencia que tienen estas plantas al estrés hídrico entre los intervalos de tiempo estudiados. RESULTADOS GENOTIPICOS

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Figura N°1 Imagen de ARNs de plantas de Fragaria chiloensis del grupo control y las sometidas a estrés hídrico. N° de plantas 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

Control 10 20 30 52 Riego cada cinco días días sin regar En la imagen se observan las distintas bandas de ARNs de las hojas de Fragaria chiloensis en los grupos control y las sometidas a estrés hídrico. Se observa la integridad del ARN puesto que se observan las 2 bandas principales de ARN y no hay un chorreo evidente.

Gráfico N° 1: Expresión del FcPR5 en hojas de Fragaria chiloensis en ausencia de agua.

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En la imagen se observa como el gen FcPR5 se expresa en las hojas de Fragaria chiloensis y a medida que avanza el periodo de ausencia de agua, 10,20, 30, 50 días respectivamente, este gen se va expresando en mayor cantidad. Gráfico N° 2: Expresión del FcPIP1 en hojas de Fragaria chiloensis en ausencia de agua. En la imagen se observa, como el gen FcPIP1 en hojas de Fragaria chiloensis asociado a las acuaporinas, proteínas de membrana, deja de expresarse a media que avanza el periodo de ausencia de agua.

Es evidente las diferencias con respecto al grupo control. Gráfico N° 3. Expresión del FcPIP2 en hojas de Fragaria chiloensis en ausencia de agua.

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En la imagen se observa, como otro gen, FcPIP2 en hojas de Fragaria chiloensis asociado a las acuaporinas, proteínas de membrana, deja de expresarse a media que avanza el periodo de ausencia de agua. Son evidentes las diferencias con respecto al grupo control. 99,9 % de confiabilidad.

DISCUSIONES FcPIP1 y FcPIP2, son genes cuya expresión regula la síntesis de proteínas transportadoras presentes en la membrana plasmática de los vegetales y regulan el equilibrio osmótico de la célula. Estas proteínas regulan la salida de agua de la célula, por lo que su represión es clave frente al estrés hídrico, lo que podría evitar la pérdida de agua celular.

Con respecto al gen FcPR5, los estudios realizados en la Universidad de Talca, (Herrera 2010), indican que este gen se expresa frente al hongo Botrytis cinerea. Este resultado coincide con el obtenido en esta investigación, que indica que este gen también se expresa en condiciones de estrés por déficit de agua, lo que permite inferir que su expresión le da más resistencia a la célula frente a los distintos tipos de estrés, desconociendo su función real. La expresión de este gen también permite deducir que la planta se encuentra en una condición de estrés, por lo tanto ser usado como un marcador molecular de esa condición.

Este resultado abre una posible línea investigativa, porque desconociendo la función específica del gen, si se puede inferir que se expresa la planta de Fragaria chiloensis tanto en estrés biótico como en estrés abiótico. En un futuro ensayo, se propone medir datos fisiológicos como contenido relativo de agua y capacidad fotosintética de las plantas con la finalidad de evaluar cómo se ven afectados estos parámetros junto a la expresión de FcPR5.

Finalmente, se puede decir que la respuesta al estrés por sequía podría estar siendo regulada por factores de transcripción que regulan coordinadamente la activación y represión de cierto grupo de genes.

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Esto es el programa genético que se activa en respuesta a sequía en esta especie en particular, en el cual participarían los genes analizados que, junto a otros, permitirían a la planta tolerar de mejor forma la falta de agua.

11. CONCLUSIÓN

Los resultados indican que el gen FcPR5 relacionado con la presencia del hongo Botrytis cinerea también se expresan en condiciones de estrés hídrico, mientras que genes que codifican para canales transportadores de agua en membrana celular, FcPIP1 Y FcPIP2, a medida que aumenta el periodo de sequía en la Fragaria chiloensis, estos disminuyen su expresión. Por lo tanto, se valida la hipótesis de trabajo propuesta. Estos resultados sugieren que los genes evaluados podrían conferir mayor tolerancia a falta de agua en esta especie nativa.

12. BIBLIOGRAFÍA

1. Figueroa C.R., Pimentel P., Gaete-Eastman C., Moya M., Herrera R., Caligari P.D.S., Moya-León M. A. Softening rate of the Chilean strawberry (Fragaria chiloensis)fruit reflects the expression of polygalacturonase and pectate lyase genes.Postharvest Biology and Technology Aug. 2008, 49(2); 210-20. 2. Herrera, Análisis genómico comparativo de la información genómica disponible de fragaria chiloensis. Universidad de Talca, 2010. 3. Retamales J. B., Caligari P. D. S., Carrasco B., Saud G.,Current Status of the Chilean Native Strawberry and the Research Needs to Convert the Species into a Commercial Crop. HortScience 2005 Oct;40(6).1633-4 Travisany Dante Análisis genómico comparativo de la información enómica. Tesis para optar al grado de Ingeniero agrónomo. Universidad de Talca. 2010 3. Rojas P “Caracterización de genes involucrados en el ablandamiento, para mejorar la vida de post cosecha de frutas climatéricas” (Tesis para optar al grado académico: Licenciado en Tecnología Médica) Universidad de Talca. Chile. . 2003

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