Pontificia Universidad Catlica de ChileFacultad de Ciencias BiolgicasDepartamento de Gentica Molecular y MicrobiologaBiologa de MicroorganismosBIO151E-2

Informe N2Identificacin, gentica molecular bacteriana y morfologa de hongos

Nombre: Diana Fuentes CastilloProfesores: Dras. Beatriz Diez y Carolina SerranoJefe de Ayudantes: Daniela RuizAyudante: Gabriela Gmez LilloFecha de entrega: 5 de Noviembre de 2014

Introduccin

La microbiologa es la ciencia que estudia a los organismos microscpicos y a los virus, de manera de entender su funcionamiento y aplicar esto en beneficio de la humanidad (1). Para generar este conocimiento, se requiere de instancias experimentales, las que permitirn obtener informacin sobre el aspecto a analizar. En las actividades prcticas realizadas, se trabaj con bacterias, virus y hongos.Las bacterias son organismos unicelulares, sin organelos, de 1 a 5 um de longitud en general (2). En vista de la variedad de especies, para su identificacin, es necesario el uso de pruebas en medios diferenciales, que estarn dirigidas por un anlisis macroscpico y microscpico previo. La certeza sobre la identidad de la bacteria se puede lograr a travs de una batera de pruebas bioqumicas o mediante sistemas de identificacin estandarizados, como API 10S, que tiene un enfoque ms amplio, pero permite una identificacin ms rpida (3). La batera bioqumica empleada consiste en 10 medios de cultivo, que en presencia de la bacteria a identificar permitir detectar una reaccin bioqumica determinada. El sistema API 10S consta de 11 pruebas bioqumicas con sustratos deshidratados.Por otro lado, para sobrevivir las bacterias poseen 3 mtodos de transferencia de genes: transformacin, en donde ADN libre es tomado por la clula; conjugacin, en donde la transferencia de ADN requiere de interaccin mediante pili, y transduccin, en donde la transferencia de ADN es mediada por un virus (4). La transduccin puede ser generalizada, en donde el virin solo posee ADN del husped, y especializada, en donde una porcin especfica del ADN del husped se integra en el genoma viral, llegando incluso a eliminar parte de este (5). Adems, se ha descubierto otra fuente de variabilidad gentica, los transposones, que son segmentos de ADN que se pueden mover de un lado al otro (6). Para verificar el proceso de conjugacin, se emplearon medios con kanamicina, antibitico cuyo objetivo son bacterias Gram (-) (7) y ampicilina, de amplio espectro (8). Para verificar el proceso de transduccin generalizada, se utiliz el fago P22, ya que este proceso es tpico de l (9). Adems, se utiliz el medio agar verde para apreciar el metabolismo bacteriano en presencia de los fagos P22 y H5, ltico y lisognico respectivamente, debido a que este medio asla a Salmonella spp. e inhibe el crecimiento de fermentadores de lactosa, como E. coli (10).Los hongos son organismos eucariontes que pueden ser unicelulares (levadura) o multicelulares (micelio), los que a su vez pueden ser septados, de clulas uninucleadas o coenocticos, de clulas multinucleadas (11). Los hongos utilizados fueron Cryptococcus, Rhodotorula, Mucor, Penicillium notatum y Aspergillus niger. Cryptococcus es una levadura, pudiendo formar blastoconidias (12). Rhodotorula es una levadura del tipo basidiomiceto (13). Mucor, es un hongo dimrfico que en ausencia de oxgeno se comporta como levadura (14). Penicillium notatum es un hongo filamentoso septado, junto con Aspergillus niger.Los trabajos prcticos se han realizado con el objetivo de:1. Identificar una bacteria Gram (-) mediante el uso de batera bioqumica convencional y el sistema de identificacin estandarizado API 10S.2. Verificar los mecanismos de conjugacin, transduccin generalizada y transposicin en Salmonella typhimurium mediante anlisis macroscpico de placas de cultivo.3. Conocer y caracterizar la morfologa macroscpica y microscpica de colonias de hongos unicelulares y pluricelulares.

Materiales y mtodos

Lista de materiales:

-Bacteria problema en medio lquido-Asa de platino convencional-Asa de platino adaptada para simular asa en punta-Mechero Bunsen-Batera de medios de cultivo Semitendidos TSI LIA Tendidos Agar corriente Agar manitol Agar citrato Lquidos Caldo corriente Caldo urea Caldo sorbitol Caldo glucosado Caldo Voges-Proskauer Semislidos MIO-Galera API 10S-Cultivos de cepas Salmonella entrica serovar Typhimurium-Lisados de fago transductor P22 de cepas 14028/Cherry y MST1063-Placas con medio Agar Luria, Agar Luria Kanamicina-Ampicilina, agar Luria Ampicilina, agar MacConkey kanamicina.-Cepa E. coli CC1000 y Salmonella 2C-Micropipetas-Puntas de micropipetas-Placas preparadas con placas de lisis del fago P22 y H5-Placas de agar verde-Agar blando-Muestra con concentracin desconocida de fagos-Microscopio Olympus CX21-Aceite de inmersin-Estufa-Agar sabouraud-Cultivos de levaduras (Cryptococcus, Rhodotorula, Candida albicans)-Cultivos de hongos filamentosos (Aspergillus niger, Mucor, Penicillium notatum)-Batera para tinciones Cristal violeta Lugol Solucin de alcohol-acetona Safranina al 1% Azul de lactofenol Tinta china-Portaobjetos-Cubreobjetos

Procedimientos:

Trabajo prctico N3 (Anexo)El procedimiento se realiz de acuerdo a lo estipulado en la gua de trabajo (15), con la excepcin de que para sembrar los medios semitendidos y semislidos no se utiliz un asa en punta.

Trabajo prctico N4El procedimiento se realiz de acuerdo a lo estipulado en la gua de trabajo (16), con la excepcin de que la incubacin a temperaturas ms alta que la ambiental se emple una estufa, en vez de un bao termorregulado, y adems de us puntas de micropipeta en vez de mondadientes

Trabajo prctico N5El procedimiento se realiz de acuerdo a lo estipulado en la gua de trabajo (17), con la excepcin de que se dispuso de un cultivo adicional: Candida albicans.

Resultados

Identificacin de bacteria Gram ()Se realiz una batera bioqumica convencional, en donde se emplearon 10 medios de cultivo, los que permiten determinar la actividad metablica de la muestra problema. Los resultados para cada prueba se presentan en la Tabla I. Estos resultados se contrastan con la actividad metablica previamente identificada de las bacterias de la familia Enterobacteriaceae (18).Complementario a esto, se realiz el sistema de identificacin estandarizado, API 10S, que permite obtener la identidad de la bacteria de manera ms rpida, mediante anlisis computacional. Los resultados para cada prueba se presentan en la Tabla II.Al obtener la identidad mediante la batera bioqumica, se obtuvo que hubo una compatibilidad de 12 aspectos, de un total de 14. Mediante API 10S, la compatibilidad que mostr el software fue de 57,2%. La compatibilidad porcentual de cada mtodo se muestra en la Tabla III.Tabla I. Batera bioqumica convencional Tabla II. API 10S Simbologa: +; positivo. -; negativo. A; cido. TSI; triple sugar iron. LIA; Lysine Iron Agar. MIO; Motilidad-Indol-Ornitina. H2S; cido sulfrico. *; no coincidi con lo esperadoLas muestras fueron observadas directamente.Los resultados que no coincidieron con lo esperado se marcaron con un asterisco.

Simbologa: +; positivo. -; negativo.Las muestras fueron observadas directamente.

Prueba bioqumicaResultado

Caldo glucosadoA

Agar manitol- *

Citrato-

Urea+

Caldo corriente- *

Voges-Proskauer-

Rojo de metilo+

Agar corriente-

TSI+

LIA-

MIO-

H2S-

ReaccinResultado

ONPG+

GLU+

ARA-

LDC+

ODC-

CIT-

H2S-

URF-

TDA-

IND+

NO2-

Oxidasa-

Tabla III. Porcentaje de compatibilidad con fenotipo de E. coliMtodo de identificacinCompatibilidad con fenotipo de E. coli

Batera Bioqumica85,7%

API 10S57,2%

El porcentaje compatibilidad de la batera bioqumica corresponde a la razn entre pruebas compatibles y pruebas totales, multiplicado por 100. El porcentaje de API 10S fue entregado por un software computacional.

Gentica microbiana

Observacin de placas de lisisAl examinar las muestras preparadas de placas de lisis de distintos fagos, fue posible identificar las caractersticas presentadas en la Tabla IV.

Tabla IV. Placas de lisis de fagos H5 y P22FagoPlacas de lisisColonias

H51S

P223No

Simbologa: Para cuantificar las placas de lisis, se us una escala que va de 0 a 3, en donde 0 es nada y 3 es lo mximo observadoLas muestras fueron observadas directamente, sin aumento.

Metabolismo bacterianoAl sembrar los fagos H5 y P22, provenientes de sus respectivas placas de lisis, en placas de agar verde, se obtuvieron los resultados de la Tabla V. Las placas de agar verde permiten el aislamiento de Salmonella spp.

Tabla V. Caractersticas de cultivos de fagos en agar verdeFagoCaractersticas

H5Predominio de colonias negras, con presencia de algunas colonias blancas

P22Colonias negras

Las muestras fueron observadas directamente, sin aumento.

Concentracin de fagosAl sembrar el fago de concentracin desconocida junto con la bacteria Salmonella typhimurium en agar corriente no hubo placas de lisis. La concentracin de fagos est dada por PFU (unidades formadoras de placas) (19)

Movilizacin de plasmidios por conjugacinAl sembrar cepas de E. coli y Salmonella tanto juntas como separadas, en medio LB Kanamicina-Ampicilina, se obtuvieron los resultados presentes en la tabla VI. Este medio inhibe el crecimiento de un amplio rango de bacterias, entre ellas E. coli y Salmonella.

Tabla VI. Placas de lisis de fagos P22Tipo de siembraBacteria sembradaCrecimiento

Zig zagE. coliNo

Salmonella typhimuriumS

E. coli + Salmonella typhimuriumS

CspedE. coli + Salmonella typhimuriumS

Las muestras fueron observadas directamente, sin aumento.

Transduccin de plsmidosAl agregar el fago P22Cherry junto a Salmonella WT en una placa LB Ampicilina, medio antibacteriano de amplio espectro, se obtuvo los resultados de la tabla VII.

Tabla VII. Tipo de siembraResultados

ZigzagColonias de color rosado

CspedColonias de color rosado

Las muestras fueron observadas directamente, sin aumento.

Mutagnesis usando fagos con transposnAl sembrar el fago P221063 junto con Salmonella WT en medio MacConkey-Kanamicina, inhibiendo el crecimiento de bacterias Gram (+) y Gram (-) respectivamente, se obtuvo los resultados de la Tabla VIII.

Tabla VIII. Tipo de siembraColor agarCantidad de colonias

Zig zagRojo oscuro 1

CspedCaf3

Simbologa: Para cuantificar las cantidad de colonias, se us una escala que va de 0 a 3, en donde 0 es nada y 3 es lo mximo observadoLas muestras fueron observadas directamente, sin aumento.

Morfologa de levaduras

En cuanto a la morfologa de levaduras, se realiz un examen macroscpico de 3 cultivos, cuyas caractersticas se presentan en la Tabla IX.

Tabla IX. Caractersticas macroscpicas de levadurasEspecieFormaColorSuperficieBordeElevacinBrillo

RhodotorulaColoniascircularesSalmnLisaLisoSS

CryptococcusColoniascircularesCremaLisaLisoSPoco

Candida albicansColonias circulares BlancoLisaLisoSNo

Las muestras fueron observadas directamente, sin aumento.

Por otro lado, para realizar el examen microscpico, se emple tincin Gram, examen al fresco, y examen al fresco de cpsula. La tincin Gram permite mayor claridad en el examen de las levaduras. Los resultados de la tincin Gram se presentan en la Tabla X, los de examen al fresco en la Tabla XI, y los de examen al fresco de cpsula en la Tabla XII.

Tabla X. Tincin GramEspecieAfinidad tintorialForma

CryptococcusSafranina Redonda

RhodotorulaCristal violetaOvoide

Candida albicansCristal violetaOvoide

Las muestras fueron observadas mediante microscopa de luz, con un aumento de 40x.

Tabla XI. Examen al frescoEspecieCaractersticas

CryptococcusClulas de forma redonda

Las muestras fueron observadas mediante microscopa de luz, con un aumento de 40x.

Tabla XII. Examen al fresco de cpsulaEspecieCaractersticas

CryptococcusEsporas azules oscuras, en distintos planos

Las muestras fueron observadas mediante microscopa de luz, con un aumento de 100x.

Morfologa de hongos filamentosos

Para determinar la morfologa de los hongos filamentosos, se realiz un examen macroscpico, cuyos resultados se presentan la Tabla XIII.

Tabla XIII. Caractersticas macroscpicas de hongos filamentososEspecieColor ansversoColor reversoSuperficie

Aspergillus nigerNegroBlanquecinoPulverulenta

Penicillium notatumVerdeAmarilloAterciopelada (ansverso corrugado)

MucorBlancoCremaAlgodonosa

Las muestras fueron observadas directamente, sin aumento.

Para poder tener una aproximacin a la identidad del hongo mediante las estructuras que contienen las esporas, se realiz un examen microscpico, cuyos resultados se presentan en la Tabla XIV.

Tabla XIV. Examen al fresco de hongo filamentosoEspecieCaractersticas

Penicillium notatumPresencia de conidias, conidiforos y filides

Las muestras fueron observadas mediante microscopa de luz, con un aumento de 100x.

Discusin

Los resultados obtenidos en cuanto a la identificacin de bacterias Gram (-), dan cuenta de una mayor precisin en la obtencin de la identidad por parte de la batera bioqumica (Tabla III), en comparacin con el sistema API 10S, lo que era de esperar, ya que API 10S tiene un enfoque ms amplio (3), lo que implica que al identificar una mayor cantidad de bacterias, existe una mayor probabilidad de que se usen pruebas que no sean tan atingentes a enterobacterias, lo que llevara a que puedan haber errores en alguna prueba que no sean tan importantes, pero que disminuyan de igual manera la compatibilidad. Adems, al emplear el mtodo API 10S, se ha reportado error de identificacin en 2 de 28 cepas de E. coli probadas (20). En cuanto a los dos resultados divergentes que hubo en el mtodo de batera bioqumica (Tabla I), que correspondieron a agar manitol y caldo corriente con reactivo de Kovacs, lo que se puede deber a una mala ejecucin de las pruebas.En la seccin de gentica microbiana, con respecto a la observacin de placas de lisis (Tabla IV), se tiene que los resultados coinciden con lo esperado, ya que en la muestra de placas de lisis de H5, fago lisognico, se encuentran colonias y una baja cantidad de placas de lisis, lo que implicara que la muerte bacteriana no es responsabilidad directa del virus, ya que hay colonias, mientras que en la muestra de P22, fago ltico (21), no se encuentran colonias y hay abundantes placas de lisis, lo que permite inferir que el virus est destruyendo las bacterias.En la seccin de metabolismo bacteriano (Tabla V), se tiene que existe una predominancia de colonias oscuras, que son signo de que hubo lisis, ya que sta acidifica el medio, provocando la oscuridad de las colonias (22). Sin embargo, hubo una pequea cantidad de colonias claras, en la placa con el fago H5, lo que implica que no existe lisis en esas colonias. Aunque se esperara que en la placa del fago H5 hubiese habido predominancia de colonias claras, esto se puede explicar por el tiempo que pas, en el que pudo haber ocurrido una lisis celular que no fue causada por los fagos.Con respecto a la determinacin de la concentracin de fagos, esta no se pudo determinar, ya que no se formaron placas de lisis, lo que se puede deber a que la concentracin del fago haya sido muy baja, a que haya habido muerte de la bacteria debido a que no se disminuy lo suficiente la temperatura del agar blando, o a un error en las diluciones.En cuanto a la movilizacin de plsmidos por conjugacin (Tabla VI), se obtuvo crecimiento cuando se sembraron ambas bacterias juntas, lo que es de esperar en el caso de que exista conjugacin, ya que ambas bacterias se transferirn los genes de resistencia que necesitan recprocamente. Sin embargo, hubo crecimiento de Salmonella typhimurium sola, lo que se podra deber a que esa cepa se haya contaminado con una bacteria que tuviera resistencia, y por conjugacin, esta bacteria le hubiese transferido genes de resistencia.En cuanto a la transduccin de plsmidos (Tabla VII), se apreci tincin rosa en las colonias, lo que es signo de que hubo transduccin del fago P22Cherry.En la seccin de mutagnesis (Tabla VIII) se not crecimiento bacteriano, lo que sugiere que hubo una gran tasa de transposicin de genes, que eventualmente otorgaron a Salmonella typhimurium resistencia a kanamicina. Adems, el menor crecimiento al sembrar en zigzag, se puede deber a que en ese mtodo, las concentraciones son muy bajas, disminuyendo la cantidad, y por tanto, actividad de los fagos (23).Por ltimo, con respecto a la morfologa de hongos, todos los resultados coincidieron con lo esperado, y la existencia de conidiforos, conidias y filides confirmaron que el hongo que se examin al fresco fue Penicillium (Tabla XIV). Sin embargo, se not un marcado aumento en la claridad de la tincin Gram en levaduras, lo que se debe a su alto contenido de glicoprotenas, en comparacin con hongos filamentosos (24).

Conclusin

En funcin de los resultados obtenidos, se puede afirmar que la identificacin de una bacteria se puede realizar tanto por medio de la batera bioqumica convencional, como de sistemas estandarizados como API 10S, pero dentro de estos dos, es ms precisa la batera bioqumica, con el costo de realizar un proceso ms engorroso en comparacin con API 10S.Adems, se puede concluir que en Salmonella typhimurium, bajo las condiciones adecuadas, pueden ocurrir los procesos de variabilidad genmica de conjugacin, transduccin generalizada y transposicin de genes.En cuanto a la morfologa de los hongos, se tiene que un examen macroscpico permite distinguir levaduras de hongos filamentosos, mientras que el examen microscpico permite identificar la especie fngica.A modo de resumen, a partir de las experiencias realizadas se pudo verificar la utilidad e importancia de los procedimientos prcticos realizados en microbiologa, teniendo como ejemplo de esto a la identificacin de bacterias u hongos, en cuanto al diagnstico de una enfermedad, o a la variabilidad del genoma bacteriano, a fin de entender la progresin de enfermedades infecciosas, en donde estos mecanismos incrementan la resistencia del microorganismo.

Bibliografa

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