Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

Co nta cto :Co nta cto : digital@bl.fcen.uba.ar

Tesis Doctoral

La reacción acrosomal inducida porLa reacción acrosomal inducida porfluido folicular como medida de lafluido folicular como medida de la

capacidad funcional delcapacidad funcional delespermatozoide humanoespermatozoide humano

Piñeiro de Calvo, Lucrecia

1998

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

This document is part of the Master's and Doctoral Theses Collection of the Central LibraryDr. Luis Federico Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied bythe corresponding citation acknowledging the source.

Cita tipo APA:

Piñeiro de Calvo, Lucrecia. (1998). La reacción acrosomal inducida por fluido folicular comomedida de la capacidad funcional del espermatozoide humano. Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires.http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3086_PineirodeCalvoCita tipo Chicago:

Piñeiro de Calvo, Lucrecia. "La reacción acrosomal inducida por fluido folicular como medidade la capacidad funcional del espermatozoide humano". Tesis de Doctor. Facultad de CienciasExactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1998.http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3086_PineirodeCalvo

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRESFACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

La reacción acrosomal inducidapor fluido folicular como medida

de la capacidad funcionaldel espermatozoide humano

Autor: Lic. Lucrecia Piñeiro de Calvo

Director:Richard J. Sherins, M.D.

Co-Director:Dr. Eduardo H. Charreau

Lugar de trabajo: Genetics & IVF Institute, Fairfax, Virginia.Estados Unidos de Norteamérica

Tesis presentada para optar al título deDoctor de la Universidad de Buenos Aires

(Orientación Quimica Biológica)

r3986.v1998

SCHOOL OF EXACT AND NATURAL SCIENCESUNIVERSITY OF BUENOS AIRES

Ph.D. Thesis:

FOLLICULAR FLUID-INDUCED ACROSOMEREACTION

AS A MEASURE OF HUMAN SPERM FUNCTION

Author:Lucrecia Piñeiro de Calvo

Director:Richard J. Sherins, M.D.

Director in Argentina:Eduardo H. Charreau, Ph.D.

Workplace:GENETICS & IVF INSTITUTE

FAIRFAX, VIRGINIA, USAand

NATIONAL INSTITUTE OF CHILD HEALTH ANDHUMAN DEVELOPMENT

BETHESDA, MARYLAND, USA

-l998­

TODO TIENE SU MOMENTO YCADA COSA SU TIEMPOBAJO EL CIELO.

Eclesiastés 3:1

A mispadresA Juan Carlos.

A María Florencia.

AGRADECIMIENTOS

A Richard J. Shen'ns, maestro y amigo, por todas las cosas que me enseñó a lo largo desiete años de trabajo, no sólo sobre Andrología, sino sobre la vida en general. Porque através de su calidad humana y científica aprendi lo que significa el buen ejercicio de laMedicina.

A Lisa Dennison-Lagos, por su apoyo constante e incondicional, dentro y fuera dellaboratorio. Porque este logro es el resultado de su esfuerzo también, aunque le cuesteaceptarlo. Por las largas horas de trabajo compartidas con mucho humor; por enseñarmequé es una Margarita, y por sobre todas las cosas, por esta gran amistad que empezócasi sin que nos diéramos cuenta y que nos sigue uniendo a través de muchas millas dedistancia.

A David Vantman, por su franca amistad y por todos los momentos de ciencia y filosofiacompartidos frente a una taza de café en los pasillos del NIH. Por enseñarme todo loque sabía. Por haberme ayudado a entender que los espermatozoides humanos no separecen nada a los de rata, aunque a veces...¿Quién diría?

A Steven Banks, “genio” de la estadística aplicada a la biomedicina y responsable deltratamiento estadístico de los resultados, por haberme hecho perder el miedo alIlp<0,05|l.

A George Koukoulis, con quien comparti mi estadía en el NlH, por sus consejosprácticos en el laboratorio, sus lecciones de historia y su desinteresada amistad.

A mis restantes compañeros de laboratorio en el NlH, Allen Burris y Linda Liu, porayudar a que no me sintiera extranjera al llegar a su país.

A Amy, Anita, Bill, Gareth, Janie, Karen, Kim, Melissa, Roakie, Ryn, Ted, todosjóvenes Biológos que desfilaron por el laboratorio de Andrología del G&IVF y notuvieron más remedio que aprender a medir reacción acrosomal. Por su valiosaasistencia técnica y por enseñarme tantas cosas lindas del "American way of life". Aalgunos, también por brindarme su amistad.

A Markku Saaranen, por su finlandesa calidez y los momentos compartidos en ellaboratorio.

A María Bustillo, de quien aprendí mucho sobre el manejo de la pareja infértil y lareproducción asistida, por su generosa amistad y buenas ideas.

A Joseph D. Schulman, Director del G&IVF, por darme la posibilidad de realizar estetrabajo y permitir que me sintiera parte de los logros del Instituto durante esos años.

A los integrantes del laboratorio de Embriología del G&IVF: Andy, Lilli, Sam, Simone,por no protestar cada vez que les pedí que me juntaran los fluidos foliculares o que meprestaran suero de cordón fetal y medio Ham's. Y porque sin ellos no habría datos deFlV en este trabajo.

A todos los demás integrantes del G&IVF, por su calidez y por haberme ayudadosiempre que lo necesite. Nombrarlos a todos sería imposible, pero cada uno sin dudacontribuyó a que G&lVF ocupara un lugar especial en mi vida.

Al Dr. Jorge Blaquier, de la mano de quien tuve la suerte de dar mis primeros pasos enla investigación científica, por enseñarme todo lo que siempre quise saber sobre elespermatozoide en el epidídimo y quejamás me atreví a preguntar.

A todos mis viejos compañeros de laboratorio en el lBYME, mi segundo hogar durantetantos años: Adriana, Alejandra, Audrey, Elsa, Esteban, Fernanda, Jorge, Juan CarlosGarberi, Miguel, Mariana, Mónica Cameo, Mónica Vázquez, Pablo, Patricia, Paty,Stella...Algunos han tomado otros rumbos, otros siguen estando en el mismo lugar.Gracias por todos los momentos compartidos: los científicos que ayudaron a miformación y los otros que llevaron a forjar muchas amistades.

A Patricia Miranda, por sus incansables “¿Y?...¿Para cuándo?”

A Clarisa Marín, por las valiosas discusiones científicas, la minuciosa revisión de estemanuscrito y los espermatozoides de tapa. Por su sincera amistad, sus palabras dealiento y sobre todo, por ser la gota que horadó la piedra.

A Mónica Cameo, por estar en el lugar adecuado en el momento adecuado. Por renovarcon tantas ganas una vieja amistad, por su contagioso entusiasmo y por abrirmegenerosamente las puertas de BR.

Al resto de los integrantes de BR, Mariana, Paula, Paulita, Quique, Sara, Vanina, porcontribuir a que pudiera encontrar alli un espacio donde crecer cientifica ypersonalmente al volver a la Argentina.

A mis alumnos, por su estímulo constante yjuventud.

Al Dr. Eduardo H. Charreau por su apoyo continuo y ayuda desinteresada que hicieronposible que pudiera concluir esta asignatura pendiente. A él y al Dr. Carlos P. Lantospor haber creído siempre en mí, a lo largo de tantos años.

A mis amigos, los de aqui y los de allá, que aunque nada tienen que ver científicamentecon este trabajo, estuvieron a mi lado compartiendo penas y alegn'as: Alejandra yGuillermo, Ana y Jorge, Antonella, Aylin y Juan, Barb y Tony, Carlos y Adriana, CheeKeng, Giorgia, Giulia, Inés y Omar, Liliana y Horacio, Machiko y Masaki, María, MaríaVictoria, Mariana y José, Mirta, Ofelia y Adrián, Sara y Duncan, Sonia y Angel, Susy,Voja...A los viejos de Montserrat y a los nuevos de Jesús Misericordioso...

A Rosa y Pedro, porque desde que recuerdo estuvieron siempre a mi lado.

A Marta, por ser una "Tía Chocha" que alguna vez imaginó que ganaría el Nobel.

A Rosa Man'a, simplemente porque sí.

A Angela, por quereme como a una hija.

A mis padres, por ser como son, por hacerme lo que soy y por su apoyo y cariñoincondicionales desde el día en que nací. A Mamá, además, por la cuidadosa lectura ycorrección de este manuscrito.

A Juan Carlos, por las largas horas frente a la computadora y la infinita paciencia.Porque sin él esto no sería realidad. Pero, especialmente, por apoyarme en todos misemprendimientos.

A María Florencia, por los simpáticos espermatozoides que aprendió a dibujar desdemuy chiquita. Por estar aquí y hacer que quiera ser mejor cada día.

RESUMEN

El objetivo de este trabajo fue evaluar el uso de un ensayo de reacción acrosomal (RA) en respuesta afluido folicular humano (hFF) como indicador de funcionalidad espermática. Se establecieron lascondiciones óptimas de ensayo utilizando espermatozoides de donantes fértiles. Se evaluó Ia influenciade la composición del medio de capacitación sobre hFF-RA: la naturaleza del suplemento proteico, perono así la composición iónica, afectó considerablemente los resultados del ensayo.Se estudió hFF-RA en 58 hombres fértiles y 232 pacientes infértiles. El %RA (diferencia entre losporcentajes de espermatozoides reaccionados en presencia y ausencia de hFF) en la población normalpresentó una distribución Gaussiana, con una media de (17:1)%. El intervalo de confianza (IC) del 95%para %RA indicó que valores inferiores al 5% se encontraban fuera del rango normal. El %RA fue mayorque 9% en 83% de los individuos normales y sólo el 2% de los mismos tuvo un %RA anormal (<5%). Secalculó la variabilidad inlraindivíduousando múltiples muestras de cada donante. obteniéndose un IC del95% de :4 unidades de RAcon respecto a la media individual.El %RA en la población infértílno presentóuna distribución Gaussiana, y el valor de su mediana fue 3%. El 60% de los pacientes presentó un %RAfuera del rango normal (<5%) y sólo el 26% de los mismos tuvo un %RA mayor de 9%. Como lospacientes ingresaron al estudio en forma secuencial, sin importar la etiología de su infertilidad. lapoblación estudiada fue muy heterogénea e incluyó individuos con un amplio espectro de caracteristicasseminales. Se observó un aumento progresivo en el número de pacientes con %RA < 5% (RA-) a medidaque se deterioró Ia calidad del semen. Sin embargo, 20% de los pacientes con buen semen fueroninesperadamente RA-, mientras que 29% de los pacientes con semen deficiente fueron RA+ (%RA >5%). Así, a pesar de que hubo correlación significativaentre %RA y otros parametros seminales, %RA nofue predecible a partir de los datos de un espermograma tradicional.Se analizó la capacidad de %RA para predecir el éxito en FIV mediante un estudio prospectivo. Lamediana del % de ovocitos fertilizados aumentó con %RA: los pacientes RA- fertilizaron solamente 12%ovocitos, mientras que los pacientes con %RA > 9% fertilizaron 50% de los ovocitos. La sensibilidad delensayo fue 0,75, su especificidad 0,55 y su razón de probabilidades 2,9; así, la posibilidad de fertilizar unovocito fue 2.9 veces mayor para los pacientes RA+ que para los RA-. Cuando los pacientes sedividieron en cuatro grupos de acuerdo con sus parametros seminales, el % de ovocitos fertilizadosdisminuyó al deteriorarse las caracteristicas del semen. Sin embargo, dentro de cada subgrupo, lamediana del % de ovocitos fertilizados fue 3 a 4 veces mayor en pacientes RA+ que en RA-, indicandoque la RA tuvo un efecto mayor sobre el éxito en FIVque los parámetros tradicionales del semen.Se trató de construir un modelo predictivo del éxito en FIV, considerando una serie de parámetros defertilidad, tanto en el hombre como en la mujer. Los resultados obtenidos en las fases de Construcción yValidación del modelo mostraron que %RA tenia la mayor correlación con el exito en FlV y que lainclusiónde cualquiera de los otros parámetros evaluados, no añadía poder estadístico al modelo.Los datos aqui presentados indican que %RA es una medida estable de la función espermática y tiene unvalor predictivo mayor para el éxito en FIVque el espermograma tradicional, incluyendo la morfología concriterios estrictos. Si bien la capacidad fertilizante no puede predecirse adecuadamente a través de unúnico parámetro del espermatozoide, la determinación de hFF-RA parecería ser una herramienta útil enla evaluación de la posibilidad de éxito de un paciente en FIV.

PALABRAS CLAVES: espermatozoide humano - reacción acrosomal - fluido folicular - FIV ­funcionalidad espermática - Písum Sativum

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the potential use of an acrosome reaction (AR) assay in response tohuman fotlicular fluid (hFF) as a sperm function diagnostic tool. Optimum assay conditions wereestablished using sperm from normal fertile men. The influence of media composition on AR inducibilitywas assessed: protein supplementation in the capacitation medium, but not ionic composition, stronegaffected assay results.hFF-AR was analyzed in 58 normal fertile men and 232 infertile patients. AAR (% reacted sperm in thepresence of fotlicular fluid - % reacted sperm in control) in the normal population followed a Gaussiandistribution, with a mean of (17:1)%. The 95% Confidence Interval (Cl) for AAR showed that values under5% would be outside the normal range. AAR was greater than 9% in 83% of the normal subjects studiedand only 2% of fertile individuals had a failed AAR (<5%). Within person variability was calculated usingmultiple specimens from each subject and rendered a 95% CI of 4 AR units above and below his meanvalue. AAR in the infertile population did not followa Gaussian distribution, and its median value was 3%.

AAR values were below the normal range (<5%) in 60% of the patients and only 26% of the patients hadvalues over 9%. Because patients entered the study sequentially, regardless of the aetiology of infertility,the patient population comprised a wide variety of subjects ranging from individuals with good to extremelypoor semen quality. There was a progressiver greater number of individuals with AAR < 5% (AR-) assemen quality deteriorated. However, among patients with good semen values, 20% were unexpectedlyAR-, and among patients with severer impaired semen quality, 29% had AAR > 5% (AR+). Thus, eventhough there was a significant correlation between AAR values and other semen measurements. AARcould not be predicted from conventional semen analysis.The ability of AAR to predict fertilization success in IVF was analyzed prospectively. The medianpercentage of eggs fertilizedincreased as AAR became greater: spermatozoa from AR- patients fertilizedonly 12% of eggs, while spermatozoa with AAR > 9% fertilized 50% of eggs. The assay had a sensitivityof 0.75, a specificity of 0.55 and an odds ratio of 2.9; thus, AR+ patients were 2.9 times more likely toachieve fertilization at IVF than AR- patients. When patients were divided into four clearly definedsubgroups according to their semen characteristics, the median percent eggs fertilized decreased assemen characteristics deteriorated. However, within each patient subgroup, the median percent eggsfertilized was 3- to 4- fold higher for AR+ than for AR- patients, indicating that AR had a greater effect onfertilizationthan traditional semen parameters.An attempt was made to construct a model to predict fertilizationsuccess at IVFtaking into account seriesof fertilityparameters, both male and female. Results obtained in the Construction and Validation phasesof the study showed that AAR had the highest correlation with fertilization success at IVF and that theinclusion of any of the other parameters evaluated in the model, added no statistical benefit.Though it is necessary to acknowledge that fertilitypotential cannot be predicted accurater measuring asingle sperm parameter, the data presented indicate that AAR is a stable measure of sperm function andhas a much higher predictive value for IVFsuccess than traditional semen parameters, including spermmorphology by strict criteria. hFF-AR assessment seems to be a clinically useful diagnostic tool indetermining a patient's likelihood of achieving fertilization at IVF.

KEY WORDS: human spermatozoon - acrosome reaction - follicular fluid - IVF - sperm function - PisumSativum

Indice i

- INTRODUCCION ­

Intrnduorir'm lFertilidad,Subfertilidad e Infertilidad 2Infertilidad " 4

EI espermatn7nide 7Interacción con el ovocito ...... .. l4Reacción Acrmnmal 16Reconocimiento y penetración de la Zona 22Fusión con el ovocito y Singamia 23Los ensayos diagnósticos en el laboratorio de Andmlngía 24Propiedades de un ensayo diagnóstico 28El ensayo de reacción acrosomal en respuesta a fluido folicular................................ .. 30

- OBJETIVOS ­

Objetivos 35

- MATERIALES Y METODOS ­

l. Sujetos ‘ ‘° ‘ 38l.l. Población normal 381.2. Población infértil 38l.3. Obtención de muestras 33

2. Análisis del semen ......... ..392. l .Concentración de espermammidec 392.2 Motilidad: porcentaje de mótiles y calidad de mc .' ' ‘ n 392.3 Morfología 402.4 Viabilidad 4o2.5 Análisis computarizado ........ ..4l

3. Procesamiento de las muestras de semen 413.1. Obtención de una fracción altamente mótil 423.2. lncubación en condiicones ‘ 433.3. Inducción de la reacción acrosomal 43

3.4. Evaluación del porcentaje de reacción acrosomal 44

4. Obtención y preparación de los fluidos biológicos utilizados ......................... ..464.1. Fluido folicular 464.2. Suero de cordón umbilical 46

Indice ii

5. Optimizacióm de las condiciones del ensayo de reacción acrosomal .............. ..475.1.0ptimización de la concentración de fluido folicular 475.2. Optimización de la concentración de espermatozoides a capacitar ................. ..485.3. Optimización del tiempo de exposición al fluido folicular............................... ..485.4. Optimizacióndel tiempode r " 485.5. Análisis ‘ "' " - 49

6. Efecto del fluido folicular sobre las características de motilidad deespermatozoides capacitados 49

7. Influencia del medio de capacitación sobre la respuesta al fluido folicular..... 507.1. Composición salina 507.2. Suplemento proteico 52

8. Ensayo piloto para comparar la reacción acrosomal inducida por fluidofolicular en espermatozoides de individuos normales y pacientes infértiles.....548.1.Sujetos ‘ "' ‘ n 548.2. Procesamiento de muestras de semen.... .. 548.3. Tratamiento de resultados ....... .. 54

9. Estudio poblacional dela reacción acrosomal inducida por fluido folicular....559.l. Individuos normales 55

9.1.]. Población ‘ 4' J 559.1.2. Procesamiento de las muestras de semen 559.1.3. Tratamiento de resultados 56

9.2. Pacientes infértiles 569.2. l. Población ‘ " J 569.2.2. Procesamiento de las muestras de semen 579.2.3. Tratamiento de resultados 57

10. Estuido del valor diagnóstico de la reacción acrosomal inducida por fluidofolicular con respecto a la capacidad fertilizante in vitro................................ ..5710.]. Población ‘ 4' J 5710.2. Procesamiento de las muestras de semen 58

10.2.1. Ensayo de reacción acrosomal 5810.2.2. Fertilización ¡n vitro 58

10.3. Obtención de ovocitos y fertilización in vitro de los miqmm 5810.4. Tratamiento de rPCIIltaan 59

ll. Búsqueda de un modelo adecuado para predecir la capacidad fertilizante deuna muestra de espe. ‘ " 60l l.l. Diseño experimental 60

l 1.1. l. Etapa de construcción ........ .. 61ll.l.2. Etapa de "J "m .............62

l 1.2. Procesamiento de las muestras... ........ .. 62

Indice iii

.N

'JI

9‘

>'

9°

- RESULTADOS ­

Optimización de las condiciones del ensayo de reacción acrosomal inducida porfluido folicular 64l.l. Concentración de fluido folicular ..................... ..64l.2. Concentración de espermammides 641.3. Tiempo de exposición al fluido folicular 661.4. Tiempo de capacitación ........ .. 69

Efecto del fluido folicular sobre las características de movimiento deespermatozoides incubados en condiciones capacitantes 7]

Características del medio de capacitación y reacción acrosomal ................... ..733.1. Efecto de la composición salina del medio sobre la reacción acrosomal inducida

por fluido folicular .... .. . 733.2. Efecto del suplemento proteico del medio de capacitación sobre la respuesta al

fluido folicular... 75

Características del medio de capacitación y parámetros de motilidad ............804. l. Efecto de la composición salina del medio sobre la motilidad de los

espermatozoides luego de 2 horas de incubación en condiciones capacitantes..804.2. Efecto del suplemento proteico del medio sobre la motilidad de los

espermatozoides luego de 2 horas de incubación en condiciones capacitantes..80

Ensayo piloto para comparar la reacción acrosomal inducida por fluidofolicular en espermatozoides de individuos normales y pacientes infértiles.... 83

Estudio poblacional de la reacción acrosomal inducida por fluido folicular..... 866. l. Población normal ................................. ..866.2. Población de pacientes infértiles ................. ..89

Estuido del valor diagnóstico de la reacción acrosomal inducida por fluidofolicular con respecto a la capacidad fertilizante ¡n vitro.......................... .. 98

7. l. Población infértil total ................................. .. 98

7.2. Subgrupos de pacientes infértiles .lOI

Búsqueda de un modelo adecuado para predecir la capacidad fertilizante deuna muestra de espermatozoides ........ l 12

8.]. Etapa de construcción l 128.2. Etapa de v "J "m .......... ..l15

Indice iv

- DISCUSION ­

Discusión 122

l. Por qué hFF como inductor 1242. Optimización del ensayo de reacción acrosomal de espermatozoides humanos en

respuesta al fluido folicular humano ...... ..1263. Efecto del fluido folicular sobre las características de movimiento de

espermatozoides capacitados .......... .. 1304. Efecto de la composición salina y e| suplemento proteico del medio de capacitación

sobre el ensayo de reacción acrosomal 1325. Ensayo piloto para comparar la reacción acrosomal inducida por fluido folicular en

individuos normales y pacientes infértiles l366. Estudio poblacional de la reacción acrosomal inducida por fluido folicular ......... .. l377. Estudio del valor diagnóstico de la reacción acrosomal inducida por fluido folicular

con respecto a la capacidad fertilizante in vitro 1418. Búsqueda de un modelo adecuado para predecir la capacidad fertilizante de una

muestra de espermatozoides humanos lSl

- REFLEXION FINAL ­

Reflexión final ..... ..155

- REFERENCIAS ­

Referencias ... l 58

Abreviaturas l7l

INTRODUCCIÓN

La infertilidad de una pareja es consecuencia de una

multiplicidad defactores que contribuyen a ella en forma

variable.

Aceptar todos los factores potencialmente relevantes y

considerar su etiología, aunque por el momento nuestra

comprension de los mismos sea limitada, es esencial para

poder progresar en el diagnóstico y tratamiento de este

complejo problema clínico.

David Mortimer, [994

Fertilidad, Subfertilidad e Infertilidad

El estado de fertilidad de una persona, además de requerir el funcionamiento adecuado

de su aparato reproductor, está sujeto a la influencia de un sinnúmero de factores

extn'nsecos y es altamente variable a lo largo de la vida. Estrictamente, sólo podemos

decir que un hombre fértil es aquél que ha tenido un hijo recientemente, en general,

en el transcurso del último año.

El hombre que logra la paternidad luego de una consulta o inclusive de un tratamiento

por infertilidad, si bien fue sin duda fértil en ese momento, no es necesariamente

normal. Si en una pareja se identifica una causa de infertilidad en la mujer, tampoco es

lícito considerar al hombre normal, ya que un 20% de las parejas que consultan por

infertilidad presenta una combinación de patologías masculina y femenina.

Solamente las parejas que nunca han tenido que ir a la consulta por problemas de

infertilidad y que han logrado un embarazo durante el transcurso de un año de intentarlo,

deberían ser consideradas normales y fértiles. Esta definición, además de encontrarse

históricamente enraizada en la práctica médica, surge de un cálculo probabílístico, ya

"' ¡ónl

que al considerar que la probabilidad mensual de concepción en las parejas normales es

del 20%, la probabilidad acumulativa de concepción al cabo de 12 meses es del 93%

(Guzick, 1996). Cuando una pareja logra concebir luego de un período de tiempo más

largo, se la considera subfértil', es posible que cierta subfertilidad del hombre haya sido

compensada por una superfertilidad de la mujer, o viceversa. Se estima que,

aproximadamente, l/3 de todas las parejas presenta problemas para concebir en algún

momento de sus vidas, pero pocas de ellas realmente no llegan a tener hijos (Puttemans

et al. 1995).

Es decir que la fertilidad, debe considerarse por un lado como un continuo que se

extiende desde la subfertilidad severa hasta la superfertilidad y por otro, como un

atributo de la pareja y no de la mujer o del hombre específicamente (Mortimer, 1994).

No se puede ya justificar el comienzo de un tratamiento por subfertilidad si no se ha

hecho una evaluación exhaustiva de ambos miembros de la pareja. Solamente la

investigación completa de todos los factores que influyen sobre la infertilidad de una

pareja permitirá desarrollar un algoritmo adecuado para su tratamiento (Puttemans et al.

1995).

Cabe señalar aquí la diferencia que existe entre los términos fertilidad y fecundidad, a

veces utilizados en forma indistinta. La fertilidad se refiere a la capacidad de concebir,

mientras que la fecundidad se refiere a la capacidad de dar a luz un nuevo individuo

(Schmidt, Münster, ¡995).

Se acepta en general que, aproximadamente, el 10% de las parejas necesita consultar o

ser tratado por problemas de infertilidad. Un estudio multicéntrico reciente, que

incluyó una serie de clinicas y centros en distintas partes del mundo, reveló que en el

30% de los casos el problema era fiJndamentalmente masculino, en el 30%

Fundamentalmente femenino, en el 27% combinación de ambos y en el 13% restante no

se pudo encontrar una causa específica para la infertilidad (de Kretser, Baker, 1996).

Infertilidad masculina

En el hombre, la fertilidad implica la producción de espermatozoides funcionales que

puedan ser depositados en la vagina en el momento adecuado, para fecundar un ovocito

y dar origen a un embrión viable. Esta definición parece sencilla pero incluye, en

realidad, una sucesión de eventos biológicos que deben tener lugar exitosamente y que

comprenden desde la adecuada producción de espermatozoides en el testículo hasta la

supervivencia embrionaria y fetal in utero (Tabla l).

Tabla l: Eventos biológicosnormalmente requeridos para lograr un embarazo

Espermatogénesis normalMaduración epididimariaTransporte por los conductos excurrentesDeposición de espermatozoides en la vagina al momento de la ovulaciónPenetración del moco cervicalTransporte a través del tracto femeninoCapacitaciónReconocimiento y unión a la zona pelúcidaReacción acrosomalPenetración de la zonaReconocimiento y fusión con el oolemaPenetración al ooplasmaDescondensación nuclearSingamiaDesarrollo embrionarioimplantación en el úteroSupervivencia embrionaria y fetal

La infertilidad masculina es, pues, un síndrome multifactorial que abarca un amplio

rango de desórdenes (Sherins, ¡995). Las causas conocidas de infertilidad, si bien son

'1Illll

numerosas y de naturaleza muy variada, pueden agruparse en un número moderado de

categorias principales (Sherins, 1995), tal como se señala en la Tabla ll:

Tabla ll: Causas conocidas de la infertilidad masculina

Deficiencia de gonadotrofinasAberraciones cromosómicasDesórdenes genéticosObstrucción de los conductos excurrentesTóxicos ambientalesAlcohol / drogasMedicamentos; quimioterapia; radiaciónEnfermedad sistémica

Enfermedad infecciosa (sistémica y genital)Desorden neurológicoVaricoceleEnfermedad autoinmuneImpotencia

Debe recordarse, de todos modos, que en aproximadamente el 50% de los hombres

infértiles, se desconoce la causa de la infertilidad.

Tradicionalmente, el espermograma ha sido el ensayo utilizado más frecuentemente

como índice de fertilidad en el hombre. Sin embargo, el objetivo principal del andrólogo

de laboratorio, que consiste en predecir adecuadamente la capacidad fertilizante de una

muestra de espermatozoides, es muy dificil o casi imposible de lograr a través de un

espermograma. Ésto es bastante fácil de comprender si se tiene en cuenta Ia

multiplicidad de fiJnciones que el espermatozoide debe llevar a cabo exitosamente para

lograr un embrión viable (Tabla l).

En algunos pocos casos, un espermograma permite llegar a una conclusión definitiva.

Por ejemplo, si existe azoospermia, o ausencia de espermatozoides mótiles, o una muy

elevada proporción de espermatozoides morfológicamente anormales, la fertilidad del

individuo se encontrará notablemente disminuida (Amann et al. 1995). Pero, en la

mayoría de los casos, el desafio es mucho más complejo y no debe sorprendernos que

los parámetros clásicamente evaluados en el espermograma no puedan predecir

adecuadamente la capacidad fertilizante. Si bien se debe reconocer que en general existe

una frecuencia mayor de infertilidad masculina entre individuos cuyos parámetros

seminales clásicos se encuentran francamente disminuidos, hay muchas excepciones.

Algunos hombres oligospérmicos (concentración de espermatozoides inferior a la

normal), embarazan fácilmente a sus mujeres mientras otros hombres con espennograma

normal son infértiles (Sherins, 1995).

Actualmente, se acepta que la funcionalidad espermática y no la concentración de

espermatozoides en semen, es el punto clave que determina si un hombre es o no fértil.

En consecuencia, muchos laboratorios se han dedicado al desarrollo de ensayos que

permitan evaluar distintos aspectos funcionales del espermatozoide, con el objeto de

predecir lo más exactamente posible la capacidad fertilizante de una población dada de

espermatozoides. Este es el caso, por ejemplo, de los criterios estrictos de morfología, el

ensayo hipoosmótico, el ensayo de actividad de acrosina, el ensayo de reacción

acrosomal en respuesta a estímulos fisiológicos y farmacológicos, el ensayo de

penetración de ovocitos de hamster, el ensayo de hemizona (Cummins, 1995; Liu,

Baker, 1992), entre otros.

Sin duda, la evidencia más contundente que apoya esta hipótesis del espermatozoide

funcional, proviene de los estudios llevados a cabo por Sherins y colaboradores, en un

grupo de pacientes con síndrome de Kallman (Burris et al. 1988). Estos pacientes, que

desde el punto de vista reproductivo poseen una deficiencia aislada de gonadotrofinas

por ausencia del factor liberador de las mismas, al ser tratados con gonadotrofma

exógena, son capaces de fertilizar naturalmente a sus esposas en el 95% de los casos. Un

espermograma llevado a cabo en estos pacientes alrededor del momento de la

concepción, puso de manifiesto que la misma se llevó a cabo con concentraciones de

espermatozoides en semen tan pequeñas como 0,5 xlOÓ/ml, valor que se encuentra

notablemente por debajo de los 20x106/ml considerado como límite inferior de

normalidad por la Organización Mundial de la Salud (OMS). En estas mismas muestras

de semen, tanto la motilidad, medida no sólo a través del porcentaje de espermatozoides

mótiles sino mediante un sistema CASA (Computer-Assisted Sperm Analyzer) que

permite determinar objetivamente ciertos parámetros de movimiento, como así también

la morfología, se encontraban dentro del rango normal (Vantman et al. 1989). Es decir,

que no importa realmente cuántos espermatozoides haya en el eyaculado, sino que los

que estén presentes sean fiincionalmente aptos.

Un espermatozoide funcionalmente competente es aquel que puede llevar a cabo con

e'xito la compleja serie de eventos que culmina con la formación de un embrión viable,

hecho que se refleja en su morfología y estructura celular altamente especializadas. Una

o varias fallas en cualquiera de las funciones espermáticas podrían dificultar o impedir la

fertilización y el embarazo. Es más, el espermatozoide humano presenta un elevado

grado de pleomorfismo, de modo que en una misma muestra de semen puede haber

distintas poblaciones de espermatozoides incapaces de fertilizar por diferentes motivos

(Amann et al. l995).

El espermatozoide

La fimción principal del espermatozoide es proveer el pronúcleo masculino del ovocito

fertilizado. Debe ser, pues, capaz de conservar su ADN, transportarlo al sitio de

fertilización, reconocer al ovocito y fusionarse con él (Curry, Watson, 1995).

La apariencia general del espermatozoide fue descripta por Anthony van Leeuwenhoek

I A l 'llllll 8

(Houtzager, 1983) en 1677, quien lo observó por primera vez al microscopio y describió

su estructura básica y su comportamiento natatorio. Los avances de la microscopía

óptica durante el siglo XIX, en realidad sólo amplificaron la descripción original de las

características externas de van Leeuwenhoek. Recién en el siglo XX, el desarrollo de la

microscopía electrónica de transmisión en la década del 50 permitió elucidar la compleja

estructura interna del espermatozoide.

El espermatozoide puede dividirse en dos partes fundamentales: el flagelo, relacionado

con la producción de energía y con la iniciación y el mantenimiento de la motilidad y la

cabeza, que contiene el ADN y participa en los mecanismos de reconocimiento de la

zona y fusión con el ovocito. (Figura l). Dentro de estas dos regiones, a su vez, se

pueden distinguir diferentes compartimientos celulares, cada uno de ellos asociado a una

fiJnción específica. Esta compartimentalización es una característica importantísima de

la estructura del espermatozoide, que le permite llevar a cabo la variedad de tareas que

culmina con la formación de un embrión viable.

La cabeza del espermatozoide, que comprende el núcleo y el acrosoma (Figura 2), se

divide comúnmente en dos regiones: acrosomal y postacrosomal (Figura l). Si bien la

organización básica de la cabeza es semejante para todos los mamíferos, la forma y el

tamaño de núcleo y acrosoma son altamente variables y específicos de especie. En el

hombre, la cabeza del espermatozoide presenta un alto grado de heterogeneidad

morfológica, conocido como pleomorfismo, que hace muy dificil definir la forma

normal. De todos modos, se considera normal a una cabeza de forma ovalada, con un

largo aproximado de 4,5-5 pm y un ancho de 2,5-3 pm en su parte más ancha, ya que

éstas son las características de los espermatozoides que han podido recuperarse del

moco cervical.

l Región awesome! Manel-na

Regiónposlacmsoml

CABEZAM- .fl

Guelo

Pieia a

Pieza .7pt'ncipal

COLA

Vaina Columnafibrosa longitudinal

Piezafinal

Figura 1: Fotografía de un espermatozoide humano morfológicamente normal yesquema del mismo, señalando las principales estructuras. A la derecha se señalanlos componentes de la cola en corte transversal a nivel de la pieza media y la piezaprincipal. (Tomado de Matsumoto, 1996).

El acrosoma es una vesícula que cubre como un capuchón a la parte anterior del núcleo.

En el hombre, el acrosoma es relativamente pequeño y rodea, aproximadamente, las 2/3

partes del núcleo. La membrana acrosomal externa (Figura 2) se encuentra

inmediatamente por debajo de la membrana plasmática del espermatozoide y se

continúa, en los extremos posteriores del capuchón, con la membrana acrosoma!

interna que cubre al envoltorio nuclear.

Las membranas acrosomales encierran a la matriz acrosomal que es rica en

carbohidratos y contiene una serie de enzimas líticas, de las cuales las más importantes y

mejor caracterizadas son la hialuronidasa y la acrosina. Estas enzimas son utilizadas

por el espermatozoide para atravesar los distintos envoltorios del ovocito. Hay

evidencias de que las enzimas acrosomales no se encuentran distribuidas al azar dentro

del acrosoma, sino empaquetadas, lo que permite su activación y liberación secuencial

(Holt, 1979). Las enzimas acrosomales son liberadas durante el transcurso de la

reacción acrosomal, evento exocitótico fundamental para que se lleve a cabo la

fertilización.

El borde posterior del acrosoma, conocido como segmento ecuatorial (Figura 2), es

una zona altamente especializada. Las características de las membranas acrosomales de

esta zona, observables al microscopio electrónico, sugieren que se trata de una

estructura muy estable que probablemente interactúa extensivamente con el

citoesqueleto (Virtanen et al. 1984). En el hombre, el segmento ecuatorial tiene forma

de medialuna y, en su zona más ancha, llega a tener hasta l/4 de la longitud total del

acrosoma. La membrana plasmática que cubre el segmento ecuatorial es el sitio de

reconocimiento del oolema y eventualmente, de fusión de membranas de espermatozoide

y ovocito (Yanagimachi, 1988).

MEMBRANASPlasmática

Acrosomalexterna ACVOSOma

Acrosomal interna ÁEnvollura nuclear 'Nu eo

l

Segmentoecuatori'áí *'

Región postacrosomal

..... >¿ Anilloposterior

Pieza media

Figura 2: Estructura de la cabeza del espermatozoide humano. La membranaplasmática recubre la membrana acrosomal externa. La membrana acrosomalinterna recubre el envoltorio nuclear. El acrosoma es más delgado en la región delsegmento ecuatorial que en la región anterior. (Tomado de (Yanagimachi, 1994))

El núcleo del espermatozoide contiene un número haploide de cromosomas y el ADN es

completamente inactivo y no se replica hasta que se encuentra dentro del ooplasma. La

forma del núcleo es altamente específica de especie y determinada por el genotipo. Si

bien en casi todas las especies tiene un alto grado de uniformidad, en el hombre existe

una gran variedad de formas nucleares, que podrían estar asociadas al grado de

condensación de la cromatina.

El flagelo está vinculado a la motilidad del espermatozoide y contiene tanto el sistema

generador de energia, las mitocondrias, como el aparato propulsor de la célula: el

axonema o filamento axial. El flagelo del espermatozoide humano puede dividirse en

cuatro regiones principales: la pieza conectora o cuello, la pieza media, la pieza

principal y la pieza final (Figura l). La anatomía característica de cada una de estas

regiones está directamente relacionada con su función.

Interacción con el ovocito

Un aspecto fiJndamental de la funcionalidad espermática es la interacción con el ovocito,

ya sea in vivo, en el sitio de fertilización (ampula de la Trompa de Falopio) o in vitro,

durante un procedimiento de fertilización asistida.

Una fertilización exitosa es el resultado de la interacción eficaz del espermatozoide

con un ovocito que finalmente culmina con la fusión del material genético de ambas

gametas. La Figura 3 sintetiza la progresión de eventos desde que el espermatozoide

entra en contacto con el ovocito hasta que se produce su incorporación al ooplasma.

1- Unión del _ , l 'espermatozoide' k . 2- Reaccuón acrosomalalazona

,Acrosoma

"53-Penetración atravésOolema 7*' de la zona pelúcida

Zona pelúcida 4 A

4- Fusión de membranasplasmáticas

5- Espermatozoideentra al ooplasma

Figura 3: Progresión de eventos desde que el espermatozoíde entra en contacto conlas células folículares del cumulus hasta que se produce su ingreso al ooplasma.(Tomado de (Alberts et al. 1994))

Los ovocitos de los mamíferos euteríos están rodeados por el cumulus oophorus,

constituido por células foliculares y una matriz extracelular, cuyo principal

componente es ácido hialurónico polímerizado. Esta estructura es la primera barrera que

presenta el ovocito a un espermatozoide fertilizante. Se pensó en un momento que,

normalmente, habría un gran número de espermatozoides rodeando al cumulus y

favoreciendo su dispersión, para que alguno de ellos pudiera penetrar el ovocito. Sin

embargo, se sabe ahora que in vivo, la relación espermatozoíde / ovocito en el sitio de

fertilización es muy cercana a la unidad, de modo que es probable que en la mayoría de

los mamíferos, el cumulus se disperse luego de la fertilización (Blandau, 196]).

En la actualidad, se acepta que los espermatozoides deben estar capacitados pero

intactos (no reaccionados) para poder penetrar el cumulus (Yanagimachi, 1994); los

espermatozoides no capacitados, o aquéllos que se encuentran totalmente reaccionados

al llegar al cumulus, pueden adherirse a él pero no son capaces de penetrarlo.

Capacitación

Los espermatozoides humanos, al igual que los de los demás mamíferos euterios, no son

capaces de fertilizar al ovocito inmediatamente después de la eyaculación. Deben sufrir

el proceso de capacitación (Bedford, 1983; Chang, ¡984), que se define operativamente

como la adquisición de capacidad para sufrir la reacción acrosomal en respuesta al

estímulo adecuado (Yanagimachi, 1988). La capacitación es necesaria para la

fertilización tanto in vivo como in vitro y comienza, en realidad, ni bien los

espermatozoides se separan del ambiente inhíbítorio del plasma seminal (Burkman,

1995). Estudios recientes indican que in vivo la capacitación requiere una comunicación

estrecha entre el espermatozoíde y el tracto genital femenino (Mortimer, 1995). Se

piensa que ¡n vivo, los espermatozoides podrían alcanzar los estadios finales de la

:Illll 1‘

capacitación durante su permanencia en el istmo de la trompa de Falopio, para así llegar

completamente capacitados al sitio de fertilización.

El tiempo necesario para la capacitación varía para las distintas especies (Yanagimachi,

1994) y para distintos individuos dentro de una misma especie; incluso puede ser

diferente para distintos espermatozoides dentro de un mismo eyaculado. Por otra parte,

es probable que la capacitación ¡n vivo ocurra más rápidamente que lo que ocurre in

vitro: es posible que el tracto genital femenino sea capaz de mantener a los

espermatozoides capacitados por períodos de tiempo largos sin que ocurra la reacción

acrosomal, como sucede in vitro (Mortimer, 1995). El tiempo requerido para capacitar

espermatozoides humanos in vitro parece ser muy variable (Perreault, Rogers, 1982); el

tiempo de capacitación in vivo, en el humano, no se conoce aún.

Desde el punto de vista celular, la capacitación incluye cambios morfológicos,

bioquímicos y funcionales, como consecuencia de los cuales los espermatozoides

adquieren capacidad de sufrir la reacción acrosomal y penetrar al ovocito (Yanagimachi,

1994). Quizás, el cambio más notorio durante la capacitación es el que se produce en la

motilidad, que se vuelve extremadamente vigorosa pero poco progresiva y se conoce

como motilidad hiperactivada (Yanagimachi, 1988). Este tipo de motilidad es

necesario para dotar al espermatozoide de la fiJerza mecánica requerida para penetrar la

zona pelúcida (Fleming, Yanagimachi, 1982), probablemente, también para un

transporte efectivo en el oviducto y penetración a través del cumulus (Katz et al. 1989).

En los animales de laboratorio, la motilidad hiperactivada aparece en forma más o menos

sincrónica cuando los espermatozoides se incuban in vitro en un medio adecuado: en el

hamster, por ejemplo, se observa un 70% de espermatozoides hiperactivados luego de 3

horas de incubación (White, Aitken, 1989). En el hombre, en cambio, el porcentaje de

hiperactivación puede variar entre el 3% y el 50% para distintas suspensiones de

' A I :Illll ¡6

espermatozoides (Burkman, 1990) y además, existe una gran variabilidad en la cinética

de hiperactivación para distintas células de una misma muestra. Por otra parte, se han

descripto distintos tipos de espermatozoides hiperactivados (Burkman, 1990) y

característicamente, el espermatozoide humano tiene un comportamiento multifásico, es

decir, puede cambiar espontáneamente de un tipo de hiperactivación a otro o, incluso,

del estado hiperactivado al no hiperactivado (Figura 4).

Todas estas características hacen que sea bastante dificil identificar este tipo de

movimiento en las suspensiones de espermatozoides humanos y que, recién con el

advenimiento de los sistemas de análisis computarizado, se haya logrado avanzar en el

estudio de la hiperactivación en el hombre y su significado funcional. Se ha propuesto

que la hiperactivación es un indicador del éxito en FIV, ya que niveles bajos de

hiperactivación se asocian con una unión deficiente a la zona pelúcida y con una

fertilización reducida (Mbizvo, Alexander, l99l; Burkman, 1995).

Reacción acrosomal

La reacción acrosomal es un evento exocitótico que implica la fiJsión de las membranas

plasmática y acrosomal externa, seguida de la formación de vesículas y consecuente

liberación del contenido acrosomal, fimdamentalmente hialuronidasa y acrosina, a través

de los orificios entre las vesículas (Figura 5).

El sitio en el cual comienza la fiJsíón de membranas puede variar de acuerdo con la

especie; en el humano parecería comenzar en la región anterior del acrosoma (Yudin et

al. 1988).

if... 17

IP.. . y/

,, Hiperactivado Hel'co'da' _ _ \. " a? , Hlperactnvado Nx

’ ' 1

’ Z" _ . V7, x l i ‘

Star-spin Transmonal é, Transmlonalug f ' r)

(A 44.. <——Transicional

y

‘ HiperactivadofiV/‘V'QÉ

Hiperactivado ' ¿z-Ï‘ ,< 4‘;» N

\ ¡IV ¡7' Transicionalx C]ñ 5x4" ¿a « rmi ‘ ‘\ \.: v< x A fi H“I v5.

La A V/VX?

\!_¿\¿'\«" 4- Transicional w meu?“ ­

Figura 4: Comportamiento multifásico de espermatozoides humanos, durante elcual las células cambian espontáneamente de un movimiento transicional a unmovimiento hiperactivado. Se señalan dos tipos de movimiento hiperactivado:helicoidal y estrellado o “star-spin”. (Tomado de (Aitken, 1995))

lntrmluu‘ión 18

MAI}

N.

.->..‘<

-:.:r_'ur.‘z''I'- \

Figura 5: Esquema que ilustra el progreso de la reacción acrosomal. (A)

Espermatozoide antes de reaccionar. Ac=acrosoma; SE=segmento ecuatorial (B)

Comienza la reacción con múltiples puntos de fusión entre las membranas

plasmática y acrosomal externa y salida del contenido acrosomal. (C) y (D) La

reacción acrosomal se completa. MA|= membrana acrosomal interna. (Tomado de

(Yanagimachi, 1994))

Cuando la capacitación ha sido completa, los espermatozoides inician y completan la

reacción acrosomal muy rápidamente al recibir el estímulo adecuado. En el humano, en

espermatozoides capacitados, se observa fusión de las membranas plasmática y

acrosomal externa luego de 5 a lO segundos de exposición a fluido folicular; la reacción

se ha completado, con dispersión de la matriz acrosomal, al cabo de los 3 minutos

(Yudin et al. 1988) (Figura 6).

Dado que el acrosoma contiene una variedad de enzimas líticas, puede ser autodigerido

por espermatozoides moribundos o ya muertos, a causa de la pérdida de selectividad de

su membrana plasmática (Yanagimachi, 1994). Al microscopio óptico, estos

espermatozoides cuyos acrosomas degeneran a causa de la muerte celular son

semejantes a aquéllos que reaccionan fisiológicamente. Es por eso que se ha sugerido

llamarfalsa a este tipo de reacción acrosomal, para distinguirla de la reacción acrosomal

verdadera que tiene lugar en espermatozoides vivos (Bedford, 1970).

La reacción acrosomal falsa, asociada con la muerte celular, ocurre continuamente en

el tracto genital femenino, que, en general, es bastante hostil al espermatozoide.

Solamente aquellos espermatozoides que se encuentren en el lugar correcto en el

momento oportuno permanecerán vivos dentro del tracto. Existen evidencias que

indican que casi todos los espermatozoides vivos en el moco cervical (Zinaman et al.

1989), el útero (Overstreet, Cooper, 1979) y el istmo de la trompa de Falopio (Smith,

Yanagimachi, 1989) tienen sus acrosomas intactos. Algunos espermatozoides podrían

iniciar la reacción acrosomal dentro del cumulus, pero todo parecería indicar que los

espermatozoides fertilizantes no comienzan su reacción acrosomal in vivo hasta que

entran en contacto con la zona pelúcida (Yanagimachi, 1994)

Figura 6: Reacción acrosomal en espermatozoides humanos en presencia de fluidofolicular humano (hFF). (A) Espermatozoide capacitado, no reaccionado. (B) 5segundos luego de exposición a hFF la matriz acrosomal está hinchada (flecha).Las puntas de flecha señalan las membranas acrosomales externa e interna. (C) 10segundos luego de exposición a hFF las membranas acrosomales externa e internacomienzan a fusionarse a la altura de la región anterior del acrosoma. (D) 20segundos luego de exposición a hFF aparecen vesículas (V) híbridas formadas pormembrana plasmática y membrana acrosomal externa. La vesiculización m seextiende al segmento ecuatorial (SE). MAI= membrana acrosomal interna; MA=matriz acrosomal. (E) Espermatozoide reaccionado con su SE intacto. (Tomado de(Yudin et al. 1988; Thomas, Meizel, 1988))

La capacidad de la zona pelúcida de inducir la reacción acrosomal ha sido confirmada en

una gran variedad de especies, inclusive el hombre (Cross et al. 1988). El mecanismo

mediante el cual las moléculas de la zona disparan la reacción acrosomal ha sido muy

estudiado, especialmente en el ratón, para el cual se ha aislado la proteína responsable de

la inducción, ZP; (Bleil, Wassarman, 1980), que tendría su equivalente en el humano

(Chamberlin, Dean, ¡990). Todo parece indicar que los espermatozoides comparten

gran parte de los mecanismos de transducción de señales con las células somáticas. Sin

embargo, dado que la reacción acrosomal es un evento terminal que ocurre muy

rápidamente, es probable que los espermatozoides utilicen algún sistema de transducción

más sencillo que los de otros tipos celulares (Yanagimachi, 1994).

Sin duda el influjo de calcio, el aumento del pH intracelular y la producción de

compuestos fusogénicos son necesarios para la reacción acrosomal (Yanagimachi,

1994). El influjo masivo de iones Caz' se produciría, tanto como consecuencia de la

activación de proteínas transportadoras de membrana, canales de Caz' voltaje

dependientes, como por inactivación de una bomba de calcio, dependiente de ATP. Esta

Ca-ATPasa mantiene bajos los niveles de calcio intracelular en el espermatozoide, ya

que fiJnciona constantemente para remover el exceso de este ion; los tratamientos que la

inactivan provocan una acumulación intracelular de calcio e inducen la reacción

acrosomal (Aitken, 1995). Los niveles intracelulares elevados de calcio activarían una

Na'/K'-ATPasa, que produce un rápido aumento en los niveles de Ki intracelular. Esto,

a su vez, on'ginaria una expulsión de H’ de la célula a través de un Nai/H' “antiporter” y

el consiguiente aumento del pH intracelular, que podría ser importante para optimizar el

fiJncionamiento de las enzimas acrosomales (Aitken, 1995). Estos movimientos de iones

estarían mediados por nucleótidos cíclicos; tanto éstos como los inhibidores de la

fosfodiesterasa estimulan la capacitación y la reacción acrosomal (Mortimer, 1995). Por

otra parte, el aumento de calcio intracelular activaría una fosfolipasa C que produce

diacilglicerol (DAG) e inositol trifosfato a partir de fosfoinositol difosfato (Ple). El

DAG así producido, junto con el Caz', estimularía una fosfolipasa A, dando lugar a

lisofosfatidilcolina y ácido araquidónico, ambos de naturaleza fiJsogénica (Roldan,

Harrison, 1990).

In virro, la reacción acrosomal puede ocurrir espontáneamente, por ejemplo cuando los

espermatozoides se incuban durante tiempos prolongados. Se considera que esta

reacción espontánea no es fisiológica ya que, en los espermatozoides fertilizantes, la

misma tiene lugar sobre la superficie de la zona y no en el medio de incubación.

Alternativamente, la reacción acrosomal puede ser inducida por una serie de agentes

fisiológicos, como por ejemplo la progesterona (Osman et al. 1989; Morales et al.

1992) o farmacológicos como el ionóforo A23187 (Aitken et al. 1993) que elevan los

niveles de calcio intracelular. Es importante notar que la mayoría de los estímulos

conocidos, independientemente de su naturaleza, no puede inducir la reacción acrosomal

si los espermatozoides no están capacitados. La membrana de un espermatozoide no

capacitado parecería ser inaccesible o incapaz de responder a los distintos estímulos,

incluyendo la proteína ZP; de la zona pelúcida (Yanagimachi, 1994).

Reconocimiento y penetración de la Zona Pelúcida

La zona pelúcida es una cubierta glicoproteica que rodea al ovocito y protege al ovocito

y al embrión recién formado de daño fisico (Nichols, Gardner, ¡989). Constituye la

última barrera fisica que debe atravesar el espermatozoide antes de fertilizar, e incluye

parte de los mecanismos que posee el ovocito para impedir la polisperrnia. A pesar de

que se puede lograr fertilización y desarrollo embrionario preimplantatorio normales in

vitro, en ausencia de la zona, ésta es necesaria para el desarrollo preimplantatorio ¡n

vivo.

Los espermatozoides capacitados se unen fuertemente a la superficie de la zona pelúcida

' A J :Illll

antes de penetrarla. Esta unión está mediada por la interacción entre moléculas de

superficie de la zona y el espermatozoide. Se han descripto receptores en la zona

capaces de reconocer glicoproteínas de membrana del espennatozoide en muchas

especies, incluyendo al humano (Yanagimachi, 1994; Chamberlin, Dean, 1990). Se

acepta actualmente, incluso en el hombre, que el espermatozoide fertilizante debe

llegar intacto a la zona pelúcida: solamente se encuentran espermatozoides intactos

hundidos en la zona pelúcida, mientras que aquéllos presentes en el espacio perivitelino

han reaccionado completamente (Sathananthan et al. 1982).

Fusión con el ovocito y Singamia

El espermatozoide que ha atravesado la zona pelúcida y pasa rápidamente a través del

espacio perivitelino, une su cabeza a la membrana plasmática del ovocito (oolema) y,

completo, es incorporado al citoplasma de la ce'lula (ooplasma). En los mamíferos

euterios, la fiJsión con el oolema comienza en la membrana plasmática del

espermatozoide, a la altura del segmento ecuatorial (Bedford, Cooper, 1978).

La reacción acrosomal es requisito indispensable para que se produzca la fusión

con el oolema: los espermatozoides intactos, aunque estén capacitados, no pueden

fusionarse (Yanagimachi, 1981). Esto sugiere que, concomitantemente con la reacción

acrosomal o como resultado de la misma, la membrana plasmática que cubre el

segmento ecuatorial sufre un importante cambio fisiológico que torna al espermatozoide

competente para la fiJsión (Yanagimachi, ¡981).

Se han propuesto distintas proteínas como mediadoras de la fusión espermatozoide­

ovocito en distintas especies, incluyendo al humano (Okabe et al. 1990; Fusi, Bronson,

¡992; Fusi et al. ¡991; Miranda, Tezón, ¡992).

La función del espermatozoide no acaba una vez que ha logrado penetrar al oolema.

Todavía es necesario que se produzca una serie de cambios en el ámbito nuclear que

culminará con la formación del pronúcleo masculino: el ovocito fertilizado se ha

convertido asi en un cigoto. Los pronúcleos masculino y femenino convergen y sus

envoltorios nucleares se desintegran. Los cromosomas de ambas gametas son liberados

al ooplasma y comienza la primera división celular: se ha completado la singamia y se

ha creado un individuo genéticamente nuevo.

Los ensayos diagnósticos en el laboratorio de Andrología

El estudio de la infertilidad masculina en el laboratorio de Andrología ha avanzado

considerablemente durante los últimos años. Sin embargo, muchas veces resulta dificil

encontrar el verdadero valor de los ensayos existentes tanto desde el punto de vista del

diagnóstico de la infertilidad masculina como del pronóstico de éxito de un tratamiento

de fertilización asistida (Yovich, Matson, 1995). (Boyers et al. 1989) sugieren que los

criterios que predicen el éxito de una fertilización in vitro deben considerarse necesarios

pero no suficientes para predecir la capacidad fertilizante de un individuo.

Para que cualquier ensayo de fertilidad sea de valor debe tener una base biológica firme

y debe ser capaz de discriminar entre grupos de individuos fértiles e infértiles. Esto ya

presenta un problema pues, en la vida real, las distribuciones de los valores de los

parámetros espermáticos para individuos fértiles e infértiles se superponen

considerablemente (Figura 7).

En consecuencia, es casi imposible encontrar un valor de corte para un parámetro dado,

que pueda distinguir perfectamente individuos fértiles de los que no lo son. Algunos

individuos fértiles presentarán un valor “anormal” con respecto al valor de corte (falsos

positivos) mientras que algunos individuos infértiles presentarán un valor “normal” con

InfértilesFértiles

N'deindividuos

Variable seminal

Figura 7: Distribución característica de un parámetro seminal cualquiera parauna población de hombres fértiles y para una población de pacientes infértiles.(Tomado de (Boyers et al. 1989))

' A l :l’lll

respecto al valor de corte (falsos negativos). Se trata, pues, de encontrar un ensayo con

un valor de corte que posea el máximo poder discriminatorio minimizando los falsos

positivos y negativos (Figura 8).

Además, el ensayo será útil siempre y cuando posea cierto grado de reproducibilidad,

de modo que la repetición del ensayo en un mismo paciente no proporcione resultados

conflictivos. La variabilidad en la técnica puede superarse a través de la utilización de

protocolos cuidadosamente estandarizados y mecanismos de control interno. Pero en el

caso de los espermatozoides humanos, existe una gran variabilidad biológica que

puede comprometer significativamente la reproducibilidad de un ensayo. Así, a veces,

distintos grupos de trabajo informan resultados que a priori parecerían contradictorios,

pero en realidad sucede que los resultados obtenidos para una población de pacientes no

son necesariamente extrapolables a otras poblaciones, incluso cuando las condiciones del

ensayo se hayan duplicado cuidadosamente.

La variabilidad biológica inherente a los espermatozoides obliga, por otra parte, a

llevar a cabo cualquier ensayo, incluso un espermograma básico, más de una vez. Esto

es particularmente cierto frente a un resultado anormal, ya que se ha demostrado

claramente que incluso los donantes fértiles pueden, ocasionalmente, presentar valores

anormales en sus parámetros espermáticos (Clark, Sherins, 1986).

El progreso continuado de los laboratorios de primer nivel dedicados a la investigación

meticulosa del proceso de fertilización y la fiJncionalidad espermática es fiJndamental

para el desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico andrológico. Sin embargo, la

transición de un ensayo promisorio a un ensayo válido debe ser llevada a cabo con

sumo cuidado y siguiendo un análisis riguroso (Yovich, Matson, 1995). Se han utilizado

diversos enfoques estadísticos, que incluyen análisis no parametricos, modelos de

Valor de cortedelensayo

g Población Fértil

NegativosVerdaderos

FalsosPositivos

PositivosVerdaderosFalsos

Negativos

EL Población Infértil I

Figura 8: Diagrama que muestra la superposición casi inevitable que ocurre en laincidencia de una determinada condición clínica, en este caso la infertilidad,cuando se aplica un único ensayo diagnóstico a la medida de dicha condiciónclínica. (Tomado de (Cummins, 1995))

'zlllll

regresión logística y análisis de variables múltiples. Sin duda, se requieren más estudios

con mayor número de casos para determinar el verdadero valor predictivo de los

ensayos de funcionalidad espermática y cómo éstos pueden contribuir a la toma de

decisiones terapéuticas. Muchos ensayos se encuentran, todavía, en estado experimental

pero pueden, sin embargo, ayudar al andrólogo clínico en su búsqueda de un diagnóstico

fisiopatológico en algunos casos individuales (Oehninger, 1995)

Por último, es importante tener en claro que cualquier ensayo evaluará un aspecto muy

particular del proceso de fertilización, de modo que no se deben tener falsas expectativas

con respecto a una utilidad generalizada, aún cuando se haya establecido su validez. En

realidad, lo ideal sería contar con un amplio espectro de ensayos que pudieran

complementarse y ayudaran así a obtener una visión integral de la situación del paciente

y su pareja.

Propiedades de un ensayo diagnóstico

Desde un punto de vista predictivo, un ensayo diagnóstico debe distinguir entre un

estado normal y uno anormal de una dada condición fisiopatológica y su resultado debe

poder predecir a qué grupo, normal o anormal, pertenece un paciente dado. Para

cualquier análisis de fiJncionalidad espermática, el ensayo debe ser capaz de diferenciar a

aquellos individuos que conciben de los que no lo hacen y el resultado del test debe

poder predecir si el paciente en cuestión podrá o no concebir (Collins, 1996).

La variabilidad natural dificulta la exactitud de estas predicciones, de modo que se ha

desarrollado un sistema para describir la exactitud de un ensayo diagnóstico o, en

realidad, para expresar sus imperfecciones: las propiedades del ensayo diagnóstico.

Las propiedades más conocidas de un ensayo diagnóstico son sensibilidad,

especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo. La definición de

estas propiedades se basa en una tabla de 2 x 2 que expresa las relaciones entre las 4

posibles combinaciones de resultado del ensayo y presencia de una condición patológica

(Tabla lll).

Tabla lll: Tabla de 2x2 que define las propiedades de un ensayo diagnóstico

Resultado del ensayo Condición patológica presente Condición patológica ausente

Anormal a (positivos verdaderos) b (falsos positivos)

Normal c (falsos negativos) d (negativos verdaderos)

Las letras a, b, c, d, representan el número de pacientes en cada grupo.

Valor predictivo negativo = proporción de pacientes normales en el ensayo que no

presentan la patología = d / (c+d)

Valor predictivo positivo

presentan la patología = a / (a+b)

proporción de pacientes anormales en el ensayo que

Sensibilidad = proporción de pacientes que presentan la patología y que son anormales

en el ensayo = a / (a+c)

Especificidad = proporción de pacientes que no presentan la patología y que son

normales en el ensayo = d / (b+d)

Las propiedades más útiles desde el punto de vista clínico son los valores predictivos,

ya que indican para un resultado determinado del ensayo, la probabilidad de presencia

(positivo) o ausencia (negativo) de una condición patológica. En cambio, la sensibilidad

simplemente señala la probabilidad de obtener un ensayo anormal dentro de una

población de individuos que se sabe son anormales y la especificidad, en cambio, la

probabilidad de obtener un ensayo normal dentro de una población de individuos que se

sabe son normales. Esta información no resulta útil al profesional de la salud, quien

pretende informar al paciente, con el resultado del ensayo en mano, la probabilidad de

que presente una condición patológica dada (Collins, 1996).

Al llevar a cabo un estudio poblacional para evaluar un ensayo diagnóstico, es

especialmente importante minimizar la selección previa de los sujetos que participan en

e'l, lo cual puede lograrse a trave's de una incorporación secuencial e indiscriminada de

individuos al estudio, de modo que todos los sujetos que se presentan participen del

mismo (Collins, 1996).

El ensayo de reacción acrosomal en respuesta a fluido folicular

Tal como se señalara anteriormente, la reacción acrosomal en el hombre ¡n vivo

parecería ocurrir luego de que el espermatozoide se ha unido a la zona pelúcida y seria

inducida por una proteina específica de la zona pelúcida. Dado que la reacción

acrosomal es un prerrequisito de la fertilización, se podria especular entonces, que la

infertilidad observada en algunos pacientes infértiles obedeciera a una incapacidad de los

espermatozoides de sufrir la reacción acrosomal.

In vitro, la reacción acrosomal de espermatozoides humanos puede ser inducida por una

variedad de estímulos: zona pelúcida solubilizada (Cross et al. 1988), secreciones de

células foliculares (Tesarik, 1985), fluido folicular (Suarez et al. 1986), progesterona

(Osman et al. 1989), lisofosfolipidos (Byrd, Wolf, 1986), ionóforo de calcio (Aitken et

al. 1984). Resultó bastante lógico pues, para aquéllos que buscamos mejorar la

evaluación andrológica de pacientes infértiles, imaginar que un ensayo de reacción

acrosomal ¡n vitro podría ser de utilidad para la identificación de una subpoblación de

pacientes infértiles. Surgieron, así, distintos protocolos de trabajo, utilizando distintos

agentes inductores de la reacción acrosomal y con la aplicación de distintas técnicas para

la evaluación del estado del acrosoma (Tan'n, Trounson, 1993).

En nuestro laboratorio se optó por estudiar el fenómeno de la reacción acrosomal en

respuesta a la estimulación por fluido folicular humano con miras al desarrollo de un

ensayo diagnóstico que permitiera evaluar la capacidad fertilizante de una muestra de

espermatozoides. El fluido folicular humano (hFF) sin duda constituye un estimulante

fisiológico de la reacción acrosomal, ya que se encuentra normalmente atrapado entre

las células del cumulus que rodean al ovocito recién ovulado.

El hFF es capaz de inducir la reacción acrosomal en espermatozoides humanos de

donantes fértiles, previamente capacitados (Suarez et al. 1986). Estudios

ultraestructurales han puesto de manifiesto que los espermatozoides capacitados

reaccionan muy rápidamente (segundos) al colocarlos en contacto con hFF y que,

morfológicamente, la reacción acrosomal transcurre en forma semejante a otras especies

(Yudin et al. 1988). Es decir, se produce a través de la fusión de las membranas

plasmática y acrosomal externa, con formación de vesículas híbridas, seguida de una

rápida solubilización de la matriz acrosomal (Figura 6). Tal como se mencionara

anteriormente, el sitio de iniciación de la reacción, parecería ser la zona anterior del

acrosoma y , desde allí, la fusión se propagaría hacia el segmento ecuatorial (Yudin et al.

1988).

El fluido folicular contiene varias moléculas que pueden iniciar la reacción acrosomal en

distintas especies (Meizel, 1988). En el humano, se ha descripto más de un posible

inductor fisiológico.

Siiteri et al. 1988 encontraron actividad inductora de la reacción acrosomal asociada a

una fracción de peso molecular 50.000 y propusieron que la misma podría ser o bien la

porción glicosídica de una glicoproteína N-glicosilada, o un factor de bajo peso

molecular no covalentemente unido a una proteína N-glicosilada, o, por último, dos

factores independiemtes, uno de alto y otro de bajo peso molecular no covalentemente

unido a otra molécula de alto peso molecular.

Por otra parte, se ha encontrado que la progesterona y l7-l-IO-progesterona son capaces

de estimular la reacción acrosomal de espermatozoides humanos ¡n vitro (Osman et al.

1989; Blackmore et al. 1990), si bien ninguna de las dos, separadamente o combinadas,

logra un nivel de reacción acrosomal comparable al del fluido folicular (Meizel et al.

1990). La progesterona ejercería su acción a través de un receptor no genómico

presente en la membrana plasmática del espennatozoide (Blackmore, Lattanzio, 199];

Tesarik et al. 1992), que podría estar acoplado a un canal de calcio, actuar él mismo

como canal de calcio o promover la inhibición de la Ca-ATPasa de membrana. Si bien la

existencia de un receptor para progesterona en la membrana contrastaría con el clásico

mecanismo de acción de los esteroides, podn'a por otra parte explicar el aumento rápido

en los niveles intracelulares de Ca2° inducido por la progesterona (Osman et al. 1989).

Otros investigadores no han logrado inducir la reacción acrosomal en espermatozoides

humanos con progesterona sóla, sino que han postulado la necesidad de que la misma se

encuentre asociada a un factor proteico, que parecería ser idéntico a la proteína

transportadora de corticosterona, CBG (Fehl et al. 1995).

También se ha descripto la inducción de reacción acrosomal en espermatozoides

humanos por un factor proteico de peso molecular mayor a 180.000 compuesto por

subunidades de peso molecular 50.000 y 29.000, cuyos extremos N-terminales presentan

un 100% de homología con las cadenas pesada y liviana de la lgG humana (Saragüeta et

al. 1994).

Es probable que todas estas sustancias presentes en el fluido folicular, que

individualmente son capaces de inducir la reacción acrosomal, constituyan in vivo

mecanismos alternativos o sinérgicos, destinados a maximizar la posibilidad de éxito en

la respuesta.

Sea cual fuere el/los iniciador/es de la reacción acrosomal presente/s en el fluido, su

mecanismo de acción parecería ocurrir a través de la estimulación de al menos dos

mecanismos de transducción de señales: el de la adenilato ciclasa / AMPc / protein­

quinasa A y el del diacilglicerol / proteín-quinasa C (De Jonge et al. 1993).

El fluido folicular puede obtenerse en cantidades abundantes y a muy bajo costo en un

centro de fertilización asistida y, como ya se mencionara, es un estimulante fisiológico

de la reacción acrosomal, pues requiere la participación activa de receptores de

membrana del espermatozoide y/o sistemas de transducción de señales (Zaneveld et al.

1991). Si bien no existe certeza de que las moléculas inductoras de la reacción

acrosomal in vitro sean las mismas que actúan in vivo, los resultados de reacción

acrosomal obtenidos in vitro con fluido folicular serían más fácilmente extrapolables a lo

que podn'a ocurrir ¡n vivo, en presencia del ovocito, que aquéllos obtenidos con otros

inductores que el espermatozoide normalmente no encontraría en su trayecto por el

tracto genital femenino.

OBJETIVOS

nhínlivne 35

Podríamos decir que uno de los mayores desafios para el andrólogo es determinar si una

dada muestra de espermatozoides podrá o no fertilizar un ovocito. Se han llevado a cabo

muchos estudios para correlacionar las características seminales y los diferentes ensayos

de fiJncionalidad espennática con el éxito en FIV. La mayoría de estos ha demostrado la

existencia de algún tipo de correlación, pero casi ninguno ha validado los resultados

obtenidos con un estudio prospectivo sobre un nuevo grupo de individuos.

El objetivo final de este trabajo fue evaluar el valor clínico del ensayo de reacción

acrosomal de espermatozoides humanos en respuesta al fluido folicular como medida de

la capacidad fertilizante de una muestra de espermatozoides.

A lo largo del camino recorrido, se plantearon una serie de objetivos parciales que,

escalonadamente, permitieron acercarse a la meta deseada:

l. Establecer las condiciones óptimas de ensayo para la determinación de la reacción

acrosomal inducida por fluido folicular humano en espermatozoides humanos.

2. Estudiar la influencia de la composición salina del medio de capacitación y del

suplemento proteico del mismo sobre el ensayo de reacción acrosomal.

Estudiar la distribución y variación de la reacción acrosomal inducida por fluidob)

folicular en la población normal (dadores voluntarios de fertilidad comprobada).

4. Estudiar la distribución y variación de la reacción acrosomal inducida por fluido

folicular en una población de pacientes infértiles.

nh ¡06an 36

5. Analizar el valor pronóstico de la reacción acrosomal, inducida por fluido folicular,

como medida de la capacidad fertilizante in vitro de una muestra de espermatozoides

humanos.

6. Construir un modelo para predecir la capacidad fertilizante in vitro de una muestrade espermatozoides humanos.

MATERIALES Y METODOS

Manu-¡aloe y Mómllnc 38

l. SUJETOS ESTUDIADOS

l.l. Población normal

La población normal estudiada está compuesta por 58 dadores voluntarios de fertilidad

comprobada, ya sea participantes del programa de donación de espermatozoides del

Fairfax Cryobank, con evidencias continuas de fertilidad, o dadores voluntarios que

hubieran concebido en el transcurso del último año.

1.2. Población infértil

La población infértil estudiada consta de 232 hombres, pertenecientes a parejas que se

presentaron secuencialmente al programa de fertilización in vitro del Genetics & IVF

Institute (G&lVF) , sin tener en cuenta la etiología de su infertilidad.

Los primeros estudios piloto se llevaron a cabo con un grupo pequeño de l5 pacientes

infértiles sin causa aparente. Estos pacientes fueron elegidos al azar entre un grupo de

parejas cuyas mujeres no mostraron ninguna anormalidad ante una revisación

ginecológica exhaustiva.

1.3. Obtención de muestras

Las muestras de semen se obtuvieron por masturbación luego de 36 a 48 horas de

abstinencia sexual. Las muestras se mantuvieron a 37°C durante 30 minutos para

promover la licuefacción y fiJeron analizadas para determinar sus características

seminales dentro de la hora de obtención, de acuerdo con lo indicado por la OMS.

Materiales y Mémdne 39

2. ANÁLISIS DEL SEMEN

Todas las muestras fueron sometidas a un espermograma de rutina, que incluyó las

siguientes determinaciones:

2.1. Concentración de espermatozoides

La concentración de espermatozoides se determinó tanto a través de un análisis

computarizado como manualmente. Para la determinación manual, una alícuota de 20 pl

de semen se mezcló con 20 pl de paraformaldehído al 1% en buffer fosfato salino, pH

7,4 (PBS). Una alícuota (Spl) de espermatozoides, así fijados, se colocó luego en una

cámara Makler (Sefi Medical Instruments, Rehovot, Israel) para su cuantificación.

2.2. Motilidad: porcentaie de mótiles y calidad de movimiento

El porcentaje de espermatozoides mótiles también se determinó manualmente y a través

de análisis computarizado. La determinación manual se llevó a cabo colocando una

alícuota de 10 pl entre porta y cubreobjetos y observando al microscopio en contraste de

fase (200X). Se evaluaron un total de 100 espermatozoides. La calidad de movimiento

se clasificó en la escala de 0 - 4 (progresión), siguiendo los lineamientos propuestos por

(Mortimer et al. 1986):

Progresión Calidad del movimiento

0 lnmótill Movimiento in situ2 Movimiento traslativo, no progresivo3 Movimiento progresivo con velocidad moderada4 Movimiento progresivo con alta velocidad

Malerialmy Mólmlm 40

El número asignado representa la calidad de movimiento promedio de los

espermatozoides observados. Todas las determinaciones de motilidad se llevaron a cabo

sobre una platina caliente mantenida a 36°C.

2.3. Morfología

La morfología de los espermatozoides se determinó de acuerdo con el llamado criterio

estricto, descripto por (Kruger et al. 1986). De acuerdo con estos criterios, un

espermatozoide normal es aquél cuya cabeza tiene fonna oval, con contormo regular,

una longitud de 4 a 5,5 pm y un ancho de 2,5 a 3,5 pm. La cabeza presenta dos regiones

bien definidas en un preparado teñido: una anterior, más clara (el acrosoma), que debe

ocupar el 40-70% del área de la cabeza, y otra posterior más oscura. La cola se inserta

simétn'camente en una depresión plana en la base de la cabeza.

Para determinar la morfología se realizó un extendido sobre un portaobjetos, con una

alícuota de lO pl de semen. Una vez seco, el extendido se tiñó con la tintura Dif-Quik

(Dade Diagnostics, Miami, FL, E.E.U.Ul), siguiendo las instrucciones del fabricante. El

extendido se analizó al microscopio utilizando un objetivo de inmersión (lOOX) y se

evaluaron 200 células por extendido. En caso de que la concentración de

espermatozoides en semen fiJera inferior a 5xl06/ ml, se concentró una alícuota (100 pl)

de semen por centrifiigación a 300xg durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante

cuidadosamente, dejando unos lO pl para resuspender el "pellet" y con el "pellet"

resuspendido se realizó el extendido.

2.4. Viabilidad

La viabilidad (% espermatozoides vivos) de los espermatozoides se determinó utilizando

Materiales y Mómdne 41

un colorante supravital: Eosina Y al 0,5% en PBS. Una alícuota de lO pl de Eosina se

agregó a un volumen igual de semen. Al cabo de 2 minutos, se agregaron lO pl de

formaldehído al 1% para fijar las células. Una alícuota de lO pl de esta suspensión,

teñida y fijada, se colocó sobre un portaobjetos y se determinó el porcentaje de células

vivas (aquéllas que no tomaron el colorante) sobre un total de 100 espermatozoides.

2.5. Análisis computarizado

El análisis computarizado de semen se llevó a cabo utilizando, indistintamente, uno de

dos sistemas CASA (Computer-Assisted Sperm Analyzer): Cellsofi (CryoResources,

New York, NY, EEUU) y Celltrack (Motion Analysis, Santa Rosa, CA, EEUU).

Ambos sistemas son indistinguibles para determinar características de motilidad, pues

cuando los datos obtenidos con los dos sistemas se correlacionan gráficamente uno

contra el otro, se ajustan sobre la línea de identidad (r = 0,985; P<0,0l', n = 50).

Del análisis computarizado se obtuvieron los siguientes parámetros:

i) Concentración de espermatozoides

ii) ii)% motilidad

iii) V040 : porcentaje de espermatozoides que se mueven con una velocidad

curvilínea menor o igual a 40 “rn/segundo

iv) L3 : porcentaje de espermatozoides que se mueven con una linealidad menor o

igual a 3

3. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS DE SEMEN

Todas las muestras utilizadas para realizar experimentos de capacitación e inducción de

Materiales y Mótndm 42

la reacción acrosomal fueron procesadas como se describe a continuación.

3.1. Obtención de una fracción altamente mótil

Luego de la licuefacción, las muestras se centrifiJgaron a 300xg durante 7 minutos para

eliminar el plasma seminal. Los espermatozoides se lavaron, luego, dos veces por

centrifugación (300xg , 7 minutos) utilizando un medio Tyrode's modificado (HSM-3B)

conteniendo NaCl 117,5 mM, NaH2P04.H20 0,3 mM, KC] 8,6 mM, CaC12.2H20 2,5

mM, MgClz.H20 0,49 mM, glucosa 2 mM, lactato de Na 19 mM, NaHCOa 25 mM,

piruvato de Na 0,25 mM y 70 pg/ml de penicilina y estreptomicina equilibrado bajo

atmósfera de 5% C02 / 95% aire a pH 7,4. Este medio salino se suplemento con 3

mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) libre de globulinas (Sigma Chemical Co.,

St.Louis, MO, EEUU).

Los espermatozoides lavados se resuspendieron en 400 pl de medio HSM-26B, de

composición iónica igual al 3B, pero suplementado con 26 mg/ml de albúmina sérica

bovina libre de globulinas y ácidos grasos. Esta suspensión de espermatozoides se filtró

por una columna de lana de vidrio para obtener los espermatozoides mótiles. La

columna estaba constituida por 20 mg de lana de vidrio (Microfibre Manville, Denver,

CO, EEUU) colocados dentro de una jeringa de insulina de l ml. La columna se lavó 2

veces con l ml de HSM-3B y luego con 400 pl de HSM-268. Se sembró la muestra de

espermatozoides y, después que la misma hubiera pasado completamente, se enjuagó la

columna con 400 pl de HSM-268 para recuperar la totalidad de los espermatozoides

mótiles. El filtrado de la columna se analizó para determinar la concentración de

espermatozoides y el porcentaje de motilidad.

En el caso de pacientes oligospérmicos severos, los espermatozoides lavados se

Materiales y Métndas 43

resuspendieron en 200 pl de medio y se filtraron a través de lO mg de lana de vidrio.

3.2. lncubación en condiciones capacitantes

La concentración de espermatozoides filtrados se ajustó a l-2 x lO6/ ml. Alicuotas de

lml se incubaron en condiciones capacitantes durante toda la noche (22 horas) en tubos

cónicos de 15 ml, parcialmente tapados e inclinados en un ángulo de 45°, a 37°C y en

una atmósfera de 5% C02 / 95% aire.

3.3. Inducción dela reacción acrosomal

Alicuotas de 200 pl de espermatozoides, previamente incubados en condiciones

capacitantes, fueron expuestas a fluido folicular humano al ¡0% (por duplicado) o medio

(tubo control) durante 30 minutos a 37°C en atmósfera de 5% C02/95% aire. Para

asegurar que la alícuota tomada fuera, finalmente, representativa de la población celular

en el tubo, cada suspensión de espermatozoides se homogeneizó por pipeteo suave y

repetido de la misma.

AI finalizar la incubación con el fluido, los espermatozoides se lavaron 3 veces con l ml

de PBS mediante centrifiigación a lOOOx g durante 5 minutos. Luego del último lavado,

se retiró el sobrenadante dejando unos 50 ul residuales que se utilizaron para

resuspender los espermatozoides. Los espermatozoides resuspendidos de cada tubo se

colocaron en dos orificios de portaobjetos para inmunofiuorescencia (Polysciences,

Washington, PA, EEUU) previamente tratados con 0,1 mg/ml poli-L-lisina (Sigma

Chemical Co., St. Louis, MO, E.E.U.U.) con el objeto de favorecer la adhesión de las

células al vidrio. Los portaobjetos se dejaron secar al aire y luego se sumergieron en

etanol 95% a 4°C durante, por lo menos, una hora para permeabilizar las membranas y

Materiales y Mótndnc 44

SCconservaron a 40C hasta SUUSO.

3.4. Evaluación del porcentaie de reacción acrosomal

El estado del acrosoma fue evaluado mediante el uso de la lectina de Pisum sativum

marcada con fluoresceína, que se asocia al contenido intraacrosomal (Cross et al. 1986).

Los espermatozoides permeabilizados se tiñeron con una solución de Pisum sativum (l

mg/ml) en PBS, durante 30 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad. Las

células teñidas se lavaron con PBS (3 cambios durante lO minutos, con agitación suave)

y los portaobjetos se montaron utilizando n-propil galato 0,2 M en glicerol para

minimizar el "quenching" de la fluorescencia. Los espermatozoides fueron observados en

un microscopio de fluorescencia Olympus BHA, equipado con un filtro UB. Se evaluó el

estado del acrosoma en 200 espermatozoides por orificio. Los espermatozoides se

clasificaron como pertenecientes a una de 3 categorías (Figura 9):

o lntactos: acrosoma fluorescente

o Reaccionados: región acrosomal oscura o punteada; segmento ecuatorial fluorescente

o Difusos: espermatozoides oscuros o con algunos puntos fluorescentes pero sin

fluorescencia sobre el segmento ecuatorial

El porcentaje de reacción acrosomal en cada orificio se calculó como:

número de espermatozoides reaccionados x lOOnúmero total de espermatozoides evaluados

El porcentaje de reacción acrosomal en respuesta al fluido folicular (%RA) se

calculó como % espermatozoides reaccionados en presencia de fluido menos %

espermatozoides reaccionados en tubo control.

"Y"Intacto Reaccionados Difusos

Materiales y Mémdm 4%

Figura 9: Esquema de los distintos patrones de fluorescencía observados almicroscopio luego de la tinción con lectina de Pisum Sativum.

Materiales y Métndm 46

4. OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN DE Los FLUIDOS BIOLÓGICOS

UTILIZADOS

4.]. Fluido folicular

El fluido folicular utilizado para inducir la reacción acrosomal, se obtuvo reuniendo los

fluidos foliculares procedentes de pacientes que realizaron ciclos de fertilización ¡n vilro

en el Genetics & lVF Institute. Cada vez que se preparó un lote de fluido, se reunieron

los fluidos de al menos 40 pacientes elegidos al azar y solamente se descartaron aquellos

fluidos que estuvieran fuertemente contaminados con sangre. Cada lote nuevo se

controló midiendo su capacidad de inducir reacción acrosomal con respecto al lote

anterior. Todos los lotes utilizados durante los estudios aquí presentados tuvieron una

capacidad inductora semejante.

El fluido folicular crudo se centrifiigó a lSOOxgdurante 15 minutos a 4°C, para eliminar

restos celulares. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,22 um (Millipore,

Bedford, MA, EEUU) y se dializó durante 48 horas (2 cambios) contra medio HHM, pH

7,4. Este medio es medio HSM en el que se ha sustituido al NaHC03 25 mM por Hepes

20 mM / NaHCO; 5 mM. El fluido dializado se filtró nuevamente a través de una

membrana de 0,22 pm, se fraccionó en alícuotas de 200 pl y se guardó congelado a ­

20°C hasta su uso.

El contenido total de proteínas en cada lote se determinó por el método de Lowry et al.

(195]). Para todos los lotes utilizados el contenido de proteínas fiJe semejante y del

orden de los 45 mg/ml.

4.2. Suero de cordón umbilical

El suero de cordón umbilical (FCS) utilizado en algunos experimentos se obtuvo

Manu-¡aloe y Mótmlm .17

reuniendo sueros de cordón umbilical procedentes de nacimientos por cesárea. El suero

crudo se centrifugó a 500xg, durante lO minutos para eliminar restos celulares. El

sobrenadante se filtró, sucesivamente, por membranas de 5 pm y 0,2 pm. El suero

filtrado se inactivó por calentamiento a 56°C durante 45 minutos, se fraccionó en

alícuotas de 3 ml y se guardó congelado a -20°C hasta su uso. La preparación final se

analizó para hepatitis A y B y para HlV. Como control de calidad de cada lote de suero,

se verificó que no existieran efectos inhibitorios del mismo sobre el porcentaje de

fertilización de ovocitos de ratón in vitro y el subsiguiente desarrollo embrionario hasta

el estadio de dos células. Alrededor de lO lotes de suero diferentes fueron utilizados

durante estos estudios.

5. OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DEL ENSAYO DE REACCIÓN

ACROSOMAL

Para optimizar las condiciones del ensayo de reacción acrosomal se utilizaron

espermatozoides provenientes de dadores voluntarios de fertilidad comprobada. Las

muestras de semen se procesaron de la forma ya indicada para obtener una suspensión

de espermatozoides altamente mótiles, es decir, dos lavados por centrifiJgación seguidos

de una filtración por columna de lana de vidrio (sección 3.1.).

5.1. Optimización de la concentración de fluido folicular

Alícuotas de 200 pl de espermatozoides, incubados en condiciones capacitantes durante

22 horas (sección 3.2.), se incubaron durante 30 minutos a 37°C bajo atmósfera de 5%

C02 / 95% aire, en presencia de dosis variables de fluido folicular humano: 0%, 2,5%,

5%, 10% y 20% V/V, en un volumen final de 300g] (sección 3.3.). El porcentaje de

Materiales y Mélmlnu 48

reacción acrosomal, como así también el porcentaje de células vivas, se determinaron en

cada caso de la manera habitual (secciones 3.4. y 2.4., respectivamente).

5.2. Optimización de la concentración de espermatozoides a capacitar

La suspensión de espermatozoides ya filtrados por lana de vidrio, procedente de cada

uno de 4 dadores voluntarios, se subdividió en 4 alícuotas de concentración diferente: 2,

4, 8 y 12 xlOó/ml, que se incubaron luego, en condiciones capacitantes, durante 22

horas. Los espermatozoides capacitados se incubaron en presencia de fluido folicular al

10% y se determinó el porcentaje de reacción acrosomal en todas las muestras siguiendo

el protocolo habitual.

5.3. Optimización del tiempo de exposición al fluido folicular

Espermatozoides capacitados en condiciones óptimas de concentración (2x106/ml),

procedentes de cada uno de 4 dadores voluntarios, se incubaron en presencia de fluido

folicular al ¡0% o medio (control) por distintos tiempos: 0, 5, lO, 20 y 30 minutos. El

porcentaje de reacción acrosomal y el porcentaje de viabilidad se determinaron en cada

muestra en la forma habitual.

5.4. Optimización del tiempo de capacitación

Los espermatozoides, procedentes de cada uno de 3 dadores voluntarios, se incubaron

en condiciones capacitantes por O, 2, 6 y 22 horas. Después de cada tiempo de

incubación, los espermatozoides se incubaron otros 30 minutos en presencia de distintas

dosis de fluido folicular: 0%, 2,5%, 5%, 10% y 20% V/V. La viabilidad de los

espermatozoides y el porcentaje de reacción acrosomal se determinaron en todas las

MEIÍPI'iaIPQy Mémdm 49

muestras.

Un estudio cinético adicional se llevó a cabo incubando en condiciones capacitantes,

durante 8 y 22 horas, la suspensión de espermatozoides procedente de cada uno de 8

dadores voluntarios.

5.5. Análisis estadístico

Los datos de todos estos experimentos se analizaron utilizando análisis de varianza

(ANOVA) (Schefi‘e, 1959). Se analizó la normalidad de los residuales del ANOVA

utilizando un test de (Shapiro, Wilk, 1965) y en ningún caso se encontró apartamiento

significativo de una distribución normal.

Las relaciones ordenadas, tal como dependencia con dosis de fluido o concentración de

espermatozoides, se analizaron utilizando un test de Bartholomew para alternativas

ordenadas (Nelson, 1977). La cinética de reacción acrosomal se analizó por medio de

ANOVA, seguido de un test de Tukey (Scheffe, 1959) con corrección por las

comparaciones múltiples entre los distintos tiempos.

6. EFECTO DEL FLUIDO FOLICULAR SOBRE LAS CARACTERÍSTICAS DE

MOTILIDAD DE ESPERMATOZOIDES CAPACITADOS

Para determinar si el fluido folicular tiene algún efecto sobre las caracteristicas de

motilidad de los espermatozoides, se utilizaron espermatozoides capacitados

provenientes de 5 dadores voluntarios, incubados en presencia y en ausencia de fluido

folicular al 10%.

Malorialoeïv Mótmlns ¡0

Se determinó la velocidad curvilínea y la linealidad para cada una de las muestras

utilizando un sistema CASA de análisis computarizado, tal como se indicara

anteriormente. Se construyeron las curvas de distribución acumulativa para velocidad

curvilínea (Vc) y linealidad (L) colocando en un gráfico los porcentajes acumulativos de

células medidos a intervalos crecientes de Vc y L.

La existencia de diferencias significativas entre células control y células expuestas al

fluido se analizó utilizando el test de Kolmogorov-Smirnov (Siegel, 1956).

7. INFLUENCIA DEL MEDIO D_ECAPACITACIÓN SOBRE LA RESPUESTA

AL FLUIDO FOLICULAR

7.1. Composición salina

Para evaluar el efecto de la composición salina del medio de capacitación sobre la

capacidad de respuesta de los espermatozoides al fluido folicular, se utilizaron 3 medios

comúnmente usados en los laboratorios de Andrología para la preparación de

espermatozoides, tanto con fines diagnósticos como para procedimientos de fertilización

in vitro: BWW, HSM y Ham's F-lO. La elección de estos medios no fiJe al azar. HSM

era el medio utilizado de rutina, en el laboratorio de Andrología del G&IVF para el

ensayo de reacción acrosomal en respuesta a fluido folicular. BWW era el medio

utilizado en el laboratorio de Andrología para el lavado y capacitación de

espermatozoides como así también para los estudios de motilidad, calidad de

movimiento y sobrevida de espermatozoides capacitados. Ham’s F-lO era el medio

utilizado por el laboratorio de Embriología del G&IVF para llevar a cabo los

procedimientos de FIV.

Malerialee _\'Métodos Sl

Los expen'mentos se realizaron sobre espermatozoides de 10 dadores voluntarios de

fertilidad comprobada. Cada eyaculado se fraccionó en 3 alícuotas que se lavaron 2

veces por centn'fugación a 300xg durante 10 minutos, utilizando Ham's F-10, BWW y

HSM, suplementados con albúmina bovina al 0,3%, libre de globulinas (Sigma Chemical

C0, St Louis, MO, E.E.U.U.). La composición salina de los 3 medios se describe en la

Tabla lV.

TABLA IV: Composición iónica de los distintos medios utilizados

BWW HSM HAM'SComponente (mM) (mM) (mM)

NaCl 84,07 117,5 126,5NaHzPO4 - 0,3 ­KC] 4,78 8,6 3,83CaClz 1,71 2,5 0,3MgC12 - 0,49 ­Glucosa 5,56 2,0 6,1 lLactato de Sodio 21,58 19,0 ­NaHCO; 35,71 25,0 20,0Piruvato de Sodio 0,25 0,25 1,0KH2P04 1,19 - 0,61MgSO4 1,19 - 0,63Acetato de Sodio 0,1 - ­Lactato de Calcio - - 0,5Acido Oxálico 0,1 - ­

Na- Total 141,71 162,05 149,66K' Total 5,97 8,6 9,44C1"Total 92,27 132,00 132,2Ca” Total 1,71 2,5 0,8Mgz‘ Total 1,19 0,49 0,63Na' /K’ 23,74 18,84 15,85mOsmolaridad (mOsM) 280-300 280-300 278-284

Luego de los lavados, cada fracción de espermatozoides se resuspendió en 300 pl del

Materiales _\'Mótmlne 52

medio correspondiente, suplementado con albúmina bovina libre de globulinas al 2,6% y

ácidos grasos (Sigma Chemical Co, St Louis, MO, E.E.U.U.) y se filtró por una

columna de lana de vidrio para obtener una población de células altamente mótiles

(sección 3.1). Luego de determinar la concentración y la motilidad de espermatozoides

en la suspensión final, se ajustó la concentración de espermatozoides a 1.5x106/ ml y las

alícuotas se capacitaron durante la noche (sección 3.2). En cada muestra se evaluó la

motilidad por CASA luego de 2 horas de incubación (sección 6), como así también la

capacidad de sufrir la reacción acrosomal en respuesta al fluido folicular a las 22 horas

(secciones 3.3 y 3.4).

Los datos obtenidos por CASA se utilizaron para construir curvas de distribución

acumulativa para velocidad curvilínea (Vc) y linealidad (L) y así evaluar el efecto de

la composición salina del medio de capacitación sobre las características de motilidad de

los espermatozoides. La existencia de diferencias significativas entre los medios se

analizó a través del test de Kolmogorov-Smimov (Siegel, 1956).

7.2. Suplemento proteico

Para evaluar el efecto de la naturaleza del suplemento proteico en el medio de

capacitación sobre la capacidad de respuesta de los espermatozoides al fluido folicular,

se utilizaron dos suplementos: albúmina de suero bovino (BSA), usado en el laboratorio

de Andrología y suero de cordón umbilical (FCS), utilizado en el laboratorio de

Embriología. De allí la elección de ambos para este estudio.

Se analizaron espermatozoides provenientes de lO dadores voluntarios de fertilidad

comprobada. Cada eyaculado se fraccionó en 3 alícuotas que se lavaron, 2 veces, por

centrifugación a 300xg durante lO minutos utilizando HSM suplementado con BSA al

Malorialnc y Mómdnc <3

0,3%. Los espermatozoides lavados se resuspendieron en HSM suplementado con BSA

al 2,6% (HSM-268), BSA al 3,5% (HSM-358) o FCS al 7,5% (HSM-FCS), se filtraron

por lana de vidrio y se incubaron en condiciones capacitantes, según se describiera

anteriormente (secciones 3.1 y 3.2). En cada muestra se evaluó la motilidad por CASA

luego de 2 horas de incubación, como así también la capacidad de sufrir la reacción

acrosomal en respuesta al fluido folicular, al cabo de 22 horas de capacitación.

Con los datos obtenidos por CASA se construyeron las curvas de distribución

acumulativas para velocidad curvilínea (Vc) y linealidad (L) (sección 6) después de 2

horas de incubación en HSM-268, HSM-358 y HSM-FCS. Se analizaron las

diferencias significativas entre los distintos suplementos a través del test de

Kolmogorov-Smirnov (Siegel, 1956).

En otra serie de experimentos se evaluó el efecto de la adición simultánea de BSA y FCS

al medio de capacitación. Los espermatozoides procedentes de cada uno de 7 individuos

normales se dividieron en 3 alícuotas que se lavaron inicialmente con HSM y, luego de la

filtración por lana de vidrio, se incubaron en condiciones capacitantes en HSM-268,

HSM-FCS o HSM adicionado con 2,6% BSA y 7,5% FCS. En cada alícuota se

determinó la capacidad de sufrir reacción acrosomal en respuesta al fluido folicular.

Finalmente, se llevó a cabo un experimento de intercambio para determinar la

reversibilidad de los efectos de BSA y FCS sobre la capacitación. Se utilizaron 7

dadores voluntarios. Los espermatozoides procedentes de cada dador se lavaron con

HSM y se filtraron por lana de vidrio e incubaron en las condiciones capacitantes

habituales en HSM-268 y HSM-FCS. Luego de la incubación (18 horas), las

suspensiones de espermatozoides se dividieron en 3 alícuotas. Una alícuota constituyó el

control de incubación y se mantuvo a 37°C. Las otras dos alícuotas se centrifugaron a

Maleriales‘ y Métndmr 54

300xg durante lO minutos; una de ellas se resuspendió en el mismo medio utilizado

durante la capacitación (control) y la otra se resuspendió en el buffer alternativo. Luego

de l y 4 horas de incubación en las condiciones capacitantes habituales, se determinó la

capacidad de respuesta al fluido folicular en todas las alícuotas.

8. ENSAYO PILOTO PARA COMPARAR LA REACCIÓN ACROSOMAL

lNDUClDA POR FLUIDO FOLICULAR EN ESPERMATOZOIDES DE

INDIVIDUOS NORMALES Y PACI_ENTESINFÉRTILES

8.1. Suietos estudiados

Se obtuvieron muestras de semen de 12 dadores voluntarios y 15 pacientes infértiles sin

causa aparente. Los pacientes se eligieron al azar entre parejas en las que la mujer no

mostró anormalidades ginecológicas ante una exhaustiva evaluación por infertilidad.

8.2. Procesamiento de las muestras de semen

Las muestras de semen se procesaron en la forma habitual para ser incubadas en

condiciones capacitantes y determinar, luego, el porcentaje de reacción acrosomal en

respuesta al fluido folicular (sección 3).

8.3. Tratamiento de resultados

Con el objeto de establecer un rango de normalidad para los valores de reacción

acrosomal inducida por fluido folicular, los datos obtenidos se trataron estadísticamente

como se indica a continuación.

Malerialec y Métmlrm 55

Para cada individuo normal, se calculó la diferencia entre los porcentajes de reacción

acrosomal en presencia y en ausencia de fluido folicular (%RA). Se encontró que los

datos se ajustaban a una distribución log normal, de modo que se aplicó una

transformación logaritmica para lograr la normalización de los datos. Se construyó un

intervalo de confianza del 95% para una cola, en la escala transformada usando una

distribución t. Luego, utilizando una transformación antilogarítmica, el intervalo de

confianza se llevó nuevamente a la escala original.

Una vez establecido el rango de normalidad, se evaluó la respuesta de los 15 pacientes

infértiles y se clasificó a cada uno de ellos como RA+ o RA-, según su respuesta se

encontrara (RA+) o no (RA-) dentro del rango normal establecido.

9. ESTUDIO POBLACIONAL DE LA REACCIÓN ACROSOMAL INDUCIDA

POR FLUIDO FOLICULAR

9.1. Individuos normales

9.1.]. Población estudiada

Participaron en este estudio 58 individuos de fertilidad comprobada, ya sea dadores

habituales de fertilidad comprobada de un banco de espermatozoides (Fairfax Cryobank)

o dadores voluntarios que hubieran concebido dentro del último año.

9.1.2. Procesamiento de las muestras de semen

Cada dador proveyó múltiples muestras de semen (mediana = 4, rango 2-27), que fiieron

Materiales y Mójndne 56

analizadas en la forma habitual para determinar parámetros seminales clásicos (sección

2) y luego se procesaron para determinar el % RA inducida por hFF (sección 3).

9.1.3. Tratamiento de resultados

Los parámetros seminales de cada individuo corresponden a la media de todas las

muestras provistas por dicho individuo.

Las múltiples muestras de cada individuo se utilizaron para determinar la variación

intraindividuo del ensayo.

La primera muestra provista por cada donante se utilizó para construir un intervalo de

confianza del 95% y así establecer un rango de normalidad para el %RA.

Se analizó la distribución de frecuencias del %RA en respuesta al fluido folicular dentro

de la población normal estudiada.

9.2. Pacientes infértiles.

9.2.1. Población estudiada

Participaron en este estudio 232 pacientes infértiles, secuencialmente tomados del grupo

de parejas infértiles que acudiera a la consulta para fertilización in vitro,

independientemente de la etiología de su infertilidad.

Materiales y Métodos 57

9.2.2. Procesamiento de las muestras de semen

Las muestras de semen provistas por estos pacientes se procesaron en la forma habitual,

tanto para determinar las caracteristicas seminales (sección 2) como para evaluar el

%RA en respuesta alfluido folicular (sección 3).

9.2.3. Tratamiento de resultados

Se estudió la distribución de frecuencias para el %RA en respuesta al fluido folicular

dentro de la población total, como así también dentro de ciertas subpoblaciones de

pacientes.

Para la población global, se analizó también la relación de los valores de %RA con otros

indicadores seminales, tales como % motilidad, V040, concentración y morfología

estricta.

lO. ESTUDIO DEL VALOR DIAGNÓSTICO DE LA REACCIÓN

ACROSOMAL INDUCIDA P03 FLUIDO FOLICULAR CON REflECTO A

LA CAPACIDAD FERTILIZANTE IN VITRO

10.1 Población estudiada

lntervinieron en este estudio los 232 pacientes infértiles que participaran en el estudio

poblacional de la reacción acrosomal. Se llevó a cabo una evaluación reproductiva

detallada de ambos miembros de la pareja, para excluir desórdenes potencialmente

reversibles.

Materiales y Mólmlrw 58

10.2. Procesamiento de las muestras de semen

10.2.1. Ensayo de reacción acrosomal

El análisis seminal se llevó a cabo de la manera habitual (sección 2), así como el

procesamiento de las muestras para determinar %RA (sección 3).

La muestra de semen que se utilizó para llevar a cabo el ensayo de reacción acrosomal

M fiJe la misma que se utilizó para FIV, sino otra muestra previa pero temporalmente

cercana al procedimiento de FIV.

10.2.2. Fertilización in vitro

Las muestras utilizadas para la fertilización in vitro se procesaron de la siguiente manera.

Una vez analizado el semen, los espermatozoides se lavaron 2 veces por centrifiigación

en Ham's F-lO (Life Technologies lnc., Grand Island, NY, USA) a 300xg durante lO

minutos. Los espermatozoides se resuspendieron en 100 pl de Ham's F-lO,

suplementado con suero de cordón umbilical (FCS), se colocaron bajo 1,5 ml del mismo

medio y se incubaron a 37°C durante l hora bajo atmósfera de 5% C02/ 95% aire para

permitir el ascenso de los espermatozoides altamente mótiles ("swim-up"). La fracción

del "swim-up" se utilizó para inseminar ovocitos a una razón de 100.000

espermatozoides / cápsula, conteniendo uno o más ovocitos.

10.3. Obtención de ovocitos 1 fertilización in vitro de los mismos

Los ovocitos se obtuvieron por aspiración folicular por vía vaginal de pacientes

previamente tratadas para inducir el desarrollo de múltiples folículos. El tratamiento

Materiales y Mótmlne 59

hormonal consistió en un análogo de factor liberador de gonadotrofinas (acetato de

leuprolide, Lupron; TAP Pharmaceuticals, Chicago, IL, EEUU) seguido de

gonadotrofma menopáusica humana (HMG, Pergonal, Serono Inc, Randolph, MA,

EEUU) o citrato de clomifeno (Serophene, Serono) combinado con HMG o HMG sola.

El desarrollo de los folículos se controló dosando estradiol sérico y midiendo el aumento

del diámetro folicular por ultrasonido. La posibilidad de una luteinización prematura se

investigó mediante el dosaje diario de hormona luteinizante (LH) y progesterona.

Las aspiraciones foliculares se llevaron a cabo 36 horas después de la inyección de

10.000 unidades internacionales de gonadotrofina coriónica humana (hCG; Profasi,

Serono).

Los ovocitos obtenidos se cultivaron a 37°C, bajo atmósfera de 5% C02, 5% 02, 90%

N2 en Ham's F-lO suplementado con FCS al 7,5% durante 6 horas, previamente a la

inseminación. El criterio de fertilización utilizado fiJe la presencia de 2 pronúcleos 16

horas luego de la inseminación y el posterior clivaje del ovocito.

10.4.Tratamiento de resultados

Se analizó el valor diagnóstico de la prueba de reacción acrosomal en respuesta al fluido

folicular con respecto al porcentaje de ovocitos fertilizados in vitro, tanto para la

población total como para distintos subgrupos de pacientes. Se determinaron

sensibilidad y especificidad del método, como así también los valores predictivos

positivo y negativo y la razón de probabilidades. Estos parámetros estadísticos se

calcularon de la siguiente manera:

Materiales y Mémrlm 6|)

o Sensibilidad: número de pacientes RA- / número de pacientes con FIV = 0

o Especificidad: número de pacientes RA+ / número de pacientes con FIV > 0

o Valor predictivo positivo: número de pacientes con FIV = 0 / número de pacientes

RA­

o Valor predictivo negativo: número de pacientes con FIV > 0 / número de pacientes

RA+

o Razón de probabilidades: (número de pacientes RA+ con FlV > 0 x número de

pacientes RA- con FIV < O) / (número de pacientes RA+ con FlV < O x número de

pacientes RA- con FlV > O)

Se construyeron curvas ROC (Metz, 1978) para evaluar el valor clinico del ensayo.

ll. BÚSQUEDA DE UN MODELO ADECUADO PARA PREDECIR LA

CAPACIDAD FERTILIZANTE DE UNA MUESTRA DE ESPERMATOZOIDES

ll.l. Diseñoexperimental

El primer objetivo de este estudio fue determinar cuál o cuáles de una serie de

parámetros masculinos y femeninos relacionados con la fertilidad, correlacionaban

individualmente con el porcentaje de ovocitos fertilizados en FlV, en un grupo de

pacientes infértiles. Luego, para crear un modelo predictivo de éxito en la fertilización in

vitro, se utilizó un análisis de regresión lineal escalonado con el porcentaje de

fertilización ¡n vitro como única variable dependiente. El objetivo de este análisis fue

encontrar la combinación de variables que proporcionara el mejor valor pronóstico para

el porcentaje de fertilización.

Materiales y Mótmlnc 61

El estudio se llevó a cabo en dos grupos independientes de pacientes infértiles para

determinar si las correlaciones originalmente establecidas con un primer grupo de

pacientes seguían siendo válidas al analizar un segundo grupo. Los pacientes, que

acudieron al G&lVF para procedimientos de FIV, fueron tomados completamente al

azar y sin tener en cuenta la etiología de su infertilidad.

ll.l.l. Etapa de construcción

Se utilizó un primer grupo de 82 pacientes y se estudió la correlación del porcentaje de

fertilización in vitro con los parámetros funcionales que se enumeran en la Tabla V.

TABLA V: Parámetros de fertilidad evaluados en la búsqueda de un modelo parapredecir la capacidad fertilizante de una muestra de espermatozoides

Espermatozoides en semen:Concentración% MotilidadV040

L3

% Morfología normal

Espermatozoides capacitados:VC60= % espermatozoides con velocidad menor o igual a 60pm/seg% RA

Parámetros ajenos al espermatozoide:Calidad de los ovocitos inseminadosPatología ginecológica: anovulación, obstrucción tubaria, endometriosis, otrasEdad de la mujerHombre: alguna vez logró concebir?

Se analizaron los datos para cada parámetro aisladamente a través del test de correlación

de Spearman.

Materiales y Métodos 62

11.1.2. Etapa de validación

Se utilizó un segundo grupo de 64 pacientes. Se tomaron en cuenta los mismos

parámetros que en la fase de construcción y el análisis estadístico se llevó a cabo en

forma semejante.

11.2. Procesamiento de las muestras

El procesamiento de las muestras de espermatozoides para los distintos ensayos

realizados se llevó a cabo de la manera habitual, según se describiera anteriormente en

las correspondientes secciones. Asimismo, los procedimientos asociados con la

fertilización in vitro se efectuaron según el protocolo detallado en la sección anterior.

RESULTADOS

1. OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DEL ENSAYO DE REACCIÓN

ACROSOMAL INDUCIDAP03 FLUIDO FOLICULAR

1.1. Concentración de fluido folicular

Al exponer espermatozoides de individuos normales, incubados durante toda la noche en

condiciones capacitantes, a diferentes dosis de fluido folicular (hFF), se observó un

aumento significativo (p<0,05) en el porcentaje de reacción acrosomal con respecto a

espermatozoides incubados en medio Sólo (Figura 10), incluso a la dosis mínima

analizada (1/50 V/V): 23 i 2 % para espermatozoides en fluido vs 7 i 1 % para

espermatozoides control (n = 6).

Se encontró que la relación entre el % reacción acrosomal y la concentración de fluido

folicular dependía de la dosis (p<0,05) y que, a partir de la dosis 1/10, se alcanzaba la

estimulación máxima. Se eligió, entonces, una concentración de fluido folicular al 10%

V/V para todos los ensayos posteriores.

La dosis de fluido folicular no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad de los

espermatozoides (Figura 10)4No se encontraron diferencias significativas (p>0,6) entre

los porcentajes de células muertas a las distintas concentraciones de fluido folicular

utilizadas.

1.2. Concentración de espermatozoides

Se estudió el efecto de la concentración de espermatozoides durante la capacitación

sobre el porcentaje de reacción acrosomal en presencia de 10% de fluido folicular. Se

encontró que la concentración a la cual se capacitan los espermatozoides es crítica para

50

8o 8‘z‘ E

9 40- Lg

É zLu 80‘ 30- gf3 oD '6'6 l­a gl- 20“ o:< LLl

E aEl Lu

% 10- °\°LIJ

3 o

. 0" Í Í I I I

% FLUIDO FOLICULAR

Figura 10: Efecto de la dosis de fluido folicular sobre el % de reacción acrosomal(H) y la viabilidad (o——o)de espermatozoides humanos capacitados durante 22horas y luego incubados durante 30 minutos en presencia de 0, 2,5, 5, 10 y 20%V/V de hFF. Los resultados se expresan como media i SEM. n = 6.

el ensayo, pues se produjo un descenso progresivo y altamente significativo (p<0,0001)

en el porcentaje de reacción acrosomal inducida por hFF a medida que aumentaba la

concentración de espermatozoides durante la capacitación (Figura ll).

Cuando la concentración de espermatozoides en el medio de capacitación llegó a los 12

millones/ml, no se observó diferencia entre los porcentajes de reacción acrosomal de

espermatozoides control y espermatozoides expuestos al fluido.

También se encontró un efecto muy significativo (p<0,0001) de la concentración de

espermatozoides sobre el porcentaje de reacción acrosomal espontáneo (controles), pero

este file significativamente menor (p<0,0001) que el efecto sobre los espermatozoides

expuestos al fluido.

Tomamos, por lo tanto, una concentración de 1 a 2 millones/ml durante la capacitación

para todos los ensayos posteriores.

1.3. Tiempo de exposición al fluido folicular

Se estudió la cinética de inducción de la reacción acrosomal por fluido folicular al 10%

sobre espermatozoides capacitados en una concentración de l a 2 millones/ml. Se

observó un aumento muy significativo (p<0,000l) en el porcentaje de reacción

acrosomal a medida que aumentó el tiempo de exposición al fluido (Figura 12). El

porcentaje de reacción acrosomal a tiempo 0 fue significativamente menor (p<0,05) que

al resto de los tiempos estudiados: 5, lO, 20 y 30 minutos, mientras que no hubo

diferencias entre el porcentaje de estimulación entre los distintos tiempos. Tampoco

hubo diferencias en los porcentajes de reacción acrosomal espontánea (tubos control) a

esos tiempos.

U1O

AOI

+hFF 1:10

(a) Ol

NO a

Control

%ESPERMATOZOlDESREACCIONADOS

3

0 l l l

0 4 8 12

CONCENTRACION DE ESPERMATOZOIDES (millones/ml)

Figura ll: Efecto de la concentración de espermatozoides durante la capacitaciónsobre el % espermatozoides reaccionados espontáneamente (control) o enrespuesta a fluido folicular 10% (+hFF 1:10). Los espermatozoides, previamentecapacitados a 2, 4, 8 y 12 millones/ml durante 22 horas, se incubaron luegodurante 30 minutos adicionales en presencia de fluido folicular 10% (o—o) omedio (0-4). Los resultados se expresan como media i- SEM. n =4.

AO

Fluido Folicular 1:10

(A)Ol

Control

_¡ o I

%ESPERMATOZOIDESREACCIONADOS

l\)O

0 | | l I

O 10 20 30

TIEMPO DE EXPOSICION AL FLUIDO FOLICULAR (min)

Figura 12: Cinética de inducción de la reacción acrosomal por hFF enespermatozoides humanos. Los espermatozoides, previamente capacitados durante22 horas a una concentración de 1-2x106/ml,se incubaron en presencia (o_o) oausencia (o——o)de hFF 10% durante 0, 5, 10, 20 y 30 minutos. Los resultados seexpresan como media i SEM. n = 4.

La viabilidad de los espermatozoides se mantuvo constante (90%) a lo largo de los

distintos tiempos analizados.

Por conveniencia, se eligió un tiempo de incubación con fluido de 30 minutos para todos

los ensayos posteriores.

1.4 Tiempo de capacitación

Se estudió el porcentaje de reacción acrosomal inducida por distintas dosis de fluido

folicular en espermatozoides incubados en condiciones capacitantes por diferentes

períodos: O, 2, 6 y 22 horas (Figura 13). No se encontró un efecto significativo del

tiempo de incubación (p>0.06) sobre el porcentaje de reacción acrosomal espontánea

(espermatozoides no expuestos al fluido). Sin embargo, el porcentaje de reacción

acrosomal en respuesta al fluido folicular aumentó significativamente (p<0,000l) con el

tiempo de capacitación. No se observó reacción acrosomal en espermatozoides no

capacitados (t = O)o en espermatozoides capacitados durante 2 horas. Recién al cabo de

6 horas de capacitación se observó un pequeño pero significativo (p<0,05) aumento en

el porcentaje de reacción acrosomal en presencia de fluido folicular humano (hFF): 6 1L3

% a las 6 horas vs. 2 i 1 % a las 2 horas con hFF 10%. Un aumento mucho mayor y

altamente significativo (p<0,000l) en el porcentaje de reacción acrosomal inducida se

observó al cabo de 22 horas de incubación en condiciones capacitantes: 30 i 6 % a las

22 horas vs. 6 i 3 % a las 6 horas con hFF 10%.

Si bien el % viabilidad disminuyó al aumentar el tiempo de capacitación (Zil % a las Oh

vs, 1215 % a las 22 hs), file semejante en espermatozoides expuestos al fluido y

espermatozoides control para todos los tiempos estudiados.

40(DOOá9 ­OO<LLl

n: 20 —(D n .1

g + capacúacuonÉ + ho ’'­<EEn. 0 “(J)uJ

°\°

0 5 10 15 20 25

CONCENTRACION hFF (°/o)

Figura 13: Efecto del tiempo de capacitación sobre el % reacción acrosomal enrespuesta a distintas dosis de hFF. Los espermatozoides, capacitados a 1-2x106/mldurante 0, 2, 6 y 22 horas, fueron incubados durante 30 minutos adicionales enpresencia de distintas dosis de hFF. Los resultados se expresan como media iSEM. n = 3.

Con el objeto de evaluar algún punto intermedio entre las 6 y las 22 horas de

capacitación, se llevó a cabo una serie de experimentos adicionales (n = 8) en los que se

analizó la respuesta al fluido folicular por parte de espermatozoides incubados en

condiciones capacitantes durante 8 y 22 horas. Luego de 8 horas de capacitación se

observó un 16 i 4 % de reacción acrosomal en espermatozoides incubados con fluido

folicular 10% vs. un 4 i 1 % de reacción en espermatozoides controles (p<0,01). Los

espermatozoides incubados en condiciones capacitantes durante 22 horas también

mostraron un incremento de 4 veces (p = 0,02) en la reacción acrosomal en presencia de

fluido folicular 10%: 22 i 5 % vs. 6 i 1 % en el control, sugiriendo que se necesitaría un

tiempo mínimo de capacitación de 8 horas para lograr la máxima respuesta al fluido

folicular.

Por conveniencia, se adoptó un tiempo de capacitación de 22 horas para todos los

experimentos subsiguientes.

2. EFECTO DEL FLUIDO FOLICULAR SOBRE LAS CARACTERÍSTICAS DE

MOVIMIENTO DE ESPERMATOZOID_ES INCUBADO_S EN CONDLCIONES

CAPACITANTES

Los espermatozoides previamente capacitados durante 22 horas en las condiciones

habituales y luego incubados durante otros 30 minutos en presencia de fluido folicular

presentaron cambios en sus características de movimiento, analizadas por CASA. La

exposición de los espermatozoides al fluido modificó la velocidad curvilínea de los

mismos de modo tal que se produjo un corrimiento de la curva de distribución

acumulativa de Vc hacia la derecha, con respecto a la curva de espermatozoides control,

incubados solamente en medio (Figara 14, panel superior).

120

100 d

60 7 Control

Fluido folicular 1:10

DISTRIBUCIONACUMULATIVA(%)

0 20 40 60 80 100 120 140 160

VELOCIDAD CURVILINEA (um/seg)

120

100 ­

80‘

60 —

Control

40«

Fluido folicular 1:1020 <

DISTRIBUCIONACUMULATIVA(%)

LINEALIDAD

Figura 14: Efecto del fluido folicular sobre la velocidad curvilínea (panel superior)y la linealidad (panel inferior) de espermatozoides humanos. Las curvas muestranla distribución acumulatíva porcentual de velocidad curvilínea y linealidad enespermatozoides capacitados durante 22 horas y luego incubados durante 30minutos adicionales en presencia de hFF (o—o) o medio (0-0). Las velocidadescurvilíneas y linealidades se determinaron mediante un sistema CASA.

Este corrimiento indica que, como consecuencia de la exposición al fluido, se produjo un

aumento en la fracción de espermatozoides más mótiles, que globalmente sería

observado como una mejora en la velocidad de movimiento. La diferencia máxima entre

las dos curvas se observó a Vc = 90 “nt/seg (p<0,001).

Por el contrario, la exposición de espermatozoides capacitados a hFF no tuvo ningún

efecto sobre la linealidad de los mismos (p>0,l), hecho que se pone de manifiesto en la

superposición de las curvas de distribución con y sin fluido (Figura 14, panel inferior).

3. CARACTERLSTICAS DEL MEDIO DE CAPACITACIÓN Y REACCIÓN

ACROSOMAL

3.]. Efecto de la composición salina del medio sobre la reacción acrosomal

inducida por fluido folicular

El efecto de pequeñas variaciones en la composición salina del medio de capacitación

sobre la respuesta de los espermatozoides a la estimulación con fluido folicular puede

observarse en la Figura 15.

Si bien los espermatozoides incubados en cualquiera de los 3 medios: HSM, BWW y

Ham's F-lO, fiieron capaces de sufrir reacción acrosomal ante la estimulación con

fluido, se observó que se lograba una estimulación mayor (p<0,01) si los

espermatozoides se habían capacitado en HSM (8 i l % control, 28 i 3 % fluido) que si

se habian capacitado en BWW (8 i 2 % control, l7 i 2 % fluido) o en Ham's F-lO (6 i

l % control, 19 i 4 % fluido). No se observaron diferencias en la capacidad de

respuesta entre espermatozoides incubados en BWW o Ham's F-lO.

40

HSM

(D< 30- To J

É iQ - HAM'S8 waÉm 20­(D<._I ­3._|LIJ

o 10­°\ T

77(FéC FF

Figura 15: Efecto de la composición salina del medio de capacitación sobre el %espermatozoides reaccionados en respuesta a fluido folicular. Espermatozoidesprocedentes de un mismo eyaculado se capacitaron durante 22 horas en HSM (El),BWW (El) o Ham’s F-10 ([1), suplementados con 26 mg/ml BSA y se incubaronluego durante 30 minutos adicionales en presencia de hFF 10% (FF) o medio (C).Las barras corresponden a media i SEM. n = 10.

3.2. Efecto del suplemento proteico del medio de capacitación sobre la respuesta al

fluido folicular.

El efecto de la naturaleza del suplemento proteico en el medio de capacitación sobre la

reacción acrosomal inducida por fluido folicular se ilustra en la Figura 16.

Los espermatozoides capacitados en medio conteniendo BSA, cuadmplicaron (p<0,05)

el porcentaje de reacción acrosomal como consecuencia de la exposición al fluido

folicular. No se observaron diferencias (p>0,6) entre aquellos espermatozoides

incubados en HSM-BSA al 2,6% (6 i- l % control, 22 i 3 % fluido) y los incubados en

HSM-BSA al 3,5% (7 i l % control, 24 i 3 % fluido). Por el contrario, los

espermatozoides incubados en medio suplementado con FCS no reaccionaron en

respuesta a la estimulación con fluido: 6 i 2 % control, 6 i 2 % fluido.

La Figura l7 ilustra el efecto del agregado simultáneo de los dos suplementos proteicos,

BSA y FCS, al medio de capacitación.

Nuevamente se observa que los espermatozoides capacitados en presencia de BSA al

2,6%, cuadruplicaron (p<0,05) su porcentaje de reacción acrosomal como consecuencia

de la exposición al fluido folicular (5 i l % control, 23 i 4 % fluido) mientras que no se

produjo respuesta al fluido luego de la capacitación en FCS (7 1- l % control, 6 i 2 %

fluido, NS). La presencia simultánea de FCS y BSA al 2,6% en el medio de capacitación

también anuló la respuesta al fluido folicular : 4 i l % control, 7 i 2 % fluido (NS). Una

vez llevada a cabo la capacitación en presencia de FCS, el agregado de BSA al 2,6%

durante la exposición al fluido folicular, no revirtió la inhibición de la respuesta al fluido:

4 i l % control, 4 i l fluido (NS).

40

358

30­ï J

%CELULASREACCIONADAS

0..

Figura 16: Efecto del suplemento proteico en el medio de capacitación sobre el %espermatozoides reaccionados en respuesta a fluido folicular. Espermatozoidesprocedentes de un mismo eyaculado se capacitaron durante 22 horas en HSMsuplementado con 26 mg/ml BSA (26B [1), 35 mg/ml BSA (35B [3) o 7,5% FCS(FCS [1) y se incubaron luego durante 30 minutos adicionales en presencia de hFF10% (FF) o medio (C). Las barras corresponden a media i SEM. n = lO.

40

30_ BSA

‘12

2S8Í]5 2o­É

É FCSFCS+BSA

FCS+BSA10_ tardío

a ï i

o-.. _ . _//¿ _%-_FF c FF c FF

Figura 17: Efecto del agregado simultáneo de BSA y FCS al medio de capacitaciónsobre el % espermatozoides reaccionados en respuesta a fluido folicular.Espermatozoides procedentes de un mismo eyaculado se capacitaron durante 22horas en HSM suplementado con 26 mg/ml BSA (BSA E] ), 7,5% FCS (FCS El)oambos (FCS + BSA [1). Se ensayó además el efecto del agregado de BSA aespermatozoides previamente capacitados en FCS (FCS + BSA tardío El). Losespermatozoides capacitados se incubaron durante 30 minutos adicionales enpresencia de hFF 10% (FF) o medio (C). Las barras corresponden a media ¿rSEM.n = 7.

Para evaluar la reversibilidad del efecto inhibitorio del FCS sobre la capacitación, se

realizó un experimento de intercambio de medios luego de la capacitación, cuyos

resultados se ilustran en la Figura l8.

Los espermatozoides incubados durante l8 horas en BSA al 2,6% perdieron

rápidamente la capacidad de reaccionar en respuesta al fluido folicular al cabo de l hora

de incubación en FCS: 9 i l % control, 8 i l % fluido (n = 10; NS). Los

espermatozoides incubados durante l8 horas en FCS al 7,5% y luego en BSA al 2,6%

durante l hora tampoco respondieron a la estimulación con fluido folicular: 4 i l %

control, 7 i 2 % fluido (n = lO; NS).

Se observó un ligero pero aún no significativo aumento en la respuesta al fluido folicular

cuando la capacitación durante 18 horas en FCS al 7,5 % fiJe seguida de una incubación

en BSA al 2,6% durante 4 horas: 4 i l % control, 9 1L2 % fluido (n = ll", NS). La

resuspensión de los espermatozoides capacitados en BSA al 2,6% en ese mismo medio

no bloqueó la respuesta al fluido folicular, indicando que el efecto inhibitorio observado

con FCS no puede atribuirse al manipuleo de las muestras.

40

w 18 hrs CAPACITACION FCSá<á 30 ­5O<uJDC

2 2° ‘.1D_lEj BSA 4hrs

¿e 1o - CONTROL i

T BSA1hr

7 T 7T T V To_Á. #1! /C FF c FF C FF

40m 18 hrs CAPACITACION BSA<2 CONTROLZo 30 _6 i0<LUDi

‘S 20 ­D_1

8¿e FCS 1'" FCS 4hrs

1o — T

7% 7O _.

Figura 18: Reversibilidad del efecto de FCS y BSA en el medio de capacitaciónsobre el % espermatozoides reaccionados en respuesta a hFF. Espermatozoides deun mismo eyaculado se capacitaron durante 18 horas en HSM suplementado conFCS (panel superior) o BSA (panel inferior). Luego de centrifugar a 300xgdurante 10 minutos, los espermatozoides previamente incubados en FCS seresuspendieron en BSA (panel superior U) y los incubados en BSA seresuspendieron en FCS (panel inferior D). Como control, una alícuota secentrifugó y resuspendió en el mismo medio: FCS El, BSA l] . Las distintasalícuotas se capacitaron durante l y 4 horas más y finalmente se incubaron otros30 minutos en presencia de hFF 10% (FF) o medio (C). Las barras corresponden amedia i SEM. n = 10.

4. CARACTERÍ_STICASDEL MEDIO DE CAPACITACIÓN Y PARÁMETROS

DE MOTlLlDAD

4.1. Efecto de la composición salina del medio sobre la motilidad de los

espermatozoides luego de 2 horas de incubación en condiciones capacitantes

Se construyeron las curvas de distribución acumulativa para velocidad curvilínea (Vc) y

linealidad (L) de espermatozoides luego de 2 horas de capacitación en HSM, BWW o

Ham's F-lO, suplementados con BSA al 2,6%.

No se encontraron diferencias en velocidad curvilínea entre los 3 medios utilizados

(Figura 19A). Sin embargo las curvas de distribución para linealidad en Ham's F-lO y

BWW fueron significativamente diferentes (Figura 19B). La curva de BWW se

encuentra desplazada hacia la izquierda en el gráfico, indicando que existe en ese medio

una mayor fracción de espermatozoides con movimiento menos lineal que en Ham's F­

lO. El punto de mayor diferencia entre ambas curvas se encontró para L = 5 (p<0,05).

4.2. Efecto del suplemento proteico del medio sobre la motilidad de los

espermatozoides luego de 2 horas de incubación en condiciones capacitantes

Se construyeron las curvas de distribución acumulativa para velocidad curvilínea (Vc) y

linealidad (L) de espermatozoides luego de 2 horas de capacitación en HSM

suplementado con BSA al 2,6% (HSM-268), BSA al 3,5% (HSM-358) y FCS al 7,5%

(HSM-PCS).

No se observaron diferencias en las distribuciones para ninguno de los parámetros

cuando los espermatozoides se incubaron en HSM-268 o HSM-35B (Figura 20A y B).

100 —

8°< + wa+ HSM+ HAM'SF-10

60­

%ACUMULATIVODEESPERMATOZOIDES

40 q

2o J

A

o - a ,

O 40 80 120 160 200

VELOCIDAD CURVILINEA (pm/seg)

U) g Y

Lu a9 10041 vo á íN ‘O 3 + wa 1*- ao — ‘

g í —o— HSMo; + HAM'SF-10É 60 4'(I) p e

LU í a

Lu ; i

0 40o ..>_ Í¡_. ‘ i

5 20 ¿j i

É 3 B

8 o ‘ n ‘

<5 o 2 4 6 8 1o°\LINEALIDAD

Figura 19: Efecto de la composición salina del medio de capacitación sobre lavelocidad curvilínea (A) y la linealidad (B) de espermatozoides humanos. Losespermatoozides se capacitaron durante 2 horas en HSM (o-o), BWW (0-...) oHam’s F-10 (o——o)suplementados con 26 mg/ml BSA. Las curvas corresponden ala distribución acumulativa porcentual para cada parámetro de motilidad en cadauno de los medios, evaluado mediante un sistema CASA.

—o— 26B

+ 353 ‘80_ + ch

%ACUMULATIVODEESPERMATOZOIDES

A

o - a a ,

o 4o ao 120 160 200

VELOCIDAD CURVILINEA (um/seg)

(D

É ï6 "’07[5' 1 + 26Bz 80; + 358É ; —-— ch iLlJ

% 60 « ‘'-'-' 1

uJ 1

o o 1o 4o —. i2 l|- ‘ \S 20 — ÍD l

3 * B 1

2 o ‘¿e o 2 4 e a 1o

LINEALlDAD

Figura 20: Efecto del suplemento proteico en el medio de capacitación sobre lavelocidad curvilínea (A) y la linealidad (B) de espermatozoides humanos. Losespermatozoides se capacitaron durante 2 horas en HSM suplementado con 26mg/ml BSA (0-0), 35 mg/ml BSA (H) o 7,5% FCS (H) . Las curvascorresponden a la distribución acumulativa porcentual para cada parámetro demotilidad en cada uno de los medios, evaluado mediante un sistema CASA.

La incubación en HSM-FCS produjo, sin embargo, un efecto bifásico sobre la velocidad

curvilínea. Se observó una fracción mayor de células "lentas" en el rango de velocidades

entre 40 y 80 pnl/seg pero una fracción significativamente mayor (p<0,05) de células

rápidas en el rango de velocidades entre 120 y 160 ¡im/seg. También se observó una

fracción mayor de espermatozoides menos lineales (p<0,05) luego de la incubación en

FCS, comparado con la incubación en medio suplementado con BSA.

5. ENSAYO PILOTO PARA COMPARAR LA REACCIÓN ACROSOMAL

INDUCIDA POR FLUIDO FOLICULAR EN INDIVIDUOS NORMALES Y

PACIENTES INFÉRTILES

Las características seminales de los dos grupos de individuos que participaron en el

estudio se resumen en la Tabla VI.

TABLA VI: Ensayo piloto: Características seminales de individuos normales ypacientes infértiles sin causa aparente.

Normales Infértiles(n = 12) (n = 15)

Concentración (IDG/ml) 103.7 i 15.8 44.1 i 73*

Motilidad (%) 79 i 4 45 i 4*

VC40 (%) 31i 6 36i6

L3 (%) 10 ¿r 3 15 i 2

Los valores corresponden a media i ES.* p<0,05 con respecto a los normales (Mann -Whitney).

Tanto la concentración de espermatozoides como el porcentaje de motilidad de los

mismos fiie significativamente menor en el grupo de pacientes que en el grupo de losé

individuos normales. Por otra parte no se encontraron diferencias significativas entre

ambos grupos en los parámetros de motilidad VC4oy L3.

La capacidad de respuesta al fluido folicular por parte de espermatozoides capacitados

procedentes de 12 dadores voluntan'os y ¡5 pacientes infértiles se ilustra en la Figura 2 l.

En todos los individuos normales se observó un aumento del porcentaje de

espermatozoides reaccionados en presencia de fluido con respecto al control, mientras

que en 6 de los 15 (40%) pacientes estudiados la exposición al fluido no modificó el

porcentaje de reacción acrosomal. Al construir el intervalo de confianza del 95% para la

población normal se encontró que una diferencia s 1% entre espermatozoides expuestos

al fluido y espermatozoides control se encontraba fuera del rango normal. En

consecuencia, 9 de los 15 pacientes estudiados presentaron una respuesta al fluido

folicular indistinguible de aquélla de los individuos normales.

Los pacientes se agruparon entonces en dos categon'as según hubieran respondido o no

a la estimulación con fluido folicular: RA+ incluye a todos aquéllos que respondieron al

fluido en forma indistinguible de los individuos normales; RA- incluye a aquellos

pacientes que resultaron estar fiJera del rango normal. Analizamos para cada subgrupo

las caracteristicas seminales (Tabla VIl).

(J‘I oDonantes lnfértiles

.h Ol

(A) Ol

.A Ol

°/oESPERMATOZOIDESREACClONADOS

N

oo

O -n -r1o 'l'l 'l'l

Figura 21: Reacción acrosomal espontánea (C) e inducida por fluido folicular (FF)en espermatozoides de donantes fértiles (o—o panel izquierdo; n=12) y pacientesinfértiles sin causa aparente (0.-. panel derecho; n=15). Los espermatozoides secapacitaron durante 22 horas a 1-3 xlOG/mly se incubaron luego durante 30minutos más en presencia de hFF (FF) o medio (C).

TABLA VII: Estudio Piloto: características seminales de pacientes infértiles

RA+ y RA­

Pacientes RA+ Pacientes RA­(n = 9) (n = 6)

Concentración (106/ml) 48.3 i 12.0 37.6 i 12.2

Motilidad (%) 47 i 7 43 i 6

VC40(%) 34 i 8 39 i 12

L3 (%) 14 i 3 18 i 5

Los valores corresponden a media i ESp>0,05 (Mann - Whitney) para los 4 parámetros evaluados

Se observó que tanto la concentración de espermatozoides y el porcentaje de motilidad

como los parámetros de motilidad Vc40 y L3 no presentaron diferencias significativas

entre ambos grupos (p>0,05), a pesar de la respuesta diferencial al fluido folicular.

6. ESTUDIO POBLACIONAL DE LA REACCIÓN ACROSOMAL INDUCIDA

POR FLUIDO FOLICULAR

6.1. Población normal.

Tal como se esperaba, los parámetros seminales de los individuos normales que

participaron de este estudio, se encontraron dentro del rango de normalidad establecido

por la OMS. Las medianas poblacionales de los parámetros evaluados, como así también

sus rangos intercuartilos, se señalan en la Tabla VIll.

TABLA VIII: Parámetros seminales en la población normal (n = 58) estudiada.

Parámetro Mediana Rango Intercuartilo

Concentración (x106/ml) 101 7o —133

% Motilidad 78 65 - 87

Progresión 3.5 3.3 - 3.8

V040 23 l3 - 43

% Formas normales 12 9 - 17

El %RA medio en la población fértil se calculó utilizando en el valor de %RA obtenido

con la primera muestra de semen de cada individuo y fue 17 i 1 % (mediana = 15%; 25

percentilo = 12%; 75 percentilo = 22; n = 58). La curva de distribución de %RA (Figura

22) se aproxima bastante a una distribución Gaussianai

Se construyó un intervalo de confianza del 95% para %RA y se encontró que valores

de %RA menores que 5% deberían considerarse fuera del rango normal. Es importante

notar que la construcción repetida de este intervalo de confianza durante un período de

5 años, arrojó consistentemente los mismos resultados,

En la Figura 23 se muestra un histograma de frecuencias para %RA en la población

normal. El 83% de los donantes presentó un valor de %RA superior al 9%, mientras

que sólo 2% de los individuos tuvo %RA menor que 5%, es decir, filera del rango

normal.

NUMERODEINDIVIDUOS

AI l

o../\./0 10 20 30 40 50

°/oRA

Figura 22: Curva de distribución de %RA en la población de donantes fértiles(n=58). La curva se construyó utilizando el %RA obtenido con la primera muestraproporcionada por cada donante.%RA = (% espermatozoides reaccionados en presencia de hFF) — (%espermatozoides reaccionados en medio sólo)

Se calculó la variabilidad intraindividuo del ensayo utilizando múltiples muestras

(rango 2-27; mediana 4) de cada individuo. El intervalo de confianza del 95% para cada

individuo incluyó 4 unidades de %RA por encima y por debajo de su valor medio; el

intervalo de confianza del 67% fue de 1-2 unidades de %RA.

6.2. Población de pacientes infértiles.

Las medianas poblacionales con sus correspondientes rangos intercuartilos de los

parámetros seminales evaluados en la población infértil se muestran en la Tabla IX.

TABLA IX: Parámetros seminales en la población de pacientes infértiles (n = 242)estudiada. Comparación con la población normal.

MedianaParámetro (Rango intercuartilo)

Pacientes infértiles Individuos normalesConcentración (x106/ml) 38.5* 101

(20 s 60) (7o —133)% Motilidad 48* 78

(38 —57) (65 —87)Progresión 2.8 3.5

(2.6-3.0) (3.3-3.8)V040 23 23

(15*33) (13-43)% Formas normales 8* 12

(4 — 11) (9 —17)

* Significativamente menor (p < 0.05) que en individuos normales (Mann - Whitney)

La concentración de espermatozoides, el % motilidad y el % formas normales fiieron

significativamente menores (p < 0,05) para la población de pacientes infértiles que para

los individuos normales.

80

°/oINDIVIDUOS

Figura 23: Histograma de frecuencias para %RA en la población fértil (n=58).Valor normal = %RA 2 5%.

La curva de distribución de %RA para la población de pacientes infértiles estudiada

(Figura 24) fue marcadamente distinta de la distribución de %RA en la población

normal y, definitivamente, no se ajusta a una distribución Gaussiana. La mediana de la

población infértil fue de 3%, con el 25 percentilo en 1% y el 75 percentilo en 9%.

La Figura 25 muestra el histograma de frecuencias de %RA para la población infértil

(panel inferior) y su fimdamental diferencia con el histograma correspondiente a la

población normal (panel superior).

El 60% de los pacientes estudiados presenó un valor de %RA menor que 5%, es decir,

fuera del rango normal; sólo en el 26% de los pacientes el %RA fue superior al 9%.

Como no se intentó excluir ningún paciente de este estudio por razones clínicas, la

población final incluyó una gran variedad de sujetos: desde individuos cuyas

características seminales eran indistinguibles de aquéllas de los individuos normales,

hasta individuos con semen de muy mala calidad. Es así que fue posible identificar

fácilmente varios subgrupos de pacientes.

El primer grupo, que llamamos "buen semen" (BS, n = 56) mostró valores normales de

concentración de espermatozoides, porcentaje de motilidad, calidad de motilidad

(medida a través de la escala de 0-4 y del parámetro V040) y morfología estricta. Estos

pacientes daban la impresión inicial de ser potencialmente fértiles y, en la mayoría de los

casos, así habían sido considerados por el médico que los derivara al G&IVF.

En un segundo grupo de pacientes, al que se llamó "desorden morfológico aislado"

(DM, n = 47) la concentración de espermatozoides y el porcentaje y calidad de

motilidad se encontraban dentro del rango normal, pero el porcentaje de formas

60 . . . . 10

PACIENTESINFERTILES

NUMERODEINDIVIDUOS

-—-DADORESNORMALES

40 50

%RA

Figura 24: Curva de distribución de %RA para dadores normales (——n=58) ypacientesInfértiles(- n=242).

%lNDIVIDUOS

%lNDIVIDUOS

80

80

NORMALES

0-4 9-12 13+5-8% AR

INFERTILES

93

Figura 25: Histograma de frecuencias para %RA en individuos normales (panelsuperior; n=58; [1)y pacientes infértiles (panel inferior; n=242; D). Valor normal =%RA 2 5%.

normales según criterios estrictos era bajo (menor del 10%). Previo a ser derivados al

G&lVF, estos pacientes también habian sido considerados fértiles.

Por lo tanto, 103 de los 232 pacientes estudiados (44%) se ubicaron dentro de los

grupos BS y DM y se había considerado inicialmente que tenían semen de buena calidad.

Los 129 pacientes restantes presentaron semen de baja calidad, reflejada en la

concentración de espermatozoides y/o motilidad y/o morfología. Los 16 pacientes que

mostraron una concentración de espermatozoides menor que lelOÓ/ml, menos del 10%

de formas normales y menos del 40% de motilidad se reunieron arbitrariamente en un

grupo con semen de calidad extremadamente baja (mal semen, MS). Los l l3 pacientes

restantes, con parámetros seminales fuera del rango normal, pero sin llegar a ser

extremos, se reunieron en el grupo "semen subóptimo" (SS). Las características

seminales de la población infértil total y de las cuatro subpoblaciones, como así también

las de la población normal, se resumen en la TablaX.

TABLA X: Parámetros seminales para los individuos fértiles, la población infértiltotal y los distintos subgrupos de pacientes infértiles.

Población Concentración Motilidad Progresión VC40 Morfología(xlOó/ml) (%) (%) (%)

Fértil 101 78 3.5 23 12(n=58) (70- 133) (65-87) (3.3-3.8) (13 -43) (9- l7)

lnfértil total 38.5 48 2.8 23 8(n=232) 20-60 (38-57) (26-30) (15-33) (4- ll)

BS 64.2 58 3.0 18 13(n=56) 440-95) (¿62 (29-32) (14-24) (ll-15)

DM 41.3 52 3.0 19 5(n = 47) (35 - 58) (50 - 56) (28 - 3.0) (16 - 22) (4 - 7)

SS 29.8 41 2.7 30 7.1

(n = l l3) (20-45) (32-48) (2.5-2.8) (22-38) (4-9)MS 6.5 41 2.5 28 3.6

(n = 16) (3 5-80) (33-45) (25-27) (22-28) (LS-5.0)

Los valores corresponden a mediana y su (rango intercuartilo)

Los pacientes se asignaron a los distintos subgrupos sin tener en cuenta el valor de

%RA. La Figura 26 muestra los histogramas de frecuencias para estos cuatro subgrupos

de pacientes. Se observó que a medida que las características del semen se deterioraron,

según criten'os clásicos, se produjo un aumento progresivo en el número de individuos

con valores de %RA por debajo del rango normal (Test para Alternativas Ordenadas;

p=0,01)_

Ya que el valor de %RA parecía estar relacionado en cierto modo con las características

del semen, se analizó la relación entre los valores de %RA y algunos parámetros

seminales, tales como la concentración de espermatozoides, el porcentaje de motilidad,

VC40y el porcentaje de formas normales, a través del test de correlación de Speannan.

%RA correlacionó significativamente con morfología (r = 0.509; p<0.001),

concentración de espermatozoides (r = 0.524; p<0.001 ), motilidad progresiva

(r = 0.416; p<0.001) y porcentaje de motilidad (r = 0.356; p<0.001), pero no se

observó correlación con VC40.

En virtud de la conocida importancia de la morfología estricta como medida de la

fiJncionalidad del esperrnatozoide, se analizó especialmente la relación entre %RA y

morfología estricta a través de un análisis de cuadrantes. Se realizó, entonces, un gráfico

del porcentaje de formas normales en función del valor de %RA para cada paciente

(Figura 27). Dado que los dos parámetros se encuentran estadísticamente relacionados,

se utilizó el coeficiente de correlación entre los mismos como la pendiente de un eje y la

perpendicular sobre la mediana como el otro eje (análisis de factores).

100

80

60

40

20%INDIVIDUOS

100

80

°/oINDIVIDUOS

100

80

60

40

20°/oINDIVIDUOS

%INDIVIDUOS

Buen Semen

0-4 5-8 9-12 13+

Desorden Morfológico

0-4 5-8 9-1 2 13+

Semen Subóptimo

357,. ' ,73,;5-8 9-12 13+

Malsemen

5-8 9-12 13+RA (%)

Figura 26: Histograma de frecuencias para %RA en los cuatro subgrupos depacientes infértiles: Buen Semen (BS; n=56; D); Desorden Morfológico (DM;n=42; El); Semen Subóptimo (SS; n=113; [1) y Mal Semen (MS; n=16; D). Valornormal = %RA 2 5%.

%DEESPERMATOZOlDESNORMALES

%RA

Figura 27: Gráfico de correlación entre %RA y % espermatozoides normales ensemen según criterios estrictos, para individuos normales (V) y pacientes infértiles(o). El coeficiente de correlación de Spearman entre ambas variables se usó comoeje principal y la perpendicular al mismo sobre la mediana (17,13) como segundoeje.

Se observó que 83% de los pacientes cayeron dentro del cuadrante caracterizado por

formas normales < 10% y %RA < 20%, mientras que los individuos pertenecientes a la

población normal se dístribuyeron uniformemente en los cuatro cuadrantes (test de X2).

Una vez más se puso de manifiesto el comportamiento marcadamente diferente de la

población infértil con respecto a la población normal.

7. ESTUDIO D_ELVALOB DIAGNÓSTICO DE LA REACCIÓN ACROSOMAL

INDUCIDA POR FLUIDO FOLICULAR CON RESPECTO A LA CAPACIDAD

FERTILIZANTE IN VITRO

7.1. Población infértil total

La mediana del porcentaje de fertilización para la población infértil total (PT; n = 232)

file 25% (rango intercuartilo 5-58%). El número de ovocitos disponible para la

fertilización van'ó entre l y 29, con una mediana de 5 ovocitos. Todos los ovocitos

aspirados fueron evaluados por el mismo embriólogo y se calificaron según su calidad en

una escala de l a 5 (l = mala; 2 = regular; 3 = buena; 4 = muy buena; 5=excelente); la

mediana poblacional para la calidad de los ovocitos fiJe 3. La edad de las mujeres que

participaron en el estudio osciló entre 23 y 45 años, con una mediana de 35.

La relación entre el porcentaje de ovocitos fertilizados in vitro y el porcentaje de

espermatozoides capaces de sufrir reacción acrosomal en respuesta al fluido folicular se

ilustra en la Figura 28, para la población infértil total.

La mediana del porcentaje de ovocitos fertilizados ¡n vitro aumentó a medida que

aumentó la capacidad de respuesta al fluido folicular (%RA). La mediana del porcentaje

de fertilización fue solo 12% (rango intercuartilo O-50%) para pacientes RA- (%RA <

5%) y aumentó progresivamente con %RA hasta alcanzar un máximo de 50% (rango

20-71%) para pacientes con %RA > 9%,

Con el objeto de analizar el valor estadístico del ensayo de %RA, se calcularon

sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivo y negativo y razón de

probabilidades (Tabla XI).

TABLA XI: Sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivo (VPP) ynegativo (VPN) y razón de probabilidades (RP) para la reacción acrosomal (%RA)como indicadora del éxito en FIV para la población total de pacientes infértiles.

N Sensibilidad Especificidad VPP VPN RP

PT 232 0.71 0.55 0.49 0.75 29*(1.6-5.0)

PT 183 0.77 0.57 0.47 0.83 45*(>2 ovocitos) (23-89)

* p<0.05 por X2al comparar el éxito en FIV de pacientes con RA+ y RA­

El 75% de los pacientes RA+ logró fertilizar por lo menos un ovocito (VPN = 0.75),

mientras que el 49% de los pacientes RA- no logró fertilizar ningún ovocito (VPP =

0.49). De todos los pacientes que no lograron fertilización alguna, 71% fue RA­

(sensibilidad = 0.71); mientras que de todos los pacientes que fertilizaron algún ovocito,

55% fue RA+ (especificidad = 0.55). La razón de probabilidades de 2.9 indica que los

pacientes RA+ tienen 3 veces más probabilidad de fertilizar por lo menos 1 ovocito en

FIV que los pacientes RA-. Este análisis se llevó a cabo considerando todos los

pacientes, independientemente del número de ovocitos disponible para fertilizar. Si

consideramos solamente aquellos pacientes con 3 o más ovocitos disponibles, el VPN y

la razón de probabilidades aumentaron, mientras que el VPP no cambió.

80

60

40

20

%OVOCITOSFERTILIZADOS(MEDIANA)

n= 232

0-4 5-8 9-12 13+

% RA

Figura 28: Porcentaje de ovocitos fertilizados in vitro (mediana) para la poblacióninfértil total (PT; n=242) en función de la capacidad de los espermatozoides desufrir reacción acrosomal en presencia de hFF (%RA).

Con el objeto de evaluar la efectividad del ensayo en predecir fertilización se

construyeron curvas ROC para %RA (Figura 29). Asimismo se construyeron las ROC

para la concentración de espermatozoides y el porcentaje de formas normales en semen,

ya que estos dos parámetros seminales también mostraron una importante correlación

con el porcentaje de fertilización in vitro (sección 8). Los pacientes se dividieron

entonces, en 2 categorias: aquéllos que no fertilizaron ningún ovocito y aquéllos que

fertilizaron por lo menos l ovocito. Las curvas se construyeron como el porcentaje

acumulativo de pacientes que no fertilizaron (ordenadas) en fiJnción del porcentaje de

los que si fertilizaron (abscisas), para valores crecientes de %RA, concentración o

morfología.

Las curvas ROC para los 3 parámetros analizados se ubicaron hacia la izquierda de la

línea de identidad, que representa un ensayo hipotético carente de valor clínico. Por lo

tanto, cualquiera de los 3 parámetros sería, en principio, potencialmente útil para

predecir si ocurrirá fertilización o no. El valor clinico del ensayo está dado por el área

bajo la curva ROC correspondiente: a mayor área, mayor valor clínico. Por lo tanto, la

posición relativa de las curvas ROC obtenidas indicaría que %RA y morfología serían

igualmente buenos y a su vez, algo mejores que la concentración de espermatozoides

para predecir si habrá fertilización.

7.2. Subgrupos de pacientes infértiles.

La Figura 30 ilustra la mediana del porcentaje de ovocitos fertilizados para cada uno de

los 4 subgrupos de pacientes ya mencionados (Tabla X).

El porcentaje de ovocitos fertilizados in vitro (mediana) disminuyó a medida que se

deterioraron las características seminales. Para los pacientes con valores seminales

z8É 100 n l l u:l|­o:tEo 80 - ­zLIJ

8a, 60 — —LUp.zLLJ

É 4o - —

La ——- CONCENTRACIONo — MORFOLOGIA2 20 ‘ °/ RA¡_ o

É28 o l l l l< 0 20 40 60 80 100o\°

% ACUMULATIVO DE PACIENTES QUE FERTILIZARON

Figura 29: Curvas ROC para concentración de espermatozoides en semen (—), %formas normales en semen (—) y %RA (-——.)como predictores del éxito en FIV. Segraficó el % acumulativo de pacientes que no fertilizaron ningún ovocito enfunción del % acumulativo de pacientes que fertilizaron por lo menos un ovocito,para valores crecientes de cada parámetro evaluado. La diagonal (—) representaun ensayo hipotético que carece de valor clínico.

" " ' Ill3

60

n=56

960VOCWOSFERWLQADOS(MEDMNA)

Figura 30: Mediana del % 0v0citos fertilizados in vitro por la población infértiltotal (PT; n=232; Ü) y los cuatro subgrupos de pacientes infértiles: Buen Semen(BS; n=56; D); Desorden Morfológico (DM; n=42; EJ); Semen Subóptimo (SS;n=113; Ü) y Mal Semen (MS; n=16; Ü). Valor normal = "/oRA2 5%.

" " ' 104

tradicionales indistinguibles de los individuos normales (BS), el porcentaje de

fertilización fiJe 46%; los pacientes con desorden morfológico aislado (DM) fertilizaron

29% de los ovocitos y los pacientes con semen subóptimo (SS) fertilizaron 25% de los

ovocitos. Los pacientes con caracteristicas seminales severamente anormales (MS)

fertilizaron 0% de los ovocitos. La edad de la mujer en cada grupo, como así también el

número de ovocitos disponibles para fertilizar y la calidad de los mismos fiJeron

semejantes para la población total y los distintos grupos de pacientes (Tabla Xll).

TABLA Xll: Edad de la mujer, calidad de los ovocitos y número de ovocitosdisponibles para fertilizar en la población total y los 4 subgrupos de pacientesinfértiles.

PTEdad de la

Calidad

Ovocitos

Los valores corresponden a mediana con su (rango intercuartilo)

Al estudiar el porcentaje de fertilización en fimción de la reacción acrosomal, dentro de

cada subgrupo de pacientes, se observó un comportamiento semejante al de la población

total (Figura 31). El porcentaje de ovocitos fertilizados in vitro aumentó al aumentar el

porcentaje de reacción acrosomal inducido por fluido folicular en todos los subgrupos

salvo MS, cuya mediana de % fertilización fue 0%.

80 . u u

c»o l

OOO)­

%OVOCITOSFERTILIZADOS(MEDIANA)

.ho I

I

0-4 5-8 9+

%RA

Figura 31: Mediana del % ovocitos fertilizados in vitro por la población infértiltotal (PT o) y por cada subgrupo de pacientes en función de la capacidad de losespermatozoides de sufrir reacción acrosomal en respuesta a hFF (%RA). BS (o) =Buen Semen; DM (o) = Desorden Morfológico; SS (o) = Semen Subóptimo; MS(o)= Mal Semen.

Entonces, se recalcularon sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivos y

negativos y razón de probabilidades, para la reacción acrosomal dentro de cada uno de

los subgrupos (Tabla XIII), con el objeto de analizar si el valor estadístico del ensayo

era mayor para algún subgrupo de pacientes en particular.

TABLA XIII: Sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivo (VPP) y

negativo (VPN) y razón de probabilidades (PP) para la reacción acrosomal (%RA)

como indicadora del éxito en FIV en la población total y en los distintos subgrupos

de pacientes infértiles.

N Sensibilidad Especificidad VPP VPN RP

PT 232 0.71 0.55 0.49 0.75 2.9*(1 6-50)

PT 183 0.77 0.57 0.47 0.83 45*(>2 ovocitos) (2.3-89)BS 56 0.27 0.83 0.36 0.76 1.77

(OS-6.9)BS 46 0.36 0.83 0.40 0.81 2.76(>2 ovocitos) (0.6-1 1.5)MD 47 0.65 0.5 0.42 0.71 1.83

(OS-5.8)MD 40 0.69 0.52 0.41 0.78 2.42(>2 ovocitos) (0.6-8.7)SS 113 0.82 0.43 0.49 0.78 3.44*

(1 4-8.0)SS 81 0.92 0.48 0.44 0.93 10.7*(>2 ovocitos) (ZZ-35.7)MS 16 0.92 O 0.73 O 0.85

(003-251)MS 15 0.92 O 0.79 0 1.09

(>2 ovocitos) (004-334)

p<0.05 por X2al comparar el éxito en FIV de pacientes RA+ y RA­La razón de probabilidades se expresa con su intervalo de confianza del 95%

Los valores predictivos positivo y negativo para los subgrupos no cambiaron con

respecto a los de la población total. La razón de probabilidades, sin embargo, aumentó

para individuos con caracteristicas seminales subóptimas pero no para los otros grupos

de pacientes. En todos los casos, la razón de probabilidades aumentó al considerar sólo

aquellos pacientes que hubieran tenido más de dos ovocitos disponibles para fertilizar.

Tal como se mencionara anteriormente, se observó un marcado aumento en el número

de pacientes RA- a medida que se deterioraron las caracteristicas seminales (Figura 26).

La Figura 32 vuelve a ilustrar este concepto al mostrar el marcado descenso en el

cociente entre el número de pacientes RA+ y el numero de pacientes RA- para cada uno

de los subgrupos de pacientes, a medida que se pasa del grupo BS al MS.

En cambio, la misma figura muestra claramente que tanto el cociente entre el número de

pacientes con mujer mayor de 35 años / menor de 35 años, como el cociente entre el

número de pacientes que presentaron ovocitos de buena / mala calidad, fueron

semejantes para todos los subgrupos de pacientes. Por lo tanto, las diferencias

observadas en los porcentajes de fertilización entre los distintos subgrupos podrían muy

bien atribuirse a diferencias en %RA pero no a diferencias en la calidad de los ovocitos

o la edad de la mujer.

Desde otro punto de vista, se segregaron los pacientes en dos categorías según la edad

de la mujer (mayor o menor de 35 años), o según la calidad de los ovocitos obtenidos

(buena o mala) y se analizaron los porcentajes de fertilización para estas dos categorías

en todos los subgrupos de pacientes (Tabla XIV).

5

% RA (>/< 5%)

———Calidad ovocitos (buena/mala)

4 " ————-Edad mujer (>/< 35) ­

E 3 — _Z¡LJOOo 2 _ _

1 - _

0

Figura 32: Cociente entre el número de individuos en cada subgrupo de pacientescon >/< valor umbral para cada uno de 3 factores que podrían afectar el éxito enFIV: %RA (———),edad de la mujer (—) y calidad de los ovocitos inseminados (——).BS = Buen Semen; DM = Desorden Morfológico; SS = Semen Subóptimo; MS =Mal Semen.

TABLA XIV: Tasa de fertilización observada en la población total y los distintossubgrupos de pacientes infértiles en función de la edad de la mujer (>/< 35 años) yla calidad de los ovocitos inseminados (buena 0 mala).

% ovocitos fertilizadosMujer < 35 Mujer > 35 Buenos ovocitos Malos ovocitos

PT 19 42* 29 25(n= 120) (n: 112) (n= 155) (n=77)

BS 33 66* 50 33(n = 27) (n = 29) (n = 37) (n = 19)

DM 20 49 47 20

(n = 25) (n = 22) (n = 33) (n = 14)SS 20 33 20 29

(n = 60) (n = 53) (n = 75) (n = 38)MS 0 20 0 0

(n=8) (n=8) (n= 10) (n=6)

* p = 0.01, Mann-Whitney

Puede observarse que, para todos los subgrupos, el porcentaje de ovocitos fertilizados

fiie alrededor del doble en las mujeres mayores de 35 años con respecto a las menores de

35, siendo esta diferencia estadísticamente significativa para la población total (PT) y el

subgrupo de pacientes con buen semen (BS). Por otra parte, los porcentajes de

fertilización fiieron independientes de la calidad de los ovocitos si consideramos la

población total de pacientes (PT) o los grupos SS y MS. Sin embargo, los porcentajes

de fertilización obtenidos con ovocitos de buena calidad, aunque no significativamemte

distintos, fueron superiores a aquéllos obtenidos con ovocitos de mala calidad en el caso

de pacientes con buen semen (BS) o déficit morfológico aislado (DM).

En cada subgrupo de pacientes, se comparó la mediana del porcentaje de ovocitos

fertilizados por pacientes RA+ con el porcentaje de fertilización de pacientes RA­

(Figura 33).

A | 1 l IÉ<_( % RA

{a o 0-4 (RA —)É 60 - I 5+ (RA+)(l)oO<(u_I,: 40 — ­0€LLJLI.

(D

,9a 20 - ­o>o°\°

0 l l l ­BS DM SS MS

Figura 33: Mediana del % ovocitos fertilizados in vitro por pacientes RA+ (———)yRA- (———)para cada uno de los subgrupos de pacientes infértiles. BS = BuenSemen; DM = Desorden Morfológico; SS = Semen Subóptimo; MS = Mal Semen.

Para los individuos del grupo BS, el porcentaje de ovocitos fertilizados fue 2.5 veces

mayor en los pacientes RA+, mientras que en los individuos de los grupos DM y SS el

porcentaje de fertilización file 4 veces mayor cuando los pacientes eran RA+.

Independientemente de que los pacientes tuvieran características seminales normales

(BS), déficit morfológico aislado (DM) o semen subóptimo (g), los pacientes RA+

fertilizaron entre 50% y 60% de los ovocitos, mientras que los pacientes RA­

fertilizaron solamente entre 15% y 20% de los ovocitos. Por lo tanto, la capacidad de los

espermatozoides de reaccionar o no ante la estimulación con fluido folicular parecería

tener mayor influencia que los parámetros tradicionales del semen sobre la capacidad de

un paciente de fertilizar in vitro.

Más aún, la reacción acrosomal parecería tener un impacto mayor sobre la capacidad de

fertilizar in vitro que la morfología estricta (Análisis de Varianza de Dos Factores;

p<0,05), como puede observarse al comparar los grupos BS y DM (Tabla XV).

TABLA XV: Comparación entre los efectos de la calidad de la morfología y lareacción acrosomal sobre los porcentajes de FIV.

% fertilizaciónRA+ RA- RA+/RA­

DM 55 13 4.2

BS 50 25 2.0

BS/DM 0.9 1.9

p<0,05 por Análisis de Varianza de Dos Factores

En estos dos grupos, los pacientes presentan concentración de espermatozoides y

motilidad semejante, pero difieren en el porcentaje de formas morfológicamente

normales. Entre todos los pacientes con desorden morfológico aislado (MD), tener RA+

cuadruplica la tasa de fertilización con respecto a tener RA-; mientras que entre todos

los pacientes con RA fallida (RA-), tener buena morfología (BS), sólo duplica la tasa de

fertilización con respecto a tener desorden morfológico aislado (DM). Asimismo, entre

todos los pacientes con semen normal (BS) tener RA+ duplica la tasa de fertilización

con respecto a tener RA- mientras que, entre todos los pacientes que responden

normalmente al fluido folicular (RA+), tener buena morfología (BS) no mejora la tasa de

fertilización con respecto a quienes presentan desorden morfológico aislado (DM).

8. BÚSQUEDA DE UN MODELO AD_ECUADO PARA PRED_ECIR LA

CAPACIDAD FERTILIZANTE DE UNAMUESTRA DE ESPERMATOZOIDES

Tal como se explicara anteriormente, este estudio se llevó a cabo en 2 etapas, utilizando

2 grupos diferentes de pacientes de modo tal que se pudiera verificar la validez del

modelo construido en una primera etapa.

8.]. Etaga de construcción

La mediana del porcentaje de ovocitos fertilizados por el grupo de pacientes (n=82)

incluido en esta primera etapa fue del 25%. El % ovocitos fertilizados correlacionó

significativamente (Spearman, p<0,05) con la concentración de espermatozoides, el %

motilidad y el % de formas normales en semen (Tabla XVI).

No se observó correlación con los parámetros de movimiento, ya sea en semen (V040y

L3) o luego de 2 horas de capacitación (VC60).Sí se encontró correlación significativa (p

< 0,05) con el %RA (Figura 34).

TABLA XVI: Coeficientes de correlación de Spearman entre el % ovocitos

fertilizados in vitro y los parámetros seminales y clínicos evaluados en laconstrucción de un modelo predictivo para FIV

Parámetro Etapa de Construcciónr IC 95 %

% RA O.39* 0.15-O.52

Concentración O.36* O.14-0.51

% Motilidad 0.28* 0.06-0.44

Edad mujer 0.25* 0.05—0.44

% Formas normales 0,24* 0.04-0.44

Concepción previa 0.09 -0.15-0.26

Calidad ovocitos 0.06 -0.24-0. 13

Linealidad < 3 -0. 11 -0.32-0.09

VC60 -0. 13 -0.32-0. 12

Patología ginecológica -0. 15 -0.35-0.06

Vc4o -O.18 -O.39-0.01

IC = Intervalo de confianzar = coeficiente de correlación de Spearman; * p < 0.05 para la correlación de Spearman

En cuanto a parámetros ajenos al espermatozoide, se encontró correlación significativa

(p<0,05) con la edad de la mujer, pero no con la patología ginecológica, la calidad

ovocitaria o la historia de concepción previa del marido.

La mejor correlación se obtuvo con %RA, seguida de concentración de espermatozoides

en semen, % motilidad y % formas morfológicamente normales. Los gráficos del %

ovocitos fertilizados en función de estas 4 variables se muestran en la Figura 34.

U)m o 100 l o o o8 2 ' o< N flo3 g 80 . g oE E ° - ' oE Lu 60 < ow LL o oo o

g 8 40 o . . . .8 I: ‘ i . O> O 0 oo O o ‘ ‘ae 8 20 0‘ C. . . i

EQ ' . o . ' o r = 0.39 10“W

O 50 100 150 200

CONCENTRACION (millones/ml)

w 100 r: o_31 . . ‘ É) 1oo‘- g . o r = 0258 Í : - ‘ s . ' i< 80 a . j 80 - . o l5 o. . . l: C ‘ z . iE ' ' É so . ° lLLI 60 ‘ o LL '

É 1 . . a) o o . o . oO i : ° o i o 4o o .5 «0+ -. . c . -- LO a O O o 0s ‘ - ’ 9 ° °

¿e 20i .. o . lo o l o 20 o . o ‘ . . . . i‘ . ‘ . . o 1 ae . . o

o ‘ - e k — y v F ° ‘ 'o 20 4o so eo ° 1° 2° 3°

es MOTlLlDAD % FORMAS NORMALES

Figura 34: Etapa de construcción de un modelo predictivo del éxito en FIV.Gráficos de correlación (Spearman) entre el % ovocitos fertilizados y algunosparámetros espermáticos: %RA (o), concentración de espermatozoides en semen(o), % motilidad en semen (o), % formas normales en semen (o). r = coeficiente decorrelación de Spearman.

La Figura 35 representa, en forma de cascada, los valores de los coeficientes de

correlación de Spearman con sus correspondientes intervalos de confianza del 95% para

todos los parámetros evaluados.

Al realizar el análisis de regresión escalonada se encontró que %RA era el mejor

indicador del éxito en FIV si se considera una única variable independiente. Al

considerar 2 variables, %RA y concentración en semen resultaron los mejores

indicadores. Aumentar el número de variables consideradas a 3 o más no tuvo ningún

valor estadístico pues ninguno de los parámetros restantes, sumado a %RA y

concentración, aumentó el valor predictivo del modelo.

8.2. Etapa de validación

La mediana del % ovocitos fertilizados por este segundo grupo de pacientes (n=64) fue

del 36%, es decir, diferente de la del grupo de pacientes incluido en la etapa de

construcción. Si bien el % ovocitos fertilizados aumentó progresivamente al aumentar el

%RA en las dos etapas, el punto de partida para ambas curvas fue diferente (Figura 36).

En la etapa de construcción partimos de una base de un 10% de ovocitos fertilizados

para el grupo de pacientes con la menor tasa de fertilización (%RA = 3-6), mientras que

en la etapa de validación partimos de una base de 22% de ovocitos fertilizados para el

mismo grupo. En consecuencia, cuando se quiso predecir el porcentaje de fertilización

en el segundo grupo de pacientes que intervino en la etapa de validación en base al

%RA, se encontró que los valores calculados distaban mucho de los valores reales,

obtenidos en FIV; las tasas de fertilización calculadas a través del modelo resultaban

siempre inferiores a las observadas.

lI. 116

%RA

Concentración

Motilidad

Edad mujer

Formas normales

Concepción previa

Calidad ovo :itos

Vc‘5°

Patología ginecológlca

VC40

l

-0.5 -0.4 -O.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

COEFICIENTE DE CORRELACION

Figura 35: Construcción de un modelo predictivo para FIV. Cascada decorrelaciones de Spearman (IC 95%) resultantes de comparar cada variable con el% ovocitos fertilizados in vitro.

%OVOCITOSFERTILIZADOS

70

60­

50­

40­

30­

20­

10­ +_._ gemas“

0 1-2 3-6

%RA

Figura 36: Mediana del % ovocitos fertilizados en función de %RA para las etapas

de construcción (o—o) y validación (o-—o)de un modelo predictivo para el éxito

en FIV.

118

El % ovocitos fertilizados in vitro correlacionó significativamente (p < 0,05) con 2 de

los parámetros seminales clásicos evaluados: concentración y % formas normales, pero

no con % motilidad (Tabla XVII). No hubo correlación con los parámetros de

movimiento V040, VC60y L3. Nuevamente se encontró correlación significativa con el

%RA y, dentro de los parámetros ajenos al espermatozoide, sólo hubo correlación con

la edad de la mujer.

TABLA XVII: Coeficientes de correlación de Spearman entre el % ovocitosfertilizados in vitro y los parámetros seminales y clínicos evaluados en laconstrucción y validación de un modelo predictivo para FIV

Parámetro Etapa de Construcción Etapa de Validaciónr IC 95 % r IC 95 %

% RA 0.39* 0.15-Or52 0.35* 0.10-0.60

Concentración 0.36* O.l4-O.51 0.30* 0.05-0.55

% Motilidad 0.28* 0.06-O.44 0.07 -0.18-0.32

Edad mujer O.25* 0.05-O.44 O.28* 0.03-0.53

% Formas normales 0.24* 0.04-0.44 0‘26* 0.01-O.51

Concepción previa 0.09 -0.15-0.26 0.18 -0.07-O.43

Calidad ovocitos 0.06 -0.24-O. 13 -0. 13 -O.38-0. 12

Linealidad < 3 -O.11 -0.32-0.09 -O.15 -0.40-0.10

VC60 -O.13 -O.32-0. 12 0.12 -0.16-0.40

Patología ginecológica -O.15 -0.35-0.06 -0.22 —047-0.03

Vc4o -O.18 -O.39-0.0l -0.07 -O.32—O.18

IC = Intervalo de confianzar = coeficiente de correlación de Spearman; * p < 0.05 para la correlación de Spearman

Tal como sucediera con el primer grupo de pacientes, la mejor correlación se obtuvo

con %RA, seguida de la concentración de espermatozoides y del % formas normales.

Los gráficos del % ovocitos fertilizados en fimción de cada uno de los 3 parámetros

seminales y el %RA se muestran en la Figura 37.

La Figura 38 representa en forma de cascada los valores de los coeficientes de

correlación de Spearman con sus correspondientes intervalos de confianza del 95% para

todos los parámetros evaluados en este grupo. Al comparar estos resultados con los de

la etapa de construcción se observan dos hechos importantes. En primer lugar, si bien la

reacción acrosomal y la concentración de espermatozoides mantienen el grado de

correlación con el porcentaje de fertilización como así también sus posiciones en la

cascada de correlaciones, los demás parámetros evaluados no lo hacen necesariamente.

En segundo lugar, se observa claramente que los intervalos de confianza de los

coeficientes de Spearman para todos los parámetros (y, por ende, el grado de

superposición de los mismos) son mayores en esta etapa de validación, lo que implica

una pérdida de independencia entre los parametros evaluados. Al realizar el análisis de

regresión escalonada se encontró nuevamente que %RA provee el mayor poder

predictivo en un modelo de parámetro único. Sin embargo, a diferencia de lo ocurrido en

la etapa de construcción, no se produjo ningún beneficio estadístico adicional en el

poder predictivo al considerar la concentración de espermatozoides o algún otro de los

parámetros evaluados junto con la reacción acrosomal con respecto a la reacción

acrosomal por sí sola.

100 4) a o o o(DO2 l¡3 80:' o . clr- . o o o gÉ 60 0 ’LL o . olr) D o oOl: 4o 1k ,8 > a o o

5 o20 0 =¿e . I’ 0.35

oo A- - A 4‘ ‘ - 9 a

0 10 20°/o RA

100 l' = 0.07 o o o o om 1 g

8 l . 3< eo ,Ng o ' o :E : n ° iE 60 o o z ou) o a o o ÉO . l5 4o . oo ï o o o o> l‘ o o

g 20 1‘ 0 lz ' 5

a - ‘0 l

% MOTILIDAD

%OVOCITOSFERTILIZADOS

%OVOCITOSFERTILIZADOS

o. o o r=0'3oo

. ‘o' o. ' o .c l.o o ' . .o. o o

. ooo o o o l

o o ‘oo

-:-.onn o. o. o o. o

0 50 100 150

‘36FORMAS NORMALES

Figura 37: Etapa de validación del modelo predictivo de éxito en FIV. Gráficos decorrelación (Spearman) entre el % ovocitos fertilizados y algunos parámetrosespermáticos: %RA (o), concentración de espermatozoides en semen (o), %motilidad en semen (o), % formas normales en semen (o).correlación de Spearman.

r = coeficiente de

%RA

Concentración

Edad mujer

Formas normales

Concepción previa

Vc60

Motilidad

V°4o

Calidad OVOCÍÍCS

Patología ginecológica

l l l l I l I I

-0.6 -O.5 -O.4 -0.3 -0.2 -O.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

COEFICIENTE DE CORRELACION

Figura 38: Validación del modelo predictivo para el éxito en FIV. Cascada decorrelaciones de Spearman (IC 95%) resultantes de comparar cada variable con el% ovocitos fertilizados in vitro.

DISCUSIÓN

Ya no quedan dudas de que la fiincionalidad del espermatozoide y no su concentración

en semen es el principal determinante de si un hombre puede o no embarazar a su pareja.

Es probable que la oligospermia sea, en la mayor parte de los casos, no un fenómeno

aislado sino la manifestación más obvia y más fácilmente medible de alguna patología

que concomitantemente produzca en el espermatozoide otras anomalías que

comprometen su capacidad funcional. Como se ha mencionado anteriormente, el

ejemplo más notable es el de los pacientes con síndrome de Kallman, en los que el

bajísimo número de espermatozoides no impide que estos hombres embaracen

naturalmente a su pareja. Los espermatozoides de tales pacientes se comportan en forma

semejante a la de donantes fértiles ante los múltiples ensayos que se llevan a cabo en el

laboratorio andrológico.

Las dos últimas décadas han sido testigos del desarrollo de numerosos ensayos

destinados a evaluar la capacidad funcional del espermatozoide humano (Cummins,

1995; Liu, Baker, 1992). La difiJsión generalizada de las técnicas de fertilización in vitro

en humanos han provisto al investigador de una herramienta valiosa para evaluar si un

ensayo funcional posee o no valor clínico.

In vivo, la reacción acrosomal es condición necesaria para que un espermatozoide pueda

fertilizar un ovocito y, por ende, la incapacidad de sufrir reacción acrosomal podría ser

causa de infertilidad, al menos en algunos individuos. Determinar la capacidad del

espermatozoide humano de sufrir reacción acrosomal in vitro podría, pues, ser un buen

reflejo de su capacidad fertilizante. En este trabajo hemos estudiado exhaustivamente la

reacción acrosomal inducida por fluido folicular humano en espermatozoides humanos

de donantes fértiles y pacientes infértiles. Con los resultados obtenidos, proponemos que

el ensayo de RA en respuesta al hFF es una herramienta útil en el diagnóstico

andrológico, que correlaciona con porcentaje de ovocitos fertilizados in vitro.

1. ¿POR QUÉ hFF COMO INDUCTOR?

El hFF, in vivo, parecería proveer un entorno favorable al espermatozoide en las

inmediaciones del ovocito, estimulando su motilidad, induciendo su hiperactivación,

favoreciendo la reacción acrosomal, atrayendo al espermatozoide hacia el ovocito y

facilitando, en suma, su penetración a través de las cubiertas del mismo (Hong et al.

1993). El hFF sería, de este modo, un inductor natural y fisiológico de la reacción

acrosomal.

Muchos grupos se han inclinado por el uso de ionóforos de calcio como estimulantes de

la reacción acrosomal en protocolos de diagnóstico andrológico, en virtud de que se

trata de sustancias químicamente definidas (De Jonge et al. 1989; Cummins et al. 1991;

Aitken et al. 1993). Esto haría más fácil la estandarización de la metodologia y la

comparación de resultados entre distintos laboratorios que el uso de fluidos biológicos

como, por ejemplo, el folicular. Sin embargo, el ionóforo puede producir resultados

variables según la naturaleza y concentración del suplemento proteico presente en el

medio, además de las variaciones debidas a los distintos lotes de producto. Tanto es así,

que se ha recomendado a los laboratorios que realicen habitualmente un ensayo con

ionóforo, titulen cuidadosamente su concentración usando espermatozoides de un

donante fértil, a fin de utilizar siempre la mínima concentración que produce la máxima

respuesta (Cummins, 1995). Por otra parte, el ionóforo de calcio es un estimulante no

fisiológico que actúa, principalmente, desordenando la estructura lípídica de la

membrana, lo cual puede resultar en la fusión de las membranas plasmática y acrosomal

externa (Tarin, Trounson, 1993). Más aún, Liu y Baker (1996) han demostrado que la

RA inducida por ionóforo A23187 no correlaciona con la RA inducida por la zona

pelúcida humana. Sugieren que la RA inducida por ionóforo no proporcionaría, por lo

tanto, información valiosa acerca de la capacidad que tiene el espermatozoide de

reaccionar fisiológicamente sobre la zona, cosa que no sucedería probablemente al usar

hFF como inductor.

Los lineamientos propuestos por la European Society of Human Reproduction and

Embryology (ESHRE), a través de un taller en el que se evaluó el ensayo de reacción

acrosomal como método avanzado de diagnóstico andrológico (ESHRE Andrology

Special Interest Group, 1996), sugieren que no debería usarse el fluido folicular como

inductor debido a su variabilidad y por no tratarse de una sustancia químicamente

definida. No existen dudas de que la capacidad inductora de un fluido folicular

individual es muy variable (Morales et al. 1992; Saaranen et al. 1993). Sin embargo, la

experiencia de nuestro laboratorio indica que esa variabilidad en la capacidad inductora

puede ser eliminada utilizando como fuente de fluido un “pool” de fluidos foliculares

individuales procedentes de varios pacientes. Teniendo la precaución de titular cada lote

nuevo de fluido contra el anterior frente a un mismo donante fértil, es posible conservar

la capacidad inductora del fluido al pasar de un lote a otro. Los distintos lotes de fluido

que han sido utilizados en el Genetics & IVF, a lo largo de ya 10 años de llevar a cabo el

ensayo, presentaron siempre la misma capacidad inductora.

Justamente por su naturaleza compleja, el fluido folicular contiene varias sustancias que,

individualmente, son capaces de inducir la reacción acrosomal y que, in vivo,

probablemente constituyen mecanismos alternativos destinados a maximizar la

probabilidad de éxito en la respuesta. Del mismo modo, in vitro, aumentarían la

sensibilidad del ensayo. De hecho, experimentos realizados en nuestro laboratorio con

espermatozoides de donantes fértiles, comparando la capacidad inductora de hFF y

progesterona, considerada el principal inductor de la reacción acrosomal en fluido

folicular, pusieron de manifiesto que la respuesta máxima alcanzada en presencia de

progesterona no superaba el 50% de la respuesta máxima en presencia de hFF. Meizel et

al. (1990) informaron resultados semejantes.

2. OPTIMIZACIÓN DEL EN_SAYO DE REACCIÓN ACROSOMAL DE

ESPERMATOZOIDES HUMANOS EN RES_PUESTA AL FLUIDO

FOLICULAR HUMANO

Estos experimentos se llevaron a cabo utilizando espermatozoides de donantes fértiles

para estandarizar adecuadamente las condiciones del ensayo, identificando aquellos

factores que podrían ser una fuente no deseada de variabilidad en los resultados.

Se eligió una concentración de hFF al 10% V/V como dosis de estimulación, pues ya a

esta concentración la respuesta en %RA resultó máxima. Otros autores han utilizado

concentraciones superiores de hasta 50% V/V, pero éstas no necesariamente se traducen

en un aumento de la fracción de espermatozoides que es capaz de responder al fluido.

Se demostró que la reacción acrosomal observada en respuesta a hFF no es

consecuencia de la muerte celular. Algunos autores (Mortimer, 1994) han recomendado

la determinación simultánea de estado acrosomal y vitalidad para asegurar que el %RA

informado corresponda a una reacción acrosomal verdadera. Nosotros realizamos una

serie de experimentos piloto, utilizando, simultaneamente, el colorante fluorescente

supravital Hoescht 23358 y encontramos porcentajes de RA semejantes al evaluar

espermatozoides vivos y totales (resultados no mostrados). Así mismo, Liu y Baker

(1998) han demostrado recientemente que existe correlación significativa entre el %RA

en respuesta a A23187 medido sobre espermatozoides vivos y totales. Byrd y Wolf

(1986) informaron también que la reacción acrosomal en espermatozoides humanos

incubados en condiciones capacitantes no está obligatoriamente ligada a la muerte

celular, es decir, espermatozoides muertos o que están muriendo no pierden,

necesariamente, SUacrosoma.

Se encontró un efecto marcado del número de espermatozoides presentes durante la

capacitación sobre la capacidad de respuesta al fluido folicular. Tanto es así, que

espermatozoides de individuos fértiles, con excelente respuesta al fluido, dejaron de

responder al aumentar 6 veces su concentración durante la capacitación. Podríamos

pensar que la presencia de elevadas concentraciones de espermatozoides retarda la

velocidad de capacitación en forma general, de modo que se requiere un tiempo mayor

para lograr una misma proporción de espermatozoides capacitados y listos para sufrir la

reacción acrosomal al enfrentarse con el estímulo adecuado. A este respecto, Yudin et

al. (1988) señalan que la capacitación de espermatozoides humanos a concentraciones

elevadas requiere tiempos más largos y que se ve favorecida por un aumento de la

temperatura de capacitación de 37° a 40°C. Esta posibilidad no se ha analizado en este

trabajo.

También se encontró una disminución significativa en el % reacción espontánea al

aumentar la concentración de espermatozoides durante la capacitación. Contrariamente,

Stock y Fraser (1987) no encontraron variación en el % reacción acrosomal espontánea

determinado por microscopía electrónica de transmisión luego de incubar

espermatozoides humanos en un rango de concentraciones de 0,5 a lelOÓ/ml durante

24 horas.

Se acepta, que una vez capacitados, los espermatozoides fimcionalmente competentes

serian capaces de reaccionar casi inmediatamente en presencia del estimulo adecuado

(Yanagimachi, 1994). En el hombre, estudios ultraestructurales de los momentos

iniciales de la reacción acrosomal, inducida por hFF, han puesto de manifiesto que el

40% de los espermatozoides se encuentran reaccionados al cabo de 3 minutos de

exposición al fluido (Yudin et al. 1988). Nuestros datos mostraron que, efectivamente,

ya a los 5 minutos (tiempo minimo ensayado) de incubación en fluido folicular, se

alcanzó el porcentaje máximo de RA. Siiteri et al. (1988), trabajando en condiciones

similares a las nuestras, informaron que la respuesta máxima se obtiene no más allá de

los 5 minutos de incubación de los espermatozoides con una fracción semipuriflcada de

hFF de PM=50.000. Como ya se dijera anteriormente, la elección de 30 minutos como

tiempo de incubación definitivo para el ensayo, obedeció a razones de conveniencia

práctica.

La reacción acrosomal solamente pudo ser inducida por fluido folicular luego de haber

incubado los espermatozoides en condiciones capacitantes por al menos 6 horas,

apoyando la idea de que la reacción acrosomal ocurre como punto final del proceso de

capacitación que normalmente tiene lugar en el tracto genital femenino (Yanagimachi,

1994). Es importante señalar que en este punto hay algunas discrepancias en la

bibliografia. Suarez et al. (1986) evaluaron la capacidad de respuesta de

espermatozoides humanos al hFF en condiciones semejantes a las nuestras y encontraron

inducción al cabo de 10 horas de capacitación , pero no asi al cabo de 5 horas. Por otra

parte, Fehl et al. (¡995) encontraron un aumento significativo en el porcentaje de

espermatozoides reaccionados en presencia de hFF luego de tan sólo 3 horas de

capacitación. Cabe señalar que, en este último caso, la capacitación se llevó a cabo en un

medio diferente y la inducción posterior se realizó con 50% V/V de hFF en lugar de

10%. Resulta muy dificil establecer comparaciones satisfactorias entre los resultados

informados por distintos investigadores, ya que las condiciones de trabajo (preparación

de muestras, medios, condiciones de capacitación e inducción, método de evaluación del

estado del acrosoma) no son necesariamente las mismas (Gearon et al. 1994). Es

fundamental, por lo tanto, establecer con la mayor precisión posible las condiciones del

ensayo, particularmente si se piensa en una fixtura aplicabilidad clínica. Se eligió un

tiempo de capacitación de 22 horas (“overnight”) por ser mucho más conveniente desde

el punto de vista práctico que el de 8 horas y no presentar diferencias con este último en

el %RA observado.

No encontramos aumento significativo en el %RA espontánea al aumentar el tiempo de

capacitación de 0 a 22 horas. Esto se contrapone con el hallazgo de Stock y Fraser

(1987), quienes sostienen que el %RA espontánea, medida por microscopía electrónica

de transmisión, aumenta significativamente de 10% a las 0 horas a 15% luego de 24

horas de capacitación. Podríamos atribuir esta discrepancia a que la determinación del

%RA por microscopía electrónica es, sin duda, más sensible que la que se lleva a cabo

por microscopía óptica pues pueden detectarse espermatozoides que se encuentran en

estadios iniciales de reacción. Asimismo, nuestro valor de RA espontánea file del orden

del 6%, inferior al 15% informado por estos autores, pero semejante al valor de 1-7%

informado por Suarez et al. (1986), utilizando condiciones de capacitación, inducción y

evaluación de RA semejantes a las nuestras. Cabe señalar aquí que en la bibliografia

existe una gran discrepancia en los %RA espontánea informados por distintos autores

que, en algunos casos, llegan a alcanzar valores del orden de 50% (Byrd et al. 1989).

Una vez más, diferencias en las poblaciones de espermatozoides evaluados, los medios y

condiciones de capacitación empleados y las técnicas de detección de la reacción

acrosomal utilizadas, hacen dificil comparar los resultados. De todos modos se acepta,

en general, que la incidencia de reacción acrosomal espontánea en el espennatozoide

humano, durante la capacitación in vitro, es pequeña y del orden del 10% al cabo de 24

horas (Stock, Fraser, 1987). Esto contrasta con lo que se ha observado en otras especies

tales como el hamster (30-60%; (Yanagimachi, 1969)), el cobayo (30-80%;

(Yanagimachi, Usui, 1974)) o el ratón (30-35%; (Fraser, 1981)).

Sin duda hay que tener en cuenta que al evaluar la capacidad de respuesta al fluido en

pacientes infértiles, en las condiciones aquí propuestas, es de importancia crucial

capacitar los espermatozoides a una concentración no superior a los 2x106/ml, con el

objeto de asegurar la máxima sensibilidad del ensayo. De lo contrario, un paciente que se

encuentre cerca del límite inferior del rango normal de respuestas, podría ser identificado

como un no respondedor.

3. EFECTO DEL FLUIDO FOLICULAR SOBRE LAS CARACTERLSTICAS D_E

MOVIMIENTO DE ESPERMATOZOIIES CAPACITADO_S

La capacidad de los espermatozoides de cambiar las características de su movimiento en

respuesta a distintas condiciones de su entorno es un aspecto importante de su capacidad

fertilizante (Tesarik et al. 1990). Ya hemos mencionado que durante la capacitación se

producen cambios notables en el movimiento del espermatozoide que llevan a la

adquisición de motilidad hiperactivada (Burkman, 1990). Esta motilidad hiperactivada ya

no se observa en los espermatozoides que se encuentran dentro del cúmulus (Tesarik et

al. ¡990). Existen evidencias de que el cúmulus sería capaz de producir y liberar

factores que modifican el movimiento del espermatozoide, aumentando su potencia y

facilitando así su penetración a través de las cubiertas oocitarias y, por ende,

incrementando la probabilidad de fertilización. Fetterolf y colaboradores (Fetterolf et al.

1994; Fetterolf et al. 1994) han demostrado que, tanto el hFF como un factor secretado

por células de cúmulus humano en cultivo, son capaces de estimular el movimiento de

espermatozoides humanos capacitados. Tesarik et al. (1990) observaron cambios

notables en las características cinemáticas de espermatozoides capacitados en presencia

de cúmulus enteros o solubilizados con hialuronidasa. Por otra parte, espermatozoides

atrapados individualmente con un rayo láser (“optical laser trap”) manifiestan un

incremento en su fiJerza relativa como consecuencia de la exposición a matn'z

extracelular solubilizada del cúmulus (Westphal et al. 1993).

Al realizar los experimentos iniciales de estandarización del ensayo de RA, observamos

una mejora en el movimiento de los espermatozoides capacitados como consecuencia de

la exposición al fluido folicular. Para estudiar este comportamiento un poco más a fondo

se analizó el efecto del fluido folicular sobre espermatozoides capacitados, a través de

dos parámetros de motilidad, velocidad curvilínea y linealidad, determinados en un

sistema CASA. Se encontró que los espermatozoides capacitados de donantes fértiles

aumentan su velocidad curvilínea luego de la incubación en fluido folicular, si bien no se

produce ningún cambio en su linealidad. Estos resultados concuerdan parcialmente con

las observaciones de Fetterolf et al. (1994), quienes observaron que la exposición a hFF

al 10% de espermatozoides previamente capacitados, efectivamente produjo un aumento

en la velocidad curvilínea, pero también una disminución de Ia linealidad. También,

Fabbri et al. (1998) han informado que el hFF in vitro aumenta la velocidad y disminuye

la linealidad de espermatozoides al cabo de 6 horas de incubación. En estos dos casos, el

tiempo prolongado de exposición a hFF podría dar cuenta de un efecto sobre la

linealidad que nosotros no observamos. Sin embargo, Tesarik et al. (1990) observaron

un aumento en la linealidad y en la velocidad rectilinea pero no en la velocidad

curvilínea en presencia de cúmulus solublizado. Si bien existen diferencias entre los

resultados obtenidos por los distintos grupos, que bien podrían atn'buirse a diferencias en

la metodologia de trabajo, todos sugieren la presencia dentro del cúmulus de factores

que favorecen la adquisición de un movimiento ágil, lineal y progresivo.

Existen también evidencias de que la estimulación de la velocidad de espermatozoides

por hFF obtenido de folículos ováricos maduros correlaciona significativamente con la

fertilización in vitro (Fetterolf et al. 1994).

Los cambios en la motilidad están asociados a sitios anatómicos del espermatozoide,

diferentes de aquéllos involucrados en el proceso de reacción acrosomal. Por lo tanto,

un estudio sistemático de las caracteristicas de movimiento inducidas por fluido folicular

podría llevar a la identificación de otros defectos fiJncionales en el espermatozoide que,

a su vez, podrían comprometer su habilidad para fertilizar un ovocito. El fenómeno de

fertilización es tan complejo, que cuántos más y más variados sean los parámetros del

espermatozoide que se pueda evaluar, mayor será la probabilidad de predecir,

exitosamente, la capacidad fertilizante de una muestra de espermatozoides.

4. EFECTO DE LA COMPOSICIÓN SALINA Y EL SUPLEMENTO

PROTEICO DEL MEDIO D_E CAPACITACIÓN SOBRE EL ENSAYO D_E_

REACCIÓN ACROSOMAL

Los laboratorios de Andrologia utilizan una gran variedad de medios de cultivo para la

preparación de espermatozoides, ya sea para su uso en procedimientos de fertilización

asistida como para fines simplemente diagnósticos (Trounson, l983). La fertilización in

vitro en humanos se ha llevado a cabo satisfactoriamente utilizando Ham’s F-lO

(Steptoe et al. 1980; Trounson et al. 1982), solución de Earle (Steptoe et al. 1980),

medio de Whitten modificado (Trounson et al. ¡982), medio Whittingham T6 (Quinn et

al. 1984) y medio Menezo Bz (Menezo et al. 1984), entre otros. El medio de

incubación provee un entorno adecuado para que se lleven a cabo en el espermatozoide

los cambios fiJndamentales asociados con los procesos de capacitación e interacción con

el ovocito (Bavister, 198]). Se ha propuesto que las condiciones de incubación más

cercanas al entorno natural de las gametas serían las que deberían proporcionar los

mejores resultados (Quinn et al. 1985). En ausencia de una comparación sistemática

entre los distintos medios utilizados, el que exista fertilización en un medio dado no es

suficiente para asegurar que las condiciones de incubación han sido óptimas para la

interacción de las gametas (Bavister, 198l ).

Se consideró importante, pues, para la estandarización del ensayo de RA determinar si el

comportamiento de los espermatozoides en el mismo, se ven'a afectado por pequeños

cambios en la composición iónica o en el suplemento proteico del medio utilizado. Los

resultados obtenidos pusieron de manifiesto que la elección del medio afecta

significativamente la función del espennatozoide humano y, consecuentemente, tiene

importantes derivaciones diagnósticas y terapéuticas.

El estudio llevado a cabo trató de determinar posibles efectos de la composición iónica

del medio y del suplemento proteico.

Los datos obtenidos mostraron que las diferencias en composición iónica y fuente de

energía entre los 3 medios empleados durante la capacitación no afectaban demasiado la

capacidad posterior del espermatozoide de sufrir reacción acrosomal en respuesta al

fluido folicular, si bien la capacitación en medio Tyrode pareció ser ligeramente más

eficaz que en BWW o Ham’s F-IO. Byrd et al. (1989) también encontraron que el %RA

inducido por ionomicina o ionóforo A23187 en espermatozoides capacitados en BWW y

Ham’s F-lO era semejante. Independientemente del medio de capacitación utilizado,

observaron un 30% y un 40% de reacción acrosomal en presencia de ionomicina y

A23 187 lpM, respectivamente.

Se encontraron, en cambio, importantes efectos de la naturaleza del suplemento proteico

sobre la reacción acrosomal: los espermatozoides incubados en medio suplementado con

FCS no fiJeron capaces de sufrir reacción acrosomal mientras que los espermatozoides

incubados en presencia de BSA sí lo hicieron. Incluso la adición de BSA, durante la

estimulación con fluido folicular, a espermatozoides ya capacitados en FCS, no file

capaz de inducir la pérdida del acrosoma.

Podríamos explicar estos resultados pensando que el FCS podría contener un inhibidor

de uno o más pasos del proceso de capacitación, requisito para que ocurra la reacción

acrosomal. Si así fuera, ¿cómo se explica que la suplementación con FCS se utilice con

resultados satisfactorios en los procedimientos de FIV? Varios grupos han demostrado

que las tasas de fertilización in vitro y clivaje embrionario son semejantes en medios

conteniendo BSA o suero (Feichtinger, Kemeter, 1984; Menezo et al. 1984).

Indudablemente, en un procedimiento de FIV, la presencia del complejo ovocito­

cúmulus sería capaz de neutralizar los efectos de tal inhibidor, posibilitando la

capacitación, reacción acrosomal y posten'or fertilización del ovocito. La idea de un

inhibidor de la capacitación presente en FCS concordan’a con los resultados de Ravnik et

al. (1990), quienes encontraron evidencias de la presencia en suero de un factor capaz de

inhibir la fimción espermática. Estudiando la actividad de transferencia de lípidos en

fluido folicular y suero, encontraron que el aumento de la penetración de ovocitos de

hamster por espermatozoides humanos en presencia de fluido folicular, era

completamente inhibido por el agregado de suero al fluido.

También se consideró la posibilidad de que el FCS estuviera quelando a la progesterona

presente en el fluido folicular y, así, eliminara del mismo uno de los principales

inductores de la reacción acrosomal en el fluido. Pero nuestro experimento de

intercambio de medios, mostró que la remoción de FCS del medio luego de la

capacitación, mediante lavado y resuspensión en medio fresco conteniendo BSA, previo

a la incubación con fluido folicular, no restituye la capacidad de reaccionar. Por lo tanto,

parecería que el FCS tuviera un efecto inhibitorio directo sobre el espermatozoide

durante la capacitación.

Como ya se mencionara, durante la capacitación se producen importantes cambios en el

movimiento de los espermatozoides, que sin duda están relacionados con su capacidad

fertilizante. Los datos obtenidos al evaluar el efecto de los cambios en la composición

del medio sobre los parámetros de movimiento indicaron que existen pequeñas

diferencias entre Ham’s F-lO y BWW y entre FCS y BSA. Quedaría por determinar si

tales diferencias tienen algún significado biológico.

Vale la pena mencionar a este respecto el estudio llevado a cabo por Mbizvo et al.

(¡990) que evaluaron el efecto de hFF sobre la hiperactivación de espermatozoides

humanos previamente capacitados en Ham’s-3SB o Ham’s-FCS y luego incubados en

presencia de hFF 5% durante 60 minutos. Si bien la incidencia máxima de

hiperactivación fue semejante con cualquiera de los dos suplementos proteicos en el

medio, el pico de hiperactivación ocurrió mas rápidamente en FCS (3 horas de

capacitación) que en 3SB (5 horas de capacitación). Estos resultados sugieren que la

expresión in vitro de la hiperactivación depende de la naturaleza del suplemento proteico

en el medio de capacitación.

Si bien la incubación en condiciones subóptimas podría no tener importancia para la

activación de las fimciones espermáticas en el caso de hombres fértiles, probablemente

no ocurrirá así en los pacientes infértiles. Para estos últimos, pequeños cambios en la

composición del medio que son beneficiosos para la capacidad fiJncional del

espermatozoide podn'an resultar en el aumento de la probabilidad de una interacción

exitosa con el ovocito.

Discusión ¡36

5. ENSAYO PILOTO PARA COMPARAR LA REACCIÓN ACROSOMAL

INDUCIDA POR FLUIDO FOLICULAR EN INDIVIDUOS NORMALES Y

PACIENTES INFÉRTILES

Los pacientes infértiles plantean al andrólogo el desafio de poder predecir la capacidad

fertilizante de una muestra de espermatozoides utilizando las herramientas disponibles en

el laboratorio de Andrología. Por lo tanto, una vez estandanzadas las condiciones del

ensayo de RA, se evaluó el uso potencial del mismo en el diagnóstico andrológico a

través de un estudio piloto sobre un pequeño grupo de pacientes infértiles sin causa

aparente y donantes fértiles.

El pequeño grupo de pacientes evaluados en esta instancia mostró 2 comportamientos

marcadamente distintos: los espermatozoides de un 60 % de los pacientes sufrieron

reacción acrosomal en respuesta al fluido folicular en forma indistinguible de los

espermatozoides de los donantes fértiles. A estos pacientes se los llamó RA+. El 40%

restante de los pacientes no reaccionó ante la estimulación con hFF y se los llamó RA-.

La falta de respuesta de estos pacientes no se pudo predecir a través de un análisis de

semen tradicional, ya que los dos grupos de pacientes, RA+ y RA- tuvieron valores

semejantes de concentración, %motilidad y parámetros de motilidad V040y L3 en semen.

Este ensayo piloto puso asi de manifiesto que el ensayo de reacción acrosomal en

respuesta a hFF podría ser de utilidad en el diagnóstico andrológico ya que existe un

grupo de pacientes infértiles que se comporta de manera francamente distinta a la de los

donantes fértiles. Más aún, dicho comportamiento no es predecible mediante un

espermograma, de modo que el ensayo de RA proporcionaria información adicional a la

que puede obtenerse de un análisis tradicional del semen.

Estas dos características del ensayo de RA en respuesta a hFF fueron condición

necesaria pero no suficiente para que dicho ensayo se considerara válido como

herramienta de diagnóstico. Para ello se hizo imprescindible llevar a cabo un estudio

prospectivo en pacientes infértiles que demostrara que existía correlación entre la

habilidad de los espermatozoides para reaccionar en respuesta al fluido y el éxito en

FIV.

6. ESTUDIO POBLACIONAL DE LA REACCIÓN ACROSOMAL INDUCIDA

POR FLUIDO FOLICULAR

Antes de llevar a cabo un estudio del valor predictivo del ensayo de RA en FIV, se

consideró importante caracterizar mejor el ensayo a través de un estudio poblacional,

tanto en donantes fértiles como en pacientes infértiles.

Al estudiar la reacción acrosomal en la población fértil encontramos que el porcentaje de

espermatozoides capaz de reaccionar frente al estímulo con fluido folicular es una

medida estable en el tiempo. La determinación del %RA en múltiples muestras de un

mismo donante demostró que los valores obtenidos se encontraban muy cercanos a la

media para el donante y que la misma no cambiaba significativamente con el tiempo. Es

asi que una ocasional reacción acrosomal negativa en un donante comúnmente RA+ es

un buen indicador de que alguna causa externa ha comprometido transitoriamente la

fiJncionalidad espermática en dicho individuo.

La distribución de los valores de %RA en la población normal se aproximó

satisfactoriamente a una Gaussiana, como sucede con la mayoría de los parámetros

seminales clásicos entre individuos fértiles (Cummins, 1995). La mediana del %RA para

la población normal fiJe de 15-17%, valor que no resulta sorprendente en virtud de la

consabida heterogeneidad y asincronicidad funcional de los espermatozoides humanos.

Tomiyama et al. (1995) observaron 7 - 13 % reacción acrosomal inducida por

progesterona en donantes fértiles y Tesarik et al. (¡992) informaron que sólo el 10% de

espermatozoides capacitados poseían receptores para progesterona en su superficie,

pero que la mayoría de ellos era capaz de sufrir RA en respuesta a la unión de la

hormona.

La construcción repetida, a lo largo de 5 años, del intervalo de confianza del 95%

demostró consistentemente que valores de %RA inferiores a 5% se encontraban fiJera

del rango normal. Una vez más, se puso así de manifiesto que el %RA es una medida

estable de la función espermática, caracteristica importante para poder considerarla un

parámetro útil para el diagnóstico andrológico.

Al evaluar la reacción acrosomal en la población de pacientes infértiles, se encontró que

su distribución, tal como sucede con casi todos los parámetros seminales, no se ajusta a

una distribución de Gauss (Cummins, 1995), sino que la mayor parte de los pacientes

presenta valores muy bajos de %RA. Esta diferencia entre las distribuciones de

donantes fértiles y pacientes infértiles también file observada por Henkel et al. (1993) al

estudiar el porcentaje de reacción acrosomal en respuesta a un shock hipotérmico.

Como ya se mencionara, no se establecieron restricciones para que los pacientes

ingresaran al estudio poblacional. Por lo tanto, la población estudiada fiJe muy

heterogénea e incluyó individuos que de acuerdo con los valores de su espennograma

cubrieron todo el rango de diagnósticos: desde la nonnosperrnia hasta la

oligoastenoteratozoospermia severa. Los pacientes se dividieron en 4 subgrupos de

acuerdo con sus características seminales, pero sin tener en cuenta el valor de %RA y se

encontró que, a medida que se deterioraron las caracten’sticas seminales en los grupos,

aumentó la fracción de pacientes con RA- (%RA<5%). Sin embargo, un 20 % de los

pacientes con buena concentración, motilidad y morfología resultó RA-, mientras que el

29% de los pacientes con caracten’sticas seminales deficientes fiJe RA+.

Si bien el %RA correlacionó significativamente con las caracten’sticas seminales en los

pacientes infértiles, estas correlaciones fueron estadísticamnete moderadas y no indican

que el valor de %RA sea completamente predecible a partir de las mismas. Los

coeficientes de correlación (r = 0,35-0,52) sugieren que solamente del 10 al 25% de la

van'abilidad observada en %RA puede atribuirse a variabilidad en los parámetros

seminales clásicos (r2=0,12-0,27) y, por lo tanto, el ensayo de reacción acrosomal

proporciona información clínica adicional a la ya provista por las medidas tradicionales

en semen.

Parinaud et al. (1995) evaluaron la relación entre el porcentaje de RA en respuesta a

distintos inductores y parámetros seminales en un grupo de ll7 pacientes infértiles y

encontraron que el porcentaje de RA en respuesta a hFF solamente correlacionó

significativamente con la morfología del acrosoma, pero no con la concentración de

espermatozoides, la motilidad o el porcentaje de formas normales. Cabe señalar que su

protocolo de trabajo fiJe distinto del nuestro, ya que los espermatozoides fueron

incubados en medio Menezo B2 durante 6 horas en presencia de 20% hFF y el

porcentaje de RA se determinó utilizando un anticuerpo monoclonal específico para la

membrana acrosomal interna.

Al evaluar medias y medianas se mide la tendencia central de la población en estudio.

Por otra parte, resulta interesante evaluar el comportamiento individual de los

integrantes de la población y, para ello, se llevó a cabo un análisis de cuadrantes. Dicho

análisis de cuadrantes se realizó para %RA y morfología estricta, ya que esta última es

considerada actualmente por algunos autores (Kruger et al. 1988; Oehninger, Kruger,

1995; Vawda et al. 1996; Enginsu et al. l993)como el parámetro seminal más

importante en la determinación de la capacidad fertilizante de una muestra. Este análisis

puso de manifiesto, nuevamente, el comportamiento diferencial de las poblaciones

nonnal e infértil, ya que mientras los donantes fértiles se dístríbuyeron homogéneamente

en los 4 cuadrantes en torno al centroide, los pacientes infértiles se concentraron

fundamentalmente en el cuadrante caracterizado por valores menores de porcentaje de

formas nonnales y %RA. En forma semejante, aunque no a través de un análisis de

cuadrantes, (Fukuda et al. 1989), encontraron una asociación entre morfología y

fimción acrosomal ya que la RA inducida por hFF fue significativamente menor en

espermatozoides con anomalías morfológicas de cabeza. También, Oehninger et al.

(1994) observaron que los pacientes teratozoospérmicos respondían anormalmente a la

progesterona in vitro, ya sea en el influjo de Cazi o en el porcentaje de RA observados.

Liu y Baker (1998) encontraron una correlación significativa entre el porcentaje de RA

en respuesta a ionóforo y la morfología estricta en semen pero, más importante aún,

demostraron (Liu, Baker, 1992) que la zona pelúcida humana in vitro es altamente

selectiva para espermatozoides morfológicamente normales.

El análisis de cuadrantes también reafirmó el concepto de que el ensayo de reacción

acrosomal proveía información que no se desprendía del espermograma tradicional, ya

que mostró claramente que un valor anormal de morfología no estaba necesariamente

acompañado de un %RA negativo y viceversa. A este respecto, Pampiglione et al.

(1993) evaluaron la capacidad de RA en respuesta a hFF en donantes fértiles luego de

clasificar los espermatozoides en 4 grupos morfológicos distintos y no encontraron

diferencias entre los mismos, concluyendo que la morfología de un espermatozoide no es

buen indicador de su capacidad para sufiír reacción acrosomal in vitro.

Si bien la reacción acrosomal es simplemente un paso en el complejo mecanismo que

culmina con la fertilización y formación de un embrión viable, el comportamiento

diferencial de hombres fértiles y pacientes infértiles parecería indicar que la

determinación de la capacidad de sufn'r reacción acrosomal, en respuesta al fluido

folicular, sería un instrumento de utilidad clínica en el diagnóstico andrológico. Esta

hipótesis fiJe probada a través de un análisis prospectivo de la relación entre el ensayo de

reacción acrosomal y la capacidad fertilizante in vitro en un grupo de pacientes infértiles.

7. ESTUDIO DEL VALOR DIAGNÓSTICO DE LA REACCIÓN ACROSOMAL

lNDUClDA P03 FLUlDO FOLICULAR CON RES_PECTOA LA CAPACIDAD

FERTILIZANTE IN VITR_0

Los resultados obtenidos al evaluar el valor diagnóstico del %RA con respecto al éxito

en FIV en una población de pacientes infértiles muestran claramente que existe una

relación entre el porcentaje de ovocitos fertilizados in vitro y la reacción acrosomal en

respuesta a hFF. El porcentaje de ovocitos fertilizados fiie marcadamente distinto según

los espermatozoides tuvieran o no capacidad de respuesta al fluido. Se pueden

distinguir, nuevamente, dos tipos de pacientes no identificables a través de los

parámetros seminales clásicos. Algunos pacientes con buenas características seminales

son inesperadamente RA- y tienen una tasa de fertilización marcadamente disminuida,

mientras que otros pacientes con características seminales deficientes son

sorprendentemente RA+ y fertilizan satisfactoriamente in vitro.

Vale la pena comentar aquí acerca del uso para el ensayo de RA de una muestra de

semen diferente de la utilizada en el procedimiento de FIV. Es cierto que un estudio que

analizara el comportamiento de los espermatozoides en la misma muestra de FIV

maximizan'a la probabilidad de revelar relaciones significativas entre la calidad de las

gametas y el resultado de FIV (Sukcharoen et al. 1996). Sin embargo, desde el punto de

vista clínico, hace falta predecir el éxito de un tratamiento antes de que el tratamiento se

lleve a cabo.

Otros investigadores han informado acerca de la relación de la reacción acrosomal en

respuesta a distintos estímulos - fisiológicos o no - con la fertilización in vitro. Krausz et

al. (1995) encontraron que los pacientes con tasa de FIV > 50% tenían un porcentaje de

RA inducida por progesterona significativamente mayor que los pacientes con tasa de

FIV < 50%. Henkel et al. (1993) utilizaron un shock térmico para inducir la RA y

encontraron que la respuesta al mismo era predictiva del éxito en FIV. Fénichel et al.

(199]); Liu y Baker (1998) y Cummins et al. (1991) han informado que la RA inducida

por ionóforo A23 187 correlaciona con la capacidad fertilizante in vitro.

El éxito de una fertilización in vitro no es un fenómeno de todo o nada. Es importante

tener en cuenta que, a diferencia de otros estudios que han intentado definir una relación

entre RA y fertilización por FIV (Fénichel et al. 1991; Krausz et al. 1995), nuestro

estudio evaluó el porcentaje de ovocitos fertilizados y no simplemente la presencia o

ausencia de fertilización o el alcanzar una tasa de fertilización mayor o menor de cierto

valor umbral.

Al analizar los pacientes individualmente, lo primero que salta a la vista es que algunos

pacientes fertilizan a pesar de ser RA- (falsos positivos) y otros pacientes no fertilizan a

pesar de ser RA+ (falsos negativos). Los falsos negativos pueden explicarse fácilmente

pensando que la reacción acrosomal es sólo uno de los muchos fenómenos que

constituyen la compleja cascada que lleva a la fertilización de un ovocito. Una falla en el

reconocimiento de la zona pelúcida, la fiisión con la membrana plasmática o la

formación de pronúcleos, entre otros, impediría la fertilización a pesar de que existiera

una adecuada capacidad de sufiir reacción acrosomal. Resulta más dificil, quizás,

comprender cómo individuos cuyos espermatozoides no son capaces de reaccionar en

respuesta a hFF presentan elevadas tasas de fertilización in vitro. Pero debe recordarse,

por un lado, que el ensayo mide un comportamiento poblacional y, en cambio, basta un

espermatozoide para lograr fertilizar un ovocito. Por otra parte, si bien las condiciones

de ensayo tratan de ser lo más favorables posible para la funcioanlidad del

espermatozoide, es muy probable que el ovocito mismo sea un inductor más poderoso

que el fluido utilizado en nuestro ensayo.

Los valores de los parámetros estadísticos calculados para el ensayo ponen de manifiesto

que se trata de un ensayo sensible con un buen valor predictivo negativo, pero no muy

específico, con un valor predictivo positivo moderado. Resulta interesante señalar que,

tanto Cummins et al. (1991) estudiando la relación entre la RA en respuesta a ionóforo

de calcio y el éxito en FIV, como Henkel et al. (1993) estudiando la reacción acrosomal

inducida por "shock" hipotérmico como predictora de la capacidad fertilizante in vitro,

encontraron que dichos ensayos eran más específicos que sensibles (Tabla XVIII).

Tabla XVIII: Cuadro comparativo de los parámetros estadísticos informados endistintos estudios que evaluaron el porcentaje de RA y la capacidad fertilizante invitro.S = sensibilidad; E = especificidad; VPP = valor predictivo positivo; VPN = valorpredictivo negativo

Estudio Inductor Valor de S E (S+E)/2 VPP VPNcorte

Calvo I-lFF 5% 0,71 0,55 0,67 0,49 0,75

Cummins A23187 10% 0,54 0,85 0,69 - ­

Henkel Shock T 7,5% 0,50 0.86 0,68 0,63 0,78

Algunos autores (Peng et al. 1987) sugieren utilizar la media entre sensibilidad y

especificidad como indicador del poder discriminatorio de un ensayo; un valor de 0,5

indicaría un ensayo no discriminatorio y un ensayo óptimo tendría un valor de l. Este

parámetro, calculado para nuestros resultados, como así también para los de Cummins y

Henkel, se encuentra próximo a 0,7 (Tabla XVI). Pareceria, pues, que el ensayo de

reacción acrosomal, independientemente del estímulo utilizado para inducir la RA y de la

técnica de evaluación del estado del acrosoma, tiene un potencial predictivo semejante.

Desde el punto de vista diagnóstico, los valores predictivos positivo y negativo son más

útiles que la sensibilidad y la especificidad. El VPP representa la probabilidad de

diagnosticar adecuadamente la falla en FIV y el VPN representa la probabilidad de

diagnosticar adecuadamente el éxito. En este caso, el ensayo de RA tendría mayor valor

estadístico como detector de fertilidad que de falta de capacidad fertilizante in vitro

(VPN > VPP). Recordemos que el %RA es un parámetro poblacional y que, in vitro,

basta un espermatozoide competente en la cápsula para poder fertilizar un ovocito.

Tal como se mencionara en resultados, la razón de probabilidades (RP) es un parámetro

estadístico que mide cuántas veces más probable es para un paciente RA+ fertilizar un

ovocito que para un paciente RA-. Los valores de RP obtenidos indican que,

efectivamente, la probabilidad de fertilizar un ovocito es significativamente mayor (3

veces) para pacientes RA+ que RA-, confirmando la utilidad del ensayo como método

diagnóstico. Permite identificar pacientes infértiles que muy posiblemente tendrán un

bajo porcentaje de éxito en FIV (50% de los pacientes RA- no fertiliza ningún ovocito)

(Figura 39) como asi también seleccionar individuos que probablemente serán capaces

de fertilizar una elevada proporción de ovocitos (80% de los pacientes con %RA > 8%

fertilizan al menos un ovocito). En el medio encontramos una zona gris (35% de los

pacientes con %RA entre 5 y 8 no logra fertilizar), donde la influencia de otros factores,

tanto masculinos como femeninos, adquiriría mayor importancia.

100

3’ FIV :80 ­

60­

4o­

°/oDEPACIENTES

20­

0-4 5-8 9+

% RA

Figura 39: Proporción de pacientes que lograron fertilizar en FIV, agrupados entres categorías de acuerdo con el %RA observado in vitro.

145

Los parámetros estadísticos se calcularon en primera instancia, con todos los pacientes

independientemente del número de ovocitos disponibles para fertilizar y, luego, con

aquellos pacientes que hubieran tenido más de 2 ovocitos disponibles. Se encontró que

la especificidad, el valor predictivo positivo y, especialmente, la razón de probabilidades

aumentaron en el segundo caso. Esto es lógico ya que al tener un solo ovocito

disponible para fertilizar se limitan a 2 las posibilidades de tasa de fertilización (0% ó

100%) mientras que al aumentar el número de ovocitos aumenta el número de

resultados posibles y, por ende, el poder estadístico del ensayo.

Las curvas ROC proveen evidencia visual de la calidad de un ensayo diagnóstico y

tienen mayor valor que los ensayos de correlación para determinar si los resultados del

ensayo proporcionan la información que se necesita para tomar decisiones clínicas (Peng

et al. 1987). Como ya señaláramos, la curva ROC de un ensayo que carece de valor

clínico se ubica sobre la línea de identidad en un eje cartesiano; cuanto más se aleja la

curva de la línea de identidad, mejor es el valor clínico del ensayo. La curva ROC para el

ensayo de reacción acrosomal en respuesta a hFF confirmó su valor clínico. Al

comparar la curva ROC para RA con las correspondientes curvas para % formas

normales y concentración de espermatozoides en semen se observó que el % formas

normales en semen tiene un valor clínico semejante al de RA pero que la concentración

de espermatozoides en semen tiene un valor clínico menor. Cummins et al. (199])

obtuvieron una curva ROC semejante para el ensayo de RA en respuesta a ionóforo, si

bien no lo compararon con otros parámetros del espermograma. Por otra parte, Ombelet

et al. (1997) estudiaron el poder predictivo de una serie de parámetros seminales con

respecto a FIV a través de curvas ROC y, al igual que nosotros, encontraron que, entre

éstos, la morfología estricta ocupa el primer lugar (no evaluaron la RA).

Vale la pena señalar que los valores de sensibilidad, especificidad y razón de

probabilidades obtenidos por estos autores son muy semejantes a los informados por

nosotros y otros autores para el ensayo de RA. También Vawda et al. (1996) analizaron

el valor diagnóstico de la morfología estricta en semen con respecto a FlV a través de

curvas ROC y del cálculo de sensibilidad y especificidad y encontraron resultados

semejantes. Nuevamente se pone de manifiesto el hecho de que un único parámetro no

puede utilizarse como predictor del comportamiento del espermatozoide en un proceso

tan complejo como la fertilización.

Habiendo analizado el comportamiento de la población total de pacientes infértiles, se

estudió luego el comportamiento de los 4 subgrupos previamente definidos: BS, con

caracteristicas seminales indistinguibles de los donantes fértiles; MD, con déficit

morfológico aislado; SS, con 2 o más parámetros seminales fuera del rango normal; MS,

con todos los parámetros seminales muy por debajo del rango normal. Si bien tanto el %

RA como el porcentaje de ovocitos fertilizados por FIV disminuye a través de los

subgrupos a medida que se deterioran las características del semen, el porcentaje de

fertilización en cada subgrupo difiere marcadamente según los espermatozoides posean

o no capacidad de reaccionar ante la estimulación con fluido folicular.

Al recalcular la razón de probabilidades para los distintos subgrupos de pacientes, se

encontró que, salvo en el caso de MS, sigue siendo válido que un paciente RA+ tiene

mayor probabilidad de fertilizar in vitro que un paciente RA- que pertenezca al mismo

subgrupo. Si bien las razones de probabilidades fiJeron distintas para los distintos

subgrupos, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas a causa de una

considerable superposición en los intervalos de confianza de cada una. Sin embargo, los

valores sugerirían que la falta de reacción acrosomal ante el estímulo con fluido folicular

sería especialmente útil para predecir la ausencia de fertilización en el grupo de pacientes

con semen subóptimo. Es decir, que en aquellos individuos con muy buen o muy mal

semen, el %RA sen'a más bien confirmatorio y proporcionaría información quizás

redundante con respecto a la ya obtenida a través del espermograma. En cambio, en los

pacientes con semen subóptimo sen’averdaderamente informativo y brindaría elementos

de juicio adicionales para predecir el éxito de un paciente en FIV. Un fenómeno

semejante ha sido observado por Liu y Baker (1998) al estudiar la correlación entre la

RA inducida por íonóforo A23l87 y la tasa de FIV, ya que la correlación entre ambos

parámetros mejoró significativamente cuando se tomó un subgrupo de pacientes

infértiles con morfología estn'cta en semen < 15%. En cambio, RA no correlacionó con

la tasa de FIV en el grupo de pacientes con morfología >15%.

El número de ovocitos disponibles para fertilizar es altamente van'able y afecta en forma

directa la probabilidad real de obtener embriones. Flaherty et al. (1995), al estudiar las

fallas en ICSI, encontraron que el número de ovocitos disponibles para fertilizar es

determinante de la falta de éxito en lCSl: mientras que con un sólo ovocito disponible el

factor de riesgo para un ICSI fallido es del 37%, con 2 ovocitos baja al 13% y con un

ovocito es solamente del 2%. En nuestro caso, el número de ovocitos disponibles para la

inseminación varió considerablemente a lo largo de la población de pacientes estudiada,

pero, sin embargo, en promedio, fue semejante para todos los subgrupos de pacientes y

para la población total.

También se evaluó el efecto de la calidad de los ovocitos (medido a través de su

morfología) sobre el %FIV. Cuando se separaron los pacientes en cada subgrupo, según

que la calidad de los ovocitos disponibles para fertilizar fiiera buena o mala, no se

encontraron diferencias significativas en el %FIV entre las dos categorías. Estos

resultados apoyan los de Liu et al. (¡988), quienes observaron que la calidad ovocitaria

no fue significativamente diferente entre dos grupos de pacientes infértiles, con tasas de

FIV mayor y menor de 50%.

En resumen, las variaciones en la capacidad fertilizante observadas entre los distintos

subgrupos de pacientes serían atribuibles a las variaciones en el %RA entre los mismos

y no al número de ovocitos disponibles para fertilizar o su calidad, que fiieron

semejantes para todos los subgrupos. De todos modos, cabe reconocer que sólo la

inseminación de un grupo de ovocitos del mismo paciente y en el mismo ciclo con

espermatozoides de donante permitiría discernir si la falta de fertilización refleja

realmente una disfunción del ovocito o del espermatozoide.

La edad de la mujer indiscutiblemente afecta el éxito de un procedimiento de

fertilización asistida (Society for Assisted Reproductive Technology, American Society

for Reproductive Medicine, 1995). No observamos diferencias en la edad promedio de la

mujer entre los 4 subgrupos de pacientes infértiles, de modo que las van'aciones en el

éxito en FIV observadas entre los distintos subgrupos no sen'an atribuibles a esta

variable. A este respecto, Vawda et al. (1996), estudiando una serie de parámetros

seminales como predictores de FIV en un grupo de pacientes infértiles, señalaron que la

edad de la mujer no influyó significativamente sobre la predicción de una tasa de

fertilización mayor o menor de 30%. Se acepta generalmente que la calidad ovocitan'a

disminuye con la edad pero, sorpendentemente, encontramos que dentro de la población

de individuos con semen normal, el porcentaje de ovocitos fertilizados in vitro fue

significativamente mayor en el grupo de mujeres >35 años. Estos resultados podn’an ser

simplemente casuales, pero también se podn’a pensar que los ovocitos de mujeres

mayores podrían perder selectividad frente al proceso de fertilización, lo cual se

traduciría en un aumento de la tasa de fertilización in vitro (Dra. Bustillo, comunicación

personal). Sin duda, al aumentar la edad de la mujer disminuye la tasa de implantación

embn'onaria y aumenta la tasa de abortos espontáneos, produciéndose en consecuencia

la conocida reducción de la fecundidad observada en mujeres de más edad (Davis,

Rosenwaks, 1996; Society for Assisted Reproductive Technology, American Society for

Reproductive Medicine, 1995).

Por último, los resultados obtenidos ponen de manifiesto claramente que la capacidad de

reaccionar ante el fluido folicular tiene mayor influencia sobre la capacidad fertilizante de

una muestra que el porcentaje de espermatozoides normales en semen, determinado

según cn'terios estrictos. Otros autores han informado que la morfología estricta es el

ensayo de mayor valor predictivo con respecto a FIV (Kruger et al. 1988; Vawda et al.

1996; Ombelet et al. 1997), pero en ninguno de estos casos se evaluó simultáneamente

el poder predictivo de morfología y RA. Sukcharoen et al. (1996) evaluaron morfología

estricta y RA en respuesta a A23 187 en un grupo de 73 pacientes infértiles y

encontraron una correlación significativa con FIV para morfología pero no para RA.

Esta diferencia no es sorprendente, ya que ese estudio se llevó a cabo en condiciones

muy distintas a las nuestras: se utilizó otro inductor de RA, distintas condiciones de

capacitación, otro método de evaluar el estado del acrosoma. Pero, quizás más

importante, es señalar que la selección de pacientes no necesariamente respondió a los

mismos criterios. De hecho, la tasa media de fertilización para el grupo de pacientes de

Sukcharoen file del 62%, mientras que la nuestra file del 35%, poniendo de manifiesto

que nuestra población de pacientes infértiles muy probablemente incluyera una

proporción mayor de casos de infertilidad severa. Así se pone en evidencia la necesidad

de llevar a cabo estudios poblacionales prospectivos en los que participen el número

máximo posible de sujetos, como así también la importancia de validar los resultados

obtenidos en una pn'mera instancia con un segundo grupo de individuos.

Discusión HI

8. BÚSQUEDA DE UN MODELO ADECUADO PARA PREDECIR LA

CAPACIDAD FERTILIZANTE D_EUNA MUESTRA DE ESPERMATOZOIDES

HUMANOS

A pesar de que existen varios estudios que han tratado de correlacioanr el ensayo de RA

con el e'xito en FIV e incluso construir un modelo predictivo, ninguno ha tratado de

validar los resultados obtenidos a través del análisis de un primer grupo de pacientes,

con un segundo grupo de pacientes distintos.

Lo primero que llama la atención al analizar los resultados obtenidos es que los valores

de los coeficientes de correlación de aquellos parámetros que correlacionaron

significativamente con los porcentajes de FIV, son relativamente bajos. Sin embargo,

otros grupos de trabajo que han estudiado las correlaciones entre distintos parámetros

espermáticos y FIV han informado valores semejantes (Liu et al. 1988; Sukcharoen et

al. 1996; Vawda et al. 1996; Liu, Baker, 1998). Este fenómeno recalca la importancia

de reconocer la contribución indudable de múltiples factores al éxito de un

procedimiento de FIV. Parinaud et al. (1996) encontraron que cada uno de los

parámetros espermáticos que correlacionaron significativamente con FIV no podía

explicar más del 14% de la variabilidad observada en FIV.

La superposición de los intervalos de confianza de los distintos coeficientes de

correlación pone de manifiesto que los factores de fertilidad evaluados en nuestro

estudio son interdependientes. Efectivamente, varios grupos de trabajo han demostrado

la existencia de correlaciones significativas entre distintos parámetros espermáticos, a

pesar de que en principio evalúen distintos aspectos de la fimcionalidad del

espermatozoide (Liu et al. 1988; Parinaud et al. 1996; Liu, Baker, 1998). Como ya

mencionáramos, es posible que los parámetros que habitualmente se evalúan sean

manifestaciones macroscópicas con un mismo origen molecular que aún no conocemos.

Parinaud et al. (1996) encontraron que los defectos de motilidad, morfología y fimción

acrosomal están íntimamente ligados y sugirieron la existencia de una deficiencia global

de la espennatogénesis y/o función epididimaria.

En la etapa de construcción del modelo, se encontró que la mejor predicción del

porcentaje de ovocitos fertilizados en FIV se obtiene a través de una combinación de la

reacción acrosomal y la concentración de espermatozoides en semen. Esto contrasta con

los resultados de Parinaud et al. (1996) quienes, si bien no evaluaron la inducibilidad de

RA, sí correlacionaron parámetros seminales con FIV y encontraron la mayor

significancia en el porcentaje de motilidad progresiva, sin encontrar correlación con la

concentración de espermatozoides en semen. Vawda et al. (1996) encontraron que el

parámetro del espermograma que mejor correlaciona con FIV es el porcentaje de

morfología normal según criterios estrictos, seguido de motilidad progresiva y

viabilidad, pero tampoco encontraron correlación con la concentración de

espermatozoides. Por otra parte, Sukcharoen et al. (1996) encontraron correlación con

concentración y con porcentaje de formas normales en semen y no con RA en respuesta

a A23187. Tal como sucede en nuestro caso, Vawda et al. (1996) y Liu et al. (1988) no

encontraron correlación del éxito en FIV con la edad de la mujer o la patología

femenina. Para Liu y Baker (1998) el porcentaje de FIV correlacionó significativamente

con RA en respuesta a A23187, seguido del porcentaje de motilidad en el medio de

inseminación. Sólo para aquellos pacientes con morfología normal superior al 15%, la

concentración de espermatozoides en semen correlacionó con FIV. Las diferencias entre

los resultados informados por los distintos grupos podrían bien deberse a la selección de

pacientes y a diferencias en la metodología, pero también ponen de manifiesto la

necesidad de validar los resultados obtenidos en una primera instancia con otros grupos

de pacientes.

Al llevar a cabo la validación con un grupo nuevo de pacientes, se observó que,

efectivamente, la reacción acrosomal se mantuvo como el parámetro individual con el

mayor valor predictivo. Sin embargo, la concentración de espermatozoides en semen, si

bien mantuvo su valor de correlación con el porcentaje de ovocitos fertilizados, no

añadió valor estadístico a la predicción. También se observaron algunas alteraciones en

la cascada de correlaciones entre los distintos parámetros evaluados y FIV. Estas

variaciones podn'an ser consecuencia de la mayor dispersión de los valores individuales

obtenidos en esta segunda etapa, puestos de manifiesto en el mayor tamaño de los IC

para los distintos coeficientes de correlación.

Sin embargo, la permanencia de la reacción acrosomal como parámetro que

individualmente posee la mejor correlación con la tasa de FIV a través de las etapas de

construcción y validación, reafirmaría la posible utilidad del ensayo de RA en respuesta a

hFF como elemento diagnóstico.

No fue posible construir un modelo de predicción cuantitativo en base a los valores de

%RA debido a la diferencia entre las curvas de respuesta del % fertilización en fiinción

de %RA para los dos grupos de pacientes. Este hecho resulta bastante lógico dada la

complejidad del fenómeno de fertilización, que hace prácticamente imposible predecirlo

con precisión a través de la medida de un número limitado de variables.

Los resultados obtenidos revelan la importancia de poner a pmeba cualquier modelo

predictivo de la capacidad fertilizante en un grupo de pacientes distinto al que se ha

utilizado para su construcción. Asimismo, queda claro que dada la gran heterogeneidad

en el comportamiento de las poblaciones de pacientes y la gran cantidad de variables que

puede influir sobre las tasas de fertilización, se necesitarán estudios que incluyan un

número elevado de pacientes y la mayor cantidad posible de determinaciones

paramétricas, para desarrollar un modelo de predicción de la fertilidad más confiable. Es

necesario determinar cuál es el conjunto de ensayos que proporciona la mayor y mejor

información acerca de la capacidad fertilizante (Liu et al. 1988).

REFLEXIÓN FINAL

"‘ “ " Final 156

Creemos haber demostrado satisfactoriamente que el ensayo de reacción acrosomal en

respuesta al fluido folicular tiene valor diagnóstico en el laboratorio de Andrología.

Cuando hablamos de valor diagnóstico y probabilidades, es importante tener en cuenta

lo que realmente significa informar a un paciente que tiene una cierta probabilidad de

fertilizar. Si decimos, por ejemplo, que la probabilidad de éxito es del 80%, estamos

simplemente informando que, de acuerdo con la experiencia previamente acumulada,

de cada lO individuos con caracteristicas semejantes a las del paciente en cuestión, 8

lograron fertilizar. Esto indudablemente parecería ser un comentario positivo, pero hay

que tener en claro que este porcentaje no informa dentro de qué grupo se encontrará el

paciente: dentro de los 8 que fertilizan o dentro de los 2 que no logran hacerlo. Este

fenómeno no es exclusivo del diagnóstico andrológico, sino de cualquier tipo de

pronóstico basado en datos poblacionales y pone de manifiesto que nunca podremos

predecir en forma exacta el comportamiento de un paciente en FIV. Sí podremos tratar

de hacerlo lo mejor posible utilizando las herramientas adecuadas.

La capacidad de sufrir RA en respuesta a hFF es un parámetro estable a través del

tiempo, que se encuentra marcadamente disminuido en muchos pero no todos los

hombres supuestamente infértiles y en algunos hombres considerados fértiles según

las caracteristicas de un espermograma. A pesar de su interdependencia con otros

parámetros espermáticos, el ensayo de RA provee información adicional acerca de la

capacidad fertilizante in vitro. Un valor de RA negativo aislado no puede tomarse como

necesariamente indicativo de un espermatozoide incompetente, así como un valor de RA

normal no asegurará fertilización. Sin embargo, el resultado del ensayo de RA sumado al

de otros ensayos, mejorará la probabilidad de predecir adecuadamente el

comportamiento de una muestra de espermatozoides en un procedimiento de

fertilización asistida y, por ende, la toma de una decisión clínica acertada.

"‘ "' " Final 151

En la era del ICSI, esta preocupación por predecir la capacidad fertilizante de una

muestra de espermatozoides quizás parezca irrelevante, dado que esta técnica de

micromanipulación se ha convertido en el mejor tratamiento disponible para la

infertilidad masculina, logrando elevados porcentajes de fertilización,

independientemente de la patología espermática. Sin embargo, ¿por qué someter

indiscriminadamente a todos los pacientes infértiles a ICSl, cuando su problema quizás

podn’a resolverse exitosamente a través de un procedimiento de fertilización asistida más

sencillo y también menos costoso? Claro está que para determinar cuál sería el

procedimiento a seguir se necesitaria contar con la mayor y mejor información posible

acerca de la fimcionalidad de las gametas. Quisiera, entonces, concluir con una frase que

sintetiza elegantemente mi posición y la de muchos otros andrólogos de laboratorio:

"EL TRATAMIENTO DE LA INFERTILIDAI) MASCULINA NECESITA MÁS

ANDROLOGÍA,N0 MENO

Cummins y Jequier, 1994

REFERENCIAS

Aitken R, 1995. Cell biology of human spennatozoa. In: Grudzinskas J, Yovich J(eds.),Gametes: the spermatozoon. Cambridge: Cambridge University Press, pp.206-237

Aitken R, Buckingham D, Huang G-F, 1993. On the use of A23817 to stimulate humanspermatozoa to undergo the acrosome reaction and exhibit sperm-oocy'te fusion:protocols and interactions. J Androl 14:132-141

Aitken R, Ross A, Hargreave T, Richardson D, Best F, 1984. Analysis of human spermfimction following exposure to the ionophore A23187. J Androl 5:321-329

Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson J, 1994. Molecular Biology ofthe Cell., New York: Garland Publishing, lnc.

Amann R, Katz D, Wang C, 1995. What is semen? How does semen analysis assist inunderstanding the reproductive status of the male? In: Robaire B, Pryor J,Trasler J (eds.), Handbook of Andrology. The American Society of Andrology,pp. 25-30

Bavister B, 1981. Analysis of culture media for in vitro fertilization and criteria forsuccess. ln: Mastroiani L, Biggers J (eds.), Fertilization and EmbryonicDevelopment in Vitro. New York: Plenum Press, pp. 41-60

Bedford J, 1970. Sperrn capacitation and fertilization in mammals. Biol Reprod2(Suppl): 128-158

Bedford J, 1983. Significance of the need for sperm capacitation before fertilization ineutherian mammals. Biology of Reproduction 28: 108-120

Bedford J, Cooper G, 1978. Membrane fiision events in fertilization of vertebrate eggs.ln: Poste G, Nicolson G (eds.), Membrane Surface Reviews (Membrane Fusion).Amsterdam: North-Holland, pp. 65-125

Blackmore P, Beebe S, Danforth D, Alexander N, 1990. Progesterone and 17a­hydroxyprogesterone. Novel stimulators of calcium influx in human sperm. JBiol Chem 265: 1376-1380

Blackmore P, Lattanzio F, 1991. Cell surface localization of a novel non-genomicprogesterone receptor on the head of human sperm. Biochem Biophys ResCommun l8lz33l-336

Blandau R, 1961. Biology of eggs and implantation. ln: Young W (ed.), Sex and

Internal Secretions. Baltimore: Williams & Wilkins, pp. 797-882

Bleil J, Wassannan P, 1980. Mammalian sperm-egg interaction: identification of aglycoprotein in mouse egg zonae pellucidae possessing receptor activity forsperm. Cell 20:873-882

Boyers S, Davis R, Katz D, 1989. Automated semen analysis. Curr Probl ObstetGynecol Fertil 12:165-200

Burkman L, 1990. Hyperactivated motility of human spermatozoa during in vitrocapacitation. ln: Gagnon C (ed.), Controls of sperm motility. Boca Raton: CRCPress, pp. 303-329

Burkman L, 1995. The motility of human spermatozoa before and after capacitation. ln:Grudzinskas J, Yovich J (eds.), Gametes: the spennatozoon. Cambridge:Cambridge University Press, pp. ¡22-139

Burris A, Clark R, Vantman D, Sherins R, 1988. A low sperm concentration does notpreclude fertility in men with isolated hypogonadotropic hypogonadism aftergonadotropin therapy. Fertil Steril 50:343-347

Byrd W, Tsu J, Wolf D, ¡989. Kinetics of spontaneous and induced acrosomal loss inhuman sperm incubated under capacitating and noncapacitating conditions.Gamete Res 22: l09-122

Byrd W, Wolf D, 1986. Acrosomal status in fresh and capacitated human ejaculatedsperm. Biol Reprod 34:859-869

Chamberlin M, Dean J, 1990. Human homolog of the mouse sperm receptor. Proc NatlAcad Sci USA 8726014-6018

Chang M, 1984. The meaning of sperm capacitation: a historical perspective. J Androl5145-50

Clark R, Sherins R, l986. Use of semen analysis in the evaluation of the infertile couple.In: Santen R, Swerdlofl‘ R (eds.), Male Reproductive Dysfunction. New York:Marcel Dekker, pp. 253

Collins J, 1996. Critical Technology Assessment. In: Adashi E, Rock J, Rosenwaks Z(eds.), Reproductive Endocrinology, Surgery and Technology. Philadelphia,New York: Lippincott-Raven, pp. 1915-1930

Cross N, Morales P, Overstreet J, Hanson F, 1986. Two simple methods for detecting

" ' 1.“ 161

acrosome-reacted human spenn. Gamete Res 15:213

Cross N, Morales P, Overstreet J, Hanson F, 1988. Induction of acrosome reactions byhuman zona pellucida. Biol Reprod 38:23 5-244

Cummins J, 1995. Tests of sperm function. In: Grudzinskas J, Yovich J (eds.), Gametes:The spermatozoon. Cambridge: Cambridge University Press, pp. 70-103

Cummins J, Jequier A, 1994. Treating male infertility needs more clinical andrology, notless. Human Reprod 9: 1214-1219

Cummins J, Pember S, Jequier A, Yovich J, Hartmann P, 1991. A test of the humansperm acrosome reaction following ionophore challenge. Relationship to fertilityand other seminal parameters. J Androl 12:98-103

Curry M, Watson P, 1995. Sperm structure and function. In: Grudzinskas J, Yovich J(eds.), Gametes: the spermatozoon. Cambridge, England: Cambn'dge UniversityPress, pp. 45-69

Davis O, Rosenwaks Z, 1996. In vitro fertilization. In: Adashi E, Rock J, Rosenwaks Z(eds.), Reproductive Endocrinology, Surgery, and Technology. Philadelphia ­New York: Lippincott-Raven., pp. 2319-2334

De Jonge C, Barratt C, Radwanska E, Cooke l, 1993. Acrosome reaction-inducingeffect of human follicular and oviductal fluid. J Androl 14:359-364

De Jonge C, Mack S, Zaneveld L, 1989. Synchronous assay for human spermcapacitation and the acrosome reaction. J Androl 10:232-239

de Kretser D, Baker H, 1996. Human Infertility: The Male Factor. ln: Adashi E, Rock J,Rosenwaks Z (eds.), Reproductive Endocrinology, Surgery and Technology.Philadelphia, New York: Lippincott-Raven, pp. 2031-2062

Enginsu M, Dumoulin J, Pieters M, Evers J, Geraedts J, 1993. Predictive value ofmorphologically normal sperm concentration in the medium for in vitrofertilization. Int J Androl 16:113-120

ESHRE Andrology Special Interest Group, 1996. Consensus workshop on advanceddiagnostic andrology techniques. Human Reprod 11:1463-1479

Fabbri R, Porcu E, Lenzi A, Gandini L, Marsella T, Flamigni C, 1998. Follicular fluidand human granulosa cell cultures: influence on sperm kinetic parameters,

hyperactivation, and acrosome reaction. Fertil Sten'l 69: 112-1 17

Fehl P, Miska W, Henkel R, 1995. Further indications of the multicomponent nature ofthe acrosome reaction-inducing substance of human follicular fluid. Mol ReprodDev 42:80-88

Feichtinger W, Kemeter P, 1984. Pregnancy following in vitro fertilization and embryotransfer using pure human serum as culture and transfer medium. Fertil Steril4:936-937

Fetterolf P, Jurisicova A, Tyson J, Casper R, 1994. Conditioned medium from humancumulus oophorus cells stimulates human sperm velocity. Biol Reprod 511184­192

Fetterolf P, Sutherland C, David Josephy P, Casper R, Tyson J, 1994. Preliminarycharacten'zation of a factor in human follicular fluid that stimulates humanspermatozoa motion. Human Reprod 9:1505-1511

Fénichel P, Donzeau M, Farahifar D, Basteris B, Ayraud N, Hsi B-L, 1991. Dynamics ofhuman sperm acrosome reaction: relation with in vitro fertilization. Fertil Steril55:994-999

Flaherty S, Payne D, Swann N, Matthews C, 1995. Assessment of fertilization failureand abnonnal fertilization after intracytoplasmic spenn injection (ICSI). ReprodFertil Dev 7: 197-210

Fleming A, Yanagimachi R, 1982. Fertile life of acrosome-reacted guinea pigspermatozoa. J Exp Zool 220: 109-1 15

Fraser L, 1981. Dibutyryl cyclic AMP decreases capacitation time in vitro in mousespermatozoa. J Reprod Fertil 62:63-72

Fukuda M, Morales P, Overstreet J, 1989. Acrosomal fimction of human spermatozoawith normal and abnonnal head morphology. Gamete Res 24259-65

Fusi F, Bronson R, 1992. Sperm surface fibronectin expression following capacitation. JAndrol 13228-35

Fusi F, Bronson R, Hong Y, Ghebrehiwei B, 1991. Complement component Clq and itsreceptor are involved in the interaction of human sperm with zona-free hamstereggs. Mol Reprod Dev 29: 180-188

Gearon C, Mortimer D, Chapman M, Forman R, 1994. Artificial induction of the

"‘ " i.“ 163

acrosome reaction in human spermatozoa. Human Reprod 9:77-82

Guzick D, 1996. Human Infertility: An Introduction. In: Adashi E, Rock J, RosenwaksZ (eds.), Reproductive Endocrinology, Surgery and Technology. Philadelphia,New York: Lippincott-Raven, pp. 1897-1914

Henkel R, Müller C, Miska W, Gips H, Schill W-B, 1993. Determination of theacrosome reaction in human spermatozoa is predictive of fertilization in vitro.Human Reprod 8:2128-2132

Holt W, 1979. Development and maturation of the mammalian acrosome. Acytochemical study using phosphotungstic acid staining. J Ultrastruct Res 68:58­71

Hong C, Chao H, Lee S, Wei Y, 1993. Modification of human sperm function by humanfollicular fluid: a review. Int J Androl 16:92-96

Houtzager H, 1983. Anthony van Leeuwenhoek. EurJ Obstet Gynecol Reprod 152199­203

Katz D, Drobnis E, Overstreet J, 1989. Factors regulating mammalian sperm migrationthrough the female reproductive tract and oocyte vestments. Gamete Res22:443-469

Krausz C, Bonaccorsi L, Luconi M, Fuzzi B, Criscuoli L, Pellegrini S, Forti G, Baldi E,1995. lntracellular calcium increase and acrosome reaction in response toprogesterone in human spermatozoa are correlated with in vitro fertilization.Human Reprod lO:120-124

Kruger T, Acosta A, Simmons K, Swanson R, Matta J, Oehninger S, 1988. Predictivevalue of abnorrnal sperm morphology in in vitro fertilization. Fertil Steril49:1 12-1 l7

Kruger T, Menkveld R, Stander F, Lombard C, Van der Merwe J, Van Zyl J, Smith K,1986. Sperm morphologic features as a prognostic factor in in vitro fertilization.Fertil Steril 46:1 l 18

Liu D, Baker H, 1992. Morphology of spermatozoa bound to the zona pellucida ofhuman oocytes that failed to fertilize in vitro. J Fertil Reprod 94271-84

Liu D, Baker H, 1992. Tests of human sperm fiJnction and fertilization in vitro. FertilSteril 58:465-483

" " ¡4‘ ¡64

Liu D, Baker H, 1996. A simple method for the assessment of the human acrosomereaction of spermatozoa bound to the zona pellucida: lack of relationship withionophore A23187-induced acrosome reaction. Human Reprod 11:551-557

Liu D, Baker H, 1998. Calcium ionophore-induced acrosome reaction correlates withfertilization rates in vitro in patients with teratozzospermic semen. HumanReprod 13:905-910

Liu D, Du Plessis Y, Nayudu P, Johnston W, Baker H, 1988. The use of in vitrofertilization to evaluate putative tests of human sperm function. Fertil Steril49:272-277

Lowry O, Rosebrough N, Farr A, Randall J, 1951. Protein measurement with the Folin­phenol reagent. J Biol Chem l93:265

Matsumoto A, 1996. Spermatogenesis. In: Adashi E, Rock J, Rosenwaks Z (eds.),Reproductive Endocrinology, Surgery and Technology. Philadelphia - NewYork: Lippincott-Raven, pp. 359-384

Mbizvo M, Alexander N, l99l. Functional changes during sperm transit; sites ofacquisition and possible inhibition of fertilizing ability. In: Baccitti B (ed),Comparative Spermatology 20 Years After. New York: Raven Press, pp. 869­878

Mbizvo M, Burkman L, Alexander N, ¡990. Human follicular fluid stimulateshyperactivated motility in human sperm. Fertil Steril 54:708-7l2

Meizel S, 1988. Molecules that initiate or help stimulate the acrosome reaction by theirinteraction with the mammalian sperm surface. Am J Anat ¡74:285-302

Meizel S, Pillai M, Díaz-Pérez E, Thomas P, l990. Initiation of the human spermacrosome reaction by components of human follicular fluid and cumulussecretions including steroids. ln: Bavister B, Cummins J, Roldan E (eds),Fertilization in Mammals. Norwell, Massachusetts: Serono Symposia, USA, pp.205-222

Menezo V, Testart J, Perrone D, 1984. Serum is not necessary in human in vitrofertilization, early embryo culture and transfer. Fertil Steril 42:750-755

Metz C, 1978. Basic principles of ROC analysis. Semin Nucl Med 8:283-298

Miranda P, Tezón J, 1992. Characteñzation of fibronectin as a marker for human

epididymal sperm maturation. Mol Reprod Dev 33:443-450

Morales P, Llanos M, Gutierrez G, Kohen P, Vigil P, Vantman D, 1992. The acrosomereaction-inducing activity of individual human follicular fluid samples is highlyvariable and is related to the steroid content. Human Reprod 7:646-65]

Mortimer D, 1994. Practical Laboratory Andrology., New York - Oxford: OxfordUniversity Press

Mortimer D, 1995. Sperm transport in the female genital tract. ln: Grudzinskas J,Yovich J (eds.), Gametes: the spermatozoon. Cambn'dge: Cambridge UniversityPress, pp. 157-174

Mortimer D, Shu M, Tan R, 1986. Standardization and quality control of spermconcentration and sperm motility counts in semen analysis. Human Reprod42166

Nelson L, 1977. Tables for testing ordered alternatives in an analysis of variance.Biometrika 642335

Nichols J, Gardner R, 1989. Effect of damage to the zona pellucida on development ofpreimplantation embryos in the mouse. Human Reprod 4: 180-187

Oehninger S, 1995. An update on the laboratory assessment of male fertility. ln:Ombelet W, Vereecken A (eds.), Human Reproduction: Modern Andrology.Oxford: Oxford University Press, pp. 38-45

Oehninger S, Blackmore P, Morshedi M, Sueldo C, Acosta A, Alexander N, 1994.Defective calcium influx and acrosome reaction (spontaneous and progesterone­induced) in spermatozoa of infertile men with severe teratozoospermia. FertilSteril 61:349-354

Oehninger S, Kruger T, 1995. The diagnosis of male infertility by semen quality. HumanReprod 10:1037-1041

Okabe M, Matzno S, Nagira M, Mimura T, Kawai Y, Mayumi T, 1990. A human spermantigen possibly involved in binding and/or fusion with zona-free hamster eggs.Fertil Steril 54: l 121-] 126

Ombelet W, Bosmans E, Janssen M, Cox A, Vlasselaer J, Gyselaers W, Vandeput H,Gielen J, Pollet H, Maes M, Steeno O, Kruger T, 1997. Semen parameters in afertile versus subfertile population: a need for change in the interpretation of

semen testing. Human Reprod 12:987-993

Osman R, Andn'a M, Jones A, Meizel S, 1989. Steroid induced exocytosis: the humansperm acrosome reaction. Biochem Biophys Res Commun 160:828-833

Overstreet J, Cooper G, 1979. The time and location of the acrosome reaction duringsperm transport in the female rabbit. J Exp Zool 209197-102

Pampiglione J, Tan S-L, Campbell S, 1993. Acrosome reactivity in spermatozoa ofdifferent morphology in response to stimulation with follicular fluid. HumanReprod 8:4l2-415

Parinaud J, Vieitez G, Moutaflian H, Richoilley G, Labal B, 1995. Variations inspontaneous and induced acrosome reaction: correlations with semen parametersand in vitro fertilization results. Human Reprod 10:2085-2089

Parinaud J, Vieitez G, Moutaflian H, Richoilley G, Milhet P, 1996. Relationshipsbetween motility parameters, morphology and acrosomal status of humanspermatozoa. Human Reprod “21240-1243

Peng H-Q, Collins J, Wilson E, Wrixon W, 1987. Receiver-operating characteristicscurves for semen analysis variables: methods for evaluating diagnostic tests ofmale gamete fimction. Gamete Res ¡72229-236

Perreault S, Rogers B, 1982. Capacitation pattern of human spermatozoa. ln: MortimerD (ed.), Practical Laboratory Andrology. Oxford: Oxford University Press, pp.13-40

Puttemans P, Ombelet W, Brosens l, 1995. Reflections on the way to conduct aninvestigation of subfertility. ln: Ombelet W, Vereecken A (eds.), HumanReproduction: Modern Andrology. Oxford: Oxford University Press, pp. 80-89

Quinn P, Kerin J, Wames G, 1985. lmproved pregnancy rate in human in vitrofertilization with the use of a medium based on the composition of human tubalfluid. Fertil Sten'l 44:493-498

Quinn P, Wames G, Kerin J, Kirby C, 1984. Culture factors in relation to the success ofhuman in vitro fertilization and embryo transfer. Fertil Sten'l 41:202-209

Ravnik S, Zarutskie P, Muller C, ¡990. Lipid transfer activity in human follicular fluid:relation to human sperm capacitation. J Androl l l:2l6-226

Roldan E, Harrison R, 1990. Molecular mechanisms leading to exocytosis during the

" ' l.“ 167

sperm acrosome reaction. ln: Bavister B, Cummins J, Roldan E (eds.),Fertilization in Mammals. Norwell, Massachusetts: Serono Symposia USA, pp.179-196

Saaranen M, Calvo L, Dennison L, Banks S, Bustillo M, Dorfmann A, Goldstein M,Thorsell L, Schulman J, Sherins R, 1993. Acrosome reaction inducing activity infollicular fluid correlates with progesterone concentration but not with oocytematurity or fertilizability. Human Reprod 8: 1448-1454

Saragüeta P, Lanuza G, Miranda P, Tezón J, Barañao J, 1994. Immunoglobulins fromhuman follicular fluid induce the acrosome reaction in human sperm. MolReprod Dev 39:280-288

Sathananthan A, Trounson A, Wood C, Leeton J, 1982. Ultrastructural observations onthe penetration of human sperm into the zona pellucida of the human egg invitro. J Androl 3:356

Scheffe H, 1959. The Analysis of Variance., New York: John Wiley & Sons, lnc.

Schmidt L, Münster K, 1995. Infertility, involuntary infecundity, and the seeking ofmedical advice in industnalized countries 1970-1992: a review of concepts,measurements and results. Human Reprod 10:1407-1418

Shapiro S, Wilk M, 1965. The analysis of variance for normality (complete samples).Biometrika 52:59]

Sherins R, 1995. How is male infertility defined? How is it diagnosed? Epidemiology,causes, work-up (history, physical, lab tests). Defining infertility. ln: Robaire B,Pryor J, Trasler J (eds.), Handbook of Andrology. The American Society ofAndrology, pp. 48-51

Siegel S, 1956. Nonparametric Statistics for the Behavioral Sciences, New York:McGraw-Hill Book Company, Inc.

Siiteri J, Gottlieb W, Meizel S, 1988. Partial characterization of a fraction from humanfollicular fluid that initiates the human sperm acrosome reaction in vitro. GameteRes 20225-42

Smith T, Yanagimachi R, 1989. Capacitation status of hamster spennatozoa in theoviduct at various times afler mating. J Reprod Fertil 86:255-261

Society for Assisted Reproductive Technology, American Society for ReproductiveMedicine, 1995. Assisted reproductive technology in the United States and

" " I.“ ¡68

Canada: 1993 results generated from the American Society for ReproductiveMedicine/Society for Assisted Reproductive Technology Registry. Fertil Steril64:]3-2]

Steptoe P, Edwards R, Purdy J, 1980. Clinical aspects of pregnancies established withcleaving embryos grown in vitro. Br J Obstet Gynaecol 87:757-768

Stock C, Fraser L, 1987. The acrosome reaction in human sperm from men of provenfertility. Human Reprod 2: 109-1 19

Suarez S, Wolf D, Meizel S, 1986. lnduction of the acrosome reaction in humanspennatozoa by a fraction of human follicular fluid. Gamete Res 14:107

Sukcharoen N, Keith J, Irvine D, itken R, ¡996. Prediction of the in vitro fertilization(IVF) potential of human spennatozoa using sperm function tests: the effect ofthe delay between testing and lVF. Human Reprod l ¡11030-1034

Tarin J, Trounson A, 1993. Zona-free sperm penetration assay and inducers of theacrosome reaction: a model for sperm microinjection under the zona pellucida.Mol Reprod Dev 35:95-104

Tesarik J, 1985. Comparison of acrosome reaction-inducing activities of human cumulusoophorus, follicular fluid and ionophore A23187 in human sperm populations ofproven fertilizing ability in vitro. J Reprod Fertil 74:383-388

Tesarik J, Mendoza Oltras C, Testart J, l990. Efiect of the human cumulus oophorus onmovement characteristics of human capacitated spermatozoa. J Reprod Fertil88:665-675

Tesarik J, Mendoza C, Moos J, Carreras A, 1992. Selective expression of aprogesterone receptor on the human sperm surface. Fertil Steril 58:784-792

Thomas P, Meizel S, 1988. An influx of extracellular calcium is required for initiation ofthe human sperm acrosome reaction induced by human follicular fluid. GameteRes 20:397-41 l

Tomiyama T, Ohashi K, Tsutsui T, Saji F, Tanizawa O, 1995. Acrosome reactioninduced in a limited population of human spennatozoa by progesterone (Cazi­dependent) and ATP (Cap-independent). Human Reprod 10:2052-2055

Trounson A, 1983. ln vitro fertilization. Curr Top Exp Endocrinol 5:43-60

Trounson A, Mohr L, Wood C, Leeton J, ¡982. Efi‘ect of delayed insemination on in

Rofornnciac 169

vitro fertilization, culture and transfer of human embryos. J Reprod Fertil64:285-294

Vantman D, Banks S, Koukoulis G, Dennison L, Sherins R, 1989. Assessment of spermmotion characteristics from fertile and infertile men using a fully automatedcomputer-assisted semen analyzer. Fertil Steril 51: 156-161

Vawda A, Gunby J, Younglai E, 1996. Serum parameters as predictors of in vitrofertilization: the importance of strict criteria sperm morphology. Human Reprod11:1445-1450

Virtanen 1, Bradley R, Paasivuo R, Lehto V-P, 1984. Distinct cytoskeletal domainsrevealed in sperm cells. J Cell Biol 99: 1983-1991

Westphal L, Dansasouri l, Shimizu S, Tadir Y, Berns M, 1993. Exposure of humanspermatozoa to cumulus oophorus results in increased relative force as measuredby a 760 nm laser optical trap. Human Reprod 8: 1083-1086

White D, Aitken R, 1989. Relationship between calcium, cyclic AMP, ATP andintracellular pH and the capacity of hamster spermatozoa to expresshyperactivated motility. Gamete Res 22: 163-177

Yanagimachi R, 1969. ln vitro acrosome reaction and capacitation of golden hamsterspermatozoa by bovine follicular fluid and its fractions. J Exp Zool 1701269-280

Yanagimachi R, 1981. Mechanisms of fertilization in mammals. ln: Mastroiani L,Biggers J (eds.), Fertilization and Embryonic Development ln Vitro. New York:Plenum Press, pp. 81-187

Yanagimachi R, 1988. Sperm-egg fusion. ln: Duzgunes N, Bronner F (eds.), CurrentTopics in Membranes and Transport. San Diego: Academic Press, pp. 3-43

Yanagimachi R, 1994. Mammalian Fertilization. ln: Knobil E, Neill J (eds.), ThePhysiology of Reproduction. New York: Raven Press, pp. 189-318

Yanagimachi R, Usui N, 1974. Calcium dependence of the acrosome reaction andactivation of guinea pig spermatozoa. Exp Cell Res 89: 161-174

Yovich J, Matson P, 1995. Male subfertility: concepts in 1995. In: Ombelet W,Vereecken A (eds.), Human Reproduction: Modern Andrology. Oxford: OxfordUniversity Press, pp. 3-9

Yudin A, Gottlieb W, Meizel S, 1988. Ultrastructural studies of the early events of the

human sperm acrosome reaction as initiated by human follicular fluid. GameteRes 20: 11-24

Zaneveld L, De Jonge C, Anderson R, Mack S, 1991. Human sperm capacitation andthe acrosome reaction. Human Reprod 6: 1265-1274

Zinaman M, Drobnis E, Morales P, et al, 1989. The physiology of sperm recovered fromthe human cervix: acrosomal status and response to inducers of the acrosomereaction. Biol Reprod 41:790-797

/ MWh-káï-ALO

ATP

BSABWWBWW-268Ca-ATPasaCASA

DAG

E

FCS

FIV

G&lVFHam’s-ZÓB

hFF

HHM

HSMHSM-3BHSM-268HSM-3 SB

HSM-FCSlC 95%

L

L3

NIHOMSPBSPIP2RA

%RA

RA+RA­RP

Vc

V040

VCÓO

VPNVPP

A‘ ' ‘ .“171

ABREVIATURAS

Adenosina trifosfatoAlbúmina de suero bovino

Medio Biggers, Whitten y WhittinghamMedio BWW, suplementado con 26 mg/ml de BSA

ATPasa dependiemte de calcioSistema computarizado para el análisis de movimiento espermático

DiacilglicerolEspecificidad, parámetro estadísticoSuero de cordón fetal

Fertilización in vitro

Genetics & lVF Institute, Fairfax, VA, E.E.U.U.

Medio Ham’s, suplementado con 26 mg/ml de BSAFluido folicular humano

Medio Tyrode's modificado, regulado con Hepes, pH 7,4Medio Tyrode's modificado para espermatozoides humanosMedio HSM, suplementado con 3 mg/ml de BSA

Medio HSM, suplementado con 26 mg/ml de BSAMedio HSM, suplementado con 35 mg/ml de BSA

Medio HSM, suplementado con 7,5% V/V de FCSIntervalo de confianza del 95%

Linealidad del espermatozoide% acumulativo de espermatozoides con linealidad menor o igual a 3National Institutes of Health, Bethesda, MD, E.E.U.U.

Organización Mundial de la SaludSolución fisiológica, regulada con fosfato, pH 7,4Fosfoinositol difosfatoReacción acrosomal

Diferencia entre los % de espermatozoides reaccionados en presencia yausencia de hFF

%RA mayor o igual a 5%%RA menor del 5%

Razón de probabilidadesSensibilidad, parámetro estadísticoVelocidad curvilínea del espermatozoide

% de espermatozoides con Vc menor o igual a 40 pm/seg% de espermatozoides con Vc menor o igual a 60 Lim/segValor predictivo negativoValor predictivo positivo