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Tesis Doctoral
La reacción acrosomal inducida porLa reacción acrosomal inducida porfluido folicular como medida de lafluido folicular como medida de la
capacidad funcional delcapacidad funcional delespermatozoide humanoespermatozoide humano
Piñeiro de Calvo, Lucrecia
1998
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
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Cita tipo APA:
Piñeiro de Calvo, Lucrecia. (1998). La reacción acrosomal inducida por fluido folicular comomedida de la capacidad funcional del espermatozoide humano. Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires.http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3086_PineirodeCalvoCita tipo Chicago:
Piñeiro de Calvo, Lucrecia. "La reacción acrosomal inducida por fluido folicular como medidade la capacidad funcional del espermatozoide humano". Tesis de Doctor. Facultad de CienciasExactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1998.http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3086_PineirodeCalvo
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRESFACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
La reacción acrosomal inducidapor fluido folicular como medida
de la capacidad funcionaldel espermatozoide humano
Autor: Lic. Lucrecia Piñeiro de Calvo
Director:Richard J. Sherins, M.D.
Co-Director:Dr. Eduardo H. Charreau
Lugar de trabajo: Genetics & IVF Institute, Fairfax, Virginia.Estados Unidos de Norteamérica
Tesis presentada para optar al título deDoctor de la Universidad de Buenos Aires
(Orientación Quimica Biológica)
r3986.v1998
SCHOOL OF EXACT AND NATURAL SCIENCESUNIVERSITY OF BUENOS AIRES
Ph.D. Thesis:
FOLLICULAR FLUID-INDUCED ACROSOMEREACTION
AS A MEASURE OF HUMAN SPERM FUNCTION
Author:Lucrecia Piñeiro de Calvo
Director:Richard J. Sherins, M.D.
Director in Argentina:Eduardo H. Charreau, Ph.D.
Workplace:GENETICS & IVF INSTITUTE
FAIRFAX, VIRGINIA, USAand
NATIONAL INSTITUTE OF CHILD HEALTH ANDHUMAN DEVELOPMENT
BETHESDA, MARYLAND, USA
-l998
TODO TIENE SU MOMENTO YCADA COSA SU TIEMPOBAJO EL CIELO.
Eclesiastés 3:1
A mispadresA Juan Carlos.
A María Florencia.
AGRADECIMIENTOS
A Richard J. Shen'ns, maestro y amigo, por todas las cosas que me enseñó a lo largo desiete años de trabajo, no sólo sobre Andrología, sino sobre la vida en general. Porque através de su calidad humana y científica aprendi lo que significa el buen ejercicio de laMedicina.
A Lisa Dennison-Lagos, por su apoyo constante e incondicional, dentro y fuera dellaboratorio. Porque este logro es el resultado de su esfuerzo también, aunque le cuesteaceptarlo. Por las largas horas de trabajo compartidas con mucho humor; por enseñarmequé es una Margarita, y por sobre todas las cosas, por esta gran amistad que empezócasi sin que nos diéramos cuenta y que nos sigue uniendo a través de muchas millas dedistancia.
A David Vantman, por su franca amistad y por todos los momentos de ciencia y filosofiacompartidos frente a una taza de café en los pasillos del NIH. Por enseñarme todo loque sabía. Por haberme ayudado a entender que los espermatozoides humanos no separecen nada a los de rata, aunque a veces...¿Quién diría?
A Steven Banks, “genio” de la estadística aplicada a la biomedicina y responsable deltratamiento estadístico de los resultados, por haberme hecho perder el miedo alIlp<0,05|l.
A George Koukoulis, con quien comparti mi estadía en el NlH, por sus consejosprácticos en el laboratorio, sus lecciones de historia y su desinteresada amistad.
A mis restantes compañeros de laboratorio en el NlH, Allen Burris y Linda Liu, porayudar a que no me sintiera extranjera al llegar a su país.
A Amy, Anita, Bill, Gareth, Janie, Karen, Kim, Melissa, Roakie, Ryn, Ted, todosjóvenes Biológos que desfilaron por el laboratorio de Andrología del G&IVF y notuvieron más remedio que aprender a medir reacción acrosomal. Por su valiosaasistencia técnica y por enseñarme tantas cosas lindas del "American way of life". Aalgunos, también por brindarme su amistad.
A Markku Saaranen, por su finlandesa calidez y los momentos compartidos en ellaboratorio.
A María Bustillo, de quien aprendí mucho sobre el manejo de la pareja infértil y lareproducción asistida, por su generosa amistad y buenas ideas.
A Joseph D. Schulman, Director del G&IVF, por darme la posibilidad de realizar estetrabajo y permitir que me sintiera parte de los logros del Instituto durante esos años.
A los integrantes del laboratorio de Embriología del G&IVF: Andy, Lilli, Sam, Simone,por no protestar cada vez que les pedí que me juntaran los fluidos foliculares o que meprestaran suero de cordón fetal y medio Ham's. Y porque sin ellos no habría datos deFlV en este trabajo.
A todos los demás integrantes del G&IVF, por su calidez y por haberme ayudadosiempre que lo necesite. Nombrarlos a todos sería imposible, pero cada uno sin dudacontribuyó a que G&lVF ocupara un lugar especial en mi vida.
Al Dr. Jorge Blaquier, de la mano de quien tuve la suerte de dar mis primeros pasos enla investigación científica, por enseñarme todo lo que siempre quise saber sobre elespermatozoide en el epidídimo y quejamás me atreví a preguntar.
A todos mis viejos compañeros de laboratorio en el lBYME, mi segundo hogar durantetantos años: Adriana, Alejandra, Audrey, Elsa, Esteban, Fernanda, Jorge, Juan CarlosGarberi, Miguel, Mariana, Mónica Cameo, Mónica Vázquez, Pablo, Patricia, Paty,Stella...Algunos han tomado otros rumbos, otros siguen estando en el mismo lugar.Gracias por todos los momentos compartidos: los científicos que ayudaron a miformación y los otros que llevaron a forjar muchas amistades.
A Patricia Miranda, por sus incansables “¿Y?...¿Para cuándo?”
A Clarisa Marín, por las valiosas discusiones científicas, la minuciosa revisión de estemanuscrito y los espermatozoides de tapa. Por su sincera amistad, sus palabras dealiento y sobre todo, por ser la gota que horadó la piedra.
A Mónica Cameo, por estar en el lugar adecuado en el momento adecuado. Por renovarcon tantas ganas una vieja amistad, por su contagioso entusiasmo y por abrirmegenerosamente las puertas de BR.
Al resto de los integrantes de BR, Mariana, Paula, Paulita, Quique, Sara, Vanina, porcontribuir a que pudiera encontrar alli un espacio donde crecer cientifica ypersonalmente al volver a la Argentina.
A mis alumnos, por su estímulo constante yjuventud.
Al Dr. Eduardo H. Charreau por su apoyo continuo y ayuda desinteresada que hicieronposible que pudiera concluir esta asignatura pendiente. A él y al Dr. Carlos P. Lantospor haber creído siempre en mí, a lo largo de tantos años.
A mis amigos, los de aqui y los de allá, que aunque nada tienen que ver científicamentecon este trabajo, estuvieron a mi lado compartiendo penas y alegn'as: Alejandra yGuillermo, Ana y Jorge, Antonella, Aylin y Juan, Barb y Tony, Carlos y Adriana, CheeKeng, Giorgia, Giulia, Inés y Omar, Liliana y Horacio, Machiko y Masaki, María, MaríaVictoria, Mariana y José, Mirta, Ofelia y Adrián, Sara y Duncan, Sonia y Angel, Susy,Voja...A los viejos de Montserrat y a los nuevos de Jesús Misericordioso...
A Rosa y Pedro, porque desde que recuerdo estuvieron siempre a mi lado.
A Marta, por ser una "Tía Chocha" que alguna vez imaginó que ganaría el Nobel.
A Rosa Man'a, simplemente porque sí.
A Angela, por quereme como a una hija.
A mis padres, por ser como son, por hacerme lo que soy y por su apoyo y cariñoincondicionales desde el día en que nací. A Mamá, además, por la cuidadosa lectura ycorrección de este manuscrito.
A Juan Carlos, por las largas horas frente a la computadora y la infinita paciencia.Porque sin él esto no sería realidad. Pero, especialmente, por apoyarme en todos misemprendimientos.
A María Florencia, por los simpáticos espermatozoides que aprendió a dibujar desdemuy chiquita. Por estar aquí y hacer que quiera ser mejor cada día.
RESUMEN
El objetivo de este trabajo fue evaluar el uso de un ensayo de reacción acrosomal (RA) en respuesta afluido folicular humano (hFF) como indicador de funcionalidad espermática. Se establecieron lascondiciones óptimas de ensayo utilizando espermatozoides de donantes fértiles. Se evaluó Ia influenciade la composición del medio de capacitación sobre hFF-RA: la naturaleza del suplemento proteico, perono así la composición iónica, afectó considerablemente los resultados del ensayo.Se estudió hFF-RA en 58 hombres fértiles y 232 pacientes infértiles. El %RA (diferencia entre losporcentajes de espermatozoides reaccionados en presencia y ausencia de hFF) en la población normalpresentó una distribución Gaussiana, con una media de (17:1)%. El intervalo de confianza (IC) del 95%para %RA indicó que valores inferiores al 5% se encontraban fuera del rango normal. El %RA fue mayorque 9% en 83% de los individuos normales y sólo el 2% de los mismos tuvo un %RA anormal (<5%). Secalculó la variabilidad inlraindivíduousando múltiples muestras de cada donante. obteniéndose un IC del95% de :4 unidades de RAcon respecto a la media individual.El %RA en la población infértílno presentóuna distribución Gaussiana, y el valor de su mediana fue 3%. El 60% de los pacientes presentó un %RAfuera del rango normal (<5%) y sólo el 26% de los mismos tuvo un %RA mayor de 9%. Como lospacientes ingresaron al estudio en forma secuencial, sin importar la etiología de su infertilidad. lapoblación estudiada fue muy heterogénea e incluyó individuos con un amplio espectro de caracteristicasseminales. Se observó un aumento progresivo en el número de pacientes con %RA < 5% (RA-) a medidaque se deterioró Ia calidad del semen. Sin embargo, 20% de los pacientes con buen semen fueroninesperadamente RA-, mientras que 29% de los pacientes con semen deficiente fueron RA+ (%RA >5%). Así, a pesar de que hubo correlación significativaentre %RA y otros parametros seminales, %RA nofue predecible a partir de los datos de un espermograma tradicional.Se analizó la capacidad de %RA para predecir el éxito en FIV mediante un estudio prospectivo. Lamediana del % de ovocitos fertilizados aumentó con %RA: los pacientes RA- fertilizaron solamente 12%ovocitos, mientras que los pacientes con %RA > 9% fertilizaron 50% de los ovocitos. La sensibilidad delensayo fue 0,75, su especificidad 0,55 y su razón de probabilidades 2,9; así, la posibilidad de fertilizar unovocito fue 2.9 veces mayor para los pacientes RA+ que para los RA-. Cuando los pacientes sedividieron en cuatro grupos de acuerdo con sus parametros seminales, el % de ovocitos fertilizadosdisminuyó al deteriorarse las caracteristicas del semen. Sin embargo, dentro de cada subgrupo, lamediana del % de ovocitos fertilizados fue 3 a 4 veces mayor en pacientes RA+ que en RA-, indicandoque la RA tuvo un efecto mayor sobre el éxito en FIVque los parámetros tradicionales del semen.Se trató de construir un modelo predictivo del éxito en FIV, considerando una serie de parámetros defertilidad, tanto en el hombre como en la mujer. Los resultados obtenidos en las fases de Construcción yValidación del modelo mostraron que %RA tenia la mayor correlación con el exito en FlV y que lainclusiónde cualquiera de los otros parámetros evaluados, no añadía poder estadístico al modelo.Los datos aqui presentados indican que %RA es una medida estable de la función espermática y tiene unvalor predictivo mayor para el éxito en FIVque el espermograma tradicional, incluyendo la morfología concriterios estrictos. Si bien la capacidad fertilizante no puede predecirse adecuadamente a través de unúnico parámetro del espermatozoide, la determinación de hFF-RA parecería ser una herramienta útil enla evaluación de la posibilidad de éxito de un paciente en FIV.
PALABRAS CLAVES: espermatozoide humano - reacción acrosomal - fluido folicular - FIV funcionalidad espermática - Písum Sativum
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the potential use of an acrosome reaction (AR) assay in response tohuman fotlicular fluid (hFF) as a sperm function diagnostic tool. Optimum assay conditions wereestablished using sperm from normal fertile men. The influence of media composition on AR inducibilitywas assessed: protein supplementation in the capacitation medium, but not ionic composition, stronegaffected assay results.hFF-AR was analyzed in 58 normal fertile men and 232 infertile patients. AAR (% reacted sperm in thepresence of fotlicular fluid - % reacted sperm in control) in the normal population followed a Gaussiandistribution, with a mean of (17:1)%. The 95% Confidence Interval (Cl) for AAR showed that values under5% would be outside the normal range. AAR was greater than 9% in 83% of the normal subjects studiedand only 2% of fertile individuals had a failed AAR (<5%). Within person variability was calculated usingmultiple specimens from each subject and rendered a 95% CI of 4 AR units above and below his meanvalue. AAR in the infertile population did not followa Gaussian distribution, and its median value was 3%.
AAR values were below the normal range (<5%) in 60% of the patients and only 26% of the patients hadvalues over 9%. Because patients entered the study sequentially, regardless of the aetiology of infertility,the patient population comprised a wide variety of subjects ranging from individuals with good to extremelypoor semen quality. There was a progressiver greater number of individuals with AAR < 5% (AR-) assemen quality deteriorated. However, among patients with good semen values, 20% were unexpectedlyAR-, and among patients with severer impaired semen quality, 29% had AAR > 5% (AR+). Thus, eventhough there was a significant correlation between AAR values and other semen measurements. AARcould not be predicted from conventional semen analysis.The ability of AAR to predict fertilization success in IVF was analyzed prospectively. The medianpercentage of eggs fertilizedincreased as AAR became greater: spermatozoa from AR- patients fertilizedonly 12% of eggs, while spermatozoa with AAR > 9% fertilized 50% of eggs. The assay had a sensitivityof 0.75, a specificity of 0.55 and an odds ratio of 2.9; thus, AR+ patients were 2.9 times more likely toachieve fertilization at IVF than AR- patients. When patients were divided into four clearly definedsubgroups according to their semen characteristics, the median percent eggs fertilized decreased assemen characteristics deteriorated. However, within each patient subgroup, the median percent eggsfertilized was 3- to 4- fold higher for AR+ than for AR- patients, indicating that AR had a greater effect onfertilizationthan traditional semen parameters.An attempt was made to construct a model to predict fertilizationsuccess at IVFtaking into account seriesof fertilityparameters, both male and female. Results obtained in the Construction and Validation phasesof the study showed that AAR had the highest correlation with fertilization success at IVF and that theinclusion of any of the other parameters evaluated in the model, added no statistical benefit.Though it is necessary to acknowledge that fertilitypotential cannot be predicted accurater measuring asingle sperm parameter, the data presented indicate that AAR is a stable measure of sperm function andhas a much higher predictive value for IVFsuccess than traditional semen parameters, including spermmorphology by strict criteria. hFF-AR assessment seems to be a clinically useful diagnostic tool indetermining a patient's likelihood of achieving fertilization at IVF.
KEY WORDS: human spermatozoon - acrosome reaction - follicular fluid - IVF - sperm function - PisumSativum
Indice i
- INTRODUCCION
Intrnduorir'm lFertilidad,Subfertilidad e Infertilidad 2Infertilidad " 4
EI espermatn7nide 7Interacción con el ovocito ...... .. l4Reacción Acrmnmal 16Reconocimiento y penetración de la Zona 22Fusión con el ovocito y Singamia 23Los ensayos diagnósticos en el laboratorio de Andmlngía 24Propiedades de un ensayo diagnóstico 28El ensayo de reacción acrosomal en respuesta a fluido folicular................................ .. 30
- OBJETIVOS
Objetivos 35
- MATERIALES Y METODOS
l. Sujetos ‘ ‘° ‘ 38l.l. Población normal 381.2. Población infértil 38l.3. Obtención de muestras 33
2. Análisis del semen ......... ..392. l .Concentración de espermammidec 392.2 Motilidad: porcentaje de mótiles y calidad de mc .' ' ‘ n 392.3 Morfología 402.4 Viabilidad 4o2.5 Análisis computarizado ........ ..4l
3. Procesamiento de las muestras de semen 413.1. Obtención de una fracción altamente mótil 423.2. lncubación en condiicones ‘ 433.3. Inducción de la reacción acrosomal 43
3.4. Evaluación del porcentaje de reacción acrosomal 44
4. Obtención y preparación de los fluidos biológicos utilizados ......................... ..464.1. Fluido folicular 464.2. Suero de cordón umbilical 46
Indice ii
5. Optimizacióm de las condiciones del ensayo de reacción acrosomal .............. ..475.1.0ptimización de la concentración de fluido folicular 475.2. Optimización de la concentración de espermatozoides a capacitar ................. ..485.3. Optimización del tiempo de exposición al fluido folicular............................... ..485.4. Optimizacióndel tiempode r " 485.5. Análisis ‘ "' " - 49
6. Efecto del fluido folicular sobre las características de motilidad deespermatozoides capacitados 49
7. Influencia del medio de capacitación sobre la respuesta al fluido folicular..... 507.1. Composición salina 507.2. Suplemento proteico 52
8. Ensayo piloto para comparar la reacción acrosomal inducida por fluidofolicular en espermatozoides de individuos normales y pacientes infértiles.....548.1.Sujetos ‘ "' ‘ n 548.2. Procesamiento de muestras de semen.... .. 548.3. Tratamiento de resultados ....... .. 54
9. Estudio poblacional dela reacción acrosomal inducida por fluido folicular....559.l. Individuos normales 55
9.1.]. Población ‘ 4' J 559.1.2. Procesamiento de las muestras de semen 559.1.3. Tratamiento de resultados 56
9.2. Pacientes infértiles 569.2. l. Población ‘ " J 569.2.2. Procesamiento de las muestras de semen 579.2.3. Tratamiento de resultados 57
10. Estuido del valor diagnóstico de la reacción acrosomal inducida por fluidofolicular con respecto a la capacidad fertilizante in vitro................................ ..5710.]. Población ‘ 4' J 5710.2. Procesamiento de las muestras de semen 58
10.2.1. Ensayo de reacción acrosomal 5810.2.2. Fertilización ¡n vitro 58
10.3. Obtención de ovocitos y fertilización in vitro de los miqmm 5810.4. Tratamiento de rPCIIltaan 59
ll. Búsqueda de un modelo adecuado para predecir la capacidad fertilizante deuna muestra de espe. ‘ " 60l l.l. Diseño experimental 60
l 1.1. l. Etapa de construcción ........ .. 61ll.l.2. Etapa de "J "m .............62
l 1.2. Procesamiento de las muestras... ........ .. 62
Indice iii
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9‘
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9°
- RESULTADOS
Optimización de las condiciones del ensayo de reacción acrosomal inducida porfluido folicular 64l.l. Concentración de fluido folicular ..................... ..64l.2. Concentración de espermammides 641.3. Tiempo de exposición al fluido folicular 661.4. Tiempo de capacitación ........ .. 69
Efecto del fluido folicular sobre las características de movimiento deespermatozoides incubados en condiciones capacitantes 7]
Características del medio de capacitación y reacción acrosomal ................... ..733.1. Efecto de la composición salina del medio sobre la reacción acrosomal inducida
por fluido folicular .... .. . 733.2. Efecto del suplemento proteico del medio de capacitación sobre la respuesta al
fluido folicular... 75
Características del medio de capacitación y parámetros de motilidad ............804. l. Efecto de la composición salina del medio sobre la motilidad de los
espermatozoides luego de 2 horas de incubación en condiciones capacitantes..804.2. Efecto del suplemento proteico del medio sobre la motilidad de los
espermatozoides luego de 2 horas de incubación en condiciones capacitantes..80
Ensayo piloto para comparar la reacción acrosomal inducida por fluidofolicular en espermatozoides de individuos normales y pacientes infértiles.... 83
Estudio poblacional de la reacción acrosomal inducida por fluido folicular..... 866. l. Población normal ................................. ..866.2. Población de pacientes infértiles ................. ..89
Estuido del valor diagnóstico de la reacción acrosomal inducida por fluidofolicular con respecto a la capacidad fertilizante ¡n vitro.......................... .. 98
7. l. Población infértil total ................................. .. 98
7.2. Subgrupos de pacientes infértiles .lOI
Búsqueda de un modelo adecuado para predecir la capacidad fertilizante deuna muestra de espermatozoides ........ l 12
8.]. Etapa de construcción l 128.2. Etapa de v "J "m .......... ..l15
Indice iv
- DISCUSION
Discusión 122
l. Por qué hFF como inductor 1242. Optimización del ensayo de reacción acrosomal de espermatozoides humanos en
respuesta al fluido folicular humano ...... ..1263. Efecto del fluido folicular sobre las características de movimiento de
espermatozoides capacitados .......... .. 1304. Efecto de la composición salina y e| suplemento proteico del medio de capacitación
sobre el ensayo de reacción acrosomal 1325. Ensayo piloto para comparar la reacción acrosomal inducida por fluido folicular en
individuos normales y pacientes infértiles l366. Estudio poblacional de la reacción acrosomal inducida por fluido folicular ......... .. l377. Estudio del valor diagnóstico de la reacción acrosomal inducida por fluido folicular
con respecto a la capacidad fertilizante in vitro 1418. Búsqueda de un modelo adecuado para predecir la capacidad fertilizante de una
muestra de espermatozoides humanos lSl
- REFLEXION FINAL
Reflexión final ..... ..155
- REFERENCIAS
Referencias ... l 58
Abreviaturas l7l
INTRODUCCIÓN
La infertilidad de una pareja es consecuencia de una
multiplicidad defactores que contribuyen a ella en forma
variable.
Aceptar todos los factores potencialmente relevantes y
considerar su etiología, aunque por el momento nuestra
comprension de los mismos sea limitada, es esencial para
poder progresar en el diagnóstico y tratamiento de este
complejo problema clínico.
David Mortimer, [994
Fertilidad, Subfertilidad e Infertilidad
El estado de fertilidad de una persona, además de requerir el funcionamiento adecuado
de su aparato reproductor, está sujeto a la influencia de un sinnúmero de factores
extn'nsecos y es altamente variable a lo largo de la vida. Estrictamente, sólo podemos
decir que un hombre fértil es aquél que ha tenido un hijo recientemente, en general,
en el transcurso del último año.
El hombre que logra la paternidad luego de una consulta o inclusive de un tratamiento
por infertilidad, si bien fue sin duda fértil en ese momento, no es necesariamente
normal. Si en una pareja se identifica una causa de infertilidad en la mujer, tampoco es
lícito considerar al hombre normal, ya que un 20% de las parejas que consultan por
infertilidad presenta una combinación de patologías masculina y femenina.
Solamente las parejas que nunca han tenido que ir a la consulta por problemas de
infertilidad y que han logrado un embarazo durante el transcurso de un año de intentarlo,
deberían ser consideradas normales y fértiles. Esta definición, además de encontrarse
históricamente enraizada en la práctica médica, surge de un cálculo probabílístico, ya
"' ¡ónl
que al considerar que la probabilidad mensual de concepción en las parejas normales es
del 20%, la probabilidad acumulativa de concepción al cabo de 12 meses es del 93%
(Guzick, 1996). Cuando una pareja logra concebir luego de un período de tiempo más
largo, se la considera subfértil', es posible que cierta subfertilidad del hombre haya sido
compensada por una superfertilidad de la mujer, o viceversa. Se estima que,
aproximadamente, l/3 de todas las parejas presenta problemas para concebir en algún
momento de sus vidas, pero pocas de ellas realmente no llegan a tener hijos (Puttemans
et al. 1995).
Es decir que la fertilidad, debe considerarse por un lado como un continuo que se
extiende desde la subfertilidad severa hasta la superfertilidad y por otro, como un
atributo de la pareja y no de la mujer o del hombre específicamente (Mortimer, 1994).
No se puede ya justificar el comienzo de un tratamiento por subfertilidad si no se ha
hecho una evaluación exhaustiva de ambos miembros de la pareja. Solamente la
investigación completa de todos los factores que influyen sobre la infertilidad de una
pareja permitirá desarrollar un algoritmo adecuado para su tratamiento (Puttemans et al.
1995).
Cabe señalar aquí la diferencia que existe entre los términos fertilidad y fecundidad, a
veces utilizados en forma indistinta. La fertilidad se refiere a la capacidad de concebir,
mientras que la fecundidad se refiere a la capacidad de dar a luz un nuevo individuo
(Schmidt, Münster, ¡995).
Se acepta en general que, aproximadamente, el 10% de las parejas necesita consultar o
ser tratado por problemas de infertilidad. Un estudio multicéntrico reciente, que
incluyó una serie de clinicas y centros en distintas partes del mundo, reveló que en el
30% de los casos el problema era fiJndamentalmente masculino, en el 30%
Fundamentalmente femenino, en el 27% combinación de ambos y en el 13% restante no
se pudo encontrar una causa específica para la infertilidad (de Kretser, Baker, 1996).
Infertilidad masculina
En el hombre, la fertilidad implica la producción de espermatozoides funcionales que
puedan ser depositados en la vagina en el momento adecuado, para fecundar un ovocito
y dar origen a un embrión viable. Esta definición parece sencilla pero incluye, en
realidad, una sucesión de eventos biológicos que deben tener lugar exitosamente y que
comprenden desde la adecuada producción de espermatozoides en el testículo hasta la
supervivencia embrionaria y fetal in utero (Tabla l).
Tabla l: Eventos biológicosnormalmente requeridos para lograr un embarazo
Espermatogénesis normalMaduración epididimariaTransporte por los conductos excurrentesDeposición de espermatozoides en la vagina al momento de la ovulaciónPenetración del moco cervicalTransporte a través del tracto femeninoCapacitaciónReconocimiento y unión a la zona pelúcidaReacción acrosomalPenetración de la zonaReconocimiento y fusión con el oolemaPenetración al ooplasmaDescondensación nuclearSingamiaDesarrollo embrionarioimplantación en el úteroSupervivencia embrionaria y fetal
La infertilidad masculina es, pues, un síndrome multifactorial que abarca un amplio
rango de desórdenes (Sherins, ¡995). Las causas conocidas de infertilidad, si bien son
'1Illll
numerosas y de naturaleza muy variada, pueden agruparse en un número moderado de
categorias principales (Sherins, 1995), tal como se señala en la Tabla ll:
Tabla ll: Causas conocidas de la infertilidad masculina
Deficiencia de gonadotrofinasAberraciones cromosómicasDesórdenes genéticosObstrucción de los conductos excurrentesTóxicos ambientalesAlcohol / drogasMedicamentos; quimioterapia; radiaciónEnfermedad sistémica
Enfermedad infecciosa (sistémica y genital)Desorden neurológicoVaricoceleEnfermedad autoinmuneImpotencia
Debe recordarse, de todos modos, que en aproximadamente el 50% de los hombres
infértiles, se desconoce la causa de la infertilidad.
Tradicionalmente, el espermograma ha sido el ensayo utilizado más frecuentemente
como índice de fertilidad en el hombre. Sin embargo, el objetivo principal del andrólogo
de laboratorio, que consiste en predecir adecuadamente la capacidad fertilizante de una
muestra de espermatozoides, es muy dificil o casi imposible de lograr a través de un
espermograma. Ésto es bastante fácil de comprender si se tiene en cuenta Ia
multiplicidad de fiJnciones que el espermatozoide debe llevar a cabo exitosamente para
lograr un embrión viable (Tabla l).
En algunos pocos casos, un espermograma permite llegar a una conclusión definitiva.
Por ejemplo, si existe azoospermia, o ausencia de espermatozoides mótiles, o una muy
elevada proporción de espermatozoides morfológicamente anormales, la fertilidad del
individuo se encontrará notablemente disminuida (Amann et al. 1995). Pero, en la
mayoría de los casos, el desafio es mucho más complejo y no debe sorprendernos que
los parámetros clásicamente evaluados en el espermograma no puedan predecir
adecuadamente la capacidad fertilizante. Si bien se debe reconocer que en general existe
una frecuencia mayor de infertilidad masculina entre individuos cuyos parámetros
seminales clásicos se encuentran francamente disminuidos, hay muchas excepciones.
Algunos hombres oligospérmicos (concentración de espermatozoides inferior a la
normal), embarazan fácilmente a sus mujeres mientras otros hombres con espennograma
normal son infértiles (Sherins, 1995).
Actualmente, se acepta que la funcionalidad espermática y no la concentración de
espermatozoides en semen, es el punto clave que determina si un hombre es o no fértil.
En consecuencia, muchos laboratorios se han dedicado al desarrollo de ensayos que
permitan evaluar distintos aspectos funcionales del espermatozoide, con el objeto de
predecir lo más exactamente posible la capacidad fertilizante de una población dada de
espermatozoides. Este es el caso, por ejemplo, de los criterios estrictos de morfología, el
ensayo hipoosmótico, el ensayo de actividad de acrosina, el ensayo de reacción
acrosomal en respuesta a estímulos fisiológicos y farmacológicos, el ensayo de
penetración de ovocitos de hamster, el ensayo de hemizona (Cummins, 1995; Liu,
Baker, 1992), entre otros.
Sin duda, la evidencia más contundente que apoya esta hipótesis del espermatozoide
funcional, proviene de los estudios llevados a cabo por Sherins y colaboradores, en un
grupo de pacientes con síndrome de Kallman (Burris et al. 1988). Estos pacientes, que
desde el punto de vista reproductivo poseen una deficiencia aislada de gonadotrofinas
por ausencia del factor liberador de las mismas, al ser tratados con gonadotrofma
exógena, son capaces de fertilizar naturalmente a sus esposas en el 95% de los casos. Un
espermograma llevado a cabo en estos pacientes alrededor del momento de la
concepción, puso de manifiesto que la misma se llevó a cabo con concentraciones de
espermatozoides en semen tan pequeñas como 0,5 xlOÓ/ml, valor que se encuentra
notablemente por debajo de los 20x106/ml considerado como límite inferior de
normalidad por la Organización Mundial de la Salud (OMS). En estas mismas muestras
de semen, tanto la motilidad, medida no sólo a través del porcentaje de espermatozoides
mótiles sino mediante un sistema CASA (Computer-Assisted Sperm Analyzer) que
permite determinar objetivamente ciertos parámetros de movimiento, como así también
la morfología, se encontraban dentro del rango normal (Vantman et al. 1989). Es decir,
que no importa realmente cuántos espermatozoides haya en el eyaculado, sino que los
que estén presentes sean fiincionalmente aptos.
Un espermatozoide funcionalmente competente es aquel que puede llevar a cabo con
e'xito la compleja serie de eventos que culmina con la formación de un embrión viable,
hecho que se refleja en su morfología y estructura celular altamente especializadas. Una
o varias fallas en cualquiera de las funciones espermáticas podrían dificultar o impedir la
fertilización y el embarazo. Es más, el espermatozoide humano presenta un elevado
grado de pleomorfismo, de modo que en una misma muestra de semen puede haber
distintas poblaciones de espermatozoides incapaces de fertilizar por diferentes motivos
(Amann et al. l995).
El espermatozoide
La fimción principal del espermatozoide es proveer el pronúcleo masculino del ovocito
fertilizado. Debe ser, pues, capaz de conservar su ADN, transportarlo al sitio de
fertilización, reconocer al ovocito y fusionarse con él (Curry, Watson, 1995).
La apariencia general del espermatozoide fue descripta por Anthony van Leeuwenhoek
I A l 'llllll 8
(Houtzager, 1983) en 1677, quien lo observó por primera vez al microscopio y describió
su estructura básica y su comportamiento natatorio. Los avances de la microscopía
óptica durante el siglo XIX, en realidad sólo amplificaron la descripción original de las
características externas de van Leeuwenhoek. Recién en el siglo XX, el desarrollo de la
microscopía electrónica de transmisión en la década del 50 permitió elucidar la compleja
estructura interna del espermatozoide.
El espermatozoide puede dividirse en dos partes fundamentales: el flagelo, relacionado
con la producción de energía y con la iniciación y el mantenimiento de la motilidad y la
cabeza, que contiene el ADN y participa en los mecanismos de reconocimiento de la
zona y fusión con el ovocito. (Figura l). Dentro de estas dos regiones, a su vez, se
pueden distinguir diferentes compartimientos celulares, cada uno de ellos asociado a una
fiJnción específica. Esta compartimentalización es una característica importantísima de
la estructura del espermatozoide, que le permite llevar a cabo la variedad de tareas que
culmina con la formación de un embrión viable.
La cabeza del espermatozoide, que comprende el núcleo y el acrosoma (Figura 2), se
divide comúnmente en dos regiones: acrosomal y postacrosomal (Figura l). Si bien la
organización básica de la cabeza es semejante para todos los mamíferos, la forma y el
tamaño de núcleo y acrosoma son altamente variables y específicos de especie. En el
hombre, la cabeza del espermatozoide presenta un alto grado de heterogeneidad
morfológica, conocido como pleomorfismo, que hace muy dificil definir la forma
normal. De todos modos, se considera normal a una cabeza de forma ovalada, con un
largo aproximado de 4,5-5 pm y un ancho de 2,5-3 pm en su parte más ancha, ya que
éstas son las características de los espermatozoides que han podido recuperarse del
moco cervical.
l Región awesome! Manel-na
Regiónposlacmsoml
CABEZAM- .fl
Guelo
Pieia a
Pieza .7pt'ncipal
COLA
Vaina Columnafibrosa longitudinal
Piezafinal
Figura 1: Fotografía de un espermatozoide humano morfológicamente normal yesquema del mismo, señalando las principales estructuras. A la derecha se señalanlos componentes de la cola en corte transversal a nivel de la pieza media y la piezaprincipal. (Tomado de Matsumoto, 1996).
El acrosoma es una vesícula que cubre como un capuchón a la parte anterior del núcleo.
En el hombre, el acrosoma es relativamente pequeño y rodea, aproximadamente, las 2/3
partes del núcleo. La membrana acrosomal externa (Figura 2) se encuentra
inmediatamente por debajo de la membrana plasmática del espermatozoide y se
continúa, en los extremos posteriores del capuchón, con la membrana acrosoma!
interna que cubre al envoltorio nuclear.
Las membranas acrosomales encierran a la matriz acrosomal que es rica en
carbohidratos y contiene una serie de enzimas líticas, de las cuales las más importantes y
mejor caracterizadas son la hialuronidasa y la acrosina. Estas enzimas son utilizadas
por el espermatozoide para atravesar los distintos envoltorios del ovocito. Hay
evidencias de que las enzimas acrosomales no se encuentran distribuidas al azar dentro
del acrosoma, sino empaquetadas, lo que permite su activación y liberación secuencial
(Holt, 1979). Las enzimas acrosomales son liberadas durante el transcurso de la
reacción acrosomal, evento exocitótico fundamental para que se lleve a cabo la
fertilización.
El borde posterior del acrosoma, conocido como segmento ecuatorial (Figura 2), es
una zona altamente especializada. Las características de las membranas acrosomales de
esta zona, observables al microscopio electrónico, sugieren que se trata de una
estructura muy estable que probablemente interactúa extensivamente con el
citoesqueleto (Virtanen et al. 1984). En el hombre, el segmento ecuatorial tiene forma
de medialuna y, en su zona más ancha, llega a tener hasta l/4 de la longitud total del
acrosoma. La membrana plasmática que cubre el segmento ecuatorial es el sitio de
reconocimiento del oolema y eventualmente, de fusión de membranas de espermatozoide
y ovocito (Yanagimachi, 1988).
MEMBRANASPlasmática
Acrosomalexterna ACVOSOma
Acrosomal interna ÁEnvollura nuclear 'Nu eo
l
Segmentoecuatori'áí *'
Región postacrosomal
..... >¿ Anilloposterior
Pieza media
Figura 2: Estructura de la cabeza del espermatozoide humano. La membranaplasmática recubre la membrana acrosomal externa. La membrana acrosomalinterna recubre el envoltorio nuclear. El acrosoma es más delgado en la región delsegmento ecuatorial que en la región anterior. (Tomado de (Yanagimachi, 1994))
El núcleo del espermatozoide contiene un número haploide de cromosomas y el ADN es
completamente inactivo y no se replica hasta que se encuentra dentro del ooplasma. La
forma del núcleo es altamente específica de especie y determinada por el genotipo. Si
bien en casi todas las especies tiene un alto grado de uniformidad, en el hombre existe
una gran variedad de formas nucleares, que podrían estar asociadas al grado de
condensación de la cromatina.
El flagelo está vinculado a la motilidad del espermatozoide y contiene tanto el sistema
generador de energia, las mitocondrias, como el aparato propulsor de la célula: el
axonema o filamento axial. El flagelo del espermatozoide humano puede dividirse en
cuatro regiones principales: la pieza conectora o cuello, la pieza media, la pieza
principal y la pieza final (Figura l). La anatomía característica de cada una de estas
regiones está directamente relacionada con su función.
Interacción con el ovocito
Un aspecto fiJndamental de la funcionalidad espermática es la interacción con el ovocito,
ya sea in vivo, en el sitio de fertilización (ampula de la Trompa de Falopio) o in vitro,
durante un procedimiento de fertilización asistida.
Una fertilización exitosa es el resultado de la interacción eficaz del espermatozoide
con un ovocito que finalmente culmina con la fusión del material genético de ambas
gametas. La Figura 3 sintetiza la progresión de eventos desde que el espermatozoide
entra en contacto con el ovocito hasta que se produce su incorporación al ooplasma.
1- Unión del _ , l 'espermatozoide' k . 2- Reaccuón acrosomalalazona
,Acrosoma
"53-Penetración atravésOolema 7*' de la zona pelúcida
Zona pelúcida 4 A
4- Fusión de membranasplasmáticas
5- Espermatozoideentra al ooplasma
Figura 3: Progresión de eventos desde que el espermatozoíde entra en contacto conlas células folículares del cumulus hasta que se produce su ingreso al ooplasma.(Tomado de (Alberts et al. 1994))
Los ovocitos de los mamíferos euteríos están rodeados por el cumulus oophorus,
constituido por células foliculares y una matriz extracelular, cuyo principal
componente es ácido hialurónico polímerizado. Esta estructura es la primera barrera que
presenta el ovocito a un espermatozoide fertilizante. Se pensó en un momento que,
normalmente, habría un gran número de espermatozoides rodeando al cumulus y
favoreciendo su dispersión, para que alguno de ellos pudiera penetrar el ovocito. Sin
embargo, se sabe ahora que in vivo, la relación espermatozoíde / ovocito en el sitio de
fertilización es muy cercana a la unidad, de modo que es probable que en la mayoría de
los mamíferos, el cumulus se disperse luego de la fertilización (Blandau, 196]).
En la actualidad, se acepta que los espermatozoides deben estar capacitados pero
intactos (no reaccionados) para poder penetrar el cumulus (Yanagimachi, 1994); los
espermatozoides no capacitados, o aquéllos que se encuentran totalmente reaccionados
al llegar al cumulus, pueden adherirse a él pero no son capaces de penetrarlo.
Capacitación
Los espermatozoides humanos, al igual que los de los demás mamíferos euterios, no son
capaces de fertilizar al ovocito inmediatamente después de la eyaculación. Deben sufrir
el proceso de capacitación (Bedford, 1983; Chang, ¡984), que se define operativamente
como la adquisición de capacidad para sufrir la reacción acrosomal en respuesta al
estímulo adecuado (Yanagimachi, 1988). La capacitación es necesaria para la
fertilización tanto in vivo como in vitro y comienza, en realidad, ni bien los
espermatozoides se separan del ambiente inhíbítorio del plasma seminal (Burkman,
1995). Estudios recientes indican que in vivo la capacitación requiere una comunicación
estrecha entre el espermatozoíde y el tracto genital femenino (Mortimer, 1995). Se
piensa que ¡n vivo, los espermatozoides podrían alcanzar los estadios finales de la
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capacitación durante su permanencia en el istmo de la trompa de Falopio, para así llegar
completamente capacitados al sitio de fertilización.
El tiempo necesario para la capacitación varía para las distintas especies (Yanagimachi,
1994) y para distintos individuos dentro de una misma especie; incluso puede ser
diferente para distintos espermatozoides dentro de un mismo eyaculado. Por otra parte,
es probable que la capacitación ¡n vivo ocurra más rápidamente que lo que ocurre in
vitro: es posible que el tracto genital femenino sea capaz de mantener a los
espermatozoides capacitados por períodos de tiempo largos sin que ocurra la reacción
acrosomal, como sucede in vitro (Mortimer, 1995). El tiempo requerido para capacitar
espermatozoides humanos in vitro parece ser muy variable (Perreault, Rogers, 1982); el
tiempo de capacitación in vivo, en el humano, no se conoce aún.
Desde el punto de vista celular, la capacitación incluye cambios morfológicos,
bioquímicos y funcionales, como consecuencia de los cuales los espermatozoides
adquieren capacidad de sufrir la reacción acrosomal y penetrar al ovocito (Yanagimachi,
1994). Quizás, el cambio más notorio durante la capacitación es el que se produce en la
motilidad, que se vuelve extremadamente vigorosa pero poco progresiva y se conoce
como motilidad hiperactivada (Yanagimachi, 1988). Este tipo de motilidad es
necesario para dotar al espermatozoide de la fiJerza mecánica requerida para penetrar la
zona pelúcida (Fleming, Yanagimachi, 1982), probablemente, también para un
transporte efectivo en el oviducto y penetración a través del cumulus (Katz et al. 1989).
En los animales de laboratorio, la motilidad hiperactivada aparece en forma más o menos
sincrónica cuando los espermatozoides se incuban in vitro en un medio adecuado: en el
hamster, por ejemplo, se observa un 70% de espermatozoides hiperactivados luego de 3
horas de incubación (White, Aitken, 1989). En el hombre, en cambio, el porcentaje de
hiperactivación puede variar entre el 3% y el 50% para distintas suspensiones de
' A I :Illll ¡6
espermatozoides (Burkman, 1990) y además, existe una gran variabilidad en la cinética
de hiperactivación para distintas células de una misma muestra. Por otra parte, se han
descripto distintos tipos de espermatozoides hiperactivados (Burkman, 1990) y
característicamente, el espermatozoide humano tiene un comportamiento multifásico, es
decir, puede cambiar espontáneamente de un tipo de hiperactivación a otro o, incluso,
del estado hiperactivado al no hiperactivado (Figura 4).
Todas estas características hacen que sea bastante dificil identificar este tipo de
movimiento en las suspensiones de espermatozoides humanos y que, recién con el
advenimiento de los sistemas de análisis computarizado, se haya logrado avanzar en el
estudio de la hiperactivación en el hombre y su significado funcional. Se ha propuesto
que la hiperactivación es un indicador del éxito en FIV, ya que niveles bajos de
hiperactivación se asocian con una unión deficiente a la zona pelúcida y con una
fertilización reducida (Mbizvo, Alexander, l99l; Burkman, 1995).
Reacción acrosomal
La reacción acrosomal es un evento exocitótico que implica la fiJsión de las membranas
plasmática y acrosomal externa, seguida de la formación de vesículas y consecuente
liberación del contenido acrosomal, fimdamentalmente hialuronidasa y acrosina, a través
de los orificios entre las vesículas (Figura 5).
El sitio en el cual comienza la fiJsíón de membranas puede variar de acuerdo con la
especie; en el humano parecería comenzar en la región anterior del acrosoma (Yudin et
al. 1988).
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IP.. . y/
,, Hiperactivado Hel'co'da' _ _ \. " a? , Hlperactnvado Nx
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Figura 4: Comportamiento multifásico de espermatozoides humanos, durante elcual las células cambian espontáneamente de un movimiento transicional a unmovimiento hiperactivado. Se señalan dos tipos de movimiento hiperactivado:helicoidal y estrellado o “star-spin”. (Tomado de (Aitken, 1995))
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Figura 5: Esquema que ilustra el progreso de la reacción acrosomal. (A)
Espermatozoide antes de reaccionar. Ac=acrosoma; SE=segmento ecuatorial (B)
Comienza la reacción con múltiples puntos de fusión entre las membranas
plasmática y acrosomal externa y salida del contenido acrosomal. (C) y (D) La
reacción acrosomal se completa. MA|= membrana acrosomal interna. (Tomado de
(Yanagimachi, 1994))
Cuando la capacitación ha sido completa, los espermatozoides inician y completan la
reacción acrosomal muy rápidamente al recibir el estímulo adecuado. En el humano, en
espermatozoides capacitados, se observa fusión de las membranas plasmática y
acrosomal externa luego de 5 a lO segundos de exposición a fluido folicular; la reacción
se ha completado, con dispersión de la matriz acrosomal, al cabo de los 3 minutos
(Yudin et al. 1988) (Figura 6).
Dado que el acrosoma contiene una variedad de enzimas líticas, puede ser autodigerido
por espermatozoides moribundos o ya muertos, a causa de la pérdida de selectividad de
su membrana plasmática (Yanagimachi, 1994). Al microscopio óptico, estos
espermatozoides cuyos acrosomas degeneran a causa de la muerte celular son
semejantes a aquéllos que reaccionan fisiológicamente. Es por eso que se ha sugerido
llamarfalsa a este tipo de reacción acrosomal, para distinguirla de la reacción acrosomal
verdadera que tiene lugar en espermatozoides vivos (Bedford, 1970).
La reacción acrosomal falsa, asociada con la muerte celular, ocurre continuamente en
el tracto genital femenino, que, en general, es bastante hostil al espermatozoide.
Solamente aquellos espermatozoides que se encuentren en el lugar correcto en el
momento oportuno permanecerán vivos dentro del tracto. Existen evidencias que
indican que casi todos los espermatozoides vivos en el moco cervical (Zinaman et al.
1989), el útero (Overstreet, Cooper, 1979) y el istmo de la trompa de Falopio (Smith,
Yanagimachi, 1989) tienen sus acrosomas intactos. Algunos espermatozoides podrían
iniciar la reacción acrosomal dentro del cumulus, pero todo parecería indicar que los
espermatozoides fertilizantes no comienzan su reacción acrosomal in vivo hasta que
entran en contacto con la zona pelúcida (Yanagimachi, 1994)
Figura 6: Reacción acrosomal en espermatozoides humanos en presencia de fluidofolicular humano (hFF). (A) Espermatozoide capacitado, no reaccionado. (B) 5segundos luego de exposición a hFF la matriz acrosomal está hinchada (flecha).Las puntas de flecha señalan las membranas acrosomales externa e interna. (C) 10segundos luego de exposición a hFF las membranas acrosomales externa e internacomienzan a fusionarse a la altura de la región anterior del acrosoma. (D) 20segundos luego de exposición a hFF aparecen vesículas (V) híbridas formadas pormembrana plasmática y membrana acrosomal externa. La vesiculización m seextiende al segmento ecuatorial (SE). MAI= membrana acrosomal interna; MA=matriz acrosomal. (E) Espermatozoide reaccionado con su SE intacto. (Tomado de(Yudin et al. 1988; Thomas, Meizel, 1988))
La capacidad de la zona pelúcida de inducir la reacción acrosomal ha sido confirmada en
una gran variedad de especies, inclusive el hombre (Cross et al. 1988). El mecanismo
mediante el cual las moléculas de la zona disparan la reacción acrosomal ha sido muy
estudiado, especialmente en el ratón, para el cual se ha aislado la proteína responsable de
la inducción, ZP; (Bleil, Wassarman, 1980), que tendría su equivalente en el humano
(Chamberlin, Dean, ¡990). Todo parece indicar que los espermatozoides comparten
gran parte de los mecanismos de transducción de señales con las células somáticas. Sin
embargo, dado que la reacción acrosomal es un evento terminal que ocurre muy
rápidamente, es probable que los espermatozoides utilicen algún sistema de transducción
más sencillo que los de otros tipos celulares (Yanagimachi, 1994).
Sin duda el influjo de calcio, el aumento del pH intracelular y la producción de
compuestos fusogénicos son necesarios para la reacción acrosomal (Yanagimachi,
1994). El influjo masivo de iones Caz' se produciría, tanto como consecuencia de la
activación de proteínas transportadoras de membrana, canales de Caz' voltaje
dependientes, como por inactivación de una bomba de calcio, dependiente de ATP. Esta
Ca-ATPasa mantiene bajos los niveles de calcio intracelular en el espermatozoide, ya
que fiJnciona constantemente para remover el exceso de este ion; los tratamientos que la
inactivan provocan una acumulación intracelular de calcio e inducen la reacción
acrosomal (Aitken, 1995). Los niveles intracelulares elevados de calcio activarían una
Na'/K'-ATPasa, que produce un rápido aumento en los niveles de Ki intracelular. Esto,
a su vez, on'ginaria una expulsión de H’ de la célula a través de un Nai/H' “antiporter” y
el consiguiente aumento del pH intracelular, que podría ser importante para optimizar el
fiJncionamiento de las enzimas acrosomales (Aitken, 1995). Estos movimientos de iones
estarían mediados por nucleótidos cíclicos; tanto éstos como los inhibidores de la
fosfodiesterasa estimulan la capacitación y la reacción acrosomal (Mortimer, 1995). Por
otra parte, el aumento de calcio intracelular activaría una fosfolipasa C que produce
diacilglicerol (DAG) e inositol trifosfato a partir de fosfoinositol difosfato (Ple). El
DAG así producido, junto con el Caz', estimularía una fosfolipasa A, dando lugar a
lisofosfatidilcolina y ácido araquidónico, ambos de naturaleza fiJsogénica (Roldan,
Harrison, 1990).
In virro, la reacción acrosomal puede ocurrir espontáneamente, por ejemplo cuando los
espermatozoides se incuban durante tiempos prolongados. Se considera que esta
reacción espontánea no es fisiológica ya que, en los espermatozoides fertilizantes, la
misma tiene lugar sobre la superficie de la zona y no en el medio de incubación.
Alternativamente, la reacción acrosomal puede ser inducida por una serie de agentes
fisiológicos, como por ejemplo la progesterona (Osman et al. 1989; Morales et al.
1992) o farmacológicos como el ionóforo A23187 (Aitken et al. 1993) que elevan los
niveles de calcio intracelular. Es importante notar que la mayoría de los estímulos
conocidos, independientemente de su naturaleza, no puede inducir la reacción acrosomal
si los espermatozoides no están capacitados. La membrana de un espermatozoide no
capacitado parecería ser inaccesible o incapaz de responder a los distintos estímulos,
incluyendo la proteína ZP; de la zona pelúcida (Yanagimachi, 1994).
Reconocimiento y penetración de la Zona Pelúcida
La zona pelúcida es una cubierta glicoproteica que rodea al ovocito y protege al ovocito
y al embrión recién formado de daño fisico (Nichols, Gardner, ¡989). Constituye la
última barrera fisica que debe atravesar el espermatozoide antes de fertilizar, e incluye
parte de los mecanismos que posee el ovocito para impedir la polisperrnia. A pesar de
que se puede lograr fertilización y desarrollo embrionario preimplantatorio normales in
vitro, en ausencia de la zona, ésta es necesaria para el desarrollo preimplantatorio ¡n
vivo.
Los espermatozoides capacitados se unen fuertemente a la superficie de la zona pelúcida
' A J :Illll
antes de penetrarla. Esta unión está mediada por la interacción entre moléculas de
superficie de la zona y el espermatozoide. Se han descripto receptores en la zona
capaces de reconocer glicoproteínas de membrana del espennatozoide en muchas
especies, incluyendo al humano (Yanagimachi, 1994; Chamberlin, Dean, 1990). Se
acepta actualmente, incluso en el hombre, que el espermatozoide fertilizante debe
llegar intacto a la zona pelúcida: solamente se encuentran espermatozoides intactos
hundidos en la zona pelúcida, mientras que aquéllos presentes en el espacio perivitelino
han reaccionado completamente (Sathananthan et al. 1982).
Fusión con el ovocito y Singamia
El espermatozoide que ha atravesado la zona pelúcida y pasa rápidamente a través del
espacio perivitelino, une su cabeza a la membrana plasmática del ovocito (oolema) y,
completo, es incorporado al citoplasma de la ce'lula (ooplasma). En los mamíferos
euterios, la fiJsión con el oolema comienza en la membrana plasmática del
espermatozoide, a la altura del segmento ecuatorial (Bedford, Cooper, 1978).
La reacción acrosomal es requisito indispensable para que se produzca la fusión
con el oolema: los espermatozoides intactos, aunque estén capacitados, no pueden
fusionarse (Yanagimachi, 1981). Esto sugiere que, concomitantemente con la reacción
acrosomal o como resultado de la misma, la membrana plasmática que cubre el
segmento ecuatorial sufre un importante cambio fisiológico que torna al espermatozoide
competente para la fiJsión (Yanagimachi, ¡981).
Se han propuesto distintas proteínas como mediadoras de la fusión espermatozoide
ovocito en distintas especies, incluyendo al humano (Okabe et al. 1990; Fusi, Bronson,
¡992; Fusi et al. ¡991; Miranda, Tezón, ¡992).
La función del espermatozoide no acaba una vez que ha logrado penetrar al oolema.
Todavía es necesario que se produzca una serie de cambios en el ámbito nuclear que
culminará con la formación del pronúcleo masculino: el ovocito fertilizado se ha
convertido asi en un cigoto. Los pronúcleos masculino y femenino convergen y sus
envoltorios nucleares se desintegran. Los cromosomas de ambas gametas son liberados
al ooplasma y comienza la primera división celular: se ha completado la singamia y se
ha creado un individuo genéticamente nuevo.
Los ensayos diagnósticos en el laboratorio de Andrología
El estudio de la infertilidad masculina en el laboratorio de Andrología ha avanzado
considerablemente durante los últimos años. Sin embargo, muchas veces resulta dificil
encontrar el verdadero valor de los ensayos existentes tanto desde el punto de vista del
diagnóstico de la infertilidad masculina como del pronóstico de éxito de un tratamiento
de fertilización asistida (Yovich, Matson, 1995). (Boyers et al. 1989) sugieren que los
criterios que predicen el éxito de una fertilización in vitro deben considerarse necesarios
pero no suficientes para predecir la capacidad fertilizante de un individuo.
Para que cualquier ensayo de fertilidad sea de valor debe tener una base biológica firme
y debe ser capaz de discriminar entre grupos de individuos fértiles e infértiles. Esto ya
presenta un problema pues, en la vida real, las distribuciones de los valores de los
parámetros espermáticos para individuos fértiles e infértiles se superponen
considerablemente (Figura 7).
En consecuencia, es casi imposible encontrar un valor de corte para un parámetro dado,
que pueda distinguir perfectamente individuos fértiles de los que no lo son. Algunos
individuos fértiles presentarán un valor “anormal” con respecto al valor de corte (falsos
positivos) mientras que algunos individuos infértiles presentarán un valor “normal” con
InfértilesFértiles
N'deindividuos
Variable seminal
Figura 7: Distribución característica de un parámetro seminal cualquiera parauna población de hombres fértiles y para una población de pacientes infértiles.(Tomado de (Boyers et al. 1989))
' A l :l’lll
respecto al valor de corte (falsos negativos). Se trata, pues, de encontrar un ensayo con
un valor de corte que posea el máximo poder discriminatorio minimizando los falsos
positivos y negativos (Figura 8).
Además, el ensayo será útil siempre y cuando posea cierto grado de reproducibilidad,
de modo que la repetición del ensayo en un mismo paciente no proporcione resultados
conflictivos. La variabilidad en la técnica puede superarse a través de la utilización de
protocolos cuidadosamente estandarizados y mecanismos de control interno. Pero en el
caso de los espermatozoides humanos, existe una gran variabilidad biológica que
puede comprometer significativamente la reproducibilidad de un ensayo. Así, a veces,
distintos grupos de trabajo informan resultados que a priori parecerían contradictorios,
pero en realidad sucede que los resultados obtenidos para una población de pacientes no
son necesariamente extrapolables a otras poblaciones, incluso cuando las condiciones del
ensayo se hayan duplicado cuidadosamente.
La variabilidad biológica inherente a los espermatozoides obliga, por otra parte, a
llevar a cabo cualquier ensayo, incluso un espermograma básico, más de una vez. Esto
es particularmente cierto frente a un resultado anormal, ya que se ha demostrado
claramente que incluso los donantes fértiles pueden, ocasionalmente, presentar valores
anormales en sus parámetros espermáticos (Clark, Sherins, 1986).
El progreso continuado de los laboratorios de primer nivel dedicados a la investigación
meticulosa del proceso de fertilización y la fiJncionalidad espermática es fiJndamental
para el desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico andrológico. Sin embargo, la
transición de un ensayo promisorio a un ensayo válido debe ser llevada a cabo con
sumo cuidado y siguiendo un análisis riguroso (Yovich, Matson, 1995). Se han utilizado
diversos enfoques estadísticos, que incluyen análisis no parametricos, modelos de
Valor de cortedelensayo
g Población Fértil
NegativosVerdaderos
FalsosPositivos
PositivosVerdaderosFalsos
Negativos
EL Población Infértil I
Figura 8: Diagrama que muestra la superposición casi inevitable que ocurre en laincidencia de una determinada condición clínica, en este caso la infertilidad,cuando se aplica un único ensayo diagnóstico a la medida de dicha condiciónclínica. (Tomado de (Cummins, 1995))
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regresión logística y análisis de variables múltiples. Sin duda, se requieren más estudios
con mayor número de casos para determinar el verdadero valor predictivo de los
ensayos de funcionalidad espermática y cómo éstos pueden contribuir a la toma de
decisiones terapéuticas. Muchos ensayos se encuentran, todavía, en estado experimental
pero pueden, sin embargo, ayudar al andrólogo clínico en su búsqueda de un diagnóstico
fisiopatológico en algunos casos individuales (Oehninger, 1995)
Por último, es importante tener en claro que cualquier ensayo evaluará un aspecto muy
particular del proceso de fertilización, de modo que no se deben tener falsas expectativas
con respecto a una utilidad generalizada, aún cuando se haya establecido su validez. En
realidad, lo ideal sería contar con un amplio espectro de ensayos que pudieran
complementarse y ayudaran así a obtener una visión integral de la situación del paciente
y su pareja.
Propiedades de un ensayo diagnóstico
Desde un punto de vista predictivo, un ensayo diagnóstico debe distinguir entre un
estado normal y uno anormal de una dada condición fisiopatológica y su resultado debe
poder predecir a qué grupo, normal o anormal, pertenece un paciente dado. Para
cualquier análisis de fiJncionalidad espermática, el ensayo debe ser capaz de diferenciar a
aquellos individuos que conciben de los que no lo hacen y el resultado del test debe
poder predecir si el paciente en cuestión podrá o no concebir (Collins, 1996).
La variabilidad natural dificulta la exactitud de estas predicciones, de modo que se ha
desarrollado un sistema para describir la exactitud de un ensayo diagnóstico o, en
realidad, para expresar sus imperfecciones: las propiedades del ensayo diagnóstico.
Las propiedades más conocidas de un ensayo diagnóstico son sensibilidad,
especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo. La definición de
estas propiedades se basa en una tabla de 2 x 2 que expresa las relaciones entre las 4
posibles combinaciones de resultado del ensayo y presencia de una condición patológica
(Tabla lll).
Tabla lll: Tabla de 2x2 que define las propiedades de un ensayo diagnóstico
Resultado del ensayo Condición patológica presente Condición patológica ausente
Anormal a (positivos verdaderos) b (falsos positivos)
Normal c (falsos negativos) d (negativos verdaderos)
Las letras a, b, c, d, representan el número de pacientes en cada grupo.
Valor predictivo negativo = proporción de pacientes normales en el ensayo que no
presentan la patología = d / (c+d)
Valor predictivo positivo
presentan la patología = a / (a+b)
proporción de pacientes anormales en el ensayo que
Sensibilidad = proporción de pacientes que presentan la patología y que son anormales
en el ensayo = a / (a+c)
Especificidad = proporción de pacientes que no presentan la patología y que son
normales en el ensayo = d / (b+d)
Las propiedades más útiles desde el punto de vista clínico son los valores predictivos,
ya que indican para un resultado determinado del ensayo, la probabilidad de presencia
(positivo) o ausencia (negativo) de una condición patológica. En cambio, la sensibilidad
simplemente señala la probabilidad de obtener un ensayo anormal dentro de una
población de individuos que se sabe son anormales y la especificidad, en cambio, la
probabilidad de obtener un ensayo normal dentro de una población de individuos que se
sabe son normales. Esta información no resulta útil al profesional de la salud, quien
pretende informar al paciente, con el resultado del ensayo en mano, la probabilidad de
que presente una condición patológica dada (Collins, 1996).
Al llevar a cabo un estudio poblacional para evaluar un ensayo diagnóstico, es
especialmente importante minimizar la selección previa de los sujetos que participan en
e'l, lo cual puede lograrse a trave's de una incorporación secuencial e indiscriminada de
individuos al estudio, de modo que todos los sujetos que se presentan participen del
mismo (Collins, 1996).
El ensayo de reacción acrosomal en respuesta a fluido folicular
Tal como se señalara anteriormente, la reacción acrosomal en el hombre ¡n vivo
parecería ocurrir luego de que el espermatozoide se ha unido a la zona pelúcida y seria
inducida por una proteina específica de la zona pelúcida. Dado que la reacción
acrosomal es un prerrequisito de la fertilización, se podria especular entonces, que la
infertilidad observada en algunos pacientes infértiles obedeciera a una incapacidad de los
espermatozoides de sufrir la reacción acrosomal.
In vitro, la reacción acrosomal de espermatozoides humanos puede ser inducida por una
variedad de estímulos: zona pelúcida solubilizada (Cross et al. 1988), secreciones de
células foliculares (Tesarik, 1985), fluido folicular (Suarez et al. 1986), progesterona
(Osman et al. 1989), lisofosfolipidos (Byrd, Wolf, 1986), ionóforo de calcio (Aitken et
al. 1984). Resultó bastante lógico pues, para aquéllos que buscamos mejorar la
evaluación andrológica de pacientes infértiles, imaginar que un ensayo de reacción
acrosomal ¡n vitro podría ser de utilidad para la identificación de una subpoblación de
pacientes infértiles. Surgieron, así, distintos protocolos de trabajo, utilizando distintos
agentes inductores de la reacción acrosomal y con la aplicación de distintas técnicas para
la evaluación del estado del acrosoma (Tan'n, Trounson, 1993).
En nuestro laboratorio se optó por estudiar el fenómeno de la reacción acrosomal en
respuesta a la estimulación por fluido folicular humano con miras al desarrollo de un
ensayo diagnóstico que permitiera evaluar la capacidad fertilizante de una muestra de
espermatozoides. El fluido folicular humano (hFF) sin duda constituye un estimulante
fisiológico de la reacción acrosomal, ya que se encuentra normalmente atrapado entre
las células del cumulus que rodean al ovocito recién ovulado.
El hFF es capaz de inducir la reacción acrosomal en espermatozoides humanos de
donantes fértiles, previamente capacitados (Suarez et al. 1986). Estudios
ultraestructurales han puesto de manifiesto que los espermatozoides capacitados
reaccionan muy rápidamente (segundos) al colocarlos en contacto con hFF y que,
morfológicamente, la reacción acrosomal transcurre en forma semejante a otras especies
(Yudin et al. 1988). Es decir, se produce a través de la fusión de las membranas
plasmática y acrosomal externa, con formación de vesículas híbridas, seguida de una
rápida solubilización de la matriz acrosomal (Figura 6). Tal como se mencionara
anteriormente, el sitio de iniciación de la reacción, parecería ser la zona anterior del
acrosoma y , desde allí, la fusión se propagaría hacia el segmento ecuatorial (Yudin et al.
1988).
El fluido folicular contiene varias moléculas que pueden iniciar la reacción acrosomal en
distintas especies (Meizel, 1988). En el humano, se ha descripto más de un posible
inductor fisiológico.
Siiteri et al. 1988 encontraron actividad inductora de la reacción acrosomal asociada a
una fracción de peso molecular 50.000 y propusieron que la misma podría ser o bien la
porción glicosídica de una glicoproteína N-glicosilada, o un factor de bajo peso
molecular no covalentemente unido a una proteína N-glicosilada, o, por último, dos
factores independiemtes, uno de alto y otro de bajo peso molecular no covalentemente
unido a otra molécula de alto peso molecular.
Por otra parte, se ha encontrado que la progesterona y l7-l-IO-progesterona son capaces
de estimular la reacción acrosomal de espermatozoides humanos ¡n vitro (Osman et al.
1989; Blackmore et al. 1990), si bien ninguna de las dos, separadamente o combinadas,
logra un nivel de reacción acrosomal comparable al del fluido folicular (Meizel et al.
1990). La progesterona ejercería su acción a través de un receptor no genómico
presente en la membrana plasmática del espennatozoide (Blackmore, Lattanzio, 199];
Tesarik et al. 1992), que podría estar acoplado a un canal de calcio, actuar él mismo
como canal de calcio o promover la inhibición de la Ca-ATPasa de membrana. Si bien la
existencia de un receptor para progesterona en la membrana contrastaría con el clásico
mecanismo de acción de los esteroides, podn'a por otra parte explicar el aumento rápido
en los niveles intracelulares de Ca2° inducido por la progesterona (Osman et al. 1989).
Otros investigadores no han logrado inducir la reacción acrosomal en espermatozoides
humanos con progesterona sóla, sino que han postulado la necesidad de que la misma se
encuentre asociada a un factor proteico, que parecería ser idéntico a la proteína
transportadora de corticosterona, CBG (Fehl et al. 1995).
También se ha descripto la inducción de reacción acrosomal en espermatozoides
humanos por un factor proteico de peso molecular mayor a 180.000 compuesto por
subunidades de peso molecular 50.000 y 29.000, cuyos extremos N-terminales presentan
un 100% de homología con las cadenas pesada y liviana de la lgG humana (Saragüeta et
al. 1994).
Es probable que todas estas sustancias presentes en el fluido folicular, que
individualmente son capaces de inducir la reacción acrosomal, constituyan in vivo
mecanismos alternativos o sinérgicos, destinados a maximizar la posibilidad de éxito en
la respuesta.
Sea cual fuere el/los iniciador/es de la reacción acrosomal presente/s en el fluido, su
mecanismo de acción parecería ocurrir a través de la estimulación de al menos dos
mecanismos de transducción de señales: el de la adenilato ciclasa / AMPc / protein
quinasa A y el del diacilglicerol / proteín-quinasa C (De Jonge et al. 1993).
El fluido folicular puede obtenerse en cantidades abundantes y a muy bajo costo en un
centro de fertilización asistida y, como ya se mencionara, es un estimulante fisiológico
de la reacción acrosomal, pues requiere la participación activa de receptores de
membrana del espermatozoide y/o sistemas de transducción de señales (Zaneveld et al.
1991). Si bien no existe certeza de que las moléculas inductoras de la reacción
acrosomal in vitro sean las mismas que actúan in vivo, los resultados de reacción
acrosomal obtenidos in vitro con fluido folicular serían más fácilmente extrapolables a lo
que podn'a ocurrir ¡n vivo, en presencia del ovocito, que aquéllos obtenidos con otros
inductores que el espermatozoide normalmente no encontraría en su trayecto por el
tracto genital femenino.
OBJETIVOS
nhínlivne 35
Podríamos decir que uno de los mayores desafios para el andrólogo es determinar si una
dada muestra de espermatozoides podrá o no fertilizar un ovocito. Se han llevado a cabo
muchos estudios para correlacionar las características seminales y los diferentes ensayos
de fiJncionalidad espennática con el éxito en FIV. La mayoría de estos ha demostrado la
existencia de algún tipo de correlación, pero casi ninguno ha validado los resultados
obtenidos con un estudio prospectivo sobre un nuevo grupo de individuos.
El objetivo final de este trabajo fue evaluar el valor clínico del ensayo de reacción
acrosomal de espermatozoides humanos en respuesta al fluido folicular como medida de
la capacidad fertilizante de una muestra de espermatozoides.
A lo largo del camino recorrido, se plantearon una serie de objetivos parciales que,
escalonadamente, permitieron acercarse a la meta deseada:
l. Establecer las condiciones óptimas de ensayo para la determinación de la reacción
acrosomal inducida por fluido folicular humano en espermatozoides humanos.
2. Estudiar la influencia de la composición salina del medio de capacitación y del
suplemento proteico del mismo sobre el ensayo de reacción acrosomal.
Estudiar la distribución y variación de la reacción acrosomal inducida por fluidob)
folicular en la población normal (dadores voluntarios de fertilidad comprobada).
4. Estudiar la distribución y variación de la reacción acrosomal inducida por fluido
folicular en una población de pacientes infértiles.
nh ¡06an 36
5. Analizar el valor pronóstico de la reacción acrosomal, inducida por fluido folicular,
como medida de la capacidad fertilizante in vitro de una muestra de espermatozoides
humanos.
6. Construir un modelo para predecir la capacidad fertilizante in vitro de una muestrade espermatozoides humanos.
MATERIALES Y METODOS
Manu-¡aloe y Mómllnc 38
l. SUJETOS ESTUDIADOS
l.l. Población normal
La población normal estudiada está compuesta por 58 dadores voluntarios de fertilidad
comprobada, ya sea participantes del programa de donación de espermatozoides del
Fairfax Cryobank, con evidencias continuas de fertilidad, o dadores voluntarios que
hubieran concebido en el transcurso del último año.
1.2. Población infértil
La población infértil estudiada consta de 232 hombres, pertenecientes a parejas que se
presentaron secuencialmente al programa de fertilización in vitro del Genetics & IVF
Institute (G&lVF) , sin tener en cuenta la etiología de su infertilidad.
Los primeros estudios piloto se llevaron a cabo con un grupo pequeño de l5 pacientes
infértiles sin causa aparente. Estos pacientes fueron elegidos al azar entre un grupo de
parejas cuyas mujeres no mostraron ninguna anormalidad ante una revisación
ginecológica exhaustiva.
1.3. Obtención de muestras
Las muestras de semen se obtuvieron por masturbación luego de 36 a 48 horas de
abstinencia sexual. Las muestras se mantuvieron a 37°C durante 30 minutos para
promover la licuefacción y fiJeron analizadas para determinar sus características
seminales dentro de la hora de obtención, de acuerdo con lo indicado por la OMS.
Materiales y Mémdne 39
2. ANÁLISIS DEL SEMEN
Todas las muestras fueron sometidas a un espermograma de rutina, que incluyó las
siguientes determinaciones:
2.1. Concentración de espermatozoides
La concentración de espermatozoides se determinó tanto a través de un análisis
computarizado como manualmente. Para la determinación manual, una alícuota de 20 pl
de semen se mezcló con 20 pl de paraformaldehído al 1% en buffer fosfato salino, pH
7,4 (PBS). Una alícuota (Spl) de espermatozoides, así fijados, se colocó luego en una
cámara Makler (Sefi Medical Instruments, Rehovot, Israel) para su cuantificación.
2.2. Motilidad: porcentaie de mótiles y calidad de movimiento
El porcentaje de espermatozoides mótiles también se determinó manualmente y a través
de análisis computarizado. La determinación manual se llevó a cabo colocando una
alícuota de 10 pl entre porta y cubreobjetos y observando al microscopio en contraste de
fase (200X). Se evaluaron un total de 100 espermatozoides. La calidad de movimiento
se clasificó en la escala de 0 - 4 (progresión), siguiendo los lineamientos propuestos por
(Mortimer et al. 1986):
Progresión Calidad del movimiento
0 lnmótill Movimiento in situ2 Movimiento traslativo, no progresivo3 Movimiento progresivo con velocidad moderada4 Movimiento progresivo con alta velocidad
Malerialmy Mólmlm 40
El número asignado representa la calidad de movimiento promedio de los
espermatozoides observados. Todas las determinaciones de motilidad se llevaron a cabo
sobre una platina caliente mantenida a 36°C.
2.3. Morfología
La morfología de los espermatozoides se determinó de acuerdo con el llamado criterio
estricto, descripto por (Kruger et al. 1986). De acuerdo con estos criterios, un
espermatozoide normal es aquél cuya cabeza tiene fonna oval, con contormo regular,
una longitud de 4 a 5,5 pm y un ancho de 2,5 a 3,5 pm. La cabeza presenta dos regiones
bien definidas en un preparado teñido: una anterior, más clara (el acrosoma), que debe
ocupar el 40-70% del área de la cabeza, y otra posterior más oscura. La cola se inserta
simétn'camente en una depresión plana en la base de la cabeza.
Para determinar la morfología se realizó un extendido sobre un portaobjetos, con una
alícuota de lO pl de semen. Una vez seco, el extendido se tiñó con la tintura Dif-Quik
(Dade Diagnostics, Miami, FL, E.E.U.Ul), siguiendo las instrucciones del fabricante. El
extendido se analizó al microscopio utilizando un objetivo de inmersión (lOOX) y se
evaluaron 200 células por extendido. En caso de que la concentración de
espermatozoides en semen fiJera inferior a 5xl06/ ml, se concentró una alícuota (100 pl)
de semen por centrifiigación a 300xg durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante
cuidadosamente, dejando unos lO pl para resuspender el "pellet" y con el "pellet"
resuspendido se realizó el extendido.
2.4. Viabilidad
La viabilidad (% espermatozoides vivos) de los espermatozoides se determinó utilizando
Materiales y Mómdne 41
un colorante supravital: Eosina Y al 0,5% en PBS. Una alícuota de lO pl de Eosina se
agregó a un volumen igual de semen. Al cabo de 2 minutos, se agregaron lO pl de
formaldehído al 1% para fijar las células. Una alícuota de lO pl de esta suspensión,
teñida y fijada, se colocó sobre un portaobjetos y se determinó el porcentaje de células
vivas (aquéllas que no tomaron el colorante) sobre un total de 100 espermatozoides.
2.5. Análisis computarizado
El análisis computarizado de semen se llevó a cabo utilizando, indistintamente, uno de
dos sistemas CASA (Computer-Assisted Sperm Analyzer): Cellsofi (CryoResources,
New York, NY, EEUU) y Celltrack (Motion Analysis, Santa Rosa, CA, EEUU).
Ambos sistemas son indistinguibles para determinar características de motilidad, pues
cuando los datos obtenidos con los dos sistemas se correlacionan gráficamente uno
contra el otro, se ajustan sobre la línea de identidad (r = 0,985; P<0,0l', n = 50).
Del análisis computarizado se obtuvieron los siguientes parámetros:
i) Concentración de espermatozoides
ii) ii)% motilidad
iii) V040 : porcentaje de espermatozoides que se mueven con una velocidad
curvilínea menor o igual a 40 “rn/segundo
iv) L3 : porcentaje de espermatozoides que se mueven con una linealidad menor o
igual a 3
3. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS DE SEMEN
Todas las muestras utilizadas para realizar experimentos de capacitación e inducción de
Materiales y Mótndm 42
la reacción acrosomal fueron procesadas como se describe a continuación.
3.1. Obtención de una fracción altamente mótil
Luego de la licuefacción, las muestras se centrifiJgaron a 300xg durante 7 minutos para
eliminar el plasma seminal. Los espermatozoides se lavaron, luego, dos veces por
centrifugación (300xg , 7 minutos) utilizando un medio Tyrode's modificado (HSM-3B)
conteniendo NaCl 117,5 mM, NaH2P04.H20 0,3 mM, KC] 8,6 mM, CaC12.2H20 2,5
mM, MgClz.H20 0,49 mM, glucosa 2 mM, lactato de Na 19 mM, NaHCOa 25 mM,
piruvato de Na 0,25 mM y 70 pg/ml de penicilina y estreptomicina equilibrado bajo
atmósfera de 5% C02 / 95% aire a pH 7,4. Este medio salino se suplemento con 3
mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) libre de globulinas (Sigma Chemical Co.,
St.Louis, MO, EEUU).
Los espermatozoides lavados se resuspendieron en 400 pl de medio HSM-26B, de
composición iónica igual al 3B, pero suplementado con 26 mg/ml de albúmina sérica
bovina libre de globulinas y ácidos grasos. Esta suspensión de espermatozoides se filtró
por una columna de lana de vidrio para obtener los espermatozoides mótiles. La
columna estaba constituida por 20 mg de lana de vidrio (Microfibre Manville, Denver,
CO, EEUU) colocados dentro de una jeringa de insulina de l ml. La columna se lavó 2
veces con l ml de HSM-3B y luego con 400 pl de HSM-268. Se sembró la muestra de
espermatozoides y, después que la misma hubiera pasado completamente, se enjuagó la
columna con 400 pl de HSM-268 para recuperar la totalidad de los espermatozoides
mótiles. El filtrado de la columna se analizó para determinar la concentración de
espermatozoides y el porcentaje de motilidad.
En el caso de pacientes oligospérmicos severos, los espermatozoides lavados se
Materiales y Métndas 43
resuspendieron en 200 pl de medio y se filtraron a través de lO mg de lana de vidrio.
3.2. lncubación en condiciones capacitantes
La concentración de espermatozoides filtrados se ajustó a l-2 x lO6/ ml. Alicuotas de
lml se incubaron en condiciones capacitantes durante toda la noche (22 horas) en tubos
cónicos de 15 ml, parcialmente tapados e inclinados en un ángulo de 45°, a 37°C y en
una atmósfera de 5% C02 / 95% aire.
3.3. Inducción dela reacción acrosomal
Alicuotas de 200 pl de espermatozoides, previamente incubados en condiciones
capacitantes, fueron expuestas a fluido folicular humano al ¡0% (por duplicado) o medio
(tubo control) durante 30 minutos a 37°C en atmósfera de 5% C02/95% aire. Para
asegurar que la alícuota tomada fuera, finalmente, representativa de la población celular
en el tubo, cada suspensión de espermatozoides se homogeneizó por pipeteo suave y
repetido de la misma.
AI finalizar la incubación con el fluido, los espermatozoides se lavaron 3 veces con l ml
de PBS mediante centrifiigación a lOOOx g durante 5 minutos. Luego del último lavado,
se retiró el sobrenadante dejando unos 50 ul residuales que se utilizaron para
resuspender los espermatozoides. Los espermatozoides resuspendidos de cada tubo se
colocaron en dos orificios de portaobjetos para inmunofiuorescencia (Polysciences,
Washington, PA, EEUU) previamente tratados con 0,1 mg/ml poli-L-lisina (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO, E.E.U.U.) con el objeto de favorecer la adhesión de las
células al vidrio. Los portaobjetos se dejaron secar al aire y luego se sumergieron en
etanol 95% a 4°C durante, por lo menos, una hora para permeabilizar las membranas y
Materiales y Mótndnc 44
SCconservaron a 40C hasta SUUSO.
3.4. Evaluación del porcentaie de reacción acrosomal
El estado del acrosoma fue evaluado mediante el uso de la lectina de Pisum sativum
marcada con fluoresceína, que se asocia al contenido intraacrosomal (Cross et al. 1986).
Los espermatozoides permeabilizados se tiñeron con una solución de Pisum sativum (l
mg/ml) en PBS, durante 30 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad. Las
células teñidas se lavaron con PBS (3 cambios durante lO minutos, con agitación suave)
y los portaobjetos se montaron utilizando n-propil galato 0,2 M en glicerol para
minimizar el "quenching" de la fluorescencia. Los espermatozoides fueron observados en
un microscopio de fluorescencia Olympus BHA, equipado con un filtro UB. Se evaluó el
estado del acrosoma en 200 espermatozoides por orificio. Los espermatozoides se
clasificaron como pertenecientes a una de 3 categorías (Figura 9):
o lntactos: acrosoma fluorescente
o Reaccionados: región acrosomal oscura o punteada; segmento ecuatorial fluorescente
o Difusos: espermatozoides oscuros o con algunos puntos fluorescentes pero sin
fluorescencia sobre el segmento ecuatorial
El porcentaje de reacción acrosomal en cada orificio se calculó como:
número de espermatozoides reaccionados x lOOnúmero total de espermatozoides evaluados
El porcentaje de reacción acrosomal en respuesta al fluido folicular (%RA) se
calculó como % espermatozoides reaccionados en presencia de fluido menos %
espermatozoides reaccionados en tubo control.
"Y"Intacto Reaccionados Difusos
Materiales y Mémdm 4%
Figura 9: Esquema de los distintos patrones de fluorescencía observados almicroscopio luego de la tinción con lectina de Pisum Sativum.
Materiales y Métndm 46
4. OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN DE Los FLUIDOS BIOLÓGICOS
UTILIZADOS
4.]. Fluido folicular
El fluido folicular utilizado para inducir la reacción acrosomal, se obtuvo reuniendo los
fluidos foliculares procedentes de pacientes que realizaron ciclos de fertilización ¡n vilro
en el Genetics & lVF Institute. Cada vez que se preparó un lote de fluido, se reunieron
los fluidos de al menos 40 pacientes elegidos al azar y solamente se descartaron aquellos
fluidos que estuvieran fuertemente contaminados con sangre. Cada lote nuevo se
controló midiendo su capacidad de inducir reacción acrosomal con respecto al lote
anterior. Todos los lotes utilizados durante los estudios aquí presentados tuvieron una
capacidad inductora semejante.
El fluido folicular crudo se centrifiigó a lSOOxgdurante 15 minutos a 4°C, para eliminar
restos celulares. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,22 um (Millipore,
Bedford, MA, EEUU) y se dializó durante 48 horas (2 cambios) contra medio HHM, pH
7,4. Este medio es medio HSM en el que se ha sustituido al NaHC03 25 mM por Hepes
20 mM / NaHCO; 5 mM. El fluido dializado se filtró nuevamente a través de una
membrana de 0,22 pm, se fraccionó en alícuotas de 200 pl y se guardó congelado a
20°C hasta su uso.
El contenido total de proteínas en cada lote se determinó por el método de Lowry et al.
(195]). Para todos los lotes utilizados el contenido de proteínas fiJe semejante y del
orden de los 45 mg/ml.
4.2. Suero de cordón umbilical
El suero de cordón umbilical (FCS) utilizado en algunos experimentos se obtuvo
Manu-¡aloe y Mótmlm .17
reuniendo sueros de cordón umbilical procedentes de nacimientos por cesárea. El suero
crudo se centrifugó a 500xg, durante lO minutos para eliminar restos celulares. El
sobrenadante se filtró, sucesivamente, por membranas de 5 pm y 0,2 pm. El suero
filtrado se inactivó por calentamiento a 56°C durante 45 minutos, se fraccionó en
alícuotas de 3 ml y se guardó congelado a -20°C hasta su uso. La preparación final se
analizó para hepatitis A y B y para HlV. Como control de calidad de cada lote de suero,
se verificó que no existieran efectos inhibitorios del mismo sobre el porcentaje de
fertilización de ovocitos de ratón in vitro y el subsiguiente desarrollo embrionario hasta
el estadio de dos células. Alrededor de lO lotes de suero diferentes fueron utilizados
durante estos estudios.
5. OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DEL ENSAYO DE REACCIÓN
ACROSOMAL
Para optimizar las condiciones del ensayo de reacción acrosomal se utilizaron
espermatozoides provenientes de dadores voluntarios de fertilidad comprobada. Las
muestras de semen se procesaron de la forma ya indicada para obtener una suspensión
de espermatozoides altamente mótiles, es decir, dos lavados por centrifiJgación seguidos
de una filtración por columna de lana de vidrio (sección 3.1.).
5.1. Optimización de la concentración de fluido folicular
Alícuotas de 200 pl de espermatozoides, incubados en condiciones capacitantes durante
22 horas (sección 3.2.), se incubaron durante 30 minutos a 37°C bajo atmósfera de 5%
C02 / 95% aire, en presencia de dosis variables de fluido folicular humano: 0%, 2,5%,
5%, 10% y 20% V/V, en un volumen final de 300g] (sección 3.3.). El porcentaje de
Materiales y Mélmlnu 48
reacción acrosomal, como así también el porcentaje de células vivas, se determinaron en
cada caso de la manera habitual (secciones 3.4. y 2.4., respectivamente).
5.2. Optimización de la concentración de espermatozoides a capacitar
La suspensión de espermatozoides ya filtrados por lana de vidrio, procedente de cada
uno de 4 dadores voluntarios, se subdividió en 4 alícuotas de concentración diferente: 2,
4, 8 y 12 xlOó/ml, que se incubaron luego, en condiciones capacitantes, durante 22
horas. Los espermatozoides capacitados se incubaron en presencia de fluido folicular al
10% y se determinó el porcentaje de reacción acrosomal en todas las muestras siguiendo
el protocolo habitual.
5.3. Optimización del tiempo de exposición al fluido folicular
Espermatozoides capacitados en condiciones óptimas de concentración (2x106/ml),
procedentes de cada uno de 4 dadores voluntarios, se incubaron en presencia de fluido
folicular al ¡0% o medio (control) por distintos tiempos: 0, 5, lO, 20 y 30 minutos. El
porcentaje de reacción acrosomal y el porcentaje de viabilidad se determinaron en cada
muestra en la forma habitual.
5.4. Optimización del tiempo de capacitación
Los espermatozoides, procedentes de cada uno de 3 dadores voluntarios, se incubaron
en condiciones capacitantes por O, 2, 6 y 22 horas. Después de cada tiempo de
incubación, los espermatozoides se incubaron otros 30 minutos en presencia de distintas
dosis de fluido folicular: 0%, 2,5%, 5%, 10% y 20% V/V. La viabilidad de los
espermatozoides y el porcentaje de reacción acrosomal se determinaron en todas las
MEIÍPI'iaIPQy Mémdm 49
muestras.
Un estudio cinético adicional se llevó a cabo incubando en condiciones capacitantes,
durante 8 y 22 horas, la suspensión de espermatozoides procedente de cada uno de 8
dadores voluntarios.
5.5. Análisis estadístico
Los datos de todos estos experimentos se analizaron utilizando análisis de varianza
(ANOVA) (Schefi‘e, 1959). Se analizó la normalidad de los residuales del ANOVA
utilizando un test de (Shapiro, Wilk, 1965) y en ningún caso se encontró apartamiento
significativo de una distribución normal.
Las relaciones ordenadas, tal como dependencia con dosis de fluido o concentración de
espermatozoides, se analizaron utilizando un test de Bartholomew para alternativas
ordenadas (Nelson, 1977). La cinética de reacción acrosomal se analizó por medio de
ANOVA, seguido de un test de Tukey (Scheffe, 1959) con corrección por las
comparaciones múltiples entre los distintos tiempos.
6. EFECTO DEL FLUIDO FOLICULAR SOBRE LAS CARACTERÍSTICAS DE
MOTILIDAD DE ESPERMATOZOIDES CAPACITADOS
Para determinar si el fluido folicular tiene algún efecto sobre las caracteristicas de
motilidad de los espermatozoides, se utilizaron espermatozoides capacitados
provenientes de 5 dadores voluntarios, incubados en presencia y en ausencia de fluido
folicular al 10%.
Malorialoeïv Mótmlns ¡0
Se determinó la velocidad curvilínea y la linealidad para cada una de las muestras
utilizando un sistema CASA de análisis computarizado, tal como se indicara
anteriormente. Se construyeron las curvas de distribución acumulativa para velocidad
curvilínea (Vc) y linealidad (L) colocando en un gráfico los porcentajes acumulativos de
células medidos a intervalos crecientes de Vc y L.
La existencia de diferencias significativas entre células control y células expuestas al
fluido se analizó utilizando el test de Kolmogorov-Smirnov (Siegel, 1956).
7. INFLUENCIA DEL MEDIO D_ECAPACITACIÓN SOBRE LA RESPUESTA
AL FLUIDO FOLICULAR
7.1. Composición salina
Para evaluar el efecto de la composición salina del medio de capacitación sobre la
capacidad de respuesta de los espermatozoides al fluido folicular, se utilizaron 3 medios
comúnmente usados en los laboratorios de Andrología para la preparación de
espermatozoides, tanto con fines diagnósticos como para procedimientos de fertilización
in vitro: BWW, HSM y Ham's F-lO. La elección de estos medios no fiJe al azar. HSM
era el medio utilizado de rutina, en el laboratorio de Andrología del G&IVF para el
ensayo de reacción acrosomal en respuesta a fluido folicular. BWW era el medio
utilizado en el laboratorio de Andrología para el lavado y capacitación de
espermatozoides como así también para los estudios de motilidad, calidad de
movimiento y sobrevida de espermatozoides capacitados. Ham’s F-lO era el medio
utilizado por el laboratorio de Embriología del G&IVF para llevar a cabo los
procedimientos de FIV.
Malerialee _\'Métodos Sl
Los expen'mentos se realizaron sobre espermatozoides de 10 dadores voluntarios de
fertilidad comprobada. Cada eyaculado se fraccionó en 3 alícuotas que se lavaron 2
veces por centn'fugación a 300xg durante 10 minutos, utilizando Ham's F-10, BWW y
HSM, suplementados con albúmina bovina al 0,3%, libre de globulinas (Sigma Chemical
C0, St Louis, MO, E.E.U.U.). La composición salina de los 3 medios se describe en la
Tabla lV.
TABLA IV: Composición iónica de los distintos medios utilizados
BWW HSM HAM'SComponente (mM) (mM) (mM)
NaCl 84,07 117,5 126,5NaHzPO4 - 0,3 KC] 4,78 8,6 3,83CaClz 1,71 2,5 0,3MgC12 - 0,49 Glucosa 5,56 2,0 6,1 lLactato de Sodio 21,58 19,0 NaHCO; 35,71 25,0 20,0Piruvato de Sodio 0,25 0,25 1,0KH2P04 1,19 - 0,61MgSO4 1,19 - 0,63Acetato de Sodio 0,1 - Lactato de Calcio - - 0,5Acido Oxálico 0,1 -
Na- Total 141,71 162,05 149,66K' Total 5,97 8,6 9,44C1"Total 92,27 132,00 132,2Ca” Total 1,71 2,5 0,8Mgz‘ Total 1,19 0,49 0,63Na' /K’ 23,74 18,84 15,85mOsmolaridad (mOsM) 280-300 280-300 278-284
Luego de los lavados, cada fracción de espermatozoides se resuspendió en 300 pl del
Materiales _\'Mótmlne 52
medio correspondiente, suplementado con albúmina bovina libre de globulinas al 2,6% y
ácidos grasos (Sigma Chemical Co, St Louis, MO, E.E.U.U.) y se filtró por una
columna de lana de vidrio para obtener una población de células altamente mótiles
(sección 3.1). Luego de determinar la concentración y la motilidad de espermatozoides
en la suspensión final, se ajustó la concentración de espermatozoides a 1.5x106/ ml y las
alícuotas se capacitaron durante la noche (sección 3.2). En cada muestra se evaluó la
motilidad por CASA luego de 2 horas de incubación (sección 6), como así también la
capacidad de sufrir la reacción acrosomal en respuesta al fluido folicular a las 22 horas
(secciones 3.3 y 3.4).
Los datos obtenidos por CASA se utilizaron para construir curvas de distribución
acumulativa para velocidad curvilínea (Vc) y linealidad (L) y así evaluar el efecto de
la composición salina del medio de capacitación sobre las características de motilidad de
los espermatozoides. La existencia de diferencias significativas entre los medios se
analizó a través del test de Kolmogorov-Smimov (Siegel, 1956).
7.2. Suplemento proteico
Para evaluar el efecto de la naturaleza del suplemento proteico en el medio de
capacitación sobre la capacidad de respuesta de los espermatozoides al fluido folicular,
se utilizaron dos suplementos: albúmina de suero bovino (BSA), usado en el laboratorio
de Andrología y suero de cordón umbilical (FCS), utilizado en el laboratorio de
Embriología. De allí la elección de ambos para este estudio.
Se analizaron espermatozoides provenientes de lO dadores voluntarios de fertilidad
comprobada. Cada eyaculado se fraccionó en 3 alícuotas que se lavaron, 2 veces, por
centrifugación a 300xg durante lO minutos utilizando HSM suplementado con BSA al
Malorialnc y Mómdnc <3
0,3%. Los espermatozoides lavados se resuspendieron en HSM suplementado con BSA
al 2,6% (HSM-268), BSA al 3,5% (HSM-358) o FCS al 7,5% (HSM-FCS), se filtraron
por lana de vidrio y se incubaron en condiciones capacitantes, según se describiera
anteriormente (secciones 3.1 y 3.2). En cada muestra se evaluó la motilidad por CASA
luego de 2 horas de incubación, como así también la capacidad de sufrir la reacción
acrosomal en respuesta al fluido folicular, al cabo de 22 horas de capacitación.
Con los datos obtenidos por CASA se construyeron las curvas de distribución
acumulativas para velocidad curvilínea (Vc) y linealidad (L) (sección 6) después de 2
horas de incubación en HSM-268, HSM-358 y HSM-FCS. Se analizaron las
diferencias significativas entre los distintos suplementos a través del test de
Kolmogorov-Smirnov (Siegel, 1956).
En otra serie de experimentos se evaluó el efecto de la adición simultánea de BSA y FCS
al medio de capacitación. Los espermatozoides procedentes de cada uno de 7 individuos
normales se dividieron en 3 alícuotas que se lavaron inicialmente con HSM y, luego de la
filtración por lana de vidrio, se incubaron en condiciones capacitantes en HSM-268,
HSM-FCS o HSM adicionado con 2,6% BSA y 7,5% FCS. En cada alícuota se
determinó la capacidad de sufrir reacción acrosomal en respuesta al fluido folicular.
Finalmente, se llevó a cabo un experimento de intercambio para determinar la
reversibilidad de los efectos de BSA y FCS sobre la capacitación. Se utilizaron 7
dadores voluntarios. Los espermatozoides procedentes de cada dador se lavaron con
HSM y se filtraron por lana de vidrio e incubaron en las condiciones capacitantes
habituales en HSM-268 y HSM-FCS. Luego de la incubación (18 horas), las
suspensiones de espermatozoides se dividieron en 3 alícuotas. Una alícuota constituyó el
control de incubación y se mantuvo a 37°C. Las otras dos alícuotas se centrifugaron a
Maleriales‘ y Métndmr 54
300xg durante lO minutos; una de ellas se resuspendió en el mismo medio utilizado
durante la capacitación (control) y la otra se resuspendió en el buffer alternativo. Luego
de l y 4 horas de incubación en las condiciones capacitantes habituales, se determinó la
capacidad de respuesta al fluido folicular en todas las alícuotas.
8. ENSAYO PILOTO PARA COMPARAR LA REACCIÓN ACROSOMAL
lNDUClDA POR FLUIDO FOLICULAR EN ESPERMATOZOIDES DE
INDIVIDUOS NORMALES Y PACI_ENTESINFÉRTILES
8.1. Suietos estudiados
Se obtuvieron muestras de semen de 12 dadores voluntarios y 15 pacientes infértiles sin
causa aparente. Los pacientes se eligieron al azar entre parejas en las que la mujer no
mostró anormalidades ginecológicas ante una exhaustiva evaluación por infertilidad.
8.2. Procesamiento de las muestras de semen
Las muestras de semen se procesaron en la forma habitual para ser incubadas en
condiciones capacitantes y determinar, luego, el porcentaje de reacción acrosomal en
respuesta al fluido folicular (sección 3).
8.3. Tratamiento de resultados
Con el objeto de establecer un rango de normalidad para los valores de reacción
acrosomal inducida por fluido folicular, los datos obtenidos se trataron estadísticamente
como se indica a continuación.
Malerialec y Métmlrm 55
Para cada individuo normal, se calculó la diferencia entre los porcentajes de reacción
acrosomal en presencia y en ausencia de fluido folicular (%RA). Se encontró que los
datos se ajustaban a una distribución log normal, de modo que se aplicó una
transformación logaritmica para lograr la normalización de los datos. Se construyó un
intervalo de confianza del 95% para una cola, en la escala transformada usando una
distribución t. Luego, utilizando una transformación antilogarítmica, el intervalo de
confianza se llevó nuevamente a la escala original.
Una vez establecido el rango de normalidad, se evaluó la respuesta de los 15 pacientes
infértiles y se clasificó a cada uno de ellos como RA+ o RA-, según su respuesta se
encontrara (RA+) o no (RA-) dentro del rango normal establecido.
9. ESTUDIO POBLACIONAL DE LA REACCIÓN ACROSOMAL INDUCIDA
POR FLUIDO FOLICULAR
9.1. Individuos normales
9.1.]. Población estudiada
Participaron en este estudio 58 individuos de fertilidad comprobada, ya sea dadores
habituales de fertilidad comprobada de un banco de espermatozoides (Fairfax Cryobank)
o dadores voluntarios que hubieran concebido dentro del último año.
9.1.2. Procesamiento de las muestras de semen
Cada dador proveyó múltiples muestras de semen (mediana = 4, rango 2-27), que fiieron
Materiales y Mójndne 56
analizadas en la forma habitual para determinar parámetros seminales clásicos (sección
2) y luego se procesaron para determinar el % RA inducida por hFF (sección 3).
9.1.3. Tratamiento de resultados
Los parámetros seminales de cada individuo corresponden a la media de todas las
muestras provistas por dicho individuo.
Las múltiples muestras de cada individuo se utilizaron para determinar la variación
intraindividuo del ensayo.
La primera muestra provista por cada donante se utilizó para construir un intervalo de
confianza del 95% y así establecer un rango de normalidad para el %RA.
Se analizó la distribución de frecuencias del %RA en respuesta al fluido folicular dentro
de la población normal estudiada.
9.2. Pacientes infértiles.
9.2.1. Población estudiada
Participaron en este estudio 232 pacientes infértiles, secuencialmente tomados del grupo
de parejas infértiles que acudiera a la consulta para fertilización in vitro,
independientemente de la etiología de su infertilidad.
Materiales y Métodos 57
9.2.2. Procesamiento de las muestras de semen
Las muestras de semen provistas por estos pacientes se procesaron en la forma habitual,
tanto para determinar las caracteristicas seminales (sección 2) como para evaluar el
%RA en respuesta alfluido folicular (sección 3).
9.2.3. Tratamiento de resultados
Se estudió la distribución de frecuencias para el %RA en respuesta al fluido folicular
dentro de la población total, como así también dentro de ciertas subpoblaciones de
pacientes.
Para la población global, se analizó también la relación de los valores de %RA con otros
indicadores seminales, tales como % motilidad, V040, concentración y morfología
estricta.
lO. ESTUDIO DEL VALOR DIAGNÓSTICO DE LA REACCIÓN
ACROSOMAL INDUCIDA P03 FLUIDO FOLICULAR CON REflECTO A
LA CAPACIDAD FERTILIZANTE IN VITRO
10.1 Población estudiada
lntervinieron en este estudio los 232 pacientes infértiles que participaran en el estudio
poblacional de la reacción acrosomal. Se llevó a cabo una evaluación reproductiva
detallada de ambos miembros de la pareja, para excluir desórdenes potencialmente
reversibles.
Materiales y Mólmlrw 58
10.2. Procesamiento de las muestras de semen
10.2.1. Ensayo de reacción acrosomal
El análisis seminal se llevó a cabo de la manera habitual (sección 2), así como el
procesamiento de las muestras para determinar %RA (sección 3).
La muestra de semen que se utilizó para llevar a cabo el ensayo de reacción acrosomal
M fiJe la misma que se utilizó para FIV, sino otra muestra previa pero temporalmente
cercana al procedimiento de FIV.
10.2.2. Fertilización in vitro
Las muestras utilizadas para la fertilización in vitro se procesaron de la siguiente manera.
Una vez analizado el semen, los espermatozoides se lavaron 2 veces por centrifiigación
en Ham's F-lO (Life Technologies lnc., Grand Island, NY, USA) a 300xg durante lO
minutos. Los espermatozoides se resuspendieron en 100 pl de Ham's F-lO,
suplementado con suero de cordón umbilical (FCS), se colocaron bajo 1,5 ml del mismo
medio y se incubaron a 37°C durante l hora bajo atmósfera de 5% C02/ 95% aire para
permitir el ascenso de los espermatozoides altamente mótiles ("swim-up"). La fracción
del "swim-up" se utilizó para inseminar ovocitos a una razón de 100.000
espermatozoides / cápsula, conteniendo uno o más ovocitos.
10.3. Obtención de ovocitos 1 fertilización in vitro de los mismos
Los ovocitos se obtuvieron por aspiración folicular por vía vaginal de pacientes
previamente tratadas para inducir el desarrollo de múltiples folículos. El tratamiento
Materiales y Mótmlne 59
hormonal consistió en un análogo de factor liberador de gonadotrofinas (acetato de
leuprolide, Lupron; TAP Pharmaceuticals, Chicago, IL, EEUU) seguido de
gonadotrofma menopáusica humana (HMG, Pergonal, Serono Inc, Randolph, MA,
EEUU) o citrato de clomifeno (Serophene, Serono) combinado con HMG o HMG sola.
El desarrollo de los folículos se controló dosando estradiol sérico y midiendo el aumento
del diámetro folicular por ultrasonido. La posibilidad de una luteinización prematura se
investigó mediante el dosaje diario de hormona luteinizante (LH) y progesterona.
Las aspiraciones foliculares se llevaron a cabo 36 horas después de la inyección de
10.000 unidades internacionales de gonadotrofina coriónica humana (hCG; Profasi,
Serono).
Los ovocitos obtenidos se cultivaron a 37°C, bajo atmósfera de 5% C02, 5% 02, 90%
N2 en Ham's F-lO suplementado con FCS al 7,5% durante 6 horas, previamente a la
inseminación. El criterio de fertilización utilizado fiJe la presencia de 2 pronúcleos 16
horas luego de la inseminación y el posterior clivaje del ovocito.
10.4.Tratamiento de resultados
Se analizó el valor diagnóstico de la prueba de reacción acrosomal en respuesta al fluido
folicular con respecto al porcentaje de ovocitos fertilizados in vitro, tanto para la
población total como para distintos subgrupos de pacientes. Se determinaron
sensibilidad y especificidad del método, como así también los valores predictivos
positivo y negativo y la razón de probabilidades. Estos parámetros estadísticos se
calcularon de la siguiente manera:
Materiales y Mémrlm 6|)
o Sensibilidad: número de pacientes RA- / número de pacientes con FIV = 0
o Especificidad: número de pacientes RA+ / número de pacientes con FIV > 0
o Valor predictivo positivo: número de pacientes con FIV = 0 / número de pacientes
RA
o Valor predictivo negativo: número de pacientes con FIV > 0 / número de pacientes
RA+
o Razón de probabilidades: (número de pacientes RA+ con FlV > 0 x número de
pacientes RA- con FIV < O) / (número de pacientes RA+ con FlV < O x número de
pacientes RA- con FlV > O)
Se construyeron curvas ROC (Metz, 1978) para evaluar el valor clinico del ensayo.
ll. BÚSQUEDA DE UN MODELO ADECUADO PARA PREDECIR LA
CAPACIDAD FERTILIZANTE DE UNA MUESTRA DE ESPERMATOZOIDES
ll.l. Diseñoexperimental
El primer objetivo de este estudio fue determinar cuál o cuáles de una serie de
parámetros masculinos y femeninos relacionados con la fertilidad, correlacionaban
individualmente con el porcentaje de ovocitos fertilizados en FlV, en un grupo de
pacientes infértiles. Luego, para crear un modelo predictivo de éxito en la fertilización in
vitro, se utilizó un análisis de regresión lineal escalonado con el porcentaje de
fertilización ¡n vitro como única variable dependiente. El objetivo de este análisis fue
encontrar la combinación de variables que proporcionara el mejor valor pronóstico para
el porcentaje de fertilización.
Materiales y Mótmlnc 61
El estudio se llevó a cabo en dos grupos independientes de pacientes infértiles para
determinar si las correlaciones originalmente establecidas con un primer grupo de
pacientes seguían siendo válidas al analizar un segundo grupo. Los pacientes, que
acudieron al G&lVF para procedimientos de FIV, fueron tomados completamente al
azar y sin tener en cuenta la etiología de su infertilidad.
ll.l.l. Etapa de construcción
Se utilizó un primer grupo de 82 pacientes y se estudió la correlación del porcentaje de
fertilización in vitro con los parámetros funcionales que se enumeran en la Tabla V.
TABLA V: Parámetros de fertilidad evaluados en la búsqueda de un modelo parapredecir la capacidad fertilizante de una muestra de espermatozoides
Espermatozoides en semen:Concentración% MotilidadV040
L3
% Morfología normal
Espermatozoides capacitados:VC60= % espermatozoides con velocidad menor o igual a 60pm/seg% RA
Parámetros ajenos al espermatozoide:Calidad de los ovocitos inseminadosPatología ginecológica: anovulación, obstrucción tubaria, endometriosis, otrasEdad de la mujerHombre: alguna vez logró concebir?
Se analizaron los datos para cada parámetro aisladamente a través del test de correlación
de Spearman.
Materiales y Métodos 62
11.1.2. Etapa de validación
Se utilizó un segundo grupo de 64 pacientes. Se tomaron en cuenta los mismos
parámetros que en la fase de construcción y el análisis estadístico se llevó a cabo en
forma semejante.
11.2. Procesamiento de las muestras
El procesamiento de las muestras de espermatozoides para los distintos ensayos
realizados se llevó a cabo de la manera habitual, según se describiera anteriormente en
las correspondientes secciones. Asimismo, los procedimientos asociados con la
fertilización in vitro se efectuaron según el protocolo detallado en la sección anterior.
RESULTADOS
1. OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DEL ENSAYO DE REACCIÓN
ACROSOMAL INDUCIDAP03 FLUIDO FOLICULAR
1.1. Concentración de fluido folicular
Al exponer espermatozoides de individuos normales, incubados durante toda la noche en
condiciones capacitantes, a diferentes dosis de fluido folicular (hFF), se observó un
aumento significativo (p<0,05) en el porcentaje de reacción acrosomal con respecto a
espermatozoides incubados en medio Sólo (Figura 10), incluso a la dosis mínima
analizada (1/50 V/V): 23 i 2 % para espermatozoides en fluido vs 7 i 1 % para
espermatozoides control (n = 6).
Se encontró que la relación entre el % reacción acrosomal y la concentración de fluido
folicular dependía de la dosis (p<0,05) y que, a partir de la dosis 1/10, se alcanzaba la
estimulación máxima. Se eligió, entonces, una concentración de fluido folicular al 10%
V/V para todos los ensayos posteriores.
La dosis de fluido folicular no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad de los
espermatozoides (Figura 10)4No se encontraron diferencias significativas (p>0,6) entre
los porcentajes de células muertas a las distintas concentraciones de fluido folicular
utilizadas.
1.2. Concentración de espermatozoides
Se estudió el efecto de la concentración de espermatozoides durante la capacitación
sobre el porcentaje de reacción acrosomal en presencia de 10% de fluido folicular. Se
encontró que la concentración a la cual se capacitan los espermatozoides es crítica para
50
8o 8‘z‘ E
9 40- Lg
É zLu 80‘ 30- gf3 oD '6'6 la gl- 20“ o:< LLl
E aEl Lu
% 10- °\°LIJ
3 o
. 0" Í Í I I I
% FLUIDO FOLICULAR
Figura 10: Efecto de la dosis de fluido folicular sobre el % de reacción acrosomal(H) y la viabilidad (o——o)de espermatozoides humanos capacitados durante 22horas y luego incubados durante 30 minutos en presencia de 0, 2,5, 5, 10 y 20%V/V de hFF. Los resultados se expresan como media i SEM. n = 6.
el ensayo, pues se produjo un descenso progresivo y altamente significativo (p<0,0001)
en el porcentaje de reacción acrosomal inducida por hFF a medida que aumentaba la
concentración de espermatozoides durante la capacitación (Figura ll).
Cuando la concentración de espermatozoides en el medio de capacitación llegó a los 12
millones/ml, no se observó diferencia entre los porcentajes de reacción acrosomal de
espermatozoides control y espermatozoides expuestos al fluido.
También se encontró un efecto muy significativo (p<0,0001) de la concentración de
espermatozoides sobre el porcentaje de reacción acrosomal espontáneo (controles), pero
este file significativamente menor (p<0,0001) que el efecto sobre los espermatozoides
expuestos al fluido.
Tomamos, por lo tanto, una concentración de 1 a 2 millones/ml durante la capacitación
para todos los ensayos posteriores.
1.3. Tiempo de exposición al fluido folicular
Se estudió la cinética de inducción de la reacción acrosomal por fluido folicular al 10%
sobre espermatozoides capacitados en una concentración de l a 2 millones/ml. Se
observó un aumento muy significativo (p<0,000l) en el porcentaje de reacción
acrosomal a medida que aumentó el tiempo de exposición al fluido (Figura 12). El
porcentaje de reacción acrosomal a tiempo 0 fue significativamente menor (p<0,05) que
al resto de los tiempos estudiados: 5, lO, 20 y 30 minutos, mientras que no hubo
diferencias entre el porcentaje de estimulación entre los distintos tiempos. Tampoco
hubo diferencias en los porcentajes de reacción acrosomal espontánea (tubos control) a
esos tiempos.
U1O
AOI
+hFF 1:10
(a) Ol
NO a
Control
%ESPERMATOZOlDESREACCIONADOS
3
0 l l l
0 4 8 12
CONCENTRACION DE ESPERMATOZOIDES (millones/ml)
Figura ll: Efecto de la concentración de espermatozoides durante la capacitaciónsobre el % espermatozoides reaccionados espontáneamente (control) o enrespuesta a fluido folicular 10% (+hFF 1:10). Los espermatozoides, previamentecapacitados a 2, 4, 8 y 12 millones/ml durante 22 horas, se incubaron luegodurante 30 minutos adicionales en presencia de fluido folicular 10% (o—o) omedio (0-4). Los resultados se expresan como media i- SEM. n =4.
AO
Fluido Folicular 1:10
(A)Ol
Control
_¡ o I
%ESPERMATOZOIDESREACCIONADOS
l\)O
0 | | l I
O 10 20 30
TIEMPO DE EXPOSICION AL FLUIDO FOLICULAR (min)
Figura 12: Cinética de inducción de la reacción acrosomal por hFF enespermatozoides humanos. Los espermatozoides, previamente capacitados durante22 horas a una concentración de 1-2x106/ml,se incubaron en presencia (o_o) oausencia (o——o)de hFF 10% durante 0, 5, 10, 20 y 30 minutos. Los resultados seexpresan como media i SEM. n = 4.
La viabilidad de los espermatozoides se mantuvo constante (90%) a lo largo de los
distintos tiempos analizados.
Por conveniencia, se eligió un tiempo de incubación con fluido de 30 minutos para todos
los ensayos posteriores.
1.4 Tiempo de capacitación
Se estudió el porcentaje de reacción acrosomal inducida por distintas dosis de fluido
folicular en espermatozoides incubados en condiciones capacitantes por diferentes
períodos: O, 2, 6 y 22 horas (Figura 13). No se encontró un efecto significativo del
tiempo de incubación (p>0.06) sobre el porcentaje de reacción acrosomal espontánea
(espermatozoides no expuestos al fluido). Sin embargo, el porcentaje de reacción
acrosomal en respuesta al fluido folicular aumentó significativamente (p<0,000l) con el
tiempo de capacitación. No se observó reacción acrosomal en espermatozoides no
capacitados (t = O)o en espermatozoides capacitados durante 2 horas. Recién al cabo de
6 horas de capacitación se observó un pequeño pero significativo (p<0,05) aumento en
el porcentaje de reacción acrosomal en presencia de fluido folicular humano (hFF): 6 1L3
% a las 6 horas vs. 2 i 1 % a las 2 horas con hFF 10%. Un aumento mucho mayor y
altamente significativo (p<0,000l) en el porcentaje de reacción acrosomal inducida se
observó al cabo de 22 horas de incubación en condiciones capacitantes: 30 i 6 % a las
22 horas vs. 6 i 3 % a las 6 horas con hFF 10%.
Si bien el % viabilidad disminuyó al aumentar el tiempo de capacitación (Zil % a las Oh
vs, 1215 % a las 22 hs), file semejante en espermatozoides expuestos al fluido y
espermatozoides control para todos los tiempos estudiados.
40(DOOá9 OO<LLl
n: 20 —(D n .1
g + capacúacuonÉ + ho ’'<EEn. 0 “(J)uJ
°\°
0 5 10 15 20 25
CONCENTRACION hFF (°/o)
Figura 13: Efecto del tiempo de capacitación sobre el % reacción acrosomal enrespuesta a distintas dosis de hFF. Los espermatozoides, capacitados a 1-2x106/mldurante 0, 2, 6 y 22 horas, fueron incubados durante 30 minutos adicionales enpresencia de distintas dosis de hFF. Los resultados se expresan como media iSEM. n = 3.
Con el objeto de evaluar algún punto intermedio entre las 6 y las 22 horas de
capacitación, se llevó a cabo una serie de experimentos adicionales (n = 8) en los que se
analizó la respuesta al fluido folicular por parte de espermatozoides incubados en
condiciones capacitantes durante 8 y 22 horas. Luego de 8 horas de capacitación se
observó un 16 i 4 % de reacción acrosomal en espermatozoides incubados con fluido
folicular 10% vs. un 4 i 1 % de reacción en espermatozoides controles (p<0,01). Los
espermatozoides incubados en condiciones capacitantes durante 22 horas también
mostraron un incremento de 4 veces (p = 0,02) en la reacción acrosomal en presencia de
fluido folicular 10%: 22 i 5 % vs. 6 i 1 % en el control, sugiriendo que se necesitaría un
tiempo mínimo de capacitación de 8 horas para lograr la máxima respuesta al fluido
folicular.
Por conveniencia, se adoptó un tiempo de capacitación de 22 horas para todos los
experimentos subsiguientes.
2. EFECTO DEL FLUIDO FOLICULAR SOBRE LAS CARACTERÍSTICAS DE
MOVIMIENTO DE ESPERMATOZOID_ES INCUBADO_S EN CONDLCIONES
CAPACITANTES
Los espermatozoides previamente capacitados durante 22 horas en las condiciones
habituales y luego incubados durante otros 30 minutos en presencia de fluido folicular
presentaron cambios en sus características de movimiento, analizadas por CASA. La
exposición de los espermatozoides al fluido modificó la velocidad curvilínea de los
mismos de modo tal que se produjo un corrimiento de la curva de distribución
acumulativa de Vc hacia la derecha, con respecto a la curva de espermatozoides control,
incubados solamente en medio (Figara 14, panel superior).
120
100 d
60 7 Control
Fluido folicular 1:10
DISTRIBUCIONACUMULATIVA(%)
0 20 40 60 80 100 120 140 160
VELOCIDAD CURVILINEA (um/seg)
120
100
80‘
60 —
Control
40«
Fluido folicular 1:1020 <
DISTRIBUCIONACUMULATIVA(%)
LINEALIDAD
Figura 14: Efecto del fluido folicular sobre la velocidad curvilínea (panel superior)y la linealidad (panel inferior) de espermatozoides humanos. Las curvas muestranla distribución acumulatíva porcentual de velocidad curvilínea y linealidad enespermatozoides capacitados durante 22 horas y luego incubados durante 30minutos adicionales en presencia de hFF (o—o) o medio (0-0). Las velocidadescurvilíneas y linealidades se determinaron mediante un sistema CASA.
Este corrimiento indica que, como consecuencia de la exposición al fluido, se produjo un
aumento en la fracción de espermatozoides más mótiles, que globalmente sería
observado como una mejora en la velocidad de movimiento. La diferencia máxima entre
las dos curvas se observó a Vc = 90 “nt/seg (p<0,001).
Por el contrario, la exposición de espermatozoides capacitados a hFF no tuvo ningún
efecto sobre la linealidad de los mismos (p>0,l), hecho que se pone de manifiesto en la
superposición de las curvas de distribución con y sin fluido (Figura 14, panel inferior).
3. CARACTERLSTICAS DEL MEDIO DE CAPACITACIÓN Y REACCIÓN
ACROSOMAL
3.]. Efecto de la composición salina del medio sobre la reacción acrosomal
inducida por fluido folicular
El efecto de pequeñas variaciones en la composición salina del medio de capacitación
sobre la respuesta de los espermatozoides a la estimulación con fluido folicular puede
observarse en la Figura 15.
Si bien los espermatozoides incubados en cualquiera de los 3 medios: HSM, BWW y
Ham's F-lO, fiieron capaces de sufrir reacción acrosomal ante la estimulación con
fluido, se observó que se lograba una estimulación mayor (p<0,01) si los
espermatozoides se habían capacitado en HSM (8 i l % control, 28 i 3 % fluido) que si
se habian capacitado en BWW (8 i 2 % control, l7 i 2 % fluido) o en Ham's F-lO (6 i
l % control, 19 i 4 % fluido). No se observaron diferencias en la capacidad de
respuesta entre espermatozoides incubados en BWW o Ham's F-lO.
40
HSM
(D< 30- To J
É iQ - HAM'S8 waÉm 20(D<._I 3._|LIJ
o 10°\ T
77(FéC FF
Figura 15: Efecto de la composición salina del medio de capacitación sobre el %espermatozoides reaccionados en respuesta a fluido folicular. Espermatozoidesprocedentes de un mismo eyaculado se capacitaron durante 22 horas en HSM (El),BWW (El) o Ham’s F-10 ([1), suplementados con 26 mg/ml BSA y se incubaronluego durante 30 minutos adicionales en presencia de hFF 10% (FF) o medio (C).Las barras corresponden a media i SEM. n = 10.
3.2. Efecto del suplemento proteico del medio de capacitación sobre la respuesta al
fluido folicular.
El efecto de la naturaleza del suplemento proteico en el medio de capacitación sobre la
reacción acrosomal inducida por fluido folicular se ilustra en la Figura 16.
Los espermatozoides capacitados en medio conteniendo BSA, cuadmplicaron (p<0,05)
el porcentaje de reacción acrosomal como consecuencia de la exposición al fluido
folicular. No se observaron diferencias (p>0,6) entre aquellos espermatozoides
incubados en HSM-BSA al 2,6% (6 i- l % control, 22 i 3 % fluido) y los incubados en
HSM-BSA al 3,5% (7 i l % control, 24 i 3 % fluido). Por el contrario, los
espermatozoides incubados en medio suplementado con FCS no reaccionaron en
respuesta a la estimulación con fluido: 6 i 2 % control, 6 i 2 % fluido.
La Figura l7 ilustra el efecto del agregado simultáneo de los dos suplementos proteicos,
BSA y FCS, al medio de capacitación.
Nuevamente se observa que los espermatozoides capacitados en presencia de BSA al
2,6%, cuadruplicaron (p<0,05) su porcentaje de reacción acrosomal como consecuencia
de la exposición al fluido folicular (5 i l % control, 23 i 4 % fluido) mientras que no se
produjo respuesta al fluido luego de la capacitación en FCS (7 1- l % control, 6 i 2 %
fluido, NS). La presencia simultánea de FCS y BSA al 2,6% en el medio de capacitación
también anuló la respuesta al fluido folicular : 4 i l % control, 7 i 2 % fluido (NS). Una
vez llevada a cabo la capacitación en presencia de FCS, el agregado de BSA al 2,6%
durante la exposición al fluido folicular, no revirtió la inhibición de la respuesta al fluido:
4 i l % control, 4 i l fluido (NS).
40
358
30ï J
%CELULASREACCIONADAS
0..
Figura 16: Efecto del suplemento proteico en el medio de capacitación sobre el %espermatozoides reaccionados en respuesta a fluido folicular. Espermatozoidesprocedentes de un mismo eyaculado se capacitaron durante 22 horas en HSMsuplementado con 26 mg/ml BSA (26B [1), 35 mg/ml BSA (35B [3) o 7,5% FCS(FCS [1) y se incubaron luego durante 30 minutos adicionales en presencia de hFF10% (FF) o medio (C). Las barras corresponden a media i SEM. n = lO.
40
30_ BSA
‘12
2S8Í]5 2oÉ
É FCSFCS+BSA
FCS+BSA10_ tardío
a ï i
o-.. _ . _//¿ _%-_FF c FF c FF
Figura 17: Efecto del agregado simultáneo de BSA y FCS al medio de capacitaciónsobre el % espermatozoides reaccionados en respuesta a fluido folicular.Espermatozoides procedentes de un mismo eyaculado se capacitaron durante 22horas en HSM suplementado con 26 mg/ml BSA (BSA E] ), 7,5% FCS (FCS El)oambos (FCS + BSA [1). Se ensayó además el efecto del agregado de BSA aespermatozoides previamente capacitados en FCS (FCS + BSA tardío El). Losespermatozoides capacitados se incubaron durante 30 minutos adicionales enpresencia de hFF 10% (FF) o medio (C). Las barras corresponden a media ¿rSEM.n = 7.
Para evaluar la reversibilidad del efecto inhibitorio del FCS sobre la capacitación, se
realizó un experimento de intercambio de medios luego de la capacitación, cuyos
resultados se ilustran en la Figura l8.
Los espermatozoides incubados durante l8 horas en BSA al 2,6% perdieron
rápidamente la capacidad de reaccionar en respuesta al fluido folicular al cabo de l hora
de incubación en FCS: 9 i l % control, 8 i l % fluido (n = 10; NS). Los
espermatozoides incubados durante l8 horas en FCS al 7,5% y luego en BSA al 2,6%
durante l hora tampoco respondieron a la estimulación con fluido folicular: 4 i l %
control, 7 i 2 % fluido (n = lO; NS).
Se observó un ligero pero aún no significativo aumento en la respuesta al fluido folicular
cuando la capacitación durante 18 horas en FCS al 7,5 % fiJe seguida de una incubación
en BSA al 2,6% durante 4 horas: 4 i l % control, 9 1L2 % fluido (n = ll", NS). La
resuspensión de los espermatozoides capacitados en BSA al 2,6% en ese mismo medio
no bloqueó la respuesta al fluido folicular, indicando que el efecto inhibitorio observado
con FCS no puede atribuirse al manipuleo de las muestras.
40
w 18 hrs CAPACITACION FCSá<á 30 5O<uJDC
2 2° ‘.1D_lEj BSA 4hrs
¿e 1o - CONTROL i
T BSA1hr
7 T 7T T V To_Á. #1! /C FF c FF C FF
40m 18 hrs CAPACITACION BSA<2 CONTROLZo 30 _6 i0<LUDi
‘S 20 D_1
8¿e FCS 1'" FCS 4hrs
1o — T
7% 7O _.
Figura 18: Reversibilidad del efecto de FCS y BSA en el medio de capacitaciónsobre el % espermatozoides reaccionados en respuesta a hFF. Espermatozoides deun mismo eyaculado se capacitaron durante 18 horas en HSM suplementado conFCS (panel superior) o BSA (panel inferior). Luego de centrifugar a 300xgdurante 10 minutos, los espermatozoides previamente incubados en FCS seresuspendieron en BSA (panel superior U) y los incubados en BSA seresuspendieron en FCS (panel inferior D). Como control, una alícuota secentrifugó y resuspendió en el mismo medio: FCS El, BSA l] . Las distintasalícuotas se capacitaron durante l y 4 horas más y finalmente se incubaron otros30 minutos en presencia de hFF 10% (FF) o medio (C). Las barras corresponden amedia i SEM. n = 10.
4. CARACTERÍ_STICASDEL MEDIO DE CAPACITACIÓN Y PARÁMETROS
DE MOTlLlDAD
4.1. Efecto de la composición salina del medio sobre la motilidad de los
espermatozoides luego de 2 horas de incubación en condiciones capacitantes
Se construyeron las curvas de distribución acumulativa para velocidad curvilínea (Vc) y
linealidad (L) de espermatozoides luego de 2 horas de capacitación en HSM, BWW o
Ham's F-lO, suplementados con BSA al 2,6%.
No se encontraron diferencias en velocidad curvilínea entre los 3 medios utilizados
(Figura 19A). Sin embargo las curvas de distribución para linealidad en Ham's F-lO y
BWW fueron significativamente diferentes (Figura 19B). La curva de BWW se
encuentra desplazada hacia la izquierda en el gráfico, indicando que existe en ese medio
una mayor fracción de espermatozoides con movimiento menos lineal que en Ham's F
lO. El punto de mayor diferencia entre ambas curvas se encontró para L = 5 (p<0,05).
4.2. Efecto del suplemento proteico del medio sobre la motilidad de los
espermatozoides luego de 2 horas de incubación en condiciones capacitantes
Se construyeron las curvas de distribución acumulativa para velocidad curvilínea (Vc) y
linealidad (L) de espermatozoides luego de 2 horas de capacitación en HSM
suplementado con BSA al 2,6% (HSM-268), BSA al 3,5% (HSM-358) y FCS al 7,5%
(HSM-PCS).
No se observaron diferencias en las distribuciones para ninguno de los parámetros
cuando los espermatozoides se incubaron en HSM-268 o HSM-35B (Figura 20A y B).
100 —
8°< + wa+ HSM+ HAM'SF-10
60
%ACUMULATIVODEESPERMATOZOIDES
40 q
2o J
A
o - a ,
O 40 80 120 160 200
VELOCIDAD CURVILINEA (pm/seg)
U) g Y
Lu a9 10041 vo á íN ‘O 3 + wa 1*- ao — ‘
g í —o— HSMo; + HAM'SF-10É 60 4'(I) p e
LU í a
Lu ; i
0 40o ..>_ Í¡_. ‘ i
5 20 ¿j i
É 3 B
8 o ‘ n ‘
<5 o 2 4 6 8 1o°\LINEALIDAD
Figura 19: Efecto de la composición salina del medio de capacitación sobre lavelocidad curvilínea (A) y la linealidad (B) de espermatozoides humanos. Losespermatoozides se capacitaron durante 2 horas en HSM (o-o), BWW (0-...) oHam’s F-10 (o——o)suplementados con 26 mg/ml BSA. Las curvas corresponden ala distribución acumulativa porcentual para cada parámetro de motilidad en cadauno de los medios, evaluado mediante un sistema CASA.
—o— 26B
+ 353 ‘80_ + ch
%ACUMULATIVODEESPERMATOZOIDES
A
o - a a ,
o 4o ao 120 160 200
VELOCIDAD CURVILINEA (um/seg)
(D
É ï6 "’07[5' 1 + 26Bz 80; + 358É ; —-— ch iLlJ
% 60 « ‘'-'-' 1
uJ 1
o o 1o 4o —. i2 l|- ‘ \S 20 — ÍD l
3 * B 1
2 o ‘¿e o 2 4 e a 1o
LINEALlDAD
Figura 20: Efecto del suplemento proteico en el medio de capacitación sobre lavelocidad curvilínea (A) y la linealidad (B) de espermatozoides humanos. Losespermatozoides se capacitaron durante 2 horas en HSM suplementado con 26mg/ml BSA (0-0), 35 mg/ml BSA (H) o 7,5% FCS (H) . Las curvascorresponden a la distribución acumulativa porcentual para cada parámetro demotilidad en cada uno de los medios, evaluado mediante un sistema CASA.
La incubación en HSM-FCS produjo, sin embargo, un efecto bifásico sobre la velocidad
curvilínea. Se observó una fracción mayor de células "lentas" en el rango de velocidades
entre 40 y 80 pnl/seg pero una fracción significativamente mayor (p<0,05) de células
rápidas en el rango de velocidades entre 120 y 160 ¡im/seg. También se observó una
fracción mayor de espermatozoides menos lineales (p<0,05) luego de la incubación en
FCS, comparado con la incubación en medio suplementado con BSA.
5. ENSAYO PILOTO PARA COMPARAR LA REACCIÓN ACROSOMAL
INDUCIDA POR FLUIDO FOLICULAR EN INDIVIDUOS NORMALES Y
PACIENTES INFÉRTILES
Las características seminales de los dos grupos de individuos que participaron en el
estudio se resumen en la Tabla VI.
TABLA VI: Ensayo piloto: Características seminales de individuos normales ypacientes infértiles sin causa aparente.
Normales Infértiles(n = 12) (n = 15)
Concentración (IDG/ml) 103.7 i 15.8 44.1 i 73*
Motilidad (%) 79 i 4 45 i 4*
VC40 (%) 31i 6 36i6
L3 (%) 10 ¿r 3 15 i 2
Los valores corresponden a media i ES.* p<0,05 con respecto a los normales (Mann -Whitney).
Tanto la concentración de espermatozoides como el porcentaje de motilidad de los
mismos fiie significativamente menor en el grupo de pacientes que en el grupo de losé
individuos normales. Por otra parte no se encontraron diferencias significativas entre
ambos grupos en los parámetros de motilidad VC4oy L3.
La capacidad de respuesta al fluido folicular por parte de espermatozoides capacitados
procedentes de 12 dadores voluntan'os y ¡5 pacientes infértiles se ilustra en la Figura 2 l.
En todos los individuos normales se observó un aumento del porcentaje de
espermatozoides reaccionados en presencia de fluido con respecto al control, mientras
que en 6 de los 15 (40%) pacientes estudiados la exposición al fluido no modificó el
porcentaje de reacción acrosomal. Al construir el intervalo de confianza del 95% para la
población normal se encontró que una diferencia s 1% entre espermatozoides expuestos
al fluido y espermatozoides control se encontraba fuera del rango normal. En
consecuencia, 9 de los 15 pacientes estudiados presentaron una respuesta al fluido
folicular indistinguible de aquélla de los individuos normales.
Los pacientes se agruparon entonces en dos categon'as según hubieran respondido o no
a la estimulación con fluido folicular: RA+ incluye a todos aquéllos que respondieron al
fluido en forma indistinguible de los individuos normales; RA- incluye a aquellos
pacientes que resultaron estar fiJera del rango normal. Analizamos para cada subgrupo
las caracteristicas seminales (Tabla VIl).
(J‘I oDonantes lnfértiles
.h Ol
(A) Ol
.A Ol
°/oESPERMATOZOIDESREACClONADOS
N
oo
O -n -r1o 'l'l 'l'l
Figura 21: Reacción acrosomal espontánea (C) e inducida por fluido folicular (FF)en espermatozoides de donantes fértiles (o—o panel izquierdo; n=12) y pacientesinfértiles sin causa aparente (0.-. panel derecho; n=15). Los espermatozoides secapacitaron durante 22 horas a 1-3 xlOG/mly se incubaron luego durante 30minutos más en presencia de hFF (FF) o medio (C).
TABLA VII: Estudio Piloto: características seminales de pacientes infértiles
RA+ y RA
Pacientes RA+ Pacientes RA(n = 9) (n = 6)
Concentración (106/ml) 48.3 i 12.0 37.6 i 12.2
Motilidad (%) 47 i 7 43 i 6
VC40(%) 34 i 8 39 i 12
L3 (%) 14 i 3 18 i 5
Los valores corresponden a media i ESp>0,05 (Mann - Whitney) para los 4 parámetros evaluados
Se observó que tanto la concentración de espermatozoides y el porcentaje de motilidad
como los parámetros de motilidad Vc40 y L3 no presentaron diferencias significativas
entre ambos grupos (p>0,05), a pesar de la respuesta diferencial al fluido folicular.
6. ESTUDIO POBLACIONAL DE LA REACCIÓN ACROSOMAL INDUCIDA
POR FLUIDO FOLICULAR
6.1. Población normal.
Tal como se esperaba, los parámetros seminales de los individuos normales que
participaron de este estudio, se encontraron dentro del rango de normalidad establecido
por la OMS. Las medianas poblacionales de los parámetros evaluados, como así también
sus rangos intercuartilos, se señalan en la Tabla VIll.
TABLA VIII: Parámetros seminales en la población normal (n = 58) estudiada.
Parámetro Mediana Rango Intercuartilo
Concentración (x106/ml) 101 7o —133
% Motilidad 78 65 - 87
Progresión 3.5 3.3 - 3.8
V040 23 l3 - 43
% Formas normales 12 9 - 17
El %RA medio en la población fértil se calculó utilizando en el valor de %RA obtenido
con la primera muestra de semen de cada individuo y fue 17 i 1 % (mediana = 15%; 25
percentilo = 12%; 75 percentilo = 22; n = 58). La curva de distribución de %RA (Figura
22) se aproxima bastante a una distribución Gaussianai
Se construyó un intervalo de confianza del 95% para %RA y se encontró que valores
de %RA menores que 5% deberían considerarse fuera del rango normal. Es importante
notar que la construcción repetida de este intervalo de confianza durante un período de
5 años, arrojó consistentemente los mismos resultados,
En la Figura 23 se muestra un histograma de frecuencias para %RA en la población
normal. El 83% de los donantes presentó un valor de %RA superior al 9%, mientras
que sólo 2% de los individuos tuvo %RA menor que 5%, es decir, filera del rango
normal.
NUMERODEINDIVIDUOS
AI l
o../\./0 10 20 30 40 50
°/oRA
Figura 22: Curva de distribución de %RA en la población de donantes fértiles(n=58). La curva se construyó utilizando el %RA obtenido con la primera muestraproporcionada por cada donante.%RA = (% espermatozoides reaccionados en presencia de hFF) — (%espermatozoides reaccionados en medio sólo)
Se calculó la variabilidad intraindividuo del ensayo utilizando múltiples muestras
(rango 2-27; mediana 4) de cada individuo. El intervalo de confianza del 95% para cada
individuo incluyó 4 unidades de %RA por encima y por debajo de su valor medio; el
intervalo de confianza del 67% fue de 1-2 unidades de %RA.
6.2. Población de pacientes infértiles.
Las medianas poblacionales con sus correspondientes rangos intercuartilos de los
parámetros seminales evaluados en la población infértil se muestran en la Tabla IX.
TABLA IX: Parámetros seminales en la población de pacientes infértiles (n = 242)estudiada. Comparación con la población normal.
MedianaParámetro (Rango intercuartilo)
Pacientes infértiles Individuos normalesConcentración (x106/ml) 38.5* 101
(20 s 60) (7o —133)% Motilidad 48* 78
(38 —57) (65 —87)Progresión 2.8 3.5
(2.6-3.0) (3.3-3.8)V040 23 23
(15*33) (13-43)% Formas normales 8* 12
(4 — 11) (9 —17)
* Significativamente menor (p < 0.05) que en individuos normales (Mann - Whitney)
La concentración de espermatozoides, el % motilidad y el % formas normales fiieron
significativamente menores (p < 0,05) para la población de pacientes infértiles que para
los individuos normales.
80
°/oINDIVIDUOS
Figura 23: Histograma de frecuencias para %RA en la población fértil (n=58).Valor normal = %RA 2 5%.
La curva de distribución de %RA para la población de pacientes infértiles estudiada
(Figura 24) fue marcadamente distinta de la distribución de %RA en la población
normal y, definitivamente, no se ajusta a una distribución Gaussiana. La mediana de la
población infértil fue de 3%, con el 25 percentilo en 1% y el 75 percentilo en 9%.
La Figura 25 muestra el histograma de frecuencias de %RA para la población infértil
(panel inferior) y su fimdamental diferencia con el histograma correspondiente a la
población normal (panel superior).
El 60% de los pacientes estudiados presenó un valor de %RA menor que 5%, es decir,
fuera del rango normal; sólo en el 26% de los pacientes el %RA fue superior al 9%.
Como no se intentó excluir ningún paciente de este estudio por razones clínicas, la
población final incluyó una gran variedad de sujetos: desde individuos cuyas
características seminales eran indistinguibles de aquéllas de los individuos normales,
hasta individuos con semen de muy mala calidad. Es así que fue posible identificar
fácilmente varios subgrupos de pacientes.
El primer grupo, que llamamos "buen semen" (BS, n = 56) mostró valores normales de
concentración de espermatozoides, porcentaje de motilidad, calidad de motilidad
(medida a través de la escala de 0-4 y del parámetro V040) y morfología estricta. Estos
pacientes daban la impresión inicial de ser potencialmente fértiles y, en la mayoría de los
casos, así habían sido considerados por el médico que los derivara al G&IVF.
En un segundo grupo de pacientes, al que se llamó "desorden morfológico aislado"
(DM, n = 47) la concentración de espermatozoides y el porcentaje y calidad de
motilidad se encontraban dentro del rango normal, pero el porcentaje de formas
60 . . . . 10
PACIENTESINFERTILES
NUMERODEINDIVIDUOS
-—-DADORESNORMALES
40 50
%RA
Figura 24: Curva de distribución de %RA para dadores normales (——n=58) ypacientesInfértiles(- n=242).
%lNDIVIDUOS
%lNDIVIDUOS
80
80
NORMALES
0-4 9-12 13+5-8% AR
INFERTILES
93
Figura 25: Histograma de frecuencias para %RA en individuos normales (panelsuperior; n=58; [1)y pacientes infértiles (panel inferior; n=242; D). Valor normal =%RA 2 5%.
normales según criterios estrictos era bajo (menor del 10%). Previo a ser derivados al
G&lVF, estos pacientes también habian sido considerados fértiles.
Por lo tanto, 103 de los 232 pacientes estudiados (44%) se ubicaron dentro de los
grupos BS y DM y se había considerado inicialmente que tenían semen de buena calidad.
Los 129 pacientes restantes presentaron semen de baja calidad, reflejada en la
concentración de espermatozoides y/o motilidad y/o morfología. Los 16 pacientes que
mostraron una concentración de espermatozoides menor que lelOÓ/ml, menos del 10%
de formas normales y menos del 40% de motilidad se reunieron arbitrariamente en un
grupo con semen de calidad extremadamente baja (mal semen, MS). Los l l3 pacientes
restantes, con parámetros seminales fuera del rango normal, pero sin llegar a ser
extremos, se reunieron en el grupo "semen subóptimo" (SS). Las características
seminales de la población infértil total y de las cuatro subpoblaciones, como así también
las de la población normal, se resumen en la TablaX.
TABLA X: Parámetros seminales para los individuos fértiles, la población infértiltotal y los distintos subgrupos de pacientes infértiles.
Población Concentración Motilidad Progresión VC40 Morfología(xlOó/ml) (%) (%) (%)
Fértil 101 78 3.5 23 12(n=58) (70- 133) (65-87) (3.3-3.8) (13 -43) (9- l7)
lnfértil total 38.5 48 2.8 23 8(n=232) 20-60 (38-57) (26-30) (15-33) (4- ll)
BS 64.2 58 3.0 18 13(n=56) 440-95) (¿62 (29-32) (14-24) (ll-15)
DM 41.3 52 3.0 19 5(n = 47) (35 - 58) (50 - 56) (28 - 3.0) (16 - 22) (4 - 7)
SS 29.8 41 2.7 30 7.1
(n = l l3) (20-45) (32-48) (2.5-2.8) (22-38) (4-9)MS 6.5 41 2.5 28 3.6
(n = 16) (3 5-80) (33-45) (25-27) (22-28) (LS-5.0)
Los valores corresponden a mediana y su (rango intercuartilo)
Los pacientes se asignaron a los distintos subgrupos sin tener en cuenta el valor de
%RA. La Figura 26 muestra los histogramas de frecuencias para estos cuatro subgrupos
de pacientes. Se observó que a medida que las características del semen se deterioraron,
según criten'os clásicos, se produjo un aumento progresivo en el número de individuos
con valores de %RA por debajo del rango normal (Test para Alternativas Ordenadas;
p=0,01)_
Ya que el valor de %RA parecía estar relacionado en cierto modo con las características
del semen, se analizó la relación entre los valores de %RA y algunos parámetros
seminales, tales como la concentración de espermatozoides, el porcentaje de motilidad,
VC40y el porcentaje de formas normales, a través del test de correlación de Speannan.
%RA correlacionó significativamente con morfología (r = 0.509; p<0.001),
concentración de espermatozoides (r = 0.524; p<0.001 ), motilidad progresiva
(r = 0.416; p<0.001) y porcentaje de motilidad (r = 0.356; p<0.001), pero no se
observó correlación con VC40.
En virtud de la conocida importancia de la morfología estricta como medida de la
fiJncionalidad del esperrnatozoide, se analizó especialmente la relación entre %RA y
morfología estricta a través de un análisis de cuadrantes. Se realizó, entonces, un gráfico
del porcentaje de formas normales en función del valor de %RA para cada paciente
(Figura 27). Dado que los dos parámetros se encuentran estadísticamente relacionados,
se utilizó el coeficiente de correlación entre los mismos como la pendiente de un eje y la
perpendicular sobre la mediana como el otro eje (análisis de factores).
100
80
60
40
20%INDIVIDUOS
100
80
°/oINDIVIDUOS
100
80
60
40
20°/oINDIVIDUOS
%INDIVIDUOS
Buen Semen
0-4 5-8 9-12 13+
Desorden Morfológico
0-4 5-8 9-1 2 13+
Semen Subóptimo
357,. ' ,73,;5-8 9-12 13+
Malsemen
5-8 9-12 13+RA (%)
Figura 26: Histograma de frecuencias para %RA en los cuatro subgrupos depacientes infértiles: Buen Semen (BS; n=56; D); Desorden Morfológico (DM;n=42; El); Semen Subóptimo (SS; n=113; [1) y Mal Semen (MS; n=16; D). Valornormal = %RA 2 5%.
%DEESPERMATOZOlDESNORMALES
%RA
Figura 27: Gráfico de correlación entre %RA y % espermatozoides normales ensemen según criterios estrictos, para individuos normales (V) y pacientes infértiles(o). El coeficiente de correlación de Spearman entre ambas variables se usó comoeje principal y la perpendicular al mismo sobre la mediana (17,13) como segundoeje.
Se observó que 83% de los pacientes cayeron dentro del cuadrante caracterizado por
formas normales < 10% y %RA < 20%, mientras que los individuos pertenecientes a la
población normal se dístribuyeron uniformemente en los cuatro cuadrantes (test de X2).
Una vez más se puso de manifiesto el comportamiento marcadamente diferente de la
población infértil con respecto a la población normal.
7. ESTUDIO D_ELVALOB DIAGNÓSTICO DE LA REACCIÓN ACROSOMAL
INDUCIDA POR FLUIDO FOLICULAR CON RESPECTO A LA CAPACIDAD
FERTILIZANTE IN VITRO
7.1. Población infértil total
La mediana del porcentaje de fertilización para la población infértil total (PT; n = 232)
file 25% (rango intercuartilo 5-58%). El número de ovocitos disponible para la
fertilización van'ó entre l y 29, con una mediana de 5 ovocitos. Todos los ovocitos
aspirados fueron evaluados por el mismo embriólogo y se calificaron según su calidad en
una escala de l a 5 (l = mala; 2 = regular; 3 = buena; 4 = muy buena; 5=excelente); la
mediana poblacional para la calidad de los ovocitos fiJe 3. La edad de las mujeres que
participaron en el estudio osciló entre 23 y 45 años, con una mediana de 35.
La relación entre el porcentaje de ovocitos fertilizados in vitro y el porcentaje de
espermatozoides capaces de sufrir reacción acrosomal en respuesta al fluido folicular se
ilustra en la Figura 28, para la población infértil total.
La mediana del porcentaje de ovocitos fertilizados ¡n vitro aumentó a medida que
aumentó la capacidad de respuesta al fluido folicular (%RA). La mediana del porcentaje
de fertilización fue solo 12% (rango intercuartilo O-50%) para pacientes RA- (%RA <
5%) y aumentó progresivamente con %RA hasta alcanzar un máximo de 50% (rango
20-71%) para pacientes con %RA > 9%,
Con el objeto de analizar el valor estadístico del ensayo de %RA, se calcularon
sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivo y negativo y razón de
probabilidades (Tabla XI).
TABLA XI: Sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivo (VPP) ynegativo (VPN) y razón de probabilidades (RP) para la reacción acrosomal (%RA)como indicadora del éxito en FIV para la población total de pacientes infértiles.
N Sensibilidad Especificidad VPP VPN RP
PT 232 0.71 0.55 0.49 0.75 29*(1.6-5.0)
PT 183 0.77 0.57 0.47 0.83 45*(>2 ovocitos) (23-89)
* p<0.05 por X2al comparar el éxito en FIV de pacientes con RA+ y RA
El 75% de los pacientes RA+ logró fertilizar por lo menos un ovocito (VPN = 0.75),
mientras que el 49% de los pacientes RA- no logró fertilizar ningún ovocito (VPP =
0.49). De todos los pacientes que no lograron fertilización alguna, 71% fue RA
(sensibilidad = 0.71); mientras que de todos los pacientes que fertilizaron algún ovocito,
55% fue RA+ (especificidad = 0.55). La razón de probabilidades de 2.9 indica que los
pacientes RA+ tienen 3 veces más probabilidad de fertilizar por lo menos 1 ovocito en
FIV que los pacientes RA-. Este análisis se llevó a cabo considerando todos los
pacientes, independientemente del número de ovocitos disponible para fertilizar. Si
consideramos solamente aquellos pacientes con 3 o más ovocitos disponibles, el VPN y
la razón de probabilidades aumentaron, mientras que el VPP no cambió.
80
60
40
20
%OVOCITOSFERTILIZADOS(MEDIANA)
n= 232
0-4 5-8 9-12 13+
% RA
Figura 28: Porcentaje de ovocitos fertilizados in vitro (mediana) para la poblacióninfértil total (PT; n=242) en función de la capacidad de los espermatozoides desufrir reacción acrosomal en presencia de hFF (%RA).
Con el objeto de evaluar la efectividad del ensayo en predecir fertilización se
construyeron curvas ROC para %RA (Figura 29). Asimismo se construyeron las ROC
para la concentración de espermatozoides y el porcentaje de formas normales en semen,
ya que estos dos parámetros seminales también mostraron una importante correlación
con el porcentaje de fertilización in vitro (sección 8). Los pacientes se dividieron
entonces, en 2 categorias: aquéllos que no fertilizaron ningún ovocito y aquéllos que
fertilizaron por lo menos l ovocito. Las curvas se construyeron como el porcentaje
acumulativo de pacientes que no fertilizaron (ordenadas) en fiJnción del porcentaje de
los que si fertilizaron (abscisas), para valores crecientes de %RA, concentración o
morfología.
Las curvas ROC para los 3 parámetros analizados se ubicaron hacia la izquierda de la
línea de identidad, que representa un ensayo hipotético carente de valor clínico. Por lo
tanto, cualquiera de los 3 parámetros sería, en principio, potencialmente útil para
predecir si ocurrirá fertilización o no. El valor clinico del ensayo está dado por el área
bajo la curva ROC correspondiente: a mayor área, mayor valor clínico. Por lo tanto, la
posición relativa de las curvas ROC obtenidas indicaría que %RA y morfología serían
igualmente buenos y a su vez, algo mejores que la concentración de espermatozoides
para predecir si habrá fertilización.
7.2. Subgrupos de pacientes infértiles.
La Figura 30 ilustra la mediana del porcentaje de ovocitos fertilizados para cada uno de
los 4 subgrupos de pacientes ya mencionados (Tabla X).
El porcentaje de ovocitos fertilizados in vitro (mediana) disminuyó a medida que se
deterioraron las características seminales. Para los pacientes con valores seminales
z8É 100 n l l u:l|o:tEo 80 - zLIJ
8a, 60 — —LUp.zLLJ
É 4o - —
La ——- CONCENTRACIONo — MORFOLOGIA2 20 ‘ °/ RA¡_ o
É28 o l l l l< 0 20 40 60 80 100o\°
% ACUMULATIVO DE PACIENTES QUE FERTILIZARON
Figura 29: Curvas ROC para concentración de espermatozoides en semen (—), %formas normales en semen (—) y %RA (-——.)como predictores del éxito en FIV. Segraficó el % acumulativo de pacientes que no fertilizaron ningún ovocito enfunción del % acumulativo de pacientes que fertilizaron por lo menos un ovocito,para valores crecientes de cada parámetro evaluado. La diagonal (—) representaun ensayo hipotético que carece de valor clínico.
" " ' Ill3
60
n=56
960VOCWOSFERWLQADOS(MEDMNA)
Figura 30: Mediana del % 0v0citos fertilizados in vitro por la población infértiltotal (PT; n=232; Ü) y los cuatro subgrupos de pacientes infértiles: Buen Semen(BS; n=56; D); Desorden Morfológico (DM; n=42; EJ); Semen Subóptimo (SS;n=113; Ü) y Mal Semen (MS; n=16; Ü). Valor normal = "/oRA2 5%.
" " ' 104
tradicionales indistinguibles de los individuos normales (BS), el porcentaje de
fertilización fiJe 46%; los pacientes con desorden morfológico aislado (DM) fertilizaron
29% de los ovocitos y los pacientes con semen subóptimo (SS) fertilizaron 25% de los
ovocitos. Los pacientes con caracteristicas seminales severamente anormales (MS)
fertilizaron 0% de los ovocitos. La edad de la mujer en cada grupo, como así también el
número de ovocitos disponibles para fertilizar y la calidad de los mismos fiJeron
semejantes para la población total y los distintos grupos de pacientes (Tabla Xll).
TABLA Xll: Edad de la mujer, calidad de los ovocitos y número de ovocitosdisponibles para fertilizar en la población total y los 4 subgrupos de pacientesinfértiles.
PTEdad de la
Calidad
Ovocitos
Los valores corresponden a mediana con su (rango intercuartilo)
Al estudiar el porcentaje de fertilización en fimción de la reacción acrosomal, dentro de
cada subgrupo de pacientes, se observó un comportamiento semejante al de la población
total (Figura 31). El porcentaje de ovocitos fertilizados in vitro aumentó al aumentar el
porcentaje de reacción acrosomal inducido por fluido folicular en todos los subgrupos
salvo MS, cuya mediana de % fertilización fue 0%.
80 . u u
c»o l
OOO)
%OVOCITOSFERTILIZADOS(MEDIANA)
.ho I
I
0-4 5-8 9+
%RA
Figura 31: Mediana del % ovocitos fertilizados in vitro por la población infértiltotal (PT o) y por cada subgrupo de pacientes en función de la capacidad de losespermatozoides de sufrir reacción acrosomal en respuesta a hFF (%RA). BS (o) =Buen Semen; DM (o) = Desorden Morfológico; SS (o) = Semen Subóptimo; MS(o)= Mal Semen.
Entonces, se recalcularon sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivos y
negativos y razón de probabilidades, para la reacción acrosomal dentro de cada uno de
los subgrupos (Tabla XIII), con el objeto de analizar si el valor estadístico del ensayo
era mayor para algún subgrupo de pacientes en particular.
TABLA XIII: Sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivo (VPP) y
negativo (VPN) y razón de probabilidades (PP) para la reacción acrosomal (%RA)
como indicadora del éxito en FIV en la población total y en los distintos subgrupos
de pacientes infértiles.
N Sensibilidad Especificidad VPP VPN RP
PT 232 0.71 0.55 0.49 0.75 2.9*(1 6-50)
PT 183 0.77 0.57 0.47 0.83 45*(>2 ovocitos) (2.3-89)BS 56 0.27 0.83 0.36 0.76 1.77
(OS-6.9)BS 46 0.36 0.83 0.40 0.81 2.76(>2 ovocitos) (0.6-1 1.5)MD 47 0.65 0.5 0.42 0.71 1.83
(OS-5.8)MD 40 0.69 0.52 0.41 0.78 2.42(>2 ovocitos) (0.6-8.7)SS 113 0.82 0.43 0.49 0.78 3.44*
(1 4-8.0)SS 81 0.92 0.48 0.44 0.93 10.7*(>2 ovocitos) (ZZ-35.7)MS 16 0.92 O 0.73 O 0.85
(003-251)MS 15 0.92 O 0.79 0 1.09
(>2 ovocitos) (004-334)
p<0.05 por X2al comparar el éxito en FIV de pacientes RA+ y RALa razón de probabilidades se expresa con su intervalo de confianza del 95%
Los valores predictivos positivo y negativo para los subgrupos no cambiaron con
respecto a los de la población total. La razón de probabilidades, sin embargo, aumentó
para individuos con caracteristicas seminales subóptimas pero no para los otros grupos
de pacientes. En todos los casos, la razón de probabilidades aumentó al considerar sólo
aquellos pacientes que hubieran tenido más de dos ovocitos disponibles para fertilizar.
Tal como se mencionara anteriormente, se observó un marcado aumento en el número
de pacientes RA- a medida que se deterioraron las caracteristicas seminales (Figura 26).
La Figura 32 vuelve a ilustrar este concepto al mostrar el marcado descenso en el
cociente entre el número de pacientes RA+ y el numero de pacientes RA- para cada uno
de los subgrupos de pacientes, a medida que se pasa del grupo BS al MS.
En cambio, la misma figura muestra claramente que tanto el cociente entre el número de
pacientes con mujer mayor de 35 años / menor de 35 años, como el cociente entre el
número de pacientes que presentaron ovocitos de buena / mala calidad, fueron
semejantes para todos los subgrupos de pacientes. Por lo tanto, las diferencias
observadas en los porcentajes de fertilización entre los distintos subgrupos podrían muy
bien atribuirse a diferencias en %RA pero no a diferencias en la calidad de los ovocitos
o la edad de la mujer.
Desde otro punto de vista, se segregaron los pacientes en dos categorías según la edad
de la mujer (mayor o menor de 35 años), o según la calidad de los ovocitos obtenidos
(buena o mala) y se analizaron los porcentajes de fertilización para estas dos categorías
en todos los subgrupos de pacientes (Tabla XIV).
5
% RA (>/< 5%)
———Calidad ovocitos (buena/mala)
4 " ————-Edad mujer (>/< 35)
E 3 — _Z¡LJOOo 2 _ _
1 - _
0
Figura 32: Cociente entre el número de individuos en cada subgrupo de pacientescon >/< valor umbral para cada uno de 3 factores que podrían afectar el éxito enFIV: %RA (———),edad de la mujer (—) y calidad de los ovocitos inseminados (——).BS = Buen Semen; DM = Desorden Morfológico; SS = Semen Subóptimo; MS =Mal Semen.
TABLA XIV: Tasa de fertilización observada en la población total y los distintossubgrupos de pacientes infértiles en función de la edad de la mujer (>/< 35 años) yla calidad de los ovocitos inseminados (buena 0 mala).
% ovocitos fertilizadosMujer < 35 Mujer > 35 Buenos ovocitos Malos ovocitos
PT 19 42* 29 25(n= 120) (n: 112) (n= 155) (n=77)
BS 33 66* 50 33(n = 27) (n = 29) (n = 37) (n = 19)
DM 20 49 47 20
(n = 25) (n = 22) (n = 33) (n = 14)SS 20 33 20 29
(n = 60) (n = 53) (n = 75) (n = 38)MS 0 20 0 0
(n=8) (n=8) (n= 10) (n=6)
* p = 0.01, Mann-Whitney
Puede observarse que, para todos los subgrupos, el porcentaje de ovocitos fertilizados
fiie alrededor del doble en las mujeres mayores de 35 años con respecto a las menores de
35, siendo esta diferencia estadísticamente significativa para la población total (PT) y el
subgrupo de pacientes con buen semen (BS). Por otra parte, los porcentajes de
fertilización fiieron independientes de la calidad de los ovocitos si consideramos la
población total de pacientes (PT) o los grupos SS y MS. Sin embargo, los porcentajes
de fertilización obtenidos con ovocitos de buena calidad, aunque no significativamemte
distintos, fueron superiores a aquéllos obtenidos con ovocitos de mala calidad en el caso
de pacientes con buen semen (BS) o déficit morfológico aislado (DM).
En cada subgrupo de pacientes, se comparó la mediana del porcentaje de ovocitos
fertilizados por pacientes RA+ con el porcentaje de fertilización de pacientes RA
(Figura 33).
A | 1 l IÉ<_( % RA
{a o 0-4 (RA —)É 60 - I 5+ (RA+)(l)oO<(u_I,: 40 — 0€LLJLI.
(D
,9a 20 - o>o°\°
0 l l l BS DM SS MS
Figura 33: Mediana del % ovocitos fertilizados in vitro por pacientes RA+ (———)yRA- (———)para cada uno de los subgrupos de pacientes infértiles. BS = BuenSemen; DM = Desorden Morfológico; SS = Semen Subóptimo; MS = Mal Semen.
Para los individuos del grupo BS, el porcentaje de ovocitos fertilizados fue 2.5 veces
mayor en los pacientes RA+, mientras que en los individuos de los grupos DM y SS el
porcentaje de fertilización file 4 veces mayor cuando los pacientes eran RA+.
Independientemente de que los pacientes tuvieran características seminales normales
(BS), déficit morfológico aislado (DM) o semen subóptimo (g), los pacientes RA+
fertilizaron entre 50% y 60% de los ovocitos, mientras que los pacientes RA
fertilizaron solamente entre 15% y 20% de los ovocitos. Por lo tanto, la capacidad de los
espermatozoides de reaccionar o no ante la estimulación con fluido folicular parecería
tener mayor influencia que los parámetros tradicionales del semen sobre la capacidad de
un paciente de fertilizar in vitro.
Más aún, la reacción acrosomal parecería tener un impacto mayor sobre la capacidad de
fertilizar in vitro que la morfología estricta (Análisis de Varianza de Dos Factores;
p<0,05), como puede observarse al comparar los grupos BS y DM (Tabla XV).
TABLA XV: Comparación entre los efectos de la calidad de la morfología y lareacción acrosomal sobre los porcentajes de FIV.
% fertilizaciónRA+ RA- RA+/RA
DM 55 13 4.2
BS 50 25 2.0
BS/DM 0.9 1.9
p<0,05 por Análisis de Varianza de Dos Factores
En estos dos grupos, los pacientes presentan concentración de espermatozoides y
motilidad semejante, pero difieren en el porcentaje de formas morfológicamente
normales. Entre todos los pacientes con desorden morfológico aislado (MD), tener RA+
cuadruplica la tasa de fertilización con respecto a tener RA-; mientras que entre todos
los pacientes con RA fallida (RA-), tener buena morfología (BS), sólo duplica la tasa de
fertilización con respecto a tener desorden morfológico aislado (DM). Asimismo, entre
todos los pacientes con semen normal (BS) tener RA+ duplica la tasa de fertilización
con respecto a tener RA- mientras que, entre todos los pacientes que responden
normalmente al fluido folicular (RA+), tener buena morfología (BS) no mejora la tasa de
fertilización con respecto a quienes presentan desorden morfológico aislado (DM).
8. BÚSQUEDA DE UN MODELO AD_ECUADO PARA PRED_ECIR LA
CAPACIDAD FERTILIZANTE DE UNAMUESTRA DE ESPERMATOZOIDES
Tal como se explicara anteriormente, este estudio se llevó a cabo en 2 etapas, utilizando
2 grupos diferentes de pacientes de modo tal que se pudiera verificar la validez del
modelo construido en una primera etapa.
8.]. Etaga de construcción
La mediana del porcentaje de ovocitos fertilizados por el grupo de pacientes (n=82)
incluido en esta primera etapa fue del 25%. El % ovocitos fertilizados correlacionó
significativamente (Spearman, p<0,05) con la concentración de espermatozoides, el %
motilidad y el % de formas normales en semen (Tabla XVI).
No se observó correlación con los parámetros de movimiento, ya sea en semen (V040y
L3) o luego de 2 horas de capacitación (VC60).Sí se encontró correlación significativa (p
< 0,05) con el %RA (Figura 34).
TABLA XVI: Coeficientes de correlación de Spearman entre el % ovocitos
fertilizados in vitro y los parámetros seminales y clínicos evaluados en laconstrucción de un modelo predictivo para FIV
Parámetro Etapa de Construcciónr IC 95 %
% RA O.39* 0.15-O.52
Concentración O.36* O.14-0.51
% Motilidad 0.28* 0.06-0.44
Edad mujer 0.25* 0.05—0.44
% Formas normales 0,24* 0.04-0.44
Concepción previa 0.09 -0.15-0.26
Calidad ovocitos 0.06 -0.24-0. 13
Linealidad < 3 -0. 11 -0.32-0.09
VC60 -0. 13 -0.32-0. 12
Patología ginecológica -0. 15 -0.35-0.06
Vc4o -O.18 -O.39-0.01
IC = Intervalo de confianzar = coeficiente de correlación de Spearman; * p < 0.05 para la correlación de Spearman
En cuanto a parámetros ajenos al espermatozoide, se encontró correlación significativa
(p<0,05) con la edad de la mujer, pero no con la patología ginecológica, la calidad
ovocitaria o la historia de concepción previa del marido.
La mejor correlación se obtuvo con %RA, seguida de concentración de espermatozoides
en semen, % motilidad y % formas morfológicamente normales. Los gráficos del %
ovocitos fertilizados en función de estas 4 variables se muestran en la Figura 34.
U)m o 100 l o o o8 2 ' o< N flo3 g 80 . g oE E ° - ' oE Lu 60 < ow LL o oo o
g 8 40 o . . . .8 I: ‘ i . O> O 0 oo O o ‘ ‘ae 8 20 0‘ C. . . i
EQ ' . o . ' o r = 0.39 10“W
O 50 100 150 200
CONCENTRACION (millones/ml)
w 100 r: o_31 . . ‘ É) 1oo‘- g . o r = 0258 Í : - ‘ s . ' i< 80 a . j 80 - . o l5 o. . . l: C ‘ z . iE ' ' É so . ° lLLI 60 ‘ o LL '
É 1 . . a) o o . o . oO i : ° o i o 4o o .5 «0+ -. . c . -- LO a O O o 0s ‘ - ’ 9 ° °
¿e 20i .. o . lo o l o 20 o . o ‘ . . . . i‘ . ‘ . . o 1 ae . . o
o ‘ - e k — y v F ° ‘ 'o 20 4o so eo ° 1° 2° 3°
es MOTlLlDAD % FORMAS NORMALES
Figura 34: Etapa de construcción de un modelo predictivo del éxito en FIV.Gráficos de correlación (Spearman) entre el % ovocitos fertilizados y algunosparámetros espermáticos: %RA (o), concentración de espermatozoides en semen(o), % motilidad en semen (o), % formas normales en semen (o). r = coeficiente decorrelación de Spearman.
La Figura 35 representa, en forma de cascada, los valores de los coeficientes de
correlación de Spearman con sus correspondientes intervalos de confianza del 95% para
todos los parámetros evaluados.
Al realizar el análisis de regresión escalonada se encontró que %RA era el mejor
indicador del éxito en FIV si se considera una única variable independiente. Al
considerar 2 variables, %RA y concentración en semen resultaron los mejores
indicadores. Aumentar el número de variables consideradas a 3 o más no tuvo ningún
valor estadístico pues ninguno de los parámetros restantes, sumado a %RA y
concentración, aumentó el valor predictivo del modelo.
8.2. Etapa de validación
La mediana del % ovocitos fertilizados por este segundo grupo de pacientes (n=64) fue
del 36%, es decir, diferente de la del grupo de pacientes incluido en la etapa de
construcción. Si bien el % ovocitos fertilizados aumentó progresivamente al aumentar el
%RA en las dos etapas, el punto de partida para ambas curvas fue diferente (Figura 36).
En la etapa de construcción partimos de una base de un 10% de ovocitos fertilizados
para el grupo de pacientes con la menor tasa de fertilización (%RA = 3-6), mientras que
en la etapa de validación partimos de una base de 22% de ovocitos fertilizados para el
mismo grupo. En consecuencia, cuando se quiso predecir el porcentaje de fertilización
en el segundo grupo de pacientes que intervino en la etapa de validación en base al
%RA, se encontró que los valores calculados distaban mucho de los valores reales,
obtenidos en FIV; las tasas de fertilización calculadas a través del modelo resultaban
siempre inferiores a las observadas.
lI. 116
%RA
Concentración
Motilidad
Edad mujer
Formas normales
Concepción previa
Calidad ovo :itos
Vc‘5°
Patología ginecológlca
VC40
l
-0.5 -0.4 -O.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
COEFICIENTE DE CORRELACION
Figura 35: Construcción de un modelo predictivo para FIV. Cascada decorrelaciones de Spearman (IC 95%) resultantes de comparar cada variable con el% ovocitos fertilizados in vitro.
%OVOCITOSFERTILIZADOS
70
60
50
40
30
20
10 +_._ gemas“
0 1-2 3-6
%RA
Figura 36: Mediana del % ovocitos fertilizados en función de %RA para las etapas
de construcción (o—o) y validación (o-—o)de un modelo predictivo para el éxito
en FIV.
118
El % ovocitos fertilizados in vitro correlacionó significativamente (p < 0,05) con 2 de
los parámetros seminales clásicos evaluados: concentración y % formas normales, pero
no con % motilidad (Tabla XVII). No hubo correlación con los parámetros de
movimiento V040, VC60y L3. Nuevamente se encontró correlación significativa con el
%RA y, dentro de los parámetros ajenos al espermatozoide, sólo hubo correlación con
la edad de la mujer.
TABLA XVII: Coeficientes de correlación de Spearman entre el % ovocitosfertilizados in vitro y los parámetros seminales y clínicos evaluados en laconstrucción y validación de un modelo predictivo para FIV
Parámetro Etapa de Construcción Etapa de Validaciónr IC 95 % r IC 95 %
% RA 0.39* 0.15-Or52 0.35* 0.10-0.60
Concentración 0.36* O.l4-O.51 0.30* 0.05-0.55
% Motilidad 0.28* 0.06-O.44 0.07 -0.18-0.32
Edad mujer O.25* 0.05-O.44 O.28* 0.03-0.53
% Formas normales 0.24* 0.04-0.44 0‘26* 0.01-O.51
Concepción previa 0.09 -0.15-0.26 0.18 -0.07-O.43
Calidad ovocitos 0.06 -0.24-O. 13 -0. 13 -O.38-0. 12
Linealidad < 3 -O.11 -0.32-0.09 -O.15 -0.40-0.10
VC60 -O.13 -O.32-0. 12 0.12 -0.16-0.40
Patología ginecológica -O.15 -0.35-0.06 -0.22 —047-0.03
Vc4o -O.18 -O.39-0.0l -0.07 -O.32—O.18
IC = Intervalo de confianzar = coeficiente de correlación de Spearman; * p < 0.05 para la correlación de Spearman
Tal como sucediera con el primer grupo de pacientes, la mejor correlación se obtuvo
con %RA, seguida de la concentración de espermatozoides y del % formas normales.
Los gráficos del % ovocitos fertilizados en fimción de cada uno de los 3 parámetros
seminales y el %RA se muestran en la Figura 37.
La Figura 38 representa en forma de cascada los valores de los coeficientes de
correlación de Spearman con sus correspondientes intervalos de confianza del 95% para
todos los parámetros evaluados en este grupo. Al comparar estos resultados con los de
la etapa de construcción se observan dos hechos importantes. En primer lugar, si bien la
reacción acrosomal y la concentración de espermatozoides mantienen el grado de
correlación con el porcentaje de fertilización como así también sus posiciones en la
cascada de correlaciones, los demás parámetros evaluados no lo hacen necesariamente.
En segundo lugar, se observa claramente que los intervalos de confianza de los
coeficientes de Spearman para todos los parámetros (y, por ende, el grado de
superposición de los mismos) son mayores en esta etapa de validación, lo que implica
una pérdida de independencia entre los parametros evaluados. Al realizar el análisis de
regresión escalonada se encontró nuevamente que %RA provee el mayor poder
predictivo en un modelo de parámetro único. Sin embargo, a diferencia de lo ocurrido en
la etapa de construcción, no se produjo ningún beneficio estadístico adicional en el
poder predictivo al considerar la concentración de espermatozoides o algún otro de los
parámetros evaluados junto con la reacción acrosomal con respecto a la reacción
acrosomal por sí sola.
100 4) a o o o(DO2 l¡3 80:' o . clr- . o o o gÉ 60 0 ’LL o . olr) D o oOl: 4o 1k ,8 > a o o
5 o20 0 =¿e . I’ 0.35
oo A- - A 4‘ ‘ - 9 a
0 10 20°/o RA
100 l' = 0.07 o o o o om 1 g
8 l . 3< eo ,Ng o ' o :E : n ° iE 60 o o z ou) o a o o ÉO . l5 4o . oo ï o o o o> l‘ o o
g 20 1‘ 0 lz ' 5
a - ‘0 l
% MOTILIDAD
%OVOCITOSFERTILIZADOS
%OVOCITOSFERTILIZADOS
o. o o r=0'3oo
. ‘o' o. ' o .c l.o o ' . .o. o o
. ooo o o o l
o o ‘oo
-:-.onn o. o. o o. o
0 50 100 150
‘36FORMAS NORMALES
Figura 37: Etapa de validación del modelo predictivo de éxito en FIV. Gráficos decorrelación (Spearman) entre el % ovocitos fertilizados y algunos parámetrosespermáticos: %RA (o), concentración de espermatozoides en semen (o), %motilidad en semen (o), % formas normales en semen (o).correlación de Spearman.
r = coeficiente de
%RA
Concentración
Edad mujer
Formas normales
Concepción previa
Vc60
Motilidad
V°4o
Calidad OVOCÍÍCS
Patología ginecológica
l l l l I l I I
-0.6 -O.5 -O.4 -0.3 -0.2 -O.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
COEFICIENTE DE CORRELACION
Figura 38: Validación del modelo predictivo para el éxito en FIV. Cascada decorrelaciones de Spearman (IC 95%) resultantes de comparar cada variable con el% ovocitos fertilizados in vitro.
DISCUSIÓN
Ya no quedan dudas de que la fiincionalidad del espermatozoide y no su concentración
en semen es el principal determinante de si un hombre puede o no embarazar a su pareja.
Es probable que la oligospermia sea, en la mayor parte de los casos, no un fenómeno
aislado sino la manifestación más obvia y más fácilmente medible de alguna patología
que concomitantemente produzca en el espermatozoide otras anomalías que
comprometen su capacidad funcional. Como se ha mencionado anteriormente, el
ejemplo más notable es el de los pacientes con síndrome de Kallman, en los que el
bajísimo número de espermatozoides no impide que estos hombres embaracen
naturalmente a su pareja. Los espermatozoides de tales pacientes se comportan en forma
semejante a la de donantes fértiles ante los múltiples ensayos que se llevan a cabo en el
laboratorio andrológico.
Las dos últimas décadas han sido testigos del desarrollo de numerosos ensayos
destinados a evaluar la capacidad funcional del espermatozoide humano (Cummins,
1995; Liu, Baker, 1992). La difiJsión generalizada de las técnicas de fertilización in vitro
en humanos han provisto al investigador de una herramienta valiosa para evaluar si un
ensayo funcional posee o no valor clínico.
In vivo, la reacción acrosomal es condición necesaria para que un espermatozoide pueda
fertilizar un ovocito y, por ende, la incapacidad de sufrir reacción acrosomal podría ser
causa de infertilidad, al menos en algunos individuos. Determinar la capacidad del
espermatozoide humano de sufrir reacción acrosomal in vitro podría, pues, ser un buen
reflejo de su capacidad fertilizante. En este trabajo hemos estudiado exhaustivamente la
reacción acrosomal inducida por fluido folicular humano en espermatozoides humanos
de donantes fértiles y pacientes infértiles. Con los resultados obtenidos, proponemos que
el ensayo de RA en respuesta al hFF es una herramienta útil en el diagnóstico
andrológico, que correlaciona con porcentaje de ovocitos fertilizados in vitro.
1. ¿POR QUÉ hFF COMO INDUCTOR?
El hFF, in vivo, parecería proveer un entorno favorable al espermatozoide en las
inmediaciones del ovocito, estimulando su motilidad, induciendo su hiperactivación,
favoreciendo la reacción acrosomal, atrayendo al espermatozoide hacia el ovocito y
facilitando, en suma, su penetración a través de las cubiertas del mismo (Hong et al.
1993). El hFF sería, de este modo, un inductor natural y fisiológico de la reacción
acrosomal.
Muchos grupos se han inclinado por el uso de ionóforos de calcio como estimulantes de
la reacción acrosomal en protocolos de diagnóstico andrológico, en virtud de que se
trata de sustancias químicamente definidas (De Jonge et al. 1989; Cummins et al. 1991;
Aitken et al. 1993). Esto haría más fácil la estandarización de la metodologia y la
comparación de resultados entre distintos laboratorios que el uso de fluidos biológicos
como, por ejemplo, el folicular. Sin embargo, el ionóforo puede producir resultados
variables según la naturaleza y concentración del suplemento proteico presente en el
medio, además de las variaciones debidas a los distintos lotes de producto. Tanto es así,
que se ha recomendado a los laboratorios que realicen habitualmente un ensayo con
ionóforo, titulen cuidadosamente su concentración usando espermatozoides de un
donante fértil, a fin de utilizar siempre la mínima concentración que produce la máxima
respuesta (Cummins, 1995). Por otra parte, el ionóforo de calcio es un estimulante no
fisiológico que actúa, principalmente, desordenando la estructura lípídica de la
membrana, lo cual puede resultar en la fusión de las membranas plasmática y acrosomal
externa (Tarin, Trounson, 1993). Más aún, Liu y Baker (1996) han demostrado que la
RA inducida por ionóforo A23187 no correlaciona con la RA inducida por la zona
pelúcida humana. Sugieren que la RA inducida por ionóforo no proporcionaría, por lo
tanto, información valiosa acerca de la capacidad que tiene el espermatozoide de
reaccionar fisiológicamente sobre la zona, cosa que no sucedería probablemente al usar
hFF como inductor.
Los lineamientos propuestos por la European Society of Human Reproduction and
Embryology (ESHRE), a través de un taller en el que se evaluó el ensayo de reacción
acrosomal como método avanzado de diagnóstico andrológico (ESHRE Andrology
Special Interest Group, 1996), sugieren que no debería usarse el fluido folicular como
inductor debido a su variabilidad y por no tratarse de una sustancia químicamente
definida. No existen dudas de que la capacidad inductora de un fluido folicular
individual es muy variable (Morales et al. 1992; Saaranen et al. 1993). Sin embargo, la
experiencia de nuestro laboratorio indica que esa variabilidad en la capacidad inductora
puede ser eliminada utilizando como fuente de fluido un “pool” de fluidos foliculares
individuales procedentes de varios pacientes. Teniendo la precaución de titular cada lote
nuevo de fluido contra el anterior frente a un mismo donante fértil, es posible conservar
la capacidad inductora del fluido al pasar de un lote a otro. Los distintos lotes de fluido
que han sido utilizados en el Genetics & IVF, a lo largo de ya 10 años de llevar a cabo el
ensayo, presentaron siempre la misma capacidad inductora.
Justamente por su naturaleza compleja, el fluido folicular contiene varias sustancias que,
individualmente, son capaces de inducir la reacción acrosomal y que, in vivo,
probablemente constituyen mecanismos alternativos destinados a maximizar la
probabilidad de éxito en la respuesta. Del mismo modo, in vitro, aumentarían la
sensibilidad del ensayo. De hecho, experimentos realizados en nuestro laboratorio con
espermatozoides de donantes fértiles, comparando la capacidad inductora de hFF y
progesterona, considerada el principal inductor de la reacción acrosomal en fluido
folicular, pusieron de manifiesto que la respuesta máxima alcanzada en presencia de
progesterona no superaba el 50% de la respuesta máxima en presencia de hFF. Meizel et
al. (1990) informaron resultados semejantes.
2. OPTIMIZACIÓN DEL EN_SAYO DE REACCIÓN ACROSOMAL DE
ESPERMATOZOIDES HUMANOS EN RES_PUESTA AL FLUIDO
FOLICULAR HUMANO
Estos experimentos se llevaron a cabo utilizando espermatozoides de donantes fértiles
para estandarizar adecuadamente las condiciones del ensayo, identificando aquellos
factores que podrían ser una fuente no deseada de variabilidad en los resultados.
Se eligió una concentración de hFF al 10% V/V como dosis de estimulación, pues ya a
esta concentración la respuesta en %RA resultó máxima. Otros autores han utilizado
concentraciones superiores de hasta 50% V/V, pero éstas no necesariamente se traducen
en un aumento de la fracción de espermatozoides que es capaz de responder al fluido.
Se demostró que la reacción acrosomal observada en respuesta a hFF no es
consecuencia de la muerte celular. Algunos autores (Mortimer, 1994) han recomendado
la determinación simultánea de estado acrosomal y vitalidad para asegurar que el %RA
informado corresponda a una reacción acrosomal verdadera. Nosotros realizamos una
serie de experimentos piloto, utilizando, simultaneamente, el colorante fluorescente
supravital Hoescht 23358 y encontramos porcentajes de RA semejantes al evaluar
espermatozoides vivos y totales (resultados no mostrados). Así mismo, Liu y Baker
(1998) han demostrado recientemente que existe correlación significativa entre el %RA
en respuesta a A23187 medido sobre espermatozoides vivos y totales. Byrd y Wolf
(1986) informaron también que la reacción acrosomal en espermatozoides humanos
incubados en condiciones capacitantes no está obligatoriamente ligada a la muerte
celular, es decir, espermatozoides muertos o que están muriendo no pierden,
necesariamente, SUacrosoma.
Se encontró un efecto marcado del número de espermatozoides presentes durante la
capacitación sobre la capacidad de respuesta al fluido folicular. Tanto es así, que
espermatozoides de individuos fértiles, con excelente respuesta al fluido, dejaron de
responder al aumentar 6 veces su concentración durante la capacitación. Podríamos
pensar que la presencia de elevadas concentraciones de espermatozoides retarda la
velocidad de capacitación en forma general, de modo que se requiere un tiempo mayor
para lograr una misma proporción de espermatozoides capacitados y listos para sufrir la
reacción acrosomal al enfrentarse con el estímulo adecuado. A este respecto, Yudin et
al. (1988) señalan que la capacitación de espermatozoides humanos a concentraciones
elevadas requiere tiempos más largos y que se ve favorecida por un aumento de la
temperatura de capacitación de 37° a 40°C. Esta posibilidad no se ha analizado en este
trabajo.
También se encontró una disminución significativa en el % reacción espontánea al
aumentar la concentración de espermatozoides durante la capacitación. Contrariamente,
Stock y Fraser (1987) no encontraron variación en el % reacción acrosomal espontánea
determinado por microscopía electrónica de transmisión luego de incubar
espermatozoides humanos en un rango de concentraciones de 0,5 a lelOÓ/ml durante
24 horas.
Se acepta, que una vez capacitados, los espermatozoides fimcionalmente competentes
serian capaces de reaccionar casi inmediatamente en presencia del estimulo adecuado
(Yanagimachi, 1994). En el hombre, estudios ultraestructurales de los momentos
iniciales de la reacción acrosomal, inducida por hFF, han puesto de manifiesto que el
40% de los espermatozoides se encuentran reaccionados al cabo de 3 minutos de
exposición al fluido (Yudin et al. 1988). Nuestros datos mostraron que, efectivamente,
ya a los 5 minutos (tiempo minimo ensayado) de incubación en fluido folicular, se
alcanzó el porcentaje máximo de RA. Siiteri et al. (1988), trabajando en condiciones
similares a las nuestras, informaron que la respuesta máxima se obtiene no más allá de
los 5 minutos de incubación de los espermatozoides con una fracción semipuriflcada de
hFF de PM=50.000. Como ya se dijera anteriormente, la elección de 30 minutos como
tiempo de incubación definitivo para el ensayo, obedeció a razones de conveniencia
práctica.
La reacción acrosomal solamente pudo ser inducida por fluido folicular luego de haber
incubado los espermatozoides en condiciones capacitantes por al menos 6 horas,
apoyando la idea de que la reacción acrosomal ocurre como punto final del proceso de
capacitación que normalmente tiene lugar en el tracto genital femenino (Yanagimachi,
1994). Es importante señalar que en este punto hay algunas discrepancias en la
bibliografia. Suarez et al. (1986) evaluaron la capacidad de respuesta de
espermatozoides humanos al hFF en condiciones semejantes a las nuestras y encontraron
inducción al cabo de 10 horas de capacitación , pero no asi al cabo de 5 horas. Por otra
parte, Fehl et al. (¡995) encontraron un aumento significativo en el porcentaje de
espermatozoides reaccionados en presencia de hFF luego de tan sólo 3 horas de
capacitación. Cabe señalar que, en este último caso, la capacitación se llevó a cabo en un
medio diferente y la inducción posterior se realizó con 50% V/V de hFF en lugar de
10%. Resulta muy dificil establecer comparaciones satisfactorias entre los resultados
informados por distintos investigadores, ya que las condiciones de trabajo (preparación
de muestras, medios, condiciones de capacitación e inducción, método de evaluación del
estado del acrosoma) no son necesariamente las mismas (Gearon et al. 1994). Es
fundamental, por lo tanto, establecer con la mayor precisión posible las condiciones del
ensayo, particularmente si se piensa en una fixtura aplicabilidad clínica. Se eligió un
tiempo de capacitación de 22 horas (“overnight”) por ser mucho más conveniente desde
el punto de vista práctico que el de 8 horas y no presentar diferencias con este último en
el %RA observado.
No encontramos aumento significativo en el %RA espontánea al aumentar el tiempo de
capacitación de 0 a 22 horas. Esto se contrapone con el hallazgo de Stock y Fraser
(1987), quienes sostienen que el %RA espontánea, medida por microscopía electrónica
de transmisión, aumenta significativamente de 10% a las 0 horas a 15% luego de 24
horas de capacitación. Podríamos atribuir esta discrepancia a que la determinación del
%RA por microscopía electrónica es, sin duda, más sensible que la que se lleva a cabo
por microscopía óptica pues pueden detectarse espermatozoides que se encuentran en
estadios iniciales de reacción. Asimismo, nuestro valor de RA espontánea file del orden
del 6%, inferior al 15% informado por estos autores, pero semejante al valor de 1-7%
informado por Suarez et al. (1986), utilizando condiciones de capacitación, inducción y
evaluación de RA semejantes a las nuestras. Cabe señalar aquí que en la bibliografia
existe una gran discrepancia en los %RA espontánea informados por distintos autores
que, en algunos casos, llegan a alcanzar valores del orden de 50% (Byrd et al. 1989).
Una vez más, diferencias en las poblaciones de espermatozoides evaluados, los medios y
condiciones de capacitación empleados y las técnicas de detección de la reacción
acrosomal utilizadas, hacen dificil comparar los resultados. De todos modos se acepta,
en general, que la incidencia de reacción acrosomal espontánea en el espennatozoide
humano, durante la capacitación in vitro, es pequeña y del orden del 10% al cabo de 24
horas (Stock, Fraser, 1987). Esto contrasta con lo que se ha observado en otras especies
tales como el hamster (30-60%; (Yanagimachi, 1969)), el cobayo (30-80%;
(Yanagimachi, Usui, 1974)) o el ratón (30-35%; (Fraser, 1981)).
Sin duda hay que tener en cuenta que al evaluar la capacidad de respuesta al fluido en
pacientes infértiles, en las condiciones aquí propuestas, es de importancia crucial
capacitar los espermatozoides a una concentración no superior a los 2x106/ml, con el
objeto de asegurar la máxima sensibilidad del ensayo. De lo contrario, un paciente que se
encuentre cerca del límite inferior del rango normal de respuestas, podría ser identificado
como un no respondedor.
3. EFECTO DEL FLUIDO FOLICULAR SOBRE LAS CARACTERLSTICAS D_E
MOVIMIENTO DE ESPERMATOZOIIES CAPACITADO_S
La capacidad de los espermatozoides de cambiar las características de su movimiento en
respuesta a distintas condiciones de su entorno es un aspecto importante de su capacidad
fertilizante (Tesarik et al. 1990). Ya hemos mencionado que durante la capacitación se
producen cambios notables en el movimiento del espermatozoide que llevan a la
adquisición de motilidad hiperactivada (Burkman, 1990). Esta motilidad hiperactivada ya
no se observa en los espermatozoides que se encuentran dentro del cúmulus (Tesarik et
al. ¡990). Existen evidencias de que el cúmulus sería capaz de producir y liberar
factores que modifican el movimiento del espermatozoide, aumentando su potencia y
facilitando así su penetración a través de las cubiertas oocitarias y, por ende,
incrementando la probabilidad de fertilización. Fetterolf y colaboradores (Fetterolf et al.
1994; Fetterolf et al. 1994) han demostrado que, tanto el hFF como un factor secretado
por células de cúmulus humano en cultivo, son capaces de estimular el movimiento de
espermatozoides humanos capacitados. Tesarik et al. (1990) observaron cambios
notables en las características cinemáticas de espermatozoides capacitados en presencia
de cúmulus enteros o solubilizados con hialuronidasa. Por otra parte, espermatozoides
atrapados individualmente con un rayo láser (“optical laser trap”) manifiestan un
incremento en su fiJerza relativa como consecuencia de la exposición a matn'z
extracelular solubilizada del cúmulus (Westphal et al. 1993).
Al realizar los experimentos iniciales de estandarización del ensayo de RA, observamos
una mejora en el movimiento de los espermatozoides capacitados como consecuencia de
la exposición al fluido folicular. Para estudiar este comportamiento un poco más a fondo
se analizó el efecto del fluido folicular sobre espermatozoides capacitados, a través de
dos parámetros de motilidad, velocidad curvilínea y linealidad, determinados en un
sistema CASA. Se encontró que los espermatozoides capacitados de donantes fértiles
aumentan su velocidad curvilínea luego de la incubación en fluido folicular, si bien no se
produce ningún cambio en su linealidad. Estos resultados concuerdan parcialmente con
las observaciones de Fetterolf et al. (1994), quienes observaron que la exposición a hFF
al 10% de espermatozoides previamente capacitados, efectivamente produjo un aumento
en la velocidad curvilínea, pero también una disminución de Ia linealidad. También,
Fabbri et al. (1998) han informado que el hFF in vitro aumenta la velocidad y disminuye
la linealidad de espermatozoides al cabo de 6 horas de incubación. En estos dos casos, el
tiempo prolongado de exposición a hFF podría dar cuenta de un efecto sobre la
linealidad que nosotros no observamos. Sin embargo, Tesarik et al. (1990) observaron
un aumento en la linealidad y en la velocidad rectilinea pero no en la velocidad
curvilínea en presencia de cúmulus solublizado. Si bien existen diferencias entre los
resultados obtenidos por los distintos grupos, que bien podrían atn'buirse a diferencias en
la metodologia de trabajo, todos sugieren la presencia dentro del cúmulus de factores
que favorecen la adquisición de un movimiento ágil, lineal y progresivo.
Existen también evidencias de que la estimulación de la velocidad de espermatozoides
por hFF obtenido de folículos ováricos maduros correlaciona significativamente con la
fertilización in vitro (Fetterolf et al. 1994).
Los cambios en la motilidad están asociados a sitios anatómicos del espermatozoide,
diferentes de aquéllos involucrados en el proceso de reacción acrosomal. Por lo tanto,
un estudio sistemático de las caracteristicas de movimiento inducidas por fluido folicular
podría llevar a la identificación de otros defectos fiJncionales en el espermatozoide que,
a su vez, podrían comprometer su habilidad para fertilizar un ovocito. El fenómeno de
fertilización es tan complejo, que cuántos más y más variados sean los parámetros del
espermatozoide que se pueda evaluar, mayor será la probabilidad de predecir,
exitosamente, la capacidad fertilizante de una muestra de espermatozoides.
4. EFECTO DE LA COMPOSICIÓN SALINA Y EL SUPLEMENTO
PROTEICO DEL MEDIO D_E CAPACITACIÓN SOBRE EL ENSAYO D_E_
REACCIÓN ACROSOMAL
Los laboratorios de Andrologia utilizan una gran variedad de medios de cultivo para la
preparación de espermatozoides, ya sea para su uso en procedimientos de fertilización
asistida como para fines simplemente diagnósticos (Trounson, l983). La fertilización in
vitro en humanos se ha llevado a cabo satisfactoriamente utilizando Ham’s F-lO
(Steptoe et al. 1980; Trounson et al. 1982), solución de Earle (Steptoe et al. 1980),
medio de Whitten modificado (Trounson et al. ¡982), medio Whittingham T6 (Quinn et
al. 1984) y medio Menezo Bz (Menezo et al. 1984), entre otros. El medio de
incubación provee un entorno adecuado para que se lleven a cabo en el espermatozoide
los cambios fiJndamentales asociados con los procesos de capacitación e interacción con
el ovocito (Bavister, 198]). Se ha propuesto que las condiciones de incubación más
cercanas al entorno natural de las gametas serían las que deberían proporcionar los
mejores resultados (Quinn et al. 1985). En ausencia de una comparación sistemática
entre los distintos medios utilizados, el que exista fertilización en un medio dado no es
suficiente para asegurar que las condiciones de incubación han sido óptimas para la
interacción de las gametas (Bavister, 198l ).
Se consideró importante, pues, para la estandarización del ensayo de RA determinar si el
comportamiento de los espermatozoides en el mismo, se ven'a afectado por pequeños
cambios en la composición iónica o en el suplemento proteico del medio utilizado. Los
resultados obtenidos pusieron de manifiesto que la elección del medio afecta
significativamente la función del espennatozoide humano y, consecuentemente, tiene
importantes derivaciones diagnósticas y terapéuticas.
El estudio llevado a cabo trató de determinar posibles efectos de la composición iónica
del medio y del suplemento proteico.
Los datos obtenidos mostraron que las diferencias en composición iónica y fuente de
energía entre los 3 medios empleados durante la capacitación no afectaban demasiado la
capacidad posterior del espermatozoide de sufrir reacción acrosomal en respuesta al
fluido folicular, si bien la capacitación en medio Tyrode pareció ser ligeramente más
eficaz que en BWW o Ham’s F-IO. Byrd et al. (1989) también encontraron que el %RA
inducido por ionomicina o ionóforo A23187 en espermatozoides capacitados en BWW y
Ham’s F-lO era semejante. Independientemente del medio de capacitación utilizado,
observaron un 30% y un 40% de reacción acrosomal en presencia de ionomicina y
A23 187 lpM, respectivamente.
Se encontraron, en cambio, importantes efectos de la naturaleza del suplemento proteico
sobre la reacción acrosomal: los espermatozoides incubados en medio suplementado con
FCS no fiJeron capaces de sufrir reacción acrosomal mientras que los espermatozoides
incubados en presencia de BSA sí lo hicieron. Incluso la adición de BSA, durante la
estimulación con fluido folicular, a espermatozoides ya capacitados en FCS, no file
capaz de inducir la pérdida del acrosoma.
Podríamos explicar estos resultados pensando que el FCS podría contener un inhibidor
de uno o más pasos del proceso de capacitación, requisito para que ocurra la reacción
acrosomal. Si así fuera, ¿cómo se explica que la suplementación con FCS se utilice con
resultados satisfactorios en los procedimientos de FIV? Varios grupos han demostrado
que las tasas de fertilización in vitro y clivaje embrionario son semejantes en medios
conteniendo BSA o suero (Feichtinger, Kemeter, 1984; Menezo et al. 1984).
Indudablemente, en un procedimiento de FIV, la presencia del complejo ovocito
cúmulus sería capaz de neutralizar los efectos de tal inhibidor, posibilitando la
capacitación, reacción acrosomal y posten'or fertilización del ovocito. La idea de un
inhibidor de la capacitación presente en FCS concordan’a con los resultados de Ravnik et
al. (1990), quienes encontraron evidencias de la presencia en suero de un factor capaz de
inhibir la fimción espermática. Estudiando la actividad de transferencia de lípidos en
fluido folicular y suero, encontraron que el aumento de la penetración de ovocitos de
hamster por espermatozoides humanos en presencia de fluido folicular, era
completamente inhibido por el agregado de suero al fluido.
También se consideró la posibilidad de que el FCS estuviera quelando a la progesterona
presente en el fluido folicular y, así, eliminara del mismo uno de los principales
inductores de la reacción acrosomal en el fluido. Pero nuestro experimento de
intercambio de medios, mostró que la remoción de FCS del medio luego de la
capacitación, mediante lavado y resuspensión en medio fresco conteniendo BSA, previo
a la incubación con fluido folicular, no restituye la capacidad de reaccionar. Por lo tanto,
parecería que el FCS tuviera un efecto inhibitorio directo sobre el espermatozoide
durante la capacitación.
Como ya se mencionara, durante la capacitación se producen importantes cambios en el
movimiento de los espermatozoides, que sin duda están relacionados con su capacidad
fertilizante. Los datos obtenidos al evaluar el efecto de los cambios en la composición
del medio sobre los parámetros de movimiento indicaron que existen pequeñas
diferencias entre Ham’s F-lO y BWW y entre FCS y BSA. Quedaría por determinar si
tales diferencias tienen algún significado biológico.
Vale la pena mencionar a este respecto el estudio llevado a cabo por Mbizvo et al.
(¡990) que evaluaron el efecto de hFF sobre la hiperactivación de espermatozoides
humanos previamente capacitados en Ham’s-3SB o Ham’s-FCS y luego incubados en
presencia de hFF 5% durante 60 minutos. Si bien la incidencia máxima de
hiperactivación fue semejante con cualquiera de los dos suplementos proteicos en el
medio, el pico de hiperactivación ocurrió mas rápidamente en FCS (3 horas de
capacitación) que en 3SB (5 horas de capacitación). Estos resultados sugieren que la
expresión in vitro de la hiperactivación depende de la naturaleza del suplemento proteico
en el medio de capacitación.
Si bien la incubación en condiciones subóptimas podría no tener importancia para la
activación de las fimciones espermáticas en el caso de hombres fértiles, probablemente
no ocurrirá así en los pacientes infértiles. Para estos últimos, pequeños cambios en la
composición del medio que son beneficiosos para la capacidad fiJncional del
espermatozoide podn'an resultar en el aumento de la probabilidad de una interacción
exitosa con el ovocito.
Discusión ¡36
5. ENSAYO PILOTO PARA COMPARAR LA REACCIÓN ACROSOMAL
INDUCIDA POR FLUIDO FOLICULAR EN INDIVIDUOS NORMALES Y
PACIENTES INFÉRTILES
Los pacientes infértiles plantean al andrólogo el desafio de poder predecir la capacidad
fertilizante de una muestra de espermatozoides utilizando las herramientas disponibles en
el laboratorio de Andrología. Por lo tanto, una vez estandanzadas las condiciones del
ensayo de RA, se evaluó el uso potencial del mismo en el diagnóstico andrológico a
través de un estudio piloto sobre un pequeño grupo de pacientes infértiles sin causa
aparente y donantes fértiles.
El pequeño grupo de pacientes evaluados en esta instancia mostró 2 comportamientos
marcadamente distintos: los espermatozoides de un 60 % de los pacientes sufrieron
reacción acrosomal en respuesta al fluido folicular en forma indistinguible de los
espermatozoides de los donantes fértiles. A estos pacientes se los llamó RA+. El 40%
restante de los pacientes no reaccionó ante la estimulación con hFF y se los llamó RA-.
La falta de respuesta de estos pacientes no se pudo predecir a través de un análisis de
semen tradicional, ya que los dos grupos de pacientes, RA+ y RA- tuvieron valores
semejantes de concentración, %motilidad y parámetros de motilidad V040y L3 en semen.
Este ensayo piloto puso asi de manifiesto que el ensayo de reacción acrosomal en
respuesta a hFF podría ser de utilidad en el diagnóstico andrológico ya que existe un
grupo de pacientes infértiles que se comporta de manera francamente distinta a la de los
donantes fértiles. Más aún, dicho comportamiento no es predecible mediante un
espermograma, de modo que el ensayo de RA proporcionaria información adicional a la
que puede obtenerse de un análisis tradicional del semen.
Estas dos características del ensayo de RA en respuesta a hFF fueron condición
necesaria pero no suficiente para que dicho ensayo se considerara válido como
herramienta de diagnóstico. Para ello se hizo imprescindible llevar a cabo un estudio
prospectivo en pacientes infértiles que demostrara que existía correlación entre la
habilidad de los espermatozoides para reaccionar en respuesta al fluido y el éxito en
FIV.
6. ESTUDIO POBLACIONAL DE LA REACCIÓN ACROSOMAL INDUCIDA
POR FLUIDO FOLICULAR
Antes de llevar a cabo un estudio del valor predictivo del ensayo de RA en FIV, se
consideró importante caracterizar mejor el ensayo a través de un estudio poblacional,
tanto en donantes fértiles como en pacientes infértiles.
Al estudiar la reacción acrosomal en la población fértil encontramos que el porcentaje de
espermatozoides capaz de reaccionar frente al estímulo con fluido folicular es una
medida estable en el tiempo. La determinación del %RA en múltiples muestras de un
mismo donante demostró que los valores obtenidos se encontraban muy cercanos a la
media para el donante y que la misma no cambiaba significativamente con el tiempo. Es
asi que una ocasional reacción acrosomal negativa en un donante comúnmente RA+ es
un buen indicador de que alguna causa externa ha comprometido transitoriamente la
fiJncionalidad espermática en dicho individuo.
La distribución de los valores de %RA en la población normal se aproximó
satisfactoriamente a una Gaussiana, como sucede con la mayoría de los parámetros
seminales clásicos entre individuos fértiles (Cummins, 1995). La mediana del %RA para
la población normal fiJe de 15-17%, valor que no resulta sorprendente en virtud de la
consabida heterogeneidad y asincronicidad funcional de los espermatozoides humanos.
Tomiyama et al. (1995) observaron 7 - 13 % reacción acrosomal inducida por
progesterona en donantes fértiles y Tesarik et al. (¡992) informaron que sólo el 10% de
espermatozoides capacitados poseían receptores para progesterona en su superficie,
pero que la mayoría de ellos era capaz de sufrir RA en respuesta a la unión de la
hormona.
La construcción repetida, a lo largo de 5 años, del intervalo de confianza del 95%
demostró consistentemente que valores de %RA inferiores a 5% se encontraban fiJera
del rango normal. Una vez más, se puso así de manifiesto que el %RA es una medida
estable de la función espermática, caracteristica importante para poder considerarla un
parámetro útil para el diagnóstico andrológico.
Al evaluar la reacción acrosomal en la población de pacientes infértiles, se encontró que
su distribución, tal como sucede con casi todos los parámetros seminales, no se ajusta a
una distribución de Gauss (Cummins, 1995), sino que la mayor parte de los pacientes
presenta valores muy bajos de %RA. Esta diferencia entre las distribuciones de
donantes fértiles y pacientes infértiles también file observada por Henkel et al. (1993) al
estudiar el porcentaje de reacción acrosomal en respuesta a un shock hipotérmico.
Como ya se mencionara, no se establecieron restricciones para que los pacientes
ingresaran al estudio poblacional. Por lo tanto, la población estudiada fiJe muy
heterogénea e incluyó individuos que de acuerdo con los valores de su espennograma
cubrieron todo el rango de diagnósticos: desde la nonnosperrnia hasta la
oligoastenoteratozoospermia severa. Los pacientes se dividieron en 4 subgrupos de
acuerdo con sus características seminales, pero sin tener en cuenta el valor de %RA y se
encontró que, a medida que se deterioraron las caracten’sticas seminales en los grupos,
aumentó la fracción de pacientes con RA- (%RA<5%). Sin embargo, un 20 % de los
pacientes con buena concentración, motilidad y morfología resultó RA-, mientras que el
29% de los pacientes con caracten’sticas seminales deficientes fiJe RA+.
Si bien el %RA correlacionó significativamente con las caracten’sticas seminales en los
pacientes infértiles, estas correlaciones fueron estadísticamnete moderadas y no indican
que el valor de %RA sea completamente predecible a partir de las mismas. Los
coeficientes de correlación (r = 0,35-0,52) sugieren que solamente del 10 al 25% de la
van'abilidad observada en %RA puede atribuirse a variabilidad en los parámetros
seminales clásicos (r2=0,12-0,27) y, por lo tanto, el ensayo de reacción acrosomal
proporciona información clínica adicional a la ya provista por las medidas tradicionales
en semen.
Parinaud et al. (1995) evaluaron la relación entre el porcentaje de RA en respuesta a
distintos inductores y parámetros seminales en un grupo de ll7 pacientes infértiles y
encontraron que el porcentaje de RA en respuesta a hFF solamente correlacionó
significativamente con la morfología del acrosoma, pero no con la concentración de
espermatozoides, la motilidad o el porcentaje de formas normales. Cabe señalar que su
protocolo de trabajo fiJe distinto del nuestro, ya que los espermatozoides fueron
incubados en medio Menezo B2 durante 6 horas en presencia de 20% hFF y el
porcentaje de RA se determinó utilizando un anticuerpo monoclonal específico para la
membrana acrosomal interna.
Al evaluar medias y medianas se mide la tendencia central de la población en estudio.
Por otra parte, resulta interesante evaluar el comportamiento individual de los
integrantes de la población y, para ello, se llevó a cabo un análisis de cuadrantes. Dicho
análisis de cuadrantes se realizó para %RA y morfología estricta, ya que esta última es
considerada actualmente por algunos autores (Kruger et al. 1988; Oehninger, Kruger,
1995; Vawda et al. 1996; Enginsu et al. l993)como el parámetro seminal más
importante en la determinación de la capacidad fertilizante de una muestra. Este análisis
puso de manifiesto, nuevamente, el comportamiento diferencial de las poblaciones
nonnal e infértil, ya que mientras los donantes fértiles se dístríbuyeron homogéneamente
en los 4 cuadrantes en torno al centroide, los pacientes infértiles se concentraron
fundamentalmente en el cuadrante caracterizado por valores menores de porcentaje de
formas nonnales y %RA. En forma semejante, aunque no a través de un análisis de
cuadrantes, (Fukuda et al. 1989), encontraron una asociación entre morfología y
fimción acrosomal ya que la RA inducida por hFF fue significativamente menor en
espermatozoides con anomalías morfológicas de cabeza. También, Oehninger et al.
(1994) observaron que los pacientes teratozoospérmicos respondían anormalmente a la
progesterona in vitro, ya sea en el influjo de Cazi o en el porcentaje de RA observados.
Liu y Baker (1998) encontraron una correlación significativa entre el porcentaje de RA
en respuesta a ionóforo y la morfología estricta en semen pero, más importante aún,
demostraron (Liu, Baker, 1992) que la zona pelúcida humana in vitro es altamente
selectiva para espermatozoides morfológicamente normales.
El análisis de cuadrantes también reafirmó el concepto de que el ensayo de reacción
acrosomal proveía información que no se desprendía del espermograma tradicional, ya
que mostró claramente que un valor anormal de morfología no estaba necesariamente
acompañado de un %RA negativo y viceversa. A este respecto, Pampiglione et al.
(1993) evaluaron la capacidad de RA en respuesta a hFF en donantes fértiles luego de
clasificar los espermatozoides en 4 grupos morfológicos distintos y no encontraron
diferencias entre los mismos, concluyendo que la morfología de un espermatozoide no es
buen indicador de su capacidad para sufiír reacción acrosomal in vitro.
Si bien la reacción acrosomal es simplemente un paso en el complejo mecanismo que
culmina con la fertilización y formación de un embrión viable, el comportamiento
diferencial de hombres fértiles y pacientes infértiles parecería indicar que la
determinación de la capacidad de sufn'r reacción acrosomal, en respuesta al fluido
folicular, sería un instrumento de utilidad clínica en el diagnóstico andrológico. Esta
hipótesis fiJe probada a través de un análisis prospectivo de la relación entre el ensayo de
reacción acrosomal y la capacidad fertilizante in vitro en un grupo de pacientes infértiles.
7. ESTUDIO DEL VALOR DIAGNÓSTICO DE LA REACCIÓN ACROSOMAL
lNDUClDA P03 FLUlDO FOLICULAR CON RES_PECTOA LA CAPACIDAD
FERTILIZANTE IN VITR_0
Los resultados obtenidos al evaluar el valor diagnóstico del %RA con respecto al éxito
en FIV en una población de pacientes infértiles muestran claramente que existe una
relación entre el porcentaje de ovocitos fertilizados in vitro y la reacción acrosomal en
respuesta a hFF. El porcentaje de ovocitos fertilizados fiie marcadamente distinto según
los espermatozoides tuvieran o no capacidad de respuesta al fluido. Se pueden
distinguir, nuevamente, dos tipos de pacientes no identificables a través de los
parámetros seminales clásicos. Algunos pacientes con buenas características seminales
son inesperadamente RA- y tienen una tasa de fertilización marcadamente disminuida,
mientras que otros pacientes con características seminales deficientes son
sorprendentemente RA+ y fertilizan satisfactoriamente in vitro.
Vale la pena comentar aquí acerca del uso para el ensayo de RA de una muestra de
semen diferente de la utilizada en el procedimiento de FIV. Es cierto que un estudio que
analizara el comportamiento de los espermatozoides en la misma muestra de FIV
maximizan'a la probabilidad de revelar relaciones significativas entre la calidad de las
gametas y el resultado de FIV (Sukcharoen et al. 1996). Sin embargo, desde el punto de
vista clínico, hace falta predecir el éxito de un tratamiento antes de que el tratamiento se
lleve a cabo.
Otros investigadores han informado acerca de la relación de la reacción acrosomal en
respuesta a distintos estímulos - fisiológicos o no - con la fertilización in vitro. Krausz et
al. (1995) encontraron que los pacientes con tasa de FIV > 50% tenían un porcentaje de
RA inducida por progesterona significativamente mayor que los pacientes con tasa de
FIV < 50%. Henkel et al. (1993) utilizaron un shock térmico para inducir la RA y
encontraron que la respuesta al mismo era predictiva del éxito en FIV. Fénichel et al.
(199]); Liu y Baker (1998) y Cummins et al. (1991) han informado que la RA inducida
por ionóforo A23 187 correlaciona con la capacidad fertilizante in vitro.
El éxito de una fertilización in vitro no es un fenómeno de todo o nada. Es importante
tener en cuenta que, a diferencia de otros estudios que han intentado definir una relación
entre RA y fertilización por FIV (Fénichel et al. 1991; Krausz et al. 1995), nuestro
estudio evaluó el porcentaje de ovocitos fertilizados y no simplemente la presencia o
ausencia de fertilización o el alcanzar una tasa de fertilización mayor o menor de cierto
valor umbral.
Al analizar los pacientes individualmente, lo primero que salta a la vista es que algunos
pacientes fertilizan a pesar de ser RA- (falsos positivos) y otros pacientes no fertilizan a
pesar de ser RA+ (falsos negativos). Los falsos negativos pueden explicarse fácilmente
pensando que la reacción acrosomal es sólo uno de los muchos fenómenos que
constituyen la compleja cascada que lleva a la fertilización de un ovocito. Una falla en el
reconocimiento de la zona pelúcida, la fiisión con la membrana plasmática o la
formación de pronúcleos, entre otros, impediría la fertilización a pesar de que existiera
una adecuada capacidad de sufiir reacción acrosomal. Resulta más dificil, quizás,
comprender cómo individuos cuyos espermatozoides no son capaces de reaccionar en
respuesta a hFF presentan elevadas tasas de fertilización in vitro. Pero debe recordarse,
por un lado, que el ensayo mide un comportamiento poblacional y, en cambio, basta un
espermatozoide para lograr fertilizar un ovocito. Por otra parte, si bien las condiciones
de ensayo tratan de ser lo más favorables posible para la funcioanlidad del
espermatozoide, es muy probable que el ovocito mismo sea un inductor más poderoso
que el fluido utilizado en nuestro ensayo.
Los valores de los parámetros estadísticos calculados para el ensayo ponen de manifiesto
que se trata de un ensayo sensible con un buen valor predictivo negativo, pero no muy
específico, con un valor predictivo positivo moderado. Resulta interesante señalar que,
tanto Cummins et al. (1991) estudiando la relación entre la RA en respuesta a ionóforo
de calcio y el éxito en FIV, como Henkel et al. (1993) estudiando la reacción acrosomal
inducida por "shock" hipotérmico como predictora de la capacidad fertilizante in vitro,
encontraron que dichos ensayos eran más específicos que sensibles (Tabla XVIII).
Tabla XVIII: Cuadro comparativo de los parámetros estadísticos informados endistintos estudios que evaluaron el porcentaje de RA y la capacidad fertilizante invitro.S = sensibilidad; E = especificidad; VPP = valor predictivo positivo; VPN = valorpredictivo negativo
Estudio Inductor Valor de S E (S+E)/2 VPP VPNcorte
Calvo I-lFF 5% 0,71 0,55 0,67 0,49 0,75
Cummins A23187 10% 0,54 0,85 0,69 -
Henkel Shock T 7,5% 0,50 0.86 0,68 0,63 0,78
Algunos autores (Peng et al. 1987) sugieren utilizar la media entre sensibilidad y
especificidad como indicador del poder discriminatorio de un ensayo; un valor de 0,5
indicaría un ensayo no discriminatorio y un ensayo óptimo tendría un valor de l. Este
parámetro, calculado para nuestros resultados, como así también para los de Cummins y
Henkel, se encuentra próximo a 0,7 (Tabla XVI). Pareceria, pues, que el ensayo de
reacción acrosomal, independientemente del estímulo utilizado para inducir la RA y de la
técnica de evaluación del estado del acrosoma, tiene un potencial predictivo semejante.
Desde el punto de vista diagnóstico, los valores predictivos positivo y negativo son más
útiles que la sensibilidad y la especificidad. El VPP representa la probabilidad de
diagnosticar adecuadamente la falla en FIV y el VPN representa la probabilidad de
diagnosticar adecuadamente el éxito. En este caso, el ensayo de RA tendría mayor valor
estadístico como detector de fertilidad que de falta de capacidad fertilizante in vitro
(VPN > VPP). Recordemos que el %RA es un parámetro poblacional y que, in vitro,
basta un espermatozoide competente en la cápsula para poder fertilizar un ovocito.
Tal como se mencionara en resultados, la razón de probabilidades (RP) es un parámetro
estadístico que mide cuántas veces más probable es para un paciente RA+ fertilizar un
ovocito que para un paciente RA-. Los valores de RP obtenidos indican que,
efectivamente, la probabilidad de fertilizar un ovocito es significativamente mayor (3
veces) para pacientes RA+ que RA-, confirmando la utilidad del ensayo como método
diagnóstico. Permite identificar pacientes infértiles que muy posiblemente tendrán un
bajo porcentaje de éxito en FIV (50% de los pacientes RA- no fertiliza ningún ovocito)
(Figura 39) como asi también seleccionar individuos que probablemente serán capaces
de fertilizar una elevada proporción de ovocitos (80% de los pacientes con %RA > 8%
fertilizan al menos un ovocito). En el medio encontramos una zona gris (35% de los
pacientes con %RA entre 5 y 8 no logra fertilizar), donde la influencia de otros factores,
tanto masculinos como femeninos, adquiriría mayor importancia.
100
3’ FIV :80
60
4o
°/oDEPACIENTES
20
0-4 5-8 9+
% RA
Figura 39: Proporción de pacientes que lograron fertilizar en FIV, agrupados entres categorías de acuerdo con el %RA observado in vitro.
145
Los parámetros estadísticos se calcularon en primera instancia, con todos los pacientes
independientemente del número de ovocitos disponibles para fertilizar y, luego, con
aquellos pacientes que hubieran tenido más de 2 ovocitos disponibles. Se encontró que
la especificidad, el valor predictivo positivo y, especialmente, la razón de probabilidades
aumentaron en el segundo caso. Esto es lógico ya que al tener un solo ovocito
disponible para fertilizar se limitan a 2 las posibilidades de tasa de fertilización (0% ó
100%) mientras que al aumentar el número de ovocitos aumenta el número de
resultados posibles y, por ende, el poder estadístico del ensayo.
Las curvas ROC proveen evidencia visual de la calidad de un ensayo diagnóstico y
tienen mayor valor que los ensayos de correlación para determinar si los resultados del
ensayo proporcionan la información que se necesita para tomar decisiones clínicas (Peng
et al. 1987). Como ya señaláramos, la curva ROC de un ensayo que carece de valor
clínico se ubica sobre la línea de identidad en un eje cartesiano; cuanto más se aleja la
curva de la línea de identidad, mejor es el valor clínico del ensayo. La curva ROC para el
ensayo de reacción acrosomal en respuesta a hFF confirmó su valor clínico. Al
comparar la curva ROC para RA con las correspondientes curvas para % formas
normales y concentración de espermatozoides en semen se observó que el % formas
normales en semen tiene un valor clínico semejante al de RA pero que la concentración
de espermatozoides en semen tiene un valor clínico menor. Cummins et al. (199])
obtuvieron una curva ROC semejante para el ensayo de RA en respuesta a ionóforo, si
bien no lo compararon con otros parámetros del espermograma. Por otra parte, Ombelet
et al. (1997) estudiaron el poder predictivo de una serie de parámetros seminales con
respecto a FIV a través de curvas ROC y, al igual que nosotros, encontraron que, entre
éstos, la morfología estricta ocupa el primer lugar (no evaluaron la RA).
Vale la pena señalar que los valores de sensibilidad, especificidad y razón de
probabilidades obtenidos por estos autores son muy semejantes a los informados por
nosotros y otros autores para el ensayo de RA. También Vawda et al. (1996) analizaron
el valor diagnóstico de la morfología estricta en semen con respecto a FlV a través de
curvas ROC y del cálculo de sensibilidad y especificidad y encontraron resultados
semejantes. Nuevamente se pone de manifiesto el hecho de que un único parámetro no
puede utilizarse como predictor del comportamiento del espermatozoide en un proceso
tan complejo como la fertilización.
Habiendo analizado el comportamiento de la población total de pacientes infértiles, se
estudió luego el comportamiento de los 4 subgrupos previamente definidos: BS, con
caracteristicas seminales indistinguibles de los donantes fértiles; MD, con déficit
morfológico aislado; SS, con 2 o más parámetros seminales fuera del rango normal; MS,
con todos los parámetros seminales muy por debajo del rango normal. Si bien tanto el %
RA como el porcentaje de ovocitos fertilizados por FIV disminuye a través de los
subgrupos a medida que se deterioran las características del semen, el porcentaje de
fertilización en cada subgrupo difiere marcadamente según los espermatozoides posean
o no capacidad de reaccionar ante la estimulación con fluido folicular.
Al recalcular la razón de probabilidades para los distintos subgrupos de pacientes, se
encontró que, salvo en el caso de MS, sigue siendo válido que un paciente RA+ tiene
mayor probabilidad de fertilizar in vitro que un paciente RA- que pertenezca al mismo
subgrupo. Si bien las razones de probabilidades fiJeron distintas para los distintos
subgrupos, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas a causa de una
considerable superposición en los intervalos de confianza de cada una. Sin embargo, los
valores sugerirían que la falta de reacción acrosomal ante el estímulo con fluido folicular
sería especialmente útil para predecir la ausencia de fertilización en el grupo de pacientes
con semen subóptimo. Es decir, que en aquellos individuos con muy buen o muy mal
semen, el %RA sen'a más bien confirmatorio y proporcionaría información quizás
redundante con respecto a la ya obtenida a través del espermograma. En cambio, en los
pacientes con semen subóptimo sen’averdaderamente informativo y brindaría elementos
de juicio adicionales para predecir el éxito de un paciente en FIV. Un fenómeno
semejante ha sido observado por Liu y Baker (1998) al estudiar la correlación entre la
RA inducida por íonóforo A23l87 y la tasa de FIV, ya que la correlación entre ambos
parámetros mejoró significativamente cuando se tomó un subgrupo de pacientes
infértiles con morfología estn'cta en semen < 15%. En cambio, RA no correlacionó con
la tasa de FIV en el grupo de pacientes con morfología >15%.
El número de ovocitos disponibles para fertilizar es altamente van'able y afecta en forma
directa la probabilidad real de obtener embriones. Flaherty et al. (1995), al estudiar las
fallas en ICSI, encontraron que el número de ovocitos disponibles para fertilizar es
determinante de la falta de éxito en lCSl: mientras que con un sólo ovocito disponible el
factor de riesgo para un ICSI fallido es del 37%, con 2 ovocitos baja al 13% y con un
ovocito es solamente del 2%. En nuestro caso, el número de ovocitos disponibles para la
inseminación varió considerablemente a lo largo de la población de pacientes estudiada,
pero, sin embargo, en promedio, fue semejante para todos los subgrupos de pacientes y
para la población total.
También se evaluó el efecto de la calidad de los ovocitos (medido a través de su
morfología) sobre el %FIV. Cuando se separaron los pacientes en cada subgrupo, según
que la calidad de los ovocitos disponibles para fertilizar fiiera buena o mala, no se
encontraron diferencias significativas en el %FIV entre las dos categorías. Estos
resultados apoyan los de Liu et al. (¡988), quienes observaron que la calidad ovocitaria
no fue significativamente diferente entre dos grupos de pacientes infértiles, con tasas de
FIV mayor y menor de 50%.
En resumen, las variaciones en la capacidad fertilizante observadas entre los distintos
subgrupos de pacientes serían atribuibles a las variaciones en el %RA entre los mismos
y no al número de ovocitos disponibles para fertilizar o su calidad, que fiieron
semejantes para todos los subgrupos. De todos modos, cabe reconocer que sólo la
inseminación de un grupo de ovocitos del mismo paciente y en el mismo ciclo con
espermatozoides de donante permitiría discernir si la falta de fertilización refleja
realmente una disfunción del ovocito o del espermatozoide.
La edad de la mujer indiscutiblemente afecta el éxito de un procedimiento de
fertilización asistida (Society for Assisted Reproductive Technology, American Society
for Reproductive Medicine, 1995). No observamos diferencias en la edad promedio de la
mujer entre los 4 subgrupos de pacientes infértiles, de modo que las van'aciones en el
éxito en FIV observadas entre los distintos subgrupos no sen'an atribuibles a esta
variable. A este respecto, Vawda et al. (1996), estudiando una serie de parámetros
seminales como predictores de FIV en un grupo de pacientes infértiles, señalaron que la
edad de la mujer no influyó significativamente sobre la predicción de una tasa de
fertilización mayor o menor de 30%. Se acepta generalmente que la calidad ovocitan'a
disminuye con la edad pero, sorpendentemente, encontramos que dentro de la población
de individuos con semen normal, el porcentaje de ovocitos fertilizados in vitro fue
significativamente mayor en el grupo de mujeres >35 años. Estos resultados podn’an ser
simplemente casuales, pero también se podn’a pensar que los ovocitos de mujeres
mayores podrían perder selectividad frente al proceso de fertilización, lo cual se
traduciría en un aumento de la tasa de fertilización in vitro (Dra. Bustillo, comunicación
personal). Sin duda, al aumentar la edad de la mujer disminuye la tasa de implantación
embn'onaria y aumenta la tasa de abortos espontáneos, produciéndose en consecuencia
la conocida reducción de la fecundidad observada en mujeres de más edad (Davis,
Rosenwaks, 1996; Society for Assisted Reproductive Technology, American Society for
Reproductive Medicine, 1995).
Por último, los resultados obtenidos ponen de manifiesto claramente que la capacidad de
reaccionar ante el fluido folicular tiene mayor influencia sobre la capacidad fertilizante de
una muestra que el porcentaje de espermatozoides normales en semen, determinado
según cn'terios estrictos. Otros autores han informado que la morfología estricta es el
ensayo de mayor valor predictivo con respecto a FIV (Kruger et al. 1988; Vawda et al.
1996; Ombelet et al. 1997), pero en ninguno de estos casos se evaluó simultáneamente
el poder predictivo de morfología y RA. Sukcharoen et al. (1996) evaluaron morfología
estricta y RA en respuesta a A23 187 en un grupo de 73 pacientes infértiles y
encontraron una correlación significativa con FIV para morfología pero no para RA.
Esta diferencia no es sorprendente, ya que ese estudio se llevó a cabo en condiciones
muy distintas a las nuestras: se utilizó otro inductor de RA, distintas condiciones de
capacitación, otro método de evaluar el estado del acrosoma. Pero, quizás más
importante, es señalar que la selección de pacientes no necesariamente respondió a los
mismos criterios. De hecho, la tasa media de fertilización para el grupo de pacientes de
Sukcharoen file del 62%, mientras que la nuestra file del 35%, poniendo de manifiesto
que nuestra población de pacientes infértiles muy probablemente incluyera una
proporción mayor de casos de infertilidad severa. Así se pone en evidencia la necesidad
de llevar a cabo estudios poblacionales prospectivos en los que participen el número
máximo posible de sujetos, como así también la importancia de validar los resultados
obtenidos en una pn'mera instancia con un segundo grupo de individuos.
Discusión HI
8. BÚSQUEDA DE UN MODELO ADECUADO PARA PREDECIR LA
CAPACIDAD FERTILIZANTE D_EUNA MUESTRA DE ESPERMATOZOIDES
HUMANOS
A pesar de que existen varios estudios que han tratado de correlacioanr el ensayo de RA
con el e'xito en FIV e incluso construir un modelo predictivo, ninguno ha tratado de
validar los resultados obtenidos a través del análisis de un primer grupo de pacientes,
con un segundo grupo de pacientes distintos.
Lo primero que llama la atención al analizar los resultados obtenidos es que los valores
de los coeficientes de correlación de aquellos parámetros que correlacionaron
significativamente con los porcentajes de FIV, son relativamente bajos. Sin embargo,
otros grupos de trabajo que han estudiado las correlaciones entre distintos parámetros
espermáticos y FIV han informado valores semejantes (Liu et al. 1988; Sukcharoen et
al. 1996; Vawda et al. 1996; Liu, Baker, 1998). Este fenómeno recalca la importancia
de reconocer la contribución indudable de múltiples factores al éxito de un
procedimiento de FIV. Parinaud et al. (1996) encontraron que cada uno de los
parámetros espermáticos que correlacionaron significativamente con FIV no podía
explicar más del 14% de la variabilidad observada en FIV.
La superposición de los intervalos de confianza de los distintos coeficientes de
correlación pone de manifiesto que los factores de fertilidad evaluados en nuestro
estudio son interdependientes. Efectivamente, varios grupos de trabajo han demostrado
la existencia de correlaciones significativas entre distintos parámetros espermáticos, a
pesar de que en principio evalúen distintos aspectos de la fimcionalidad del
espermatozoide (Liu et al. 1988; Parinaud et al. 1996; Liu, Baker, 1998). Como ya
mencionáramos, es posible que los parámetros que habitualmente se evalúan sean
manifestaciones macroscópicas con un mismo origen molecular que aún no conocemos.
Parinaud et al. (1996) encontraron que los defectos de motilidad, morfología y fimción
acrosomal están íntimamente ligados y sugirieron la existencia de una deficiencia global
de la espennatogénesis y/o función epididimaria.
En la etapa de construcción del modelo, se encontró que la mejor predicción del
porcentaje de ovocitos fertilizados en FIV se obtiene a través de una combinación de la
reacción acrosomal y la concentración de espermatozoides en semen. Esto contrasta con
los resultados de Parinaud et al. (1996) quienes, si bien no evaluaron la inducibilidad de
RA, sí correlacionaron parámetros seminales con FIV y encontraron la mayor
significancia en el porcentaje de motilidad progresiva, sin encontrar correlación con la
concentración de espermatozoides en semen. Vawda et al. (1996) encontraron que el
parámetro del espermograma que mejor correlaciona con FIV es el porcentaje de
morfología normal según criterios estrictos, seguido de motilidad progresiva y
viabilidad, pero tampoco encontraron correlación con la concentración de
espermatozoides. Por otra parte, Sukcharoen et al. (1996) encontraron correlación con
concentración y con porcentaje de formas normales en semen y no con RA en respuesta
a A23187. Tal como sucede en nuestro caso, Vawda et al. (1996) y Liu et al. (1988) no
encontraron correlación del éxito en FIV con la edad de la mujer o la patología
femenina. Para Liu y Baker (1998) el porcentaje de FIV correlacionó significativamente
con RA en respuesta a A23187, seguido del porcentaje de motilidad en el medio de
inseminación. Sólo para aquellos pacientes con morfología normal superior al 15%, la
concentración de espermatozoides en semen correlacionó con FIV. Las diferencias entre
los resultados informados por los distintos grupos podrían bien deberse a la selección de
pacientes y a diferencias en la metodología, pero también ponen de manifiesto la
necesidad de validar los resultados obtenidos en una primera instancia con otros grupos
de pacientes.
Al llevar a cabo la validación con un grupo nuevo de pacientes, se observó que,
efectivamente, la reacción acrosomal se mantuvo como el parámetro individual con el
mayor valor predictivo. Sin embargo, la concentración de espermatozoides en semen, si
bien mantuvo su valor de correlación con el porcentaje de ovocitos fertilizados, no
añadió valor estadístico a la predicción. También se observaron algunas alteraciones en
la cascada de correlaciones entre los distintos parámetros evaluados y FIV. Estas
variaciones podn'an ser consecuencia de la mayor dispersión de los valores individuales
obtenidos en esta segunda etapa, puestos de manifiesto en el mayor tamaño de los IC
para los distintos coeficientes de correlación.
Sin embargo, la permanencia de la reacción acrosomal como parámetro que
individualmente posee la mejor correlación con la tasa de FIV a través de las etapas de
construcción y validación, reafirmaría la posible utilidad del ensayo de RA en respuesta a
hFF como elemento diagnóstico.
No fue posible construir un modelo de predicción cuantitativo en base a los valores de
%RA debido a la diferencia entre las curvas de respuesta del % fertilización en fiinción
de %RA para los dos grupos de pacientes. Este hecho resulta bastante lógico dada la
complejidad del fenómeno de fertilización, que hace prácticamente imposible predecirlo
con precisión a través de la medida de un número limitado de variables.
Los resultados obtenidos revelan la importancia de poner a pmeba cualquier modelo
predictivo de la capacidad fertilizante en un grupo de pacientes distinto al que se ha
utilizado para su construcción. Asimismo, queda claro que dada la gran heterogeneidad
en el comportamiento de las poblaciones de pacientes y la gran cantidad de variables que
puede influir sobre las tasas de fertilización, se necesitarán estudios que incluyan un
número elevado de pacientes y la mayor cantidad posible de determinaciones
paramétricas, para desarrollar un modelo de predicción de la fertilidad más confiable. Es
necesario determinar cuál es el conjunto de ensayos que proporciona la mayor y mejor
información acerca de la capacidad fertilizante (Liu et al. 1988).
REFLEXIÓN FINAL
"‘ “ " Final 156
Creemos haber demostrado satisfactoriamente que el ensayo de reacción acrosomal en
respuesta al fluido folicular tiene valor diagnóstico en el laboratorio de Andrología.
Cuando hablamos de valor diagnóstico y probabilidades, es importante tener en cuenta
lo que realmente significa informar a un paciente que tiene una cierta probabilidad de
fertilizar. Si decimos, por ejemplo, que la probabilidad de éxito es del 80%, estamos
simplemente informando que, de acuerdo con la experiencia previamente acumulada,
de cada lO individuos con caracteristicas semejantes a las del paciente en cuestión, 8
lograron fertilizar. Esto indudablemente parecería ser un comentario positivo, pero hay
que tener en claro que este porcentaje no informa dentro de qué grupo se encontrará el
paciente: dentro de los 8 que fertilizan o dentro de los 2 que no logran hacerlo. Este
fenómeno no es exclusivo del diagnóstico andrológico, sino de cualquier tipo de
pronóstico basado en datos poblacionales y pone de manifiesto que nunca podremos
predecir en forma exacta el comportamiento de un paciente en FIV. Sí podremos tratar
de hacerlo lo mejor posible utilizando las herramientas adecuadas.
La capacidad de sufrir RA en respuesta a hFF es un parámetro estable a través del
tiempo, que se encuentra marcadamente disminuido en muchos pero no todos los
hombres supuestamente infértiles y en algunos hombres considerados fértiles según
las caracteristicas de un espermograma. A pesar de su interdependencia con otros
parámetros espermáticos, el ensayo de RA provee información adicional acerca de la
capacidad fertilizante in vitro. Un valor de RA negativo aislado no puede tomarse como
necesariamente indicativo de un espermatozoide incompetente, así como un valor de RA
normal no asegurará fertilización. Sin embargo, el resultado del ensayo de RA sumado al
de otros ensayos, mejorará la probabilidad de predecir adecuadamente el
comportamiento de una muestra de espermatozoides en un procedimiento de
fertilización asistida y, por ende, la toma de una decisión clínica acertada.
"‘ "' " Final 151
En la era del ICSI, esta preocupación por predecir la capacidad fertilizante de una
muestra de espermatozoides quizás parezca irrelevante, dado que esta técnica de
micromanipulación se ha convertido en el mejor tratamiento disponible para la
infertilidad masculina, logrando elevados porcentajes de fertilización,
independientemente de la patología espermática. Sin embargo, ¿por qué someter
indiscriminadamente a todos los pacientes infértiles a ICSl, cuando su problema quizás
podn’a resolverse exitosamente a través de un procedimiento de fertilización asistida más
sencillo y también menos costoso? Claro está que para determinar cuál sería el
procedimiento a seguir se necesitaria contar con la mayor y mejor información posible
acerca de la fimcionalidad de las gametas. Quisiera, entonces, concluir con una frase que
sintetiza elegantemente mi posición y la de muchos otros andrólogos de laboratorio:
"EL TRATAMIENTO DE LA INFERTILIDAI) MASCULINA NECESITA MÁS
ANDROLOGÍA,N0 MENO
Cummins y Jequier, 1994
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ATP
BSABWWBWW-268Ca-ATPasaCASA
DAG
E
FCS
FIV
G&lVFHam’s-ZÓB
hFF
HHM
HSMHSM-3BHSM-268HSM-3 SB
HSM-FCSlC 95%
L
L3
NIHOMSPBSPIP2RA
%RA
RA+RARP
Vc
V040
VCÓO
VPNVPP
A‘ ' ‘ .“171
ABREVIATURAS
Adenosina trifosfatoAlbúmina de suero bovino
Medio Biggers, Whitten y WhittinghamMedio BWW, suplementado con 26 mg/ml de BSA
ATPasa dependiemte de calcioSistema computarizado para el análisis de movimiento espermático
DiacilglicerolEspecificidad, parámetro estadísticoSuero de cordón fetal
Fertilización in vitro
Genetics & lVF Institute, Fairfax, VA, E.E.U.U.
Medio Ham’s, suplementado con 26 mg/ml de BSAFluido folicular humano
Medio Tyrode's modificado, regulado con Hepes, pH 7,4Medio Tyrode's modificado para espermatozoides humanosMedio HSM, suplementado con 3 mg/ml de BSA
Medio HSM, suplementado con 26 mg/ml de BSAMedio HSM, suplementado con 35 mg/ml de BSA
Medio HSM, suplementado con 7,5% V/V de FCSIntervalo de confianza del 95%
Linealidad del espermatozoide% acumulativo de espermatozoides con linealidad menor o igual a 3National Institutes of Health, Bethesda, MD, E.E.U.U.
Organización Mundial de la SaludSolución fisiológica, regulada con fosfato, pH 7,4Fosfoinositol difosfatoReacción acrosomal
Diferencia entre los % de espermatozoides reaccionados en presencia yausencia de hFF
%RA mayor o igual a 5%%RA menor del 5%
Razón de probabilidadesSensibilidad, parámetro estadísticoVelocidad curvilínea del espermatozoide
% de espermatozoides con Vc menor o igual a 40 pm/seg% de espermatozoides con Vc menor o igual a 60 Lim/segValor predictivo negativoValor predictivo positivo
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