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Estudios de macro- y microevolución con secuenciación masiva dirigida

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Estudios de macro- y microevolución

con secuenciación masiva dirigida

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SEBOT 2020Lisa Pokorny1 & Juan Viruel2

1Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas 2Royal Botanic Gardens, Kew (RBGK)

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Hyb-Seq1. Introducción: secuenciación masiva2. Secuenciación mixta 3. Diseño de paneles de captura4. Análisis bioinformáticos5. Ejemplos6. El futuro es ahora

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1.Introducción:

Secuenciación Masiva

● Cronología● Limitaciones● Técnicas

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Cronología y comparación de instrumentos de secuenciación masiva

Fig. 1. Reuter et al. 2015. Mol. Cell 58: 586–597

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Costes de secuenciación por genoma (para humanos en dólares)

2ª generación (fragmentos cortos)

3ª generación (fragmentos largos)

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Tamaños del genoma en plantas embriofitas

Fig. 1. Pellicer et al. 2018. Genes 9 (2), 88

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Técnicas de muestreo genómico

Aleatorio

▣ A perdigones (shotgun seq)

▣ Genotipado por secuenciación (GbS, RAD-seq)

Estratificado

▣ Trascriptómica (RNA-seq)

▣ Enriquecimiento y captura (microfluídica, en fase sólida, en solución)

Mixto

▣ Combinando a perdigones con captura en solución (Hyb-Seq)

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Estratificado

▣ Trascriptómica (RNA-seq)

▣ Enriquecimiento y captura (microfluídica, en fase sólida, en solución)

Técnicas de muestreo genómico

Aleatorio Mixto

Hyb-Seq

Fig. 1. Davey et al. 2011. Nat. Rev. Genet. 12: 499–510 Fig. 5. Metzker. 2010. Nat. Rev. Genet. 11: 31–46

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Secuenciación Sanger vs. masiva dirigida

Secuenciación de terminación de cadena (Sanger sequencing)

Secuenciación masiva dirigida (target capture sequencing)

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Hyb-Seq

Secuenciación mixta

Fig. 1. Dodsworth*, Pokorny*, Johnson* et al. 2019. Trends Plant Sci. 24 (10), 887–891

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2.Secuenciación

mixta (Hyb-Seq)● Definición● Materiales● Métodos

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Secuenciación aleatoria a perdigones(genome skimming)

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Secuenciación masiva dirigida

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‘’80% 20%

Hyb-Seq = shotgun + targeted sequencing

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Hyb-Seq: flujo de trabajo molecularHale et al. 2020. Strategies for reducing per-sample costs in target capture sequencing for phylogenomics and population genomics in plants. APPS, in press.

200 ng

1000 ng>5ng/µl

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Optimización de protocolos molecularesFig. 3. Brewer et al. 2019. Front. Plant Sci. 10: 1102Fig. 3. Bakker et al. 2015. Biol. J. Linn. Soc. 117: 33–43

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3.Diseño de

paneles de captura

● Específicos● Universales● Comparativa

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Recursos genómicosTranscriptomas, ESTs, genomas...

Recursos económicosProducción y optimización

Recursos computacionalesDiseño con MarkerMiner, BaitFisher, DOMINO...

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Fig. 9. Cheng et al. 2018. GigaScience 7: 1–9.

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‘’2,840 genes de

angiospermas en copia

baja o única

(2,663 baja + 177 única)

Fig. 3. De Smet et al. 2013. PNAS 110: 2898–2903

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Transcriptomas▣ Preexistentes o material vivo ▣ Ensamblaje de novo

Genoma(s) de referencia▣ 16 disponibles en ▣ Posible añadir más

Panel de enriquecimiento y captura comercial▣ Co-diseño del panel

Diseño de panel específico

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Fig. 1. Chamala et al. 2015. Apps. Plant Sci. 3(4): 1400115

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A partir de▣ Cuatro transcriptomas

□ 3x grupo de estudio (Dioscorea) □ 1x género hermano (Tacca).

▣ Dos genomas de referencia□ Oryza sativa (Poales)□ Xerophyta viscosa (Pandanales)

Resultados▣ 260 genes de copia baja o única

□ (+43 genes de interés)□ >60% enriquecimiento

▣ Excelente resolución filogenética

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Figs. 1, S5 & S6. Liu et al. 2019. Nat. Commun. 10: 1485

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http://mossmatters.net/blog/SequenceClusters.html

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http://mossmatters.net/blog/SequenceClusters.html

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¿Panel universal o específico?

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¿Panel universal o específico?

▣ ¿Cuál es tu hipótesis?

▣ ¿Qué recursos genómicos, computacionales y económicos tienes?

▣ ¿Y por qué no ambos?

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¿Panel universal o específico?

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¿Panel universal o específico?

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¿Panel universal o específico?

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4.Análisis

bioinformáticos

● Calidad● Procesado● Filogenómica● Ploidía

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Calidad

Recorta

Pega

Colorea

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Calidad

Recorta

Pega

Colorea

Datos en bruto

Secuencias

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Calidad

FastQC|Trimmomatic

BLASTx|BWA

SPAdes|exon(intron)erate

HybPiper

Datos en bruto

Secuencias

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HybPiper

https://github.com/mossmatters/HybPiper/wiki

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PHYLUCE HybPhyloMaker

https://phyluce.readthedocs.io/en/latest/ Fig. 1. Fér & Schmickl. 2018. Evol. Bioinfo. 14: 1–9

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Procesado

Alinea

Poda y enmascara

Refina

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Procesado

Alinea

Poda y enmascara

Refina

Secuencias

Alineamientos

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Procesado

MAFFT|PASTA|UPP

AMAS|trimAl

FastTree|TreeShrink

Secuencias

Alineamientos

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PASTA

Fig. 1. Mirarab et al. 2015. J. Comput. Biol. 22 (5): 377–386

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Fig. 2. Nguyen et al. 2015. Genome Biol. 16: 123

UPP

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TreeShrink

Fig. 1. Mai & Mirarab. 2015. BMC Genomics 19: 272

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Genes

Filogenómica

Especies

Evolución

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Genes

Filogenómica

Especies

Evolución

Alineamientos

Filogenias

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Árboles de genes vs. árboles de especies

Fig. 1. Liu et al. 2015. Ann. N. Y. Acad. Sci 1360: 36–53

Concatenación Coalescencia en 1 paso Coalescencia en 2 pasos

especie Aespecie Bespecie Cespecie Despecie E

gen 1 gen 2 gen 3 gen 4

árboles de genessúper-matriz

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Árboles de genes vs. árboles de especies

Fig. 1. Liu et al. 2015. Ann. N. Y. Acad. Sci 1360: 36–53

Concatenación Coalescencia en 1 paso Coalescencia en 2 pasos

especie Aespecie Bespecie Cespecie Despecie E

gen 1 gen 2 gen 3 gen 4

árboles de genessupermatriz

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Filogenómica

RAxML-NG|IQ-tree|PhyML

ASTRAL III

Alineamientos

Filogenias

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Árboles de genes vs. árboles de especies

Fig. 1. Liu et al. 2015. Ann. N. Y. Acad. Sci 1360: 36–53

Concatenación Coalescencia en 1 paso Coalescencia en 2 pasos

especie Aespecie Bespecie Cespecie Despecie E

gen 1 gen 2 gen 3 gen 4

árboles de genessupermatriz

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Filogenómica

ML|PoMo|SVDquartets

Alineamientos

Filogenias

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Genes

Filogenómica

Especies

Evolución

Alineamientos

Filogenias

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Filogenómica

BEAST 1.x y 2.x|RevBayes

Alineamientos

Filogenias

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RevBayes

https://revbayes.github.io/tutorials/

Métodos comparativos (Ornstein-Uhlenbeck)

Tiempos de divergencia (Birth-Death)

Tasas de diversificación (HiSSE)

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RAxML-NG|IQ-tree|PhyML

Filogenómica

PAML|HyPhy

Alineamientos

Filogenias

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▣ GARD (Genetic Algorithm for Recombination Detection)

▣ FEL (Fixed Effects Likelihood)

▣ SLAC (Single-Likelihood Ancestor Counting)

▣ FUBAR (Fast, Unconstrained Bayesian AppRoximation)

▣ MEME (Mixed Effects Model of Evolution)

▣ aBSREL (adaptive Branch-Site Random Effects Likelihood)

▣ BUSTED (Branch-Site Unrestricted Statistical Test for Episodic Diversification)

▣ RELAX

http://www.hyphy.org/getting-started/#characterizing-selective-pressures

HyPhy

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Fig. 1. Wendel. 2015. Am. J. Bot. 102(11): 1753–1756

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Visualización del nivel de ploidía ploidyNGS

Fig. 1. Corrêa dos Santos et al. 2017. Bioinformatics 33(16): 2575–2576

Haploide Diploide

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Visualización del nivel de ploidía ploidyNGS

Fig. 1. Corrêa dos Santos et al. 2017. Bioinformatics 33(16): 2575–2576

Haploide Diploide

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Histogramas obtenidos con simulaciones

https://github.com/diriano/ploidyNGS

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Estimación del nivel de ploidía nQuire

Fig. 2. Weiß et al. 2018. BMC Bioinformatics 19: 122. Disponible en https://github.com/clwgg/nQuire

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Secuencias producidas con Hyb-Seq

Fig. 2. Viruel et al. 2019. Front. Plant Sci. 10: 937

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Ploidía estimada con datos de Hyb-Seq de material de herbario

Fig. 3. Viruel et al. 2019. Front. Plant Sci. 10: 937

1 / 1 = 1

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Ploidía estimada con datos de Hyb-Seq de material de herbario

Fig. 3. Viruel et al. 2019. Front. Plant Sci. 10: 937

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‘’ FastQC+Trimmomatic

BWA+ploidyNGS

nQuire+R

Datos en bruto

Ploidía

Fig. S5b. Viruel et al. 2019. Front. Plant Sci. 10: 937

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Ploidía estimada con datos de Hyb-Seq de material de herbario

Fig. 3. Viruel et al. 2019. Front. Plant Sci. 10: 937

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5.Ejemplos:

● Flores● Tabaibas● Juncias● Chefleras

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Órdenes y familias APG IV

▣ Transcriptomas 1KP

▣ Captura con angiosperms-353

▣ SRAs (RNA-seq) de NCBI

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Órdenes y familias APG IV

▣ Transcriptomas 1KP

▣ Captura con angiosperms-353

▣ SRAs (RNA-seq) de NCBI

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Captura y minado

Fig. 4. Brewer et al. 2019. Front. Plant Sci. 10: 1102

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Análisis filogenómicos

trimmomatic

HybPiper

UPP+TS+trimAl

Datos en bruto

Alineamientos

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Resultados preliminares

IQ-tree+UFboot

ASTRAL+LPP

SortaDate+BEAST

Alineamientos

Filogenias

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Euphorbia balsamifera s.l.

Figs. 1, 3 & 4. Villaverde*, Pokorny* et al. 2018. New Phytol. 220: 636–650

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C4 Cyperus Clade

Figs. 1, 2 & 4. Larridon*, Villaverde* et al. 2020. Front. Plant Sci.

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Shee et al. 2020. Front. Plant Sci., in press

Schefflera

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6.el futuro es

ahora

● Fragmentos largos

● Depauperacióncon CRISPR

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https://nanoporetech.com/sites/default/files/s3/posters/pdf/P17013%20SeqCap%20v7.0%20A4%20_compressed.pdf

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https://arborbiosci.com/wp-content/uploads/2019/01/PAGXXVII-Poster-CRISPR-Cas-Targeted-Sequencing.pdf

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¡Gracias!¿Preguntas?

1000 PLANT TRANSCRIPTOMES INITIATIVE GLOBAL TREE SEED BANK PROJECTPAFTOL RESEARCH PROGRAMME

Lisa Pokorny [ @Calyptrochaeta]

Juan Viruel [[email protected]]

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Foto: WJ Baker


Pública Estudio de Opiniónstatic.emol.cl/emol50/documentos/archivos/2017/11/... · Muestreo aleatorio estratificado por cuotas. El muestreo es una aproximación al método probabilístico,

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