Métodos aplicados para -caroteno Dra. Paz Robert C. Universidad de Chile Facultad de Ciencias...
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Métodos aplicados para -caroteno
Dra. Paz Robert C.
Universidad de ChileFacultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
Dpto. Ciencia de los Alimentos y Tecnología QuímicaQuímica de Alimentos y Materias Grasas
Taller FAO, 2008
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Estructura básica
• Tetraterpeno de 40 carbonos, simétrico y lineal formado a partir de 8 unidades isoprenoides de 5 C unidas de manera tal que el orden se invierte en el centro.
• Amplio sistema de doble enlace conjugado.
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Análisis de Carotenoides
-carotenoProvitamina A
Provitamina ACarotenos principales
Composición completa
Dependiendo del grado de información deseado
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Características espectrales
Caroteno Solvente max1%A1 cm
-caroteno Acetona (429) 452 478 -
cloroformo (435) 461 485 2396
etanol (425) 450 478 2620
hexano (425) 450 477 2592
Espectro de absorción de carotenoides son dependientes del solvente
1%A1cm usado en el cálculo de la concentración también varía marcadamente con el solvente
Carotenoides en solución obedecen la Ley de Lambert-Beer. Su absorbancia es directamente proporcional a la concentración.Britton, 1995; Rodriguez-Amaya. 2001
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TRANS CAROTENO
EPOXICAROTENOSAPOCAROTENOS
COMPUESTOS DEBAJO PESO MOLECULAR
CIS-CAROTENOS
oxidaciónisomerización
oxidación
POSIBLE ESQUEMA DE DEGRADACIÓN DE CAROTENOS
Pérdida de color
Pérdida valor nutritivo
Pérdida de sabor
Moléculas altamente insaturadas
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... Isomerización cis• causa leve pérdida de color, disminución
de 2 a 6 nm en la , aparición de un pick en la región UV
15-cis
13-cis
transLicopeno
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Procedimiento Analítico
• Muestreo y preparación de la muestra• Extracción con acetona en frio• Transferencia (partición) a éter de petróleo,
hexano, eter etílico• Saponificación y lavado• Concentración en evaporador rotatorio
(<35°C)• Separación cromatográfica• Identificación y cuantificación.
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Muestreo y preparación de la muestra.
1. Homogenización de la materia prima
2. Extracción con acetona en frío
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Partición a éter de petróleo
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Separación OCC FM: porcentajes crecientes de acetona en éter de petróleo
MgO : Celite (1:1)
Espectro de absorción UV/VIS, Rf, orden de elución cromatográfica reacciones específicas.
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Fases Estacionarias-OCC
• Alúmina• Sílica• CaCO3
• Ca(OH)2
• MgO• ZnCO3
• Tierras silíceas (tierra de diatomeas, kieselguhr, hyflosupercel)
• Celulosa, almidón, dextran cross-linked (sephadex), Polietilen
• Mezclas de ellos
Rodriguea-Amaya, 2001
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Criterios de identificación OCC
Espectro de absorción UV-Vis de acuerdo con el cromóforo sugerido
Propiedades cromatográficas concordantes en dos sistemas diferentes. Orden de salida OCC y Rf(TLC).
•Estructura fina del espectro (%III / II)*100
Britton, 1995
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Espectro de absorción max
• zeinoxantina 421 445 474 • -criptoxantina 421 445 475
• Luteina 421 445 475
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-criptoxantina (425) 449 476
zeaxantina (424) 449 476
Espectro de absorción max
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Métodos Oficiales AOAC
• Carotenos en plantas frescas Ch-45 (941.15) /método espectrofotométrico.
• Carotenos y xantofilas en plantas secas y alimentos mezclados Ch-45 (970.64)/ método espectrofotométrico
• Carotenos y carotenoides en productos de macaroni Ch-32 (938.04)
• Carotenos y carotenoides en huevos Ch-32 (938.04)
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Carotenos en plantas frescas
• Pigmentos solubles en grasa, extraídos y cromatografiados para remover clorofilas e hidroxicarotenos, los cuales son determinados espectrofotométricamente y expresados como beta-caroteno
MUESTRA
• Extracción• Acetona
/hexano (40+60)
COLUMNA
• Elución• acetona:hex
ano (1+9)
MgO:hyflosupersel (1:1)
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Carotenos y xantofilas en plantas secas y alimentos mezclados
Muestra aguaHexano-acetona-etanol
absoluto-tolueno (10+7+6+7)
Saponificación en caliente
Saponificación en frío
Silica gel G+hyflosupersel (1:1)
Carotenos •Hexano:acetona (96+4), 436 nm
MHC•Hexano:acetona (90+10) 474 nm•Zeinoxantina, criptoxantina
DHC•Hexano:acetona (80+20) 474 nm•Luteina, zeaxantina
xantofilas •Hexano;acetona:metanol (80:10:10)•Violaxantina, neoxantina, otros
MgO:hyflosupersel (1:1)
Carotenos
• Hexano:acetona (90+10)
Total xantofilas
• Hexano;acetona:metanol (80:10:10)
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Separación-HPLC
Fase inversa-Fases enlazadas RP-18 ó C18
RP-8 ó C8
C-30
Ntrilo, amino
Fase Inversa-HPLCColumnas enlazadas RP-18: Aplicable a carotenoides de todos los niveles de polaridad.Materiales RP son inertes, formación de artefactos es mínima.Se puede trabajar en elusión con gradiente
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Separación-HPLC
Fase Normal• Sílice
compuestos son eluídos de acuerdo a su polaridad, útil para separación de xantofilas, los carotenos son pobremente resueltos• Alúmina, Ca(OH)2
Para algunas separaciones especiales. Presentan dificultades prácticas: tienen una vida corta y necesitan un control riguroso de humedad
Fase NormalCa(OH)2
AlúminaSílice
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Criterios de identificación-HPLC
Tiempos de retención tr
Tiempo de retención relativo TRR = tr,i / tr,st
Adición a la muestra del componente supuesto: normalmente se agrega a la muestra, el supuesto componente i y se ve cual pico crece.
Correlaciones gráficas de estructura -retención
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Criterios de identificación HPLC
Espectro de absorción UV-Vis de acuerdo con el cromóforo sugerido
Propiedades cromatográficas concordantes en dos sistemas diferentes.
Espectro de masas que confirme por lo menos la masa molecular.
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CuantificaciónCurva de calibración
Comparación con muestras de concentración conocida
Cs/Cst = As/Ast
Standard Interno
Fi (Ci/Cst) = (Ast/Ai)
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Características espectrales de carotenoides identificados
Fracción Fase movil Identificación Rf**
1 5% acetona (426) 448 476 B-Caroteno 0,98 (425) 450 4772 10% acetona (422) 444 472 Zeinoxantina 0,43 421 445 4753 20%acetona 450 Apocarotenal prob. 0,984 30-40% acetona (424) 442 468 Anteroxantina prob 0,19 (422) 445 4725 60% acetona (422) 442 472 Luteína 0,19 (421) 445 474
zeaxantina (424) 449 4766 100% acetona 432 458 488 Rubixantina 0,52 434 460 4907 10% agua-acetona 442 468 500 Licopeno 0,98 444 470 502
* Davies, 1976; Rodriguez-Amaya, 1999
** Placa de sílice, FM metanol 5% en benceno
Máx long de onda Máx long de ondaLiteratura*
Rosa mosqueta (Rosa Rubiginosa)
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HPLC (Rosa Mosqueta)
Columna: RP-18 symmetry, 5u, 250 mmFase móvil: acetonitrilo: metanol: acetato de etilo (65: 20: 15)Flujo: 1ml/min
-caroteno
Licopeno
Rubixantina
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Tomate Zanahoria
Identificación por Trr con patrones extraídos.