1. UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS MICROSCOPIA y Tcnicas Microscpicas Semestre Acadmico - 2011 PROFESOR: Segundo T.Caldern Pinillos Bilogo-Maestra en Fisiologa Humana UNMSM-FMH San Fernando FACULTAD DE MEDICINA SAN FERNANDO DPTO. DE CIENCIAS DINAMICAS Escuela Acadmico Profesional deTecnologa Mdica BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

2. ESTUDIOGENERAL DE LA CELULAMTODOS DE ESTUDIO DE LA CLULA Y LOS TEJIDOS

I. Tcnicas preparatorias utilizadas en microscopa ptica.

La correcta observacin del material biolgico con el microscopio ptico requiere una serie de procesos previos que, son los siguientes:

1. Fijacin. Las clulas de los rganos y tejidos mueren y se descomponen cuando son extradas de su medio sino se las mantiene en condiciones especiales.

El proceso de fijacin no evita la muerte celular, pero preserva de la descomposicin manteniendo la estructura morfolgica.

Entre los muchos lquidos fijadores utilizados, como el alcohol y el cido actico, el formaldehdo o formol es el ms habitual.

3.

2.Inclusin y corte.

Los organismos unicelulares y las clulas aisladas pueden observarse con facilidad al microscopio, los rganos y tejidos, son demasiado gruesos para que sean traspasados por la luz; de ah que se necesite cortarlos en finas lminas.

Para ello se utiliza un aparato, llamado microtomo, que permite la realizacin de cortes de tan slo algunas micras de espesor.

4.

El material biolgico resulta de ordinario extremadamente blando para poder efectuar los cortes; por ello, a la fijacin sigue un proceso de endurecimiento del material y su inclusin en una sustancia plstica, generalmente parafina o resina.

Una alternativa rpida a la inclusin, aunque con resultados de menor calidad, es congelar el tejido y realizar los cortes en un microtomo especial para esta finalidad (criotomo).

5.

3. Tincin. Una dificultad en la observacin microscpica es el escaso contraste que presenta el material biolgico, debido a su alto contenido en agua.

Para mejorar el contraste se utilizan las tinciones, que permiten colorear artificialmente los distintos componentes tisulares. Son muchos y variados los colorantes empleados.

La tincin ms usada esHEMATOXILINAyEOSINA , otros colorantes son combinacionesTRICROMICAS ,TETRACROMICAS , coloraciones PAS para la demostracin de hidratos de carbono, etc.

6. LA LUZ

Es una forma de energa que se propaga en lnea recta y en forma de ondas.

La distancia entre los mximos o mnimos de las ondas que describen es la medida del a que determina del color.

La altura por encima o por debajo del eje da la medida de la amplitud que viene a ser la intensidad.

Interferencia: Cuandodos ondas o rayos se encuentran en un punto, pueden producir diferentes resultados, segn lleguenfasadas o desfasadas.

7. II) TECNICAS DE MICROSCOPA

• Lentes:

• Ocultar

• Objetivos

• Condensador

A) El microscopio ptico de campo claro

Caractersticas. Bsicamente, el microscopio ptico compuesto es un tubo provisto de lentes (una en cada extremo) que amplan sucesivamente la imagen del objeto (preparacin histolgica), el cual est intensamente iluminado.

8.

Se encuentra prxima al objeto y se denominalente objetivo;la otra lente se sita junto al ojo del observador, en cuya retina se forma la segunda imagen aumentada, y recibe el nombre delente ocular.

Este esquema simple inicial se perfecciona aadiendolentes intermediasy otros dispositivos, como elcondensador,que concentra la luz emitida por la fuente luminosa sobre el objetivo, dispositivos para aumentar el contraste, etc.

9. MICROSCOPIA DE CAMPO CLARO

El objeto recibe luz desde abajo por una superficie uniformemente iluminada, la cual es concentrada por el objetivo en el plano imagen de la fuente luminosa.

Parte de la luz procedente de la superficie iluminado es dispersada y reflejada por el objeto, actuando este como una fuente de luz secundaria.

Esta luz del objeto es concentrada por el objetivo en el plano imagen del objeto situado por encima del plano imagen de a fuente luminosa.

Cuando estos planos imagen se observan por el ocular , el objeto se ve contra un fondo claro. Si el objeto es transparente no seren el fondo cloro

10. 11.

SISTEMA PTICO

OCULAR : Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del objetivo.

OBJETIVO : Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta.

CONDENSADOR : Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin.

DIAFRAGMA : Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.

FOCO : Dirige los rayos luminosos hacia el condensador

12.

SISTEMA MECNICO

SOPORTE : Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.

PLATINA : Lugar donde se deposita la preparacin.

CABEZAL : Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular.

REVLVER : Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos.

TORNILLOS DE ENFOQUE : Macromtrico que aproxima el enfoque y micromtrico que consigue el enfoque correcto.

13.

Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogi correctamente en el uso anterior, ya debera estar en esas condiciones.

Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas.

Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparacin es de bacterias.

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO PTICO 14.

Para realizar el enfoque:

Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico.

Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos.

Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntida la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino.

15.

Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino.

Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 3.

El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin.

16.

Lo importante del microscopio no son los aumentos en s mismos, sino elpoder de resolucin.

Este se define corno la capacidad de distinguir como imgenes distintas dos cercanas.

El poder de resolucin se mide utilizando como unidad la inversa dellmite de resolucin(poder de resolucin = 1/lmite de resolucin).

El lmite de resolucin se define corno la distancia mnima entre dos puntos para que puedan distinguirse como tales. Se calcula por la frmula de Abbe:

Lmite de resolucin = = 0.61 x longitud de onda/apertura numrica 17.

Lalongitud de ondadepender de la luz empleada; si se usa luz natural blanca, la longitud de onda es 550 nm.

Laapertura numricaes igual a:nxseno ;siendonel ndice de refraccin (cambio en la velocidad de la luz difractada) del medio situado entre el objeto y la lente, yel ngulo de semiapertura de la lente.

Si el medio es aire,n =1. Si se utiliza aceite de inmersin.n =1.51.

El valor de seno a es siempre menor que uno (0.93 como mximo .en los microscopios actuales). En estas condiciones:

Lmite de resolucin = 0.61 x 550/(1.51 x 0.93) = = 335.5/1.4 = 240 nm 18.

Si se tiene en cuenta que el lmite de resolucin del ojo humano es 0.23 nm, con la utilizacin del microscopio ptico se ha multiplicado unas 1000 veces su capacidad de resolucin

Este lmite de resolucin obtenido con el microscopio de luz es muy difcil de mejorar.

Los aumentos finales se obtienen multiplicando los del objetivo por los del ocular.

Hay que tener en cuenta que la resolucin de la imagen es la del objetivo, puesto que el ocular no ampla el poder de resolucin.

Sin embargo, el ocular es muy til, porque con slo el objetivo quedara la imagen demasiado pequea.

19.

MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES

Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posicin de observacin, asegurarse de que la parte mecnica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda.

Cuando no se est utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y daen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.

Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de ptica.

No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se est utilizando el microscopio.

20.

B) Medios de aumentar el contraste en diversas modalidades de microscopa ptica.

Para estudiar el material vivo, en el que no pueden aplicarse las tinciones convencionales pues las clulas mueren en la fijacin, se emplea el microscopio decontraste de fases.

C) El microscopio deinterferencia

Se basa en principios similares, pero tiene la ventaja de proporcionar resultados cuantitativos. Con este microscopio se pueden determinar cambios en el ndice de refraccin, y las variaciones de fase se pueden reflejar en cambios de color tan acentuados que una clula viviente es capaz de aparecer coloreada.

21.

D) Otro microscopioutilizado es el depolarizacin.Se basa en la propiedad de ciertas sustancias ( anistropas ) que tienen un distinto ndice de refraccin segn la direccin que se considere. Las sustancias que siempre mantienen el ndice de refraccin se llaman istropas.

E) Otro microscopio ,denominadocitofotomtrico,se basa en el hecho de que diversos componentes celulares absorben especficamente determinadas bandas de luz.

As, mientras que los cidos nucledos absorben la banda de 260 nm (ultravioleta), las protenas absorben la de 280 nm.

22.

Asimismo, algunas reacciones histoqumicas dan bandas de absorcin especficas en el espectro visible y pueden analizarse cuantitativamente con estos microscopios.

As, mientras la citofotometra con luz ultravioleta permite detectar los cidos nucledos (DNA y RNA) sin distinguir entre ambos, si se realizan tinciones especficas para el DNA (como la reaccin deFeulgen),el microscopio citofotomtrico puede cuantifiar el contenido en DNA, sin confundirlo con el de RNA.

23. MICROSCOPIO DE LUZ POLARIZADA

Luz Polarizada : La luz es una forma de energa que se transmite en en lnea recta , pero formando ondas en ngulo recto con la direccin de transmisin. Vibra en todos los planos simultneamente, esta es la luz normal o no polarizada.

Luz polarizada: Luz que vibra en un solo plano la que al pasar por un polaroide con barras y ranuras paralelas , que se interponen en el eje de transmisinde luz y que las ranuras estn verticales entonces las ondas verticales pasarn a su travs pero las horizontales no.

24. MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA

Fluorescencia : caractersticas de ciertos cuerpos que cuando se les ilumina o radia con luz de onda corta(ultravioleta) son capaces de convertir la luz de onda corta que no es visible en otra de onda larga visible. En la verdadera fluorescencia la visibilidad de la luz dura solo mientras dura la radiacin. Fosforescencia dura despus que se retira la fuente de rayos ultravioletas.

Fluorescencia primaria : presentan fluorescencia natural. Vegetales, minerales.

Fluorescencia secundaria : Cuando los cuerpos generalmente biolgicos presentan fluorescencia luego de haberles teido con Fluorcromos.

25. MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA

Microscopio de luz ultravioleta : solo puede utilizar lentes de cuarzo.

M. De fluorescencia : Dentro del gran espectro de rayos ultravioletas sea aplican solo de gran mayores longitudes de unos 3500 , a los cuales los colorantes y sustancias fluorescentes son muy activos.

Que se necesita : Lmpara de mercurio de 250W, condensador de lentes de cristal y reflector metlico.Filtro de absorcin para eliminar el calor, para eliminar la luz visible, (Wood) o un filtro de interferencia, produce un fondo negro.

Filtro de retencin

26.

F)Para el anlisis de clulas y tejidos con fluorescencia propia, o que han sido tratados con colorantesfluorescentes( fluorocromos ) se utiliza el microscopio defluorescencia .La caracterstica fundamental de este microscopio es la incorporacin de una lmpara: que acta excitando el fluorocromo, y de un filtro especial, que presenta altos valores de transmisin para las ondas emitidas por el colorante fluorescente.

27.

Estos microscopios son grandes y complejos. Utilizan electrones en vez de luz y aumentan los objetos hasta 250.000 veces.

Las imgenes que se producen son en blanco y negro y muchas veces tienen colores falsos.

El microscopio electrnico de barrido (MEB) sirve para examinar la superficie de los objetos. Produce imgenes de gran aumento (ms de cien mil veces) y muestra la forma real de los objetos.

Adems de mostrar increbles figuras, el microscopio electrnico investigador muestra detalles que pueden ser de vital importancia para cientficos en muchas reas, como la medicina. Trabaja examinando la superficie de un objeto con un delgado haz electrnico.

Microscopios electrnicos : 28.

El Microscopio Electrnico De Transmisin (MET)

El microscopio electrnico de transmisin ( MET ) trabaja iluminando , un ejemplar en la platina con un haz de electrones y enfocando y aumentando la imagen con lentes magnticas.

Esta imagen electrnica, que es invisible, se transforma en una imagen normal, visible mediante una pantalla especial.

29.

G) El microscopio electrnico de transmisin

El microscopio electrnico supone un considerable aumento en el poder de resolucin al emplear y cuya longitud de onda es unas l00 000 veces menor.

Al ser de pequea longitud de onda pueden contornear muy bien los objetos, lo que proporciona un gran poder de resolucin.

Para desviar los electrones de un modo controlado, se utilizan lentes que no son pticas sino electromagnticas.

Unfilamento(ctodo) en un tubo de vidrio a alto vaco es calentado emitiendo electrones que tienden a seguir una trayectoria rectilnea, una lente electromagntica (que hace las veces decondensador)los electrones son concentrados en el objeto.

30.

Una segunda lente electromagntica funciona como lenteobjetivo,dando una imagen ampliada del objeto.

La tercera lente es elproyector,que acta de ocular, volviendo a ampliar la imagen y proyectndola sobre una pantalla fluorescente o sobre placas fotogrficas.

Entre ambas lentes hay unalente intermedia,tambin electromagntica, que ampla una vez ms la imagen.

Igual que en el microscopio de luz, los aumentos del microscopio electrnico se obtienen multiplicando los del objetivo, lente intermedia y proyector.

31.

Tcnicas preparatorias usadas en microscopa electrnica de transmisin.

Al igual que en la microscopa ptica, la observacin del material biolgico al microscopio electrnico requiere de unas tcnicas preparatorias que incluyen la fijacin, inclusin, corte y contraste de ese material.

Puesto que se van a observar las estructuras con mayor detalle que en la microscopa ptica (a nivel ultraestructural), estas tcnicas son an ms delicadas.

La fijacin se realiza generalmente en glutaraldehdo, que consigue una mejor preservacin de los tejidos que el formol, seguida de posfijacin con osmio, que impregna muchas estructuras con diversa afinidad proporcionando un contraste al chocar los electrones con la muestra.

32.

La inclusin se realiza en resinas plsticas, de epxido o metacrilatos, que proporcionan una mayor dureza. Los cortes han de ser extremadamente finos (cortes ultrafinos entre 20 y 80 nm de espesor), lo que slo se consigue con un aparato de alta precisin, denominado ultramicrtomo.

Para contrastar el material no se emplean colorantes sino tomos de metales pesados, como el plomo y el uranilo, que acentan el contraste proporcionado por el osmio.

33. PROCESAMIENTO PARA MET

La muestra apenas tomada, debe ser cortada en cubitos de 1mm de lado.

34. PROCESAMIENTO PARA MET

La muestra debe ser cortada con una hoja de afeitar desengrasada y ayudndose con un mondadiente.

35. PROCESAMIENTO PARA MET

Luego de ser cortadas deben ser fijadas con glutaraldehido al 2.5 a 3%, pH 7.2 y O.1 M a 4 C.

Post-fijadas en Tetraxido de Os. En las mismas condiciones.

36. PROCESAMIENTO PARA MET

Deshidratar con una batera de alcohol etlico de grado ascendente desde 30 al absoluto

37. PROCESAMIENTO PARA MET

El embebidose har con cambios sucesivos de resina: acetona en varias proporciones.

La inclusin con resina Epoxy.

38. PROCESAMIENTO PARA MET

Los cortes se realizan en un ultramicrtomo

39.

Los cortes se pueden hacer tambin con una cuchilla de diamante.

PROCESAMIENTO PARA MET 40.

Se recogen cortes de 1 a 2 m y se tien con Azul de toluidina, los que son observados al ML. para su identificacin.

PROCESAMIENTO PARA MET 41. Detalles ultraestructurales del mismo parsito revelado por el MET 42.

H) El microscopio electrnico de barrido

El microscopio de barrido o descanningse utiliza para el estudio de superficies de clulas y orgnulos celulares.

Como en el microscopio electrnico de transmisin, se trabaja con alto vaco, pero el haz electrnico no es fijo y de superficie amplia sino puntual y mvil, de modo que rastrea punto por punto la muestra.

No se hacen cortes ultrafinos de la muestra. La muestra se recubre de tomos opacos (oro y platino) mediante sombreado metlico.

Su principal utilidad es la observacin de la superficie de las clulas y componentes de los tejidos, para obtener una visin tridimensional de su forma externa y organizacin espacial.

43. 44. 45. 46. Trichomona vaginalis 47. LA MEB EN EL ESTUDIO BACTERIOLGICO

La identificacinde bacterias patgenas o no ; mejoran el conocimiento de ellas y su importancia en el ecosistema.

48. Estudiando las Bacterias

Bacilos

Cocos

Estreptococos

Estreptobacilos

49. III) DIFRACCIN DE RAYOS X

Esta tcnica instrumental proporciona una mayor resolucin que las tcnicas ms perfeccionadas de microscopa electrnica. Consiste esencialmente en, hacer atravesar un haz fino de rayos X sobre el material que va a ser analizado, y colocar detrs una placa, fotogrfica que recoge el espectrograma.

La tcnica se basa en que las radiaciones se difractan al encontrarse pequeos obstculos.

Sabiendo el ngulo de incidencia de un punto del. espectrograma y la longitud de onda del haz incidente se puede calcular el espacio que produce la difraccin.

Los rayos X tienen un poder de penetracin mucho mayor que el de los electrones y pueden utilizar con materiales muy gruesos.

50. IV) INMUNOHISTOQUMICA

Las tcnicas de inmunohistoqumica utilizan anticuerpos corno reactivos especficos para demostrar una multitud de sustancias diferentes, supongamos que se quiere estudiar la distribucin de la actina en clulas o tejidos de rata.

Se obtiene actina purificada de rata y se usa como antgeno al inyectarla a un conejo. Este forma anticuerpos frente a la actina de rata:

Estos anticuerpos antiactina los unimos a un colorante fluorescente, y los anticuerpos unidos al colorante se ponen en contacto con las clulas de rata que se quieren estudiar.

51.

Donde hay actina se unirn a ella los anticuerpos, que se harn visibles en el microscopio de fluorescencia gracias al colorante al ser observados En vez de un colorante fluorescente se puede unir al anticuerpo una enzima como laperoxidasa,que se pone de manifiesto mediante ladiaminobenzidina,formndose un precipitado pardo donde hay peroxidasa y, por consiguiente, donde hay anticuerpo.

A veces, una sustancia es tan escasa que apenas se pone de manifiesto con la tcnica inmunohistoqumica descrita. En estos casos puede ampliarse el efecto utilizando lainmunohistoqumica indirecta.

En esta tcnica, anticuerpos de conejo se usan, a su vez, como antgenos al inyectarlos en la cabra. Los anticuerpos de cabra son los que se unen al colorante fluorescente o a la peroxidasa.

52.

De esta manera se consigue que a las molculas de la sustancia en estudio (actina, por ejemplo) se unan molculas del primer anticuerpo (obtenido en el conejo), al cual, a su vez, se unen varias molculas del anticuerpo obtenido en la cabra, que es el visible.

Las tcnicas de inmunocitoqumica son tambin aplicables a la microscopa electrnica con las modificaciones pertinentes.

53. Ag rata + Ac conejo + Ac cabra + colorante fluorescente (o peroxidasa) Ag rata Inyeccin en conejo INMUNOHISTOQUMICAAg conejo-anti Ag rata Ag rata + Ac conejo Ac cabra-anti Ac conejo+ colorante fluorescete o peroxidasaIncubacn con clulas de rataInyeccin en cabraAg rata + Ac conejo + Ac cabra + colorante fluorescente (o peroxidasa) Ag rata Inyeccin en conejo INMUNOHISTOQUMICAAg conejo-anti Ag rata Ag rata + Ac conejo Ac cabra-anti Ac conejo+ colorante fluorescete o peroxidasaIncubacn con clulas de rataInyeccin en cabraAg rata + Ac conejo + Ac cabra + colorante fluorescente (o peroxidasa) Ag rata Inyeccin en conejo INMUNOHISTOQUMICAAg conejo-anti Ag rata Ag rata + Ac conejo Ac cabra-anti Ac conejo+ colorante fluorescete o peroxidasaIncubacn con clulas de rataInyeccin en cabraAg rata + Ac conejo + Ac cabra + colorante fluorescente (o peroxidasa) Ag rata Inyeccin en conejo INMUNOHISTOQUMICAAg conejo-anti Ag rata Ag rata + Ac conejo Ac cabra-anti Ac conejo+ colorante fluorescete o peroxidasaIncubacn con clulas de rataInyeccin en cabraAg rata + Ac conejo + Ac cabra + colorante fluorescente (o peroxidasa) Ag rata Inyeccin en conejo INMUNOHISTOQUMICAAg conejo-anti Ag rata Ag rata + Ac conejo Ac cabra-anti Ac conejo+ colorante fluorescete o peroxidasaIncubacn con clulas de rataInyeccin en cabra 54. V) FRACCIONAMIENTO CELULAR

Es una tcnica bioqumica utilizada para separar los distintos orgnulos y componentes celulares para su estudio bioqumico y al microscopio electrnico.

La tcnica se inicia con lahomogeneizacin. El tejido se tritura en un homogeneizador (mbolo que gira mediante un motor, y que ajusta a la pared de un vaso), de manera que las clulas se comprimen entre el mbolo y el vaso, destruyndose lo suficiente como para que sus orgnulos queden libres, pero no para que stos se rompan. Unos 20 minutos de homogeneizacin bastan para obtener este efecto.

55.

Se somete a la 1centrifugacin,que se realiza a unas 1000 veces la fuerza de la gravedad (1000 G) durante unos 20 minutos.

El resultado es que los ncleos se sedimentan, mientras que los dems orgnulos celulares quedan en el sobrenadante.

Este se somete a la2 centrifugacin(10 000 G durante 20 minutos). El sedimento formado est compuesto por mitocondrias, lisosomas y peroxisomas.

56.

Esquema del procedimiento utilizado en la tcnica de inmunohistoqumica.

El sobrenadante se somete a la 3centrifugacin(105 000 G durante 2 horas). El sedimento consiste en retculo endoplasmtico rugoso y ribosomas libres (la denominadafraccin microsomal).

El sobrenadante consiste en citoplasma fundamental con microtbulos y filamentos, retculo endoplasmtico liso, complejo de Golgi y membrana plasmtica(fraccin citoslica).

Para separar el retculo endopla.smtico de los ribo-somas se resuspende la fraccin microsomal, que se trata con un detergente(desoxicolato),y se centrifuga a 105 000 G durante 20 minutos. En el sedimento quedan los ribosomas y en el sobrenadante las membranas de retculo endoplasmtico.

57.

Del sedimento de la 2 centrifugacin puede resuspenderse en gradiente de sacarosa y en el sobrenadante las mitocondrias. A su vez, las mitocondrias pueden romperse por tumefaccin mantenindolas durante 20 minutos en una solucin de albmina y fosfato 0.2 M, apH7.2.

A continuacin las mitocondrias rotas se centrifugan a 38 000 G durante 20 minutos.

En el sobrenadante queda la matriz mitocondrial, y en el sedimento las membranas mitocondriales.

Se resuspende el sedimento y se centrifuga a 1900 G durante 15 minutos, obtenindose como sedimento la membrana interna, y como sobrenadante la membrana externa.

58.

Tambin, en ultracentrfugas analticas, pueden separarse partculas an ms pequeas, como virus o macromolculas (cidos nucleicos, protenas, etc.).

Mediante ventanas transparentes en el tubo de centrifugacin, y empleando tcnicas pticas y electrnicas, puede observarse el desplazamiento de las partculas y determinarse la velocidad a la que se sedimentan(coeficiente de sedimentacin).

Este coeficiente depende del peso molecular, tamao y forma de la partcula y se expresa en la forma deunidades S (Svedberg).

59. Tratamiento con desoxicolato de sodio al 0.26% y centrifugacin a 105 000 g 20 min. Representacin esquemtica de los sucesivos pasos en el fraccionamiento celular 60. VI) CITOQUMICA E HISTOQUMICA

Las tinciones empleadas comnmente en microscopa ptica nos indican por s mismas acerca de la naturaleza qumica de los componentes de las clulas y tejidos, la tincin de rutina ms comn (la hematoxilina y eosina) utiliza un colorante bsico (hematoxilina) y un colorante cido (eosina).

Las sustancias de naturaleza cida (como los cidos nucleicos) tienen afinidad por la hematoxilina y, en general, por todos los colorantes bsicos, con los que se tien, y por eso estas sustancias se denominan sustancias basfilas.

Por el contrario, las sustancias de naturaleza bsica (la mayor parte del citoplasma) tienen afinidad por la eosina y, en general, por los colorantes cidos, con los que se tien, y por eso se les denomina acidfilas o eosinfilas.

61.

Existen muchos otros colorantes que se emplean usualmente en la histologa convencional. No siempre se utilizan dos colorantes; pueden emplearse tres o ms en las tinciones denominadas tricrmicas, tetracrmicas,

Estos usos combinados de colorantes permiten mayores distinciones entre los diversos tipos celulares y componentes tisulares. Por ejemplo, existen colorantes especialmente indicados para la demostracin de carbohidratos (PAS)DNA (Feulgen) o lpidos (rojo grasa)

62. 63. El camino es arduo, persevera en el estudio y logrars tu formacin profesional... Biocalpi !BIENVENIDOS INGRESANTES 2011! GRACIAS