Modificación de los genomas para su aplicación en ... · SÓLO EN CULTIVOS CELULARES...

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Modificación de los genomas para su aplicación en biotecnología

alimentaria

R. Osta

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Introducción 1/68

Animal transgénico para la Esclerosis Lateral Amiotrófica

Definición4/68

¿ Qué son los organismos modificados genéticamente?¿ Qué son los organismos modificados genéticamente?

Cualquier organismo cuyo material genético ha sido modificado de una manera que no se produce de forma natural en el apareamiento o en la recombinación natural.

(Directiva 90/220/CEE)

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6/68

¿Qué vamos a tratar?.¿Qué vamos a tratar?.

- Modificación genética en organismos unicelulares

-Modificación genética en organismos pluricelulares.

- Aplicaciones de esta metodología y clonación.

Indice

6/68

s

vínicas

mediante

el

uso

de

técnicas

de

DNA

s

vínicas

mediante

el

uso

de

técnicas

de

DNA

Modificación de organismos unicelulares: bacterias y

levaduras.

¿Si vemos un video?

Modificación genética en organimso unicelulares

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DefiniciónIntroducción2/68

Pero ,¿qué necesitaremos

recordar?

Introducción 3/68

Estructura de un gen

PROMOTOR

RNA (cDNA)

IntronesExones

PROTEÍNA

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5/68

Recombinación homóloga

Al azar

TRANSGÉNESISTRANSGÉNESIS

Tipos de transgénesis

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GENOMAGENOMA

GENGEN

TRANSGÉNTRANSGÉN


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GENGEN

Al azarAl azarTRANSGÉNTRANSGÉN

ConcatémerosConcatémeros

Gen crucialGen crucial

Zonas metiladasZonas metiladas


GENGEN

TRANSGÉNTRANSGÉN

Recombinaciónhomóloga

Recombinaciónhomóloga

TRANSGÉNTRANSGÉN


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•Expresión

•Localización de la expresión

•Regulación de la expresión.

•cDNA, DNA genómico.

•Promotor.

•Enhancer, elementos cis y trans.

¿De qué constará el ADN que queremos insertar?¿De qué constará el ADN que queremos insertar?

Transgénesis al azar

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s1-antitripsina humana

s1-antitripsina humana

Promotor-lactoglobulina

bovina


bovina

Transgén simpleTransgén simple


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¿Por qué no lo pones en la pizarra que nos enteraremos

más?


Knock-in:Animal creado mediante recombinación homóloga para que un gen se exprese bajo el promotor que deseemos.

Knock-out: (fuera de combate)Animal creado mediante recombinación homóloga para evitar la expresión de un gen.

Términos utilizadosTérminos utilizados

Transgénesis por recombinación homóloga

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-Zona homólogas al gen de interés.

-Resistencia a antibióticos/mismo gen:- Kanamicina (procariotas)- Neomicina (eucariotas)

¿De qué consta una construcción para la recombinación homológa?

¿De qué consta una construcción para la recombinación homológa?

Knock-out

-Opcional:- Gen marcador- Gen de expresión.

Knock-in


GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO

CONSTRUCCIÓN GENÉTICA


MGen

marcador

R

Resistencia

Recombinación homólogaRecombinación homóloga

Promotor

p DNA


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DNA

MMGen

marcadorGen

marcador

R

ResistenciaResistencia

Promotor

p








DNA

MMGen

marcadorGen

marcador

R

ResistenciaResistencia

Promotor

p


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MODOS DE INTRODUCCIÓN DEL TRANSGEN

MODOS DE INTRODUCCIÓN DEL TRANSGEN

Modos de introducción del transgen

DIRECTAMENTE EN EMBRIÓN.REALIZABLES EN CULTIVOS CELULARESDIRECTAMENTE EN EMBRIÓN.REALIZABLES EN CULTIVOS CELULARES

IN VIVOIN VIVO

IN VITROIN VITROSÓLO EN CULTIVOS CELULARESSÓLO EN CULTIVOS CELULARES


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IN VIVOIN VIVO


•DIRECTOS•DIRECTOS

•INDIRECTOS•INDIRECTOS

- Espermatozoides- Biolística- Microinyección



IN VIVOIN VIVO







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Esponda, P.C.B.I. y C.S.I.CEsponda, P.C.B.I. y C.S.I.C

ESPERMATOZOIDESESPERMATOZOIDES


IN VIVOIN VIVO







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Biolística o método de bombardeo.Biolística o método de bombardeo.


• Partículas de tungsteno u oro • Descarga con helio.

Características:– Capacidad de introducción limitada.

HA SIDO MUY UTILIZADA EN PLANTAS

Biolística o método de bombardeo.Biolística o método de bombardeo.


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IN VIVOIN VIVO







• Microinyección en el pronúcleo masculino.

• Microinyección en el citoplasma del huevo.

Añaden protección al DNA (polilisinas, etc.)

MICROINYECCIÓNMICROINYECCIÓN


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•Transgen

•Cigotos

•Introducir el transgén en el cigoto

•Desarrollar el embrión

•Construcción al azar.

•Animales donadores.

•Micromanipulador.

• Madres receptoras

¿Qué necesitamos para realizar la microinyección?

¿Qué necesitamos para realizar la microinyección?

•Ovulación cíclica y corta (ratón, rata).– Machos y hembras donadoras

– Hembras receptoras y machos vasectomizados

•Otras especies– Tratamientos hormales en las hembras.

– Hembras donadoras y receptoras y machos.

¿Como consigo los cigotos?

¿Como consigo los cigotos?

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MicromanipuladorMicromanipulador




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Pronúcleo masculinoPronúcleo masculino


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En animales domésticos (sobre

todo en la especie porcina)

es necesario centrifugar el huevo

debido al vitelo.


IN VIVOIN VIVO


•INDIRECTOS•INDIRECTOS- Bacterias/Virus- Liposomas- Bacterias/Virus- Liposomas





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IN VIVOIN VIVO







Agrobacteriumtumefaciens con gen de interes

DNA de la planta

Co-cultivo 48 horas22ºC

Formación de callos

Aislamiento de posiblesplantas transformadas

DNA insertadoen el genoma

Pruebas genéticasque permitancontrolar la inserción del gen


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IN VIVOIN VIVO







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• CATIÓNICOS– Su carga positiva reacciona con la negativa

del DNA formando un complejo.

• pH SENSIBLE O ANIÓNICO– Mediante una desestabilización por bajo pH el

DNA entra en “núcleo del liposoma”.

LIPOSOMASLIPOSOMAS


MÉTODOS “IN VITRO”(Cultivos celulares)

MÉTODOS “IN VITRO”(Cultivos celulares)

Las células modificadas genéticamente deberán ser introducidas posteriormente

en el embrión u óvulo


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IN VIVOIN VIVO







IN VIVOIN VIVO

IN VITROIN VITRO






•QUÍMICOS•QUÍMICOS

•FÍSICOS•FÍSICOS

Precipitación con fosfato de calcioPrecipitación con fosfato de calcio

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•Coprecipitación de DNA y calcio (presencia de fosfato).

•Introducción por endocitosis.•Eficiencia de transfección 1% (max. 10%)

Características:- Pequeña expresión del transgén.- Introducción de varias copias.- No hay toxicidad para las células.

FOSFATO DE CALCIOFOSFATO DE CALCIO


IN VIVOIN VIVO

IN VITROIN VITRO






•QUÍMICOS•QUÍMICOS

•FÍSICOS•FÍSICOS

Precipitación con fosfato de calcioPrecipitación con fosfato de calcio

•FÍSICOS•FÍSICOS ElectroporaciónElectroporación

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ELECTROPORACIÓNELECTROPORACIÓN•Introducción del transgén por poros nucleares tras un choque eléctrico.

•Factores de eficacia: naturaleza, distancia entre electrodos, buffer y CÉLULAS.

Características:- Mucha muerte celular- Tendencia a introducir una sola copia. Método de elección para la recombinación homóloga.


¿Cómo consigo un ¿Cómo consigo un animal adulto a partir de células

en cultivo?


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DOS OPCIONESDOS OPCIONES

Células indiferenciadas que sean capaces de colonizar

un embrión y formar parte de su organismo, incluidos los gametos.

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Células transformadas en indiferenciadas:

CLONACIÓN2


Células ES o indiferenciadasCélulas ES o indiferenciadas

SÓLO AISLADAS EN RATÓNSÓLO AISLADAS EN RATÓNModos de introducción del transgen

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NUMEROSOS INTENTOS PERO......NUMEROSOS INTENTOS PERO......

Las células ES no se han aislado en otras especies animales

(Experiencias realizadas en peces)


OTROS CULTIVOS CELULARES:Fibroblastos, Glándula

mamaria, etc.

Clonación de células somáticas


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DOLLYDOLLY


DOLLYDOLLY

G0 :- Baja la transcripción.- Baja la traducción.- Condensación de la cromatina


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PRODUCCIÓN DE: Millie,

Christa, Alexis, Carrel y Dotcom

Polejaeva, I.A. y cols. (2000)Nature, 407, 86-90Polejaeva, I.A. y cols. (2000)Nature, 407, 86-90

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1. Cambio de características de organismos utilizados en la producción de alimentos

2.-Producción de sustancias terapéuticas en- Organismos unicelulares.- Biotecnología de corral.

3.Nuevos alimentos- Cambio cuantitativo- Cambio cualitativo

Aplicaciones

AplicacionesAplicaciones

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Aplicaciones


linalol linasa

Gen LIS

Sintesis de linalol

Asociado a los componente de aroma afrutado y floral

Aplicaciones

Introducción del Gen LIS en levadura viníca

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Aplicaciones


Aplicaciones

Producción de proteínas recombinantes en organismos

unicelulares

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Transformación

Crecimiento secundario

Purificación proteína

Crecimiento a gran escala

Salida al mercado

Biotecnología de corral

- Transgénicos clásicos hasta ahora ya que no existían células indiferenciadas en los animalesque nos interesan.- Producción de proteínas de interés en sanidad.

Ejemplo (ya creado):Tracy

(Roslin Institute - PPL Therapeutics)

Aplicaciones

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TRACYTRACY

s1-antitripsinahumana

s1-antitripsinahumana


ovina


ovina

Aplicaciones

Primeros ensayos en ratón:

4.3 Kb Promotor WAP de ratón

6.6 Kb de AAT-humanocDNA

12.5 gr./litroObtienen microlitros

de leche

Volumen/año gr./año Producción vital8 litros

400 litros10.000 l.

0.04 Kg.2 kg. 50 kg

1 Kg.100 kg. toneladas

ConejaOvejaVaca

Aplicaciones

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Roslin Institute-PPL Therapeutics(lo que sabemos......)

s1-antitripsina

Fibrinógeno

Factor VII y Proteína C

Factor XI

BSSL (lipasa)

Anticuerpos humanizados

Aplicaciones

POLLY: Primer clon transgénicoPOLLY: Primer clon transgénico

Aplicaciones

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Aplicaciones


Producción Animal/Nuevos alimentosModificaciones cuantitativas

- Muchos intentos realizados.- Transgénicos clásicos.

- Animales y plantas usados en alimentación.

Aplicaciones

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Producción Animal/Nuevos alimentos

REINO VEGETAL

Aplicaciones

Aplicaciones

Ejemplo (ya creado):Un Salmón (Aqua Bounty Farms):

- Promotor: AFP (proteína anticongelación)- cDNA: Hormona del crecimiento.

LA REVOLUCIÓN AZUL!!!!

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Producción Animal/Nuevos alimentosModificaciones cualitativas

- Transgénicos clásicos.- Animales y plantas usados en alimentación.

Reino vegetal: la mayoría de los alimentos.Reino animal: Proyectos de creación.

Aplicaciones

Producción Animal/Nuevos alimentosReino vegetal

- Transgénicos clásicos.- Animales y plantas usados en alimentación.

- Tomate Flavr-Savr.- Maíz Bt.

- Tolerancia a los herbicidas 54%- Resistencia a insectos (Bt) 37%- Resistencia vírica 14%- Rasgos cualitativos >1%

Aplicaciones

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- Promotor: 35 S virus mosaico de coliflor.- RNA antisentido de la enzima poligalacturonasa (actuá sobre la pectina)

- Tomate Flavr-Savr: Primer producto transgénico comercializado en el mundo (Mayo de 1994). Maduración retardada.

Aplicaciones


Maíz que expresa la toxina del Bacillus thuringiensis se une a los receptores del tubo digestivo del insecto (taladro).

- Maíz Bt:Muchisima presion social.

Aplicaciones

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¿Qué es un alimento transgénico?

-Productos vegetales: tomate "Flavr Svr”, Maiz Bt...- Productos de animales transgénicos:salmones, leche sin determinadas proteínas, etc.

- Alimentos que en su preparación se utilizan sustancias modificadas genéticamente (cuajo recombinante)- Animales tratados con proteínas recombinantes...- Animales alimentados con alimentos transgénicos

Aplicaciones

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