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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

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Tesis Doctoral

Modulación de las propiedadesModulación de las propiedadesópticas de nanocristalesópticas de nanocristales

semiconductores (Quantum Dots)semiconductores (Quantum Dots)por modificación superficial :por modificación superficial :

AplicacionesAplicaciones

Menéndez, Guillermo Oscar

2012

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Menéndez, Guillermo Oscar. (2012). Modulación de las propiedades ópticas de nanocristalessemiconductores (Quantum Dots) por modificación superficial : Aplicaciones. Facultad deCiencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

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Menéndez, Guillermo Oscar. "Modulación de las propiedades ópticas de nanocristalessemiconductores (Quantum Dots) por modificación superficial : Aplicaciones". Facultad deCiencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2012.

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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Química Orgánica

Modulación de las propiedades ópticas de nanocristales

semiconductores (Quantum Dots) por modificación

superficial. Aplicaciones.

Tesis presentada para optar al título de

Doctor de la Universidad de Buenos Aires Área Química Orgánica

Guillermo Oscar Menéndez

Directora de Tesis Dra. Elizabeth A. Jares-Erijman

Directora Asistente

Dra. Carla C. Spagnuolo

Consejera de Estudios

Dra. Elizabeth A. Jares-Erijman

Buenos Aires, Noviembre de 2012

A la Dra. Elizabeth Jares, quien durante estos años fue una guía y un apoyo in‐

condicional, me alentó en los momentos difíciles, me brindó libertad y confianza. Por transmitirme su pasión, su optimis‐mo, su tesón, su experiencia y su afecto.

A mi mamá, quien me enseñó que uno disfru‐ta de sus logros si ha trabajado duro para

conseguirlos: aquí están.

A mis hermanos Carlos y Claudia, porque siempre cuento con ellos.

A Eve, por hacerme feliz, por transmitirme su alegría, por ser mi apoyo, por estar a mi lado.

AGRADECIMIENTOS

Deseo expresar mi agradecimiento a todos aquellos que han hecho posible la

realización de este trabajo.

A Eli, por haberme dado la oportunidad de trabajar en su laboratorio y recibir‐

me en su grupo, por su permanente apoyo, estímulo, generosidad y optimismo, por

darme la libertad de trabajar convencido de lo que hacía, sin imposiciones. También

quisiera agradecerle su incansable búsqueda de oportunidades para nosotros, por ge‐

nerar y mantener un grupo de trabajo agradable, donde siempre predominó la solida‐

ridad y el compañerismo. Me faltan las palabras… pero no el sentimiento.

A Carla, porque sin su ayuda y consejos esta tesis sería muy diferente, por ser mi

apoyo cuando las circunstancias así lo requirieron, por permitirme compartir con ella

mis inquietudes, éxitos y fracasos.

A Luciana, mi primera mentora en el grupo, por ayudarme y aconsejarme en

forma desinteresada en mis comienzos dentro de la síntesis orgánica.

A los que comparten o compartieron el laboratorio, Mimi, Jony, Sebas, Ceci, Eva,

Julito, Doris, Sandra, Jime, Lu Barcos, Tincho, Fran, Fede F., Fede C., Yani, Amparo, Juli‐

ta, Flori, Marce, Pau y Lu Ortiz, porque siempre fuimos un equipo que fue para delante

pese a las circunstancias que nos tocaron, porque hicieron del laboratorio algo ameno y

divertido, que también se extendió fuera de la Facultad.

Especialmente quisiera agradecerle a Fran, por toda su ayuda con el FLIM, por

trabajar codo a codo para hacerle frente a ese gran desafío, que finalmente consegui‐

mos superar. También a Tincho por su ayuda con las células “caprichosas”, y a Doris

por confiar en mí y conseguir lo que fuese necesario pasa seguir adelante.

Mi profundo agradecimiento a Tom Jovin, por su generosidad, sus valiosas críti‐

cas y enriquecedoras discusiones científicas, por mostrarme que existe una solución

para cada problema. Quisiera agradecerle por recibirme en su grupo y permitirme rea‐

lizar dos estadías en el Instituto Max Planck de Biofísica Química de Göttingen. Tam‐

AGRADECIMIENTOS

bién quisiera agradecer a quienes hicieron posible que mi estadía allá fuera agradable

y productiva, Donna, Vale Sigot, Michellis, Sole Galli, Sole Celej, Anthony, Achim y Re‐

nate.

Al Consejo de Investigaciones Científicas y Técnicas por otorgarme las becas que

me permitieron llevar a cabo esta tesis.

Al Departamento de Química Orgánica de la FCEyN‐UBA, por brindarme el es‐

pacio para mi desarrollo como investigador y docente. Especialmente quisiera agrade‐

cerle a Dr. Oscar Varela, por su apoyo y ayuda desinteresada cuando fue necesario.

A todos mis compañeros del Departamento de Química Orgánica, docentes y no

docentes, por su colaboración y ayuda.

Al Departamento de Química Orgánica de la Facultad de Química de la Univer‐

sidad de Göttingen por los espectros de resonancia magnética nuclear y de masa.

Al Dr. Roberto Salvarezza, su grupo de INIFTA‐CONICET, y en particular a Emili‐

ano Cortés, por su ayuda en la caracterización de superficies. A la Dra. Lucila Méndez

de Leo, INQUIMAE‐CONICET, por los espectros FT‐IR y PM‐IRRAS. Al Dr. Federico Wi‐

lliams, INQUIMAE‐CONICET, por los espectros de XPS.

A mis amigos de la carrera que, por algo, quedaron. A Germán, Guto, Nico y

Jony, por las noches del triángulo y demás, porque en la vida no todo es trabajo. A

Melu, por ser una gran amiga y permitirme saber que puedo contar con vos. A Vero,

Bren y Eva con quienes compartimos cursos, congresos y las laaargas charlas de pasillo

que acompañaron esta tesis, por compartir las frustraciones y alegrías diarias y por ser

muy buenas amigas.

A mis amigos de la vida, Diego, Guille, Tinchín, Jero y Vinz, por bancarme aun

cuando sé que los descuido. Porque no es necesario que hablemos todos los días, pero

nos tenemos presentes.

A todos los Bonifazi, por recibirme y hacerme parte de su familia.

AGRADECIMIENTOS

A mis hermanos, Claudia y Carlos, porque están cuando hacen falta. A mis cu‐

ñados, Christian y Daiana, a mis tíos y tías, a mis primos y primas.

A mi mamá, Ligia, porque sin ella nada de esto hubiese sido. Porque dejó todo

por nosotros y, aún hoy, nos sigue ayudando. Por salir adelante a pesar de todo, por

sus valores y enseñanzas. Porque si hoy soy lo que soy es porque ella fue quien fue. A

mi papá, Horacio, que siempre está presente.

A Eve, por ser mi compañera. Por contenerme, entenderme, apoyarme y respe‐

tarme. Por sacar una sonrisa en todo momento, aun en “esos” momentos. Por lo vivido,

pero mucho más por lo que vendrá, porque lo mejor está por llegar.

RESUMEN

MODULACIÓN DE LAS PROPIEDADES ÓPTICAS DE NANOCRISTALES SEMICONDUCTORES

(QUANTUM DOTS) POR MODIFICACIÓN SUPERFICIAL. APLICACIONES.

El objetivo de esta tesis es el desarrollo de nanoherramientas basadas en nano‐

partículas semiconductoras luminiscentes (Quantum Dots, QDs) mediante su modifica‐

ción superficial. Esto incluye la creación de elementos de control de las propiedades

ópticas de las nanopartículas así como también el diseño de métodos de unión especí‐

fica a biomoléculas e internalización en células.

Con este fin, se sintetizaron una serie de tricarbocianinas simétricas y asimétri‐

cas como sensores fluorescentes de Zn(II) y pH, ópticamente activos en la zona del

infrarrojo cercano (Near Infrared Region, NIR) del espectro de radiación. Se trabajó en

esta zona del espectro debido a las múltiples ventajas para su aplicación en biomedici‐

na, microscopía de fluorescencia o química de materiales, ya que ofrece mínima inter‐

ferencia de absorción y fluorescencia con muestras biológicas y una alta penetración

en tejidos, entre otras. Asimismo, los fluoróforos obtenidos fueron conjugados con

diferentes plataformas, entre las que se incluyen el uso de monocapas autoensambla‐

das, dendrímeros y nanopartículas fluorescentes (Quantum Dots) y de oro. Se describe

la síntesis, caracterización estructural, propiedades ópticas y funcionamiento de los

sensores en solución y en dichos sistemas supramoleculares.

Finalmente, se diseñaron y desarrollaron sensores de pH fluorescentes basados

en Quantum Dots conjugados con fluoróforos, uno de los cuales fue utilizado en mi‐

croscopía confocal y de tiempo de vida media de fluorescencia para la marcación espe‐

cífica en células con el fin de estudiar procesos celulares in‐vivo. Este sistema se pre‐

senta como un prototipo de sensado celular basado en determinaciones resueltas en

el tiempo.

Palabras Claves: Nanosensores, FRET, tricarbocianinas, Quantum Dots, FLIM.

ABSTRACT

MODULATION OF THE OPTICAL PROPERTIES OF SEMICONDUCTOR NANOCRYSTALS

(QUANTUM DOTS) BY SURFACE MODIFICATION. APPLICATIONS.

The aim of this thesis is the development of nanotools based on luminescent

semiconductor nanoparticles (Quantum Dots, QDs) by means of its surface modifica‐

tion. This approach includes the development of control elements of the optical prop‐

erties of the nanoparticles, besides the design of methods for specific recognition of

biomolecules and cell internalization.

Several symmetric and asymmetric tricarbocyanines dyes were synthesized as

fluorescent sensors for Zn(II) and pH, which are active in the near infrared (NIR) region

of the electromagnetic spectrum. Emissive dyes in this region of the radiation spec‐

trum have multiple advantages regarding their application in biomedicine, fluores‐

cence microscopy and chemistry of materials. In the NIR region, the radiation is rela‐

tively poorly absorbed by biomolecules and can penetrate deeply into tissues. Moreo‐

ver, there is also less cellular autofluorescence in this region. In addition, the dyes syn‐

thesized were conjugated to different platforms, such as self‐assembled monolayers,

dendrimers, Quantum Dots and gold nanoparticles. The synthesis, structural character‐

ization, optical properties and performance of fluorescent sensors both in solution and

in such supramolecular systems is described.

A novel pH fluorescent sensor based on a pH‐sensitive dye conjugated to Quan‐

tum Dots was developed. The nanoprobe was used to study the cellular processes in

vivo by means of confocal and fluorescence lifetime imaging microscopy. The fluoro‐

phore‐QD conjugate nanosensor is a prototype of a series of lifetime‐based cellular

sensors.

Keywords: Nanosensors, FRET, tricarbocyanine, Quantum Dots, FLIM.

ABREVIATURAS

Reactivos y solventes

AcOEt acetato de etilo

AcCN acetonitirilo

Biotina ácido 5‐[(3aS,4S,6aR)‐2‐oxohexahidro‐1H‐tieno[3,4‐d]imidazol‐4‐ il] pentanoico

Boc2O di‐tert‐butildicarbonato

DCC N,N’‐diciclohexilcarbodiimida

DMF dimetilformamida

DMSO dimetilsulfóxido

DPEN N,N’‐(dipicolil)etilendiamina

EDTA ácido dietilenaminotetraacético

EtOH etanol

Et3N trietilamina

Fmoc 9‐fluorenilmetoxicarbonilo

HAcO ácido acético

Hepes ácido 4‐(2,hidroxietil)‐1‐piperazinetansulfónico

HT hexanotiol

NHS N‐hidroxisuccinimida

PEG polietilenglicol

PBS buffer fosfato salino

THF tetrahidrofurano

TFA ácido trifluoroacético

ABREVIATURAS

Otras

ACP proteína transportadora de acilo

AuNP nanopartícula de oro

BSA albúmina de suero bovino

CCD cromatografía en capa delgada

CoA coenzima A

DMEM medio de Eagle modificado por Dubelcco

EMAR microscopía de masa de alta resolución

EGF factor de crecimiento epidérmico

ESI ionización por electrospray

FLIM microscopía de tiempos de vida media de fluorescencia

FRET transferencia de energía por resonancia de Förster

FT‐IR espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier

ns nanosegundo

PM‐IRRAS espectroscopía infrarroja de reflexión‐absorción con modulación de la polarización

SAv estreptavidina

SAM monocapa autoensamblada

SERS espectroscoía Raman aumentada por superficie

STM microscopía de efecto túnel

TCSPC conteo de fotones individuales correlacionados en el tiempo

XPS espectroscopía fotoelectrónica de rayos X

VC voltametría cíclica

ÍNDICE

INTRODUCCIÓN

1. SENSORES FLUORESCENTES ............................................................................................. 1

2. NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES ................................................................................ 10

3. SENSORES BASADOS EN NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES ................................................. 15

4. TRANSFERENCIA DE ENERGÍA POR RESONANCIA DE FÖRSTER ................................................ 17

5. MODIFICACIÓN SUPERFICIAL DE NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES ...................................... 22

6. OBJETIVO GENERAL Y ESPECÍFICOS .................................................................................. 25

7. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 29

CAPÍTULO 1. SÍNTESIS DE CLOROTRICARBOCIANINAS PRECURSORAS.

1.1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 31

1.2. FOTOFÍSICA Y PROPIEDADES ESPECTROSCÓPICAS ................................................................ 34

1.3. RUTAS SINTÉTICAS UTILIZADAS PARA LA OBTENCIÓN DE TRICARBOCIANINAS ............................ 38

1.3.1. SÍNTESIS DE LOS PRECURSORES .................................................................................. 38

1.3.2. SÍNTESIS DE TRICARBOCIANINAS SIMÉTRICAS ................................................................ 42

1.4. SÍNTESIS DE TRICARBOCIANINAS ASIMÉTRICAS ................................................................... 47

1.5. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 52

1.6. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 53

CAPÍTULO 2. SENSORES MOLECULARES DERIVADOS DE AMINOTRICARBOCIANINAS.

2.1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 55

2.2. SÍNTESIS DE SONDAS FLUORESCENTES DERIVADAS DE TRICARBOCIANINAS ............................... 57

2.3. PROPIEDADES ESPECTROSCÓPICAS DE DERIVADOS N‐SUSTITUIDOS ........................................ 58

2.4. TRICARBOCIANINAS COMO MARCADORES ESPECÍFICOS........................................................ 64

2.5. TRICARBOCIANINAS COMO SENSORES DE PH ..................................................................... 71

2.6. TRICARBOCIANINAS COMO SENSORES DE ZN(II) ................................................................ 76

ÍNDICE

2.7. CONCLUSIONES ........................................................................................................... 81

2.8. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................. 83

CAPÍTULO 3. NANOSENSORES DERIVADOS DE AMINOTRICARBOCIANINAS.

3.1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 85

3.2. MODULACIÓN DE LAS PROPIEDADES ÓPTICAS DE QUANTUM DOTS ........................................ 90

3.3. NANOSENSORES DE PH DERIVADOS DE TRICARBOCIANINAS .................................................. 98

3.4. SENSORES DE PH DERIVADOS DE DENDRÍMEROS .............................................................. 110

3.5. SENSORES DE ZN(II) DERIVADOS DE QUANTUM DOTS ...................................................... 113

3.6. CONCLUSIONES ......................................................................................................... 121

3.7. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 122

CAPÍTULO 4. TRICARBOCIANINAS CONFINADAS SOBRE SUPERFICIES.

4.1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 125

4.2. INMOVILIZACIÓN DE CIANINAS SOBRE SUPERFICIES ........................................................... 128

4.3. CARACTERIZACIÓN INICIAL DE LOS ENSAMBLADOS ............................................................ 131

4.4. NATURALEZA DE LA INTERACCIÓN CON LA SUPERFICIE ....................................................... 133

4.5. INTEGRIDAD QUÍMICA DE LA TRICARBOCIANINA EN EL ENSAMBLADO .................................... 134

4.6. DETERMINACIÓN DE LA COBERTURA SUPERFICIAL SOBRE EL SUSTRATO DE ORO ....................... 136

4.7. ENSAMBLADOS DE TRICARBOCIANINAS SOBRE NANOPARTÍCULAS DE ORO .............................. 141

4.8. CONCLUSIONES ......................................................................................................... 146

4.9. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 148

CAPÍTULO 5. NANOSENSORES APLICADOS A SISTEMAS IN VIVO.

5.1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 151

ÍNDICE

5.2. DISEÑO Y CARACTERIZACIÓN DEL SENSOR DE PH .............................................................. 156

5.2.1. SÍNTESIS DEL SENSOR DE PH FLUORESCENTE BIOTINILADO ............................................. 156

5.2.2. MODULACIÓN DE LAS PROPIEDADES ÓPTICAS DE NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES .......... 158

5.3. FOTOFÍSICA DEL NANOSENSOR DE PH FLUORESCENTE ....................................................... 166

5.4. CALIBRADO DEL SENSOR DE PH FLUORESCENTE ............................................................... 174

5.5. DETERMINACIONES EN SISTEMAS IN VIVO ....................................................................... 177

5.6. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 184

5.7. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 186

CAPÍTULO 6. MATERIALES Y MÉTODOS.

6.1. GENERALIDADES ....................................................................................................... 189

6.2. ESPECTROSCOPÍAS DE ABSORCIÓN Y FLUORESCENCIA ........................................................ 210

6.3. MICROSCOPÍAS DE FLUORESCENCIA .............................................................................. 212

6.4. CULTIVO CELULAR Y CRIO‐PRESERVACIÓN ....................................................................... 213

6.5. PREPARACIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE ORO .................................................................. 214

6.6. CARACTERIZACIÓN DE SUPERFICIES ............................................................................... 215

6.7. CÁLCULOS TEÓRICOS ................................................................................................. 218

6.8. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 219

CAPÍTULO 7. TÉCNICAS INSTRUMENTALES.

7.1. ESPECTROSCOPÍAS DE FLUORESCENCIA RESUELTA EN EL TIEMPO .......................................... 221

7.1.1. DETERMINACIONES DE TIEMPOS DE VIDA EN EL DOMINIO DEL TIEMPO ............................. 221

7.1.2. DETERMINACIONES DE TIEMPOS DE VIDA EN EL DOMINIO DE LAS FRECUENCIAS ................. 225

7.1.3. MICROSCOPÍA DE TIEMPOS DE VIDA MEDIA DE FLUORESCENCIA ..................................... 228

7.1.4. ANÁLISIS DE FASORES EN MICROSCOPÍAS DE TIEMPOS DE VIDA MEDIA DE FLUORESCENCIA ... 231

ÍNDICE

7.1.5. MICROSCOPÍA RÁPIDA DE TIEMPOS DE VIDA MEDIA DE FLUORESCENCIA ........................... 236

7.2. TÉCNICAS DE CARACTERIZACIÓN DE SUPERFICIES .............................................................. 239

7.2.1. MICROSCOPÍA DE EFECTO TÚNEL ............................................................................. 239

7.2.2. ESPECTROSCOPÍA FOTOELECTRÓNICA DE RAYOS X ....................................................... 243

7.2.3. ESPECTROSCOPÍA INFRARROJA DE REFLEXIÓN‐ABSORCIÓN CON MODULACION DE LA POLARIZA‐

CIÓN ................................................................................................................ 248

7.2.4. VOLTAMETRÍA CÍCLICA ........................................................................................... 254

7.2.5. ESPECTROSCOPÍAS DE DISPERSIÓN RAMAN ................................................................ 260

7.3. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 263

CONCLUSIONES GENERALES ............................................................................................ 265

INTRODUCCIÓN

SENSORES FLUORESCENTES

1

1. SENSORES FLUORESCENTES

La fluorescencia es un tipo de fotoluminiscencia en donde una especie emite luz

desde el primer estado electrónicamente excitado (S1), el cual puede ser generado por

métodos físicos o químicos. Existe una extensa variedad de materiales luminiscentes,

entre los que se cuentan minerales, moléculas orgánicas, complejos con metales de

transición o nanopartículas de metales nobles o de semiconductores. Entre ellos, las

moléculas fluorescentes (también denominadas fluoróforos, fluorocromos o sondas

fluorescentes) siguen siendo las de mayor importancia; entre sus ventajas se cuentan

su alta disponibilidad, bajo precio y versatilidad. Las familias de compuestos fluores‐

centes son tan variadas que fácilmente se puede satisfacer una necesidad específica en

términos de propiedades espectroscópicas y reactividad química.

Cuando una molécula es excitada mediante la absorción de un fotón, ésta pue‐

de retornar al estado basal mediante la emisión de energía (fluorescencia) o por mu‐

chos otros caminos de relajación (Figura 1).

Hay cinco parámetros fotofísicos fundamentales entre las propiedades ópticas

de una molécula fluorescente que brindan información con fines prácticos: la intensi‐

Figura 1. Posibles rutas de relajación de moléculas excitadas.

INTRODUCCIÓN

2

dad de fluorescencia, la longitud de onda de excitación y de emisión, el tiempo de vida

media de fluorescencia y la polarización de la emisión fluorescente.

La intensidad de fluorescencia depende del coeficiente de extinción molar del

fluoróforo, ε, y del rendimiento cuántico de fluorescencia, φFl, el cual se define

como la relación entre los fotones emitidos respecto a los fotones absorbidos

por la muestra, ecuación [1].

donde kr y knr se refieren a los procesos de relajación radiativos y no radiativos,

respectivamente.

Los espectros de absorción y emisión, caracterizados por las longitudes de onda

de máxima excitación y emisión, λExc y λEm, respectivamente, dependen de la

estructura química del fluoróforo. La diferencia entre ambos parámetros se de‐

nomina corrimiento de Stokes.

El tiempo de vida media de fluorescencia, τFl, es el tiempo promedio que la mo‐

lécula pasa en el estado excitado antes de emitir un fotón. Se expresa como:

donde kr y knr se refieren a los procesos de relajación radiativos y no radiativos,

respectivamente. El tiempo de vida media de fluorescencia es una de las carac‐

terísticas más importantes de una molécula fluorescente ya que define la ven‐

tana experimental de observación de un fenómeno dinámico.

La polarización de la emisión se describe en términos de la anisotropía, r, la cual

se define según la ecuación [3].

Fl

r nr

1

k k[2]

[3] I I

rI 2I

[1] rFl

r nr

n fotonesemitidos k

n fotonesabsorbidos k k

n° fotones emitidos

n° fotones absorbidos


3

donde I e I// representan a las intensidades de emisión perpendicular y para‐

lela a la dirección de polarización de la radiación de excitación linealmente po‐

larizada, respectivamente. La misma se origina en la existencia de momentos

de transición para la absorción y emisión, que tienen direcciones específicas en

la estructura de la molécula. Las mediciones de anisotropía revelan el despla‐

zamiento angular del fluoróforo que ocurre entre la absorción y la emisión.

Estos parámetros que caracterizan la fluorescencia de una molécula determi‐

nada son afectados por cualquier proceso que involucre interacciones de la molécula

en el estado excitado con su ambiente cercano y, por lo tanto, pueden proveer infor‐

mación del microentorno molecular. El éxito de la fluorescencia como herramienta en

el estudio de la estructura y la dinámica de sistemas in vivo reside en la gran sensibili‐

dad de las técnicas basadas en este fenómeno y la íntima relación de sus parámetros

característicos con el microentorno de la molécula emisiva, permitiendo la extracción

de información espacial y temporal. Entre las variables que caracterizan el microen‐

torno del fluoróforo se pueden contar la polaridad del solvente, formación de enlaces

de hidrógeno, pH, viscosidad, temperatura, potencial eléctrico y/o la concentración de

iones, entre otros.

El diseño de sensores fluorescentes es de suma importancia debido a la gran

demanda en química analítica, bioquímica clínica, medicina, química ambiental, biolo‐

gía molecular, etc. Numerosos analitos pueden ser detectados mediante técnicas fluo‐

rescentes: cationes (H+, Li+, Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Zn2+,Pb2+,Al3+,Cd2+,etc), aniones (iones

haluros, citratos, carboxilatos, fosfatos, ATP, etc), moléculas neutras (azúcares, p. ej.

glucosa) o gases (O2, CO2, NO, etc). Actualmente existe una gran variedad de sensores

moleculares fluorescentes para aplicaciones particulares y muchos de ellos están dis‐

ponibles comercialmente. Sin embargo, es continua la necesidad de desarrollar senso‐

res que mejoren la selectividad y minimicen la perturbación del microentorno estudia‐

do. La gran relevancia que han cobrado los sensores fluorescentes puede ser explicada

a través de las múltiples ventajas que presentan en términos de su versatilidad, dispo‐

INTRODUCCIÓN

4

nibilidad, sensibilidad, selectividad, tiempo de respuesta, observación localizada (p. ej.

mediante microscopías de fluorescencia), etc. Más aún, los extensos avances logrados

en la mejora de la resolución espacial y temporal en el equipamiento también repre‐

sentan factores importantes que explican dicho éxito. La Figura 2 muestra la progre‐

sión del número de publicaciones por año en revistas científicas utilizando “sensor

fluorescente” como palabra clave con el motor de búsqueda SciFinder al 21 de mayo

de 2012, donde es posible observar el creciente interés en la tecnología fluorescente

para la detección y cuantificación de analitos mediante el uso sensores fluorescentes.

Todas las tecnologías de sensado se rigen por un principio común: “Sin interac‐

ción, no hay información”. En cada interacción, pueden distinguirse al menos dos espe‐

cies: una de ellas es, por supuesto, el objeto que quiere detectarse, comúnmente lla‐

mado analito. Puede ser una especie de cualquier tamaño y complejidad, desde proto‐

nes, moléculas pequeñas o iones hasta grandes partículas o células. La otra especie,

diseñada para la detección del analito, es el sensor. Éste tiene dos funciones, la prime‐

ra consiste en la interacción con el analito en una forma lo más selectiva posible, reco‐

nociéndolo frente a otras especies de estructura y propiedades similares que pueden

estar presentes en el sistema estudiado. La estructura responsable de esto se denomi‐

1960

1965

1970

1975

1980

1985

1990

1995

2000

2005

2010

0

1000

2000

Nº d

e pu

blic

acio

nes

Año

Figura 2. Número de publicaciones por año en revistas científicas utilizando “sensor fluorescente” como palabra clave a mayo de 2012. Base de datos: Sci Finder.


5

na unidad de reconocimiento o receptor. La otra función es la de “visualizar” la interac‐

ción, reportarla y proveer una señal que puede ser analizada. La estructura responsa‐

ble de la generación de dicha señal se denomina como reportero. En el caso de senso‐

res fluorescentes, este último corresponde al fluoróforo, el cual se convierte en un

transductor que convierte la información (presencia del analito) en una señal óptica

expresada como el cambio en alguna de las características fotofísicas (゜Exc, 0Máx, ゜Em,

φFl, τFl, etc) del fluoróforo.

Los sensores fluorescentes pueden ser clasificados en tres tipos (Figura 3):

Clase 1: fluoróforos que sufren de apagamiento (quenching) luego de colisionar

con el analito (p. ej. I‐, Cl‐, O2).

Clase 2: fluoróforos que se unen reversiblemente al analito. Si el analito es un

H+, se utiliza frecuentemente el término indicador de pH fluorescente. Si el ana‐

lito es un ion, es apropiado hablar de un agente quelante fluorescente.

Clase 3: fluoróforos unidos, vía un espaciador o no, a un receptor. El diseño de

estos sensores requiere un cuidado especial para satisfacer los criterios de afi‐

nidad y selectividad, aspectos relevantes del campo de la Química Supramole‐

cular. Los cambios en las propiedades fotofísicas del fluoróforo luego de su in‐

teracción con el analito se estudian en el campo de la Fotofísica. En el caso de

reconocimiento de iones, el receptor es llamado ionóforo, mientras que el sen‐

sor molecular es llamado fluoroionóforo.

En los casos 2 y 3, la interacción del analito con el sensor puede conllevar una

disminución de la fluorescencia (Disminución de la Fluorescencia por Complejación,

DFC) o un aumento de la misma (Aumento de la Fluorescencia por Complejación, AFC).

Además, en estos casos, donde el sensado fluorescente está acompañado de la com‐

plejación del analito se establece el equilibrio químico definido en la ecuación [4].

[4] LFl Fl L

INTRODUCCIÓN

6

Y se define la constante de disociación del complejo analito‐sensor para dicho

equilibrio según la ecuación [5].

El valor de la constante de disociación del complejo debe encontrarse en el

rango de concentraciones de analito esperado para la muestra, la cual puede variar

ampliamente dependiendo del campo de aplicación. En la Tabla 1 se presentan los

rangos típicos de constantes de disociación utilizados en sensado molecular, junto con

ejemplos característicos de cada tipo de interacción.

Figura 3. Clases principales de sensores fluorescentes para iones o moléculas pequeñas.

[L][Fl]Kd

[LFl] [5]


7

Tabla 1. Ejemplos de diferentes tipos de constantes de disociación. Tipo de interacción Kd(M‐1) Ejemplos

Débil >10‐5 Interacciones de detergentes en micelas acuosas

Media 10‐5‐10‐7 Interacciones enzima‐sustrato y enzima‐inhibidor comunes

Fuerte 10‐7‐10‐10 Interacciones de drogas sintéticas utilizadas en química medicinal con sus objetivos

Muy fuerte <10‐10 Interacciones de anticuerpos con antígenos

altamente específicos. Interacción de biotina con avidina (10‐15)

Los fluoróforos orgánicos ofrecen una inmensa variedad de propiedades quími‐

cas, fotoquímicas y espectroscópicas. Por ello, al momento de elegir un compuesto

fluorescente para su aplicación en el marcado de biomoléculas o el sensado de analitos

de interés es necesario establecer un criterio de selección práctico. Entre los paráme‐

tros deseables que caracterizan un fluoróforo para su aplicación se pueden contar:

Coeficiente de extinción molar y rendimiento cuántico de fluorescencia. Estos paráme‐

tros son los que contribuyen en mayor medida al “brillo” del fluoróforo, que deter‐

mina la sensibilidad de la detección fluorescente. El coeficiente de extinción molar

para fluoróforos orgánicos debería estar en el orden de 103‐105 mol‐1cm‐1, valores

menores no resultan productivos, mientras que valores mayores son difíciles de al‐

canzar. El rendimiento cuántico de fluorescencia puede variar entre valores muy ba‐

jos a casi 100% , es deseable que sea tan alto como sea posible.

Longitud de onda de excitación y longitud de onda de emisión. Para lograr el mayor

brillo posible, el fluoróforo debe excitarse a una longitud de onda cercana al máximo

de absorción. Para estudios en células in vivo es deseable que la longitud de onda de

excitación sean mayores a 400‐460 nm. En este sentido el uso de fluoróforos con un

máximo de absorción en la zona del infrarrojo cercano (Near Infrared region, región

NIR) del espectro de radiación (800‐1000 nm) resulta óptimo. Es necesario tener en

cuenta el rango operacional de longitudes de onda del detector al momento de se‐

INTRODUCCIÓN

8

leccionar la longitud de onda del máximo de emisión del fluoróforo, en particular pa‐

ra la detección de radiación en la zona NIR del espectro.

Corrimiento de Stokes. Un valor alto en esta propiedad es deseable, pero no estric‐

tamente necesaria. De hecho, muchos de los fluoróforos no cumplen con esta carac‐

terística. Sin embargo, un gran corrimiento de Stokes permite disminuir los efectos

de dispersión de luz y facilita la separación de la radiación de excitación y emisión.

Fotoestabilidad. Los fluoróforos orgánicos pueden ser degradados luego de un núme‐

ro de ciclos de excitación‐emisión. La degradación tiene lugar debido a reacciones fo‐

toquímicas que muchas veces involucran oxígeno molecular y están acoplados a la

producción de oxígeno singulete. En tecnologías donde no sea un requerimiento la

exposición intensa a luz de excitación, una baja fotoestabilidad puede no acarrear

problemas. Sin embargo, en técnicas como microscopía de fluorescencia o en estu‐

dios de moléculas individuales resulta de suma importancia contar con fluoróforos

con una alta fotoestabilidad.

A la actualidad, se han desarrollado una gran cantidad de clases de fluoróforos

que pueden ser utilizados como sensores fluorescentes, de los cuales se discutirán los

considerados “fluoróforos clásicos” junto con los desarrollos más importantes obteni‐

dos para cada uno de ellos.

Fluoresceínas: La Figura 4.a presenta la estructura de la fluoresceína y sus espectros

de absorción y emisión. Estos fluoróforos son ampliamente utilizados para el marca‐

do de biomoléculas. Poseen una absorbancia relativamente alta, un rendimiento

cuántico de fluorescencia alto (incluso en agua) y una solubilidad en agua elevada. Su

máximo de absorción su encuentra muy cercano a la línea espectral 488 nm del ex‐

tensamente utilizado laser de ion argón. Son muy empleados en aplicaciones de mi‐

croscopías de fluorescencia y citometría de flujo. Sin embargo, poseen una baja foto‐

estabilidad, además la intensidad de fluorescencia es fuertemente sensible al pH del

medio y son objeto de apagamiento por alta concentración. Los fluoróforos de la fa‐


9

milia del Oregon Green son análogos fluorados de la fluoresceína, que son menos

sensibles al pH del medio.

Rodaminas: En la Figura 4.b se muestran la estructura química de la rodamina 123 y

los espectros de absorción y emisión en metanol. Al igual que las fluoresceínas son

muy utilizadas para el marcado de biomoléculas. Su máximo de excitación se encuen‐

tran alrededor de los 520 nm, cercano a la línea espectral de 514 nm del laser de ion

argón. Los miembros de esta familia son fluoróforos catiónicos, permeables en célu‐

las y con una buena solubilidad en agua. Debido al pequeño corrimiento de Stokes

que presentan, estos fluoróforos también sufren de apagamiento por concentración.

Se han desarrollado un gran número de análogos que poseen pequeñas modificacio‐

nes estructurales, siendo los más conocidos y utilizados la rodamina B, rodamina 6G,

Rodamina 101, TAMRA, entre otros.

Cianinas: Estos fluoróforos pertenecen a una clase de compuestos orgánicos que son

muy utilizados en fotografía y tecnologías laser, los cuales serán estudiados con más

detalle en el Capítulo 2 de esta tesis. Se ha generado un gran interés en esta familia

de fluoróforos debido a sus excelentes propiedades, como ser alta fotoestabilidad,

buena solubilidad en agua y un alto rendimiento cuántico de fluorescencia. Una des‐

ventaja común es que muchos de ellos presentan un corrimiento de Stokes pequeño

y una vida media de fluorescencia corta (normalmente menos de 1 ns). Sus espectros

de absorción cubren una región amplia de longitudes de onda, extendiéndose hacia

400 450 500 550 600 650 7000.0

0.5

1.0

Longitud de onda (nm )400 450 500 550 600 650

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Longitud de onda (nm )

Figura 4. Estructura química y espectros normalizados de absorción y emisión de fluoresceína (a) y rodamina 123 (b).

a. b.

INTRODUCCIÓN

10

el rojo y la zona de infrarrojo cercano. Los integrantes más ampliamente conocidos y

utilizados de esta familia de fluoróforos son los Cy3, Cy5 y Cy7, Figura 5.

Otras familias de fluoróforos ampliamente utilizada son los “Alexa dyes”, que se

obtienen por modificación química de diferentes tipos de compuestos fluorescentes

como ser carbocianinas, rodaminas o aminocumarinas. Los rangos de emisión y excita‐

ción de estos fluoróforos cubren el espectro de radiación entero, yendo desde el ultra‐

violeta hacia el rojo, siendo menos sensibles al apagamiento por concentración y con

estabilidad mejorada respecto al compuesto de origen.

2. NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES

El uso de fluoróforos orgánicos para la marcación de biomoléculas o como sen‐

sores fluorescentes encuentra su mayor limitación en sus propiedades fotofísicas in‐

trínsecas: p.ej. restricción en la excitación, perfiles anchos de emisión y/o bajos umbra‐

les de fotoblanqueo. Esto acota las posibilidades en cuanto a la adquisición de imáge‐

nes y la obtención simultánea de múltiples señales en microscopías de fluorescencia.

En este sentido, los nanocristales de semiconductores (también denominados puntos

cuánticos o Quantum Dots) han surgido como una excelente alternativa debido a sus

4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 00 .0

0 .5

1 .0

Abso

rció

n N

orm

aliz

ada

Longitud de onda 蔕 nm 蔔

5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 00 .0

0 .5

1 .0

Em

isió

n N

orm

aliz

ada

L o n g itu d d e o n d a (n m )Figura 5. Estructura química y espectros normalizados de absorción y emisión para Cy3 (negro), Cy5 (azul) y Cy7(rojo).

NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES

11

propiedades ópticas y espectroscópicas únicas.1 Éstas han abierto nuevas posibilidades

en diversas áreas y han sido empleados como sondas fluorescentes en aplicaciones en

las que los fluoróforos orgánicos no podían ser utilizados.2‐5

Los Quantum Dots (QDs) son nanocristales de material semiconductor en los

que, debido a su pequeño tamaño, tienen lugar efectos cuánticos que cambian sus

propiedades en lo que respecta a la absorción y emisión de luz. Los QDs típicamente

utilizados en estudios biológicos son nanopartículas compuestas de un núcleo de CdSe

de diámetro variable recubierto por una capa de ZnS (Figura 6). Esta capa pasivante

tiene la función de proteger el núcleo de la oxidación, evitar la pérdida de Cd(II) o Se(II)

a la solución y, entonces, mejorar la fotoluminiscencia.

Los QDs no son solubles en agua por eso es necesaria la funcionalización de su‐

perficie con ligandos hidrofílicos, ya sea a través de procesos de intercambio o por en‐

capsulamiento del nanocristal con capas de material orgánico heterofuncional, típica‐

mente TOP/TOPO (tri‐n‐octilfosfina/óxido de tri‐n‐octilfosfina). Estos ligandos no sólo

mejoran la solubilidad en agua sino que también sirven como sitio de anclaje de bio‐

moléculas. El tamaño de estas partículas se encuentra en el orden de los 2‐10 nm de

diámetro en el núcleo. La Figura 7 muestra el tamaño comparativo de las nanopartícu‐

las semiconductoras fluorescentes comerciales (Life Technologies Co), incluyendo los

diferentes recubrimientos.

Las propiedades espectroscópicas de los Quantum Dots se deben al efecto de‐

nominado “confinamiento cuántico” en el semiconductor. Cuando el material absorbe

Figura 6. Estructura esquemática de una nanopartícula semiconductora fluorescente.

INTRODUCCIÓN

12

energía, se genera un par coulómbico hueco‐electrón que se denomina excitón. Si el

tamaño de la nanopartícula se torna comparable con el radio de Bohr del excitón (dis‐

tancia hueco‐electrón en el estado excitado) el par electrón/hueco queda “confinado”.

De la misma manera que los átomos y las moléculas pequeñas, dichos pares generan

estados de energía cuantizados y discretos y, entonces, las transiciones entre ellos con‐

llevan espectros de absorción y emisión característicos.

Los Quantum Dots pueden absorber fotones cuando la energía de excitación es

mayor que la energía del band gap (separación entra la banda de valencia y la de con‐

ducción en el semiconductor macroscópico, Figura 8.b). El estado excitado de menor

energía se conoce como primer excitón y corresponde a la transición de menor energía

posible en la nanopartícula. A partir de allí, la excitación a menores longitudes de onda

es posible porque a mayores energías se encuentran un número creciente de estados

electrónicos, y esto se refleja en que el coeficiente de extinción molar aumenta gra‐

dualmente a longitudes de onda menores. Como consecuencia se obtienen espectros

de absorción excepcionalmente anchos (como un continuo). No obstante, debido a

que las transiciones no están acopladas con vibraciones atómicas, los espectros de

emisión de los QDs son angostos y simétricos. Estos nanocristales pueden absorber

fotones en un amplio rango de energía pero emiten a una longitud de onda caracterís‐

tica, Figura 8.c.

Figura 7. Tamaño comparativo (diámetro hidrodinámico) de Quantum Dots. (Life Technologies Co).

NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES

13

La separación entre los niveles cuantizados del estado fundamental y los dife‐

rentes estados excitados (y, por lo tanto, las posiciones de las bandas de absorción y

emisión) están directamente relacionadas con el tamaño de las nanopartículas. Cuanto

más pequeñas son, menos niveles de energía pueden ser ocupados por los electrones

y, entonces, mayor es la distancia entre los niveles individuales. Por lo tanto, una dis‐

minución del tamaño redunda en un desplazamiento de la emisión a longitudes de

onda menores (mayores energías), Figura 8.a y 8.c.

Las características de los espectros de absorción (anchos, en un continuo) y de

emisión (angostos, sintonizables) convierte a las nanopartículas fluorescentes en una

importante herramienta para aplicaciones en microscopías de fluorescencia ya que

permiten la excitación simultánea de QDs de diferentes colores con la misma fuente de

excitación y la detección selectiva de la emisión mediante el uso de filtros adecuados.6

a. b.

c.

Figura 8. a. Soluciones de nanocristales monodispersos de CdSe de tamaño creciente (de izquierda a derecha, 2 a 7 nm), Delft University of Technology. b. Incremento del band gap del semiconductor a medida que disminuye el tamaño del nanocristal. c. Espectros de excitación (línea llena) y de emisión (línea punteada) de Quantum Dots comerciales de CdSe (Life Technologies Co).

INTRODUCCIÓN

14

En la Tabla 2 se muestran las principales características de QDs y fluoróforos

orgánicos. De la comparación sobresalen dos propiedades: la posibilidad de sintonizar

la emisión en función del tamaño de la nanopartícula y de excitar simultáneamente

nanocristales de diferentes tamaños (y colores) a una única longitud de onda de exci‐

tación alejada de las bandas de emisión (pudiendo ser mayor a 100 nm).

Tabla 2. Comparación de las principales propiedades de fluoróforos orgánicos y QDs

Parámetro Fluoróforos orgánicos Quantum Dots

Tamaño 0,5‐2,0 nm 10‐20 nm

Espectro de absorción

Variable, a menudo angosto y asimétrico, ocasionalmen‐te con estructura vibrónica, sensible a interacciones

intermoleculares.

Extremadamente anchos

Coeficiente de extinción molar

Variable, usualmente en el rango de 103‐105 M‐1cm‐1.

Muy altos, hasta 107 M‐1cm‐1

Espectro de emisión

Anchos (40‐70 nm de ancho medio), asimétricos, la posi‐ción puede mostrar una fuerte sensibilidad a inter‐acciones intermoleculares.

Angostos (25‐30 nm de an‐cho medio), simétricos, sin

tailing hacia el rojo

Corrimiento de Stokes Variable, comúnmente 10‐100 nm

Altos, dada la posibilidad de excitar en el UV

Tiempo de vida media de fluorescencia

Cortos; 0,5‐5,0 ns (con po‐cas excepciones)

Usualmente mayores que los fluoróforos orgánicos,

10‐20 ns

Rendimiento cuántico de fluorescencia

Variable, depende fuerte‐mente del medio

Variable, depende fuerte‐mente del recubrimiento,

puede llegar al 90% Fotoestabilidad Variable a pobre Excelente

Resistencia Química Variable, frecuentemente pobre Excelente

Disponibilidad de modificación química Variable a alta Normalmente pobre

Toxicidad en células Variable, frecuentemente baja

Variable, no está estudiada en profundidad

SENSORES BASADOS EN NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES

15

3. SENSORES BASADOS EN NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES

Las excepcionales propiedades ópticas y fotofísicas de los Quantum Dots fueron

explotadas en múltiples aplicaciones, p. ej. el marcado de biomoléculas en microsco‐

pias de fluorescencia7 o estudios de seguimiento de partículas.8,9 No obstante, si bien

las nanopartículas fluorescentes son útiles para identificar su posición en un entorno

dado, su insensibilidad intrínseca a la presencia de la mayoría de los analitos químicos

y biológicos de interés los convierte en una herramienta de utilidad limitada como

sondas sensibles a su microentorno. Sin embargo, en los últimos años se han desarro‐

llado múltiples metodologías sintéticas para la preparación de nanopartículas solubles

en agua10 que pueden ser funcionalizadas con moléculas que transfieran la sensibilidad

a analitos de interés y permitan aprovechar las excelentes propiedades ópticas que

presentan los nanocristales de semiconductor para el desarrollo de nuevos sensores

fluorescentes basados en Quantum Dots.

Hasta el momento, se han explotado dos procesos fotofísicos distintos para la

construcción de sensores fluorescentes basados en nanopartículas: la transferencia de

energía de excitación en forma no radiativa (transferencia de energía por resonancia

de Förster) y la transferencia de carga (transferencia electrónica) entre la nanopartícu‐

la y las especies que se encuentran en su superficie.11

El apagamiento de QDs fotoexcitados mediante una Transferencia Electrónica

(Electronic Transfer, ET) es un mecanismo fotofísico muy versátil que permite sondear

las interacciones entre los sitios donantes‐aceptores de electrones que se encuentren

espacialmente en un entorno muy cercano a la nanopartícula (p.ej. en su superficie).

El proceso de transferencia electrónica puede transcurrir mediante dos rutas

generales que se describen en la Figura 9.

INTRODUCCIÓN

16

Cuando el QD es excitado por un fotón, se genera un par hueco‐electrón en la

banda de valencia y de conducción del nanocristal. En presencia de un aceptor de elec‐

trones (A) que posea un orbital LUMO de menor energía que la banda de conducción

del semiconductor tiene lugar una transferencia electrónica desde el nanocristal hacia

el aceptor de electrones, despoblando la banda de conducción. En forma similar, en la

presencia de un donante de electrones (D) que posea un orbital HOMO de mayor

energía que la banda de valencia del semiconductor, tiene lugar una transferencia

electrónica desde el donante hacia la nanopartícula, recombinándose con los huecos

de la banda de valencia. Las dos rutas de transferencia electrónica disminuyen la po‐

blación de transportadores de carga las bandas de conducción o de valencia del semi‐

conductor, e inhiben la relajación del QD por la vía radiativa.

La constante de velocidad de transferencia electrónica entre el QD y un aceptor

de electrones (o entre un donante de electrones y el QD) se representa en la ecuación

[6].

donde r0 y r representan la distancia de Van der Waals y la distancia real entre

el donante y el aceptor, respectivamente, β es la constante de acoplamiento electróni‐

Figura 9. Rutas de apagamiento de un Quantum Dot por un aceptor (A) o un donante (D) de electro‐nes mediante un proceso de transferencia de electrones.

0 2

0 B

( G )22 (r r ) 4 k T0

ET DA

B

4 1k T e e

h 4 k T

[6]

TRANSFERENCIA DE ENERGÍA POR RESONANCIA DE FÖRSTER

17

co, ΔG0 y λ son la diferencia de energía libre y la energía de reorganización asociada

con el proceso de transferencia electrónica.

La modificación superficial de nanopartículas con especies que interactúen se‐

lectivamente con analitos que sean buenos donantes o aceptores de electrones, con‐

lleva a que la eficiencia del proceso de ET, y por lo tanto el rendimiento cuántico de

fluorescencia del QD, sea dependiente de la concentración del analito, obteniéndose

de esta manera un sensor fluorescente. Recientemente, Medintz y colaboradores

desarrollaron un sensor de pH basados en Quantum Dots conjugados con dopamina,

cuyo funcionamiento está basado en la transferencia de electrones entre la nanopartí‐

cula y las especies reducida u oxidada de la dopamina (cuyo potencial redox es depen‐

diente del pH del medio).12

4. TRANSFERENCIA DE ENERGÍA POR RESONANCIA DE FÖRSTER

La Transferencia de Energía por Resonancia de Förster (Förster Resonance

Energy Transfer, FRET) es un proceso que involucra una transferencia de energía no

radiativa desde una especie fotoexcitada, que actúa como un donante de energía, ha‐

cia otra especie que opera como aceptora (ubicada en las cercanías de la primera) y

que, a su vez, puede relajar hacia su estado basal con emisión de radiación (emisión

sensibilizada, sensitized emission).

La transferencia de energía no radiativa requiere de algún tipo de interacción

entre las especies participantes, y sólo tiene lugar si existen transiciones vibrónicas en

el donante que tengan prácticamente la misma energía que las transiciones corres‐

pondientes en el aceptor; en esos casos, se dice que las transiciones están acopladas o

“en resonancia”. En la práctica, esto se observa cuando el espectro de emisión del do‐

nante se superpone con el de absorción del aceptor (Figura 10).

El tratamiento teórico del proceso de transferencia de energía se basa en con‐

siderar al fluoróforo como un dipolo oscilante, que puede intercambiar energía con

otro dipolo de frecuencia de resonancia similar. Por lo tanto, el proceso FRET es similar

INTRODUCCIÓN

18

al comportamiento de dos osciladores acoplados. La constante de velocidad de trans‐

ferencia de energía para un par donante‐aceptor (D‐A) aislado separados por una dis‐

tancia r se puede calcular utilizando el formalismo desarrollado por Theodor

Förster13,14 en 1948, ecuación [7].

donde kD y τD son la constante de velocidad de emisión y el tiempo de vida me‐

dia de fluorescencia para el donante en ausencia de la transferencia, r es la distancia

entre el donante y el aceptor (asumiendo que permanece constante durante el tiempo

de vida media de fluorescencia del donante) y R0 es la distancia crítica conocida como

radio de Förster, que se define como la distancia en la que el decaimiento espontáneo

del donante y la transferencia de energía son igualmente probables (kD = kT). La fuerte

dependencia de la constante de velocidad para el proceso de transferencia de energía

con la distancia (sexta potencia inversa) es característica de este tipo de fenómenos y

ha propiciado el uso de esta técnica para su aplicación como “regla molecular”.15

El parámetro R0 puede ser determinado a partir de datos espectroscópicos, y se

define según la ecuación [8].

a. b.

Figura 10. a. Integral de solapamiento espectral entre los espectros de emisión y absorción de las especies donante y aceptora, respectivamente. b. Esquema de niveles de energía de las especies do‐nante y aceptora, mostrando las transiciones acopladas.

[7] 6 6

0 0T D

D

R 1 Rk k

r r


19

donde NAv es el número de Avogadro, τD es el tiempo de vida media de fluores‐

cencia del donante en ausencia del aceptor, n es el índice de refracción del medio (que

típicamente se asume como 1.4 para biomoléculas en solución acuosa), D0 es el ren‐

dimiento cuántico de fluorescencia del donante en ausencia del proceso FRET, ゛2 es el

factor que describe la orientación relativa en el espacio de los momentos dipolares de

transición del donante y del aceptor, usualmente se asume como 2/3 que corresponde

a un ensamble de aceptores aleatoriamente distribuidos alrededor del donante (esta

aproximación no siempre es aplicable). Por último, J(゜) representa la integral de sola‐

pamiento espectral entre el espectro de emisión del donante y el de absorción del

aceptor, que se calcula según la ecuación [9].

donde FD(゜) representa al espectro de emisión del donante con su área norma‐

lizada y 0A es el espectro de absorción del aceptor (expresado como coeficiente de ex‐

tinción molar). Por lo tanto, para R0 en Å, ゜ en nm, 0A(゜) en M‐1cm‐1 (la integral de sola‐

pamiento se obtiene entonces en unidades de M‐1cm‐1nm4), el radio de Förster se

puede determinar según la ecuación [10]. Los valores típicos para R0 se encuentran en

el rango de 15‐60 Å.

La eficiencia del proceso FRET, EFRET, se define según la ecuación [11].

[10]

[11]

1 6

2 4 40 D D A

0

R 0.2108 n F ( ) ( ) d

T TFRET 1

T D T D

k kE

k k k

[9] 4D A

0

J( ) F ( ) ( ) d

[8] 2 0

6 D0 5 4

Av

9(ln10)R J( )

128 N n

INTRODUCCIÓN

20

La eficiencia de la transferencia de energía puede ser determinada experimen‐

talmente (y comúnmente se la define de esta manera) según la ecuación [12], a partir

de medidas de intensidad de emisión o de tiempos de vida media de fluorescencia.

donde FDA, FD y τDA, τD son las intensidades de emisión y el tiempo de vida me‐

dia de fluorescencia del donante en presencia y en ausencia del aceptor, respectiva‐

mente.

Si se reemplaza la ecuación [7] en la ecuación [11], la eficiencia de transferencia

puede expresarse en función de r y R0, ecuación [13].

Notar que cuando la distancia entre el donante y el aceptor es igual al radio de

Förster la eficiencia de la transferencia es del 50% . La ecuación [13] muestra que la

distancia entre el donante y el aceptor puede determinarse mediante medidas de la

eficiencia de la transferencia, siempre y cuando no sea muy diferente de R0 (que puede

calcularse mediante la ecuación [10]), en estos casos el rango de trabajo típicamente

se encuentra entre el 10‐90% de R0.

No obstante, la eficiencia del proceso FRET es dependiente de todos los pará‐

metros antes indicados, siendo la integral de solapamiento espectral (J) uno de los más

utilizados en el desarrollo de sensores fluorescentes basados en nanopartículas.16

En el año 2012, durante la elaboración de este manuscrito, se encontró un tra‐

bajo reportado por Dennis y colaboradores17 en el cual se describe un sensor de pH

basado en un conjugado de Quantum Dots y proteínas fluorescentes (mOrange y mO‐

range M163K) para el sensado de pH intracelular. Estos sensores se basan en el cambio

en el espectro de absorción de la especie aceptora en presencia del analito, lo que re‐

60

FRET 6 60

RE

R r [13]

DA DAFRET

D D

FE 1 1

F

[12]


21

dunda en un cambio en la integral de solapamiento y, por lo tanto, en la eficiencia del

proceso de transferencia de energía (Figura 11).

En la Figura 12.a se muestra una representación esquemática del sensor

desarrollado. Se utilizaron como nanopartículas centrales Quantum Dots ITK funcio‐

nalizados con grupos carboxilo 525 nm (Life Technologies Co). Por lo tanto, a pH básico

el solapamiento espectral es bueno y la eficiencia del proceso FRET es alta,

observándose el apagamiento de la fluorescencia de la nanopartícula y la emisión

sensibilizada del aceptor. Estos resultados se observan en la Figura 12.b, donde se

muestran los cambios en la relación intensidad de fluorescencia del donante y del

aceptor para ambas proteínas fluorescentes. En la Figura 12.c y d se presentan los

espectros correspondientes a la titulación de los sensores de pH utilizando las

Figura 11. Espectros de absorción de mOrange (a) y mOrange M163K (c) titulados con HCl 0,1M. La posterior adición de NaOH muestra la reversibilidad de los cambios espectrales, indicados como es‐pectros “reversos”. Representación del coeficiente de extinción molar en función del pH para mOran‐ge (b) y mOrange M163K (d), los pKa calculados son de 6,9 y 7,9, respectivamente.17

Absorban

cia

Absorban

cia

Coeficiente

de

Extinción

Molar

(M‐1cm

‐1)

Coeficien

te de

Extinción

Molar

(M‐1cm

‐1)

Longitud de onda (nm)


INTRODUCCIÓN

22

proteínas fluorescentes mOrange y mOrange M163K, respectivamente. Este trabajo

representa un claro ejemplo de sensores desarrollados a partir de nanopartículas

semiconductoras fluorescentes funcionalizadas con especies aceptoras FRET sensibles

a pH.

5. MODIFICACIÓN SUPERFICIAL DE NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES

En general, las nanopartículas de material semiconductor comerciales están

protegidas por un recubrimiento de trioctilfosfina (Tri‐n‐OctilPhosphine, TOP) u óxido

de trioctilfosfina (Tri‐n‐OctilPhosphine Oxide, TOPO), los nanocristales así obtenidos

resultan hidrofóbicos, dispersables sólo en medio orgánico (generalmente se comer‐

cializan como dispersiones en hexano o tolueno) y, por lo tanto, poco útiles para apli‐

caciones en sistemas biológicos. Sin embargo, los ligando de TOP/TOPO en la superficie

pueden ser intercambiados con otros agentes via reacciones de intercambio de ligan‐

a. b.

c. d.

Figura 12. a. Representación esquemática del sensor de pH desarrollado. b. Relación de intensidad de emisión del donante (QD) a aceptor (proteínas fluorescentes), la barra de error corresponde a la des‐viación estándar de tres medidas independientes. c. y d. Espectros de emisión correspondientes a la titulación de los sensores con mOrange y mOrange M163K, respectivamente. (゜Exc 400 nm).17

Longitud de onda (nm)Intensidad

de

Fluorescencia

(UA)

Longitud de onda (nm) Intensidad

de

Fluorescencia

(UA)

MODIFICACIÓN SUPERFICIAL DE NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES

23

dos utilizando reactivos tiolados (normalmente ácido mercaptoacético o ácido 11‐

mercaptoundecanoico) o ditiolados (típicamente ácido lipoico) para formar monoca‐

pas en la superficie del nanocristal.18 Alternativamente, es posible llevar a cabo modifi‐

caciones de los ligandos existentes utilizando interacciones electrostáticas, hidrofóbi‐

cas o del tipo anfitrión‐huésped.11

En la Figura 13 se muestran los diferentes métodos de funcionalización de la

superficie con ligandos hidrofílicos, mediante procesos de intercambio de ligandos o

por encapsulamiento del nanocristal con capas de material orgánico anfifílico. Estos

métodos no sólo mejoran la dispersión en agua de las nanopartículas sino que también

Figura 13. Modificación de Quantum Dots con recubrimientos con ligandos hidrofílicos para su uso enmedio acuoso y preservación de las propiedades de luminiscencia. A. Intercambio del recubrimiento hidrofóbico con ligandos hidrofílicos. a‐d. monocapas funcionalizadas con tioles o ditioles, e. péptidos terminados en cisteína, f. siloxanos tiolados, g. dendrones funcionalizados con ácidos carboxílicos. B. Encapsulación con bicapas funcionalizadas anfifílicas de h. fosfolípidos o i. copolímeros.

INTRODUCCIÓN

24

estabilizan sus propiedades luminiscentes y, además, sirven como sitios de unión para

la posterior modificación superficial de las nanopartículas. En particular, los polímeros

anfifílicos derivados del poli‐isobutilen anhídrido maleico con una cadena lateral hidro‐

fóbica (Figura 13.i) han sido ampliamente utilizados para la derivatización de nanopar‐

tículas semiconductoras recubiertas de TOPO, no sólo para la conjugación de diferen‐

tes funcionalidades en su superficie, sino que también para aprovechar el microam‐

biente hidrofóbico existente entre las cadenas carbonadas de ambas capas del recu‐

brimiento para alojar moléculas insolubles en agua.19‐21

En la Figura 14 se muestran los métodos más utilizados para la conjugación su‐

perficial de nanopartículas con un recubrimiento hidrofílico, los cuales usualmente

cubren la superficie de residuos carboxilo. Por lo tanto, el método más utilizado para la

Figura 14. Modificación superficial de Quantum Dots con especies moleculares o macromoleculares. a. y b. unión covalente directa de moléculas pequeñas o biomoléculas. c. y d. unión de ligandos o proteínas para la conjugación específica de otras moléculas. e. Asociación electrostática de polímeros.

OBJETIVO GENERAL Y ESPECÍFICOS

25

funcionalización superficial de las nanopartículas es la unión covalente de moléculas

que posean un grupo amino en su estructura, p. ej. mediante esta estrategia resulta

posible conjugar ácidos nucleicos modificados o aminoácidos mediante una unión co‐

valente directa al recubrimiento hidrofílico de la nanopartícula (Figura 14.a y b).

Otra estrategia consiste en la unión covalente de una funcionalidad que poste‐

riormente permita introducir un elemento de reconocimiento hacia la nanopartícula.

Como ejemplo puede nombrarse la unión covalente de un derivado de un ácido boró‐

nico covalentemente unido al recubrimiento, el cual habilita la posibilidad de la unión

selectiva de ligandos modificados con dos hidroxilos vecinales (Figura 14.c). Asimismo,

una metodología alternativa consiste en la unión covalente de proteínas u otra biomo‐

lécula que permita el reconocimiento especifico del ligando especialmente modifica‐

dos, p. ej. Quantum Dots recubiertos con estreptavidina (Life Technologies), los cuales

reconocen específicamente ligandos derivatizados con biotina (Figura 14.d).

También pueden utilizarse estrategias que involucran la modificación en varias

capas de QDs haciendo uso de interacciones electrostáticas entre ellas. Por ejemplo, la

deposición de polímeros con carga positiva sobre nanopartículas recubiertas de grupos

carboxilatos (Figura 14.e). La introducción de grupos funcionales adecuados en el po‐

límero con carga positiva permitiría la posterior modificación de las nanopartículas.

6. OBJETIVO GENERAL Y ESPECÍFICOS

El trabajo presentado en esta Tesis se enmarca en un proyecto general en el

cual se propone el desarrollo de nuevas nanoherramientas fluorescentes para micros‐

copía de fluorescencia con el objetivo de elucidar los mecanismos biofísicos y bioquí‐

micos responsables de la función celular. Se enfatiza en las mismas la escala nanoscó‐

pica de trabajo y el método de marcación espectroscópica ya que de esta manera se

asegura la sensibilidad y la resolución espacial y temporal necesarias. Además, estas

propiedades permiten su uso en diferentes técnicas de microscopía (FLIM, FRAP, con‐

focal, etc) posibilitando así la obtención de imágenes en el contexto de la célula viva y

INTRODUCCIÓN

26

un análisis multidimensional (espacial, temporal y paramétrico) con el cual se puedan

inferir correlaciones de importancia. Estas consideraciones pueden aplicarse tanto a

células normales como a aquellas afectadas por estrés o enfermedad. Es así que este

proyecto tiene una aplicabilidad y relevancia inmediata.

El objetivo general de esta Tesis estuvo orientado al desarrollo de sensores ba‐

sados en nanopartículas semiconductoras fluorescentes mediante su modificación

superficial. Esto incluye la creación de elementos de control de las propiedades ópticas

de las nanopartículas así como el diseño de métodos de unión específica a biomolécu‐

las e internalización en células.

Dentro de este proyecto se encararon varios objetivos específicos:

i. Desarrollo de rutas sintéticas para la obtención de tricarbocianinas simétricas y

asimétricas y su aplicación como marcadores específicos y sensores fluorescentes.

ii. Diseño de sensores basados en la modificación superficial de nanopartículas fluo‐

rescentes de material semiconductor.

iii. Aplicación de los nanosensores obtenidos para estudios de microscopía in vivo.

En primer lugar, se decidió encarar el desarrollo de metodologías sintéticas pa‐

ra la obtención de tricarbocianinas simétricas y asimétricas, una familia de fluoróforos

que presentan múltiples ventajas para su aplicación como marcadores específicos y en

el diseño de sensores fluorescentes. Este tipo de compuestos han sido utilizados con

éxito en el desarrollo de sensores fluorescentes de diversos tipos de analitos, entre

ellos pH,22 Zn(II),23 Hg(II),24 Cd(II),25 etc. Las tricarbocianinas pertenecen a la familia de

fluoróforos de las cianinas, ampliamente conocidas y estudiadas, que tienen la caracte‐

rística de ser activos en la zona del infrarrojo cercano del espectro de radiación NIR. Sin

embargo, los ejemplos encontrados en literatura para este tipo de sensores fluores‐

centes involucran el uso de tricarbocianinas simétricas, que poseen sólo una funciona‐

lidad en las cadenas alquílicas de los nitrógenos heterocíclicos. La síntesis de tricarbo‐

cianinas heterocíclicas permitiría la posibilidad de contar con dos funcionalidades dife‐

OBJETIVO GENERAL Y ESPECÍFICOS

27

rentes en las cadenas alquílicas citadas, siendo de particular interés en este trabajo de

Tesis el desarrollo de tricarbocianinas asimétricas que posean los grupos funcionales

sulfonato (para mejorar la solubilidad en agua del fluoróforo) y carboxilo (para el mar‐

cado de biomoléculas o analitos de interés). Además, la introducción de dos grupos

heterocíclicos diferentes en los extremos de la cadena conjugada posibilitaría el ajuste

de las propiedades ópticas del fluoróforo obtenido.

En trabajos previos se encontraron sólo dos referencias de síntesis de tricarbo‐

cianinas asimétricas26,27 de cadena rígida; por ello, se ha considerado un desafío in‐

teresante el desarrollo de una ruta sintética para la obtención de este tipo de cianinas

en la escala de los cientos de miligramos. En el Capítulo 1 se discuten los resultados

obtenidos con el establecimiento de dicha ruta de síntesis.

En el Capítulo 2 se describe el uso de las tricarbocianinas simétricas y asimétri‐

cas en el desarrollo de sensores fluorescentes y marcadores específicos de biomolécu‐

las. Particularmente se discutirá la fotofísica de la interacción de los fluoróforos con

proteínas, los cambios en sus propiedades ópticas cuando se conjugan en la superficie

de la biomolécula y el cálculo de la constante de disociación del conjugado. Además, se

sintetizaron sensores de pH y Zn(II) basados en las tricarbocianinas simétricas y asimé‐

tricas, se estudió su comportamiento frente a los analitos de interés y se calcularon las

constantes de disociación correspondientes.

En el Capítulo 3 se discute a la modificación superficial de nanopartículas de

semiconductor fluorescentes. Se sintetizaron tricarbocianinas biotiniladas para el mar‐

cado específico de nanopartículas fluorescentes recubiertas con estreptavidina, se es‐

tudió el comportamiento de los Quantum Dots frente a la interacción con las tricarbo‐

cianinas como moduladores de la señal fluorescente de los nanocristales. Además, se

sintetizaron tricarbocianinas asimétricas biotiniladas sensibles a pH y a la concentra‐

ción de Zn(II) para su conjugación específica con las nanopartículas. Se estudiaron los

cambios en las propiedades ópticas de los nanocristales como resultado de la interac‐

INTRODUCCIÓN

28

ción con las tricarbocianinas biotiniladas y el comportamiento de los nanosensores

fluorescentes en presencia del analito.

En el Capítulo 4 se estudian las interacciones presentes en las tricarbocianinas

cuando se las confina en una superficie. Para ello, se sintetizó un derivado tiolado de

aminotricarbocianinas, el cual fue utilizado para construir ensamblados sobre superfi‐

cies de oro de rugosidad monoatómica por incubación con una solución del fluoróforo.

Los ensambles obtenidos fueron caracterizados mediante diversas técnicas, cuyos re‐

sultados permitieron concluir que la naturaleza del ensamblado depende fuertemente

de las especies presentes en la solución de incubación. Asimismo, se construyeron en‐

sambles de aminotricarbocianina sobre la superficie de nanopartículas de oro de

12 nm de diámetro.

En el Capítulo 5 se desarrollaron sensores de pH fluorescentes basados en na‐

nopartículas semiconductoras, utilizando 5(6)‐carboxinaftofluoresceina biotinilada. Se

estudiaron los cambios en las propiedades fluorescentes de los Quantum Dots que

conlleva la interacción con el fluoróforo biotinilado. Además, se analizaron los cambios

en las propiedades fluorescentes de los sensores con la variación del pH. Los resulta‐

dos de ambos estudios permitieron desarrollar un modelo fotofísico para los nanosen‐

sores fluorescentes basados en una nanopartícula donante central y múltiples acepto‐

res de FRET en su superficie. Asimismo, se utilizaron los nanosensores en una aplica‐

ción in vivo en la marcación específica de receptores erbB1 mediante el uso del factor

de crecimiento epidérmico (Epidermic Growth Factor, EGF) que es un ligando específi‐

co de dicho receptor en la línea celular estable derivada de ovario de Hamster Chino

(Chinese Hamster Ovary, CHO) y se estudiaron los cambios de pH asociados a la madu‐

ración de endosomas en el contexto de la célula viva, mediante microscopías avanza‐

das de fluorescencia (FLIM y confocal).

BIBLIOGRAFÍA

29

7. BIBLIOGRAFÍA

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INTRODUCCIÓN

30

(27) Pham, W.; Medarova, Z.; Moore, A. Bioconjug Chem 2005, 16, 735‐740.

CAPÍTULO 1

SÍNTESIS DE CLOROTRICARBOCIANINAS PRECURSORAS

INTRODUCCIÓN

31

1.1. INTRODUCCIÓN

Las cianinas se encuentran entre las familias de pigmentos sintéticos más cono‐

cidos, y son muy usados como fotosensibilizadores en fotografía,1 en tecnologías laser2

y en celdas fotovoltaicas.3 Más recientemente, comenzaron a ser utilizados como son‐

das fluorescentes para la marcación de biomoléculas.4‐6 Es así que las aplicaciones de

estos compuestos se han incrementado fuertemente en secuenciación de ADN,7 mi‐

croscopía in vivo8 y proteómica.9 Especialmente en las dos últimas décadas, su popula‐

ridad ha aumentado como marcadores fluorescentes para proteínas y ácidos nucleicos

en investigaciones en microscopía de fluorescencia a nivel de molécula individual.10‐12

Las cianinas son fluoróforos que estructuralmente están compuestos por una cadena

de polimetinos que conforman un sistema de electrones π conjugados con un grupo

donante y otro aceptor de electrones en los extremos (Figura 1.1.a). Se considera a

cada compuesto como un híbrido de resonancia de dos estructuras canónicas que no

son completamente representados por una única estructura química.

En la familia de las cianinas, los extremos de la cadena de polimetinos se en‐

cuentran sustituidos por dos átomos de nitrógeno, uno de los cuales es terciario y el

otro cuaternario13 que actúan como grupo donante y aceptor de electrones, respecti‐

Figura 1.1. a. Estructura química general de fluoróforos basados en polimetinos. (GD: Grupo donante de electrones, GA: Grupo aceptor de electrones). b. Estructura química general de las familias de cianinas Estreptocianinas (2), Hemicianinas (3) y Cianinas de cadena cerrada (4), (R: alquilo).

RN+

R

NR

RX- n

N+

R

N

RX- n

N+

R

NR

RX- n

XXX

GA GDn

GD: O, N, S

GA:OO+ S+

N+

a.

b.

n: 0,1,2,3…

2 3 4

1

CAPÍTULO 1 – SÍNTESIS DE CLOROTRICARBOCIANINAS PRECURSORAS

32

vamente. Ambos átomos de nitrógeno pueden formar parte de heterociclos, dando

lugar a tres familias de cianinas: las Estreptocianinas (2), las Hemicianinas (3) y las Cia‐

ninas de cadena cerrada (4), según ninguno, uno o los dos extremos formen parte de

heterociclos, respectivamente (Figura 1.1.b). Las últimas son las más desarrolladas y se

las conoce normalmente como “cianinas”.

Los grupos heterocíclicos más utilizados son restos de indolenina, quinolina,

benzoxazol o benzotiazol (Figura 1.2). Las cianinas simétricas que derivan de estos ani‐

llos heterocíclicos se nombran utilizando la nomenclatura general diXCm(n) donde n es

el número de átomos de carbono en la cadena de polimetinos, m es el número de

átomos de carbono en la cadena alquílica primaria de los sustituyentes unidos a los

nitrógenos, y X corresponde a la naturaleza de los anillos heterocíclicos en los extre‐

mos de la cadena de polimetinos, típicamente I para anillos de tipo indolenina, Q para

quinolinas, O para benzoxazol y S para benzotioxazol.

En 1990, Waggoner y colaboradores introdujeron la nomenclatura “Cy” que

aun hoy es muy utilizada para denominar a una familia de indocarbocianinas diseñadas

para la marcación fluorescente de proteínas y ácidos nucleicos,14,15 de las cuales Cy3,

Cy5 y Cy7 son los más utilizados (Figura 1.3). El uso de esta nomenclatura se extendió

Figura 1.2. Panel izquierdo: Estructura química general de las cianinas de ciclo cerrado, las líneas pun‐teadas representan los núcleos heterocíclicos que se encuentran sustituidos con cadenas alquílicas. Panel derecho: Sustituyentes heterocíclicos más utilizados

CmH2m+1

N+ N

CmH2m+1

x

N+

CmH2m+1

N+

CmH2m+1

N+

O

CmH2m+1

N+

S

CmH2m+1

Quinolina, diQCn(m)(2,2'-carbocianinas)

Indolenina, diICn(m)(indocarbocianinas)

Benzoxazol, diOCn(m)(oxacarbocianinas)

Benzotiazol, diSCn(m)(tiacarbocianinas)

5

INTRODUCCIÓN

33

para designar derivados estructuralmente diferentes de los originales, por lo que hoy

en día ya no representa a una única familia de compuestos.

Las Cy3 y Cy5 fueron los fluoróforos de preferencia durante el desarrollo de las

espectroscopías de moléculas individuales debido principalmente a su excelente foto‐

estabilidad, sus secciones eficaces de absorción y rendimientos cuánticos de fluores‐

cencia. Además son compatibles con los láseres comunes y detectores de fotones indi‐

viduales, y están disponibles comercialmente como derivados que pueden conjugarse

covalentemente con proteínas y ácidos nucleicos.16

Fluoróforo λ Máx Abs(nm) λ Máx Em(nm) 0Máx (M‐1cm‐1) φFl

Cy3 548 562 150.000 0,04

Cy3.5 581 596 120.000 0,14

Cy5 646 664 250.000 0,27

Cy5.5 673 692 190.000 0,23

Cy7 747 774 200.000 0,28

Fluoresceína 490 520 88.000 0,92

Rodamina 123 510 530 85.000 0,90

Figura 1.3. Estructura química de los ésteres succimidilo de Cy3, Cy5 y Cy7. Propiedades espectroscó‐picas de las cianinas y fluoróforos más utilizados en marcación fluorescente de biomoléculas.


34

1.2. FOTOFÍSICA Y PROPIEDADES ESPECTROSCÓPICAS

La absorción de luz en la región visible del espectro de estos compuestos es

consecuencia de transiciones electrónicas del sistema de electrones deslocalizados.

A medida que se incrementa el número de unidades de vinilenos en la cadena (n en la

Figura 1.1.b) la posición del pico de máxima absorción en el espectro UV‐visible se

desplaza hacia longitudes de onda mayores en una proporción de aproximadamente

100 nm por unidad, lo que se conoce con el término “desplazamiento de vinileno”. En

la Figura 1.4 se muestran los espectros de absorción y de emisión de las cianinas Cy3,

Cy5 y Cy7 en etanol, típico para esta familia de compuestos.

En las cianinas, la conjugación del aceptor y el donante de electrones a través

del sistema πde la cadena de polimetinos determina que el núcleo del fluoróforo se

encuentre en el mismo plano, restringiendo en gran medida el número de conforma‐

ciones posibles. En el estado basal, dicha cadena se encuentra en la forma más estable

toda‐trans a menos de que exista algún tipo de impedimento estérico. Sin embargo,

las cianinas pueden sufrir isomerizaciones alrededor de los enlaces C‐C conjugados en

la cadena de polimetinos que influyen notablemente en las propiedades ópticas de

Figura 1.4. Espectros de absorción y emisión de Cy3 ( , absorción; , emisión), Cy5 ( , absorción; , emisión) y Cy7 ( , absorción, , emisión) para soluciones 10 µM en etanol.

400 500 600 700 8000.0

0.5

1.0

0.0

0.5

1.0

Fluorescencia N

ormalizadaA

bsor

banc

ia N

orm

aliz

ada

Long de onda (nm)Longitud de onda (nm)

FOTOFÍSICA Y PROPIEDADES ESPECTROSCÓPICAS

35

estos fluoróforos. No obstante, las isomerizaciones desde el estado excitado (fotoiso‐

merizaciones) muchas veces representan el mecanismo de relajación más eficiente en

solución.

El comportamiento fotofísico de los fluoróforos con cadenas de polimetinos

usualmente se describe en términos de una superficie de energía potencial como la

descrita en la Figura 1.5, propuesta por primera vez por Rullière y colaboladores.17

Luego de la absorción de luz, el estado excitado singulete (1N) se desactiva mediante

una serie de procesos competitivos, siendo los más eficientes la emisión de fluores‐

cencia (f), la conversión interna (ic) y la rotación alrededor de un enlace C‐C de la ca‐

dena de polimetinos, cada uno de ellos caracterizado por la constante de velocidad

correspondiente: kf, kic y kNt, respectivamente. La eficiencia relativa de la fotoisomeri‐

zación con respecto a los otros dos procesos depende de la temperatura, la viscosidad

del solvente y la presencia de sustituyentes en la cadena que puedan crear algún tipo

Figura 1.5. Diagrama de energía potencial para la fotoisomerización de cianinas. Las energías de los estados basal y primer estado excitado singulete están representadas como función del ángulo de torsión (). N representa la forma normal (isómero trans),1N el primer estado excitado singulete de la forma normal, t el estado retorcido y P el fotoisómero cis; kic y kf son las constantes de velocidad para la conversión interna y la emisión de fluorescencia, respectivamente.


36

de impedimento estérico. La isomerización desde el estado excitado singulete ocurre

vía un intermediario no espectroscópico parcialmente retorcido del estado excitado (t)

que decae rápidamente en forma no radiativa a la hipersuperficie del estado basal pa‐

ra dar el fotoisómero (P) o retornar al estado basal termodinámicamente más estable

todo‐trans (N).18 Se ha determinado que el fotoisómero (P) posee un rendimiento

cuántico de fluorescencia muy bajo19 y se postula que en su formación sólo uno de los

dobles enlaces se isomeriza dando lugar a una conformación mono‐cis.18 Una vez for‐

mado el fotoisómero tiene lugar una retroisomerización térmica para dar el isómero

todo‐trans, termodinámicamente más estable (P→N). Este proceso se ha invesピgado

exhaustivamente sobre un número considerable de cianinas y se encontró que se trata

de una reacción de primer orden con una velocidad que depende fuertemente de la

viscosidad del solvente18 pero es independiente de la polaridad del mismo.20

Los estados excitados singulete de cianinas con cadenas cortas (n=1) en solven‐

tes de baja viscosidad se caracterizan por tener un tiempo de vida media de fluores‐

cencia (τF) muy corto y un rendimiento cuántico de fluorescencia (φFl) bajo debido a

que la rotación en torno al enlace C‐C resulta muy efectiva.21 La eficiencia de la emi‐

sión de fluorescencia aumenta significativamente cuando la rotación de los enlaces en

la cadena de polimetinos se ve impedida, como se observa con fluoróforos en solven‐

tes de alta viscosidad21 o unidos a biomoléculas.22 Otra alternativa consiste en incorpo‐

rar un ciclo en la cadena de polimetinos para imponerle rigidez y de esa manera evitar

la rotación en torno a dichos enlaces. Las cianinas que cumplen este requisito estructu‐

ral se denominan “tricarbocianinas” e incorporan un ciclo de seis miembros fusionado

a la cadena de polimetinos.23 Otros ejemplos son las “escuaraínas”24 (que contienen

una unidad de ácido escuárico) o el comercialmente disponible Cy3b25 (Figura 1.6).

Las tricarbocianinas y las escuaraínas tienen la característica de ser ópticamente

activas en la zona del infrarrojo cercano (Near Infrared Region, NIR) del espectro de

radiación (600‐900nm). Esta característica presenta múltiples ventajas para su aplica‐

ción en biomedicina, microscopías de fluorescencia, química de materiales, ya que

FOTOFÍSICA Y PROPIEDADES ESPECTROSCÓPICAS

37

ofrece mínima interferencia de absorción y fluorescencia con muestras biológicas, su

excitación es posible con diodos laser de bajo costo, se obtiene una menor dispersión

de la luz de excitación y una alta penetración en tejidos. Sin embargo, las escuaraínas

presentan algunas desventajas, como ser una alta reactividad frente a ataques nu‐

cleofílicos en el anillo central de cuatro miembros, deficiente en electrones, y una gran

tendencia a formar agregados no fluorescentes.

La formación espontánea de agregados es un proceso conocido en las cianinas,

debido a las interacciones de van der Waals presentes en el sistema conjugado, el cual

adopta una conformación totalmente plana. En las tricarbocianinas se intenta dismi‐

nuir estas fuerzas atractivas mediante la introducción de grupos voluminosos y/o el

desarrollo de cargas netas en el núcleo del fluoróforo para favorecer la repulsión elec‐

trostática entre moléculas. Otra solución que se ha encontrado para superar estas difi‐

cultades fue encapsular los fluoróforos en cavidades del tipo rotaxanos26 o ciclodextri‐

nas,27 a costa de trabajar con sistemas supramoleculares más complejos y de mayor

tamaño.

Figura 1.6. Cianinas con cadena rígida. a) tricarbocianinas, b) escuaraínas y c) Cy3b.

Fluoróforo Máx Abs Máx Em Máx F a 617nm 757nm 70.000 M‐1cm‐1 0.38

b 634nm 657nm 135.000 M‐1cm‐1 0.67

c 558nm 573nm 130.000 M‐1cm‐1 0.70


38

En este capítulo se describirá la síntesis de tricarbocianinas simétricas y asimétri‐

cas con un átomo de cloro en la posición meso, las cuales fueron utilizadas como pre‐

cursoras de los sensores de fluorescentes desarrollados en esta tesis.

1.3. RUTAS SINTÉTICAS UTILIZADAS PARA LA OBTENCIÓN DE TRICARBOCIANINAS

1.3.1. Síntesis de los precursores

Como se discutió en la sección anterior, una de las principales familias de com‐

puestos fluorescentes activos en la zona NIR (600‐900nm) son las tricarbocianinas es‐

tructuralmente rígidas. Más allá de las ventajas que muestran en cuanto a sus propie‐

dades fotofísicas, la ruta sintética de estos compuestos presenta un precursor común

de gran versatilidad 6 a partir del cual pueden derivarse múltiples compuestos fluores‐

centes mediante un único paso de reacción (Figura 1.7). El compuesto 6 posee un

átomo de cloro en la posición meso que puede ser sustituido fácilmente por diversos

nucleófilos (alcóxidos, aminas o tioles) a través de una reacción del tipo Sustitución

Aromática Nucleofílica Radicalaria (SRN1).

La síntesis de este precursor se lleva a cabo mediante la condensación de dos 2‐

metil‐aza‐heterociclos con un bisaldehído insaturado o un equivalente del mismo,

normalmente la base de Schiff, a reflujo en medio neutro o básico, respectivamente.

La diversidad estructural se logra mediante variaciones en la cadena poliénica, en los

sustituyentes de los átomos de nitrógeno y/o en los heterociclos. Combinando estas

Figura 1.7. Modificaciones sobre el precursor común 6 y esquema retrosintético para su obtención. R1,2 = alquilo, bencilo, COOH, SO3

‐; X = O, NHPh.

6

RUTAS SINTÉTICAS UTILIZADAS PARA LA OBTENCIÓN DE TRICARBOCIANINAS

39

variables en el diseño de la estructura final, es posible controlar la solubilidad, reactivi‐

dad, y propiedades espectroscópicas de las cianinas derivadas de ellos.

Los grupos funcionales sulfonato y carboxilato son los más utilizados como sus‐

tituyentes ya que le confieren al compuesto final una mayor solubilidad en agua y la

posibilidad de conjugación con biomoléculas, respectivamente; y son completamente

inertes tanto en las condiciones de la reacción de formación del núcleo del fluoróforo

como en sus modificaciones posteriores.

En esta tesis se trabajó con dos aza‐heterociclos comerciales, la 2,3,3‐trimetil‐

indolenina (7) y el 1,1,2‐trimetilbenzo[e]indol (8), como reactivos de partida para ob‐

tener derivados con dos grupos funcionales diferentes, sulfonato y carboxilato. La Fi‐

gura 1. muestra la nomenclatura que será utilizada para designar en forma general a

los heterociclos 7 y 8.

En la reacción de cuaternización de los heterociclos se utilizaron como agentes

alquilantes el ácido 6‐bromohexanoico y la 1,3‐propanosultona (Figura 1.). Se probaron

diferentes condiciones de solventes y temperaturas para cada combinación de reacti‐

Figura 1.9. Obtención de los derivados cuaternizados de los aza‐heterociclos

N N+

O

OH

Br

O

OH

Reflujo

N N+

SO3-

Reflujo

Br-

O

S O

O

X

X

9

10

7 8

Figura 1.8. Nomenclatura general utilizada para designar los aza‐heterociclos utilizados.


40

vos, los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 1.1. La purificación de los pro‐

ductos se realiza por evaporación del solvente y posterior cristalización con éter etílico.

Estas reacciones se pueden llevar a cabo en la escala de los gramos de reactivos con

muy buenos rendimientos.

En base a trabajos previos, se decidió utilizar dos solventes de reacción con fi‐

nes comparativos: tolueno28 y o‐diclorobenceno.23 Con este último no se obtuvieron

buenos resultados, los menores rendimientos pueden deberse a la dificultad para re‐

mover el solvente luego de concluida la reacción. Asimismo, la cristalización por agre‐

gado de éter etílico sólo permitió una recuperación parcial del producto.

Por otro lado, el uso de tolueno resultó ser el más adecuado ya que con el

mismo se obtuvieron buenos rendimientos en todos los casos.

Algo para destacar es la menor reactividad del 1,2,2‐trimetilbenzo[e]indol fren‐

te a la 2,3,3‐trimetilindolenina, ya que en todos los casos los rendimientos fueron me‐

nores para el primero. Con el objeto de estudiar esta diferencia de reactividad se llevó

a cabo un análisis mediante cálculos teóricos. Para ello, se optimizaron las estructuras

Tabla 1.1. Condiciones de reacción ensayadas para la alquilación de los aza‐heterociclos. (MO: Microon‐das)

Agente alquilante Solvente Temp (°C) Tiempo (h) Rend Producto

2,3,3‐trimetilindolenina

Ácido bromohexanoico

o‐dicloro benceno 100 24 78%

11 Tolueno 110 48 83%

Acetonitrilo (MO) 150 1 98%

1,3‐Propano‐ sultona


12 Tolueno 110 16 82%

1,1,2‐trimetilbenzo[e]indol

Ácido bromohexanoico

o‐dicloro benceno 100 48 NR

13 Tolueno 110 24 4%

1,3‐Propano‐ sultona


14 Tolueno 110 18 87%


41

de ambos compuestos heterocíclicos al nivel de teoría B3LYP‐6311G+(2d), aplicando

un análisis de orbitales naturales de enlace (Natural Bond Orbital) y utilizando el mo‐

delo SCRF‐PCM (Self Consistent Reaction Field‐Polarized Continuum Model) para simu‐

lar el solvente de reacción (tolueno) implementados en Gaussian 09W.29 Paras las es‐

tructuras minimizadas se calcularon las funciones de Fukui del orbital molecular de

mayor energía ocupado (Highest Occupied Molecular Orbital, HOMO) para el átomo de

nitrógeno del heterociclo utilizando diferentes funciones de base (Tabla 1.2). Se obser‐

va que en todos los casos los índices de Fukui son mayores para 7 respecto a 8, mos‐

trando que el primero es más susceptible frente a un ataque nucleofílico que el último,

lo cual coincide con los resultados experimentales.

Asimismo, se realizó un análisis cualitativo sobre las estructuras minimizadas

observando el potencial electrostático calculado sobre la superficie de isodensidad

0,05 de los orbitales moleculares correspondientes a los pares de electrones libres de

Tabla 1.2. Funciones de Fukui para el átomo de nitrógeno en el HOMO utilizando diferentes funcionesde base en el cálculo.

Heterociclo Funciones de base

B3LYP‐SDD B3LYP‐6311G+(d) B3LYP‐6311G+(2d)

Benzo 0.02640 0.02667 0.02815

Indol 0.08505 0.08505 0.08041

Figura 1.9. Potencial electrostático evaluado sobre la superficie isodensidad de los orbitales moleculares correspondientes al par de electrones libres del átomo de nitrógeno para los compuestos heterocíclicos estudiados.


42

los átomos de nitrógeno en los heterociclos (Figura 1.9). Se observó que el orbital mo‐

lecular correspondiente al 1,2,2‐trimetilbenzo[e]indol se encuentra extendido sobre el

anillo heterocíclico y, por lo tanto, menos localizado sobre el átomo de nitrógeno que

el correspondiente a la 2,3,3‐trimetilindolenina. Estos análisis permiten explicar en

forma teórica la diferencia de reactividad encontrada entre ambos compuestos.

Por otro lado, con el fin de probar una nueva metodología, se ensayó la reac‐

ción de 2,3,3‐trimetilindolenina asistida por microondas y utilizando acetonitrilo como

solvente de reacción, la cual permitió disminuir el tiempo de reacción a 1 hora ( siendo

de 48 horas para el reflujo normal) mostrando un excelente rendimiento (98% ).

1.3.2. Síntesis de tricarbocianinas simétricas

Existen dos rutas sintéticas reportadas para la obtención de las tricarbocianinas

simétricas,28,30 que se presentan en la Figura 1.10.

En ellas se utiliza como precursor un bisaldehído insaturado 15 o su base de

Schiff correspondiente 17. El primero se obtuvo mediante el tratamiento de ci‐

clohexanona con oxicloruro de fósforo en cloruro de metileno y dimetilformamida,30 el

cual puede ser protegido con anilina in‐situ para obtener el derivado 1728 (Figura 1.11).

Figura 1.10. Esquemas sintéticos para la obtención de tricarbocianinas simétricas

15

16

17

16


43

El mecanismo propuesto para la reacción de formación de 15 se muestra en la

Figura 1.12.31 La reacción comienza con el ataque de la dimetilformamida sobre el oxi‐

cloruro de fósforo para formar el reactivo de Vilsmeier‐Haack, I (diclorofosfonato de

N‐clorometilen‐N,N‐dimetilamonio). El mismo se adiciona sobre el enol de la ci‐

clohexanona, II, para (luego de la adición de otra molécula de I) dar el derivado hemi‐

cianina III. La reacción posterior de adición de una nueva molécula de I seguida de un

Figura 1.11. Esquema de obtención de los precursores 15 y 17. 17 15

NO

HPClO

ClCl+

PO

ClCl

N+O

HCl-

N+Cl

HI

PO

ClCl-O

N+Cl

HI

OH

+

II

NCl

H

O+H

-HCl

O

N+HN+

Cl

HI

+

+

O

N+

N Cl

HO

N+

N+

Cl--H

O

N

N+

N+Cl

HI

H+- +

O

N+

N+

H

Cl

NH O

N+

N+

NCl- +

Cl

N+N

Cl

N+N

Cl

OHO+2H2O

-2 NH2Me2

15

IV

III

IVFigura 1.12.Mecanismo propuesto para la formación de 15.


44

ataque de cloruro sobre el carbono meso del sistema heptametino rinde la base de

Schiff derivada de la N,N‐dimetilamina, la cual se hidroliza para dar el bisaldehído 15.

Las principales ventajas de trabajar con el precursor 17 son que el producto ob‐

tenido es fácilmente cristalizable y sensiblemente más estable, pudiendo ser almace‐

nado por meses a temperatura ambiente y cubierto de la luz sin signos de descompo‐

sición. Por otro lado, el bisaldehído 15 resulta ser mucho más difícil de cristalizar del

medio de reacción y sólo puede ser almacenado por 3 semanas a ‐20°C en desecador y

bajo atmósfera de Ar. No obstante, este último mostró una mayor reactividad en la

posterior reacción de condensación con las sales cuaternarias 11, 12 o 14, ya que 17

presentó una mezcla compleja de productos que disminuye el rendimiento de la reac‐

ción. La Figura 1.10 muestra las dos condiciones de reacción utilizadas para la obten‐

ción del núcleo del fluoróforo cuyos resultados se muestran en la Tabla 1.3, en el caso

de utilizar el bisaldehído 15 se utilizaron las condiciones de Narayanan y colaborado‐

resl23 en benceno/n‐butanol dando como resultado un rendimiento de alrededor del

50% que, sin embargo puede mejorarse si se agregan molecular sieves 4Å activadas32

al medio de reacción, logrando así rendimientos de hasta un 70% . En el caso de la base

de Schiff 17 la reacción se llevó a cabo utilizando etanol absoluto como solvente y ace‐

tato de sodio anhidro obteniéndose rendimientos del 60% . El grado de avance de estas

reacciones puede ser controlado en forma sencilla debido a que reactivos y productos

son reconocibles por sus diferentes colores: rojo‐lila para la sal cuaternaria del hetero‐

ciclo, amarillo o violeta para el bisaldehído o su base de Schiff, respectivamente, y ver‐

de oscuro para la tricarbocianina simétrica formada. En todos los casos, el producto de

Heterociclo Bisaldehído Rendimiento Tricarbocianina

11 15 73%

18 17 58%

14 15 62%

19 17 48%

Tabla 1.3. Rendimientos obtenidos en la síntesis de tricarbocianinas simétricas.


45

reacción se recristaliza de éter etílico‐metanol obteniéndose la tricarbocianina corres‐

pondiente en la forma de cristales verde oscuro.

La Figura 1.13 muestra las cianinas simétricas obtenidas en este trabajo. Cabe

destacar que esta secuencia sintética puede escalarse al orden de los gramos de pro‐

ducto final, constituyendo una metodología sencilla para la síntesis de fluoróforos en la

zona NIR del espectro de radiación.

Un hecho llamativo fue que la cianina 19 dio lugar a cristales de color rojo bri‐

llantes, los cuales recuperaban el color verde correspondiente cuando eran redisuel‐

tos, p ej. en dimetilsulfóxido. En este sentido, se ensayaron diferentes solventes de

recristalización con el objeto de lograr cristales de tamaño adecuado para su análisis

por difracción de rayos X, sin embargo en todos los casos se obtuvieron cristales pe‐

queños, insuficientes para su estudio mediante dicha técnica.

En las Figuras 1.15 y 1.16 se muestran los espectros RMN‐1H de las tricarbocia‐

ninas simétricas 18 y 19. En ellos es posible identificar tres señales características de la

familia de las tricarbocianinas, dos de ellas se encuentran en la zona 6,0‐6,5ppm y 8,0‐

8,5 ppm y corresponden a los metinos de la cadena poliénica del sistema ‐conjugado.

Estas señales se pueden reconocer en forma sencilla dado que se tratan de dos doble‐

tes con una constante de acoplamiento escalar grande, correspondiente a un doble

enlace con configuración trans (JTrans≈14Hz). La otra señal característica de este tipo de

compuestos corresponde a los metilenos unidos directamente al átomo de nitrógeno

cuaternizado del heterociclo. Esta señal es un triplete que se encuentra alrededor de

Figura 1.13. Heptametincianinas simétricas obtenidas 18 y 19.


46

los 4,00‐4,50 ppm, debido al efecto inductivo que ejerce el nitrógeno adyacente defi‐

ciente en electrones, desprotegiendo el núcleo y llevando la señal a campos bajos.

Cabe destacar que los espectros RMN‐1H permiten confirmar que las tricarbo‐

cianinas 18 y 19 son simétricas y que las estructuras químicas mostradas son sólo una

representación de un híbrido de resonancia con dos formas canónicas. También se

desprende que la carga positiva correspondiente al átomo de nitrógeno cuaternizado

se encuentra deslocalizada en el sistema poliénico, permitiendo la conjugación de los

grupos donante y aceptor de electrones en los extremos de la cadena poliénica.

1.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.5

913

12 11 10 1’’

2’’

8

4 5 6

7

8

9

13

12 11

10

2’

1’’ 2’’

1’ 1

2’

4 5

6

7

1’

Figura 1.14. Espectro RMN‐1H de 18 (500MHz, solvente MeOD‐d4)

SÍNTESIS DE TRICARBOCIANINAS ASIMÉTRICAS

47

1.4. SÍNTESIS DE TRICARBOCIANINAS ASIMÉTRICAS

Las estrategias sintéticas discutidas permiten la obtención de cianinas simétri‐

cas, en las que se aprovechan las características de cada grupo funcional presentes en

las cadenas alquílicas de los átomos de nitrógeno del heterociclo (en estos casos, la

mejora de la solubilidad en agua de los grupos sulfonato o la posibilidad de marcado

de biomoléculas de los grupos carboxilo), pero sólo uno de dichos grupos funcionales

estará presente en el fluoróforo final. La síntesis de tricarbocianinas asimétricas en las

que coexistan ambos grupos funcionales sería de gran ventaja ya que no sólo permiti‐

ría contar al mismo tiempo con las propiedades de cada uno de ellos, sino que también

sería posible modular las propiedades espectrales mediante el uso de diferentes hete‐

rociclos a cada lado del núcleo de la heptametincianina.

11 12

13

1’’ 2’’

10

1

4

56

7

9

810

1112

13

1’

2’

2’’

1’’

1’2’

4 5 6

7

8 9

Figura 1.15. Espectro RMN‐1H de 19 (500MHz, solvente DMSO‐d6)


48

En la bibliografía más reciente, se han encontrado trabajos que describen la ob‐

tención de pentametincianinas asimétricas de cadena lineal,15,33‐36 en las cuales se rea‐

lizan las condensaciones sucesivas de la base de Schiff del bisaldehído correspondiente

con cada heterociclo (Figura 1.16).

El punto clave de esta estrategia consiste en la obtención del intermediario 21,

el cual puede ser aislado, para luego llevar a cabo la condensación en un segundo paso

con otro equivalente de la sal cuaternaria de un heterociclo diferente. Sólo se encon‐

traron dos trabajos de reciente publicación que extiendan esta estrategia de síntesis

con tricarbocianinas asimétricas de cadena rígida, ya sea con distintos sustituyentes en

los anillos heterocíclicos37 o diferentes cadenas alquílicas.23

En el primer caso, Pham y colaboradores aplicaron la estrategia utilizada para

los análogos de cadena lineal que se describe en la Figura 1.16 con rendimientos de

alrededor del 10% . Mediante esta estrategia sintética no solo se obtiene el fluoróforo

asimétrico, sino que los productos simétricos siempre se encuentran entre los subpro‐

ductos, disminuyendo considerablemente el rendimiento de la reacción. Con el objeto

de mejorar el rendimiento de la reacción en una escala del orden de los cientos de

Figura 1.16. Esquema sintético para la obtención de penta y heptametincianinas asimétricas de cade‐na lineal(n=2,3). R1,2= Alquilo, bencilo.

21

22

20


49

miligramos de producto final, se estudió esta estrategia sintética buscando obtener el

fluoróforo asimétrico derivado de las sales cuaternarias 11 y 14. El avance de la reac‐

ción para la obtención del derivado hemicianina se pudo comprobar en forma sencilla

mediante una CCD en fase reversa (RPC18) y utilizando una mezcla de solvente meta‐

nol‐agua (9:1) debido a la diferencia de color de los reactivos (violeta del bisaldehído

insaturado y rojo‐violáceo de los compuestos heterocíclicos), el intermediario hemi‐

cianina (azul) y la tricarbocianina simétrica o asimétrica (verde oscuro). El estudio de la

reacción de formación de la hemicianina permitió concluir que la formación de la mis‐

ma no es completa ya que la sal cuaternaria del heterociclo comienza a reaccionar con

la hemicianina a medida que esta se forma en lugar de hacerlo con la base de Schiff del

bisaldehído insaturado, obteniéndose así el fluoróforo simétrico. Por lo tanto, se dis‐

minuyó la relación molar de la sal cuaternaria y se intentó aislar el intermediario hemi‐

cianina. Se ensayaron diferentes técnicas separativas: entre ellas cristalización, croma‐

tografía en columna utilizando como fase estacionaria sílica de fase normal y reversa

(C18), alúmina ácida, neutra y básica, resinas de intercambio aniónica y catiónica,

fuertes y débiles, Sephadex LH20 y G25, Toyopearls HF‐40W en diferentes diámetros,

longitudes, flujos de solvente, etc. En todos los casos se obtuvo descomposición del

intermediario en múltiples compuestos antes de poder recuperarlo.

Debido a estos resultados, se optó por seguir la ruta sintética descripta por Na‐

rayanan y colaboradores23 (Figura 1.17), donde se informa la obtención de derivados

asimétricos de tricarbocianinas de cadena rígida utilizando una secuencia de reaccio‐

nes one‐pot. Esta estrategia involucra el uso de 2‐cloro‐1‐formil‐3‐(hidroxi‐

metilen)ciclohex‐1‐eno (15) como bisaldehído insaturado. En comparación con la es‐

trategia que utiliza una base de Schiff, se observa una menor velocidad de reacción de

condensación, lo que permite el agregado en pasos de dos bases heterocíclicas dife‐

rentes. Se informa un rendimiento del 99% para la síntesis de 23, el cual fue aislado

por simple evaporación del solvente, cristalización y lavado con éter etílico.


50

Este procedimiento fue llevado a cabo en nuestro laboratorio utilizando las sa‐

les de los heterociclos 11 y 14 y el bisaldehído 15 (Figura 1.18). En todos los casos, al

trabajar en las condiciones de la referencia 26, se obtuvo además del producto asimé‐

trico como componente principal, diversas cantidades de la tricarbocianina simétrica

derivada de la base heterocíclica sulfonada 14.

Este hecho, además de disminuir el rendimiento para la obtención del fluorófo‐

ro asimétrico, dificulta la purificación de ambas tricarbocianinas, ya que sus solubilida‐

des son muy similares imposibilitando su separación por recristalización. Por otro lado,

la cromatografía en columna en fase normal dio como resultado la descomposición de

las tricarbocianinas antes de poder aislarlas. Por lo tanto, se probaron diferentes técni‐

cas separativas, entre ellas cromatografía en columna en fase reversa (C18), fase de

alúmina básica y neutra, cromatografía líquida de alta resolución con fases estaciona‐

rias C8 y C18, utilizando diferentes solventes de elución; sin embargo, los mejores re‐

sultados se obtuvieron mediante cromatografía de exclusión por tamaño utilizando

Figura 1.17. Esquema de obtención de tricarbocianinas asimétricas de cadena rígida

15

Figura 1.18. Esquema de síntesis de la tricarbocianina asimétrica 23.

2315

14

11


51

Sephadex LH20 y ToyoPearls HF40W empleando metanol como solvente de corrida, en

columnas de 1,5 m y 0,75 m de largo, respectivamente. Con esta última se obtuvieron

los mejores rendimientos, pudiendo purificar 23 a partir de la mezcla de tricarbociani‐

nas en la escala de los cientos de miligramos. El rendimiento alcanzado se encuentra

en torno al 60% , menor al que se informan los autores en el trabajo antedicho, pero

aun así aceptable desde el punto de vista sintético.

En la Figura 1.19 se muestra el espectro RMN‐1H correspondiente a la tricarbo‐

cianina 23. Se puede observar el desdoblamiento de las señales correspondientes a los

hidrógenos en posición alfa a los nitrógenos cuaternizados (11 y 9’’), en el anillo cen‐

tral (1’’’ y 3’’’) y la cadena de polimetinos (1’,2’, 6’ y 7’) debido a la presencia de anillos

heterocíclicos diferentes en los extremos del sistema conjugado.

11 9’’

131’’’ 3’’’

13’’

12

2’’’

10’’

12’’

11’’

10 8’’

6’ 2’ 4

8

7

9

5

6,

5’’

7’’

1’ 7’6’’

1

4

56

7

8

9

10

1112

13

1’

2’ 6’

7’ 1’’

4’’

1’’’

5’’ 6’’

7’’

9’’ 10’’

11’’ 12’’

13’’

2’’’3’’’

8’’

Figura 1.19. Espectro RMN‐1H de 23 (500MHz, solvente MeOD‐d4)


52

1.5. CONCLUSIONES

En este capítulo se describió la síntesis de diferentes aza‐heterociclos cuaterni‐

zados adecuadamente funcionalizados. Estas unidades se acoplaron a 2‐cloro‐1‐formil‐

3‐(hidroximetilen)ciclohex‐1‐eno generando meso‐clorotricarbocianinas de estructuras

simétricas y asimétricas. Los compuestos resultantes se caracterizaron completamen‐

te. Cabe destacar la síntesis de una meso‐triclorocarbocianina asimétrica en la escala

de los cientos de miligramos.

BIBLIOGRAFÍA

53

1.6. BIBLIOGRAFÍA

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CAPÍTULO 2

SENSORES MOLECULARES DERIVADOS DE AMINOTRICARBOCIANINAS

CAPÍTULO 2 – SENSORES MOLECULARES DERIVADOS DE AMINOTRICARBOCIANINAS

55

2.1. INTRODUCCIÓN

Las cianinas han sido ampliamente utilizadas como marcadores fluorescentes

en estudios de elucidación de mecanismos biológicos mediante microscopías de fluo‐

rescencia, siendo una de sus principales atractivos la propiedad de ser ópticamente

activas en la zona NIR del espectro. Como se describió con anterioridad, este tipo de

radiación tiene la particularidad de poseer alta penetración en tejidos y un nivel míni‐

mo de autofluorescencia, estas características fueron aprovechadas en estudios in vivo

de marcación y sensado en células1 o animales pequeños.2‐4

Por ello, se han desarrollado múltiples sensores fluorescentes basados en tri‐

carbocianinas para diversos analitos de interés, como ser Cu2+,5 Cd2+,6 Hg2+,7 o Zn2+,8

algunos de los cuales se muestran en la Figura 2.1. Estos iones se encuentran entre los

metales pesados más abundantes en suelos y agua, por lo que su cuantificación resulta

de suma importancia ya que este tipo de contaminación es origen de problemas eco‐

lógicos y representa un riesgo significante para la salud humana.

Particularmente, el zinc es un elemento esencial que está involucrado en pro‐

cesos fisiológicos y patológicos en los organismos vivos. El ion Zn2+ es el segundo metal

de transición más abundante en el cuerpo humano, tiene un papel fundamental como

Figura 2.1. Ejemplos de sensores fluorescentes de iones basados en tricarbocianinas.

24

INTRODUCCIÓN

56

componente de un gran número de proteínas y actúa como catalizador en diversos

procesos celulares.9 Por ello, la determinación espacio‐temporal de Zn2+ en muestras

biológicas utilizando sensores fluorescentes es de gran significancia para intentar en‐

tender el rol de dicho componente en la biología molecular. Como consecuencia, el

desarrollo de nuevos sensores fluorescentes para Zn2+ ha recibido una atención consi‐

derable.10

Otro parámetro que resulta de un interés excepcional es el pH, debido al rol

crucial que tiene la acidez en sistemas biológicos. Se encuentra establecido que el pH

intra y extracelular está influenciado por diversos procesos fisiológicos y patológicos

(p.ej. un ambiente acídico puede estar asociado con el desarrollo de tumores,11 fibrosis

quística,12 asma,13 etc). Por lo tanto, se han desarrollado una gran variedad de senso‐

res fluorescentes de pH para su aplicación en microscopía de células in vivo, con espe‐

cial énfasis en un pH de trabajo de entre 5,0 y 7,5; en las cercanías del pH fisiológico.14

En todos los ejemplos citados se utiliza como precursor común la meso‐

cloroheptametincianina 24, la cual es derivatizada con el ionóforo correspondiente

mediante un único paso de reacción. Esta versatilidad hace de las tricarbocianinas una

familia de fluoróforos muy atractiva para el desarrollo de bibliotecas de marcadores

y/o sensores fluorescentes activos en la zona NIR del espectro de radiación (Figura

2.1).

La sustitución del átomo de cloro en la posición meso de la cadena de polimeti‐

nos por un átomo de nitrógeno conlleva un cambio abrupto en las propiedades ópticas

de los fluoróforos (p.ej. un gran desplazamiento hipsocrómico de las bandas de absor‐

ción y un excepcional aumento del corrimiento de Stokes) que son aprovechadas en el

desarrollo de nuevas sondas para la cuantificación y marcación específica de analitos

en estudios de microscopía de fluorescencia.15

En este capítulo se describirá la síntesis y caracterización de dos nuevos senso‐

res fluorescentes activos en la zona NIR del espectro de radiación. Uno de ellos fue


57

diseñado para la detección de Zn2+ en soluciones acuosas, el cual está basado en una

tricarbocianina simétrica sulfonada. El segundo sensor fue diseñado para la detección

de pH en el rango fisiológico, el mismo está basado en una tricarbocianina asimétrica

con el objetivo de aprovechar las propiedades de dos grupos funcionales diferentes, en

este caso el aumento de la solubilidad en agua que proporciona un grupo sulfonato y

la posibilidad de conjugación a biomoléculas que ofrece un grupo carboxilo. Asimismo,

fue sintetizada una tricarbocianina biotinilada para estudiar los efectos de la conjuga‐

ción del fluoróforo sobre biomoléculas.

2.2. SÍNTESIS DE SONDAS FLUORESCENTES DERIVADAS DE TRICARBOCIANINAS

Como se detalló anteriormente, la versatilidad de intermediarios como el 24

permite obtener una familia de compuestos fluorescentes a partir de un precursor

común mediante un único paso de reacción. Esta transformación se lleva a cabo me‐

diante el tratamiento de la meso‐clorotricarbocianina correspondiente con un nu‐

cleófilo en dimetilformamida como solvente de reacción (Figura 2.2).

Esta reacción es consistente con una Sustitución Nucleofílica Aromática Radica‐

laria (SRN1).16 El mecanismo aceptado para este tipo de reacciones se muestra en la

Figura 2.3, e involucra una etapa inicial de transferencia electrónica desde el reactivo

que genera un radical libre (Ecuación [2.1]), el cual se fragmenta eliminando el grupo

saliente como un anión (Ecuación [2.2]). En la etapa de propagación, el catión radical

formado reacciona con el nucleófilo (Ecuación [2.3]) para producir un nuevo radical

Figura 2.2. Esquema de obtención de derivados de tricarbocianinas sustituidos en la posición meso.

25

PROPIEDADES ESPECTROSCÓPICAS DE DERIVADOS N‐SUSTITUIDOS

58

que finalmente genera el producto de sustitución por transferencia electrónica con

una nueva molécula de sustrato (Ecuación [2.4]), cerrando la etapa de propagación.

Esta reacción fue utilizada para la obtención de una familia de tricarbocianinas

estructuralmente relacionadas, con el objetivo de desarrollar sensores fluorescentes

de pH y Zn2+ y estudiar la fotofísica de estos fluoróforos cuando interactúan con bio‐

moléculas (Figura 2.4).

2.3. PROPIEDADES ESPECTROSCÓPICAS DE DERIVADOS N‐SUSTITUIDOS

Como se detalló con anterioridad, la introducción de un átomo de nitrógeno en

la posición meso del esqueleto de las tricarbocianinas lleva aparejado un cambio brus‐

co en sus propiedades espectroscópicas, los cuales se ven reflejados en la Figura 2.5.

Los espectros de absorción y emisión del derivado N‐sustituido son más anchos,

pierden resolución y no guardan una relación especular entre sí. Además, la longitud

de onda correspondiente al máximo de absorción muestra un gran desplazamiento

Figura 2.3.Mecanismo propuesto para la Sustitución Nucleofílica Aromática Radicalaria.14

[2.1]

[2.3] [2.2]

[2.4]

Figura 2.4. Aminotricarbocianinas sintetizadas para reconocimiento específico (26), y como sensores fluorescentes de Zn2+ (27) y de pH (28).

26

27 28


59

hipsocrómico (desde 820 nm a 660 nm). Este efecto no es tan pronunciado en el es‐

pectro de emisión (desde 830nm a 790nm), lo que redunda en un fuerte impacto en el

corrimiento de Stokes, que se incrementa notablemente (de 10 nm a 130 nm). Estos

cambios en las propiedades espectroscópicas sólo se observan si el sustituyente en la

posición meso es un átomo de nitrógeno, y no se advierten si la sustitución es por un

átomo de oxígeno o azufre (los cuales retienen las propiedades ópticas de los deriva‐

dos clorados). Recientemente se han llevado a cabo estudios que atribuyen estos fe‐

nómenos a una transferencia intramolecular de carga (Intramolecular Charge Transfer,

ICT) que posee un rendimiento cuántico excepcionalmente elevado.15,17

Las reacciones de transferencia electrónica son uno de los procesos fotoquími‐

cos elementales más importantes en química y biología.18,19 Hace más de cinco déca‐

das que Mulliken20 introdujo el concepto de transición de transferencia de carga

(Charge Transfer, CT) para referirse a una excitación directa a un estado en el que un

electrón se transfiere desde un grupo donante (D) a uno aceptor (A). Un caso particu‐

lar son las denominadas reacciones de transferencia intramolecular de carga que tie‐

19 26

Figura 2.5. Espectros de absorción (■) y emisión (�) para tricarbocianinas sustituidas en la posición meso con un átomo de cloro (a, 19) o de nitrógeno (b, 26) en PBS.

400 600 800 10000.0

0.5

1.0

Longitud de onda (nm)400 600 800 1000

0.0

0.5

1.0


a. b .


60

nen lugar cuando los grupos donante y aceptor coexisten en la misma molécula y están

conjugados mediante un sistema π. Luego de una excitación electrónica al estado S1,

denominado “estado localmente excitado” (LE) de tipo (π‐π*), puede establecerse un

estado transferencia intramolecular de carga (ICT) donde el grupo donante cede un

electrón al grupo aceptor a través del sistema conjugado, produciéndose una separa‐

ción neta de cargas (Figura 2.6). Posteriormente, el sistema puede emitir radiativa‐

mente desde cualquiera de estos dos estados, de forma que en el espectro de fluores‐

cencia se observen dos bandas de emisión.

Un ejemplo característico de este proceso es el N,N‐dimetil‐4‐aminobenzoni‐

trilo (DMABN, Figura 2.7.a), esta molécula ha sido objeto de extensos estudios, dado

Figura 2.6. Esquema de los procesos de transferencia de estados.

E

Coordinada de reacción

EstadoLE

Estado TICT


IF Hexano THF b.

a. c.

29

Figura 2.7. a. Estructura química de DMABN. b. Espectros de emisión para DMABN en hexano y en tetrahidrofurano. c. Diagrama de energía potencial de DMABN. (Adaptado de ref 19).


61

que a pesar de su simplicidad estructural, presenta dos picos de emisión en solventes

polares (Figura 2.7.b).

Este fenómeno fue estudiado extensivamente por Lippert y colaboradores.21 En

el estado fundamental, la molécula es casi plana, ya que de este modo la deslocaliza‐

ción electrónica entre los electrones del grupo dimetilamino y el anillo de fenilo es

máxima. De acuerdo con el principio de Frank‐Condon, el estado localmente excitado

(LE), todavía es plano inmediatamente después de la excitación. Entonces tiene lugar la

relajación por el disolvente, junto con una rotación concomitante del grupo dimetila‐

mino hasta que alcanza un ángulo en el que la deslocalización es nula. Esto lleva a una

situación denominada estado de Transferencia Intramolecular de Carga con Torsión

(Twisted Intramolecular Charge Transfer, TICT) en la que la separación de cargas es

total entre el grupo diamino y el cianofenilo (Figura 2.7.c). Este estado se verá muy

favorecido en un solvente polar (p.ej. THF), donde en el espectro de fluorescencia la

banda debida a la emisión del estado LE (la banda “normal”) estará acompañada por

otra banda a una longitud de onda mayor, debida a la emisión del estado TICT (banda

“anómala”) como se muestra en la Figura 2.7.b. Sin embargo, en solventes no polares

el estado TICT no estará estabilizado por el solvente y el espectro de emisión de 29

sólo mostrará la banda debida al estado LE.

El proceso de transferencia electrónica se suele representar como un perfil de

reacción en el que para transición electrónica vertical el estado de menor energía co‐

rresponde a LE mientras que el ICT se localiza a una energía mayor. En una cierta re‐

gión de las superficies de energía potencial, estos dos estados excitados se invierten y

el estado de transferencia de carga se estabiliza frente al localmente excitado (Figura

2.8). De esta manera, si el estado ICT es menos estable que el LE o la barrera energéti‐

ca para el paso de LE→ICT es demasiado elevada, se obtendrá en el espectro de emi‐

sión sólo un pico de fluorescencia, denominado “banda normal” (Figura 2.8.a). Para

poder observar la fluorescencia desde el estado ICT es necesario que los cambios elec‐

trónicos que se produzcan en este proceso, así como los factores de entorno que in‐


62

tervengan, se encuentren favorecidos tanto termodinámica como cinéticamente (Figu‐

ra 2.7.b).

El análisis de los espectros de absorción y emisión de las tricarbocianinas N‐

sustituidas (Figura 2.5) permite observar que no existe una relación de simetría entre

ellos (p.ej. el ancho de pico a media altura de las bandas de absorción y emisión son de

2972 cm‐1 y 1544 cm‐1, respectivamente). Esto indica que existe un cambio en la geo‐

metría entre las especies que absorben y que emiten energía,22 algo usual en los pro‐

cesos de transferencia electrónica. Recientemente, se ha probado que las tricarbocia‐

ninas tanto en su estado fundamental como en el estado localmente excitado poseen

una geometría piramidal en torno al átomo de nitrógeno en posición meso de la cade‐

na de polimetinos, la cual pasa a una forma plana en el estado ICT (Figura 2.9).15

a. b.

Figura 2.7. Esquemas fotofísicos para los procesos de transferencia electrónica intramolecular

a. b.

Figura 2.8. a. Geometría piramidal del átomo de nitrógeno central para el estado fundamental y LE de tricarbocianinas. b. Configuración plana para el estado excitado de tipo ICT.


63

Esta conclusión fue confirmada mediante diferentes experimentos realizados

para la aminotricarbocinanina 30 en solventes polares de alta viscosidad (p.ej. glicerol),

donde se observó que la velocidad de transferencia de carga desde el estado LE al ICT

disminuye debido a que la molécula retiene la geometría piramidal en el estado exci‐

tado por la alta viscosidad del solvente y, entonces, la emisión sólo proviene desde el

estado LE (Figura 2.9).15

Asimismo, Nagano y colaboradores encontraron que la longitud de onda de

máxima absorción está relacionada con la naturaleza de los sustituyentes presentes en

el átomo de nitrógeno central en las aminocarbocianinas.8 El estudio permitió concluir

que al disminuir la densidad electrónica en el átomo de nitrógeno disminuye la energía

de la transición electrónica y, por lo tanto, aumenta la longitud de onda del máximo de

absorción del fluoróforo. Este resultado está de acuerdo con la teoría clásica de Khun

para fluoróforos basados en polimetinos:23 en las heptametincianinas la densidad elec‐

trónica en el átomo de carbono en posición meso de la cadena de polimetinos es baja

para el orbital HOMO y resulta alta para el orbital LUMO; de esta manera, los grupos

sustituyentes en el átomo de nitrógeno central que sean atractores de electrones afec‐

tarán esencialmente al orbital LUMO, estabilizándolo, y no tanto al HOMO, dando lu‐

gar a un desplazamiento batocrómico. Asimismo, el postulado predice el efecto opues‐

to para el caso de sustituyentes atractores de electrones. La teoría de Kuhn ha sido

verificada en diversos estudios.24 En la Figura 2.10 se muestran los orbitales HOMO y

LUMO para la aminotricarbocianina 27 utilizando el método DFT al nivel de teoría


Intensidad

゜Exc=490nm% glicerol 100% 90% 80% 70% 0%

30

Figura 2.9. Espectros de emisión de 30 en etanol en presencia de diferentes cantidades de glicerol.

TRICARBOCIANINAS COMO MARCADORES ESPECÍFICOS

64

B3LYP 6311+(2d), donde se observa la diferencia de densidad electrónica en la posición

meso del sistema conjugado para cada orbital. Este resultado provee una herramienta

para el diseño de sensores fluorescentes, basados en la diferencia de la capacidad do‐

nante de electrones del átomo de nitrógeno central cuando está unido o no al analito

de interés.

2.4. TRICARBOCIANINAS COMO MARCADORES ESPECÍFICOS

La marcación de biomoléculas y estructuras subcelulares con compuestos fluo‐

rescentes es una herramienta de uso común en laboratorios de biología molecular pa‐

ra el estudio estático y dinámico de proteínas, ácidos nucleicos, receptores y transduc‐

ción de señales, procesos celulares, etc, ya sea conjugados directamente o a anticuer‐

pos específicos.

El marcado de biomoléculas se logra mediante el uso de grupos reactivos ade‐

cuados como ser ácido carboxílico, amino, tiol, etc. Sin embargo, entre ellos sólo el

grupo carboxilo resulta ser inerte frente a las condiciones de reacción involucradas en

la síntesis de tricarbocianinas sin la necesidad de hacer uso de la química de grupos

protectores. No obstante, la marcación directa de receptores o subestructuras celula‐

res no es posible debido a la gran cantidad de grupos reactivos presentes tanto en el

citoplasma como en los tejidos celulares. En estos casos, se hace uso de sistemas de

HOMO LUMO

Figura 2.10. Orbitales HOMO y LUMO para la aminotricarbocianina 27 utilizando el método DFT B3LYP‐6311G+(2d).


65

marcadores específicos que frecuentemente requiere de modificaciones genéticas de

la biomolécula blanco. Otra forma de lograr especificidad sin necesidad de alterar la

biomolécula de interés o recurrir a sondas sofisticadas es utilizar a sistemas conocidos

de ligando‐receptor. El sistema biotina‐estreptavidina es de los más ampliamente utili‐

zados debido a que se trata de una unión de alta afinidad y estabilidad, y se encuentra

perfectamente caracterizado, por lo que es empleado como sistema modelo de inter‐

acción ligando‐receptor.25

La unión biotina‐avidina es la interacción biológica conocida más fuerte entre

un ligando y una proteína (Kd = 1,3 x 10‐15 M a pH 5,0). La biotina (también conocida

como vitamina H, Figura 2.12) es una molécula pequeña, hidrofóbica que funciona

como coenzima de carboxilasas, se encuentra involucrada en la gluconeogénesis y en

la síntesis de ácidos grasos, isoleucina y valina. La estreptavidina (SAv) es una proteína

que se aísla a partir del cultivo de Streptomyces avidinii, es un análogo tetramérico no

glicosilado de la avidina con un peso molecular de 52,8 kDa (Figura 2.12).26 Al igual que

la avidina, cada molécula de estreptavidina tiene la capacidad de unir 4 moléculas de

biotina, con una constante de disociación similar (Kd = 4 x 10‐14 M). Las dos proteínas

sólo tienen un 33% de homología en su secuencia, sin embargo sus estructuras secun‐

darias, terciarias y cuaternarias son esencialmente equivalentes. A pesar de que la avi‐

dina posee una mayor afinidad por la biotina, en general la estreptavidina suele pre‐

sentar menos problemas con la señal de fondo.

Figura 2.11. Panel izquierdo. Estructura química de la biotina. Panel derecho. Estructura cristalográ‐fica de estreptavidina conjugada con dos moléculas de biotina.24


66

El sistema biotina‐estreptavidina se encuentra extensamente difundido en apli‐

caciones de biología molecular y bionanotecnología debido a la resistencia del conju‐

gado frente a solventes orgánicos, desnaturalizantes (p.ej. cloruro de guanidinio), de‐

tergentes (p.ej. SDS, Triton), enzimas proteolíticas y condiciones de temperatura y pH

extremas. Sin embargo, la unión de un fluoróforo biotinilado a proteínas como la es‐

treptavidina puede alterar las propiedades fluorescentes de la sonda27 a menos que se

utilice un espaciador suficientemente largo, aunque con el consecuente aumento de la

velocidad de disociación.28 Se han reportado casos de apagamiento (quenching) debi‐

do a la presencia de los aminoácidos triptofano y tripsina.29 Además, debido al confi‐

namiento espacial sobre la superficie de la biomolécula se pueden dar interacciones

entre fluoróforos, p.ej. se ha reportado que para cianinas unidas a cadenas de ADN

tiene lugar la formación de dímeros y agregados sobre la superficie de la biomacromo‐

lécula.30

En la Figura 2.13 se muestra la síntesis de una tricarbocianina biotinilada solu‐

ble en agua (26). Para tal fin, el precursor clorado 19 y la (+)‐biotinil‐3,6‐dioxaoc‐

tanodiamina comercial (NH2‐PEG2‐Biotina, Pierce) se hacen reaccionar en DMF, a tem‐

peratura ambiente y en presencia de trietilamina. El compuesto 26 se obtuvo con un

63% de rendimiento con un máximo en el espectro de absorción a 660nm (33.600 M‐

1cm‐1) y en el de emisión a 790 nm (Exc 660 nm, φFl = 0,05) en PBS.

19 26Figura 2.12. Síntesis de la tricarbocianina simétrica biotinilada 26.


67

El espectro RMN‐1H de 26 muestra las señales características de los compues‐

tos biotinilados, dos dobles dobletes correspondientes a los hidrógenos cabeza de

puente en el sistema bicíclico de la biotina (Figura 2.13, señales a y b) y el multiplete

correspondiente al metino donde se une la cadena alifática de la biotina en el sistema

bicíclico de la misma (Figura 2.13, señal c).

En la Figura 2.14 se comparan los espectros de absorción UV‐visible de 26 en

solución y conjugada con SAv, se observa una disminución considerable de la absor‐

bancia y un corrimiento batocrómico del máximo de 20 nm. El coeficiente de extinción

molar de 26 en solución resulta ser un 50% mayor que en el conjugado con la proteína.

Este comportamiento ya fue reportado para otras cianinas conjugadas a biomoléculas

y ha sido atribuido a interacciones entre fluoróforos (p.ej. dimerización).27

Figura 2.13. Espectro RMN‐1H de 26 (500 MHz, solvente MeOD‐d4). Inset: Señales características correspondientes a biotina.

ab

a bc

c


68

Dado que la mayoría de los derivados biotinilados de fluoróforos sufren un

apagamiento de su fluorescencia luego de unirse a SAv, se estudió el comportamiento

de 26 frente a la conjugación con la proteína. Dado que la cinética de asociación es

suficientemente rápida, se llevó a cabo una titulación de una solución de SAv mediante

agregados sucesivos de 26 cada 3min (Figura 2.15). Se observa un quencheo del 40%

para el complejo en relación 4:1 (26/SAv), que es la mitad del valor observado para la

comercialmente disponible 4‐biotinfluoresceina.31 A pesar de este apagamiento, la

fluorescencia residual para el conjugado proteína‐fluoróforo es suficiente para la de‐

Figura 2.15. Titulación de estreptavidina con 26 (●), el control se realizó en ausencia de proteína (■) en PBS. ゜Exc = 650 nm

0 2 4 6 8 10

0

50

100

150

200

Inte

nsid

ad 7

90 n

m (

U.A

.)

[26]/[SAv]

exc = 650 nm

500 600 700 800 9000.00

0.05

0.10

Abs

orba

ncia

Longitud de onda (nm)Figura 2.14. Cambios en el espectro de absorción de una solución 3,6 ´M de 26 cuando se incuba con 0 (■), 1, 2, 3, 4 y 7 (●) equivalentes de estreptavidina en PBS.


69

tección en experimentos de fluorescencia. El perfil de la titulación resultó ser similar al

reportado para otros conjugados de fluoróforos biotinilados, mostrando un incremen‐

to de la intensidad de fluorescencia en la zona de 0‐2 equivalentes de 26 respecto a

SAv, seguido de una leve disminución en la emisión hasta llegar al máximo apagamien‐

to con 4 equivalentes del fluoróforo. Luego comienza una zona de crecimiento lineal

de la intensidad de fluorescencia con una pendiente igual a la mostrada por la muestra

control, lo que indica la ausencia de unión inespecífica significativa entre 26 y la pro‐

teína, lo cual fue comprobado mediante una titulación de estreptavidina presaturada

con biotina, donde no se observó apagamiento del fluoróforo.

Las propiedades del fluoróforo biotinilado 26 en el microscopio de fluorescen‐

cia y su especificidad frente a la conjugación con estreptavidina fueron puestas a prue‐

ba mediante el uso de partículas magnéticas recubiertas con estreptavidina comercia‐

les (DynaBeads M‐280, Life Technologies). Estas partículas están compuestas de un

material superparamagnético, tienen un diámetro de 2,8 µm y poseen una monocapa

de estreptavidina unida covalentemente a su superficie. Las partículas fueron incuba‐

das durante 10 minutos con una solución 10 nM de 26 en PBS, luego se aplicó un cam‐

po magnético para separar las partículas, y se procedió a lavarlas con PBS para eliminar

el fluoróforo no unido. Por último se colocaron las partículas marcadas en un sistema

portaobjetos multicavidad y se tomaron imágenes en un microscopio de fluorescencia

de campo amplio (Olympus IX‐71), Figura 2.16. Como control negativo, con el objeto

de evaluar la magnitud de interacciones inespecíficas, se preincubaron las esferas

Figura 2.16. a. Portaobjetos multicavidad (Hamamatsu). b. Esferas superparamagnéticas recubiertas de estreptavidina DynaBeads M280 (Life Technologies).

a. b.


70

magnéticas con una solución de biotina 10 ´M, y luego con una solución 10nM de 26.

De esta manera, se bloquean los sitios activos de las estreptavidinas en la superficie de

las partículas antes de la conjugación del fluoróforo. Por lo tanto, si se observara algu‐

na señal fluorescente en dicha muestra, se debería a interacciones inespecíficas entre

la proteína y la tricarbocianina biotinilada 26.

En la Figura 2.17 se muestran las imágenes de fluorescencia y transmisión ob‐

tenidas para las muestras del fluoróforo y el control. Puede concluirse que no existen

interacciones inespecíficas entre la tricarbocianina biotinilada y las proteínas en la su‐

perficie de las esferas.

Figura 2.17. a. Marcado de esferas magnéticas recubiertas con estreptavidina. b. Control negativo. El panel superior muestra las imágenes de fluorescencia, el panel inferior la imagen DIC.

a b

Fluorescencia DIC


71

2.5. TRICARBOCIANINAS COMO SENSORES DE PH

Como se discutió en la Sección 2.3, las tricarbocianinas nitrogenadas en la posi‐

ción meso de la cadena de polimetinos pueden ser utilizados como sensores de pH. El

rango dinámico de estos sensores se encuentra entre pH 4 y 6, ya que el pKa de las

tricarbocianinas sustituidas con monoaminas primarias se encuentra alrededor de 4,9.

Recientemente se ha publicado un trabajo donde se llevó a cabo un diseño racional de

sondas de pH basadas en tricarbocianinas N‐sustituidas, con el objetivo de ajustar el

valor de pKa del fluoróforo y, por lo tanto, el rango dinámico del sensor.14 En dicho

trabajo, Nagano y colaboradores sintetizaron tricarbocianinas N‐sustituidas con dife‐

rentes piperazinas y etilendiaminas, de manera de formar una estructura supramole‐

cular que coordine un protón entre ambos átomos de nitrógeno (Figura 2.18).

Cuando se utilizó la N‐metilpiperazina como sustituyente en la cadena de poli‐

metinos, se obtuvo un sensor de pH fluorescente en la zona NIR del espectro de radia‐

ción con un pKa de 6,80, que resulta adecuado para su utilización en sistemas in vivo

dado su cercanía al pH fisiológico.

A la luz de estos resultados, se decidió llevar a cabo la síntesis de un sensor de

pH basado en una tricarbocianina asimétrica, con el objeto de desarrollar un fluoróforo

soluble en agua con la capacidad de anclaje a un objetivo como ser una proteína, su‐

perficie, etc. Para tal fin, se llevó a cabo el acoplamiento entre la heptametincianina 23

y N‐metilpiperazina (Figura 2.19).

Figura 2.18. Equilibrio ácido base propuesto para tricarbocianinas N‐sustituidas con 1,2‐diaminas.

TRICARBOCIANINAS COMO SENSORES DE PH

72

Se obtuvo el fluoróforo con un 45% de rendimiento como un sólido azul oscuro,

con un coeficiente de extinción molar de 65.000 M‐1cm‐1, y presenta un máximo en el

espectro de absorción a 650 nm y en el espectro de emisión a 805 nm (Exc 650 nm,

φFl = 0,04) en PBS 10 mM, pH 9,00.En la Figura 2.20 se muestra el espectro RMN‐1H de

28, donde se observan las señales correspondientes a la N‐metilpiperazina.

bc

a

b

c a

Figura 2.20. Espectro RMN‐1H de 28 (500 MHz, solvente MeOD‐d4). Se muestran las señales corres‐pondientes a la N‐metilpiperazina.

23 28

Figura 2.19. Síntesis de aminotricarbocianina asimétrica sensible al pH, 28.


73

Para analizar el comportamiento de la aminotricarbocianina 28 frente a cam‐

bios en el pH del medio, se llevó a cabo una titulación de una solución 230 nM en PBS

10 mM. Si se analizan los cambios en el espectro de absorción de una solución de 28

en función del pH del medio (Figura 2.21), se observa un desplazamiento batocrómico

de 83 nm con la acidificación del solvente. Este comportamiento puede explicarse me‐

diante la teoría de Kuhn (vista en la sección 2.3), basada en la diferente capacidad do‐

nante de electrones del átomo de nitrógeno en posición meso de la cadena de polime‐

tinos cuando la aminocarbocianina se encuentra protonada o no. Para este tipo de

tricarbocianinas, la densidad electrónica en el átomo de carbono central en la cadena

de polimetinos es alta en el orbital LUMO y baja para el HOMO (Figura 2.11); por ello,

si el pH del medio es inferior al pKa del fluoróforo, el átomo de nitrógeno se encuentra

protonado y, entonces, disminuye su capacidad donante de electrones. Este efecto es

más importante para el orbital LUMO (disminuyendo su energía) que para el HOMO,

como consecuencia disminuye la diferencia de energía entre ambos estados electróni‐

cos y la energía de la transición electrónica es menor, dando lugar a un corrimiento

batocrómico en el máximo de absorción.

En la Figura 2.22 se muestran los cambios en la posición del máximo de absor‐

ción en función del pH del medio (panel izquierdo) y la variación en la absorbancia a

600 700 8000.00

0.02

0.04

Abs

orba

ncia


Figura 2.21. Espectros de absorción de una solución 830 nM de 28 en PBS a diferentes valores de pH.

pH 10,34

pH 2,53

TRICARBOCIANINAS COMO SENSORES DE PH

74

[2.5] Aa a

B

[B] x xpH pK log pK log

[A] x x

650nm a diferentes valores de pH. Los puntos obtenidos se ajustan a la función de

Henderson‐Hasselbach, según se muestra en la ecuación [2.5].

donde x, xA y xB corresponden a la señal obtenida para la muestra y las especies

ácida y básica, respectivamente. Se obtuvo un valor de pKa del sensor para cada curva,

los cuales resultaron ser de 6,1±0,2 para el desplazamiento de los máximos de absor‐

ción y de 6,75±0,06 para el caso del cambio en la absorbancia en función del pH. Am‐

bos valores son congruentes entre sí y cercanos al valor informado para sensores simi‐

lares.14 Este valor de pKa para sensores fluorescentes en las cercanías del pH fisiológico

son óptimos para determinaciones in vivo.

Conjuntamente, se llevó a cabo la titulación adquiriendo los espectros de emi‐

sión en función del pH del medio para una solución 830 nM de 28 en PBS (Figura 2.23).

Se observó que a medida que el medio se acidifica hay un corrimiento batocrómico en

el espectro de emisión, aunque en este caso sólo es de 12 nm.

2 4 6 8 10660

680

700

720

740

Max

Abs

(nm

)

pH2 4 6 8 10

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

Abs

orba

ncia

650n

m

pH

pKa = 6,75±0,05

R2=0,996

pKa = 6,1±0,2

R2=0,982

a. b.

Figura 2.22. Curvas de calibrado para una solución 830 nM de la tricarbocianina 28 en PBS 10mM. a. Desplazamiento en el máximo de absorción. b. Cambio en la absorbancia a 650nm.


75

En la Figura 2.24.a muestra las variaciones en el máximo de emisión de fluores‐

cencia en función del pH del medio, mientras que en la Figura 2.24.b se muestran los

cambios en la intensidad de fluorescencia a 805nm (Exc = 650nm) a diferentes valores

de pH. El ajuste de los valores obtenidos a la ecuación [2.5] permitió determinar el pKa

del sensor, que resultó ser de 6,7±0,1.y de 6,50±0,15, para el ajuste a partir de los da‐

tos de cambio de longitud de onda de máxima emisión y de cambios en la intensidad

de emisión, respectivamente.

4 6 8 10798

801

804

807

810

813

Max

Fl (n

m)

pH4 6 8 10

10

20

30

40

50

60

Inte

nsid

ad d

e F

luor

esce

ncia

805n

m (

U.A

.)

pH

Figura 2.24. Resultados obtenidos para una titulación de una solución 830 nM de 28 en PBS 10mM en función del pH del medio, Exc 650 nm. a. Corrimientos en el máximo de emisión. b. Cambios en la intensidad de fluorescencia.

a. b.

pKa = 6,50±0,15

R2=0,986

pKa = 6,7±0,1

R2=0,992

Figura 2.23. Espectros de emisión de una solución 830 nM de 28 en PBS a diferentes valores de pH, desde 2,53 (●) a 11,25 (■). Exc = 650 nm.

750 800 850 9000

20

40

60

Inte

nsid

ad (

UA

)


TRICARBOCIANINAS COMO SENSORES DE ZN(II)

76

2.6. TRICARBOCIANINAS COMO SENSORES DE ZN(II)

Como parte de un esfuerzo permanente por desarrollar nuevas herramientas

para el estudio de Zn2+ hemos sintetizado un sensor fluorescente basado en aminotri‐

carbocianinas. Como agente quelante del metal de transición se ha utilizado la N,N‐

di(2‐picolil)etilendiamina (DPEN,Figura 2.25, 33). Esta unidad de reconocimiento ya ha

sido utilizada con éxito en diferentes sensores fluorescentes para estudios in vivo, de‐

bido a su selectividad frente a otros metales alcalinos y alcalinos térreos que son

abundantes en el medio celular.8,32 El compuesto 33 fue preparado a partir de etilen‐

diamina en dos pasos de reacción.

El precursor 32 obtenido fue conjugado con la tricarbocianina simétrica 19 para

obtener el sensor fluorescente 27 (Figura 2.26), el cual fue purificado mediante croma‐

tografía de exclusión por tamaños utilizando Sephadex LH20 como fase estacionaria y

N+ N

HN

-O3SSO3-

N

N

N

X

N+ N

-O3SSO3-

X

Cl

X

DMF, Et3N

Figura 2.26. Síntesis del sensor fluorescente de Zn2+ basado en tricarbocianinas asimétricas. 19 27

33

Figura 2.25. Ruta sintética para la obtención del resto N,N‐di(2‐picolil)etilendiamina.

31 3233

50% 65%


77

metanol como solvente de corrida.

El sensor fluorescente 27 se obtuvo como un sólido azul oscuro con un 53% de

rendimiento, presenta un coeficiente de extinción molar de 61.000 M‐1cm‐1, muestra

un máximo de absorción en 700nm y un máximo de emisión en 800nm (Exc=700nm,

φFl = 0,02).

En la Figura 2.27 se presenta el espectro RMN‐1H obtenido para 27, donde se

muestran algunas señales características del resto N,N‐di(2‐picolil)etilendiamina.

En la Figura 2.28 se observan los cambios en el espectro de absorción para una

solución 1,96 ´M de 27 en buffer HEPES 100mM, 150mM NaCl, pH 7,4 con el agregado

de ZnCl2 en el mismo buffer. Puede observarse que existe un desplazamiento bato‐

crómico de alrededor de 20nm a medida que aumenta la relación [Zn2+]/[27].

a

b

d

c

a

b

c

d

Figura 2.27. Espectro RMN‐1H de 27 (500MHz, solvente MeOD‐d4). Se muestran las señales caracterís‐ticas correspondientes al resto DPEN.


78

Dicho corrimiento se analiza en detalle en la Figura 2.29.a, donde puede obser‐

varse que el aumento en la longitud de onda del máximo de absorción tiene lugar has‐

ta la relación molar de catión/sensor 1:1, estabilizándose luego en un valor de 718 nm.

Este comportamiento también puede explicarse según lo visto en la sección 2.3: cuan‐

do la N,N‐di(2‐picolil)etilendiamina se coordina con el ion metálico decrece la densidad

electrónica sobre la unidad DPEN, disminuyendo entonces la habilidad donora de elec‐

trones del átomo de nitrógeno unido directamente a la cadena de polimetinos del

fluoróforo.

Figura 2.29. Resultados obtenidos para la titulación de una solución 1,96M de 27 con ZnCl2. a. Desplazamiento batocrómico del máximo de absorbancia. b. Cambios en la absorbancia a 725nm.

a. b.

0 1 2 3 40.10

0.12

0.14

Abs

orba

ncia

725

nm

[Zn2+]/[27]0 1 2 3 4

700

705

710

715

720

Max

Abs

(nm

)

[Zn2+]/[27]

Figura 2.28. Cambios en los espectros de absorción de una solución 1.96 ´M de 27 en buffer HEPES 100 mM con el agregado de Zn2+. (■) 0 Eq Zn2+, (●) 1 Eq Zn2+,(▲) 4 Eq Zn2+.

400 500 600 700 800 9000.00

0.05

0.10

0.15

Abs

orba

ncia



79

En la Figura 2.29.b se muestran los cambios en la absorbancia en función de la

relación molar ion metálico/sensor. Puede observarse que existe un cambio gradual en

la absorbancia hasta llegar a una relación 1:1 de [Zn2+]/[27], en ese punto se alcanza un

plateau a partir del cual no hay más incrementos en la absorbancia.

Asimismo, se llevó a cabo la titulación de una solución 1,96 M del sensor 27,

monitoreando los espectros de emisión de fluorescencia (Exc = 650nm), los cuales se

muestran en la Figura 2.30.

Se observa, nuevamente, un desplazamiento batocrómico de alrededor de

20nm del máximo de emisión y una disminución en la intensidad de la emisión a

785 nm con el agregado de ZnCl2, el cual se muestra en detalle en la Figura 2.31.

Se determinaron los valores de constante de disociación para el sensor. A partir

de los datos obtenidos se llevó a cabo el cálculo del cambio fraccional, el cual se deta‐

lla en la ecuación [2.6].

[2.6] 0

sat 0

X XF

X X

Figura 2.30. Cambios en el espectro de emisión para una solución de 1,96M de 27 en buffer HEPES 100 mM con el agregado de ZnCl2. (■) 0 Eq Zn2+, (●) 1 Eq Zn2+,(▲) 4 Eq Zn2+., Exc = 650nm.

700 750 800 850 9000

20

40

60

80

100

Inte

nsid

ad (

UA

)



80

donde X es el valor de la señal observada, X0 es la señal inicial del sistema sin el

analito y Xsat es la señal en el punto de saturación. Luego se ajustan los valores obteni‐

dos al modelo propuesto en la ecuación [2.7], según trabajos previos.33

Mediante los datos extraídos de los espectros de emisión, se obtuvo un valor

de constante de disociación con Zn2+ de 330±30 nM para 27 (Figura 2.32.a). El valor de

Kd calculado a partir de los espectros de absorción fue de 300±40 nM (Figura 2.32.b),

siendo los resultados consistentes entre sí.

0 2 4 6 8 100.0

0.5

1.0

Cam

bio

frac

cion

al F

l 805n

m

[Zn2+] (M)

Kd = 330±30 nM R2 = 0,998

0 2 4 6 80.0

0.5

1.0

Cam

bio

frac

cion

al A

bs65

0nm

[Zn2+] (M)

Kd = 300±40 nM R2 = 0,989

a. b.

Figura 2.32. Determinación de las constantes de disociación del sensor 27.

2

max min

2

R Zn R KdF

Kd Zn[2.7]

Figura 2.31. Resultados obtenidos para la titulación de una solución 1,96M de 27 con ZnCl2, Exc = 650nm a. Desplazamiento batocrómico del máximo de emisión. b. Cambios en la intensidad de emisión a 785nm.

0 1 2 3 4 5

20

40

60

Inte

nsid

ad d

e F

luor

esce

ncia

785n

m (

UA

)

[Zn2+]/[X]

a. b.

0 1 2 3 4 5

785

790

795

800

805

810 M

ax F

l (nm

)

[Zn2+]/[X] [Zn2+]/[27] [Zn2+]/[27]


81

Los valores de Kd para sensores fluorescentes ya reportados de Zn(II) que po‐

seen DPEN como unidad de reconocimiento se encuentran en el orden del subnano‐

molar(Figura 2.33.a y b).34,35 Nagano y colaboradores8 describieron el desarrollo de un

sensor fluorescente basado en tricarboindoleninas con una Kd de 98nM (Figura 2.33.c),

donde atribuyen la menor afinidad de estos sensores fluorescentes al impedimento

estérico generado por los cuatro grupos metilos del fluoróforo. En este sentido, para el

caso del sensor 27, se suma un nuevo componente que corresponde a la presencia de

los anillos naftalénicos, lo que aumentaría todavía más la congestión estérica. Sin em‐

bargo, este efecto no es tan importante ya que las constantes de disociación obtenidas

se encuentran en el mismo orden. El valor de Kd obtenido para el sensor fluorescente

27 establece un rango dinámico de detección de entre 10 nM y 1 ´M para Zn2+ (apro‐

ximadamente entre 0,1 y 10 veces el valor de Kd), altamente conveniente para su apli‐

cación en sistemas biológicos.

2.7. CONCLUSIONES

En este capítulo se mostró el desarrollo de nuevos marcadores y sensores fluo‐

rescentes basados en aminotricarbocianinas. En primer lugar se sintetizó una aminotri‐

carbocianina biotilinada. Se estudió la respuesta del fluoróforo frente a la conjugación

con estreptavidina y se pudo comprobar la especificidad de la interacción mediante

microscopía de fluorescencia.

Kd = 5,5 nM Kd = 98 nM Kd = 0,78 nM

Figura 2.33. Sensores fluorescentes para Zn2+ que utilizan DPEN como unidad de reconocimiento. a: ZnAF‐2F,34 b: ZnAF‐1,35 c: DIPCY.8

a. b. c.

CONCLUSIONES

82

Asimismo, se sintetizaron nuevos sensores de pH y Zn2+ basados en aminotri‐

carbocianinas, los cuales fueron completamente caracterizados. Se determinó el pKa

de la sonda fluorescente de pH, mediante determinaciones de cambios en la absor‐

bancia y la emisión de fluorescencia, así como también mediante los cambios en la

longitud de onda del máximo de absorción y emisión. Los valores de pKa obtenidos

muestran que el sensor fluorescente resulta prometedor para su aplicación en siste‐

mas biológicos para determinaciones in vivo.

Finalmente, se determinó la constante de afinidad del sensor fluorescente de

Zn2+ mediante determinaciones de los cambios en la intensidad de emisión fluorescen‐

cia y de absorbancia, cuyo orden de magnitud resulta conveniente para su aplicación

en sistemas biológicos.


83

2.8. BIBLIOGRAFÍA

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CAPÍTULO 3

NANOSENSORES DERIVADOS DE AMINOTRICARBOCIANINAS

INTRODUCCIÓN

85

3.1. INTRODUCCIÓN

Como se mencionó con anterioridad, las técnicas convencionales de sensado

mediante sondas fluorescentes tienen las ventajas de ser enormemente versátiles,

poseer una alta disponibilidad y un bajo costo lo que las convierte en una excelente

opción para una gran variedad de aplicaciones. Sin embargo, con frecuencia los límites

de detección de los sensores fluorescentes tradicionales no son suficientes para satis‐

facer los requerimientos de algunas aplicaciones, p.ej. en la detección de metales pe‐

sados. En la actualidad, la detección de iones metálicos mediante técnicas de fluores‐

cencia al nivel de trazas habitualmente requiere de procedimientos adicionales de en‐

riquecimiento, que muchas veces resultan ineficientes o problemáticos.

Los nanocristales fluorescentes presentan propiedades ópticas excelentes, par‐

ticularmente en lo que atañe al brillo y fotoestabilidad, no obstante son intrínseca‐

mente insensibles a la composición del medio. Una estrategia para el desarrollo de

sensores fluorescentes con límites de detección pequeños consiste en la modificación

superficial de nanopartículas fluorescentes con fluoróforos sensibles al analito de inte‐

rés. El principio de funcionamiento de estos sensores se basa en la modulación de las

propiedades ópticas del nanocristal mediante procesos de transferencia de energía

(FRET) o de electrones (ET), ya descriptos en la introducción de este trabajo de tesis

(página 15). No obstante, otra estrategia se basa en el uso de estructuras supramole‐

culares que contengan múltiples moléculas del fluoróforo, con el objeto de incremen‐

tar la señal obtenida y, de esta manera, disminuir los límites de detección y aumentar

la afinidad debido al efecto de la multivalencia.

Una metodología conveniente para la creación de este tipo de estructuras es la

conjugación del fluoróforo con dendrímeros convenientemente funcionalizados. Gene‐

ralmente se describe a los dendrímeros como una macromolécula que se caracteriza

por tener una estructura tridimensional altamente ramificada, lo que la provee de un

gran número de funcionalidades en su superficie (Figura 3.1).

CAPÍTULO 3 – NANOSENSORES DERIVADOS DE AMINOTRICARBOCIANINAS

86

La química de los dendrímeros fue desarrollada en 1978 por Buhleier y colabo‐

radores donde reportan la primeras “moléculas en cascada”.1 La palabra “dendrímero”

proviene de dos palabras griegas: “dendron”, que significa árbol, y “meros”, que signi‐

fica parte. Debido a su carácter multivalente y monodisperso, los dendrímeros han

sido de gran interés en el campo de la química y la biología, especialmente en aplica‐

ciones como el transporte de drogas, terapia génica y quimioterapia.2 Los dendrímeros

poseen 3 componentes arquitectónicos diferenciados: (i) el núcleo iniciador, (ii) capas

internas (generaciones) compuestas de unidades repetitivas ramificadas unidas al nú‐

cleo interior y (iii) la superficie exterior (funcionalidad terminal). A partir del núcleo,

cada rama se expande mediante ramificaciones secuenciales junto con la adición de

capas de monómeros, formando de esta manera dendrímeros de mayor orden o “ge‐

neraciones”.3 Dado que estas moléculas son producidas en una secuencia iterativa de

reacciones, tienen la gran ventaja de no ser polidispersas, de manera que cada molé‐

cula tiene el mismo número de átomos, el mismo tamaño y la misma forma. Se han

desarrollado diferentes tipos de dendrímeros pudiendo ser de naturaleza aromática,

hidrofóbica o hidrofílicas,4 entre los últimos se destacan los basados en po‐

li(amidoamina) (PAMAM), los cuales son solubles en agua, exponen aminos en superfi‐

cie, se pueden obtener hasta la generación 10 y son de los más utilizados para diversas

Figura 3.1. Proyección tridimensional de la estructura de un dendrímero PAMAM de generación 4,5 con los componentes principales de su arquitectura: (I) Núcleo, (II) Interior y (III) Superficie.

INTRODUCCIÓN

87

aplicaciones. Los intermediarios obtenidos durante la síntesis de dendrímeros se de‐

nominan como media‐generación, un ejemplo clásico son los PAMAM terminados en

ácidos carboxílicos (Figura 3.1). La gran disponibilidad de grupos funcionales en la su‐

perficie de los dendrímeros pueden ser aprovechados para confinar espacialmente

múltiples moléculas fluorescentes, con el objeto de generar especies con mejores pro‐

piedades ópticas que el fluoróforo en solución.

Otra estrategia para lograr el confinamiento espacial de fluoróforos consiste en

el desarrollo de nanopartículas híbridas de material orgánico e inorgánico, en este caso

las moléculas del fluoróforo pueden ser conjugadas tanto en el interior de las nanopar‐

tículas como en su superficie ya sea por adsorción física o conjugación covalente a

grupos expuestos en la misma (Figura 3.2.a y b).

Para el caso de un fluoróforo confinado en el interior de la nanopartícula se tie‐

ne la ventaja de aislar al fluoróforo del entorno, protegiéndolo de la interacción con

moléculas del solvente o especies reactivas como oxígeno o iones en solución. Además

se aumenta la estabilidad en entornos agresivos (p.ej. en medios celulares in vivo). En

este caso, si bien se disminuye la fotodegradación del fluoróforo, al mismo tiempo su

emisión de fluorescencia es insensible a cambios en el medio y no es posible su aplica‐

ción como sensores fluorescentes. Por otro lado, para fluoróforos conjugados en la

superficie de la nanopartícula la restricción conformacional es menos significativa por

Figura 3.2. Estructura esquemática de nanopartículas de sílica de tipo núcleo‐cubierta modificadas con fluoróforos, el cual puede confinarse en el núcleo (a) o en la superficie (b) de la nanopartícula. Estructura de tipo mesoporosa, que permite el acceso del solvente al interior de la nanopartícula (c).

a. b. c.


88

lo que el aumento en su fotoestabilidad no es tan importante. En este sentido, los

nanomateriales porosos resultan ser la solución más atractiva, ya que poseen la mayor

relación superficie a volumen y cavidades que son adecuadas para una incorporación

eficiente del fluoróforo (Figura 3.2.c). De esta manera, se abre la posibilidad de obte‐

ner un alta densidad de moléculas fluorescentes que permiten incrementar el brillo de

las nanopartículas en un factor de dos a cuatro órdenes de magnitud.5 Asimismo, gra‐

cias a su gran luminiscencia y fotoestabilidad reforzada, las nanopartículas de sílica

modificadas con fluoróforos han sido utilizadas para el desarrollo de sistemas de

bioanálisis y diagnóstico ultrasensible.6

Los fluoróforos confinados en entornos sólidos suelen exhibir un aumento en el

rendimiento cuántico y el tiempo de vida media de fluorescencia respecto a entornos

líquidos, lo que conlleva un mayor brillo e intensidad de la emisión fluorescente. Esto

se debe a la restricción espacial impuesta por la matriz sólida que impide la fotoisome‐

rización de enlaces, colisiones intermoleculares y relajamiento dieléctricos; todos ellos

factores que disminuyen la emisión fluorescente.7

No obstante, un proceso importante que se observa para fluoróforos confina‐

dos en un espacio reducido es el apagamiento dependiente de la concentración (auto‐

apagamiento o self‐quenching). Por ejemplo, para el marcado de una proteína o ácido

nucleico si se incrementa el número de moléculas de fluoróforo por biomolécula es

muy frecuente que la señal fluorescente obtenida crezca en forma lineal hasta llegar a

un máximo, luego del cual comienza a disminuir (Figura 3.3).8 Este efecto es muy im‐

portante para algunos compuestos fluorescentes y muchas veces resulta ser el factor

limitante en el diseño de dispositivos con alta densidad de fluoróforo.

El autoapagamiento se debe principalmente a dos procesos, la transferencia de

energía y las trampas no fluorescentes. Estas últimas se forman por asociaciones no

fluorescentes de las moléculas del fluoróforo, usualmente dímeros. Este proceso fre‐

cuentemente trae como resultado el apagamiento estático de la fluorescencia, nor‐

malmente mediante un mecanismo de Transferencia Fotoinducida de Electrones9

INTRODUCCIÓN

89

(Photoinduced Electron Transfer, PET). Estas especies no‐fluorescentes absorben radia‐

ción pero no presentan emisión de fluorescencia (actuando como trampas de luz), lo

que resulta en el apagamiento del sistema.

Por otro lado, cuando las moléculas de un fluoróforo se disponen a distancias

pequeñas pueden perder las propiedades de emisores independientes. Al ser excita‐

das, comienzan a interactuar de acuerdo al mecanismo FRET, el cual fue tratado con

anterioridad en este trabajo de tesis (página 17). En dichos ejemplos el proceso FRET

tenía lugar entre dos especies diferentes que actuaban como donante y aceptor, este

caso se denomina hetero‐FRET. No obstante, el proceso de transferencia de energía

puede tener lugar entre dos moléculas del mismo fluoróforo, denominándose homo‐

FRET. En este caso, el mecanismo es el mismo, y también requiere que exista un sola‐

pamiento entre el espectro de emisión y el de absorción de las especies involucradas,

esta condición se cumple para los fluoróforos que posean un corrimiento de Stokes

pequeño. El proceso homo‐FRET es importante para casos de biomoléculas con una

alta densidad de marca o cuando el fluoróforo se encuentra confinado, p.ej. en una

solución concentrada dentro de vesículas fosfolipídicas (liposomas).

Fluoróforos/proteína (mol:mol)

Fluorescen

cia del

conjugado

Figura 3.3. Fluorescencia relativa de conjugados de anticuerpos IgG preparados usando diferentes fluoróforos.2


90

La importancia de estos efectos depende fuertemente de las propiedades del

fluoróforo. Por ejemplo, las fluoresceínas y rodaminas presentan una eficiencia homo‐

FRET alta y también un autoapagamiento elevado. Sin embargo, otras familias de

fluoróforos como los pirenos y perilenos poseen una eficiencia homo‐FRET elevada

pero un autoapagamiento pequeño. Por último, en fluoróforos con corrimientos de

Stokes elevados (aminotricarbocianinas, complejos metálicos luminiscentes) la eficien‐

cia del proceso homo‐FRET es mínima. No obstante, estos procesos pueden ser contro‐

lados de manera de aprovechar al máximo el aumento en la intensidad de la señal

fluorescente al confinar fluoróforos en un espacio pequeño, aunque también son utili‐

zados para el desarrollo de diferentes sensores fluorescentes.10,11

En las secciones que siguen, se mostrará la caracterización de aminotricarbo‐

cianinas como moduladores de las propiedades ópticas de Quantum Dots. Los conju‐

gados obtenidos fueron caracterizados mediante espectroscopías de fluorescencia en

estado estacionario y resuelta en el tiempo. Asimismo, se sintetizó un sensor de pH

basado en un dendrímero funcionalizado con una aminotricarbocianina fluorescente

sensible a pH. Además, se sintetizaron aminotricarbocianinas biotinilada sensibles a pH

y a Zn2+, las cuales fueron utilizadas para el desarrollo de sensores de pH y de Zn2+ ba‐

sados en nanopartículas fluorescentes, los cuales fueron caracterizados mediante es‐

pectroscopías de fluorescencia en estado estacionario y resuelta en el tiempo.

3.2. MODULACIÓN DE LAS PROPIEDADES ÓPTICAS DE QUANTUM DOTS

Con el objeto de aprovechar las excelentes propiedades ópticas de las nanopar‐

tículas de material semiconductor fluorescentes, se han desarrollado una gran varie‐

dad de biosondas utilizando el proceso FRET como principio de funcionamiento, entre

las que se destacan los sondas para maltosa,12 oligonucleótidos,13,14 proteasas15 o trini‐

trotolueno (TNT).16 Cabe destacar la gran contribución en el desarrollo de biosensores

y biosondas derivadas de Quantum Dots‐FRET realizada por Medintz, Mattoussi y cola‐

boradores.12,15,16

MODULACIÓN DE LAS PROPIEDADES ÓPTICAS DE QUANTUM DOTS

91

La modificación superficial de las nanopartículas fluorescentes se ha llevado a

cabo por diferentes estrategias (página 22), entre las cuales la formación de una unión

covalente entre la sonda y el recubrimiento hidrofílico del nanocristal resulta una de

las más explotadas en la actualidad, p.ej. en el desarrollo de sondas de pH,17 Zn(II)18 o

monosacáridos.19 Esta estrategia tiene la ventaja de colocar a las moléculas del aceptor

muy cercanas al donante central (QD), aumentando la eficiencia del proceso FRET

(Figura 3.4.a). Sin embargo, mediante esta metodología resulta difícil la cuantificación

del número de aceptores ubicados en la superficie de la nanopartícula. Asimismo, la

preparación de un nuevo stock de conjugados y/o un cambio en la relación fluorófo‐

ro/QD requiere de una síntesis totalmente nueva, con pasos de purificación que mu‐

chas veces resultan dificultosos.

Por ello, para conjugar las moléculas a la superficie de las nanopartículas lumi‐

niscentes se planteó una estrategia no covalente, mediante el uso del sistema biotina‐

estreptavidina (Figura 3.4.b). Dicha metodología tiene como ventaja sobre la técnica

covalente la posibilidad de trabajar con QDots comerciales de diferentes longitudes de

onda de emisión, obtener fácilmente y en forma reproducible sensores con diferentes

relaciones aceptor/donante o conjugar diferentes moléculas a la misma nanopartícula

central con el objetivo de extender el rango del sensor, hacerlo sensible a otros pará‐

metros o unir moléculas que permitan el targeting específico para experimentos in

vivo (EGF, NGF, etc).20

a. b.

Figura 3.4. Estrategias de conjugación de moléculas sobre la superficie de Quantum Dots. a. Unión covalente directa sobre el recubrimiento hidrofílico. b. Funcionalización mediante estreptavidina, esta estrategia tiene la ventaja de poder conjugar diferentes especies sobre la superficie del QD.


92

Las nanopartículas fluorescentes conjugadas con estreptavidina se encuentran

disponibles comercialmente con dos tipos de recubrimientos. En uno de ellos las molé‐

culas de proteína se conjugan al recubrimiento hidrofílico a través de un espaciador de

polietilenglicol (PEG) según se esquematiza en la Figura 3.5.a. Este tipo de recubri‐

miento demostró reducir el marcado inespecífico en experimentos de citometría de

flujo21 y microscopía de fluorescencia,22 mejorando de esta manera la relación se‐

ñal/ruido.

La otra configuración disponible conjuga las moléculas de estreptavidina direc‐

tamente al recubrimiento hidrofílico de la nanopartícula, según se esquematiza en la

Figura 3.5.b. Esta disposición tiene como resultado un menor tamaño de partícula y un

aumento en el número de moléculas de proteína por nanocristal en comparación con

los conjugados con PEG. Estas características son aprovechadas especialmente en ex‐

perimentos de transferencia de energía.14

La prueba de principio del sistema propuesto se llevó a cabo mediante la con‐

jugación de la tricarbocianina biotinilada 26 con una nanopartícula fluorescente ade‐

cuada. Para asegurar una eficiencia del proceso FRET apropiada, a una distancia do‐

nante‐aceptor fija, es necesario que la integral de solapamiento espectral (ecuación

[7], página 18) entre el espectro de emisión del QD (donante) y el de absorción de 26

(aceptor) tenga una magnitud elevada. En este sentido, el par QD655‐26 resulta muy

a. b.

Figura 3.5. Esquemas de los diferentes recubrimientos disponibles comercialmente para Quantum Dots conjugados con estreptavidina, QD655‐SAv PEG (a) y QD655‐SAv ITK (b)


93

conveniente determinándose para dicho sistema una integral de solapamiento espec‐

tral J elevado (5,04x1017 M‐1cm‐1nm4), Figura 3.6, que conlleva a un valor alto de R0

(12,9 nm) para el sistema, utilizando los siguientes parámetros adicionales: φD = 0,52;23

゛2 = 2/3 (de acuerdo a la simplificación generalizada, el valor adecuado de ゛2 para QDs

aún no se encuentra establecido) y n=1,33 (correspondiente a H2O). Este valor de R0 es

mayor al reportado típicamente para otros sistemas QD‐fluoróforo (usualmente entre

5‐6 nm).24,25

Los sistemas se caracterizaron mediante titulación de una solución de los Quan‐

tum Dots correspondientes con la tricarbocianina biotinilada (26) registrando el espec‐

tro de emisión de la nanopartícula fluorescente luego de cada agregado. Se eligió co‐

mo longitud de onda de excitación 400nm, ya que corresponde a un mínimo en el es‐

pectro de excitación del fluoróforo evitando de esta manera la excitación directa del

mismo. En la Figura 3.7 se muestran los resultados obtenidos para la titulación de

QD655‐SAv ITK con la tricarbocianina biotinilada 26. Se observa que con el aumento de

la relación [26]/[QD655] hay una fuerte disminución en la intensidad de emisión de la

nanopartícula. Cuando la relación fluoróforo/nanopartícula alcanza el valor de 100:1 se

alcanza el máximo apagamiento (90% ), a partir del cual agregados posteriores de la

tricarbocianina no tienen efecto sobre la intensidad de emisión del nanocristal.

550 600 650 7000.00

0.01

0.02

0.03

Inte

nsid

ad d

e Em

isió

n N

orm

aliz

ada

Longitud de onda 蔕nm 蔔

0

20

40

60

Absortividad molar x 10

-3 蔕M

-1 cm-1

蔔

Figura 3.6. Espectros de emisión normalizado de QD655‐SAv ITK (negro) y de absorción de 26 utiliza‐dos para el cálculo de la integral de solapamiento espectral


94

Figura 3.7. Cambios en la intensidad de emisión de QD655‐SAv ITK con 26 en PBS. Inset: Cambios en el espectro de emisión de la nanopartícula desde una relación [26]/[QD655] de 0 (azul) a 234 (rojo).

Asimismo, en la Figura 3.8 se muestran los resultados obtenidos para la titula‐

ción de QD655‐SAv PEG con la tricarbocianina 26 en PBS. Se observa el mismo compor‐

tamiento que para las nanopartículas del tipo ITK. En este caso se alcanza el valor de

máximo quenching del 89% para una relación fluoróforo/nanopartícula de 20:1.

0 10 20 300.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Inte

nsid

ad d

e Em

isió

n N

orm

aliz

ada 6

55nm

[26]/[QD655]

600 620 640 660 6800

200

400

600

Inte

nsid

ad d

e E

mis

iَn

(U.A

.)

Longitud de onda

Figura 3.8. Cambios en la intensidad de emisión de QD655‐SAv PEG con 26 en PBS. Inset: Cambios en el espectro de emisión de la nanopartícula desde una relación [26]/[QD655] de 0 (azul) a 34 (rojo).

0 75 150 2250.00

0.25

0.50

0.75

1.00

600 625 650 6750

100

200

300

Inte

nsid

ad d

e Em

isió

n N

orm

aliz

ada 65

0nm

[26]/[QD655]In

tens

idad

de

Emis

ión

蔕U.A

.

蔔



95

Con el objeto de elucidar el mecanismo de la modulación en la intensidad de

emisión se realizaron titulaciones de las nanopartículas con la tricarbocianina biotinila‐

da monitoreando los tiempos de vida media de fluorescencia. Las curvas de decaimien‐

to obtenidas se ajustaron a un modelo biexponencial, y se determinaron los tiempos

de vida media de fluorescencia promedio como la media ponderada por las amplitudes

de cada componente. El uso de la media ponderada por las amplitudes o las intensida‐

des de cada componente (Capítulo 7, página 224), depende del fenómeno estudiado

en cada caso. Por ejemplo, para el cálculo de constantes de apagamiento colisionales

se debe utilizarse el promedio ponderado por intensidades, sin embargo, para experi‐

mentos de transferencia de energía de resonancia se deben utilizar los decaimientos

ponderados por la amplitud para el cálculo de las eficiencias de transferencia de ener‐

gía.

En la Figura 3.9 se muestran los cambios en el tiempo de vida media de fluores‐

cencia promedio para la titulación de QD655‐SAv ITK con el agregado de 26 en PBS. Se

observa nuevamente una fuerte disminución del tiempo de vida media promedio de

las nanopartículas con el agregado de la tricarbocianina 26. Asimismo, se alcanza un

valor mínimo para una relación fluoróforo/nanopartícula de 100:1, en concordancia

Figura 3.9. Cambios en el tiempo de vida media de fluorescencia promedio de QD655‐SAv ITK con 26en PBS. Inset: Curvas de decaimiento de fluorescencia de las nanopartículas con el agregado de 26, desde una relación fluoróforo/nanopartícula de 0 (azul) a 198 (rojo).

0 100 200

0.01

0.1

1

0 50 100 150 2000

5

10

15

Cue

ntas

nor

mal

izad

as

Tiempo (ns)

Tie

mpo

de

vida

med

ia d

e flu

ores

cenc

iapr

omed

io (

ns)

[26]/[QD655]


96

con los valores obtenidos mediante la determinación mediante intensidad de emisión

en estado estacionario.

Conjuntamente, se llevó a cabo la titulación de QD655‐SAv PEG con la tricarbo‐

cianina 26 en PBS analizando los cambios en el tiempo de vida medio promedio de‐

terminado del modo ya descripto en el caso de los QD655‐SAv ITK. Los resultados se

muestran en la Figura 3.10. Al igual que en los casos anteriores se observa una gran

disminución del tiempo de vida media promedio con el agregado de la tricarbocianina.

Cuando la relación fluoróforo/nanopartícula alcanza el valor de 15:1 se logra la máxi‐

ma eficiencia para el proceso FRET, que corresponde a un 56% . Este valor resulta me‐

nor que el obtenido para la determinación realizada mediante la intensidad de emisión

en estado estacionario. Esta discrepancia puede atribuirse a las pérdidas de señal fluo‐

rescente (posiblemente debido a agregación de las nanopartículas) cuando se realizan

titulaciones sobre soluciones de Quantum Dots. Este efecto trae aparejado una dismi‐

nución de la intensidad de fluorescencia de la muestra que no está relacionada con el

proceso FRET, dando como resultado un error por exceso cuando la determinación se

lleva a cabo mediante cambios en la intensidad de emisión en estado estacionario. No

obstante, dado que el tiempo de vida media de fluorescencia es una magnitud que no

Figura 3.10. Cambios en el tiempo de vida media de fluorescencia promedio de QD655‐SAv PEG con 26 en PBS. Inset: Curvas de decaimiento de fluorescencia de las nanopartículas con el agregado de 26, desde una relación fluoróforo/nanopartícula de 0 (azul) a 34 (rojo).

0 5 10 15 20 25 30 355

10

15

0 100 200

0.01

0.1

1

Tie

mpo

de

vida

med

ia d

e flu

ores

cenc

ia p

rom

edio

(ns

)

[26]/[QD655]

Cue

ntas

nor

mal

izad

as

Tiempo (ns)


97

depende de la concentración de la muestra, esta es la razón por la que este tipo de

determinaciones son insensibles a pérdidas del material fluorescente.

Un aspecto que merece ser analizado es la diferencia en la magnitud del apa‐

gamiento entre QD655 con ambos tipos de recubrimiento, dado que para los PEG se

obtienen eficiencias de transferencia de energía similares a las logradas con los ITK

pero con una carga menor de fluoróforo biotinilado. De acuerdo al proveedor de las

nanopartículas la principal diferencia entre los conjugados de QD ITK y PEG reside en la

forma de unir las moléculas de estreptavidina al recubrimiento de la nanopartícula.

Como se describió con anterioridad, en los conjugados QD‐SAv PEG las moléculas de

proteína se acoplan mediante un espaciador de polietilenglicol con el objeto de mini‐

mizar el marcado no específico, mientras que en los conjugados QD‐SAv ITK las molé‐

culas de proteína se unen directamente al recubrimiento hidrofílico de la nanopartícu‐

la. De esta manera, el fabricante reporta que la formulación de nanopartículas ITK re‐

sulta tener un mayor número de moléculas de estreptavidina por nanocristal en rela‐

ción al conjugado PEG, lo cual fue confirmado en literatura.26 Asimismo, las curvas de

titulación obtenidas por espectroscopía de fluorescencia en estado estacionario y re‐

suelto en el tiempo (Figuras 3.6, 3.7, 3.8 y 3.9) están de acuerdo con estos parámetros,

con valores de 100 y 20 sitios de unión a biotina para los conjugados ITK y PEG, respec‐

tivamente.

No obstante, los resultados obtenidos muestran que para una cantidad fija de

fluoróforo el conjugado QD655‐SAv PEG muestran un apagamiento más fuerte con 26

que el QD655‐SAv ITK, lo cual puede resultar poco intuitivo. De acuerdo al fabricante,

las propiedades espectrales de ambos tipos de nanopartículas son idénticas, por lo

tanto las diferencias deberían encontrarse en la distribución de las moléculas de pro‐

teína en la superficie de ambos tipos de nanopartículas. Estos resultados permiten

proponer dos tipos de modelos: i. todos los sitios activos en las nanopartículas con el

recubrimiento de tipo ITK tienen una orientación espacial para los sitios de unión de 26

que reduce la eficiencia de la transferencia de energía, ii. es posible plantear un mode‐


98

lo de poblaciones heterogéneas, con el misma afinidad por los sitios activos pero con

una eficacia de transferencia de energía diferente y diferenciable, lo cual reduce la

eficiencia de transferencia de energía global del sistema.27

De esta manera, se pudo comprobar que el par FRET QD655/aminotricarbocia‐

nina presenta excelentes características, dados los altos valores de eficiencias de FRET

alcanzadas. Asimismo, resultó posible modular las propiedades ópticas de emisión de

la nanopartícula fluorescente mediante el agregado de diferentes relaciones de fluoró‐

foro, abriendo la posibilidad de extender este sistema al desarrollo de nanosensores

fluorescentes.

3.3. NANOSENSORES DE PH DERIVADOS DE TRICARBOCIANINAS

En 2006 Snee y colaboradores28 reportaron el primer sensor de pH fluorescente

basado en Quantum Dots modificados con fluoróforos sensibles al medio que interac‐

túan mediante un proceso FRET. En el mismo se utilizó una escuaraína unida covalen‐

temente al recubrimiento hidrofílico de la nanopartícula.

Dados los excelentes resultados obtenidos para el sistema modelo QD655/26

se decidió desarrollar un nanosensor fluorescente de pH basado en la tricarbocianina

28. Este fluoróforo ya había sido probado con éxito como sensor de pH en el rango

fisiológico (Sección 2.5), además dada su naturaleza asimétrica resulta posible explotar

las ventajas de los grupos funcionales presentes en la molécula: el grupo sulfonato que

aumenta la solubilidad en agua y el carboxilo, sitio de funcionalización que permite la

conjugación con una amina biotinilada. Se llevó a cabo la reacción de 28 con la

(+)‐N‐biotinil‐3,6,9‐trioxaundecanodiamina (NH2‐PEG3‐Biotina, Pierce) mediante acti‐

vación del grupo carboxilo utilizando N,N'‐diciclohexilcarbodiimida (DCC) y

N‐hidroxisuccinimida (NHS) en DMF, a temperatura ambiente y en presencia de trieti‐

lamina (Figura 3.11).

NANOSENSORES DE PH DERIVADOS DE TRICARBOCIANINAS

99

La aminotricarbocianina biotinilada 34 se obtuvo con un rendimiento del 55%

(゜Máx Abs = 650nm, 0650nm = 60.500 M‐1cm‐1, φFl = 0,04). En la Figura 3.12 se muestra el

espectro RMN‐1H de 34, donde se indican algunas señales características del resto bio‐

tinilado y la tricarbocianina asimétrica sensible a pH precursora, 28.

28

34

Figura 3.11. Esquema sintético para la obtención de la tricarbocianina biotinilada 34 sensible al pH.

N+

N

N

SO

-O

O

HN

O

N

OO

NH

NH

OH

NHH

SO

O

a

b

c d

e

h

f

g b e f g h c

d

a

Figura 3.12. Espectro RMN‐1H de 34 (500MHz, solvente MeOD‐d4). Se muestran algunas señales ca‐racterísticas del núcleo de tricarbocianina y del resto biotinilado.


100

Con el objeto de caracterizar el par FRET QD655/34, se tomaron los espectros

de absorción de la aminotricarbocianina 34 a diferentes valores de pH. En la Figura

3.13.a se muestran los resultados obtenidos, junto con el espectro de emisión de

QD655‐SAv ITK. Con estos datos, se calcularon las integrales de solapamiento del sis‐

tema a diferentes valores de pH (Figura 3.13.b), observándose que la integral de sola‐

pamiento disminuye con el pH del medio. Esto permite concluir que la eficiencia del

proceso FRET será mayor a pH básico que en ácido, dando como resultado una modu‐

lación en las propiedades ópticas de la nanopartícula fluorescente en función del pH

del medio.

La tricarbocianina biotinilada 34 fue utilizada para titular una solución 5 nM de

QD655‐SAv ITK en PBS, pH 9,65. Se registraron los cambios en la intensidad de emisión

de la nanopartícula irradiando la muestra a 400 nm (donde la excitación directa de la

aminotricarbocianina es mínima). En la Figura 3.14 se observa un marcado descenso

de la intensidad de emisión de las nanopartículas a medida que aumenta la relación

[34]/[QD655], conjuntamente se puede observar la aparición de una banda de emisión

a 740nm correspondiente a la emisión sensibilizada del fluoróforo a través del proceso

de transferencia de energía

Figura 3.13. a. Espectros de absorción de 34 desde pH9,50 (azul) a 2,53 (rojo). Espectro de emisión de QD655 (verde). b. Cambios de la integral de solapamiento espectral del par FRET QD655/29 como función del pH.

2 4 6 8 10

3

6

9

J x

10-1

5

蔕 M-1cm

-1nm

4

蔔

pH550 600 650 700 750 800 850

0

20

40

60

Abso

rtivi

dad

mol

ar x

10-3

蔕M-1cm

-1

蔔


600 700 800

0

80

160 Intensidad de Emisión

蔕U.A.

蔔

a. b.


101

Figura 3.14. Cambios en el espectro de emisión para la titulación de una solución 5nM de QD655‐SAv ITK con 34 en PBS pH 9,65 (゜Exc=400nm), desde una relación [34]/[QD] de 0 (azul) a 220 (rojo). Inset: Ampliación de la zona de 700‐850 nm, donde se observa la emisión sensibilizada del aceptor FRET.

Con el objeto de estudiar la unión específica del fluoróforo al recubrimiento de

la nanopartícula se llevó a cabo la titulación con 34 de QD655‐SAv ITK preincubadas

con 1.000 eq de biotina libre. De esta manera, se bloquean los sitios de unión sobre la

superficie de la nanopartícula y se impide la conjugación con el fluoróforo. En la Figura

3.15 se observan los resultados obtenidos, la intensidad de emisión de las nanopartícu‐

las esencialmente no se ve afectada por la presencia de la tricarbocianina biotinilada.

Asimismo, se tomaron espectros de emisión de 34 en PBS, pH 9,65 con ゜Exc= 400nm en

600 650 700 750 800 8500

200

400

700 750 8000

10

Inte

nsid

ad d

e F

luor

esce

ncia

(U

.A.)


Inte

nsid

ad

de F

luor

esce

ncia

(U

.A.)


Figura 3.15. Cambios en el espectro de emisión para la titulación de una solución 5nM de QD655‐SAv ITK preincubados con biotina con 34 en PBS, pH 9,65 (゜Exc=400nm), desde una relación [34]/[QD] de 0 (azul) a 220 (rojo). Inset: Espectro de emisión de 34 en ausencia de QD655 con ゜Exc=400nm.

600 650 700 750 800 8500

100

200

300

400

500

Inte

nsid

ad d

e F

luor

esce

ncia

(U

.A.)


700 750 8000

10

Inte

nsid

ad d

e F

luor

esce

ncia

(U

.A.)



102

ausencia de las nanopartículas fluorescentes. Los resultados se muestran en el inset de

la Figura 3.15 donde se observa la ausencia de señal, de esta manera se confirma que

la señal observada a 740nm corresponde a la emisión sensibilizada debido al proceso

FRET y no a excitación directa de la sonda.

En la Figura 3.16.a se muestran los cambios en la intensidad de fluorescencia a

655nm cuando se titulan los QD655‐SAv ITK con la tricarbocianina biotinilada 34. Pue‐

de observarse que cuando la relación [34]/[QD655] alcanza el valor de 150:1 se obtie‐

ne la máxima eficiencia de apagamiento (EFRET = 76% ). Asimismo, para la muestra con‐

trol (con los sitios de unión a biotina bloqueados) existe un apagamiento del 12% para

la relación [34]/[QD655] de 220:1, que puede atribuirse a un mecanismo de FRET ines‐

pecífico (sin mediar interacción a la proteína en el recubrimiento de la nanopartícula)

dada la elevada concentración de fluoróforo necesaria para alcanzar dicha relación

(1,1 ´M en aminotricarbocianina). En la Figura 3.16.b se muestran los cambios obser‐

vados en la relación de intensidad de emisión a 740nm y a 655nm como función de la

relación fluoróforo/nanopartícula. Puede verse que existe un crecimiento lineal (aso‐

ciado a la emisión sensibilizada debido al proceso FRET) hasta alcanzar la relación de

150:1, a partir de la cual agregados posteriores no incrementan la intensidad de emi‐

sión de la aminotricarbocianina.

0 50 100 150 2000.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Inte

nsid

ad d

e em

isió

n a

655n

m n

orm

aliz

ada

[29]/[QD655]0 50 100 150 200

0.00

0.05

0.10

0.15

Fl 74

0nm/F

l 655n

m

[29]/[QD655]

a. b.

Figura 3.16. a. Cambios en la intensidad de emisión a 655nm para la titulación de una solución 5nM de QD655‐SAv ITK con 34 en PBS pH 9,65 (negro) y para la muestra control (rojo). b. Variación en la relación de intensidad de fluorescencia a 740nm respecto a la intensidad de emisión a 655nm como función de la relación [34]/[QD655]. ゜Exc=400nm

[34]/[QD655] [34]/[QD655]


103

Asimismo, se llevó a cabo una titulación con 34 de una solución 5 nM de

QD655‐SAv ITK en buffer PBS pH 9,65, determinando el tiempo de vida media de fluo‐

rescencia de las nanopartículas luego de cada agregado. Las curvas de decaimiento de

fluorescencia obtenidas se ajustaron a una función biexponencial, determinando luego

el tiempo de vida media de fluorescencia promedio como la media pesada por las am‐

plitudes de cada componente. En la Figura 3.17.a se muestran las variaciones en los

tiempos de vida media de fluorescencia frente a los agregados de 34. Se observa una

marcada disminución de cada componente hasta alcanzar un plateau para una relación

fluoróforo/nanopartícula de 150:1 donde se determinó la eficiencia máxima del proce‐

so FRET, que resultó ser del 70% . Ambos valores se encuentran en concordancia con

los resultados obtenidos para la determinación mediante la intensidad de emisión en

estado estacionario.

En la Figura 3.17.b se muestran las variaciones en las amplitudes de cada com‐

ponente frente a cambios en la relación fluoróforo/nanopartícula. Se observa un au‐

mento de la proporción de la componente corta del decaimiento de fluorescencia a

medida que aumenta la relación [34]/[QD655]. De esta manera, la disminución en el

tiempo de vida media de fluorescencia global de las nanopartículas no sólo se debe al

acortamiento en el valor de las dos componentes sino que, al mismo tiempo, crece

también la proporción de la componente corta al decaimiento global.

Figura 3.17. a. Cambios en el tiempo de vida media de fluorescencia para una titulación de una solu‐ción 5 nM de QD655‐SAv ITK con 34 en PBS pH 9,65. En la figura se muestran las componentes corta (negro) y larga (rojo) resultantes del ajuste de los decaimientos junto con el promedio (azul). b. Varia‐ción de las amplitudes de cada componente en función de la relación fluoróforo/nanopartícula.

0 100 200

500

1000

1500

Cue

ntas

[29]/[QD655]0 100 200

10

20

30

Tie

mpo

de

vida

med

iade

fluo

resc

enci

a (n

s)

[29]/[QD655]

a. b.

[34]/[QD655] [34]/[QD655]


104

Este estudio previo permite escoger la relación [34]/[QD655] a utilizar para

construir el sensor de manera de obtener la máxima variación en las señales registra‐

das (intensidad de emisión en estado estacionario y tiempos de vida media de fluores‐

cencia), al tiempo que se mantengan sitios libres para la posible conjugación de otras

especies a la superficie de la nanopartícula. Para este sistema se decidió utilizar una

relación de QD655‐SAv ITK a 34 de 100:1, ya que de esta manera aún persisten cerca

de 50 sitios activos libres en el recubrimiento de la nanopartícula.

Dado que el objetivo de este trabajo de tesis es el desarrollo de nanosensores

fluorescentes para su aplicación en microscopías de fluorescencia, se procedió a carac‐

terizar el comportamiento de los nanosensores de pH basados en la conjugación de 34

a nanopartículas fluorescentes mediante este tipo de técnicas. Las medidas de intensi‐

dad de fluorescencia son muy utilizadas para estudiar procesos en cultivos celulares y

tejidos, sin embargo no siempre es posible extraer información cuantitativa a partir de

dichas determinaciones. Esto se debe a que la intensidad de fluorescencia en un de‐

terminado pixel de la imagen depende tanto del entorno del fluoróforo como de la

concentración local de la sonda (que muchas veces resulta desconocida), desafortuna‐

damente estas dos contribuciones no son fácilmente diferenciables. No obstante,

también es posible caracterizar al fluoróforo en una muestra en función de su tiempo

de vida media de fluorescencia. Como se detalló con anterioridad, este parámetro no

depende de la concentración local de la sonda, por lo tanto la variación de esta magni‐

tud puede asociarse a un cambio en el entorno del fluoróforo. Por lo tanto, se utilizó la

técnica de microscopía de tiempos de vida media de fluorescencia (Fluorescence Life‐

time Imaging Microscopy, FLIM, página 236) para la caracterización del nanosensor

frente a cambios en el pH de la muestra.

Sin embargo, en experimentos de microscopías de fluorescencia es frecuente la

presencia de contribuciones de diferentes especies al tiempo de vida media en cada

pixel de la imagen, algunas de las cuales algunas pueden ser multiexponenciales.29,30

Asimismo, a diferencia de las determinaciones llevadas a cabo en sistemas en cubeta,


105

en las determinaciones de los tiempos de vida media de fluorescencia aplicadas a mi‐

croscopios la recolección de luz sólo puede llevarse a cabo durante una cantidad limi‐

tada de tiempo (100‐200 ´s por pixel) lo que resulta en una integración de aproxima‐

damente 500‐1000 fotones por pixel.31 Esta cantidad difícilmente es suficiente para la

diferenciar un decaimiento monoexponencial de un biexponencial (y, de esta manera,

poder determinar si se encuentran presentes dos especies en un mismo pixel).

El análisis de los datos colectados en un experimento FLIM en el dominio del

tiempo requiere el ajuste de los decaimientos observados en cada pixel, mediante el

uso de una o varias funciones exponenciales. Teniendo en cuenta que en normalmente

una imagen se encuentra formada por alrededor de 105 pixeles, puede concluirse que

este tipo de análisis se torna dificultoso y requiere una potencia computacional consi‐

derable.32,33 En 2008, Digman y colaboradores34 presentaron una forma de simplificar

el análisis de las imágenes obtenidas en experimentos FLIM mediante el uso de fasores

(Sección 7.1.4, página 231), evitando de esta manera algunos de los problemas del

análisis exponencial e implementando una visión gráfica global e intuitiva de los proce‐

sos que afectan los tiempos de vida media de fluorescencia en cada pixel.35,36

El método de los fasores transforma los histogramas de los retrasos en cada pi‐

xel a un fasor, que presenta las propiedades de un vector. Para cada pixel se calculan

sus coordenadas en el diagrama de fasores (Pi,j(ω) y Qi,j (ω)) que se construyen de

acuerdo a las ecuaciones [3.1] y [3.2].

donde Mi,j(ω) y ϕi,j(ω) corresponden a la modulación y la fase de la emisión con

respecto a la excitación, ω es la frecuencia angular de modulación del laser de excita‐

ción y los subíndices i y j identifican un pixel en la imagen. Tanto la fase como la modu‐

lación dependen de la frecuencia de modulación de la excitación, por lo que ambas

coordenadas en el diagrama de fasores también son función de dicha frecuencia.

[3.1]

[3.2] i,j i,j i,j

i,j i,j i,j

Q ( ) M ( )cos( ( ))

P ( ) M ( )seno( ( ))


106

Para el caso de un pixel i,j donde haya una contribución de varias componentes

exponenciales al tiempo de vida media, las coordenadas P y Q del diagrama de fasores

están dadas por las ecuaciones [3.3] y [3.4].

donde fk es la contribución a la intensidad fraccional de la componente con

tiempo de vida τk. Se observa que los fasores asociados a todos los decaimientos mo‐

noexponenciales posibles están representados por un semicírculo centrado en (0,5;0) y

de radio 0,5; el cual se denomina “círculo universal”. Sobre el mismo, un fasor corres‐

pondiente a un tiempo de vida muy corto (pequeño retraso en la fase) se encuentra

cercano al punto (1;0) mientras que un fasor correspondiente a un tiempo de vida muy

largo se encontrará cercano al punto (0;0), Figura 3.18.a.

Para determinar la contribución fraccional de dos componentes asociados a un

fasor, se resuelven gráficamente las Ecuaciones [3.3] y [3.4]. Todas los fasores asocia‐

dos a las combinaciones de dos componentes se encuentran en el diagrama en una

recta que une los fasores de las componentes aisladas, Figura 3.18.b. La posición rela‐

tiva dentro de dicho segmento está dada por la contribución fraccional de cada com‐

ponente al tiempo de vida media global.

a b.

Figura 3.18. a. Diagrama de fasores, mostrando el círculo universal y las zonas asociadas con tiempos de vida media de fluorescencia largos y cortos. b. Todos los fasores correspondientes a la combina‐ción de dos componentes de tiempos de vida media de fluorescencia (τ1 y τ2) caen en una recta que une los mismos y a una distancia dada por la contribución fraccional de cada componente (f1 y f2).

[3.3]

[3.4]

ki,j 2

k k

k ki,j 2

k k

fQ ( )

1 ( )

fP ( )

1 ( )


107

Los sensores de pH fueron armados por incubación de una solución 165 nM de

nanocristales con una solución de 34 (concentración final 16.5 µM, relación 100:1) en

buffer fosfato de sodio 1mM, 150mM NaCl, pH 9,65 durante 15 minutos. Luego las

muestras se diluyen a una concentración final de 10 nM de nanosensor en buffers

10mM, 150mM NaCl, 1% BSA de pH conocido. Se utilizaron tres soluciones reguladoras

de diferente naturaleza en diferentes rangos de pH: ácido 2‐(N‐morfolino)etan‐

sulfónico (MES, pKa = 6,15) , ácido 4‐(2‐hidroxiethil)‐1‐piperazinetansulfónico (HEPES,

pKa = 7,55) y N,N‐bis(2‐hidroxietil)glicina (bicina, pKa = 8,35) para los rangos de pH 5‐6,

6‐8 y 8‐10, respectivamente. De esta manera se evita el desarrollo de especies multi‐

cargadas que puedan modificar la fuerza iónica entre las diferentes soluciones de cali‐

brado.

En la Figura 3.19 se observan los cambios en la población de fasores a 20 y

40 MHz para los nanosensores fluorescentes frente a cambios en el pH del buffer. Se

observa que a medida que el pH disminuye los fasores se desplazan hacia la zona de

mayores valores de tiempo de vida media de fluorescencia, lo cual está de acuerdo con

el comportamiento esperado según los cálculos de variación de la eficiencia del proce‐

so FRET realizados con anterioridad (Figura 3.13).

No obstante, con el objeto de definir si los cambios observados pueden atri‐

buirse exclusivamente a la presencia del fluoróforo sensible a pH en la superficie de las

nanopartículas o a otro efecto, se realizaron determinaciones del tiempo de vida me‐

Figura 3.19. Diagrama de fasores tomados a 20MHz (a) y 40MHz (b) para la titulación de una solución 10nM del conjugado QD655‐SAv ITK:34 en relación 1:100 a diferentes valores de pH.

a b.


108

dia de fluorescencia para muestras de QD655‐SAv ITK sin funcionalizar con 34 a dife‐

rentes valores de pH. En la Figura 3.20 se muestran los resultados obtenidos, se obser‐

va que en el rango de pH 9,50‐6,50 el tiempo de vida media de fluorescencia (y, por lo

tanto, los fasores asociados) de las nanopartículas permanece esencialmente constan‐

te, mientras que por debajo de dicho valor la posición de los fasores se desplaza fuer‐

temente hacia la zona de tiempos de vida media de fluorescencia cortos. Es sabido que

los QDs hidrofílicos comerciales no son estables en soluciones con valores de pH por

debajo de 7, ya que los grupos carboxilatos presentes en el recubrimiento anfifílico

(Figura 13, página 23) que los mantienen solubles en medios acuosos comienzan a

neutralizarse y, por lo tanto, la nanopartícula pierde densidad de carga en su superficie

y comienzan a colapsar. Los agregados son claramente visibles durante el desarrollo de

las determinaciones en la forma de clusters de material fluorescente con un brillo su‐

perior al de la solución (que corresponde a QDs sin agregar).

Estos resultados permiten concluir que estos nanosensores de pH fluorescentes

son útiles en el rango de pH 7,00‐9,75; ligeramente por encima del rango de pH ácido

necesario para el estudio in vivo de muchos procesos fisiológicos y patológicos de alta

relevancia como el desarrollo de tumores, fibrosis quística, etc; ya discutidos con ante‐

rioridad (Capítulo 2, página 56).

a b.

Figura 3.20. Diagrama de fasores tomados a 20MHz (a) y 40MHz (b) para la titulación de una solución 10nM del conjugado QD655‐SAv ITK a diferentes valores de pH.


109

Una estrategia que podría aplicarse para mejorar la estabilidad de las nanopar‐

tículas en solución sería la introducción de más grupos cargados en la estructura quí‐

mica de la tricarbocianina, de manera de aumentar la carga superficial del conjugado

con la nanopartícula y, de esta manera, prevenir la agregación de los QDs.

Cabe destacar que en 2012, durante la escritura de este trabajo de tesis, Tang y

colaboradores37 reportaron en el Journal of the American Chemical Society el desarro‐

llo de un sensor de pH basado en nanopartículas modificada con tricarbocianinas. Se

sintetizaron dos tricarbocianinas LS662 y LS664 (Figura 3.21) activas en la zona NIR del

espectro de radiación, las cuales fueron conjugadas con nanopartículas fluorescentes

de material semiconductor con un máximo de emisión en 750nm mediante la unión

covalente directa al recubrimiento de cisteamina presentes en las mismas. Se reportó

que LS662 interactúa con la nanopartícula central mediante un proceso FRET (pKa 5,2),

mientras que LS664 lo hace mediante un proceso PET (pKa 3,5). En ambos casos, se

utiliza el tiempo de vida media de fluorescencia como señal para llevar a cabo la cuan‐

tificación. Sin embargo, en este trabajo no se realizan estudios en sistemas in vivo ni

mediante técnicas de microscopías.

Figura 3.21. Sensores de pH basados en tricarbocianinas activas en la zona NIR del espectro. La inter‐acción del fluoróforo con la nanopartícula mediante uno de dos procesos distintos.24


110

Según reportan los autores, estos nanosensores fluorescentes basados en tri‐

cabocianinas, a diferencia de los obtenidos en este trabajo de tesis, son estables a pH

ácido informándose determinaciones hasta un pH de 2. Seguramente esta estabilidad

extendida puede encontrar explicación en la mayor densidad de carga observada en

las tricarbocianinas LS662 y LS664 en comparación con 34. No obstante, una seria des‐

ventaja de los nanosensores desarrollados por Tang y colaboradores reside en que no

dejan lugar para la marcación específica de analitos de interés (p.ej. a biomoléculas).

Asimismo, los valores de pKa obtenidos para estos sistemas (5,2 y 3,5 para los conju‐

gados con LS662 y LS664, respectivamente) se encuentran considerablemente por de‐

bajo de los valores adecuados para la aplicación en sistemas in vivo. En este sentido,

los sensores de pH basados en 34 fueron especialmente diseñados para su aplicación

en entornos biológicos, permitiendo la marcación específica en biomoléculas y facili‐

tando la posibilidad de internalización en células mediante el uso de ligandos biotinila‐

dos, los cuales se encuentran disponibles comercialmente y son de fácil acceso (p.ej.

factores de crecimiento biotinilados, entre ellos el EGF conjugado con biotina).

3.4. SENSORES DE PH DERIVADOS DE DENDRÍMEROS

Como se detalló con anterioridad, los dendrímeros se muestran como estructu‐

ras muy promisorias para la confinación espacial de diferentes especies. Recientemen‐

te, se han reportado diferentes trabajos donde se aprovechan las propiedades fisico‐

químicas de dendrímeros utilizándolos como soportes para la construcción de sensores

fluorescentes.38,39

En 2011, Ornelas y colaboradores reportaron la síntesis de dendrímeros funcio‐

nalizados con aminotricarbocianinas mediante el uso de diferentes estrategias, p.ej.

cicloadición azida‐alquino catalizada por cobre (Copper‐catalyzed Azide Alkine Cy‐

cloaddition, CuAAC), acoplamiento carboxilo‐amina o reacción directa de tipo SRN1.40,41

Los conjugados construidos fueron utilizados en la marcación específica de diferentes

especies para su visualización mediante microscopías de fluorescencia.

SENSORES DE PH DERIVADOS DE DENDRÍMEROS

111

Estos antecedentes fueron la base para el desarrollo de nanosensores fluores‐

centes de pH basados en la aminotricarbocianina 28 conjugada sobre dendrímeros.

Para tal fin, se hizo reaccionar el fluoróforo con dendrímeros PAMAM de cuarta gene‐

ración (64 sitios activos, 5nm de diámetro) en DMF mediante los reactivos de acopla‐

miento DCC y NHS en presencia de trietilamina (35, Figura 3.22) en una relación den‐

drímero:28 de 1:10. La mezcla de reacción fue purificada mediante diálisis contra agua

bidestilada durante una noche y posteriormente liofilizada para obtener un residuo

azul oscuro. Si bien al momento de la impresión de este trabajo no se pudo obtener

una caracterización completa del conjugado 35 (la cual se encuentra en curso), el cam‐

bio observado en sus propiedades (aumento de la solubilidad en agua, del coeficiente

de extinción molar y del rendimiento cuántico de fluorescencia) respecto de la tricar‐

bocianina 28 son, a nuestro criterio, suficiente evidencia de la obtención del producto

propuesto.

El dendrímero funcionalizado obtenido 35 fue caracterizado mediante la titula‐

ción de una solución 100 nM en PBS a diferentes valores de pH, tomando los espectros

de absorción y emisión (゜Exc=650 nm) luego de cada agregado. Los resultados obteni‐

dos se muestran en la Figura 3.23, junto con el ajuste de los datos a la ecuación de

Figura 3.22. Esquema del nanosensor de pH basado en dendrímeros PAMAM (4ta generación, 64 sitios activos, diámetro 5 nm) conjugado con 28.

35


112

Henderson Hasselbach (ecuación [3.5]) con el objeto de determinar el valor del pKa del

nanosensor según cada set de datos obtenidos.

Los cálculos arrojaron un valor de pKa de 7,90±0,05 y 8,20±0,05 para el ajuste

de los cambios en la absorbancia a 650nm o la intensidad de fluorescencia a 750nm

(゜Exc = 650 nm), respectivamente.

Un aspecto interesante es la comparación entre los rendimientos cuánticos de

fluorescencia del sensor de pH libre 28, φFl = 0,04, y conjugado sobre el dendrímero 35,

φFl = 0,12. La mejora en las propiedades fluorescentes del fluoróforo puede atribuirse a

la restricción espacial impuesta por el dendrímero al actuar como soporte del fluorófo‐

ro. De esta manera, se pudo comprobar que la conjugación del sensor de pH fluores‐

cente 28 sobre la superficie de los dendrímeros.

Esta estrategia resulta muy interesante al momento de desarrollar no sólo sen‐

sores, sino que también marcadores fluorescentes dado que los dendrímeros pueden

resultar de gran relevancia para aplicaciones biomédicas como ser el transporte de

drogas, microscopía de fluorescencia y terapias génicas.42 Asimismo, la conjugación de

4 6 8 10

0.01

0.02

Abs

orba

ncia

650n

m

pH4 6 8 10

5

10

15

20

Inte

nsid

ad d

e flu

ores

cenc

ia 75

0nm

(U.A

.)

pH

a. b.

pKa = 8,20±0,05

R2=0,998

pKa = 7,90±0,05

R2=0,994

Figura 3.23. Curvas de calibrado para una solución 100 nM de 35 en PBS a diferentes valores de pH, tomando el espectro de absorción (a) y de emisión (b, ゜Exc=650 nm) luego de cada agregado.

Aa a

B


[A] x x

[3.5]

SENSORES DE ZN(II) DERIVADOS DE QUANTUM DOTS

113

los dendrímeros con biotina constituye una nano‐plataforma muy prometedora para la

diagnosis y tratamiento de cáncer.43

3.5. SENSORES DE ZN(II) DERIVADOS DE QUANTUM DOTS

En 2008 Ruedas‐Rama y colaboradores18 reportaron el desarrollo de un sensor

de Zn2+ basado en nanopartículas fluorescentes de material semiconductor, utilizando

como unidad de reconocimiento a diferentes aza éteres corona (Figura 3.24). Los mis‐

mos fueron inmovilizados en la superficie de los nanocristales mediante la unión cova‐

lente del azamacrociclo correspondiente al recubrimiento de cisteínas de la nanopartí‐

cula y se propuso que éstos actúan como quenchers de los QD mediante un proceso de

transferencia fotoinducida de carga. Los tres sensores de Zn2+ desarrollados mostraron

una linealidad muy buena en el rango de 5‐500 ´M con un límite de detección por de‐

bajo de 2,4 ´M.

En este trabajo de tesis se desarrolló un sensor de Zn(II) derivado de la tricar‐

bocianina asimétrica 23 utilizando DPEN como unidad de reconocimiento del analito

(ya utilizado con éxito en 27) y un resto biotinilado para la unión específica a la nano‐

partícula fluorescente (36, Figura 3.25).

De esta manera, se hizo reaccionar la meso‐triclorocarbocianina asimétrica 23

con la N,N’‐di(2‐picolil)etilendiamina (DPEN, 33) para dar la aminotricarbocianina asi‐

métrica 37 con un 66% de rendimiento. En la Figura 3.26 se muestra el espectro

RMN‐1H de 37, donde se indican algunas señales características del mismo.

Figura 3.24. Estructura de sensores fluorescentes de Zn2+ basados en Quantum Dots.18


114

a b

c d

f g

h e

a

b

dc

e h

f

g

Figura 3.26. Espectro RMN‐1H de 37 (500MHz, solvente CD3OD). Se muestran algunas señales característi‐cas del núcleo de tricarbocianina y de la DPEN.

23

37

36

Figura 3.25. Esquema sintético para la obtención de la aminotricarbocianina sensible a Zn2+, 36.


115

El último paso de reacción consiste en el acoplamiento del resto biotinilado, la

(+)‐N‐biotinil‐3,6,9‐trioxaundecanodiamina (NH2‐PEG3‐Biotina, Pierce) mediante acti‐

vación del grupo carboxilo utilizando N,N'‐diciclohexilcarbodiimida (DCC) y N‐

hidroxisuccinimida (NHS) en DMF, a temperatura ambiente y en presencia de trietila‐

mina, Figura 3.25.

La mezcla de reacción se evaporó a presión reducida y el residuo obtenido fue

purificado mediante cromatografía en placa preparativa RPC18 utilizando una mezcla

de metanol/agua (9:1) como solvente de elución. De esta manera se obtuvo el com‐

puesto 36 con un 35% de rendimiento, en la Figura 3.27 se muestra el espectro 1H‐

RMN‐1H obtenido donde se indican algunas señales características de la tricarbociani‐

na precursora y del resto biotinilado.

j

k

a b

cd

f g

he

i f

g

e hj k

i

b

a

Figura 3.27. Espectro RMN‐1H de 36 (500MHz, solvente CD3OD). Se muestran algunas señales característi‐cas de la tricarbocinaina precursora 37 y del resto biotinilado.


116

El compuesto 36 se caracterizó mediante su espectro de absorción en PBS y se

observó la aparición de una banda en 780 nm asociada a la aparición de agregados de

la aminotricarbocianina, sumada a la banda del monómero en 660 nm (Figura 3.28).

Por lo tanto se ensayaron diferentes solventes con el objetivo de minimizar la apari‐

ción de agregados, en todos los casos se observó la desaparición de la banda corres‐

pondiente a los mismos acompañado de un desplazamiento del máximo de absorción

correspondiente al monómero. Un caso particular resulta la mezcla de estreptavidi‐

na/36 en relación 1:1 en PBS 1% DMSO, donde las propiedades de solubilidad del com‐

plejo corresponden esencialmente a la de la proteína. En la Tabla 3.1 se resumen los

parámetros de absorción para cada solvente.

Tabla 3.1. Parámetros de absorción para 36 en diferentes sistemas de solventes.

Solvente λMáx Abs (nm) 0Máx (M‐1cm‐1)

DMSO 710 34.700

PBS/AcCN (1:1) 700 43.300

SAv en PBS 1% DMSO 630 67.000

500 600 700 800 9000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Abs

orba

ncia

Nor

mal

izad

a

Longitud de onda (nm)Figura 3.28. Espectros de absorción normalizados para 36 en PBS (rojo), PBS/AcCN 1:1 (azul), DMSO (negro) y estreptavidina en PBS 1% DMSO en relación SAv:36 1:1 (verde).


117

El conjugado estreptavidina/36 en relación 1:1 fue titulado con ZnCl2 en PBS

1% DMSO registrándose el espectro de emisión (゜Exc = 630 nm) luego de cada agregado

(Figura 3.29). Se observó que a medida que aumenta la relación [Zn2+]:[36] tiene lugar

una fuerte disminución en la intensidad de emisión del fluoróforo.

Se calcularon los cambios fraccionales según la ecuación [3.6] y se ajustaron los

datos obtenidos a la ecuación [3.7] para determinar el valor de la constante de disocia‐

ción del complejo con Zn2+, según se muestra en la Figura 3.30.

Se obtuvo un valor de Kd de 470±40 nM, que se encuentra en el orden del ob‐

tenido para 27, siendo ligeramente superior a este último lo que puede atribuirse al

mayor impedimento estérico que se desarrollaría alrededor de los fluoróforos por es‐

Figura 3.29. Cambios en el espectro de emisión de una mezcla 1:1 de estreptavidina/36 en PBS 1% DMSO frente a agregados de ZnCl2 desde una relación Zn2+/36 de 0 (azul) a 2,5 (rojo). ゜Exc = 630nm.

700 750 800 8500

10

20

30

40

50In

tens

idad

de

emis

ión

蔕U.A

.

蔔


0

sat 0

X XF

X X[3.6]

2

max min

2

R Zn R KdF

Kd Zn[3.7]


118

tar confinados en la superficie de la proteína. No obstante, el valor de Kd obtenido

resulta apropiado para la determinación de Zn2+ en una gran variedad de aplicaciones,

entre los que se cuentan los sistemas biológicos debido al rango dinámico de aplica‐

ción. El valor de Kd obtenido para 36 resulta ser significativamente menor al obtenido

para el sensor reportado por Ruedas‐Rama donde se informa un rango dinámico lineal

entre 5‐500 ´M. Sin embargo, cabe destacar que en los últimos los sensores ya se en‐

cuentran conjugados sobre la nanopartícula y puede existir un impedimento estérico

entre las unidades de reconocimiento que dificulte la interacción con el analito.

Luego se calculó el cambio en la integral de solapamiento espectral (J) entre los

QD655 y el conjugado SAv:36 en relación 1:1 frente a diferentes concentraciones de

Zn2+ (Figura 3.31). Se observa una fuerte disminución del valor de J con el aumento de

Figura 3.30. Cálculo de la constante de disociación del conjugado 36.

0 2 4 6 8 100.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Cam

bio

Fra

ccio

nal F

l 770n

m

[Zn2+] (M)

Kd = 470±40 nM R2 = 0.999

500 600 700 8000

20

40

60

Abso

rtivi

dad

mol

ar x

10-3

蔕M-1cm

-1

蔔


0

80

160

Intensidad de emisión

蔕U.A.

蔔0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

5

10

J x

10-1

5

蔕M-1cm

-1nm

4

蔔

[Zn2+]/[36]

a. b.

Figura 3.31. a. Cambios en la absorbancia de un conjugado SAv/36 (1:1) frente a agregados de ZnCl2, desde una valor de 0 (azul) a 2,5 (rojo), junto con el espectro de emisión de QD655 (negro). b. Varia‐cion en la integral de solapamiento espectral entre el nanocristal (donante) y 36 (aceptor).


119

la relación Zn2+/36, que resulta adecuado para la construcción de un sensor fluores‐

cente basado en la modulación de la eficiencia de la transferencia de energía según el

diseño seguido.

Por lo tanto y con el objeto de caracterizar el sistema QD655‐SAv ITK/36 se lle‐

vó a cabo una titulación de una solución de nanopartículas en PBS con una solución de

la aminotricarbocianina biotinilada en PBS 1% DMSO, registrando los cambios en la

intensidad de emisión del nanocristal. Como se esperaba, se observó una disminución

en la intensidad de fluorescencia de las nanopartículas relacionada con el incremento

en la relación [36]/QD655 (Figura 3.32.a). Asimismo se llevó a cabo la titulación de una

muestra control de nanopartículas (preincubados con un gran exceso de biotina libre y,

por lo tanto, insensibles a la presencia de fluoróforos biotinilados), observándose un

comportamiento similar que en la muestra anterior, según se observa en la Figura

3.32.a. Para descartar la posibilidad de conjugación inespecífica de la sonda se llevó a

cabo la titulación de las nanopartículas con el 36 en PBS 1% DMSO tomando los tiem‐

pos de vida media de fluorescencia luego de cada agregado (Figura 3.32.b) para las

nanopartículas libres y las preincubadas con biotina libre (muestra control). Se observa

que para los primeros el tiempo de vida media de fluorescencia disminuye con el au‐

mento de la relación [36]/[QD655], debido a la conjugación de una mayor cantidad de

0 100 200 3000.0

0.5

1.0

Inte

nsid

ad d

e em

isió

n a

655n

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[36]/[QD655]0 100 200 300

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20

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蔕ns

蔔

[36]/[QD655]

Figura 3.32. Titulación de una solución 10 nM de QD655‐SAv ITK en PBS con 36 en PBS‐1% DMSO to‐mando el máximo de emisión de fluorescencia (a) y el tiempo de vida media de fluorescencia prome‐dio de las nanopartículas luego de cada agregado. Los puntos negros corresponden a la muestra de QD655‐SAv ITK mientras que los puntos rojos corresponden al control de QD655‐SAv ITK preincuba‐dos con biotina

a. b.


120

aceptores en la superficie de la nanopartícula. Sin embargo para la muestra control el

tiempo de vida media de fluorescencia permanece prácticamente constante a medida

que la relación fluoróforo/nanopartícula aumenta, pudiéndose concluir que la dismi‐

nución de la intensidad de fluorescencia en este caso no se debe a un proceso de

transferencia de energía en el estado excitado.

A la luz de estos resultados, puede concluirse que la disminución de la intensi‐

dad de fluorescencia para esta titulación no se debe exclusivamente a la conjugación

de 36 en la superficie de la nanopartícula. Sino que tiene lugar otro proceso que puede

atribuirse a la presencia de DMSO en la solución madre de 36 utilizada en la titulación

(PBS 1% DMSO). La presencia del cosolvente es necesaria para disolver totalmente la

aminotricarbocianina y minimizar la presencia de agregados. Se ha estudiado el efecto

de diferentes cosolventes (acetonitrilo, metanol, DMF) en ausencia de la tricarbociani‐

na y en todos los casos se obtuvo un apagamiento de la señal fluorescente de la nano‐

partícula de 70‐80% para un agregado del 10% de mezcla buffer:cosolvente 1% .

Por lo tanto, la baja solubilidad en agua de 36 hace necesaria la presencia de un

cosolvente al momento de construir los conjugados con las nanopartículas. Una forma

posible de aumentar la solubilidad en agua de la tricarbocianina sería la introducción

de grupos con densidad de carga neta sobre la estructura química de la misma, p.ej.

mediante el agregado de grupos sulfonato. De esta manera, no sería necesario el uso

del cosolvente y, de esta manera, se podrían construir los conjugados QD‐fluoróforo,

esquema base de los nanosensores fluorescentes.

La formación de agregados de tricabocianinas en solventes acuosos y orgánicos

es un proceso extensamente conocido, el cual será examinado en profundidad en el

Capítulo 4 de este trabajo de tesis.

CONCLUSIONES

121

3.6. CONCLUSIONES

En este capítulo se mostró el desarrollo de nuevos sensores de pH y Zn2+ basa‐

dos en tricarbocianinas conjugadas sobre la superficie de Quantum Dots mediante el

uso de la interacción biotina‐estreptavidina. En primer lugar se llevó a cabo la prueba

de principio del funcionamiento de los nanosensores mediante el estudio de la modifi‐

cación de las propiedades ópticas de la aminotricarbocianina biotinilada 26, sintetizada

en el Capítulo 2 de este trabajo de tesis. El estudio de la modulación de las propieda‐

des fluorescentes de las nanopartículas conjugadas con estreptavidina mediante técni‐

cas en estado estacionario y resuelta en el tiempo frente al agregado del fluoróforo,

permitió describir la naturaleza de la interacción entre el fluoróforo y las nanopartícu‐

las, mostrando que el par FRET aminotricarbocianina‐QD655 resulta adecuado para la

construcción de los nanosensores.

Se sintetizaron derivados biotinilados de aminotricarbocianinas asimétricas

sensibles a pH (34) y Zn2+ (36), los cual fueron caracterizados mediante el estudio de

los cambios en sus propiedades ópticas frente a diferentes concentraciones del analito

de interés. Ambos sensores fluorescentes mostraron ser herramientas prometedoras

para su utilización en diferentes aplicaciones de alto interés biológico.

Para la tricarbocianina sensible a Zn2+ (36) la necesidad de usar un cosolvente

que evite la formación de agregados no fluorescentes, no permitió la construcción de

los conjugados con las nanopartículas fluorescentes QD655‐SAv.

Sin embargo, la aminotricarbocianina sensible a pH biotinilada (34) fue utilizada

con éxito para la construcción de nanosensores de pH mediante su conjugación con

QD655‐SAv ITK. Las sondas fluorescentes así construidas fueron caracterizadas me‐

diante el estudio de los cambios en los tiempos de vida media de fluorescencia de las

nanopartículas a diferentes valores de pH mediante el uso de microscopía FLIM, mos‐

trando una excelente performance en el rango 7,0‐9,5.


122

3.7. BIBLIOGRAFÍA

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CAPÍTULO 4

TRICARBOCIANINAS CONFINADAS SOBRE SUPERFICIES

INTRODUCCIÓN

125

4.1. INTRODUCCIÓN

Una propiedad característica e interesante de las cianinas es su habilidad para

formar espontáneamente agregados en solución, y en interfaces líquido‐sólido y líqui‐

do‐aire.1,2 El autoensamblado de esta familia de fluoróforos anfifílicos en agregados se

encuentra determinado por un delicado balance entre diferentes interacciones inter‐

moleculares: la fuerza de dispersión del esqueleto de la cianina, las fuerzas entrópicas

provenientes de las cadenas alquílicas, las fuerzas electrostáticas y de enlace de hidró‐

geno de los grupos iónicos y polares y las fuerzas de van der Waals.3,4 Mukamel y cola‐

boradores han estimado que la energía libre de agregación para la formación de un

dímero es alta, del orden de 20 kcal mol‐1.5 El comportamiento de los fluoróforos fren‐

te a la agregación resulta de suma importancia ya que influye notablemente en sus

propiedades fotofísicas y fotoquímicas. En particular, los agregados en solución mues‐

tran cambios en los espectros de absorción al compararlos con las especies monoméri‐

cas. Se han caracterizado dos tipos de comportamientos, la aparición de bandas con un

desplazamiento batocrómico respecto al monómero, denominadas bandas J6 (en ho‐

nor a Jelley, uno de los primeros investigadores que estudiaron este fenómeno), o de

bandas que muestran un corrimiento hipsocrómico, que se designan como bandas H7

(de Hipsocrómico). La aparición de estas nuevas bandas de absorción puede explicarse

en términos de la teoría de acoplamientos de excitones moleculares, i.e. el acopla‐

miento de momentos de transición de las moléculas de fluoróforo.8 El comportamien‐

to de las cianinas frente a la agregación es uno de los que se ha estudiado más extensi‐

vamente debido a que son los fluoróforos que mejor forman autoensamblados, siendo

los agregados J de los más importantes desde el punto de vista comercial para la sen‐

sibilización espectral fotográfica.9

La teoría de los excitones moleculares permite explicar la relación existente en‐

tre la orientación relativa de los cromóforos en los agregados y los desplazamientos

espectrales observados. Está comúnmente aceptado que ambos tipos de agregados (J

CAPÍTULO 4 – TRICARBOCIANINAS CONFINADAS SOBRE SUPERFICIES

126

y H) están compuestos de moléculas de fluoróforo ubicadas en forma paralela, que

forman un cristal bidimensional al agruparse. De acuerdo a la teoría de excitones mo‐

leculares, las moléculas en el agregado se comportan como dipolos puntuales que in‐

teractúan entre sí, dando lugar a dos nuevas bandas excitónicas: con un nivel de ener‐

gía mayor o menor respecto al nivel de energía del monómero, según la interacción

entre los dipolos individuales (Figura 4.1).10 En los agregados J, la disposición de las

moléculas tiene lugar en un arreglo del tipo cabeza‐cola, mientras que en los agrega‐

dos H las moléculas se disponen en un arreglo paralelo de tipo sandwich. Las energías

de transición electrónicas de dichos agregados pueden explicarse por las diferencias en

la geometría del empaquetamiento molecular,11,12 observándose que los agregados de

tipo J muestran un desplazamiento batocrómico (hacia el rojo) respecto de la banda

del monómero y los de tipo H un corrimiento hipsocrómico (hacia el azul).

Las estructuras de los agregados se diferencian según el denominado “ángulo

de deslizamiento”, α, que representa al ángulo entre la línea de los centros de una co‐

lumna de moléculas de fluoróforos y el eje longitudinal de cualquiera de las moléculas.

Se observa que ángulos pequeños (α<32°) resultan en desplazamientos batocrómicos

(agregados J), mientras que ángulos mayores (α>32°) se corresponden con desplaza‐

mientos hipsocrómicos (agregados H). Cabe destacar que el modelo de excitones sólo

es válido cuando la interacción entre los orbitales de las moléculas constituyentes es

Figura 4.1. Representación esquemática de la relación entre la disposición espacial de los fluoróforos en los agregados y los desplazamientos en los espectros de absorción, según la teoría de los excitones moleculares.10 Las líneas punteadas representan transiciones prohibidas.

INTRODUCCIÓN

127

despreciable.13 La tendencia de las moléculas a formar agregados depende tanto de la

estructura química del fluoróforo como de propiedades del entorno, como ser el pH, la

fuerza iónica, la concentración del cromóforo, la polaridad del solvente, la concentra‐

ción de electrolitos y la temperatura. En términos generales, el proceso de autoen‐

samblado depende en forma directa de la concentración del fluoróforo y fuerza iónica

y en forma inversa de la temperatura de trabajo.

Kimura y colaboradores14 llevaron a cabo un estudio de la detección de agrega‐

dos H y J de una tiacarbocianina (38) en solución acuosa, donde observaron la forma‐

ción de los diferentes tipos de agregados en función de la concentración del fluorófo‐

ro. En la Figura 4.2 se observan los espectros de absorción a diferentes concentracio‐

nes de 38, el espectro de menor concentración (0,001 mM) se asigna al monómero del

fluoróforo.15 Cuando se aumenta la concentración a 1 mM el espectro muestra una

nueva banda (centrada en 475 nm) que se encuentra desplazada con respecto al pico

del monómero (548 nm), esta banda se asigna a agregados H. Si la concentración de 38

se incrementa a 10 mM se observa la aparición de un pico agudo e intenso (centrado

en 636 nm), desplazado hacia el rojo con respecto al pico del monómero, que se asigna

a la formación de agregados J. También puede observarse que a concentraciones in‐

termedias (4 mM) se distingue la presencia de los dos tipos de agregados (H y J).

Figura 4.2. Espectros de absorción de la tiacarbocianina utilizada en el estudio (37) en soluciones acuo‐sas a diferentes concentraciones.10

38


128

La mayor parte de los fluoróforos orgánicos muestran tendencia a formar agre‐

gados de tipo H (o dímeros), sin embargo para los fluoróforos basados en polimetinos

la formación de agregados J resulta típica. Éstos tienen la particularidad de mostrar

una emisión fluorescente muy intensa, con bandas muy angostas, lo que convierte a

los agregados en sí mismos en potenciales sensores fluorescentes.

4.2. INMOVILIZACIÓN DE CIANINAS SOBRE SUPERFICIES

La construcción de ensamblados moleculares sobre superficies sólidas resulta

atractiva para muchos grupos de investigación en diferentes disciplinas. En este senti‐

do, los agregados J formados por cianinas poseen propiedades ópticas excepcionales

que despertaron gran interés, como ser la transferencia de energía y la cinética de de‐

caimiento radiativa de los agregados,16,17 o sus propiedades ópticas no lineales, poten‐

cialmente útiles para el desarrollo de dispositivos optoelectrónicos moleculares.18

Como se mencionó con anterioridad, las transiciones electrónicas en los agre‐

gados están influenciadas por la orientación de las moléculas en los mismos, lo que

permite sugerir que sería posible conseguir cierto grado de control sobre las propieda‐

des ópticas de los agregados J si se logra manipular el empaquetamiento molecular.

Como consecuencia, se ha originado un interés considerable en la obtención de imá‐

genes de alta resolución de estos ensambles moleculares con el objeto de llevar a cabo

un análisis exhaustivo de la naturaleza de los agregados. Es así que en trabajos recien‐

tes se ha estudiado la posibilidad de inmovilizar cianinas sobre superficies en diferen‐

tes sustratos, p.ej. mica,19,20 grafito21 u oro.22 Entre ellas, la adsorción de las cianinas

sobre superficies de oro resulta particularmente interesante debido a la notable esta‐

bilidad del Au frente a la oxidación y a sus propiedades ópticas y electrónicas bien de‐

finidas y perfectamente caracterizadas. En este sentido, se ha reportado que las ciani‐

nas pueden organizarse como agregados J sobre monocapas autoensambladas (Self‐

Assembled Monolayers, SAMs) de ácido 11‐mercaptoundecanoico23 y cisteamina24 so‐

bre superficies de oro. En el último caso, se ha conseguido una densidad de

INMOVILIZACIÓN DE CIANINAS SOBRE SUPERFICIES

129

1,3x1014 moléculas cm‐2 ancladas individualmente a la superficie por medio de interac‐

ciones electrostáticas. Asimismo, se ha reportado la formación de agregados J sobre la

superficie de nanopartículas de oro.25 En este sentido, la formación de agregados J

sobre sustratos plasmónicos ha adquirido una fuerte atención debido a la interacción

entre los estados excitados localizados en los agregados con los plasmones presentes

en el sustrato, que dan lugar a la formación de estados mixtos conocidos como “plexci‐

tones”, dado que se trata del acoplamiento de plasmones y excitones. Estos nuevos

estados artificiales, tienen implicaciones importantes en optoelectrónica y dispositivos

ópticos no lineales, metamateriales y sensado molecular aumentado por efectos de

superficie, entre otros.26‐29

Sin embargo, en los ejemplos discutidos los agregados J están débilmente an‐

clados a la superficie del sustrato mediante interacciones electrostáticas o del tipo van

der Waals. En este sentido, la disponibilidad de una molécula de cianina con una fun‐

cionalidad tiolada permitiría un anclaje mucho más efectivo a la superficie de Au. Sin

embargo, esta estrategia de funcionalización superficial involucra la competencia entre

dos tipos de empaquetamiento molecular: por un lado, está establecido que en tioles

ensamblados sobre superficies de oro, los enlaces S‐Au conllevan una distancia óptima

a la molécula más cercana de 0,5 nm; sin embargo, para agregados J en solución el

apilamiento π‐ π de las moléculas de cianina resulta en una distancia óptima entre mo‐

léculas vecinas de sólo 0,33 nm. Sumado a esto, la estructura de los ensambles de

cromóforos sobre superficies de oro no se encuentra totalmente elucidada aún, debi‐

do a que las SAMs formadas a partir de tioles aromáticos son mucho más complejas

que las de tioles alifáticos.30 En muchos casos, se observa que coexisten fases conti‐

nuas de tioles autoensamblados con islas de agregados cuya estructura y origen aún se

encuentran en discusión.31,32 En este sentido, se ha reportado la existencia de SAMs de

pirenos con diferentes tioles alifáticos de diferentes largos que pueden formar agrega‐

dos desordenados, SAMS con distancias moleculares compatibles con apilamiento π‐ π

o estructuras del tipo 5x√3 dependiendo del largo del ピol y la temperatura a la que se

construye el ensamblado.30


130

Dada la fuerte tendencia a la formación de agregados que mostraron algunas

de las cianinas sintetizadas en este trabajo de tesis, se decidió diseñar una tricarbocia‐

nina derivatizada con una funcionalidad tiolada (Figura 4.3, 42) para estudiar la forma‐

ción de autoensamblados sobre sustratos de Au(111) y nanopartículas (NP) de oro.

La tricarbocianina tiolada protegida 41 se obtuvo como un sólido azul con un

75% de rendimiento, se utiliza como precursor para almacenarla y se desprotege justo

antes de llevar a cabo los experimentos. La estructura de la tricarbocianina 42 permite

su anclaje a superficies de Au mediante una unión covalente S‐Au, mientras que los

grupos carboxilos en los extremos de la cadena alquílica permitirían una posterior con‐

jugación con una variedad de sustratos, como ser biotina, receptores de analitos, etc.

Para estudiar los ensambles de la tricarbocianina (y mezclas de la misma con

hexanotiol) en las diferentes superficies de Au, se utilizaron diferentes técnicas ins‐

Figura 4.3. Ruta sintética para la obtención de la tricarbocianina tiolada 42.

40

18 41

42

40

39

CARACTERIZACIÓN INICIAL DE LOS ENSAMBLADOS

131

trumentales de superficies, entre ellas la Microscopía de Efecto Túnel (Scanning Tunne‐

ling Microscopy, STM), Espectroscopía Raman Amplificada por Superficies (Surface En‐

hanced Raman Spectroscopy, SERS), Espectroscopía Fotoelectrónica de Rayos‐X (X‐Ray

Photoelectron Spectroscopy, XPS), Espectroscopía Infrarroja de Reflexión‐Absorción

con Modulación de Polarización (Polarization Modulation InfraRed Reflection‐

Absorption Spectroscopy, PM‐IRRAS) y técnicas electroquímicas como Voltametría

Cíclica (Cyclic Voltammetry), las cuales se detallan en la sección 7.2, página 239.

4.3. CARACTERIZACIÓN INICIAL DE LOS ENSAMBLADOS

La caracterización inicial de los ensamblados de la tricarbocianina tiolada sobre

un sustrato de oro se realizó mediante microscopía STM. Se tomaron imágenes de los

SAMs formados sobre sustratos de Au(111), que se preparon por incubación en una

solución 100 ´M de 42 en metanol. La Figura 4.4.a muestra los resultados obtenidos,

donde se observan las terrazas de Au(111) cubiertas por un gran número de especies

de tamaño nanoscópico distribuidas en forma aleatoria, que se asignan a la tricarbo‐

Figura 4.4. a. Imagen de STM (datos crudos), vista superior de 200 x 200 nm2 de un sustrato de Au(111) cubierto con 42. Sobre la superficie de Au, se observan especies de tricarbocianina (puntos brillantes) distribuidas al azar. b. Imagen de STM de 75 x 200 nm2 donde se muestran dominios orde‐nados de corto alcance de los adsorbatos de 42. c. Imagen 3D de STM de 50 x 50 nm2 de adsorbatos de 42 aleatoriamente distribuidos. d. Densidad espectral de potencia (PSD) que muestra una distribu‐ción amplia de especies. La línea verde indica el tamaño promedio de los adsorbatos (2,6 nm).

0.1 0.01 1E-3

PS

D 2

D is

o

Longitud de onda (m.ciclo-1)


132

cianina adsorbida. Un análisis detallado muestra que en ciertos lugares, estas especies

parecen seguir una orientación preferencial formando filas paralelas (p.ej. en el centro

de la terraza grande en la Figura 4.4.a), un comportamiento similar al reportado para

otros compuestos aromáticos sobre Au(111).32 No obstante, en la Figura 4.4.b se ob‐

servan dominios ordenados de corto alcance, en la forma de arreglos de puntos (de 2 a

3 nm) separados por 3,5 nm sobre la superficie de Au(111). Otros puntos se encuen‐

tran distribuidos en forma totalmente aleatoria, como puede observarse en la Figura

4.4.c. Estos últimos, que cubren la mayor parte de la superficie de oro, muestran dife‐

rentes contrastes, algunos son brillantes mientras que otros parecen más oscuros. El

análisis de la densidad espectral de potencia (Power Spectral Density, PSD) de los pun‐

tos dispuestos en forma aleatoria muestra una amplia distribución de tamaños con un

promedio de 2,6 nm, este valor es ligeramente superior al tamaño del sistema conju‐

gado de la cianina (2,1 nm, obtenido por optimización de estructuras mediante DFT‐

B3LYP al nivel de teoría 6‐31G*). Además de la amplia distribución de tamaños, en la

PSD se observa la existencia de especies con mayores valores de longitud de onda que

perficies.4 Este tipo de agregados moleculares desordenados también se han

tado para tricarbocianinas en solución y en superficies.4 Este tipo de agregados mole‐

culares desordenados también se han observado en ensamblados de 1‐(11‐mercapto‐

undecanodecil)pireno sobre superficies de Au(111).30 La estructura de los ensamblados

formados con 42 difiere completamente de los reportados para películas de heptame‐

tincianinas formados por spin‐coating, los cuales muestran especies de 50 nm.33 Cabe

destacar que en la técnica STM además de la información topológica se agrega infor‐

mación espectroscópica: por ejemplo la densidad local de estados electrónicos, los

modos vibracionales de moléculas adsorbidas o los modos colectivos de excitación de

una muestra. Esto se debe a que la información recogida en un STM es cierta convolu‐

ción de la topografía con las propiedades electrónicas de la muestra. La interpretación

de las imágenes de un STM es un tema de estudio en sí mismo.

En este punto, la información obtenida no permite diferenciar si las especies de

2,6 nm observadas corresponden a una única molécula de tricarbocianina o a un agre‐

NATURALEZA DE LA INTERACCIÓN CON LA SUPERFICIE

133

gado de la misma. Conjuntamente, también surgen otro tipo de interrogantes, entre

ellos: i. ¿Cuál es la naturaleza de la interacción de 42 sobre la superficie de Au(111),

fisisorción o quimisorción? ii. ¿La tricarbocianina se encuentra estructuralmente intac‐

tas en el ensamble? iii. Si se trata de una quimisorción, ¿cuál es la cobertura de enlaces

tiolato sobre la superficie? El uso de diferentes técnicas permitirá responder estas in‐

terrogantes en las siguientes secciones.

4.4. NATURALEZA DE LA INTERACCIÓN CON LA SUPERFICIE

Para determinar la naturaleza de la interacción de la tricarbocianina 42 con la

superficie de Au se realizó un estudio mediante espectroscopía XPS. Para ello, se estu‐

diaron sustratos de oro previamente incubados con la tricarbocianina, los resultados

más importantes se muestran a continuación. La señal correspondiente al orbital S 2p

(Figura 4.5.a) puede ser deconvolucionada en dos componentes correspondientes a

tioles quimisorbidos (162 eV) y tioles libres (163 eV)34, dando como resultado una rela‐

ción 162 eV/163 eV de 3:1. Esto confirma que existe una cantidad significante de mo‐

léculas de 42 que se encuentran unidos al sustrato de oro mediante un enlace tiolato.

La presencia de moléculas de tricarbocianinas adsorbidas es también consistente con

el espectro N 1s mostrado en la Figura 4.5.b. El pico principal en 399 eV se ha asignado

a los átomos de nitrógeno en los anillos de heterocíclicos presentes en la cianina35 y al

grupo amino36 presentes en la molécula. Del análisis de los datos obtenidos en el es‐

pectro XPS resulta una relación S 2p/N 1s cercana a 3, que es el valor esperado para

170 165 160 155

Cue

ntas

(U

.A.)

Energia de enlace (eV)

S 2p404 402 400 398 396

Cue

ntas

(U

.A.)

Energia de enlace (eV)

N 1s

a. b.

Figura 4.5. Espectro XPS de alta resolución de los SAMs de 42 sobre sustratos de oro, a. S 2p y b. N 1s


134

42. Además se obtiene una relación C:O:N:S de 42:11:3:1, muy cercano al esperado

44:4:3:1, con la excepción del O, que frecuentemente se encuentra presente como

agua fisisorbida en SAMs hidrofílicas36.

En resumen, los datos obtenidos de los espectros XPS indican que la mayor par‐

te de las moléculas de tricarbocianina se encuentran quimisorbidas en la superficie de

Au(111) mediante un enlace tiolato (componente S 2p 162 eV). Sin embargo, también

se desprende que alrededor del 25% de las moléculas de 42 están fisisorbidas sobre el

sustrato con el grupo tiol intacto (componente S 2p 163 eV), este componente puede

ser asignado a una fracción de moléculas de tricarbocianina intercaladas en la SAM o

en una segunda capa de adsorbato que no puede interactuar directamente con la su‐

perficie de Au, pero que permanece inmovilizado mediante fuerzas intermoleculares37.

4.5. INTEGRIDAD QUÍMICA DE LA TRICARBOCIANINA EN EL ENSAMBLADO

Mediante la técnica PM‐IRRAS es posible obtener el espectro IR del ensamblado

de 42 sobre la superficie de Au. A partir de éste, se pudo determinar la presencia e

integridad de la tricarbocianina sobre el sustrato mediante su comparación con el es‐

pectro IR de transmisión de 42 adsorbido sobre una pastilla de KBr.

La Figura 4.6 muestra los resultados obtenidos, se observa la presencia del mo‐

do de estiramiento asociado con el grupo carboxílico en ambos sistemas, ｀a C=O a 1735‐

1730 cm‐1. Las bandas correspondientes a los modos colectivos de los anillos también

se observan a ~1566 a 1585 cm‐1 y ~1464 a 1456 cm‐1.38 Estas dos bandas también

pueden ser asignadas a grupos C=C y C=N en resonancia39 y, probablemente, se trate

de la contribución de ambas señales. La banda observada a 1384‐1393 cm‐1 puede

asignarse al modo de deformación (~C‐H), mientras que la banda ancha por debajo de

los 1200 cm‐1 puede asignarse a modos de estiramiento C‐C alifático y a vibraciones de

anillos aromáticos orto‐disustituídos.

INTEGRIDAD QUÍMICA DE LA TRICARBOCIANINA EN EL ENSAMBLADO

135

En la zona de altas frecuencias se observan bandas correspondientes a los mo‐

dos , ｀a CH2 y ｀s CH2 que pueden ser asignadas a las cadenas alquílicas,40,41 en la pastilla

de KBr estos picos aparecen a 2918 y 2850 cm‐1 respectivamente, lo que indica que las

cadenas alquílicas se encuentran totalmente desplegadas con una conformación toda‐

trans, mientras que en la SAM sobre la superficie de Au(111) estas bandas se encuen‐

tran ligeramente desplazadas a números de onda mayores (2926 y 2855 cm‐1), indi‐

cando que las cadenas se encuentran retorcidas.42,43 En la Tabla 4.1 se resumen las

asignaciones realizadas.

Tabla 4.1. Asignación de señales IR para la tricarbocianina 42

Asignación Número de onda (cm‐1)

Pastilla KBr Monocapa sobre Au(111)

νa CH2 2918 2926

νs CH2 2850 2855

νa C=O 1735 1730

νC=C (conjugado) y/o modos

colectivos de anillos aromáticos 1566 1585

νC=N (conjugado) y/o modos

colectivos de anillos aromáticos 1464 1456

~C‐H 1384 1393

νC‐C 1134 (ancho) 1206 (ancho)

Flexión C‐H en el plano + esti‐

ramiento anillos aromáticos

orto disustituidos

1067

3300 3200 3100 3000 2900 2800 2700 2600

0.0000

0.0004

0.0008

0.0012

0.0016

0.0020

0.0024

0.0028

1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000

R/R

N úm ero de onda (cm -1) N úm ero de onda (cm -1)

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

Absorbancia

Figura 4.6. Espectro PM‐IRRAS de SAM de 42 sobre Au(111), línea negra. La resolución fue de 4 cm‐1 y se acumularon 1500 barridos. Espectro de transmisión FTIR de 42 adsorbido sobre una pastilla de KBr (línea roja), la resolución fue de 4 cm‐1 y se acumularon 200 barridos.


136

La Figura 4.6 muestra que la tricarbocianina 42 adsorbida sobre la pastilla de

KBr o en la SAM sobre Au(111) exhibe, en términos generales, las mismas bandas en

las mismas posiciones y con idéntica intensidad relativa, lo que redunda que no hay

una orientación preferencial de las moléculas sobre la superficie. La mayor diferencia

es el desplazamiento de las señales asignadas a ｀a CH2 y ｀s CH2 que permite concluir que

en la monocapa las cadenas alquílicas se encuentran más desordenadas que en la pas‐

tilla de KBr. Estos resultados permiten confirmar que la tricarbocianina permanece

intacta en la superficie. Además, estos resultados ratifican la ausencia de una orienta‐

ción preferencial de los agregados, como se desprendía de las imágenes de STM.

4.6. DETERMINACIÓN DE LA COBERTURA SUPERFICIAL SOBRE EL SUSTRATO DE ORO

Mediante la técnica de voltametría cíclica es posible calcular el cubrimiento su‐

perficial de las moléculas de CNN adsorbidas sobre la superficie y también estimar la

estabilidad del ensamblado. Está establecido que la desorción reductiva de monocapas

formadas por tioles proporciona picos catódicos en soluciones acuosas debidos a la

ruptura de los enlaces de tiolato S‐Au. Asumiendo que se trata de un proceso de 1

electrón, el cubrimiento superficial se calcula mediante la integración del pico de re‐

ducción. Por otro lado, dado que la adsorción de alcanotioles de distinto largo de ca‐

dena ha sido ampliamente estudiada, se puede utilizar el valor de la posición del pico

catódico de desorción para estimar la estabilidad del autoensablado de la CNN con

respecto a alcanotioles. Con esta finalidad se prepararon autoensamblados de he‐

xanotiol, los cuales se encuentran perfectamente caracterizados.

En la Figura 4.7 se muestran las curvas de desorción reductiva para SAMs for‐

madas con 42 y 6‐hexanotiol sobre sustratos de Au(111). Como se mencionó anterior‐

mente, la desorción reductiva de estos compuestos muestra potenciales de pico cató‐

dicos bien definidos que preceden a la reacción de evolución de hidrógeno (Hydrogen

Evolution Reaction, HER). Los resultados mostrados en la Figura 4.7 representan a una

serie de 10 determinaciones de desorciones reductivas.

DETERMINACIÓN DE LA COBERTURA SUPERFICIAL SOBRE EL SUSTRATO DE ORO

137

Las curvas muestran que las SAMs formadas a partir de 42 son desorbidas del

sustrato de Au a un potencial en el pico (Ep) de ‐0,92 V, mientras que las SAMs forma‐

das a partir de 6‐hexanotiol presentan un Ep= ‐0,99 V, en concordancia con resultados

previos.44 La diferencia entre los potenciales de pico de ambos tipos de monocapas es

de sólo 0,07 V (asumiendo un electrón por unión tiolato para la desorción reductiva).

Este resultado también vislumbra que el 6‐hexanotiol es un buen candidato como

agente de dilución de 42 para la preparación de SAMs mixtas. La densidad de carga

involucrada en la desorción del pico de 6‐hexanotiol (q) es de 7,5±7 ´C cm‐2, a partir

del cual se calcula una cubrimiento superficial de tiolato de 1/3 de acuerdo con la es‐

tructura c(4x2) que normalmente se encuentra en las imágenes STM de este tipo de

SAMs45. En el caso del potencial de pico catódico para monocapas formadas con 42

involucra una carga de 22±5 ´C cm‐2, consistente con el mayor tamaño de la molécula

de tricarbocianina.

No obstante, la pequeña disminución en la estabilidad electroquímica de la

monocapa formada a partir de 42 en comparación con la formada a partir de 6‐

-1.4 -1.2 -1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2-0.20

-0.15

-0.10

-0.05

0.00

0.05

-1.0 -0.9 -0.8

-0.02

-0.01

0.00

j [m

A.c

m-2]

E [SCE] / V

j (m

A c

m-2)

E [ESC] (V)

E [ESC] (V)

j (mA

cm

‐1)

Figura 4.7. Curvas de desorción reductiva para SAMs formados sobre Au(111) de 42 (roja) y he‐xanotiol (azul), adquiridos a 0,05 V s‐1 en NaOH 0,1 M. Inset: curvas de desorción tomadas para SAMs formados por 42 monoméricas (verde) o monómeros y agregados J (rojo)


138

hexanotiol, se atribuye a la mayor solubilidad de la tricarbocianina en el electrolito

acuoso, que puede asistir la desorción. De hecho, está establecido que para desorcio‐

nes reductivas en medio acuoso existe una contribución de fuerzas hidrofóbicas que

ayudan a estabilizar la monocapa de 6‐hexanotiol sobre la superficie de Au.

Como se mencionó con anterioridad, las soluciones de tricarbocianina frecuen‐

temente están formadas por una mezcla de monómeros y agregados de cianinas. Esto

pudo determinarse mediante el análisis de los espectros de absorción UV‐visible de

soluciones 50 ´M de 42 en metanol, a 0 y 24 h de preparadas, según se muestra en la

Figura 4.8.a. En las soluciones recién preparadas se observa una banda con un máximo

de absorción en 650nm, que es la esperada para aminotricarbocianinas en su forma

monomérica (curva roja). Sin embargo, luego de 24 h de incubación protegidos de la

luz, se observa la aparición de una banda a 800 nm que corresponde a la formación de

agregados J (curva negra).46

Los autoensamblados de 42 sobre sustratos de Au(111) fueron también carac‐

terizados por espectroscopia Raman utilizando dos líneas laser de excitación: por un

lado 647,1 nm, donde tiene el máximo de absorción la forma monomérica de la tricar‐

Longitud de onda (nm) Desplazamiento Raman (cm‐1)

Absorban

cia

Intensidad

(U.A.)

Intensidad

(U.A.)

a. b. c.

Figura 4.8. a. Espectros UV‐visible de soluciones 50 ´M de 42 en metanol, luego de 0 (rojo) y 24 h (negro) de preparadas. Bandas de baja frecuencia de los espectros Raman de tricarbocianinas tioladas sobre sustratos de oro con líneas de excitación a 647,1 nm (b) y 775 nm (c). Las curvas corresponden a ensamblados formados a partir de soluciones con (negro) y sin (rojo) agregados J en solución.

DETERMINACIÓN DE LA COBERTURA SUPERFICIAL SOBRE EL SUSTRATO DE ORO

139

bocianina, y 775 nm, donde se excita selectivamente los agregados J (según se muestra

en la Figura 4.8.a). Cabe destacar que este estudio de espectroscopía Raman se mues‐

tran las bandas de baja frecuencia (450‐800 cm‐1) típica de los agregados J fisisorbidos

en superficies de diferentes metales.47 Estos modos vibracionales Raman se han detec‐

tado (y predicho en forma teórica) sólo para los agregados, no se observan (o son ape‐

nas visibles) en tricarbocianinas en su forma monomérica,48 se asignaron a vibraciones

fuera del plano en cianinas similares.49,50 Como se observa en las Figura 4.8.b y c, en

comparación con el espectro del monómero, se observa un incremento en la intensi‐

dad y desdoblamiento de la banda a 558 cm‐1 (a 647,1 nm) en 526 cm‐1 y 558 cm‐1 (a

775nm). El hecho de que las bandas de baja frecuencia aumenten su intensidad cuan‐

do se incide con la línea laser de 775 nm podría deberse a un proceso Raman resonan‐

te que está relacionado con la excitación de los estados electrónicos del agregado J

(excitones localizados), que poseen una absorción intensa en 800 nm, como se mues‐

tra en el espectro de la Figura 4.8.a.51 Por lo tanto, la presencia de bandas de baja fre‐

cuencia y su dependencia de la línea laser utilizada en la excitación, son una clara evi‐

dencia de la presencia de agregados J sobre la superficie de Au(111), en concordancia

con los resultados obtenidos en las secciones anteriores.

La espectroscopía Raman también puede ser utilizada para elucidar el meca‐

nismo que tiene lugar en la interfaz sólido‐líquido y cuál es el origen de los agregados

sobre la superficie del sustrato. Pueden plantearse, al menos, dos mecanismos para la

formación de los agregados: que la agregación se produzca luego de la adsorción del

monómero sobre la superficie o que ocurra una adsorción selectiva de los agregados

ya formados en la solución. Para ello se llevaron a cabo incubaciones de sustratos de

Au(111) en soluciones de 42 exclusivamente en su forma monomérica (Figura 4.8.a,

curva roja) o con una baja proporción de agregados J (Figura 4.8.a, curva negra). En el

espectro Raman de ambas muestras se observa una banda centrada en 310 cm‐1 que

fue asignada con anterioridad al enlace S‐Au,52 un indicio más de que la tricarbocianina

tiolada se encuentra adsorbida sobre de la superficie mediante enlaces tiolato con el

sustrato. Sin embargo, la comparación de ambos espectros Raman permite confirmar


140

que no se observan agregados cuando la solución de incubación sólo está compuesta

de tricarbocianina exclusivamente en su forma monomérica. Este resultado contrasta

con trabajos previos donde se reporta que la agregación está promovida por interfaces

sólido/líquido.2

Un análisis más profundo permite establecer comparaciones entre los agrega‐

dos formados a partir de soluciones que contienen exclusivamente monómeros o una

mezcla de monómero con agregados J. La integración de la banda a 310 cm‐1 corres‐

pondiente al enlace S‐Au muestra que la cantidad de uniones tiolatos en SAMs forma‐

das con la presencia de agregados es el doble de la que se obtiene sólo con monóme‐

ro. Esta relación también fue confirmada por las densidades de carga involucradas en

las curvas de desorción reductiva (Figura 4.7, inset) para SAMs formadas a partir de

una mezcla de monómeros y agregados J (22±5 Ć cm‐2) o de monómeros únicamente

(11±2 Ć cm‐2). Si se considera que la SAM consiste en un arreglo de monómeros con

un largo de 2,1 nm separados por 0,5 nm (la distancia al vecino próximo encontrada en

alcanotioles45 y pequeños tioles aromáticos30 sobre Au(111)) se predice un valor de

densidad de carga de 16 Ć cm‐2, que es muy cercano al valor obtenido en forma expe‐

rimental de 11±2 Ć cm‐2. Sin embargo, el valor obtenido para SAMs formadas a partir

de mezclas de monómero y agregados J es de 22±5 Ć cm‐2, éste concuerda perfecta‐

mente con un arreglo ideal de moléculas de tricarbocianina de 2,1 nm de largo separa‐

das por una distancia de 0,33 nm (distancia encontrada en agregados en solución),53

para el que se predice una densidad de carga de 23 Ć cm‐2. Además, cabe destacar

que para SAMs formadas a partir de tioles aromáticos voluminosos mediante micros‐

copía STM también se ha obtenido una distancia a la molécula vecina más cercana de

0,33 nm.30

El hecho de que las superficies autoensambladas formadas a partir de agrega‐

dos J tienen un número mayor de enlaces tiolato por unidad de área permitiría explicar

su adsorción preferencial al sustrato de Au(111). Además, si bien en estos ensambles la

separación entre moléculas vecinas es menor a la óptima para enlaces S‐Au de alcano‐

ENSAMBLADOS DE TRICARBOCIANINAS SOBRE NANOPARTÍCULAS DE ORO

141

tioles, la distancia de 0,33 nm también resulta compatible con superficies de Au(111), y

se estima que la diferencia entre las energías de adsorción para ambos tipos de empa‐

quetamientos es pequeña.54 También se ha propuesto que los enlaces S‐Au podrían

ocupar sitios de adsorción diferentes sobre la superficie de Au(111).55‐57 Además, las

interacciones entre moléculas de tricarbocianina en los agregados J también contribui‐

rían a la estabilización de la superficie autoensamblada.

Respecto al mecanismo de adsorción, resulta razonable pensar que los agrega‐

dos J deberían adsorberse en forma preferencial por sobre los monómeros en el esta‐

do de fisisorción inicial (antes de la disociación del enlace S‐H) ya que su mayor tama‐

ño daría lugar a mayores interacciones del tipo van der Waals. De esta manera se ex‐

plicaría la adsorción selectiva de los agregados J sobre la superficie de Au(111) aun

cuando en la solución haya una gran cantidad de tricarbocianina en su forma monomé‐

rica y sólo un pequeño número de agregados J (Figura 4.8.a). La adsorción selectiva de

agregados J de mayor tamaño con respecto a otros más pequeños también ha sido

propuesto para la adsorción sobre superficies de AgBr, mediante un proceso repetitivo

de adsorción‐desorción.58 Sin embargo, resulta llamativo que los SAMs formados por

monómeros sean incapaces de formar agregados J sobre la superficie de oro. Como se

desprende de los resultados obtenidos, la disposición de las moléculas en el ensam‐

blado es diferente, mostrando que la distancia a la molécula vecina es cercana a los

0,5 nm para las SAMs formadas a partir de monómero y de 0,33 nm para las ensam‐

bladas a partir de la mezcla de monómeros y agregados J. En este sentido, resulta po‐

sible proponer que la barrera energética para reordenar las moléculas en el ensambla‐

do sobre la superficie es demasiado alta para ser sobrepasada, por lo que este proceso

no se observa en la escala de tiempo de los experimentos.

4.7. ENSAMBLADOS DE TRICARBOCIANINAS SOBRE NANOPARTÍCULAS DE ORO

Como se mencionó anteriormente, la obtención de agregados J sobre la super‐

ficie de sustratos plasmónicos resulta de gran interés para su aplicación en dispositivos


142

ópticos no lineales o en optoelectrónica, entre otros. Con el objetivo de caracterizar

este tipo de ensamblados, se procedió a la formación de SAMs de agregados J sobre la

superficie de nanopartículas de oro (AuNPs). Para tal fin, se sintetizaron las nanopartí‐

culas según el método de Turkevich,59 las cuales se obtuvieron estabilizadas en buffer

citrato pH 7.5. Las AuNPs obtenidas fueron caracterizadas mediante espectroscopía

UV‐visible y Microscopía de Transmisión Electrónica (Transmission Electron Microsco‐

py, TEM), Figura 4.9. El pico de máxima absorción (resonancia del plasmón superficial)

está ubicado en 520 nm, en concordancia con resultados previos. Asimismo, la Figura

4.9.b muestra la función de distribución de tamaños y como inset una imagen TEM de

las AuNPs estabilizadas en buffer citrato pH 7,5. La determinación de la distribución de

tamaños se llevó a cabo utilizando el programa ImageJ,60 obteniéndose un tamaño

promedio de 12±1 nm sobre una población de 230 partículas, sin utilizar algoritmos de

ningún tipo.

La funcionalización de las AuNPs se realizó mediante el desplazamiento del re‐

cubrimiento de citratos por la SAM formada a partir de la tricarbocianina 42 tiolada.

Para ello, se incubaron las AuNPs con la tricarbocianina en una relación 1:1000, respec‐

tivamente, durante una noche y en la oscuridad. Las AuNPs funcionalizadas (AuNPs‐42)

se separaron del exceso de tricarbocianina en solución mediante una serie de pasos de

8 10 12 14 16 18 200.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Tamaño de partícula (nm)

Frec

uenc

ia N

orm

aliz

ada

a. b.

Figura 4.9. Caracterización de nanopartículas de oro estabilizadas en buffer citrato pH 7,5. A. Espectro UV‐visible. b. Función de distribución de tamaños. Inset: Imagen TEM.

300 450 600 750 9000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Abs

orba

ncia

Longitud de onda (nm)Longitud de onda (nm) Tamaño de partícula (nm)

Frecuen

cia Norm

alizada

Absorbancia

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,2

0,4

0,8

0,6

8 10 12 14 16 18 20


143

centrifugación a 4°C.Para monitorear el proceso de limpieza, se tomaron espectros UV‐

visible a las soluciones sobrenadantes hasta observar la ausencia de la señal de tricar‐

bocianina. La Figura 4.10.a muestra el espectro UV‐visible de las AuNPs‐42 purificadas

en buffer citrato; a fines comparativos, se muestra también el espectro correspondien‐

te a las AuNPs originales estabilizadas en buffer citrato, pH 7,5. Ambos espectros son

esencialmente idénticos, con un pico de máxima absorbancia posicionado en 520nm,

indicando que el procedimiento de funcionalización no afecta la naturaleza de las

AuNPs. Asimismo, el espectro UV‐visible de las AuNPs‐42 muestra un pequeño hombro

en 800 nm, que corresponde al recubrimiento con 42 pero debido al elevado valor del

coeficiente de absorción molar de las nanopartículas no es fácilmente detectable. Por

otro lado, la Figura 4.10.b muestra la distribución de tamaños de partículas, el cual fue

generado a partir de imágenes TEM (inset) de la misma forma que para las AuNPs indi‐

viduales. Se determinó de esta manera un tamaño promedio de 12±1 nm, para 190

partículas, que es el mismo valor obtenido para las AuNPs‐42 sin funcionalizar en buf‐

fer citrato, aunque la distribución de tamaños no es exactamente la misma. Estos re‐

sultados permiten concluir que la modificación superficial de las AuNPs‐42 con la tri‐

carbocianina 42 no afecta la morfología de las nanopartículas originales.

Para caracterizar el ensamblado sobre la superficie de las nanopartículas, se

400 600 800-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Abs

orba

ncia

Longitud de onda (nm) 8 10 12 14 16 18 200.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Tamaño de partícula 蔕nm 蔔

Frec

uenc

ia N

orm

aliz

ada

a. b.

Figura 4.10. Caracterización de nanopartículas de Au funcionalizadas con 42. a. Espectro UV‐visible de las nanopartículas modificadas con la tricarbocianina (línea llena) y sin modificar (línea punteada) en buffer citrato pH 7,5. b. Función de distribución de tamaños para nanopartículas modificadas. Inset: imagen TEM de las nanopartículas.


144

realizó un espectro SERS de las mismas utilizando una línea de excitación a 647,1 nm.

En la Figura 4.11 se presenta el resultado obtenido, puede observarse que, al igual que

en el caso de la superficie de Au(111) plana, el espectro muestra una banda centrada

en 310 cm‐1 consistente con la presencia de enlaces tiolato. Asimismo, la banda a

558 cm‐1, observada también en las SAMs sobre un sustrato de Au(111), permite con‐

firmar la presencia de los agregados J en la superficie de las AuNPs.

Otra característica deseable en la formación de ensamblados es la capacidad de

controlar la cantidad de tricarbocianina inmovilizada en la superficie de sustrato. Con

este objeto, se prepararon monocapas autoensambladas en presencia de 6‐hexanotiol.

La Figura 4.12 se muestran las imágenes STM de los sustratos de Au(111) incubados en

una mezcla 1:10 de 42 y 6‐hexanotiol, respectivamente. Pueden observarse las terra‐

Figura 4.11. Bandas de baja frecuencia en el espectro SERS de nanopartículas de oro modificadas con 42 en solución (línea de excitación 647,1 nm).

Desplazamiento Raman (cm‐1)

Absorbancia

Figura 4.12. Imágenes STM de SAMs mixtas formadas a partir de una mezcla 42:6‐hexanotiol (1:10). a. Imagen de 200 x 200 nm2, notar la baja densidad de puntos brillantes. Imagen de alta resolución de 50x50 nm2 (b) y 30x15 cm2 (c) mostrando agregados de tricarbocianina aislados (puntos brillantes) ensamblados entre filas de moléculas de 6‐hexanotiol.

Agregados JAu‐S


145

zas de Au con los típicos huecos inducidos por la adsorción del tiol alifático y algunos

puntos brillantes correspondientes a agregados J de la tricarbocianina. Utilizando una

imagen con resolución molecular (Figura 4.12.b y c) es posible apreciar que los puntos

brillantes están insertados dentro de los dominios de 6‐hexanotiol, los cuales exhiben

filas separadas por 1 nm (Figura 4.12.c), típicas del cristal c(4x2) de tioles alifáticos so‐

bre Au(111). El tamaño promedio de los puntos brillantes es similar al reportado en la

Sección 4.3 (página 131) para los ensamblados formados a partir de la tricarbocianina

tiolada, lo que sugiere que se trata nuevamente de especies agregadas. Esto se condi‐

ce con el espectro UV‐visible registrado para la solución con la mezcla 42:6‐hexanotiol,

Figura 4.13, donde se observa la presencia una banda de absorción en 800 nm, carac‐

terístico de los agregados J de la tricarbocianina 42.

Un análisis detallado de las imágenes STM de alta resolución obtenidas para el

ensamblado mixto (Figura 4.12.b y c) permite concluir que los agregados de tricarbo‐

cianina se adsorben preferentemente en los bordes de los huecos provocados por el

ensamble del tiol alifático. Este resultado también fue observado en SAMs mixtas de

azul de metileno y 6‐hexanotiol,61 y fue atribuido a que en esas regiones existe un ma‐

yor desorden en el ensamble de tiol lo que favorece la inclusión de los agregados.

400 600 8000.000

0.025

0.050

0.075

0.100


Abs

orba

ncia

Figura 4.13. Espectro UV‐visible de una solución 1:10 de 42:6‐hexanotiol en metanol, luego de 24 horas de incubación.


146

4.8. CONCLUSIONES

Este trabajo permitió estudiar y caracterizar la formación de superficies auto‐

ensambladas de tricarbocianinas sobre sustratos de oro, tanto en superficies planas de

Au(111) como de nanopartículas de Au de 12nm de diámetro mediante diversas técni‐

cas instrumentales.

En primer lugar, los datos obtenidos a partir de las espectroscopías XPS y Ra‐

man demostraron que la mayoría de las moléculas de tricarbocianina tiolada (42) se

encuentran unidas a la superficie de Au(111) y a las nanopartículas de oro mediante

enlaces tiolato (S‐Au), del mismo tipo que las reportadas para tioles alifáticos sobre

superficies de Au(111). Por otro lado, mediante los espectros Raman, imágenes STM y

estimaciones de la cobertura superficial (mediante las curvas de desorción reductiva)

se pudo concluir que la mayoría de las moléculas de tricarbocianina se encuentran so‐

bre la superficie del sustrato como agregados J, siempre que éstos estén presentes

(aun en pequeña proporción) en la solución de incubación. Sin embargo, también se ha

encontrado que si la solución inicial está formada sólo por tricarbocianina en su forma

monomérica, el autoensamblado formado no puede reorganizarse para formar agre‐

gados J sobre el sustrato, p.ej. cuando los parámetros del ensamble se optimizan para

el monómero, la unión S‐Au es suficientemente fuerte para superar las interacciones

provenientes del apilamiento π‐π entre los monómeros adsorbidos. A partir de estos

resultados, se pudo concluir que los agregados J se adsorben en forma preferencial

sobre la superficie del sustrato, aun cuando los mismos se encuentran en una muy baja

proporción en la solución de incubación. El hecho de que los agregados J subsistan en

la superficie de Au es un indicativo de que las fuerzas de interacción provenientes del

apilamiento π‐π entre un gran número de moléculas en el agregado J introduce una

barrera de energía que no puede ser sobrepasada para optimizar la unión S‐Au con el

sustrato. Asimismo, la adsorción de agregados J involucra el doble de enlaces tiolato

por unidad de superficie respecto al ensamblado formado sólo por monómeros, este

hecho puede ser una fuerza impulsora importante que dirija el proceso de autoensam‐

CONCLUSIONES

147

blado. También se ha mostrado que el ensamblado de agregados J no sólo tiene lugar

en superficies de Au atómicamente planas sino que también pueden ensamblarse so‐

bre sustratos rugosos como las que se encuentra en la superficie de nanopartículas de

oro.

Asimismo, se ha mostrado que es posible usar tioles alifáticos como agentes de

dilución eficientes para los agregados J, de manera que resulta posible controlar su

cantidad sobre la superficie de Au(111) a través de la proporción de tricarbociani‐

na:alcanotiol en la solución de incubación utilizada.

Esta estrategia de inmovilización de tricarbocianinas sobre superficies tiene la

ventaja de ser muy versátil, ya que a partir del precursor común 18, según las rutas

sintéticas vistas en el Capítulo 2 de este trabajo de tesis, es posible extender esta es‐

trategia a una familia de tricarbocianinas con tioles de diferente longitud, con el objeto

de estudiar cómo se afectan las propiedades del ensamblado con el largo de la cadena

de tiol alifático. Asimismo, la presencia de los grupos carboxílicos en el núcleo de la

tricarbocianina abre la posibilidad de funcionalizaciones posteriores para la construc‐

ción de sensores fluorescentes, agentes de reconocimiento específico, etc.


148

4.9. BIBLIOGRAFÍA

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CAPÍTULO 5

NANOSENSORES APLICADOS A SISTEMAS IN VIVO

INTRODUCCIÓN

151

5.1. INTRODUCCIÓN

El pH intracelular (pHi)1 juega un rol crítico en muchos procesos en células, en‐

zimas y tejidos, su regulación es esencial para muchos procesos celulares, entre ellos la

proliferación y apoptosis,2,3 transporte de iones,4,5 endocitosis6 o contracción muscu‐

lar.7 Por lo tanto, el estudio de los cambios de pH en el interior de células in vivo es

muy importante para el estudio de las funciones celulares y lograr un mejor entendi‐

miento de las funciones patológicas y fisiológicas, p. ej. fagocitosis,8 endocitosis9 e in‐

ternalización vía interacción receptor‐ligando.10 Valores anormales de pHi frecuente‐

mente están asociados con un funcionamiento, crecimiento o división celular inapro‐

piados, y frecuentemente se observan en enfermedades como cáncer11 o Alzheimer.12

Algunas organelas, p. ej. endosomas13 y vacuolas en plantas,14 poseen valores de pH

intracompartimental en el rango de 4 a 6. En biología celular, los valores bajos de pH

en los diferentes compartimentos pueden ser utilizados para la desnaturalización de

proteínas o para activar la función de enzimas y proteínas, p. ej. el ambiente acídico en

lisosomas (pH 4,5‐5,5)15 facilita la degradación de proteínas durante el metabolismo

celular. Por lo tanto, frecuentemente la disfunción celular se encuentra asociada con

valores de pH anormales en organelas.13

La existencia de conexiones intrínsecas entre la función celular y el pH intrace‐

lular implica que es posible conseguir información crítica para el estudio de procesos

fisiológicos y patológicos mediante determinaciones precisas del pH intracelular, inclu‐

so en organelas individuales. Por lo tanto, el desarrollo de técnicas con buena resolu‐

ción espacial y temporal resulta altamente conveniente. El pH intracelular puede ser

determinado mediante diferentes técnicas, entre las que se cuenta el uso de micro‐

electrodos, resonancia magnética nuclear, espectroscopía de absorbancia o microsco‐

pía y espectroscopía de fluorescencia.2,6 Entre ellos, los métodos fluorescentes tienen

alta relevancia para la determinación del pH intracelular en células intactas y regiones

subcelulares y muestran diversas ventajas sobre las otras técnicas, entre las que se

CAPÍTULO 5 – NANOSENSORES APLICADOS A SISTEMAS IN VIVO

152

cuentan una alta sensibilidad y resolución espacial y temporal.3 Más aun, las técnicas

fluorescentes tienden a ser operacionalmente sencillas y, en la mayoría de los casos,

no son destructivas.

No obstante, las determinaciones realizadas mediante fluoróforos indicadores

de pH se ven fuertemente influenciadas por diferentes factores, entre los que se cuen‐

tan variaciones de concentración local de la sonda o cambios en el camino óptico.6

Durante la década pasada, el método más utilizado para la caracterización de meca‐

nismos regulatorios en diferentes compartimentos celulares fue la microscopía de

fluorescencia mediante el uso de “detección radiométrica”,16 i.e. relaciones obtenidas

entre detecciones simultáneas (o casi simultáneas) de determinaciones de fluorescen‐

cia a dos (o más) longitudes de onda de emisión y/o excitación de la sonda de pH. En

este sentido, las técnicas de fluorescencia resueltas en el tiempo han mostrado un rá‐

pido crecimiento dando lugar a una estrategia de microscopía fluorescente diferente,

la microscopía de tiempos de vida media de fluorescencia (Fluorescence Lifetime Ima‐

ging Microscopy, FLIM) la cual fue utilizada con éxito para el seguimiento de diferentes

procesos celulares in vivo.17‐19

Sin embargo, el uso de indicadores fluorescentes basados en fluoróforos orgá‐

nicos pequeños muestra algunas limitaciones severas debido a su rápido fotoblanqueo

durante el transcurso de la determinación, lo que no permite el seguimiento en el

tiempo de muchos procesos celulares. Por ello, el desarrollo de indicadores fluorescen‐

tes con mayor sensibilidad, relación señal‐ruido mejorada y alta fotoestabilidad es un

área en constante expansión. Estas mejoras permitirían llevar a cabo una gran cantidad

de determinaciones, p.ej. determinaciones de la respuesta del pH intracelular frente a

cambios en el entorno, estado y tipo de célula. Adicionalmente, la capacidad de de‐

terminar el pH con resolución espacial y temporal podría utilizarse para la visualización

de la internalización y liberación de transportadores de drogas.20,21

En los últimos años se han reportado diferentes trabajos donde se utilizan na‐

nopartículas de material semiconductor funcionalizados como sensores de pH. De esta

INTRODUCCIÓN

153

manera se aprovechan las ventajas que presentan las nanopartículas frente a las

fluoróforos orgánicos, entre las que se destacan su elevada fotoestabilidad (que permi‐

te determinaciones extendidas en el tiempo), alto rendimiento cuántico y gran brillo

(que mejoran la sensibilidad en la detección) y tiempos de vida media de fluorescencia

largos (que facilitan su determinación mediante técnicas FLIM). Durante el desarrollo

de este trabajo de tesis, se han reportado diferentes sensores de pH basados en QDs

modificados con moléculas que modulan sus propiedades ópticas mediante procesos

de transferencia de electrones o de energía.22‐25

No obstante, las aplicaciones de los QDs en microscopías in vivo o in vitro están

limitadas por su agregación y pobre internalización.26‐29 La internalización de QDs de‐

pende de muchos factores, entre ellos el tamaño, la carga superficial y las funcionali‐

dades presentes en la superficie.30 Se han investigado diferentes técnicas para el

transporte intracelular de QDs como ser la electroporación31, microinyección32, y téc‐

nicas bioquímicas, entre las que se destacan el uso de péptidos catiónicos o mediante

sistemas ligando‐receptor.29,33‐35

Uno de los métodos más utilizados para el transporte selectivo de nanopartícu‐

las es la endocitosis mediada por receptores.36‐38 La unión de ligandos que son especí‐

ficos para ciertos receptores permite un incremento de 1.000 veces en la concentra‐

ción intracelular de la especie respecto de los métodos físicos, siendo de los métodos

más efectivos para la internalización de diferentes especies. Uno de los sistemas más

utilizados para la internalización mediante receptores es la endocitosis mediada por

factores de crecimiento epidérmico (Epidermal Growth Factor, EGF).39 El proceso de

internalización por receptores se esquematiza en la Figura 5.1: comienza con la unión

del ligando a un receptor específico, luego tiene lugar una invaginación de la membra‐

na plasmática formando una vesícula que termina por desprenderse de la membrana

para incorporarse al citoplasma (endosomas tempranos, pH 6,5). Luego tiene lugar un

flujo de H+ hacia el interior dando lugar a los endosomas tardíos (pH~5,5), los cuales


154

pueden fusionarse entre sí. A su vez, éstos pueden fusionarse con lisosomas (pH~4,5)

que poseen enzimas proteolíticas que llevan a la degradación proteica.

En 2004, Lidke y colaboradores utilizaron QD recubiertos con estreptavidina pa‐

ra llevar a cabo estudios de internalización celular utilizando el receptor erbB1, uno de

los cuatros subtipos de receptor homólogos.39 En dicho trabajo se preparó una fusión

del receptor erbB3 con mCitrina (un tipo de proteína fluorescente) el cual fue expresa‐

do en células A431 (células de carcinoma epidermoide humano). Estas células fueron

incubadas con QD655‐SAv PEG conjugados con EGF biotinilado (QD‐EGF), los cuales se

unen rápidamente a la superficie celular (las células expresan el receptor erbB1 en

forma endógena), Figura 5.2. Este trabajo demostró que la internalización de las nano‐

partículas fluorescentes se lleva a cabo en forma de conjugados con el receptor erbB1,

dejando el erbB3‐mCitrina en la membrana celular. Las nanopartículas unidas al recep‐

tor, son transportadas rápidamente a lo largo de las filopodias celulares mediante un

proceso de transporte retrógrado.

Figura 5.1. Esquema de la progresión del camino endocítico mediado por receptores.

INTRODUCCIÓN

155

Los conjugados de QD‐EGF unidos a las filopodias fueron detectados al nivel de

nanopartículas individuales, Figura 5.2.b. El uso de nanopartículas fluorescentes hizo

posible el estudio de procesos celulares sin precedentes en la literatura hasta ese mo‐

mento.

En este capítulo se mostrará la síntesis y caracterización de un sensor de pH ba‐

sado en una carboxinaftofluoresceína biotinilada. El mismo fue diseñado para ser con‐

jugado con nanopartículas fluorescentes funcionalizadas con estreptavidina, de mane‐

ra de generar un nuevo nanosensor de pH fluorescente. Asimismo, se analizó desde un

punto de vista fotofísico la modulación en las propiedades ópticas de la nanopartícula

central en presencia del fluoróforo biotinilado, proponiéndose un modelo que permite

describir la naturaleza de la interacción y determinar algunos parámetros de interés

(p.ej. el número y naturaleza de los sitios de unión en las nanopartículas). También se

llevó a cabo la caracterización de la respuesta de los nanosensores construidos frente a

cambios en el pH del medio mediante técnicas en estado estacionario y resueltas en el

tiempo y se propuso un modelo fotofísico para describir los resultados obtenidos. Asi‐

Figura 5.2. Transporte retrógrado de QD‐EGF en filopodias. Panel superior. Células A431 expresando el receptor erbB3‐mCitrina, proyección de máxima intensidad de 4 secciones confocales de 0,5 ´m en función del tiempo. Panel inferior. Ampliación de la filopodia señalada en la última imagen del panel superior. Barras de escala, 5´m.


156

mismo, se llevó a cabo la caracterización de los nanosensores en sistemas in vivo me‐

diante Microscopía de Tiempos de vida de Fluorescencia (FLIM).

5.2. DISEÑO Y CARACTERIZACIÓN DEL SENSOR DE PH

5.2.1. Síntesis del sensor de pH fluorescente biotinilado

Dada la baja estabilidad física de los sensores de pH basados en QD655‐

aminotricarbocianinas (Capítulo 3) a valores de pH por debajo de 7, se decidió llevar a

cabo el diseño de un sensor basado en un fluoróforo de una naturaleza química dife‐

rente. En este sentido, los fluoróforos derivados de xantenos son de los más amplia‐

mente utilizados en diversas aplicaciones de espectroscopía de fluorescencia.40 En esta

familia se encuadra la fluoresceína (43, Figura 5.3), un dihidroxixanteno, que resulta

ser uno de los fluoróforos de referencia y de los más explotados en sistemas biológi‐

cos, dado que su forma dibásica es altamente soluble en agua y posee un pKa cercano

al pH fisiológico (pKa3~6,7). Sin embargo, sus longitudes de onda de emisión y excita‐

ción se encuentran cercanas a los 500nm, superponiéndose con la autofluorescencia

presente en los materiales biológicos proveniente de restos triptófano o porfirinas. Por

ello, en las aplicaciones biológicas se buscan fluoróforos con bandas de excitación y

emisión desplazadas hacia mayores longitudes de onda. Una estrategia utilizada fue la

extensión del sistema conjugado hacia uno o ambos extremos del sistema xanteno de

la fluoresceína, destacándose entre ellos los benzo[c]xantenos, conocidos como semi‐

naftofluoresceínas 44 (SNAFL‐1) o seminaftorodaminas 45 (SNARF‐1) dependiendo de

si el anillo benzo[c]xanténico se encuentra sustituido en la posición 10 con un átomo

de oxígeno o nitrógeno, respectivamente (Figura 5.3).41 Estos indicadores, cuyos valo‐

43 44 45 46 Figura 5.3. Estructuras químicas de los fluoróforos indicadores de pH basados en xantenos más rele‐vantes: fluoresceína (43), SNARF‐1 (44), SNAFL‐1 (45) y 5(6)‐carboxinaftofluoresceina (46).

5 6

10 11

9

DISEÑO Y CARACTERIZACIÓN DEL SENSOR DE PH

157

res de pKa se encuentran en el rango fisiológico, muestran bandas de emisión y excita‐

ción diferentes para las especies protonadas y desprotonadas. La introducción de un

anillo bencénico adicional en el sistema xanténico de 45 conlleva al núcleo de la nafto‐

fluoresceína, cuyo espectro de emisión y absorción se encuentran desplazados hacia

mayores longitudes de onda y su forma más utilizada es la 5(6)‐carboxinafto‐

fluoresceína (46, Figura 5.3) con un grupo carboxilo adicional para su conjugación con

biomoléculas.

La 5(6)‐carboxinaftofluoresceína es una sonda de pH con un pKa ~7,6 y longitu‐

des de onda de absorción y emisión desplazadas hacia el rojo (forma básica

゜Máx Abs = 598 nm y ゜Máx Em = 668 nm, forma ácida ゜Máx Abs = 509 nm y ゜Máx Em = 572 nm).

Debido a su valor de pKa cercano al pH fisiológico, esta sonda fluorescente ha sido

aplicada para la determinación de pH intracelular.42 Debido a la gran diferencia obser‐

vada entre las bandas de absorción entre las formas ácida y básica, este fluoróforo

resulta adecuado para la construcción de un sensor de pH basado en nanopartículas

fluorescentes.

Para poder conjugar el fluoróforo a la superficie de los QDs se llevó a cabo la

reacción de derivatización de la 5(6)‐carboxinaftofluoresceína (comercializada como

una mezcla de isómeros) con (+)‐N‐biotinil‐3,6‐dioxaoctanodiamina (NH2‐PEG2‐Biotina,

Pierce) para obtener 47 con un 52% de rendimiento, según se muestra en la Figura 5.4.

El compuesto 47 muestra un máximo de absorción en 594 nm y una coeficiente

de extinción molar de 90.000 M‐1cm‐1 para su forma básica y un máximo de absorción

en 525 nm y un coeficiente de extinción molar de 16.000 M‐1cm‐1 para su forma ácida.

46 47Figura 5.4. Esquema de obtención de la 5(6)‐carboxinaftofluoresceína biotinilada 47.

O

OHO

O

HOHN O

OO

SNH

HN O

NH

H

H

O

OHO

O

HO

OO

OH

i) DCC, NHS, DMF

ii) NH2-PEG2-biotinaEt3N, DMF


158

En la Figura 5.5 se muestra el espectro de RMN‐1H donde se observan algunas señales

características de la 5(6)‐carboxinaftofluoresceína y del resto biotinilado. Mediante un

análisis de la integración de las señales correspondientes al anillo bencénico del núcleo

del fluoróforo se pudo determinar que el compuesto comercial 5(6)‐carboxinafto‐

fluoresceína contiene un 65% del isómero sustituido en la posición 5 y un 35% del isó‐

mero sustituido en la posición 6.

5.2.2. Modulación de las propiedades ópticas de nanopartículas fluorescentes

Dado que el máximo de absorción para la forma básica de 47 es 594 nm y para

la ácida es de 525 nm se decidió utilizar como nanopartícula central a Quantum Dots

conjugados con estreptavidina con un máximo de emisión en 605 nm, sin el espaciador

de PEG (QD605‐SAv ITK). Para caracterizar el sistema, se llevó a cabo una titulación de

una solución 3 ´M de 47 en PBS a diferentes valores de pH, según se muestra en la

O

OHO

O

HOHN O

OO

SNH

HN O

NH

H

HO

a b

c

ed g

f h

a e b

c

d

hg

f

47

Figura 5.5. Espectro RMN‐1H de 47 (500 MHz, solvente MeOD‐d4). Se muestran algunas señales caracte‐rísticas del núcleo de 5(6)‐carboxinaftofluoresceína y del resto biotinilado.


159

Figura 5.6.a. Con estos datos es posible calcular la variación de la integral de solapa‐

miento espectral (J) en función del pH para el sistema 47/QD605 (Figura 5.6.b), obser‐

vándose que para un valor de pH de 9,0 se tiene un valor de J elevado

(1,07x1016 M‐1cm‐1nm4) mientras que a pH 4,5 dicho parámetro disminuye considera‐

blemente (3,21x1014 M‐1cm‐1nm4), lo que conlleva una disminución importante del

radio de Förster del sistema (R0pH 9,0 = 5,5 nm y R0pH 4,8 = 3,0 nm, valores calculados uti‐

lizando los siguientes parámetros: φD = 0,52;43 ゛2 = 2/3 y n = 1,33). El valor de R0 obte‐

nido a pH 9,0 se encuentra en el orden de los encontrados para sistemas similares

(p.ej. 6,4 nm para el sistema Alexa594/QD585).44

Asimismo, se realizó una titulación de QD605‐SAv ITK con 47 en PBS pH 9,5, los

resultados se muestran en la Figura 5.7. Puede observarse que a medida que aumenta

la relación [47]/[QD605] la intensidad de emisión a 605nm de la nanopartícula dismi‐

nuye considerablemente. Como muestra control de la marcación inespecífica del

fluoróforo sobre el nanocristal se utilizaron QD605‐SAv ITK preincubados con 1.000 eq

de biotina, de esta manera se bloquean los sitios activos en la superficie de la nanopar‐

tícula evitando la conjugación con el fluoróforo biotinilado 47. Como se desprende de

la Figura 5.7, el agregado de 47 a la muestra control de nanopartículas no afecta las

propiedades ópticas de la misma, pudiendo concluirse que la interacción entre el

fluoróforo con el nanocristal se debe a la interacción específica biotina‐estreptavidina

Figura 5.6. a. Cambios en la absortividad molar de 47 a diferentes valores de pH, desde 9,0 (rojo) hasta 4,8 (azul), junto con el espectro de emisión de QD605. b. Variaciones en la integral de solapa‐miento espectral para el sistema 47/QD605 a diferentes valores de pH.

400 600 8000

20

40

60

80

100

Intensidad de Em

isión Norm

alizada


Abso

rtivi

dad

mol

ar (x

10-3 M

-1cm

-1)

5 6 7 8 90.0

0.5

1.0

J

蔕x10-1

6 M-1cm

-1nm

4

蔔

pH

a. b.


160

presente en los mismos. En la Figura 5.7.b puede observarse que para agregados de

fluoróforo posteriores a una relación [47]/[QD605] de 80 no modifican la intensidad de

emisión de la nanopartícula, alcanzándose un plateau de máxima modulación de la

fluorescencia de la nanopartícula, correspondiente a una eficiencia de apagado del

86% .

El proceso de modulación de las propiedades fluorescentes de QD605‐SAv ITK

también fue estudiado mediante los cambios en los tiempos de vida media de fluores‐

cencia de las nanopartículas. En la Figura 5.8 se muestran los resultados obtenidos. Es

posible observar que a medida que aumenta la relación [47]/[QD605] la intensidad de

fluorescencia de los QD605‐SAv ITK decae rápidamente, este efecto se muestra en más

detalle en los paneles inferiores de la Figura 5.8, donde se grafican los resultados del

ajuste de los decaimientos a una función biexponencial. Se observa que ambas com‐

ponentes disminuyen en magnitud, hasta alcanzar un plateau a partir de un valor de

[47]/[QD605] de 75, punto en el cual se alcanza el máximo valor de eficiencia para la

modulación en el tiempo de vida media de fluorescencia de la nanopartícula central

que resulta ser del 85% . Ambos valores obtenidos (relación [47]/[QD605] de saturación

y eficiencia máxima de apagamiento) se corresponden perfectamente con los logrados

0 25 50 75 1000.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Inte

nsid

ad d

e Em

isió

n 60

5nm

Nor

mal

izad

a

[47]/[QD605]

550 600 6500.0

0.5

1.0

550 600 650 700 7500.0

0.5

1.0

Inte

nsid

ad d

e Em

isió

nN

orm

aliz

ada


Inte

nsid

ad d

e Em

isió

nN

orm

aliz

ada


a. b.

Figura 5.7. a. Variación en la intensidad de emisión para una titulación de QD605‐SAv ITK con 47 en PBS pH9,5 desde una relación [47/[QD605] igual a 0 (rojo) a 105 (azul). En el inset se muestra la titula‐ción para una muestra de QD605‐SAv ITK presaturada con biotina. b. Variación en el máximo de in‐tensidad de emisión a 605 nm normalizada para la titulación de QD605‐SAv ITK (negro) y QD605‐SAv‐ITK presaturados con biotina (rojo) con 47 en PBS, pH 9,0.


161

mediante la titulación a partir de medidas de fluorescencia en estado estacionario,

confirmando que la modulación en las propiedades ópticas de las nanopartículas se

debe exclusivamente a procesos desde el estado excitado, p.ej. FRET.

Asimismo, se llevó a cabo un estudio más exhaustivo de los procesos involucra‐

dos en el apagamiento de la fluorescencia de la nanopartícula. Para tal fin, se realizó

una titulación de QD605‐SAv ITK con 47 en forma continua mediante el uso de una

bomba de inyección para jeringas (World Precision Instruments Inc) adaptada a un

fluorímetro de estado estacionario (Figura 5.9).

De esta manera, fue posible registrar en forma continua los cambios en la in‐

tensidad de fluorescencia de las nanopartículas con el agregado del fluoróforo biotini‐

lado 47. Como muestra control se utilizó una solución de QD605‐SAv ITK preincubada

0 25 50 75 1000

5

10

15

Tie

mpo

de

vida

(ns

)

[47]/[QD605]0 25 50 75 100

0

5

10

15

Tie

mpo

de

vida

(ns

)

[47]/[QD605]Figura 5.8. Variaciones en los decaimientos en la intensidad de fluorescencia de QD605‐SAv ITK (a) y muestra control (b) a diferentes valores de [47]/[QD605], desde 0 (rojo) a 105 (azul). En los paneles inferiores se muestran los resultados del ajuste de los decaimientos a una función biexponencial, mostrando ambas componentes (verde y naranja) y el promedio pesado por amplitudes (negro).

a. b.

100 200

0.01

0.1

1

Cue

ntas

Nor

mal

izad

as

Tiempo (ns)100 200

0.01

0.1

1

Cue

ntas

Nor

mal

izad

as

Tiempo (ns)


162

con 1.000 eq de biotina, de manera de bloquear los sitios activos de unión en la su‐

perficie de la nanopartícula. En la Figura 5.10 se muestran los resultados obtenidos

donde puede observarse que el comportamiento es análogo al observado en la Figura

Inyector automático

Controlador del agitador magnético

Jeringa de vidrio

Aguja de 10 cm

Cubeta de 5x5 mm

a. b.

Soporte multicubeta

Soporte multicubeta

Inyector automático

Figura 5.9. a. Sistema para montado para titulaciones con agregado continuo de muestra con detec‐ción simultánea de la intensidad de fluorescencia. b. Detalle del soporte multicubeta y la bomba de inyección automática.

Figura 5.10. Variación en la intensidad de emisión de QD605‐SAv ITK (negro) con el agregado continuo de 47 en buffer PBS pH 9,5. El control (verde) se llevó a cabo utilizando QD605‐SAv ITK preincubados con biotina libre. ゜Exc = 400 nm.

0 30 60 90 120

0.5

1.0

Inte

nsid

ad d

e Em

isió

n 60

5nm

Nor

mal

izad

a

[47]/[QD605]


163

5.7.b, un apagamiento de la intensidad de fluorescencia de las nanopartículas hasta

alcanzar un plateau para una relación [47]/[QD605] cercana a 80.

Estos datos fueron ajustados a un modelo matemático a fin de extraer más in‐

formación sobre el sistema utilizado (número de sitios activos por nanopartícula, efi‐

ciencia del proceso FRET, etc). Se propone una distribución aleatoria de ligandos bioti‐

nilados para los sitios de unión de estreptavidina, suponiendo un número total de si‐

tios por nanopartícula n constante. Para una relación [47]/[QD605] dada (x) se define

la ocupancia fraccional α, que representa la fracción ocupada (en promedio) de los

sitios activos disponibles (n); es decir α = x/n. El modelo tiene como premisa que la

probabilidad (pi) de encontrar i (entre 0 y n) sitios activos ocupados para una dada

ocupancia global α (entre 0 y 1) está dada por una distribución binomial, según se

muestra en la ecuación [5.1].

Para un modelo de un donante central con múltiples aceptores en su periferia,

la eficiencia de transferencia total puede expresarse según la ecuación [5.2].

donde i es el número total de aceptores interactuando con el mismo donante,

kT,j es la constante de transferencia de energía individual (que depende de las condi‐

ciones de cada par donante‐aceptor individual en el ensamblado de múltiples acepto‐

res) y τD es el tiempo de vida media de fluorescencia del donante en ausencia de acep‐

tores (ver ecuación [9], página 19). Esta expresión se simplifica para una configuración

de aceptores idénticos que se encuentran a una distancia r fija alrededor del donante

central, según se muestra en la ecuación [5.3].

n i i

i

n!(1 )p

i!(n i)!

[5.1]

i

T ,jj 1

FRET ,i i1

D T ,jj 1

k

E

k

[5.2]


164

Si esta expresión se combina con la relación introducida por Förster para la

constante de velocidad de la transferencia de energía (ecuación [7], página 18) se ob‐

tiene la ecuación [5.4].

Por lo tanto, la fluorescencia residual del donante está dada por la probabilidad

de que no tenga lugar el proceso FRET, y se describe según la ecuación [5.5]

Es posible introducir un factor fenomenológico a como una forma simple de

tomar en cuenta la posibilidad de que algunos sitios de unión periféricos (mayor r)

puedan ser ocupados preferencialmente (por ser más accesibles) en la fase inicial de la

titulación, en cuyo caso a>0 (porque r disminuiría en el transcurso de la titulación y,

entonces, el valor efectivo de aumenta). Si, al contrario, los sitios más cercanos a la

superficie de la nanopartícula son los que se unen preferencialmente (p.ej. debido a la

distribución de cargas superficiales o a interacciones hidrofóbicas), entonces a<0 (dado

que r aumentaría durante el transcurso de la titulación y, por lo tanto, el valor efectivo

de disminuye). Si todos los sitios muestran una afinidad equivalente, entonces a=0.

(Ecuación [5.6].

Con estos parámetros se construye la ecuación [5.7] que representa la fluores‐

cencia normalizada de las nanopartículas fluorescentes para una ocupancia α.

TFRET,i 1

D T

ikE

ik [5.3]

[5.4]

0

0

6Rr

FRET,i 6Rr

i iE

1 i1 i

6

0R

r

;

NoFRET,i FRET

i 1E 1 E ,i 1

1 i 1 i

[5.5]

[5.6] NoFRET,i

1E

1 i(1 ai)


165

donde el primer término (1‐α)n representa a la fracción de QDs sin ligandos (y

por lo tanto con fluorescencia constante). El segundo término representa la fluores‐

cencia residual de los QDs con i = 1 a n ligandos ocupados. En cada caso, la fluorescen‐

cia relativa depende de (i) i, (ii) y (iii) a, el factor fenomenológico que toma en cuenta

una posible heterogeneidad en la población de sitios.

Por último, es posible introducir un parámetro que tome en cuenta la posibi‐

lidad de que haya una fracción de QDs que no se encuentren funcionalizados con es‐

treptavidina en su recubrimiento, ya que los mismos presentarán una fluorescencia

relativa que no dependerá de la ocupancia (Ecuación [5.8]).

Los datos obtenidos en la titulación continua de QD605‐SAv ITK con 47 en PBS

pH 9,5 fueron ajustados a la ecuación [5.8] utilizando como variable independiente y

, n, a y como parámetros de ajuste mediante un algoritmo desarrollado por el Dr

Thomas Jovin utilizando el software Wolfram Mathematica 8.0 (Wolfram Research).

Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 5.11.

Se puede concluir que los ajustes funcionan bien de acuerdo a un modelo sim‐

ple (los n sitios parecen ser equivalentes, dado el pequeño valor obtenido para el pa‐

rámetro a). Además, el 97% de las nanopartículas en solución participan del proceso

FRET y el número total de sitios por nanopartícula es de 78. Asimismo se obtuvo un

valor de R0/r global de 0,63 (=(R0/r)6=0,065) para el sistema estudiado, que permite

estimar un valor de r promedio de 8,7 nm, el mismo se encuentra dentro de los valores

esperados para nanopartículas fluorescentes, ya que sus diámetros se encuentran en

el rango de entre 10‐20 nm.

[5.7]n i in n

n ni NoFRET,i

i 1 i 1

n!(1 ) 1F (1 ) pE (1 )

i!(n i)! 1 i(1 ai)

n i inn

i 1

n!(1 ) 1F (1 ) (1 )

i!(n i)! 1 i(1 ai)

[5.8]


166

5.3. FOTOFÍSICA DEL NANOSENSOR DE PH FLUORESCENTE

Con el objeto de estudiar la respuesta de los nanosensores fluorescentes frente

a cambios en el pH del medio se construyeron conjugados de QD605‐SAv ITK con 47 en

relación 1:30, denominados pHiQD605‐ITK(30) (del inglés pH indicator Quantum Dots)

donde el número entre paréntesis indica la relación [47]/[QD] utilizada para construir

el nanosensor, en PBS pH 9,50. Dado la conocida tendencia a formar agregados que

muestran las nanopartículas fluorescentes frente a cambios en el pH, se decidió utilizar

como estándar interno a QD525‐SAv ITK preincubadas con un exceso de biotina, dado

que la emisión de dichas nanopartículas se encuentra suficientemente alejada de la

fluorescencia de QD605‐SAv ITK como para asegurar que no se registren señales cru‐

zadas. Asimismo, este sistema tiene la ventaja de que pueden excitarse ambas nano‐

partículas con la misma longitud de onda de irradiación (400 nm, en este caso).

Se llevó a cabo una mezcla 1:1 de QD525‐SAv ITK preincubados con un exceso

de biotina con los nanosensores pHiQD605‐ITK(30) previamente formados, la cual fue

titulada utilizando HCl 0,01N y se registró el cambio en la intensidad de emisión luego

de cada agregado (Figura 5.12.a). Como control se utilizaron QD605‐SAv ITK (sin conju‐

gar con 47) preincubados con 1.000 equivalentes de biotina y, asimismo, añadidos a la

solución de los QD525‐SAv ITK (Figura 5.12.b). Se determinaron las relaciones

= 0,97

a = ‐0,001

n = 78

= 0,065

0 30 60 90 120

0.25

0.50

0.75

1.00

Flu

ores

cenc

ia r

elat

iva

[47]/[QD605]

� Datos

� Ajuste

Figura 5.11. Ajuste de la variación en la intensidad de emisión de QD605‐SAV ITK cuando se titula en forma continua con 47 en PBS pH 9,5 a la función descripta en la ecuación [5.8].

FOTOFÍSICA DEL NANOSENSOR DE PH FLUORESCENTE

167

Fl605nm/Fl525nm para cada valor de pH y se ajustaron los datos obtenidos a la ecuación de

Henderson Hasselbach, ecuación [5.9], según se muestra en la Figura 5.12.c.

donde xA, xB y x corresponden a la relación de intensidades para la especie áci‐

da, básica y a un pH determinado, respectivamente. El ajuste de los datos obtenidos a

la ecuación [5.9] permitió obtener un valor de pKa de 6,9±0,1; algo menor al valor in‐

formado para el fluoróforo libre (pKa 7,9). Esto puede explicarse si se toma en cuenta

la densidad de carga en la superficie de la nanopartícula, que genera un microentorno

diferente al del fluoróforo en solución.

Aa a

B


[A] x x

[5.9]

a. b.

c.

Figura 5.12. Variación en la intensidad de emisión para pHiQD605‐ITK(30) (a) y QD605‐SAv ITK (b) relativa a QD525‐COOH ITK frente a cambios en el pH, desde un valor de pH de 9,5 (azul) a 6,0 (rojo). Ajuste de los cambios en la intensidad de emisión relativa frente a variaciones de pH

5 6 7 8 9 10

0.6

0.8

1.0

Fl 60

5nm/F

l 525n

m

pH

pKa = 6,9±0,1

R2 = 0,999

500 6000.0

0.5

1.0In

tens

idad

de

Emis

ión

Nor

mal

izad


500 6000.0

0.5

1.0

Inte

nsid

ad d

e Em

isió

n N

orm

aliz

ada



168

El nanosensor pHiQD605‐ITK(30) también fue caracterizado mediante la deter‐

minación de los tiempos de vida media de fluorescencia a diferentes valores de pH. Los

decaimientos obtenidos fueron ajustados a un modelo biexponencial mediante el uso

de un algoritmo desarrollado por el Dr. Thomas Jovin utilizando el software Wolfram

Mathematica 8.0 (Wolfram Research) y se calculó además el tiempo de vida media de

fluorescencia promedio como la media pesada por las amplitudes de cada componen‐

te, los resultados obtenidos se muestran en la Figura 5.13.a.

En forma inesperada, el perfil de la variación de las diferentes componentes del

tiempo de vida media de fluorescencia y de su media pesada por las amplitudes no

sigue relación sigmoidea alrededor del pKa del sensor esperada, sino que se ajustan a

una función lineal en el rango de pH de entre 5 y 10 (Figura 5.13.b ).

Asimismo, en la Figura 5.14 se observa la variación en las amplitudes (factor

preexponencial) y las intensidades relativas (definidas según la Ecuación [5.10]) de las

dos componentes del tiempo de vida media de fluorescencia de las nanopartículas

para pHiQD‐ITK(30). Se observa que a medida que el pH del medio aumenta, los tiem‐

pos de vida media de fluorescencia disminuyen (Figura 5.13) al tiempo que también

Figura 5.13. a. Variación en el tiempo de vida media de fluorescencia para pHiQD605‐ITK(30) para las dos componentes del modelo biexponencial (verde y naranja) y el promedio pesado por amplitudes (negro). b. Ajuste de la variación del tiempo de vida media de fluorescencia promedio a una función lineal.

5 6 7 8 92

4

6

8

10

12

14

Tie

mpo

de

vida

med

iade

fluo

resc

enci

a (n

s)

pH5 6 7 8 9

5

6

7

8

9

Tie

mpo

de

vida

med

iode

fluo

resc

enci

a pr

omed

io (

ns)

pH

a. b.

m = ‐0,97 ± 0,04 b = 13,8 ± 0,3 R2= 0,983

[5.10] x xx

1 1 2 2

ampint

amp amp

; x = 1,2


169

Figura 5.15. Variación en los tiempos de vida media de fluorescencia para QD605‐SAv ITK incubados en una relación [biotina]/[QD605] de 1:30 a diferentes valores de pH.

aumenta el peso (amplitud e intensidad relativa) de la componente más corta del

tiempo de vida media global.

Con el objeto de estudiar la respuesta intrínseca de los QD605‐SAv ITK frente a

cambios en el pH se procedió a llevar a cabo la determinación del tiempo de vida me‐

dia de fluorescencia para las nanopartículas conjugadas con biotina libre en una rela‐

ción [biotina]/[QD605] de 1:30 a diferentes valores de pH. Los resultados obtenidos se

muestran en la Figura 5.15 donde se observa que el tiempo de vida media de las nano‐

partículas es independiente del pH del medio.

El modelo fotofísico de transferencia de energía desde una nanopartícula cen‐

tral hacia múltiples aceptores en su superficie no permite explicar la relación lineal

obtenida entre el tiempo de vida media de fluorescencia y el pH del medio, por ello se

5 6 7 8 9

0.2

0.3

0.4

0.5A

mpl

itud

x 10

-3 (

cuen

tas)

pH

a. b.

Figura 5.14. Variación en la amplitud (a) y la intensidad relativa (b) de las componentes corto (negro) y largo (rojo) del decaimiento de la intensidad de fluorescencia para pHiQD‐ITK(30).

5 6 7 8 90.2

0.4

0.6

0.8

Inte

nsid

ad r

elat

iva

pH

5 6 7 8 9 100

5

10

15

Tie

mpo

s de

vid

a m

edia

de

fluo

resc

enci

a (n

s)

pH


170

trabajó en el desarrollo de un nuevo mecanismo que se ajuste a los datos experimen‐

tales observados.

El modelo propuesto se resume en la Figura 5.16, el mismo involucra una trans‐

ferencia de energía bidireccional entre la nanopartícula central y los múltiples acepto‐

res en la superficie actuando al mismo tiempo como donantes y aceptores de energía.

En el mecanismo planteado, la nanopartícula absorbe el pulso de luz (400 nm)

produciendo una transición desde el estado basal (G) hacia uno de dos estados excita‐

dos S1* (“central”) o S2* (“periférico”) con constantes de velocidad k1 y k2, respecti‐

vamente. Ambos estados se asignan a las dos componentes del modelo biexponencial

aplicado para el decaimiento de la intensidad de fluorescencia de las nanopartículas.

Típicamente, la contribución del tiempo de vida media más corto se asocia a la recom‐

binación intrínseca de estados poblados en el núcleo de la nanopartícula (asignado a

S1*, estado excitado localizado en el centro de la nanopartícula), mientras que la com‐

ponente larga usualmente se atribuye a defectos en la periferia de la nanopartícula

que dan lugar a estados de superficie y trampas en el proceso de recombinación de los

portadores de carga (asignado a S2*, estado excitado localizado en la superficie de la

nanopartícula).45 Ambos estados decaen al estado basal con constantes de velocidad

kd1 y kd2. En presencia del aceptor (A) en la superficie de la nanopartícula, S1* y S2*

Figura 5.16. a. Modelo fotofísico propuesto para el sistema de nanopartícula central y múltiples acep‐tores en la superficie. b. Esquema del modelo propuesto para el nanosensor QD605‐SAv ITK/47.

a. b.


171

pueden participar del proceso FRET (denominado “FRET directo”), con constantes de

velocidad kft1 y kft2. Dado que la transferencia de energía involucra una ruta adicional

para la relajación de ambos estados excitados se tiene como resultado una disminu‐

ción en ambos tiempos de vida media de fluorescencia τ1 y τ2 (Figura 5.13.a).

Sin embargo, los aceptores también absorben luz (400 nm), aunque con baja

eficiencia dada la baja absorbancia de 47 a la longitud de onda de excitación, y a partir

del estado excitado A* puede decaer radiativamente, con constante de velocidad kd3,

o participar de un proceso de transferencia de energía hacia la nanopartícula central

(que en este caso actúa como aceptor). Este proceso fue denominado “retro FRET” y

tiene lugar hacia ambos estados excitados con constantes de velocidad krt1 y krt2.

El mecanismo de “FRET directo” es más efectivo a pH básico ya que la integral

de solapamiento es mayor con la especie básica de 47 (aunque no desaparece a pH

ácido, dada la absorbancia remanente del fluoróforo). No obstante, el mecanismo “re‐

tro‐FRET” es más efectivo a pH ácido, dado que el coeficiente de extinción molar de la

nanopartícula crece en gran medida hacia longitudes de onda menores (Figura 5.17).

Durante el ajuste de los datos obtenidos al modelo propuesto se observó que el

tiempo de vida media promedio mostraba otra dependencia adicional, indicando que

el uso de un solo valor de pKa para 47 no permite simular la dependencia de los valo‐

400 500 600 7000

1

2

3

Coe

ficie

nte

de E

xtin

ción

Mol

ar x

10-6

蔕M-1cm

-1

蔔


0.0

0.5

1.0

Intensidad de Emisión

Norm

alizada

Figura 5.17. Espectros de emisión (línea punteada) y absorción (línea llena) de QD605‐SAv ITK (a) y 47 (b) en su forma ácida (rojo, pH 5,0) y básica (azul, pH 9,0).

a. b.

400 500 600 700 8000.0

0.1

0.2

0.3

Abso

rban

cia


0.0

0.5

1.0

Intensidad de Emisión

Norm

alizada


172

res de pH. Una búsqueda en literatura indicó que el pKa de la 5(6)‐carboxinaftofluores‐

ceína disminuye cuando la fuerza iónica del medio aumenta.46 Esta dependencia es de

importancia ya que puede esperarse un cambio importante en la fuerza iónica del mi‐

croentorno del fluoróforo debido a la titulación de los restos ácido‐base de la proteína

a la cual se encuentra conjugado (la estreptavidina tiene una carga negativa que au‐

menta con el pH, lo que podría reducir el pKa del indicador ligado). Una aproximación

posible es la introducción de una dependencia lineal del pKa con el pH del medio, co‐

mo una forma de corrección de este fenómeno en el modelo propuesto.

Por lo tanto, se llevó a cabo el ajuste al modelo simulando los datos experimen‐

tales obtenidos ingresando las diferentes constantes de velocidad como parámetros

con el objeto de obtener relaciones entre las mismas. El resultado del ajuste se mues‐

tra en la Figura 5.18 donde se observa que es posible explicar el comportamiento mos‐

trado por los nanosensores frente a cambios en el pH del medio.

Los resultados indican que el proceso de transferencia de energía desde los dos

estados excitados S1* y S2* hacia el aceptor A son iguales (kft1 = kft2). Además, el

modelo puede explicar los datos recogidos si el proceso “retro‐FRET” sólo tiene lugar

hacia el estado con tiempo de vida corto (S1*), explicando de esta manera el aumento

4 5 6 7 8 9

0.4

0.6

Am

plitu

d re

lativ

a

pH4 5 6 7 8 9 10

5

10

Tie

mpo

de

vida

med

ia (

ns)

pH

Figura 5.18. Comparación del ajuste del modelo propuesto (figuras huecas) a los datos obtenidos (figu‐ras llenas) para (a) la variación en las componentes corta y larga del tiempo de vida media de fluores‐cencia (naranja y verde, respectivamente) y el tiempo de vida media promedio pesado por las amplitu‐des (negro) y (b) la variación en las amplitudes relativas de cada proceso al decaimiento global.

a. b.


173

en la amplitud de esta componente en el tiempo de vida media de fluorescencia global

a medida que aumenta el pH (Figura 5.18.b); es decir, krt2=0. Asimismo, se encontró

que el factor de corrección lineal para el pKa de 47 en función del pH es de 0.64 unida‐

des de pKa por cada unidad de pH.

Durante la escritura de este trabajo de tesis, se han reportado cuatro ejemplos

representativos de sensores de pH basados en nanopartículas, los cuales ya fueron

presentados en las secciones anteriores. Dos de los cuales son del tipo radiométrico

(LS662 y LS664, desarrollados por Tang y colaboradores )47, mientras que en los otros

dos (mOrange y mOrange M163K, desarrollados por Dennis y colaboradores)25 el sen‐

sado está basado en los cambios en el tiempo de vida media de fluorescencia. En la

Figura 5.19 se muestra a modo comparativo las curvas de calibrado obtenidas para los

a. b. c. d.

Figura 5.19. Curvas de calibrado para sensores basados en nanopartículas fluorescentes de tipo ra‐diométrico (LS662, a) y (LS664, b)25 y de tiempos de vida media (mOrange y mOrange M163K, c)47. Comparacion con la obtenida para pHiQD‐ITK(30), (d)


174

nanosensores mencionados y para los pHiQD‐ITK(30). En los casos (a), (b) y (c) se ob‐

serva el clásico comportamiento para sensores de pH basados en fluoróforos indicado‐

res, con un rango dinámico lineal de 2 unidades de pH alrededor del pKa del sensor.

Sin embargo, los nanosensores pHiQD‐ITK(30) mostraron un comportamiento atípico,

un rango de pH con respuesta lineal extendido (desde 5 hasta 9) el cual resulta extre‐

madamente ventajoso al momento de proyectar posibles aplicaciones para los mis‐

mos. Una ventaja adicional de los nanosensores desarrollados se encuentra en la tec‐

nología no covalente utilizada para la conjugación del fluoróforo sensible a pH, dado

que su multivalencia intrínseca permite, en una forma sencilla, una funcionalización

adicional de los nanosensores que puede ser aprovechada con múltiples propósitos,

p.ej. su conjugación en forma específica mediante el uso de ligandos biotinilados lo

que podría extender su aplicación a sistemas celulares in vivo e in vitro.

5.4. CALIBRADO DEL SENSOR DE PH FLUORESCENTE

Se llevó a cabo la calibración del sensor de pH fluorescente basado en QD605‐

SAv ITK conjugado con 47 en una relación 1:30, pHiQD‐ITK(30) mediante la técnica de

Microscopía de Tiempos de vida media de Fluorescencia empleando el sistema DFD‐

FLIM, ya utilizado en la sección 3.3 (página 98). La calibración se llevó a cabo de mane‐

ra similar a la realizada en el Capítulo 3 (página 107), preparando una solución madre

165 nM de nanocristales que fue incubada con una solución de 47 (concentración final

4,95 ´M, relación 30:1) en buffer fosfato de sodio 1mM, 150 mM NaCl, pH 9,5 durante

15 minutos. Luego, se preparan diluciones de la muestra a una concentración final de

10 nM en nanopartículas en buffer 10 mM, 150 NaCl, 0,1% BSA de pH conocido. Asi‐

mismo, se utilizaron soluciones reguladores de distinta naturaleza para cubrir el rango

de pH de calibrado (MES, HEPES y bicina para los rangos de pH 5‐6, 6‐8 y 8‐10, respec‐

tivamente).

CALIBRADO DEL SENSOR DE PH FLUORESCENTE

175

En la Figura 5.20 se muestran los cambios en la población de fasores a 20 y 40

MHz para los pHiQD‐ITK (30) a diferentes valores de pH. Es posible observar que a me‐

dida que el pH del medio disminuye la población de fasores se desplaza hacia la zona

de mayores tiempos de vida media de fluorescencia, lo cual está de acuerdo con los

resultados obtenidos en las determinaciones previas. Cabe destacar que a valores de

pH por debajo de 7 se pierde resolución, ya que los fasores comienzan a superponerse

entre sí. Esto puede deberse a que la frecuencia de modulación de la fuente de luz

pulsada quizás no resulta ser la óptima para los tiempos de vida media de fluorescen‐

cia obtenidos en las determinaciones de las nanopartículas.

A la luz de estos resultados, y con el objeto de extender la resolución en la zona

de pH ácido para el nanosensor fluorescente, se decidió aumentar la relación fluorófo‐

ro/nanopartícula llevándolo al valor de 60:1, respectivamente. Esta nueva configura‐

ción de nanosensores se denominaron pHiQD‐ITK(60). Cabe destacar la gran ventaja

que representa el uso del sistema estreptavidina‐biotina frente a la metodología cova‐

lente al momento de construir conjugados con diferentes relaciones fluoróforo/QD, ya

que simplemente implica la mezcla del sensor biotinilado con la nanopartícula en la

proporción deseada, mientras que para la metodología covalente sería necesario reali‐

zar una nueva reacción de conjugación, purificación y cuantificación.

Figura 5.20. Diagramas de fasores a 20 MHz (a) y 40 MHz (b) para la titulación de pHiQD‐iTK (30) a diferentes valores de pH. Se muestran los tres replicados obtenidos para cada valor de pH.

a. b.


176

En la Figura 5.21.a se muestran los resultados obtenidos para la calibración de

los nanosensores pHiQD‐ITK(60), junto con los valores de tiempos de vida según el

modelo fotofísico propuesto, el cual también permite explicar satisfactoriamente las

variaciones observadas respecto del pH. Asimismo, se observa que subsiste la relación

lineal entre los tiempos de vida media de fluorescencia de las nanopartículas y el pH

del medio (Figura 5.21.b). En este caso los valores de los tiempos de vida media son

menores que los obtenidos para pHiQD‐ITK(30), lo cual se condice con el mayor núme‐

ro de aceptores de energía en la superficie de la nanopartícula. Asimismo, la variación

en el tiempo de vida de fluorescencia resulta algo mayor que para los pHiQD‐ITK(30),

lo cual se refleja en los valores de la pendiente del ajuste lineal realizado, siendo ‐0,97

y ‐1,10 ns por unidad de pH para pHiQD(30) y pHiQD(60), respectivamente.

Asimismo, se llevó a cabo la calibración mediante el sistema Fast‐FLIM, ya utili‐

zado con anterioridad. La misma se llevó a cabo de manera similar a la realizada para

pHiQD‐ITK(30), preparando una solución madre 165 nM de nanocristales la cual fue

incubada con una solución de 47 (concentración final 9,9 ´M, relación 60:1) en buffer

fosfato de sodio 1mM, 150 mM NaCl, pH 9,5 durante 15 minutos. Luego, se preparan

diluciones de la muestra a una concentración final de 10 nM en nanopartículas en buf‐

fer 10 mM, 150 NaCl, 0,1% BSA de pH conocido. Asimismo, se utilizaron soluciones re‐

Figura 5.21. a. Variación en las componentes corta y larga del tiempo de vida media de fluorescencia (naranja y verde, respectivamente) y el tiempo de vida media promedio pesado por las amplitudes (negro) para los pHiQD‐ITK(60), figuras llenas, y valores predichos al modelo fotofísico (figuras hue‐cas). b. Ajuste lineal de la variación en el tiempo de vida media de fluorescencia en función del pH.

5 6 7 8 9

2

4

6

Tie

mpo

de

vida

med

ia d

eflu

ores

cenc

ia (

ns)

pH

m = ‐1,10 ± 0,05 b = 11,8 ± 0,4 R2= 0,9836

a. b.

4 5 6 7 8 9 10

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Tie

mpo

de

vida

med

ia d

eflu

ores

cenc

ia (

ns)

pH

DETERMINACIONES EN SISTEMAS IN VIVO

177

guladores de distinta naturaleza para cubrir el rango de pH de calibrado (MES, HEPES y

bicina para los rangos de pH 5‐6, 6‐8 y 8‐10, respectivamente.

En la Figura 5.22 se muestran los resultados obtenidos para la calibración de

pHiQD‐ITK(60) a diferentes valores de pH del medio. Se observa que, por comparación

con la calibración obtenida para pHiQD‐ITK (30), Figura 5.20, la población de fasores se

haya desplazada hacia la zona de tiempos de vida menores, lo cual es coherente con el

resultado esperado para el nanosensor con una mayor carga de fluoróforo biotinilado.

Asimismo, también se observa que en este caso se logra una mayor dispersión en la

zona de pH de entre 7,5 y 5,10 que, como se mencionó anteriormente, corresponde al

rango de aplicación para el estudio de una gran cantidad de procesos fisiológicos y

patológicos de alto interés, según se desarrolló en el Capítulo 2 (página 56).

5.5. DETERMINACIONES EN SISTEMAS IN VIVO

El objetivo final de este trabajo de tesis es el desarrollo de nanosensores

fluorescentes para su aplicación en microscopías in‐vivo, mediante sistemas de

marcación específica. Para tal fin se llevó a cabo la prueba de principio del nanosensor

desarrollado pHiQD‐ITK(60) mediante su aplicación al estudio del cambio de pH

endosomas durante la progresión del camino endocítico mediado por receptores,

según se discutió con anterioridad (página 153). La marcación específica de proteínas

en células vivas puede llevarse a cabo por varios métodos, mucho de los cuales se

Figura 5.22. Diagrama de fasores tomados a 20 MHz (a) y a 40 MHz (b) para la titulación de una solu‐ción 10 nM del nanosensor pHiQD‐ITK(60).

a. b.


178

basan en la presencia de residuos de cisteína reducidos, lo que dificulta su aplicación

en proteínas de membrana ubicadas del lado extracelular.48‐51

Un sistema muy interesante es la fusión de la proteína de estudio con una

secuencia que codifica para un péptido (tag) reconocido específicamente por una

enzima que sea capaz de unirlo covalentemente con una sonda. De esta manera, se

logra una alta especificidad en la marcación (dada por la enzima de reconocimiento)

con sondas adecuadas para los estudios a realizar. Uno de los tag más utilizados es un

péptido de 77 aminoácidos basado en la secuencia de la proteína transportadora de

acilo (Acyl Carrier Protein, ACP) de Escherichia coli, que es reconocida específicamente

por una fosfopanteteinil transferasa (ACP sintasa, ACP‐S) que transfiere el grupo

fosfopanteteinilo de la Coenzima A (CoA) a una serina conservada dentro de la

secuencia ACP (Figura 5.23).52

Mediante la utilización de un derivado biotinilado de la CoA (48, Figura 5.23) se

Figura 5.23. Panel Superior. Modificación covalente de proteínas de membrana en células vivas. Las células expresando la proteína de membrana de interés fusionada al tag ACP son marcadas a través de la enzima ACP‐S, que transfiere un grupo fosfopanteteinilo de la CoA a una serina conservada en la secuencia de dicho tag. La CoA puede estar modificada con una sonda. Panel inferior. Estructura quí‐mica del CoA biotinilado utilizado para marcar específicamente el receptor erbB1 en células CHO.

48


179

puede modificar en forma covalente y específica a la proteína de interés expresada en

la superficie, permitiendo asimismo diferenciarla de la que aún está siendo procesada

en el retículo endoplasmático y el sistema Golgi dado que la reacción enzimática ocu‐

rre únicamente en la superficie celular. Una vez biotinilada la proteina de interés, es

posible llevar a cabo una posterior marcación específica de la misma con una sonda

adecuada funcionalizada con estreptavidina, p.ej. utilizando QDs conjugados con

estreptavidina. Esta metodología fue utilizada para marcar con pHiQD‐ITK(60),

aprovechando los sitios activos de union a biotina libres en el nanosensor, al receptor

erbB1, involucrado en el proceso de endocitosis mediada por EGF, de manera de

estudiar los cambios de pH durante el proceso endocítico

Para los estudios in vivo se utilizó una línea derivada de ovario de Hámster

Chino (Chinese Hamster Ovary, CHO) que expresa de forma estable el receptor erbB1

conjugado a un ACP (ACP‐erbB1). Las células fueron incubadas con la CoA biotinilada

(48) y la enzima ACP‐S, con el objeto de biotinilar los receptores. Por último se las

incubó con los pHiQD‐ITK(60), los cuales se conjugan sobre la superficie celular

mediante la interacción entre el receptor biotinilado y los sitios de unión de biotina

libres en las estreptavidinas del recubrimiento de la nanopartícula. Los receptores

marcados se mantienen en la membrana plasmática hasta que se estimulen los

receptores mediante la adición de EGF al medio extracelular (el procedimiento

experimental adoptado se detalla en la Sección 6.4, página 213).Con el objeto de

estudiar el efecto del microentorno celular sobre la señal obtenida del nanosensor de

pH y, de esta manera, validar la curva de calibrado obtenida para los pHiQD‐ITK(60) en

solución, se realizó una nueva calibración de los nanosensores conjugados sobre la

membrana celular.


180

En la Figura 5.24.a y b se muestran los resultados obtenidos para las curva de

calibrado a 20MHz y 40MHz de los pHiQD‐ITK(60) conjugados sobre la membrana

celular. Si se comparan la distribuciones de poblaciones en los diagramas de fasores a

20MHz y 40MHz en función del pH del medio con los obtenidos para el nanosensor en

solución (Figura 5.24.c y d) puede observarse que la posición de los mismos son

análogas en el rango de pH 5,25‐7,00; sin embargo, a partir de un valor de pH de 7,50

las poblaciones de fasores se desplazan hacia tiempos de vida mayores. Esto puede

atribuirse a la gran cantidad de proteínas localizadas en la membrana celular y,

particularmente, en el microentorno de los nanosensores de pH. Se genera así una

distribucion de cargas (dependiente del pH) que puede modificar los valores de pKa de

los fluoróforos conjugados sobre la superficie de las nanopartículas (según se vio en la

construccion del modelo fotofísico, página 172) y, por lo tanto, perturbar la lectura del

nanosensor.

Figura 5.24. Diagrama de fasores a 20 MHz (a) y 40 MHz (b) para la calibración de pHiQD‐ITK(60) con‐jugados sobre la membrana plasmática de células CHO transfectadas con el receptor ACP‐erbB1. Comparación de las curvas de calibrado obtenidas a 20Mhz (c) y 40MHz (d) para los pHiQD‐ITK(60) en solución (figuras llenas) y conjugados sobre la membrana celular (figuras huecas).

a. b.

c. d.


181

En la Figura 5.25 se muestran imágenes representativas de las células CHO

transfectadas con ACP‐erbB1 y marcadas con pHiQD‐ITK(60) en la membrana celular.

Se tomaron imágenes DIC, confocales de fluorescencia de las nanopartículas y FLIM.

Puede observarse que a pesar del efecto regulador observado para valores de pH por

encima de 7,50 es posible diferenciar perfectamente las poblaciones de fasores

correspondientes a cada valor de pH.

Figura 5.25. Imágenes DIC, confocal de fluorescencia y FLIM de células CHO transfectadas con ACP‐erbB1 conjugadas con pHiQD‐ITK(60) y montadas en soluciones buffer de pH 5,40; 6,80 y 8,25. Se muestran las máscaras para cada valor de pH en los diagramas de fasores a ambas frecuencias. Barras de escala: 5 µm.

20 MHz 40 MHz

pH 5,40 pH 6,80 pH 8,25

DIC

QD605

FLIM


182

Los nanosensores pHiQD‐ITK(60) fueron utilizados para estudiar los cambios de

pH en dos etapas de la vía endocítica. Para ello se marcaron células CHO transfectadas

con el receptor ACP‐erbB1, según el procedimiento descripto con anterioridad. Se

tomaron imágenes DIC, confocal de fluorescencia y FLIM de las células marcadas sin

estímulo de EGF. En la Figura 5.26 se muestran los resultados obtenidos, se observa

que la marca se localiza en la membrana de las células, y que la poblacion de fasores

obtenidas para los píxeles de la imagen se encuentran a un valor de pH de 7,40, el cual

es el esperado ya que se trata de receptores expuestos al buffer de armado de las

células que se encuentra a un pH fisiológico. Asimismo, se llevaron a cabo

determinaciones en células CHO que fueron estimuladas con EGF 100 nM durante

30 minutos a 37°C. En la Figura 5.27 se muestran los resultados obtenidos de las

determinaciones realizadas, donde se observa que la marca fluorescente se localiza

exclusivamente en el interior de las células, además la población de fasores en la

imagen FLIM se encuentran a un valor de pH cercano a 6,50. Estos resultados se

Figura 5.26. Imágenes DIC, confocal de fluorescencia y FLIM de células CHO transfectadas con ACP‐erbB1 conjugadas con pHiQD‐ITK(60) sin estímulo de EGF. Se muestran las máscaras para cada valor de pH en los diagramas de fasores a ambas frecuencias. Barras de escala: 5 µm.


183

encuentran de acuerdo al camino endocítico discutido anteriormente.

Algo para destacar es que en ambas determinaciones se observan algunas

desviaciones en la posición de la población de fasores respecto de la obtenida para la

curva de calibrado. Esta diferencias pueden atribuirse a la presencia señal de fondo y

de autofluorescencia proveniente de otras especies presentes en el medio celular.

Dado que las coordenadas en el diagrama de fasores para un pixel corresponde a la

suma vectorial del fasor asociado a cada componente del decaimiento total, la

presencia de estas especies resultan en un desplazamiento del fasor asociado a cada

pixel. La determinación de la posición de los fasores correspondientes a la

autofluorescencia celular resulta dificultosa, dado que no resultó posible discernir la

señal de fondo de la correspondiente a los sensores. No obstante, este hecho no

dificulta la determinación, ya que las desviaciones observadas resultaron mínimas.

Figura 5.27. Imágenes DIC, confocal de fluorescencia y FLIM de células CHO transfectadas con ACP‐erbB1 conjugadas con pHiQD‐ITK(60) estimuladas con EGF 100 nM durante 30 minutos a 37°C. Se muestran las máscaras para cada valor de pH en los diagramas de fasores a ambas frecuencias. Barras de escala: 5 µm.


184

A la fecha, sólo se encuentran escasos reportes sobre la aplicación de sensores

de pH derivados de nanopartículas fluorescentes a la determinacion del pH intracelular

in vivo. Este trabajo resulta uno de los primeros en esta área ylos resultados obtenidos

muestran su gran potencial, dada la versatilidad y simplicidad que ofrece el sistema

para la construcción de los nanosensores sensibles.

5.6. CONCLUSIONES

En este capítulo se ha presentado el desarrollo de un nuevo sensor de pH deri‐

vado de nanopartículas fluorescentes. Para ello, se sintetizó el fluoróforo biotinilado

necesario para la construcción del nuevo nanosensor, el cual fue caracterizado com‐

pletamente mediante titulaciones monitoreadas por medidas de absorción y emisión

de fluorescencia.

Asimismo, la naturaleza multivalente de la estrategia de conjugación utilizada

(sistema biotina‐estreptavidina) permitió llevar a cabo una caracterización exhaustiva

del sistema formado por el fluoróforo biotinilado y la nanopartícula central. Dada la

alta constante de formación del conjugado biotina‐estreptavidina (y la elevada veloci‐

dad de formación del complejo) fue posible realizar una titulación continua de las na‐

nopartículas que permitieron desarrollar un modelo fotofísico con el cual se pudieron

estimar parámetros del sistema fluoróforo‐nanopartícula (número de sitios activos por

nanopartícula, eficiencia del proceso FRET, etc).

Los nanosensores fueron caracterizados frente a cambios de pH a través de

medidas de fluorescencia en estado estacionario y resuelta en el tiempo. Se observó

un comportamiento atípico en la respuesta del cambio de los tiempos de vida media

de fluorescencia a diferentes valores de pH del medio, mostrando una relación lineal

en un rango de pH extendido, lo cual resulta muy ventajoso al momento de proyectar

posibles aplicaciones. Se desarrolló un modelo fotofísico de funcionamiento de los

nanosensores que permitieron explicar el comportamiento observado mediante la

CONCLUSIONES

185

introducción de un proceso “retro‐FRET” desde el fluoróforo conjugado en la superficie

hacia la nanopartícula central.

Adicionalmente, aprovechando la posibilidad de funcionalización con diferentes

conjugados, se presentó su aplicación en un sistema biológico. Para tal fin, se llevó a

cabo un estudio de marcación específica de células in vivo, pudiendo diferenciar con

resolución espacial y temporal dos etapas de la vía endocítica.

Este trabajo resulta pionero en el desarrollo de sensores derivados de nanopar‐

tículas fluorescentes gracias a la gran versatilidad que ofrece el sistema biotina‐

estreptavidina para la construcción de los mismos. La estrategia de conjugación utili‐

zada permite su extensión a una inmensa variedad de sensores fluorescentes en forma

sencilla, dado que permite seleccionar la longitud de onda de trabajo (dada la gran

oferta existente de nanopartículas de diferentes longitudes de onda de emisión), el

analito de interés (dada por la inconmensurable cantidad de sensores fluorescentes

moleculares, que solamente requieren su funcionalización con un resto biotinilado), la

posibilidad de conjugación con diferentes especies (para conferirle a los nanosensores

propiedades adicionales, p.ej. especificidad en la marcación mediante el uso de ligan‐

dos receptor‐específicos) y la versatilidad y simpleza que ofrece al momento de opti‐

mizar la relación [fluoróforo]/[nanopartícula] que mejor se adapte al sistema desarro‐

llado.


186

BIBLIOGRAFÍA

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CAPÍTULO 6

MATERIALES Y MÉTODOS

GENERALIDADES

189

6.1. GENERALIDADES

6.1.1. Uso de solventes anhidros y reactivos sensibles a la humedad

Los solventes utilizados fueron de calidad “para análisis” o superior, y se purifi‐

caron según métodos descriptos en bibliografía.1 En todos los casos las reacciones con

solventes o reactivos sensibles a la humedad se llevaron a cabo con material de vidrio

previamente flameado y bajo atmósfera de nitrógeno o argón.

6.1.2. Cromatografía en placa delgada

Se utilizaron cromatofolios de sílica gel F254 de 0,20mm de espesor sobre sopor‐

te de aluminio y cromatofolios de sílica RPC18 F254,5 sobre soporte de aluminio

(Merck). Los sistemas de solventes empleados (técnica ascendente) se indican en cada

caso. El revelado se llevó a cabo con luz UV (254 y/o 366 nm) o por inmersión en una

solución de 0,04 M de (NH4)6Mo7O24.4H2O, 3 mM de Ce(SO4)2 en H2SO4‐H2O (9:1) y

posterior calentamiento o cinamaldehído en H2SO4 10% en etanol (revelador específi‐

co para biotina) o ninhidrina 1% en etanol (revelador específico para grupos amino).

6.1.3. Resonancia Magnética Nuclear

Los espectros RMN se adquirieron con espectrómetros Bruker AC‐200 (Depar‐

tamento de Química Orgánica, FCEyN, UBA a 200 MHz para 1H y 50 MHz para 13C),

Bruker AM‐500 (LANAIS RMN‐500, CONICET, a 500 MHz para 1H y 125 MHz para 13C),

Bruker 400 MHz (Instituto Max Planck de Bioquímica‐Física de Göttingen a 400 MHz

para 1H), Mercury 300 MHz (Universidad de Göttingen a 300 MHz para 1H y 75 MHz

para 13C), INOVA 500 MHz (Universidad de Göttingen a 500 MHz para 1H y 125 MHz

para 13C). Se utilizaron solventes deuterados que se indican en cada caso. Los despla‐

zamientos químicos (~) se indican en partes por millón (ppm) respecto de la señal de

tetrametilsililo (TMS) o el solvente deuterado correspondiente. Los patrones de aco‐

plamiento se consideraron de primer orden, y las constantes de acoplamiento (J) se

expresaron en Hz. Las señales se describen como s (singulete), d (doblete), t (triplete),

CAPÍTULO 6 – MATERIALES Y MÉTODOS

190

q (cuarteto), quin (quinteto), dd (doble doblete), ddd (doble doblete doblete), td (triple

doblete), sa (singulete ancho) y m (multiplete).

La asignación de los espectros de RMN se realizó, cuando fue posible, mediante

comparación con datos publicados para compuestos estructuralmente relacionados.

En otros casos, fue necesario el empleo de técnicas bidimensionales: HSQC, HMBC y

COSY.

6.1.4. Espectrometría de masa de alta resolución (EMAR)

Se utilizó un equipo Bruker Daltonics micrOTOF equipado con una fuente de io‐

nes de ionización por electrospray (ESI) y un analizador de tiempo de vuelo (TOF), Uni‐

versidad de Göttingen.

6.1.5. Capítulo 1 – Síntesis de clorotricarbocianinas precursoras

Procedimiento general para la obtención de los derivados carboxílicos de los aza‐

heterociclos

Una solución de la base nitrogenada (3,6 mmol) y ácido 6‐bromohexanoico

(5,4 mmol) en tolueno anhidro (2,5 ml) se calentó a 80°C durante 18 h bajo atmósfera

de argón. Se evaporó el solvente a presión reducida y luego se terminó de evaporar en

bomba de aceite. Se obtuvo un líquido muy viscoso de color pardo, el cual se trató con

éter etílico en baño de hielo, precipitando un sólido violeta que fue filtrado y lavado

con éter etílico.

GENERALIDADES

191

Bromuro de N‐(6‐carboxihexil)‐2,3,3‐trimetilindolenonio (11).

Se partió de 0,57 g (3,6 mmol) de 2,3,3‐trimetilindolenina y 1 g (5,1 mmol) de ácido

6‐bromohexanoico. Se obtuvieron 1,05 g de producto (3,0 mmol, 83% ).

Método alternativo con microondas:

En un tubo de microondas de vidrio de 10ml se pesaron 0,126 g (0,88 mmol) de 2,3,3‐

trimetilindolenina y 0,170 g (0,88 mmol) de ácido 6‐bromohexanoico. Se agregaron 5

ml de acetonitrilo y se llevó a 150°C durante 1 hora bajo en un equipo de microondas

Monowave 300 (Anton Paar). El producto precipita del medio de reacción, se filtra y se

lava con éter etílico. Se obtuvieron 0,274 g (0,78 mmol, 98% ) del producto deseado.

RMN‐1H (300 MHz, CD3OD): ~ 7,88 (dd, J = 6,2, 2,9 Hz, 1H), 7,77 (dd, J = 5,5, 3,4 Hz,

1H), 7,65 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,63 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 4,53 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 2,34 (t, J =

7,1 Hz, 2H), 2,10 – 1,88 (m, 2H), 1,77 – 1,64 (m, 2H), 1,61 (s, 6H), 1,58 – 1,48 (m, 2H).

RMN‐13C (75 MHz, CD3OD): ~ 196,8, 172,3, 140,9, 139,8, 129,9, 128,9, 124,6, 118,6,

54,2, 47,7, 31,4, 28,0, 26,4, 26,4, 24,0, 21,0, 15,6.

EMAR (ESI‐): (M‐H)‐ calc C17H24BrNO2 352,0918; encontrado 352,0918

Bromuro de 3‐(5‐carboxipentil)‐1,1,2‐trimetil‐1H‐benzo[e]indolenonio (13).

Se partió de 1 g (4,77 mmol) de 1,1,2‐trimetilbenzo[e]indol y 1,4 g (7,18 mmol) de áci‐

do 6‐bromohexanoico. Se obtuvieron 0,07g (0,2 mmol, 4% ) del producto.


192

RMN‐1H (300 MHz, CD3OD): ~ 8,29 (dd, J = 16,9, 8,6 Hz, 2H), 8,10 (dd, J = 27,0, 8,5 Hz,

2H), 7,77 (dt, J = 14,5, 7,0 Hz, 2H), 4,66 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 2,36 (t, J = 6,9 Hz, 2H), 2,24 –

1,94 (m, 2H), 1,85 (s, 6H), 1,81 – 1,43 (m, 4H).

RMN‐13C (75 MHz, CD3OD): ~ 195,3, 173,3, 139,5, 135,7, 133,0, 130,6, 128,7, 128,3,

126,1, 121,8, 115,4, 57,4, 47,7, 33,4, 27,1, 25,3, 24,0, 21,6, 14,1.

EMAR (ESI‐): (M‐H)‐ C21H26BrNO2 403,1147; encontrado 403,1142.

Procedimiento general para la obtención de los derivados sulfonados de los aza‐

heterociclos

Una solución de la base nitrogenada (9,7 mmol) y 1,3‐propanosultona

(14,5 mmol) en tolueno anhidro (10 ml) se llevó a reflujo durante 18hs bajo atmósfera

de argón. Luego el sistema se dejó enfriar, se llevó a 4°C y se observó la aparición de

un precipitado, el cual fue filtrado y lavado con éter etílico.

Sal interna de 2,3,3‐trimetil‐1‐(3‐sulfopropil)‐3H‐indolenonio (12).

Se partió de 1ml (6,23 mmol) de 2,3,3‐trimetilindolenina y 1,1 g (9,01 mmol) de 1,3‐

propanosultona se obtuvieron 1,44 g del producto (5,11 mmol, 82% ).

RMN‐1H (300 MHz, CD3OD): ~ 8,06 (dd ancho, 1H), 7,85 (dd ancho, 1H), 7,62 (m, 2H),

4,75 (t, 2H, J = 7,2 Hz), 2,65 (t, 2H, J = 6,5 Hz), 2,17 (m, 2H), 1,54 (s, 6H).

RMN‐13C (75 MHz, CD3OD): ~ 194,4, 145,2, 142,3, 128,1, 126,9, 121,8, 115,4, 54,1,

47,8, 44,1, 24,2, 23,4, 14,1.

EMAR (ESI‐): (M‐H)‐ calc. C14H19NO3S 280,1014; encontrado 280,1018.

GENERALIDADES

193

Sal interna de N‐(3‐sulfopropil)‐1,1,2‐trimetilbenzo[e]indolenonio (14).

Se partieron de 2 g (9,6 mmol) de 1,1,2‐trimetilbenzo[e]indol y 1,7 g (13,9 mmol) de

1,3‐propanosultona se obtuvieron 2,75 g (8,32 mmol, 87% ) de un sólido violáceo.

RMN‐1H (300 MHz, CD3OD): ~ 8,30 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 8,19 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 8,11 (d, J

= 8,9 Hz, 2H), 7,78 (t, J = 7,1 Hz, 1H), 7,68 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 4,75 (t, 2H, J = 7,2Hz), 3,30

(dd, J = 3,2, 1,6 Hz, 2H), 2,43 (dt, J = 14,5, 7,7 Hz, 2H), 1,82 (d, J = 3,6 Hz, 6H).

RMN‐13C (75 MHz, CD3OD): ~ 164,2, 143,7, 142,8, 131,4, 130,8, 124,8, 116,9, 116,6,

98,2, 70,8, 56,3, 48,2, 26,5, 25,4, 24,9, 23,0.

EMAR (ESI‐): (M‐H)‐ calc. C18H21NO3S 330,1169; encontrado 330,1171.

2‐cloro‐1‐formil‐3‐(hidroximetilen)‐1‐ciclohexeno (15)

Se agregó desde una ampolla compensadora y gota a gota una solución de

POCl3 (18,5 ml, 0,198 mmol) en diclorometano (17 ml) a una solución de DMF (20 ml)

en diclorometano (20 ml) pre enfriada en un baño de hielo. Luego, se agregó también

gota a gota una solución de ciclohexanona (5 g, 0,050 mmol); terminado este agregado

se eliminó el baño de hielo (se obtuvo una solución amarilla), se conectó un refrigeran‐

te en posición de reflujo y se llevó el sistema a ebullición durante 3 horas. Se obtuvo

una solución roja que se llevó a un baño de hielo y a la cual se le agregó gota a gota

agua pre enfriada a 0°C. Se dejó agitando en baño de hielo por 15 min y luego se llevó

el sistema bifásico formado a 4°C por una noche. Se obtuvieron unos cristales amarillos

en forma de aguja que fueron filtrados, lavados con agua fría y éter etílico y secados en

vacío (4,18 g, 24,2 mmol, 48% ).

15

N+

SO

O-O


194

RMN‐1H (200 MHz, DMSO‐d6): ~ 2,36 (t, J = 6,1 Hz, 4H), 1,58 (quin, J = 6,0 Hz, 2H).

RMN‐13C (50 MHz, DMSO‐d6) ~ 191,4, 136,4, 119,9, 26,2, 22,1.

EMAR (EI+): (M+H)+ calc. C8H9ClO2 172,0291; encontrado 172,0299.

Clorhidrato de N‐[5‐Anilino‐3‐cloro‐2,4‐(propano‐1,3‐diil)‐2,4‐ pentadien‐1‐iliden]ani

lina (17)

Se agregó desde una ampolla compensadora y gota a gota una solución de

POCl3 (10 ml, 107 mmol) en diclorometano (9 ml) a una solución de DMF (10 ml,

129 mmol) en diclorometano (10 ml) pre enfriada en un baño de hielo. Luego, se agre‐

gó también gota a gota una solución de ciclohexanona (2,5 ml, 24 mmol); terminado

este agregado se quitó el baño de hielo (se obtuvo una solución amarilla), se conectó

un refrigerante en posición de reflujo y se llevó el sistema a ebullición durante 3 horas.

Luego se llevó al sistema a 20°C, se agregó gota a gota, y cuidando que la temperatura

no se eleve, una mezcla de etanol/anilina (1:1) y se dejó por 1 hora a temperatura am‐

biente. Luego, se llevó el sistema a un baño de hielo y se agregaron 20ml de HCl 10%

pre enfriado y se llevó a 4ºC durante una noche. Se obtuvo un precipitado púrpura que

se filtró y se lavó con agua fría y éter etílico (2,62 g, 7 mmol, 30% )

RMN‐1H (300 MHz, CD3OD): ~ 8,63 (s, 2H), 7,75 – 7,33 (m, 8H), 7,37 – 7,09 (m, 2H),

2,71 (t, J = 6,1 Hz, 4H), 1,98 (quin, J = 5,7 Hz, 2H).

RMN‐13C (75 MHz, CD3OD) ~ 150,4, 140,7, 131,1, 128,0, 120,0, 116,4, 25,6, 21,0.

EMAR (ESI+): (M+H)+ calc. C20H19N2Cl 323,1310; encontrado 323,1308.

17

GENERALIDADES

195

Procedimiento general para la síntesis de tricarbocianinas simétricas Método A:

Una solución de bisaldehído 15 (0,6 mmol) y la sal de indolenonio correspon‐

diente (0,6 mmol) en una mezcla de n‐butanol/benceno (7:3) anhidros fue calentada

bajo reflujo junto con molecular sieves 4Å (100% m/m de 15) hasta que se consuma la

sal de indolenonio (1 h). Luego se adicionó un equivalente adicional (0,6 mmol) de la

sal de indolenonio y piridina seca y la mezcla resultante fue calentada bajo reflujo por

1 h más. Luego de separar los molecular sieves por filtración se indujo la precipitación

del producto deseado mediante la evaporación parcial del solvente y el posterior agre‐

gado de éter etílico. Los cristales verdes obtenidos fueron filtrados bajo presión redu‐

cida y lavados con agua fría y éter etílico para obtener los compuestos espectroscópi‐

camente puros.

Método B:

Se reflujó una solución de la sal de indolenonio correspondiente (0,6 mmol), 17 (0,3

mmol) y acetato de sodio anhidro (0,7 mmol) en etanol absoluto (15 ml) bajo atmósfe‐

ra de nitrógeno durante 3,5 h. Luego el solvente se evaporó bajo presión reducida. Se

obtuvo un sólido verde oscuro que se recristalizó de éter etílico:metanol.


196

Compuesto 18.

Método A: Preparado a partir de 11 (0,381 g, 1,08 mmol) y el bisaldehído 15 (0,092 g,

0,54 mmol) en 30 ml de la mezcla de benceno:n‐butanol. Se obtuvieron 0,300 g (0,39

mmol, 73% ) del producto como un sólido verde intenso.

Método B: Preparado a partir de 11 (0,211 g, 0,6 mmol), 17 (0,110 g, 0,3 mmol) y ace‐

tato de sodio anhidro (0,057 g, 0,7 mmol) en 15 ml de etanol. Se obtuvieron 0,132 g

del producto (0,17 mmol, 58% ).

RMN‐1H (500 MHz, CD3OD) ~ 8,44 (d, J = 14,1 Hz, 2H), 7,53 (dd, J = 7,5, 0,7 Hz, 2H),

7,47 – 7,40 (m, 2H), 7,34 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,29 (td, J = 7,5, 0,8 Hz, 2H), 6,30 (d, J =

14,1 Hz, 2H), 4,19 (t, J = 7,4 Hz, 4H), 2,74 (t, J = 6,1 Hz, 4H), 2,28 (t, J = 7,3 Hz, 4H), 2,04

– 1,92 (m, 4H), 1,86 (dd, J = 15,0, 7,5 Hz, 4H), 1,74 (s, 12H), 1,72 – 1,61 (m, 2H), 1,56 –

1,45 (m, 4H).

RMN‐13C (125 MHz, CD3OD) ~ 178,8, 174,3, 151,1, 145,5, 143,6, 142,6, 130,0, 128,8,

128,1, 126,5, 123,5, 112,3, 102,4, 50,7, 49,5, 47,9, 45,1, 35,8, 28,3, 27,5, 26,1, 22,1.

EMAR (ESI‐): (M‐H)‐ calc. C42H52BrClN2O4 761,2727; encontrado 761,2731.

N+N

Cl

HO OH

O O

Br-

18

GENERALIDADES

197

Compuesto 19.

Método A: Preparado a partir de 14 (0,417 g, 1,26 mmol) y el bisaldehído 15 (0,100 g,

0,63 mmol) en 28ml de la mezcla de benceno:n‐butanol. Se obtuvieron 0,311 g (0,39

mmol, 62% ) del producto como un sólido verde intenso.

Método B: Se utilizaron 0,205 g (0,62 mmol) de 12, 0,111 g (0,31 mmol) de 17 y

0,060 g (0,72 mmol) de acetato de sodio anhidro. Se obtuvieron 0,118 g (0,148 mmol,

48% ).

RMN‐1H (500 MHz, DMSO‐d6): ~ 8,32 (d, J = 14,1 Hz, 2H), 8,25 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 8,05

(d, J = 8,9 Hz, 2H), 8,01 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,82 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,60 (td, J = 6,8, 1,2

Hz, 2H), 7,47 (td, J = 6,8, 1,2 Hz, 2H), 6,52 (d, J = 14,3 Hz, 2H), 4,47 (t, 4H), 2,74 (t, J =

5,6 Hz, 4H), 2,60 (t, J = 6,7 Hz, 4H), 2,05 (quin, J = 7,2 Hz, 4H), 1,90 (s, 12H), 1,82 (quin,

J = 5,8 Hz, 3H).

RMN‐13C (125 MHz, DMSO‐d6) ~ 173,8, 147,8, 142,6, 140,2, 134,1, 132,0, 130,9, 130,4,

128,2, 128,0, 127,0, 125,4, 122,7, 112,3, 102,0, 51,1, 49,1, 48,2, 43,5, 27,5, 26,5, 24,2,

21,09.

EMAR (ESI‐): (M‐H)‐ calc. C44H47N2O6S2Cl 797,2491; encontrado 797,2493.


198

Compuesto 23.

Se preparó una solución de 14 (0,145 g, 0,43 mmol), 15 (0,068 g, 0,40 mmol) y

0,150 g de molecular sieves 4Å en 15 ml de una mezcla de n‐butanol/benceno (7:3)

anhidros. Se llevó a reflujo bajo atmósfera de nitrógeno durante 2h. La solución tomó

una coloración roja, indicación de la formación de la hemicianina. Luego se agregó una

solución de 11 (0,169 g, 0,48 mmol) en 5 ml del solvente de reacción y se continuó el

reflujo durante 16 h. La mezcla obtenida se filtró para remover las molecular sieves y el

solvente se evaporó a presión reducida. Se obtuvo un residuo verde rojizo que se re‐

cristalizó de éter etílico:metanol para aislar la mezcla de tricarbocianinas. El producto

se aisló mediante repetidas cromatografías de exclusión por tamaños utilizando como

fase estacionaria Toyopearls HF40W (2 cm de diámetro y 75 cm de altura) y metanol

como solvente de elución. Se obtuvieron 0,183 g (0,25 mmol, 62% ) del producto como

un sólido verde oscuro.

RMN‐1H (500 MHz, CD3OD): ~ 8,57 (d, J = 14,3 Hz, 1H), 8,39 (d, J = 14,0 Hz, 1H), 8,27 (d,

J = 8,5 Hz, 1H), 8,03 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,99 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,74 (d, J = 8,9 Hz, 1H),

7,65 (ddd, J = 8,4, 6,9, 1,2 Hz, 1H), 7,50 (dt, J = 7,5, 1,3 Hz, 2H), 7,49 (dd, J = 8,0, 1,1 Hz,

1H), 7,41 (td, J = 8,0, 1,1 Hz, 1H), 7,30 (dd, J = 8,0, 0,9 Hz, 1H), 7,26 (td, J = 7,5, 0,6 Hz,

1H), 6,55 (d, J = 14,3 Hz, 1H), 6,24 (d, J = 14,0 Hz, 1H), 4,54 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 4,15 (t, J =

7,4 Hz, 2H), 3,02 (t, J = 6,7 Hz, 2H), 2,81 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 2,72 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 2,33

(dt, J = 14,7, 7,0 Hz, 2H), 2,23 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,02 (s, 6H), 1,96 (t, J = 5,9 Hz, 2H), 1,85

(q, J = 7,6 Hz, 2H), 1,72 (s, 6H), 1,69 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 1,52 (dd, J = 10,1, 7,3 Hz, 3H).

RMN‐13C (125 MHz, CD3OD) ~ 176,2, 173,4, 150,8, 145,6, 144,7, 143,8, 142,4, 140,8,

135,6, 134,0, 133,7, 132,0, 131,1, 130,6, 129,8, 129,3, 128,8, 128,7, 128,0, 126,3,

GENERALIDADES

199

126,2, 123,4, 112,3, 112,0, 102,9, 101,7, 56,8, 55,7, 52,6, 50,4, 45,1, 44,3, 37,4, 28,4,

28,1, 27,9, 27,7, 27,5, 27,4, 26,8, 24,5, 22,2, 18,7.

EMAR (ESI‐): (M‐H)‐ calc. C43H49N2O5SCl 739,2978; encontrado 739,2979.

6.1.6. Capítulo 2 – Sensores moleculares derivados de aminotricarbocianinas

Compuesto 26

Se tomaron 27,5 mg (34,5 ´mol) de 19 y se agregaron 25 mg (66,7 ´mol) de

(+)‐biotinil‐3,6‐dioxaoctanodiamina (NH2‐PEG2‐Biotina, Pierce) disuelta en 1 ml de

DMF anhidra y, por último, 32 ´l (230 ´mol) de trietilamina. La solución resultante se

agitó a temperatura ambiente por 10 h cubierta de la luz. La mezcla resultante se eva‐

poró a presión reducida para obtener un residuo azul intenso, el cual se purificó me‐

diante cromatografía de exclusión por tamaños utilizando Sephadex LH20 (2 cm de

diámetro y 100 cm de altura) para dar 25 mg (21,7 ´mol, 63% ) de producto.


= 9,0 Hz, 6H), 7,92 (d, J = 8,0 Hz, 6H), 7,56 (t, J = 7,2 Hz, 4H), 7,54 (d, J = 8,9 Hz, 3H),

7,38 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 6,03 (d, J = 9,8 Hz, 2H), 4,40 (dd, J = 7,8, 4,9 Hz, 1H), 4,30 (t, 4H),

4,18 (dd, J = 7,8, 4,5 Hz, 1H), 3,97 (t, J = 4,6 Hz, 2H), 3,86 (t, J = 4,3 Hz, 2H), 3,78 (t, J =

4,3 Hz, 2H), 3,71 (t, J = 4,7 Hz, 2H), 3,56 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 3,38 – 3,33 (m, 3H), 3,04 (dd,

J = 9,4, 5,0 Hz, 1H), 3,00 (t, J = 6,9 Hz, 5H), 2,81 (dd, J = 12,7, 5,0 Hz, 1H), 2,62 (t, J = 6,0


200

Hz, 5H), 2,28 (quin, J = 14,4, 7,0 Hz, 5H), 2,14 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 1,98 (sa, 2H), 1,90 –

1,79 (m, 3H), 1,68 – 1,61 (m, 1H), 1,61 – 1,54 (m, 2H), 1,53 – 1,43 (m, 2H).

RMN‐13C (125 MHz, CD3OD) ~ 174,7, 164,6, 140,5, 131,2, 130,0, 129,6, 128,4, 126,9,

123,5, 121,6, 110,1, 69,9, 69,8, 69,3, 61,9, 60,2, 55,5, 49,7, 49,6, 39,6, 38,9, 35,3, 28,3,

28,0, 27,3, 25,4, 24,7, 22,4, 21,6.

EMAR (ESI‐): M‐ calc. C60H75N6O10S3 1135,4712; encontrado 1135,4722.

Compuesto 28

A una solución de 53,4 mg (70 ´mol) de 23 en 1 ml de DMF anhidra se agregó 16 ´l

(140 ´mol) de N‐metilpiperazina y, posteriormente, 78 ´l (560 ´mol) de trietilamina.

La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 10 h y cubierta de la

luz. Posteriormente se evaporó el solvente a presión reducida, obteniéndose un resi‐

duo azul intenso. Se purificó la mezcla de reacción mediante cromatografía de exclu‐

sión por tamaños utilizando Sephadex LH20 como fase estacionaria (2 cm de diámetro

y 150 cm de alto) y metanol como solvente de elución. Se obtuvo 25mg (29 mol, 45% )

del producto de reacción.


= 5,3 Hz, 1H), 7,93 (d, J = 10,6 Hz, 1H), 7,82 (d, J = 13,6 Hz, 1H), 7,62 (d, J = 8,9 Hz, 1H),

7,59 (dd, J = 7,0, 1,4 Hz, 1H), 7,43 (dd, J = 7,5, 1,2 Hz, 1H), 7,42 (ddd, J = 8,3, 6,8, 1,0 Hz,

2H), 7,35 (td, J = 7,9, 1,1 Hz, 1H), 7,16 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,15 (td, J = 7,5, 0,8 Hz, 1H),

6,21 (d, J = 13,6 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 13,5 Hz, 1H), 4,37 (t, J = 7,8 Hz, 2H), 4,03 (t, J = 7,4

Hz, 2H), 3,78 (t, J = 4,7 Hz, 4H), 3,35 (s, 2H), 2,99 (t, J = 6,9 Hz, 2H), 2,81 (s, 3H), 2,62 (t,

J = 6,5 Hz, 2H), 2,55 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 2,52 (s, 3H), 2,32 – 2,25 (m, 2H), 2,20 (t, J = 7,4

GENERALIDADES

201

Hz, 2H), 2,02 (s, 6H), 1,90 – 1,78 (m, 4H), 1,71 (sa, 2H), 1,70 – 1,64 (m, 2H), 1,54 – 1,44

(m, 2H), 1,29 (s, 2H). 13C NMR (125 MHz, CD3OD) ~ 172,4, 169,2, 142,8, 141,6, 141,4, 140,4, 140,0, 132,4,

131,5, 130,2, 129,7, 128,2127,1, 125,2, 125,0, 123,9, 123,3, 121,7, 110,4, 109,5, 96,6,

96,4, 56,4, 54,0, 50,0, 45,1, 42,9, 42,0, 37,1, 27,8, 27,5, 26,6, 26,4, 25,8, 24,6, 22,6,

21,7.

EMAR (ESI+): (M+Na)+ calc. C48H60N4O5S 827,4177; encontrado 827,4185.

Dendrímeros PAMAM‐G4.0 conjugados con 28

A 2 mg (2,5 ´mol) de 28 se agregaron 50 ´l (0,28 ´mol) de una solución 10% m/m

de dendrímero PAMAM de 4ta generación (G 4.0, PM 14 KDa) en metanol. Se evaporó

el solvente bajo corriente de N2, y se redisolvió en DMSO (500 ´l). Se agregó 0,5 mg

(4,35 ´mol) de N‐hidroxisuccinimida (NHS) disuelta en 50 ´l de DMSO y 0,5 ´l (3,6

mmol) de trietilamina. Por último, se agregó 0,75 mg (3,64 ´mol) de N,N’‐

diciclohexilcarbodiimida (DCC) disuelta en 50 ´l de DMSO. Se dejó agitando 10 h cu‐

bierto de la luz. La solución resultante se dializó utilizando una membrana Cellu‐Sep T2

(MWCO 6000‐8000 Da) durante 16 horas en agua bidestilada a 4°C y cubierto de la luz.

La solución resultante se liofilizó, obteniéndose un residuo azul.

N,N‐di(2‐picolil)etilendiamina (33)

Se disolvió 6 ml de etilendiamina (31, 90 mmol) y 0,6 ml de trietilamina

(43 mmol) en etanol (5ml). La mezcla se llevó a un baño de hielo y se adicionó gota a

gota 1 g (46 mmol) de di‐ter‐butildicarbonato (BOC2O) disuelto en etanol (2 ml). La

mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente durante 2,5 h, luego se evaporó el

solvente a presión reducida. Se obtuvo un aceite que se disolvió en 30 ml de CH2Cl2 y


202

se extrajo con una solución de HAcO 1 N (3x15 ml). Se juntaron todas las fases acuosas

y se lavó con CH2Cl2. Posteriormente, se neutralizó la solución resultante con NaOH 2N

y se extrajo con CH2Cl2. Las fases orgánicas obtenidas se juntaron, se secaron con

Na2SO4 (anh) y se evaporó el solvente a presión reducida. Se obtuvo 3,683 g (23 mmol,

50% ) de la etilendiamina monoprotegida, 32, como un aceite amarillento. El compues‐

to 32 fue utilizado sin posterior purificación en la reacción subsiguiente.

Se disolvieron 0,6535 g (4 mmol) de 32, 1,50 g (9,14 mmol) de clorhidrato de 2‐

clorometilpiridina y 1,70 g de Na2CO3 en 25 ml de etanol. Se llevó a atmósfera de argón

y se calentó a reflujo durante 7,5 h, luego de lo cual se evaporó el solvente a presión

reducida. El residuo obtenido se redisolvió en NaOH 2N (30 ml) y se extrajo con CH2Cl2

(3x30 ml). Las fases orgánicas se juntaron y se secaron con Na2SO4 (anh) y se evaporó a

presión reducida para dar un aceite marrón. El crudo de reacción se purificó mediante

cromatografía flash utilizando AcOEt/cHex (1:9) como solvente de elución. Se obtuvie‐

ron 0,91 g (2,6 mmol, 66% ) del producto como un aceite amarillento. El producto ob‐

tenido se conservó protegido hasta el momento de ser utilizado.

La desprotección se llevó a cabo de la siguiente manera. Se disolvió el derivado

obtenido (0,91 g, 2,6 mmol) en 10 ml de CH2Cl2 y se llevó a baño de hielo. Se agregó

gota a gota 10 ml de ácido trifluoroacético y se dejó agitando a temperatura ambiente

durante 1,5 h. El solvente se eliminó por evaporación a presión reducida y el residuo

obtenido se redisolvió con NaOH 2N (20ml). Se extrajo con CH2Cl2 (3x10 ml), las fases

orgánicas se juntaron, se secaron con Na2SO4 (anh) y se evaporó a presión reducida

para dar 0,63 g (2,6 mmol, cuantitativo) de un líquido amarillento el cual se utilizó sin

posterior purificación.

RMN‐1H (200 MHz, CDCl3): ~ 8,54 (d, J = 4,3 Hz, 2H), 7,63 (td, J = 7,6, 1,5 Hz, 2H), 7,41

(d, J = 7,7 Hz, 2H), 7,15 (dd, J = 6,7, 5,4 Hz, 2H), 3,86 (s, 4H), 3,21 (t, J = 5,5 Hz, 2H), 2,70

(t, J = 5,7 Hz, 2H), 2,00 (s, 2H).

RMN‐13C (50 MHz, CDCl3): ~ 157,8, 144,1, 137,4, 121,4, 120,9, 64,5, 51,8, 38,1.

GENERALIDADES

203

Compuesto 27

Se disolvieron 54 mg (68 ´mol) de 19 y 33 mg (136 ´mol) de 33 en 2 ml de DMF

anhidro y se agregaron 55 ´l (395 ´mol) de trietilamina. La solución se agitó a tempe‐

ratura ambiente durante 20 h cubierta de la luz. Luego se evaporó el solvente a pre‐

sión reducida obteniéndose un residuo azul intenso. El crudo de reacción se purificó

mediante repetidas cromatografías de exclusión por tamaños utilizando Toyopearls

HW40F (2 cm de diámetro y 75 cm de altura) como fase estacionaria y metanol como

solvente de elución. Se obtuvieron 36 mg (36 ´mol, 53% ) de producto como un sólido

azul intenso.

RMN‐1H (500 MHz, CD3OD): ~ 8,53 (d, J = 4,3 Hz, 2H), 8,06 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,96 –

7,86 (m, 4H), 7,86 – 7,76 (m, 4H), 7,60 – 7,51 (m, 4H), 7,47 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,43 –

7,29 (m, 4H), 5,95 (d, J = 12,1 Hz, 2H), 4,24 (t, J = 7,2 Hz, 4H), 4,07 (s, 4H), 3,87 (t, J =

5,5 Hz, 2H), 3,11 – 2,91 (m, 6H), 2,69 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 2,33 – 2,22 (m, 5H), 1,90 – 1,83

(m, 2H), 1,82 (s, 12H), 1,49 – 1,24 (m, 2H).

RMN‐13C (125 MHz, CD3OD) ~ 168,1, 158,4, 148,8, 140,6, 137,3, 130,9, 129,8, 129,6,

128,4, 126,7, 123,8, 123,1, 122,7, 121,4, 109,9, 93,6, 67,7, 59,7, 53,8, 49,0, 38,8, 30,2,

28,7, 27,0, 25,9, 23,5, 22,3, 21,2, 13,0, 10,0.

EMAR (ESI‐): M‐ calc. C58H63N6O6S2 1003,4256; encontrado 1003,4243.

N+ N

HN

-O3SSO3-

N

N

N

27

N+ N

-O3SSO3-

19

Cl

33DMF, Et3N


204

6.1.7. Capitulo 3 – Nanosensores derivados de aminotricarbocianinas

Compuesto 34

Se tomaron 6,3 mg (7,8 ´mol) de 28 y 5 mg (11,9 ´mol) de (+)‐N‐biotinil‐3,6,9‐

trioxaundecanodiamina (NH2‐PEG3‐biotina, Pierce) y se agregó 1 ml de DMF anhidro y

5 ´l (35,8 ´mol) de trietilamina. Luego se incorporaron 1,5 mg (11,7 ´mol) de

N‐hidroxisuccinimida (NHS) disueltos en 100 ´l de DMF anhidro y, por último, 3,6 mg

(17,6 ´mol) de N,N’‐diciclohexilcarbodiimida (DCC) en 100 ´l de DMF anhidro. La solu‐

ción resultante se llevó a sequedad a presión reducida. El residuo obtenido se purificó

por cromatografía en placa preparativa RPC18 utilizando como solvente de elución una

mezcla de metanol/agua (9:1). Se obtuvieron 5,2 mg (4,3 ´mol, 55% ) del producto co‐

mo un sólido azul intenso.

RMN‐1H (500 MHz, CD3OD): ~ 8,23 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 8,07 – 7,90 (m, 3H), 7,82 (d, J =

13,4 Hz, 1H), 7,70 – 7,56 (m, 2H), 7,46 (dd, J = 6,6, 5,4 Hz, 2H), 7,37 (t, J = 7,7 Hz, 1H),

7,17 (dd, J = 8,4, 5,1 Hz, 2H), 6,26 (d, J = 13,0 Hz, 1H), 6,02 (d, J = 13,5 Hz, 1H), 4,49 (dd,

J = 8,1, 5,2 Hz, 1H), 4,41 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 4,30 (dd, J = 7,8, 4,5 Hz, 1H), 4,05 (t, J = 7,2

Hz, 2H), 3,81 (s, 4H), 3,70 – 3,60 (m, 8H), 3,57 – 3,50 (m, 4H), 3,37 (s, 4H), 3,02 (t, J =

6,8 Hz, 4H), 2,92 (dd, J = 12,8, 5,0 Hz, 1H), 2,84 (s, 4H), 2,58 – 2,56 (m, 2H), 2,55 (s, 3H),

2,35 – 2,27 (m, 4H), 2,27 – 2,19 (m, 4H), 2,04 (s, 6H), 1,92 – 1,81 (m, 6H), 1,73 (s, 6H),

1,69 – 1,56 (m, 2H), 1,54 – 1,41 (m, 4H), 1,36 – 1,28 (m, 4H).

N+

N

N

SO

-O

O

OH

O

N

NH2-PEG3-biotina

DCC, NHS, Et3NDMF

N+

N

N

SO

-O

O

HN

O

N

OO

NH

NH

OH

NHH

SO

O28

34

GENERALIDADES

205

EMAR (ESI+): (M+Na)+ calc. C66H92N8O9S2 1227,6321; encontrado 1227,6341

Compuesto 37

Se disolvieron 60 mg (81 ´mol) de 23 y 58 mg (240 ´mol) de 33 en 2 ml de DMF

anhidro se agrega 90 ´l (640 ´mol) de trietilamina. La solución se agitó a temperatura

ambiente durante 20 h cubierta de la luz. Luego se evaporó el solvente a presión redu‐

cida obteniéndose un residuo azul intenso. El crudo de reacción se purificó mediante

repetidas cromatografías de exclusión por tamaños utilizando Toyopearls HW40F

(2 cm de diámetro y 75 cm de altura) como fase estacionaria y metanol como solvente

de elución. Se obtuvieron 50 mg (53 ´mol, 66% ) de producto como un sólido azul in‐

tenso.


= 8,7 Hz, 2H), 7,86 – 7,80 (m, 2H), 7,82 (d, J = 10,6 Hz, 2H), 7,70 (d, J = 12,7 Hz, 1H),

7,55 (d, J = 7,7 Hz, 2H), 7,48 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,36 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,29 (dd, J = 17,8,

7,6 Hz, 2H), 7,05 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,01 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 5,78

(d, J = 12,6 Hz, 1H), 4,25 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 4,06 (s, 4H), 3,92 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 3,84

(t, J = 5,2 Hz, 2H), 3,22 (q, J = 7,3 Hz, 2H), 3,02 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 3,00 (t, J = 7,4 Hz, 2H),

2,70 (t, J = 5,8 Hz, 2H), 2,61 (t, J = 5,8 Hz, 2H), 2,33 – 2,17 (m, 4H), 1,89 – 1,84 (m, 2H),

1,82 (s, 6H), 1,76 – 1,63 (m, 2H), 1,56 (s, 6H), 1,50 (dt, J = 15,1, 7,7 Hz, 2H), 1,33 (t, J =

7,3 Hz, 2H).


206

RMN‐13C (125 MHz, CD3OD) ~ 176,9, 166,3, 158,3, 148,8, 137,3, 131,0, 129,8, 129,6,

128,4, 127,9, 126,7, 123,7, 123,1, 122,7, 122,0, 121,5, 121,4, 109,9, 108,3, 93,6, 59,6,

53,7, 46,5, 34,1, 29,3, 27,7, 27,0, 26,2, 25,9, 25,8, 24,7, 22,3, 21,1, 7,8.

EMAR (ESI‐): (M‐H)‐ calc. C57H66N6O5S 945,4743; encontrado 945,4715.

Compuesto 36

Se preparó una solución de 9 mg (9,5 ´mol) de 37, 6 mg (14,3 ´mol) de (+)‐N‐

biotinil‐3,6,9‐trioxaundecanodiamina (NH2‐PEG3‐biotina, Pierce) en 1 ml de DMF anhi‐

dro. Se agregaron 4 ´l (28,7 ´mol) de trietilamina, 1,6mg (14,25 ´mol) de N‐

hidroxisuccinimida (NHS) y, por último, 2,3 mg (11,4 ´mol) de N,N’‐diciclohexilcarbo‐

diimida (DCC). La solución resultante se dejó agitando durante 10 h a temperatura am‐

biente y cubierta de la luz, luego de lo cual se evaporó el solvente a presión reducida.

El crudo de reacción obtenido fue purificado mediante cromatografía en placa prepa‐

rativa RPC18 utilizando como solvente de elución una mezcla de metanol/agua (9:1).

Se obtuvieron 3,1 mg (4,4 ´mol, 35% ) del producto puro como un sólido azul intenso.


= 8,7 Hz, 1H), 7,91 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,88 – 7,78 (m, 2H), 7,71 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 7,56

(d, J = 7,7 Hz, 2H), 7,49 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,41 – 7,23 (m, 5H), 7,05 (t, J = 7,5 Hz, 1H),

7,02 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 6,00 (d, J = 13,0 Hz, 1H), 5,78 (d, J = 12,7

N+ N

SO O-

O

HN

N

N

N

O

HO

N+ N

SO

-O

O

HN

N

N

N

HN

OO

O

NH

NH

OH

NHH

SO

O

Biotin-PEG3-NH2

DCC, NHS,Et3NDMF

3736

GENERALIDADES

207

Hz, 1H), 4,48 (dd, J = 7,6, 4,9 Hz, 1H), 4,29 (dd, J = 7,9, 4,5 Hz, 1H), 4,26 (t, J = 7,4 Hz,

2H), 4,07 (s, 4H), 3,94 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 3,85 (t, J = 5,5 Hz, 2H), 3,69 – 3,59 (m, 8H),

3,53 (t, J = 5,4 Hz, 4H), 3,20 (s, 3H), 3,01 (dd, J = 15,5, 8,6 Hz, 4H), 2,97 – 2,86 (m, 1H),

2,71 (t, J = 10,1 Hz, 2H), 2,62 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 2,33 – 2,13 (m, 6H), 1,88 – 1,84 (m, 2H),

1,82 (s, 6H), 1,76 – 1,58 (m, 8H), 1,57 (s, 6H), 1,46 (dt, J = 22,7, 7,5 Hz, 4H), 1,37 – 1,18

(m, 6H), 1,04 – 0,88 (m, 2H).

RMN‐13C (125 MHz, CD3OD) ~ 174,6, 173,2, 158,3, 148,8, 141,6, 139,6, 137,3, 131,0,

129,9, 127,9, 126,7, 123,7, 123,2, 122,7, 122,0, 121,6, 121,4, 109,9, 108,3, 106,7, 70,2,

69,8, 69,2, 61,9, 60,2, 59,6, 55,6, 53,7, 48,4, 39,6, 38,9, 38,4, 35,3, 28,4, 28,1, 27,7,

27,0, 26,2, 25,9, 25,8, 25,4, 25,3, 22,3, 21,2.

EMAR (ESI‐): (M‐H)‐ calc. C75H98N10O9S2 1345,6888; encontrado 1345,6880.

6.1.8. Capitulo 4 – Tricarbocianinas confinadas sobre superficies

2‐(9H‐fluoren‐9‐ilmetilsulfanil)etanamina (40).

A una solución de N‐Boc‐cisteamina (0,3 g, 1,70 mmol) en 10 ml de CH2Cl2 se

añadió 0,620 g (1,86 mmol) de N‐(9‐fluorenilmetoxicarbonil)succinimida, FmocSuc, y

260 ´l (1,86 mmol) de trietilamina. Luego de 4 horas de agitación, el solvente de reac‐

ción se removió a presión reducida y se purificó mediante cromatografía en columna

de sílica gel utilizando como solvente de elución cHex:AcOEt (9:1) para dar 0,538 g

(1,5 mmol, 89% ) de la N‐Boc‐S‐Fm‐cisteamina como un aceite transparente. El produc‐

to obtenido se conservó protegido hasta el momento de ser utilizado.

RMN‐1H (200 MHz, CDCl3): ~ 7,73 (dd, J = 15,9, 7,2 Hz, 4H), 7,59 – 7,26 (m, 4H), 4,84 (s,

1H), 4,13 (t, J = 6,2 Hz, 1H), 3,30 (dd, J = 11,9, 5,8 Hz, 2H), 3,12 (d, J = 6,3 Hz, 2H), 2,64

(t, J = 6 Hz, 2H), 1,46 (s, 9H).


208

RMN‐13C (50 MHz, CDCl3) ~ 155,7, 145,9, 141,1, 127,6, 127,0, 124,8, 119,9, 79,4, 47,0,

39,7, 36,1, 33,3, 28,4.

La desprotección se llevó a cabo de la siguiente manera. Se disolvió el derivado obte‐

nido (79 mg, 0,22 mmol) en 0,5 ml de CH2Cl2 y se llevó a baño de hielo. Se agregó gota

a gota 0,5 ml de ácido trifluoroacético y se dejó agitando a temperatura ambiente du‐

rante 30 min. El solvente se eliminó por evaporación a presión reducida y el residuo

obtenido se redisolvió con NaOH 2N (2ml). Se extrajo con CH2Cl2 (3x2 ml), las fases

orgánicas se juntaron, se secaron con Na2SO4 (anh) y se evaporaron a presión reducida

para dar 0,57 g (0,22 mmol, cuantitativo) de un aceite amarillento el cual se utilizó in‐

mediatamente sin posterior purificación.

Compuesto 42

A una solución de 18 (10 mg, 13 ´mol) en 1 ml de DMF anhidro se añadió 40

junto con 5 ´L (36 ´mol) de trietilamina, se dejó agitando la solución por 10 h en la

oscuridad. Luego el solvente se evaporó en vacío para obtener un sólido azul oscuro. El

producto se purificó por cromatografía de filtración en gel, utilizando como fase esta‐

cionaria Sephadex LH‐20 (1 cm de diámetro y 75 cm de altura) empleando metanol

como solvente de elución. De esta manera se obtuvieron 8,7 mg (9,75 ´mol, 75% ) del

compuesto 41 como un sólido azul oscuro.

N+

O

HO

N

O

OH

ClDMF, 40

N+

O

HO

N

O

OH

HN

S

N+

O-O

N

O

OH

HN

SH

PiperidinaDMF

Et3N

1841

42

Fm

GENERALIDADES

209

Posteriormente, se trató el compuesto 41 para remover el grupo protector. Se

disolvieron 8,7 mg (9,7 mmol) de 41 en 1 ml de una mezcla de DMF y piperidina (2:1).

La solución se dejó agitando a temperatura ambiente durante 2,5 h, luego de lo cual se

removió el solvente a presión reducida. El crudo de reacción fue purificado mediante

cromatografía de exclusión por tamaños utilizando Sephadex LH20 como fase estacio‐

naria (1 cm de diámetro y 75 cm de altura) y metanol como solvente de elución segui‐

da de cromatografía en capa preparativa RPC18 utilizando una mezcla de meta‐

nol/agua (4:1) como solvente de corrida. Se obtuvieron de esta manera 4,0 mg (5,5

´mol, 57% ) del producto como un sólido azul intenso

RMN‐1H (200 MHz, CD3OD): ~ 7,86 (d, J = 13,0 Hz, 2H), 7,59 – 7,35 (m, 4H), 7,31 (d, J =

7,8 Hz, 2H), 7,11 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 5,88 (d, J = 13,1 Hz, 2H), 4,26 – 4,06 (m, 2H), 4,01 (t,

J = 5,2 Hz, 4H), 3,21 – 2,89 (m, 6H), 2,53 (t, J = 5,8 Hz, 2H), 2,28 (t, J = 11,3 Hz, 2H), 1,80

(d, J = 8,6 Hz, 6H), 1,68 (s, 12H), 1,54 – 1,17 (m, 8H).

EMAR (ESI+): M+ calc. C44H57N3O4S, 723,4064, encontrado, 723,4057.

6.1.9. Capítulo 5 – Nanosensores aplicados a sistemas in vivo

Compuesto 47

Se preparó una solución de 2,7 mg (5,7 ´mol) de 5(6)‐carboxinaftofluoresceína

en 1 ml de DMF sobre con molecular sieves 4Å. Se agregaron 2 ´l (14 ´mol) de trietil‐

amina, 1,3 mg (11,4 ´mol) de N‐hidroxisuccinimida (NHS) y 1,5 mg (7,27 ´mol) de

N,N’‐diciclohexilcarbodiimida (DCC). Luego se evaporó el solvente a presión reducida y

se purificó el crudo de reacción mediante cromatografía en capa preparativa RPC18

utilizando una mezcla metanol:agua (4:1) como solvente de elución. Se obtuvieron

2,5 mg (3´mol, 52% ) del producto como un sólido rosáceo.

O

OHO

O

HOHN O

OO

SNH

HN O

NH

H

H

O

OHO

O

HO

OO

OH

i) DCC, NHS, DMF

ii) NH2-PEG2-biotinaEt3N, DMF

46 47


210

RMN‐1H (500 MHz, CD3OD): ~ 8,69 (dd, J = 9,0, 1,8 Hz, 2H), 8,56 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,23

(dd, J = 8,0, 1,6 Hz, 1H), 8,21 (d, J = 1,3 Hz, 1H), 8,19 (dd, J = 8,1, 0,7 Hz, 1H), 7,68 (d, J =

0,8 Hz, 1H), 7,43 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,38 (dd, J = 9,0, 2,4 Hz, 2H), 7,34 (dd, J = 8,0, 0,5

Hz, 1H), 7,19 (d, J = 1,7 Hz, 2H), 6,76 (dd, J = 10,2, 9,0 Hz, 2H), 4,43 (dd, J = 7,9, 4,4 Hz,

1H), 4,21 (dd, J = 6,3, 3,3 Hz, 1H), 3,77 – 3,64 (m, 4H), 3,62 – 3,50 (m, 4H), 3,47 (t, J =

4,4 Hz, 2H), 3,38 – 3,34 (m, 2H), 3,19 – 3,10 (m, 1H), 3,10 – 3,01 (m, 1H), 2,91 – 2,77

(m, 2H), 2,06 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,71 – 1,45 (m, 4H), 1,42 – 1,24 (m, 2H).

Las señales en cursiva corresponden al isómero 5 y en imprenta al isómero 6. La inte‐

gración de las señales determinar una relación de isómeros 5/6 de 65:35.

RMN‐13C (125 MHz, CD3OD) ~ 174,7, 164,6, 131,2, 130,0, 129,6, 128,4, 126,9, 123,5,

121,6, 110,1, 70,2, 69,9, 69,8, 69,3, 61,9, 60,1, 55,5, 49,7, 49,6, 39,6, 38,9, 35,3, 28,3,

28,0, 27,3, 25,4, 24,7, 22,4, 21,6.

EMAR (ESI‐): (M‐H)+ calc. C45H44N4O10S, 831,2706; encontrado, 831,2710.

6.2. ESPECTROSCOPÍAS DE ABSORCIÓN Y FLUORESCENCIA

6.2.1. Espectroscopía UV/visible

Se utilizó un espectrofotómetro UV/Vis Cary 50 de doble haz con 1 nm de reso‐

lución y con un rango espectral de 190‐1000 nm. Se utilizaron cubetas de 1 cm y 5 mm

de paso óptico.

6.2.2. Espectroscopía de fluorescencia en estado estacionario

Los espectros de fluorescencia en estado estacionario fueron determinados en

un espectrofluorómetro Varian Cary Eclipse, equipado con un soporte multicubeta

termostatizado mediante un sistema peltier. Los espectros de emisión fueron corregi‐

dos por la sensibilidad del detector. Las concentraciones de los fluoróforos se ajusta‐

ron de manera de que su absorbancia sea menor a 0,1 para evitar efectos de filtro in‐

terno, autoapagamiento, etc.

ESPECTROSCOPÍAS de absorción y fluorescencia

211

6.2.3. Espectroscopía de tiempos de vida media

Los tiempos de vida media de fluorescencia obtenidos mediante el método

TCSPC fueron determinados utilizando un sistema Horiba Jobin Yvon IBH FluoroCube‐

11‐NL, equipado con un diodo laser N‐405L (longitud de onda: 405±10nm, ancho de

pulso: <200ps) y un detector TBX‐04‐C. Se dispuso un filtro de banda en la entrada del

detector, 605/WB20 (Omega Optical) y 655/WB20 (Omega Optical) en las determina‐

ciones de QD605 y QD655, respectivamente. La dependencia de la detección con la

polarización se eliminó utilizando la condición de “ángulo mágico” (polarizadores de

excitación y emisión a 0° y 54,7°, respectivamente). Se utilizaron soluciones 10 nM de

nanopartículas en buffer de pH conocido y cubetas de 5 mm de paso óptico. Los datos

obtenidos fueron procesados mediante el uso de programa DAS6 (Horiba Scientific).

Alternativamente, se utilizó un método desarrollado por el Dr Thomas Jovin utilizando

el software Wolfram Mathematica 8.0, en el cual se representa R[t] por una función

arbitraria con una forma analítica para F[t].

6.2.4. Determinación de rendimientos cuánticos de fluorescencia

Las determinaciones de los rendimientos cuánticos de emisión se realizaron a

partir de soluciones aproximadamente 1 ´M de los fluoróforos en PBS. Los valores

informados se calcularon mediante el método comparativo y utilizando Alexa 647 co‐

mo referencia (φFl = 0,33 en PBS).2 Se utilizan soluciones del fluoróforo incógnita y la

referencia de aproximadamente la misma absorbancia y se aplica la ecuación [1].

donde IX e IRef son los espectros de fluorescencia corregidos y A es la absorban‐

cia a la longitud de onda de excitación.

Re f exc

X exc

A ( )X exc emFl,X

A ( )Fl,Ref Ref exc em

I ( , )d 1 10

1 10I ( , )d

[1]


212

6.3. MICROSCOPÍAS DE FLUORESCENCIA

6.3.1. Microscopía confocal

Se utilizó un microscopio confocal Olympus Fluoview FV 1000 provisto de un

objetivo de inmersión en agua UPLSAPO 60XW 1,2 AN (Olympus), equipado con un

laser de 405 nm. Se empleó un espejo dicroico de excitación de 460 nm (Semrock), un

espejo dicroico de emisión de 490 nm (Olympus) y un filtro de emisión 590/WB60

(Olympus).

6.3.2. Microsocopía de tiempos de vida media de fluorescencia

Las determinaciones FLIM fueron realizadas utilizando un microscopio confocal

Olympus Fluoview FV 1000 provisto de un objetivo de inmersión en agua UPLSAPO

60XW 1,2 AN (Olympus) equipado con un diodo laser de 440 nm pulsado a una fre‐

cuencia de 20MHz (ISS) y acoplado a un sistema de detección Fast‐FLIM (ISS). Se utilizó

un espejo dicroico de excitación de 460 nm (Semrock), un espejo dicroico de emisión

de 490 nm (Olympus) y un filtro de emisión 605/WB15 (Semrock). Los datos obtenidos

fueron procesados mediante el programa SimFCS desarrollado por el Dr. Enrico Grat‐

ton. Alternativamente, se utilizó un método desarrollado por el Dr Thomas Jovin utili‐

zando el programa Wolfram Mathematica 8.0.

6.3.3. Microscopía de campo amplio

Se utilizó un microscopio invertido Olympus IX‐71 equipado con una lámpara de

mercurio X‐Cite 120PC y una cámara EMCCD refrigerada (dispositivo de carga acoplada

con multiplicación de electrones, Electron Multiplier Charged Coupled Device) Andor

iXon3 885K‐VP. Se utilizó un objetivo de aire UPLSAPO 40X 0,9 AN (Olympus), un filtro

de excitación 655/WB20 (Omega Optical), un espejo dicroico de 770 nm (Chroma) y un

filtro de emisión 800/WB80 (Omega Optical).

Las nanopartículas magnéticas recubiertas con 26 se prepararon de la siguiente

manera: se tomaron 10 µl DynaBeads M‐280 (Life Technologies Inc), las cuales fueron

previamente lavadas 3x50 µl con PBS, y se incubaron con 50 µl de una solución 10 nM

CULTIVO celular y crio‐preservación

213

de 26 durante 10 minutos. Luego se procedió a la separación y lavado de las partículas

(3 x 50 µl con PBS). Posteriormente, se realizó una dilución 1:200 en PBS de la suspen‐

sión obtenida y se llevó (25 µl) a un portaobjetos multicavidad (A10657, Hamamatsu).

Se adquirieron imágenes DIC y de fluorescencia de las partículas conjugadas con el

fluoróforo. Las muestras control se prepararon mediante una incubación de las partí‐

culas magnéticas con un exceso de biotina libre (10 µl de una solución 10 µM) previo al

tratamiento con 26, de manera de bloquear los sitios activos en las partículas.

6.4. CULTIVO CELULAR Y CRIO‐PRESERVACIÓN

6.4.1. Cultivo celular

Se utilizaron células de la línea estable CHO transfectadas con el receptor ACP‐

erbB1 las cuales se mantuvieron en medio DMEM‐alta glucosa suplementado con anti‐

biótico‐antimicótico 1% (Gifco) y 10 % (v/v) suero fetal bovino (SFB) a 37°C en 5 % CO2

y 98 % de humedad. Se plaquearon en vidrios de 12mm de diámetro, donde se realiza‐

ron los experimentos de microscopía, las células se despegadas con EDTA 1mM en PBS

(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4).

6.4.2. Crio‐preservación

Cultivos a 90 % de confluencia se trataron con EDTA‐PBS, como fue descripto

previamente, y las células fueron colectadas en tubos Falcon de 15mL por centrifuga‐

ción (4 minutos a 600 rpm). Las células resuspendidas en DMEM‐alta glucosa 20% SFB

a concentración final de entre 1 y 1,5.106 cel/ml fueron fraccionadas en criotubos y se

agregó DMSO a una concentración final de 10% (v/v). Los criotubos fueron colocados

en un dispositivo “cryo‐cooler” a ‐80 °C para transferirse a N2 líquido luego de 24 horas

de congelamiento.

6.4.3. Marcado de las células

Se incubaron células de la línea estable CHO transfectadas con el receptor ACP‐

erbB1 en cubreobjetos de 12 mm de diámetro en medio DMEM de alta glucosa suple‐

mentado con 10% de suero fetal bovino, hasta una confluencia del 75% , posteriormen‐


214

te se mantuvieron durante 12 horas en medio de cultivo DMEM sin aditivos, de esta

manera se mejora la eficiencia del marcado debido a un aumento en la cantidad de

receptores sobre la membrana celular. Luego se incubaron las células con una solución

1 ´M de 48 y 2 ´M de la enzima ACP‐S en buffer RAB‐Tyrode (135 mM NaCl, 10 mM

KCl, 10 mM MgCl2, 1mM CaCl2, 10 mM HEPES pH 7.2, 0,1 % BSA) durante 30 a 60 minu‐

tos a 37°C. Posteriormente se incubaron las células durante 15 minutos con una solu‐

ción 1 nM de pHiQD‐ITK(60). Para las muestras del nanosensor internalizado se llevó a

cabo una estimulación de los receptores con EGF 100 nM durante 30 minutos a 37°C.

Los cubreobjetos se montaron utilizando un buffer RAB‐Tyrode de pH conocido.

A las muestras montadas se les tomaron imágenes DIC, confocales de fluorescencia y

FLIM con un microscopio confocal Olympus Fluoview FV 1000 acoplado con un módulo

de detección DFD‐FLIM.

6.5. PREPARACIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE ORO

6.5.1. Nanopartículas de oro estabilizadas en buffer citrato (AuNP)

Las nanopartículas de oro fueron sintetizadas de acuerdo a métodos standard

introducidos por Turkevich y colaboradores3,4 y modificados por Frens5. Brevemente,

se disolvieron 4,5 mg de ácido tetracloroáurico (HAuCl4) en 45 ml de agua desionizada,

a 10 ml de esta solución se llevó a ebullición en un balón bajo agitación. Posteriormen‐

te, se agregaron 1,6 ml de citrato de sodio (Merck) 1% en agua desionizada. Luego de 5

minutos la solución se torna roja y su intensidad aumentó con el tiempo. Luego de 15

minutos, se dejó enfriar la solución y se continuó agitando durante otros 15 minutos.

Las AuNP estabilizadas en buffer citrato pH 7,5 fueron caracterizadas mediante

espectroscopía UV‐visible y microscopía de transmisión electrónica (Transmission Elec‐

tron Microscopy, TEM). Se determinó la distribución de tamaños fue llevada a cabo

mediante el programa ImageJ dando como resultado un tamaño promedio de

12 ± 1 nm (N=230 partículas).

CARACTERIZACIÓN de superficies

215

6.5.2. Nanopartículas recubiertas de aminotricarbocianina (AuNP‐ CNN)

Se incubó una solución de las nanopartículas estabilizadas en buffer citrato de

pH 7,5 y una solución de 42 en una relación molar 1:1000. Las nanopartículas fueron

cuantificadas mediante el cálculo de un coeficiente de absorción molar aproximado

para las AuNP utilizando el método desarrollado por Mie,6 obteniéndose un valor de

0,145x10‐9 M‐1cm‐1 el cual es coherente con el obtenido en reportes previos.7 La mez‐

cla de AuNP y 42 fue incubada durante 16 h a temperatura ambiente y cubierta de la

luz. Las nanopartículas funcionalizadas con la aminotricarbocianina (AuNP‐CNN) fueron

aisladas del exceso de 42 en solución mediante pasos de centrifugación secuenciales a

4°C. En primer lugar, la mezcla de reacción fue centrifugada durante 1 h a 3200g, el

sobrenadante fue separado y el residuo obtenido se resuspendió en buffer citrato

pH 7,5. El procedimiento se repitió en un segundo paso de centrifugación durante 1 h a

4600g y, finalmente, 3 veces más durante 1 h a 7600g. Los sobrenadantes obtenidos

fueron guardados y analizados mediante espectroscopía UV‐visible con el objeto de

monitorear los pasos de lavado. Luego del segundo paso de centrifugación no se de‐

tectaron restos de 42 en el espectro UV‐visible, sin embargo se continuó para asegurar

el proceso de lavado. Las AuNP‐CNN obtenidas fueron caracterizadas mediante espec‐

troscopía UV‐visible y TEM. Determinándose un tamaño promedio de 12±1 nm

(N = 190 partículas).

6.6. CARACTERIZACIÓN DE SUPERFICIES

6.6.1. Microscopía de efecto túnel

Las imágenes STM que se llevaron a cabo en este trabajo de tesis fueron lleva‐

das a cabo en colaboración con el grupo del Dr Roberto Salvarezza (INIFTA‐CONICET) y

estuvieron a cargo de la Dra. Doris Grumelli. Se utilizó un microscopio Nanoscope IIIa

de Veeco Instruments (Santa Bárbara, CA). Asimismo, se utilizaron puntas de pla‐

tino/iridio comerciales (Nanoprobes™ STM tips) de 8mm de largo y 0,25mm de diáme‐

tro que fueron limpiadas bajo corriente de nitrógeno antes de su uso. Se utilizaron

voltajes túnel de entre 800‐1000 mV y corrientes de 300 pA. El programa de análisis


216

utilizado fue el provisto por la empresa fabricante del microscopio (Nanoscope III Digi‐

tal Instruments Inc., versión 4.22).

6.6.2. Espectroscopía fotoelectrónica de Rayos X

Las determinaciones de espectroscopía de rayos X realizadas en esta tesis se

llevaron a cabo en colaboración con el grupo del Dr. Federico Williams (INQUIMAE‐

CONICET). Las medidas fueron realizadas bajo condiciones de UAV (presión de base

menor a 5x10‐10mbar) en un espectrómetro Specs UHV equipado con un analizador de

energía PHOIBOS 150 9MCD (Specs GmbH) hemiesférico de 150mm de radio promedio

con detector Multi‐Channeltron de 9 canales. Los espectros XPS fueron adquiridos con

una energía de paso constante de 20 eV usando una fuente de MgKα (XR50, Specs

GmbH) (1253,6 eV) operada a 12,5 kV y 20 mA y un ángulo de detección de 30°. La

calibración de la escala de energía se llevó a cabo utilizando oro evaporado (energía de

unión de Au4f7/2 = 84,00 eV). Las relaciones atómicas y las concentraciones en la super‐

ficie fueron calculadas a partir de las intensidades integradas de los niveles internos

luego de llevar a cabo las correcciones instrumentales y de fotoionización.

6.6.3. Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier y de reflexión‐

absorción con modulación de la polarización

Las determinaciones de PM‐IRRAS y FT‐IR presentados en esta tesis se llevaron

a cabo en colaboración con el grupo de la Dra. Lucila Méndez de Leo (INQUIMAE‐

CONICET). Los experimentos PM‐IRRAS fueron realizados con un espectrómetro Ther‐

mo Nicolet 8700 (Nicolet, Madison, WI) equipado con un banco óptico externo (TOM

box) con un detector MCT‐A (Nicolet), un modulador fotoelástico (PEM, PM‐90 con un

cabeza óptica II/Zs50 ZnSe 50 kHz (Hinds Instrument, Hillsboro, OR), espejos polariza‐

dor y lente de enfoque sobre el detector de ZnSe. Un demulador (Syncronous Sampling

Demodulator, SSD, GWC Instruments, Madison, QI) fue usado para separa las señales

provenientes del detector y alimentarlas a la consola de adquisición del espectrógrafo.

Los espectros IR fueron adquiridos con el PEM programado con un retardo de media

onda a 2900 cm‐1, para analizar la región del estiramiento de C‐H, y a 1500 cm‐1 para

CARACTERIZACIÓN de superficies

217

analizar la deformación de los enlaces C‐H y de la región aromática. El ángulo de inci‐

dencia fue de 80°, que rinde el máximo de la raíz cuadrática media de la fuerza del

campo eléctrico para la interface aire/Au(111). En este trabajo se utilizó la técnica de

demodulación desarrollada por Corn, la señal fue corregida por la respuesta del PEM

utilizando el método descripto por Frey.8 Típicamente se acumularon 8000 y 1500 ba‐

rridos y la resolución fue ajustada a 2 y 4 cm‐1, respectivamente.

Los espectros FT‐IR de transmisión obtenidos para la tricarbocianina sólida fue‐

ron determinados utilizando pastillas de KBr. La resolución fue ajustada a 4 cm‐1 y se

acumularon 200 barridos.

6.6.4. Voltametría cíclica

Los experimentos electroquímicos se llevaron a cabo con la Dra. Doris Grumelli

(INIFTA‐CONICET). Se utilizó una celda de vidrio equipada con electrodo de referencia y

electrodo auxiliar. Las determinaciones se llevaron a cabo con un potenciostato TEQ

con control mediante computadora para la adquisición de datos. Los electrodos con

sustrato de Au(111). Las soluciones fueron purgadas con nitrógeno. Todos los poten‐

ciales medidos y reportados fueron tomados con respecto a un electrodo de referencia

de calomelanos (Standard Calomel Electrode, SCE). Las soluciones de NaOH 0,1 M fue‐

ron preparadas utilizando agua desionizada proveniente de un sistema de purificación

Milli‐Q (Millipore Products, Bellford). Las electrodesorciones de tioles de los sustratos

de Au fueron llevadas a cabo mediante un barrido de potencial desde ‐0,2 a ‐1,40 V a

0,05 Vs‐1 en una solución acuosa de NaOH 0,1 M a temperatura ambiente. La densidad

de carga y el potencial de pico derivados del proceso de desorción fueron tomados

como indicadores de cobertura de superficie de los tioles que formaban el SAM co‐

rrespondiente.

6.6.5. Espectroscopía Raman

Los experimentos de dispersión Raman sobre superficie de Au(111) y SERS so‐

bre nanopartículas de Au fueron llevados a cabo en colaboración con el grupo de tra‐

bajo del Dr. Roberto Salvarezza (INIFTA‐CONICET) y realizados por el Lic. Emiliano Cor‐


218

tés en el laboratorio del Dr. Alejandro Fainstein (CAB, CNEA, Bariloche). Se utilizó un

espectrómetro triple Jobin‐Yvon T64000 operando en modo sustractivo y equipado

con un dispositivo de cargas interconectadas (Charge‐Coupled Device, CCD) enfriado

con N2 líquido. La excitación fue realizada utilizando un laser de Ar‐Kr (647,1 nm) y un

laser de estado sólido Ti:Zafiro de longitud de onda variable en forma continua entre

690 y 1080 nm (específicamente 775 nm). Los espectros fueron adquiridos 3 veces

(acumulativas) durante 300 s para Au(111) y 2 veces (acumulativas) durante 10 s para

las nanopartículas de Au. Se utilizó una potencia en el laser de 40 mW con un ángulo

de incidencia de 25° y enfocado en un círculo de 30 ´m de diámetro. La apertura nu‐

mérica de colección fue de 0,2; alineada a la normal de la superficie de Au(111). En el

caso de las nanopartículas de Au, los espectros fueron tomados en solución.

6.7. CÁLCULOS TEÓRICOS

La optimización de geometrías en el estado fundamental se llevó a cabo me‐

diante cálculos ab initio mediante la teoría del funcional de densidad (Density Functio‐

nal Theory, DFT) implementada en Gaussian 09A‐A.1.9 Se utilizó el funcional con tres

parámetros de Becke y Lyng‐Yang‐Parr (B3LYP) al nivel de teoría 6311G+(2d). Cuando

fue necesario se aplicó un modelo de fase condensada empleando el modelo del con‐

tinuo polarizable‐campo de reacción autoconsistente (Self Consistent Reaction Field‐

Polarizable Continuum Model, SCRF‐PCM) con los parámetros apropiados para el sol‐

vente de reacción.

Para el cálculo de las funciones de Fukui se aplicó un análisis de orbitales natu‐

rales de enlace (Natural Bond Orbital, NBO). Los resultados obtenidos fueron analiza‐

dos mediante un algoritmo desarrollado por el Dr. Carlos Stortz.

BIBLIOGRAFÍA

219

6.8. BIBLIOGRAFÍA

(1) Armarego, W. L. F.; Perrin, D. D. Purification of laboratory chemicals; Butterworth Heinemann, 1997. (2) Johnson, I. D.; Life, T.; Haugland, R. P.; Spence, M. T. Z. The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 11th Edition; Life Technologies, 2010. (3) Turkevich, J. Gold Bulletin 1985, 18, 86‐91. (4) Turkevich, J.; Stevenson, P. C.; Hillier, J. Discussions of the Faraday Society 1951, 11, 55‐75. (5) Frens, G. Nature Phys Sci 1973, 241, 20‐22. (6) Quinten, M. Optical Properties of Nanoparticle Systems; Wiley, 2011. (7) Amendola, V.; Meneghetti, M. The Journal of Physical Chemistry C 2009, 113, 4277‐4285. (8) Frey, B. L.; Corn, R. M.; Weibel, S. C. In Handbook of Vibrational Spectroscopy; John Wiley & Sons, Ltd: 2006. (9) Frisch, M. J.; Trucks, G. W.; Schlegel, H. B.; Scuseria, G. E.; Robb, M. A.; Cheeseman, J. R.; Scalmani, G.; Barone, V.; Mennucci, B.; Petersson, G. A.; Nakatsuji, H.; Caricato, M.; Li, X.; Hratchian, H. P.; Izmaylov, A. F.; Bloino, J.; Zheng, G.; Sonnenberg, J. L.; Hada, M.; Ehara, M.; Toyota, K.; Fukuda, R.; Hasegawa, J.; Ishida, M.; Nakajima, T.; Honda, Y.; Kitao, O.; Nakai, H.; Vreven, T.; Montgomery, J. J. A.; Peralta, J. E.; Ogliaro, F.; Bearpark, M.; Heyd, J. J.; Brothers, E.; Kudin, K. N.; Staroverov, V. N.; Kobayashi, R.; Normand, J.; Raghavachari, K.; Rendell, A.; Burant, J. C.; Iyengar, S. S.; Tomasi, J.; Cossi, M.; Rega, N.; Millam, J. M.; Klene, M.; Knox, J. E.; Cross, J. B.; Bakken, V.; Adamo, C.; Jaramillo, J.; Gomperts, R.; Stratmann, R. E.; Yazyev, O.; Austin, A. J.; Cammi, R.; Pomelli, C.; Ochterski, J. W.; Martin, R. L.; Morokuma, K.; Zakrzewski, V. G.; Voth, G. A.; Salvador, P.; Dannenberg, J. J.; Dapprich, S.; Daniels, A. D.; Farkas, Ö.; Foresman, J. B.; Ortiz, J. V.; Cioslowski, J.; Fox, D. J., Gaussian 09, Revision A.1, 2009 Gaussian, Inc., Wallingford CT.

CAPÍTULO 7

TÉCNICAS INSTRUMENTALES

ESPECTROSCOPÍAS DE FLUORESCENCIA RESUELTA EN EL TIEMPO

221

7.1. ESPECTROSCOPÍAS DE FLUORESCENCIA RESUELTA EN EL TIEMPO

7.1.1. Determinaciones de tiempos de vida en el dominio del tiempo

El método de Conteo de Fotones Individuales Correlacionados en el Tiempo

(Time Correlated Single Photon Counting, TCSPC) para la determinación de tiempos de

vida media de fluorescencia es uno de los más utilizados en la actualidad. El principio

básico de esta técnica se basa en que la probabilidad de detectar un fotón individual a

un tiempo t luego de un pulso de excitación es proporcional a la intensidad de fluores‐

cencia en ese momento. La muestra es excitada repetidas veces por un pulso corto de

luz y se registran los tiempos de arribo de fotones individuales. Con los datos obteni‐

dos a partir de un gran número de eventos se reconstruye la curva de decaimiento de

la intensidad de fluorescencia, según se observa en la Figura 7.1.

En la Figura 7.2 se muestra el arreglo instrumental convencional para esta téc‐

nica. La fuente de excitación emite un pulso óptico que es asociado con un pulso eléc‐

trico, el cual se dirige a través de un discriminador a la entrada INICIO de un conversor

de tiempo‐amplitud (Time‐to‐Amplitude Converter, TAC). Mientras tanto, la muestra es

Figura 7.1. Principio de funcionamiento del método TCSPC

CAPÍTULO 7 – TÉCNICAS INSTRUMENTALES

222

excitada por el pulso óptico y emite fluorescencia. El pulso eléctrico obtenido en el

detector es dirigido a la entrada FIN del TAC, lo que genera un pulso de salida cuya

amplitud es proporcional al tiempo transcurrido entre la señal INICIO y la de FIN. Se

incluye un discriminador en el paso óptico cuya función es seleccionar fotones indivi‐

duales (excluyendo los eventos de múltiples fotones) y aumentar la precisión en la

determinación del tiempo de arribo. Luego de un gran número de eventos de excita‐

ción y detección, se obtiene un histograma que representa la curva de decaimiento de

la intensidad de fluorescencia. Es importante que el número de pulsos con respuesta

fluorescente sea mucho menor que el número de pulsos de excitación (< 0,01‐0,05) de

manera que la probabilidad de detectar dos fotones en un pulso de excitación sea des‐

preciable. Esta condición se satisface ajustando la óptica del equipo (p.ej. mediante un

Figura 7.2. Diagrama esquemático de un espectrofluorómetro TCSPC


223

filtro de densidad neutra) de manera de que el fotomultiplicador no detecte más de un

fotón por cada pulso de excitación.

La función de decaimiento observada, F(t), es la convolución de la respuesta

instrumental R(t) y del decaimiento teórico (modelo dependiente) de la intensidad de

fluorescencia I(t) de la muestra luego de un pulso ~ (función de Dirac) de excitación,

según se muestra en la ecuación [7.1].

La función de la respuesta instrumental representa el perfil del pulso de luz

proveniente de la fuente de excitación y se determina experimentalmente bajo las

mismas condiciones que para la muestra, remplazándola con una solución dispersiva,

p.ej. Ludox (sílica coloidal) o glicógeno.

Generalmente, la función de decaimiento de la intensidad de fluorescencia de

la muestra se ajusta a un modelo multiexponencial, donde se asume que dicho perfil

resulta de la suma de múltiples decaimientos monoexponenciales, ecuación [7.2].

donde αj son las amplitudes (factor preexponencial, son proporcionales a la po‐

blación los componentes a t=0) que decaen con tiempos de vida media τj y n represen‐

tan el número de componentes del decaimiento. Para determinar las amplitudes y los

tiempos de vida se aplica una reconvolución iterativa. Conociendo F(t) y R(t) se obtiene

I(t) por deconvolución de F(t) utilizando el método de cuadrados mínimos no lineal. La

descripción óptima es aquella que minimiza el valor de los residuales χ2. En general, el

ajuste se considera aceptable cuando 0,99< χ2<1,4.

Para un decaimiento multiexponencial, ecuación [7.2], la contribución fraccio‐

nal del componente j a la intensidad total en el estado estacionario está dada por la

ecuación [7.3].

F(t) R(t) I(t) [7.1]

t

j

n

jj 1

I(t) e

[7.2]


224

donde fj es la intensidad fraccional de la componente j, tal que la sumatoria so‐

bre todas las fj es igual a 1.

Cuando se aplica un modelo de decaimiento multiexponencial, muchas veces

resulta útil determinar el tiempo de vida media de fluorescencia promedio. Se utilizan

dos definiciones para el mismo, según se muestran en las ecuaciones [7.4] y [7.5].

donde ai representa la amplitud fraccional de la componente i. La ecuación

[7.4] define al tiempo de vida medio promedio como una media pesada por la intensi‐

dad fraccional de cada componente, y por ello se lo denomina tiempo de vida media de

fluorescencia ponderado por las intensidades, Int . En el caso de la ecuación [7.5], se

define el tiempo de vida media de fluorescencia promediado por las amplitudes, Amp ,

donde se utilizan los términos preexponenciales fraccionales (ai) como factor de pon‐

deración.

El uso de una definición u otra depende del fenómeno en estudio. Por ejemplo,

los tiempos de vida media ponderados por intensidades se utilizan en el cálculo de

constantes de apagamiento colisional, mientras que para experimentos que involucran

j j j0j n

i i0i 1

I (t)dtf

I(t)dt

[7.3]

i

n2

ini 1

Int i i ni 1

i ii 1

f

n

i i ni 1

Amp i ini 1

ii 1

a

[7.4]

[7.5]


225

transferencia de energía, el cálculo de la eficiencia del proceso se utilizan los tiempos

de vida media ponderados por amplitudes.

En la Figura 7.3 se muestra el ajuste del decaimiento de la intensidada de fluo‐

rescencia para QD605 a un modelo biexponencial.

7.1.2. Determinaciones de tiempos de vida en el dominio de las frecuencias

Un método alternativo para la determinación de tiempos de vida media de

fluorescencia es la técnica de fase‐modulación. En este caso, la muestra es excitada

con una fuente de radiación continua modulada en intensidad, típicamente se utiliza

una función senoidal, Figura 7.4. Se observa que la respuesta fluorescente presenta la

misma frecuencia de modulación pero con un retraso en la fase y parcialmente demo‐

dulada con respecto a la excitación. La respuesta armónica del sistema se caracteriza

50 100 1501

10

100

1000

Cue

ntas

Tiempo (ns)

50 100 150-10

-5

0

5

10

Res

idua

les

Tiempo (ns)Figura 7.3. Decaimiento de la intesidad de fluorescencia de QD605‐SAv ITK, mostrando el ajuste a un modelo biexponencial y los residuales obtenidos.

τ1=4,11 ns α1=870 cuentas τ2=16,20 ns α2=2130 cuentas


226

por el cambio en la fase φ (entre 0 y 90°) y la relación de demodulación M (entre 0 y

1), Figura 7.4. Estos parámetros se determinan para una frecuencia de modulación de

excitación determinada y pueden relacionarse con el tiempo de vida media de fluores‐

cencia de la muestra, según las ecuaciones [7.6] y [7.7].

donde M representa a la relación de modulación, φ es el cambio en la fase, ω

es la frecuencia de modulación de la radiación de excitación y τPh y τMod son los tiem‐

pos de vida media de fluorescencia determinados a partir de medidas de la fase y la

modulación, respectivamente. Se observa que los valores de fase y modulación son

dependientes de la frecuencia de modulación, Figura 7.5.a. Para decaimientos mono‐

Figura 7.4. Esquema de excitación y emisión en un espectrofluorímetro de fase y modulación. Deter‐minación de los parámetros de desfasaje y demodulación de la radiación de excitación (rojo) respecto de la emisión (negro).

2 2Mod

1M

1

PhTan( )

[7.6]

[7.7]

Figura 7.5. a. Relación entre la fase y modulación con la frecuencia de modulación de la radiación de excitación. b. Cambios en la modulación (línea llena) y la fase (línea punteada) para muestras con tiempos de vida de 5ns (rojo), 1ns (azul) y dos componentes (1 y 5ns) con igual amplitud (negro)

a. b.


227

exponenciales, se tiene τMod = τPh. Sin embargo, para decaimientos multiexponenciales

los tiempos de vida calculados a partir de las ecuaciones [7.6] y [7.7] para una frecuen‐

cia dada son valores aparentes, resultado de un complejo sistema de ponderación de

los τi individuales correspondientes a las distintas componentes del decaimiento.

Además, se observa que τModAp > τPhAp. La resolución de estos sistemas involucra la in‐

troducción de las transformadas de seno (Pω ) y coseno (Qω) de I(t) según se muestra

en las ecuaciones [7.8] y [7.9].

La combinación de estas ecuaciones permite obtener relaciones para la deter‐

minación de M y φ.

En sistemas con decaimientos multiexponenciales se tiene que las transforma‐

das P y Q se relacionan con los tiempos de vida media de cada componente según las

ecuaciones [7.12] y [7.13].

[7.8]

[7.9] 0

0

I(t)cos( t)dtQ Mcos( )

I(t)dt

0

0

I(t)seno( t)dtP Mseno( )

I(t)dt

PArcTan

Q

2 2M P Q

[7.10]

[7.11]

[7.12]

[7.13]

ni i

2 2i 1 i

fP

1

n

i2 2

i 1 i

fQ

1


228

La resolución de estos sistemas complejos se realiza mediante la determinación

del cambio de fase φ y M a diferentes frecuencias de modulación de excitación y pos‐

terior ajuste de los datos obtenidos al sistema de ecuaciones ecuaciones [7.10]‐[7.13]

para cada valor de ω, Figura 7.5.b.

Una ventaja de este método reside en que durante el procesamiento de los da‐

tos no es necesario realizar deconvoluciones de la señal observada.

7.1.3. Microscopía de tiempos de vida media de fluorescencia

La microscopía de tiempos de vida media de fluorescencia (Fluorescence Lifeti‐

me Imaging Microscopy, FLIM) es una técnica en la cual se lleva a cabo la determina‐

ción del tiempo de vida media en los píxeles individuales de una imagen tomada con

un microscopio de fluorescencia. En este sentido, las técnicas de determinación de

tiempos de vida en el dominio del tiempo y de las frecuencias se encuentran imple‐

mentadas tanto para microscopías de barrido como para las de campo amplio.

Las microscopías de barrido con laser brindan mayor resolución y contraste de

imagen, pero conllevan mayores tiempos de adquisición. Asimismo, los microscopios

de este tipo normalmete utilizan detectores puntuales y, por lo tanto, una electrónica

de detección más sencilla. Por otro lado, los detectores de campo amplio ofrecen ma‐

yores velocidades de adquisición

En los sistemas que trabajan en el dominio de las frecuencias (fase‐modulación)

se utiliza un sistema con modulación continua en la fuente de excitación y en el detec‐

tor. Para el caso de microscopios de campo amplio se utiliza una cámara equipada con

un intensificador de imagen cuya ganancia es modulada en forma continua con la

misma frecuencia que la fuente de excitación pero con una diferencia de fase contro‐

lada. La Figura 7.6 muestra el arreglo experimental para la determinación de los tiem‐

pos de vida media de fluorescencia utilizando un microscopio de campo amplio me‐

diante el método homodino (igual frecuencia de modulación en la excitación y la de‐

tección) de fase‐modulación.1


229

La señal de intensidad de fluorescencia en cada posición (r) de la imagen es

proporcional a la concentración del fluoróforo en la posición r, C(r), el coseno de la

diferencia de fase entra la emisión y la detección, la modulación en el detector (MD) y

la modulación en la emisión en cada posición, M(r), según se muestra en la ecuación

[7.14]

donde φD es la fase de modulación de la ganancia en el detector y φ(r) es el

desfasaje asociada a la emisión de fluorescencia. Un valor de φD=0 resulta en una in‐

tensidad máxima para un tiempo de vida nulo (p.ej. luz dispersada). La diferencia de

fase y la modulación asociada al fluoróforo en cada punto de la imagen (τPhAp(r) y

τModAp(r), respectivamente) se relaciona con los tiempos de vida media de fluorescen‐

cia aparentes según las relaciones vistas con anterioridad, ecuaciones [7.15] y [7.16].

[7.15]

[7.16] 2 Ap 2

Mod

1M(r)

1 (r)

ApPhTan( (r)) (r)

[7.14] 1D D D2I( ,r) kC(r) 1 M M(r)cos( (r) )

Figura 7.6. Diagrama esquemático de un microscopio de campo amplio FLIM de fase modulación.


230

La determinación de los tiempos de vida media de fluorescencia aparentes de

fase y modulación (τPhAp(r) y τModAp(r), respectivamente) no es posible mediante un

único valor de fase en el detector (φD). Por ello se lleva a cabo la colección de una serie

de imágenes sensibles a la fase donde φD se varía sobre 360° que se utilizan para de‐

terminar de manera obtener los valores de φ(r) y M(r) en cada pixel.

En resumen, la muestra es iluminada con luz modulada en intensidad, mientras

se utiliza una cámara y un intensificador de imagen para obtener una serie de imáge‐

nes sensibles a la fase. En dichas imágenes, la intensidad en cada pixel se espera que

varíe como el coseno de la diferencia de fase (ecuación [7.14]) y pueden relacionarse

con los tiempos de vida media aparentes de fase y modulación según las ecuaciones

[7.15] y [7.16]. Cabe destacar que las diferencias de fase y modulación obtenidas invo‐

lucran además factores instrumentales, los cuales son corregidos mediante las ecua‐

ciones [7.17] y [7.18].

donde φI y MI corresponden al cambio de fase y modulación intrínsecos del

equipo y se calculan de manera de obtener los valores adecuados de fase y modula‐

ción para un standard de tiempo de vida conocido, habitualmente fluoresceína.

Otra forma de detección es la del tipo heterodino la cual se logra mediante la

modulación del intensificador de imagen a una frecuencia f+Δf, mientras que la fluo‐

rescencia se modula a una frecuencia f. De esta manera la señal fluorescente de alta

frecuencia se transforma en una señal modulada a una frecuencia Δf (denominada

frecuencia de correlación cruzada, en el orden de los Hz ó kHz) que contiene la misma

información que la señal original de alta frecuencia.2 La fase y la modulación de la se‐

ñal de frecuencia Δf se determina simultáneamente en cada pixel en una cámara CCD.

Al igual que la técnica de tipo homodino (Δf = 0) se aplica secuencialmente un retardo

D D I

DD

I

MM

M

[7.17]

[7.18]


231

en la fase de la detección y se obtiene una serie de imágenes dentro de un ciclo de

360° con frecuencia Δf. La principal ventaja del método heterodino se encuentra en

que convierte las señales de alta frecuencia en una de baja frecuencia Δf que es fácil‐

mente manejable y detectada con mayor precisión, pero reteniendo la información de

fase y modulación de la señal fluorescente original.

Para el caso de decaimientos multicomponente es necesario al adquisición de

conjuntos de imágenes a diferentes frecuencias, p.ej. para un decaimiento triexponen‐

cial es necesaria la adquisición al menos a 5 frecuencias diferentes debido a el sistema

presenta cinco variables independientes (3 tiempos de vida media de fluorescencia y

dos amplitudes fraccionales) cuyo análisis puede ser complejo y computacionalmente

costoso.

7.1.4. Análisis de fasores en microscopías de tiempos de vida media de fluorescen‐

cia

La microscopía de tiempos de vida media de fluorescencia es una herramienta

fundamental y ha demostrado ser una herramienta poderosa en el análisis cuantitativo

de muestras biológicas.3,4 Sin embargo, aun existen ciertos desafíos a ser resueltos en

lo concerniente a la adquisición de datos así como a su análisis e interpretación.

En primer lugar, la señal en cada pixel de la imagen de intensidad de fluores‐

cencia puede estar conformada por diferentes especies, cada una de las cuales puede

mostrar un decaimiento multiexponencial. Asimismo, sólo es posible colectar luz por

un espacio limitado de tiempo (100‐200 ´s/pixel) lo que resulta en una pequeña canti‐

dad de fotones (500‐1000 fotones/pixel).5 En determinaciones realizadas en el dominio

del tiempo, este pequeño número de fotones difícilmente sea suficiente para distinguir

un decaimiento monoexponencial de uno biexponencial mediante el ajuste multiexpo‐

nencial discutido con anterioridad. Para el caso de las determinaciones en el dominio

de las frecuencias, el análisis de sistemas con decaimientos multiexponenciales requie‐

re la recolección de datos a múltiples frecuencias para luego resolver un complejo sis‐


232

tema de ecuaciones, lo cual puede resultar extremadamente costoso desde el punto

de vista de recursos de cálculo.6,7

En 2008, Digman y colaboradores8 presentaron el análisis de fasores aplicado a

la interpretación de datos proveniente de microscopías de tiempos de vida media de

fluorescencia. Este método puede ser aplicado a las técnicas de adquisición en el do‐

minio del tipo o de las frecuencias debido a que utiliza una representación diferente de

los decaimientos donde cada especie molecular tiene su identificación y cada proceso

(p.ej. procesos FRET o cambios de concentraciones de especies) puede ser fácilmente

reconocible. La información en cada pixel es representada desde un punto de vista

gráfico y global,9,10 donde el algoritmo utilizado no requiere de ajustes a modelos ni de

conocimientos previos del sistema.

El análisis de fasores trabaja en un nuevo “espacio” donde cada población (o

especie molecular) en la muestra se identifica por un único vector en el “diagrama de

fasores”. Este vector especial se denomina “fasor” y su ubicación en el diagrama de

fasores es única, sin importar el número de componentes necesarias para describir el

decaimiento de la intensidad de fluorescencia. Como se observa en la Figura 7.7, las

coordenadas de un fasor se calculan de acuerdo transformadas seno y coseno de I(t),

ecuaciones [7.8] y [7.9].

Figura 7.7. Representación gráfica de un fasor en un diagrama de fasores, se muestra el círculo uni‐versal y un fasor, el cual está identificado por su módulo M y fase φ.


233

En una imagen de intensidad de fluorescencia para cada pixel se calculan sus

coordenadas en el diagrama de fasores (Pi,j(ω) y Qi,j (ω)) de acuerdo a las ecuaciones

[7.19] y [7.20].

donde Mi,j(ω) y ϕi,j(ω) corresponden a la modulación y la fase de la emisión con

respecto a la excitación, ω es la frecuencia angular de modulación de excitación y los

subíndices i y j identifican un pixel en la imagen.

Para el caso de un pixel i,j donde haya una contribución de varias componentes

exponenciales al tiempo de vida media, las coordenadas P y Q del diagrama de fasores

están dadas por las ecuaciones [7.21] y [7.22].

donde fk es la contribución a la intensidad fraccional de la componente con

tiempo de vida τk. Se observa que los fasores asociados a todos los decaimientos posi‐

bles están representados por un semicírculo centrado en (0,5;0) y de radio 0,5; el cual

se denomina “círculo universal”. Sobre el mismo, los fasores asociados a tiempos de

vida monoexponenciales caen sobre el borde del círculo universal. Además, un fasor

correspondiente a un tiempo de vida muy corto (τ≈0, pequeño retraso en la fase) se

encuentra cercano al punto (1;0) mientras que un fasor correspondiente a un tiempo

de vida muy largo (τ≈∞)se encontrará cercano al punto (0;0), Figura 7.7. Cabe destacar

que la posición de un fasor en el diagrama de fasores depende de la frecuencia de mo‐

dulación de la excitación, ω, ya que tanto φ como M también están relacionados con la

misma (ecuaciones [7.6] y [7.7]), por lo que se tendrá un espacio de fasores distinto

para cada frecuencia de modulación.

[7.19]

[7.20] i,j i,j i,j

i,j i,j i,j

Q ( ) M ( )cos( ( ))

P ( ) M ( )seno( ( ))

[7.21]

[7.22]

ki,j 2

k k

k ki,j 2

k k

fQ ( )

1 ( )

fP ( )

1 ( )


234

El diagrama de fasores es un nuevo sistema coordenado donde el decaimiento

total medido resulta de una combinación lineal del tiempo de vida media de fluores‐

cencia de cada componente. El fasor asignado a un decaimiento multiexponencial está

dado por la suma vectorial pesada por las contribuciones de cada componente. En el

caso de un decaimiento biexponencial el fasor determinado experimentalmente siem‐

pre cae dentro de una recta que une a los fasores componentes, según se muestra en

la Figura 7.8.a. La contribución de cada componente identifica de forma exacta la posi‐

ción del fasor correspondiente al decaimiento total dentro de dicho segmento. Cabe

destacar que si se desconocen las componentes de un fasor que cae dentro del círculo

universal, éste puede asociarse con múltiples combinaciones de tiempos de vida dife‐

rentes. En estos casos se hace necesario el uso de diagramas de fasores a diferentes

frecuencias de modulación de la excitación (generalmente armónicas superiores de la

misma) para poder identificar las componentes del mismo. Esta es otra propiedad fun‐

damental de los fasores, varias especies moleculares diferentes pueden estar asocia‐

das al mismo fasor a una frecuencia determinada, sin embargo el análisis a múltiples

frecuencias (múltiples armónicas de la frecuencia de modulación fundamental) resuel‐

ve estos fasores y permite identificarlos unívocamente.

Para el caso N especies moleculares, todas las posibles combinaciones de po‐

blaciones están contenidas en un polígono de N vértices que son coincidentes con la

ubicación de los fasores de las diferentes especies moleculares, en la Figura 7.8.b se

Figura 7.8. a. El fasor asociado a una mezcla de dos componentes es la combinación lineal pesada por las contribuciones de cada componente y siempre cae en la recta que los une. b. El fasor asociado a una mezcla de N componentes está limitado al área de un polígono de N vértices, 3 en este ejemplo.

a. b.


235

muestra un ejemplo para un decaimiento con 3 componentes.

Como se detalló con anterioridad el método de análisis mediante fasores puede

aplicarse a datos adquiridos en el dominio del tiempo o de las frecuencias. En la Figura

7.9 se muestra que aun cuando la dependencia temporal de la intensidad de fluores‐

cencia en ambas metodologías es completamente diferente (debido que el modo de

adquisición es distinto) es posible utilizar el mismo conjunto de ecuaciones para des‐

cribirlos, debido a que ambas funciones son periódicas y continuas. Para ello se toman

cuatro valores en el perfil de intensidades (n1, n2, n3 y n4), a partir de los cuales se

calculan los valores de φ y M. Este hecho representa una gran ventaja, dado que el

cálculo de los fasores para un set de datos involucra un único conjunto de ecuaciones,

sin importar si la adquisición de los datos fue realizada en el dominio del tiempo o de

las frecuencias.

2 2 2

n1 n2 n3 n4DC

4

AC (n1 n3) (n2 n4)

n2 n4Arctan

n1 n3

ACM

DC

2 2 2

n1 n2 n3 n4DC

4

AC (n1 n3) (n2 n4)

n2 n4Arctan

n1 n3

ACM

DC

a.

b.

Figura 7.9. Cálculo de la fase y modulación para datos en el dominio de las frecuencias (a) y del tiem‐po (b). En ambos casos se identifican 4 valores que se utilizan para el cálculo de los parámetros.


236

7.1.5. Microscopía rápida de tiempos de vida media de fluorescencia

Los métodos tradicionales de FLIM en el dominio de las frecuencias requieren

del uso de detectores con ganancia modulada y amplificadores de radio‐frecuencia11

los cuales son costosos y no son fácilmente acoplables a los microscopios confocales

convencionales. Recientemente, Colyer y colaboradores12 presentaron una nueva ins‐

trumentación para la aplicación en microscopía de tiempos de vida media de fluores‐

cencia de bajo costo denominado “Microscopía de Tiempos de vida media de Fluores‐

cencia en el Dominio de la Frecuencia Digital” (Digital Frequency Domain Fluorescence

Lifetime Imaging Microscopy, DFD‐FLIM) o Fast‐FLIM, debido a que permite obtener

menores tiempos de adquisición con una calidad comparable a los métodos TCSPC, ya

que optimiza la eficiencia de los fotones emitidos. Esta aproximación cae en la catego‐

ría del “dominio de las frecuencias” aunque opera en un modo de conteo de fotones.

Como se vio con anterioridad, en las técnicas analógicas la adquisición en el

dominio de las frecuencias se lleva a cabo mediante la modulación de la ganancia de

un fototubo multiplicador (Photomultiplier Tube, PMT) o un intensificador de imáge‐

nes. En la técnica DFD‐FLIM la modulación de las señales analógicas se remplazan con

un esquema de modulación digital dentro de los circuitos de la colección de datos (en

lugar de al nivel del detector). Esto se lleva a cabo utilizando múltiples ventanas de

muestreo dentro de cada período de excitación, como se muestra en la Figura 7.10.

Figura 7.10. Esquema del principio heterodino digital, con un valor de Δf exagerada (Δf=f/8 en lugar de Δf=f/256 utilizado en la implementación). Los fotones detectados (círculos) se asignan a uno de cuatro ventanas temporales (warrival), de acuerdo a su tiempo de arribo. En el caso real, las ventanas de muestreo se mueven a lo largo de un período entero de la respuesta de emisión en 256 pasos.


237

Debido a que la modulación se lleva a cabo en forma digital, la señal puede ser proce‐

sada en un número arbitrario de ventanas de muestreo sin pérdida de señal, por lo

que el PMT puede operar a la máxima ganancia durante toda la adquisición.

Se utiliza una heterodinación entre la frecuencia de muestreo y la frecuencia de

excitación para lograr una buena sensibilidad a tiempos de vida media corta y para

asegurar una distribución de muestreo de la emisión fluorescente uniformemente dis‐

tribuida, según se muestra en la Figura 7.10.

Para relacionar la ventana de muestreo a la que un fotón es detectado (warrival)

con una porción del período de excitación, es necesario conocer la fase relativa entre

el muestreo y la excitación. Esto se implementa mediante la introducción de un conta‐

dor de fase de correlación cruzada (pccc) que relaciona en forma consistente las fases

de muestreo, de excitación y de correlación cruzada.

De esta manera, a la salida del circuito se tiene para cada fotón detectado un

valor que identifica su ventana de arribo (warrival) y la fase relativa entre el muestreo y

la excitación, dado por el contador de correlación cruzada de fase (pccc). En la imple‐

mentación utilizada, estos dos valores se combinan para obtener un índice de fase de

correlación cruzada (p) según se muestra en la ecuación [7.23].

donde nw es el número total de ventanas de muestreo. Este índice p se utiliza

para construir un histograma de fases de correlación cruzada para cada fotón detecta‐

do, H(p), ver Figura 7.11. Dichos gráficos presentan una forma funcional dada por la

convolución del decaimiento de la emisión fluorescente con la función de respuesta

instrumental. Es posible construir una imagen de intensidad sumando los puntos (np)

del histograma de fases en cada pixel, según se muestra en la ecuación [7.24].

arrivalccc

w

256wp 255 p mod256

n

[7.23]

pn 1

p 0I H(p)

[7.24]


238

Figura 7.11. Histograma de cuentas recibidas para cada valor de fase en un período de correlación cruzada. En esta figura la fase fue dividida en 64 intervalos.

Los datos obtenidos pueden analizarse mediante el método de los fasores, des‐

cripto con anterioridad, para ello es necesario calcular los componentes de los fasores

normalizados por intensidad a la armónica h, ecuaciones [7.25] y [7.26].

A partir de estos parámetros es posible calcular los valores de fase y modula‐

ción mediante las ecuaciones [7.10] y [7.11]. Asimismo, se utiliza la determinación de

una referencia de tiempo de vida media conocido para llevar a cabo las correcciones

de fase y modulación relacionadas con la función de respuesta instrumental.

Los datos obtenidos se representan mediante un histograma fasores para cada

pixel de la imagen, según se muestra en la Figura 7.12 se muestran los diagramas de

fasores para fluoresceína y rodamina B adquiridos a 48MHz.12

p

p

n 1

H,hp 0 p

n 1

H,hp 0 p

1 2 pQ H(p)cos

I n

1 2 pP H(p)seno

I n

[7.25]

[7.26]

TÉCNICAS DE CARACTERIZACIÓN DE SUPERFICIES

239

7.2. TÉCNICAS DE CARACTERIZACIÓN DE SUPERFICIES

7.2.1. Microscopía de efecto túnel

Se han desarrollado muchos métodos para el estudio de superficies, dentro de

los cuales la microscopía de barrido de efecto túnel (Scanning Tunneling Microscopy,

STM) está entre las más importantes debido a que permite controlar la posición de una

punta delgada para “mapear” superficies con resolución atómica y así generar una

imagen de la superficie, con información topográfica (3D). El microscopio de efecto

túnel consiste básicamente en una plataforma y una sonda que efectúa un barrido de

la muestra (Figura 7.13).13

Figura 7.12. Histograma de fasores normalizados para soluciones de fluoresceína (a) y rodamina B (b), adquiridos a 48MHz.13

Figura 7.13. Esquema básico de un microscopio de efecto túnel (STM).


240

El funcionamiento de este tipo de microscopios está basado en el efecto túnel,

el cual tiene su origen en la mecánica cuántica. Desde el punto de vista de la física clá‐

sica la transferencia de electrones a través del espacio estaría prohibida. Sin embargo,

cuando se aplica una diferencia de potencial entre la punta y la muestra en un micros‐

copio como el de la Figura 7.13, se observa una corriente que decae en forma expo‐

nencial con la distancia entre ambos electrodos. Para un voltaje entre la punta y la

muestra pequeño en relación a la función trabajo del material (altura de la barrera

energética de tuneleo) se tiene una relación dada por la ecuación [7.27].

Donde IT representa la corriente túnel, d es la distancia punta‐muestra, VT es el

voltaje aplicado entre los dos electrodos, φ representa la barrera local y β es una cons‐

tante (1,025 Å‐1eV ‐1/2). Cabe destacar que la función trabajo se refiere a una propiedad

global de la superficie de un sólido que representa un promedio de varias caras crista‐

linas en superficies policristalinas, la composición química de un sólido compuesto por

varios elementos, la presencia de adsorbatos con cubrimiento no uniforme de la su‐

perficie, etc. Por otro lado, la barrera local determinada con el STM se refiere a una

propiedad local de la superficie.

La microscopía por efecto túnel está basada en dos tecnologías esenciales, la

formación de una punta metálica pequeña y el control fino de la posición por parte de

los piezoelementos (Figura 7.14.a y b). Las puntas se preparan a partir de tungsteno

por métodos electroquímicos o bien por corte mecánico de alamabres de pla‐

tino/iridio. Efectivamente sólo participa de la microscopía la parte de la punta formada

por los átomos cercanos a la superficie barrida (ver detalle en la Figura 7.14.c). Las po‐

siciones vertical y lateral de la punta están controladas por transductores piezoeléctri‐

cos, los cuales se deforman por aplicación de diferencias de potencial aplicadas por la

unidad de control del microscopio.

dT TI V e [7.27]


241

El microscopio de efecto túnel puede ser operado de diferentes modos,14 el

más comúnmente utilizado es el modo de corriente constante (Figura 7.15.a), en el

cual mientras la punta barre la superficie un sistema de retroalimentación modifica la

elongación del piezoeléctrico (mediante la aplicación de una señal eléctrica) de manera

de mantener una corriente túnel constante. La imagen topográfica, que es una repre‐

sentación tridimensional de una matriz de datos z(x,y), se obtiene a partir del voltaje

que debe ser aplicado al piezoeléctrico en cada punto de la superficie. Con este modo

se pueden barrer superficies de elevada rugosidad, es decir que no sean necesaria‐

mente planas a nivel atómico. Una desventaja de este modo reside en el tiempo de

respuesta del sistema de retroalimentación que limita la velocidad de barrido.

a. b. c.

Figura 7.14. Interacción entre la punta sostenida por el elemento piezoeléctrico a escala macroscópica (a) y atómica (b). Además se muestra el detalle de la punta desde la escala microscópica a la atómica

Figura 7.15. Modos de operación de microscopio STM, corriente constante (a) o altura constante (b)

a. b.


242

Para aumentar la velocidad de barrido se utiliza el modo de operación de altura

constante (Figura 7.15.b) donde la punta barre la superficie de la muestra rápidamente

a una altura constante, sin hacer uso del sistema de retroalimentación. Las variaciones

en la corriente túnel, que son registradas como función de la posición, permiten obte‐

ner una resolución al nivel atómico. Este modo sólo puede aplicarse a superficies que

sean atómicamente planas, ya que de otra manera la punta podría estrellarse en algu‐

na saliente del material mientras se realiza el barrido de alta velocidad.

El microscopio STM debe ser calibrado antes de realizar determinaciones.13 En

el caso de medidas en dimensiones en el plano, se emplea un patrón de grafito (Highly

Ordered Pyrolytic Graphite, HOPG), que consiste de láminas apiladas de átomos de

carbono en empaquetamiento compacto hexagonal, cuyas distancias de ordenamiento

se encuentran perfectamente caracterizadas (Figura 7.16.a). La calibración en la di‐

mensión normal a la superficie se lleva a cabo mediante el uso de escalones mono‐

atómicos de Au(1,1,1), (Figura 7.16.b).

Cabe destacar que en la técnica STM además de la información topológica se

agrega información espectroscópica: por ejemplo la densidad local de estados electró‐

nicos, los modos vibracionales de moléculas adsorbidas o los modos colectivos de exci‐

tación de una muestra. Esto se debe a que la información recogida en un STM es cierta

a. b.

Figura 7.16. Patrones utilizados para la calibración de un microscopio STM: a. HOPG y b. Au(1,1,1)


243

convolución de la topografía con las propiedades electrónicas de la muestra. La inter‐

pretación de las imágenes de un STM es un tema de estudio en sí mismo.

7.2.2. Espectroscopia fotoelectrónica de rayos X

La espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (X‐ray Photoelectron Spectros‐

copy, XPS) se basa en el fenómeno fotoeléctrico, el cual fue descubierto en 1987 por

Heinrich Rudolf Hertz. Si bien, las bases teóricas fueron desarrolladas por Albert Eins‐

tein en 1905, no fue hasta 1960 que se desarrolló su uso analítico, gracias a los traba‐

jos pioneros del grupo de Kai M. Siegbahn, quien obtuvo el Premio Nobel de Física en

1981 por sus contribuciones al desarrollo de la espectroscopía electrónica.

La capacidad de detectar estados químicos diferentes, junto con la sensibilidad

a la superficie, ha hecho que esta técnica espectroscópica sea de las más aplicadas

para el análisis general de superficies. Mediante esta metodología es posible detectar

todos los elementos (excepto hidrógeno y helio). En materiales sólidos la profundidad

de análisis varía desde las 2 a las 15‐20 capas atómicas superficiales. Además, median‐

te esta técnica es posible examinar áreas desde 30x30 ´m a 1x1 cm. Esta tipo de es‐

pectroscopías es aplicable a materiales orgánicos, biológicos y poliméricos así como

también a metales, semiconductores y cerámicos. Es esencialmente una técnica no

destructiva, aunque hay casos en los que el haz de rayos X puede dañar la muestra,

sobre todo si es orgánica. Debido a que esta técnica es usada frecuentemente para

análisis químico, se la solía llamar espectroscopía electrónica para análisis químico

(Electron Spectroscopy for Chemical Analysis, ESCA).

El principio básico de esta técnica reside en el efecto fotoeléctrico y de foto‐

emisión. Durante la determinación la muestra es irradiada con fotones de alta energía

(rayos X) los cuales pueden ser dispersados o bien causar una transición electrónica en

un átomo de la muestra, con la consecuente eyección de dicho electrón (Figura 7.17).

A partir de medidas del espectro de la radiación emergente es posible identificar los


244

átomos en sus distintos estados de oxidación, así como la intensidad puede ser em‐

pleada para cuantificación.

La energía cinética EK del electrón eyectado (fotoelectrón) depende de la ener‐

gía del fotón (h｀) a través de la ecuación de Einstein para el efecto fotoeléctrico, ecua‐

ción [7.28].15

donde EB es la energía de unión del electrón referida al nivel de Fermi y W es la

función trabajo del espectrómetro. Midiendo la energía cinética de los electrones con

un espectrómetro correctamente calibrado y empleando una fuente de radiación co‐

nocida, se obtienen los espectros de cuentas en función de la energía cinética, la cual

se puede transformar fácilmente a energía de unión mediante la aplicación de la ecua‐

ción [7.28]. Los picos en XPS se asignan de acuerdo a sus números cuánticos (nlj) donde

n es el número cuántico principal, l es el número cuántico magnético y j es el acopla‐

miento spin‐orbital.

En la Figura 7.18.a se muestra el espectro XPS de un sustrato modificado con

FAD (Flavina‐Adenina Dinucleótido) empleando como fuente de radición MgKα. Esta

fuente sólo es suficientemente energética para interactuar con los electrones de la

Figura 7.17. Esquema del proceso de fotoemisión en XPS.

[7.28] K BE h E W


245

capa 4s del Au en adelante. Se puede destacar, que los picos tienen intensidades va‐

riables y que, excepto los subniveles s, los otros subniveles aparecen como dobletes

(Figura 7.18.b). Los dobletes surgen del acoplamiento spin‐orbital (j‐j) y la diferencia de

energía entre los dos estados, ΔEj, refleja la naturaleza “paralela” o “antiparalela” de

los vectores de momento angular del spin y el orbital (en la Figura 7.18.b, Au 4f5/2 y

Au 4f7/2). La separación en energía ΔEj aumenta con el incremento de Z para un subni‐

vel dado (n, l constantes) o bien aumenta al disminuir l para n constante (en Figura

7.18.a, 4p > 4d > 4f).

Es importante notar que las intensidades de los picos de los diferentes niveles

energéticos no son iguales, debido a que la probabilidad de fotoeyección desde cada

orbital (llamada sección transversal de fotoionización, σ) es diferente. La probabilidad

también varía para un orbital dado en diferentes átomos y depende de la energía de

los rayos X utilizados. Para un átomo de P por ejemplo, utilizando rayos X de MgKα, la

sección transversal para el nivel 2s, σP2s, es mayor que σP2p, por lo que el pico de XPS

del P 2s es mayor que el P 2p.

Figura 7.18.a. Espectro de XPS de un sustrato de Au modificado con FAD utilizando Mg Kα. b. Espectro de XPS de alta resolución para Au 4f, donde se puede apreciar el doblete característico

a. b.


246

Entonces, el número de picos en el espectro corresponde al número de niveles

de energía ocupados en los átomos cuyas EB son menores que la energía de los rayos X,

h｀; la posición de los picos es una medida directa de las EB de los electrones en los or‐

bitales e identifica los átomos en cuestión. Además, las intensidades de los picos de‐

penden del número de átomos presentes y del valor de σ para el orbital considerado.

Este análisis resulta de la consideración de que los electrones se comportan como par‐

tículas independientes, es decir, los niveles de energía de uno de ellos no es afectado

por los otros. Esto es sólo una aproximación y pueden aparecer características adicio‐

nales en el espectro si se consideran las implicancias de los electrones pasivos (no fo‐

toeyectados).

En realidad, la energía de unión exacta para un electrón en un elemento de‐

pende del entorno químico en el que se encuentra dicho elemento. De hecho, el valor

de EB cambia de acuerdo al entorno, lo que se denomina corrimiento químico (por ana‐

logía a la técnica de resonancia magnética nuclear, RMN). En los niveles internos, la

energía del electrón está determinada por las interacciones coulómbicas con otros

electrones y por el potencial de atracción del núcleo. Cualquier cambio en el entorno

químico involucra una redistribución espacial en los electrones de valencia producien‐

do una variación en la carga del átomo y la creación de un potencial diferente, que

será percibido por los electrones internos, lo cual resulta en un cambio en sus EB. Este

hecho es quizá el más relevante en las aplicaciones de XPS como técnica analítica, ya

que de este modo, se pueden detectar distintos estados de oxidación, átomos vecinos

en una molécula, diferentes sitios de adsorción, etc.

Por último, para cuantificar los espectros de XPS, se debe tener en cuenta la in‐

tensidad y la posición de los picos. Entre otros valores, el ancho de banda a mitad del

máximo (full width at half máximum, FWHM) es un indicador útil para el número de

enlaces involucrados, daño por rayos X y carga diferencial en la superficie. Los criterios

a seguir para cuantificar una región incluyen definir un rango de energías en la cual la

señal pueda ser atribuida a la transición de interés y la correcta remoción de la señal


247

de fondo que no corresponde al pico. Cuando existe interferencia por distintas contri‐

buciones de picos en una misma señal, se debe hacer un ajuste adecuado mediante la

aplicación de un modelo, típicamente por medio de curvas Gaussianas/Lorentzianas

(deconvolución).

El arreglo experimental de los equipos de XPS consta de diferentes componen‐

tes, Figura 7.19, se utiliza una cámara de ultra alto vacío (UAV) donde la presión debe

alcanzar un rango de entre 1x10‐9‐1x10‐12 mbar.16 Hay dos razones principales para

este requerimiento: i. las moléculas de gas residual pueden dispersar fácilmente los

electrones de baja energía lo que resulta en una disminución de la relación se‐

ñal/ruido, ii. a una presión de 10‐6 mbar en sólo 1s se forma una monocapa de gas so‐

bre la superficie, dificultando la determinación.14 La cámara de análisis de UAV esen‐

cialmente está compuesta esencialmente de una aleación de níquel y hierro, el cual es

muy importante dado que actúa como un escudo frente a campos magnéticos (inclusi‐

ve el de la Tierra) y asegurar de esta manera un camino libre medio a los electrones

eyectados lo suficientemente largo como para que lleguen al detector. Las condiciones

de UAV se logran mediante una serie de bombas de vacío que trabajan como un con‐

junto de manera de mantener la presión deseada, una de las cuales es una bomba tur‐

Figura 7.19. Diagrama esquemático de un espectroscopio XPS.


248

bomolecular, que actúa como un extractor molecular da alta velocidad, y elimina los

gases que puedan presentarse en la cámara de UAV. Esta bomba es especialmente

importante durante la colocación y el retiro de las muestras en el sistema.

La fuente de rayos X también es un componente importante del sistema, dado

que la energía cinética de los electrones eyectados depende de la energía irradiación.

Típicamente se utiliza una fuente de ánodo doble, siendo las dos fuentes más comunes

las de AlKα y MgKα. El uso de ánodos dobles es muy útil para diferenciar las señales XPS

de los picos Auger (electrones secundarios).

La energía de los electrones eyectados se determina mediante el análisis de su

deflección en campos electrostáticos o magnéticos, denominado analizador de sector

hemiesférico. El sistema de detección de los electrones está basado en la ganancia

producida por multiplicadores de electrones, comúnmente un multiplicador de elec‐

trones de canal, llamado channeltron.

7.2.3. Espectroscopía infrarroja de reflexión‐absorción con modulación de la polari‐

zación

La espectroscopía infrarroja por absorción‐reflexión (Infrared Reflec‐

tion‐Absorption Spectroscopy, IRRAS) es una herramienta poderosa en el estudio de

materiales ya que brinda información estructural y muy valiosa. En particular, se puede

utilizar para caracterizar materiales depositados sobre superficies.17,18

Un haz de luz IR incidente sobre una superficie pulida a espejo puede separarse

en dos componentes respecto del plano de incidencia: p‐polarizada y s‐polarizada. El

campo eléctrico asociado a la componente p oscila en dirección paralela al plano de

incidencia, mientras que en la componente s, lo hace en la dirección perpendicular. La

Figura 7.20 muestra los vectores eléctricos, incidentes y reflejados, para cada compo‐

nente.


249

Figura 7.21. Dependencia angular del cambio de fase (~p y ~s), a, y de los factores de absorción (Ap y As), b, de las componentes p y s, respectivamente.

En la Figura 7.21.a se observa que el cambio de fase de la componente s no ex‐

hibe dependencia significativa con el ángulo de incidencia θ y es aproximadamente

180° para todos los ángulos de incidencia. Esto resulta en una amplitud neta nula de la

radiación s‐polarizada cerca de la superficie (0 a 10‐2 ゜), Figura 7.21.b. En contraste, el

desfasaje de la componente p depende fuertemente del ángulo de incidencia. La am‐

plitud de dicha componente pasa por un máximo cuando el ángulo θ es de 88°. En este

caso, los campos incidente y reflejado asociados a esta radiación (Ep y Ep´, respectiva‐

mente), se suman dando como resultante un campo de casi el doble de amplitud que

la radiación incidente.

Plano de incidencia

Figura 7.20. Ilustración esquemática de la descomposición de la radiación IR en sus componentes p‐ y s‐polarizadas. Ep y Es son los vectores eléctricos incidentes y E´p y E´s son los vectores reflejados de las componentes p y s, respectivamente.

a. b.


250

Cuando se quimisorbe una especie a una superficie conductora, existe cierta

transferencia de carga entre ambas. En el caso de sustratos metálicos, la distribución

de carga neta inducirá una distribución de carga imagen (Figura 7.22.a). Si la molécula

tiene un momento dipolar, se generará un dipolo imagen en la superficie, los cuales a

su vez pueden descomponerse vectorialmente en las direcciones perpendicular y para‐

lela al plano de la muestra (Figura 7.22.b). En este caso, también se observa que, mien‐

tras la magnitud de la componente del dipolo perpendicular a la superficie se duplica

por efecto de la carga imagen, la componente paralela desaparece. Como resultado de

las interacciones constructivas entre el campo del oscilador y las ondas incidentes

p‐polarizadas, debería esperarse un aumento de las intensidades de absorción cuando

la orientación de la propagación de la onda incidente es cercana a la del ángulo rasan‐

te.

Por lo tanto, las vibraciones activas que pueden ser detectadas con esta técnica

deben tener una componente del momento dipolar de transición perpendicular a la

superficie de la muestra. Esto significa que una dada vibración puede no ser observada

en un espectro IR de absorción‐reflexión, aunque la vibración sea activa en el infrarro‐

jo. Estos resultados dan lugar a la llamada “regla de selección superficial” que es am‐

pliamente utilizada en el estudio de orientación molecular en películas delgadas o mo‐

nocapas depositadas sobre metales.19

Debido a que la cantidad de luz absorbida en esta configuración es pequeña se

deben promediar las señales colectando muchos espectros para aumentar la relación

señal‐ruido a niveles aceptables. El espectro resultante para un sustrato modificado se

Figura 7.22. Esquema de distribución de las cargas real e imagen inducida para una molécula con una carga permanente monopolar (a) y una molécula con un momento dipolar dinámico que se puede descomponer vectorialmente.

a. b.


251

divide por un espectro blanco adecuado (tomado sobre un sustrato limpio, por ejem‐

plo) para obtener un espectro de pseudo‐absorbancia (ecuación [7.28]).

donde R y Ro son las intensidades de reflexión de la muestra y de la referencia,

respectivamente.

Cuando se analizan capas orgánicas gruesas (espesor > 400 Å) depositadas so‐

bre una superficie, la técnica IRRAS funciona muy bien, generando espectros con ban‐

das intensas. Sin embargo, cuando se tienen capas ultra‐delgadas, en el orden de una

monocapa molecular, esta técnica se acerca a su límite de detección y son necesarios

tiempos largos de adquisición para mejorar la relación señal/ruido. Durante el tiempo

de medida distintas inestabilidades instrumentales pueden afectar notablemente al

espectro final. Además, la absorción del entorno de la muestra (H2O y CO2 atmosféri‐

cos) también es detectada, y cambios muy pequeños en las condiciones ambientales

pueden dificultar mucho la interpretación de los espectros.

En la espectroscopía infrarroja por absorción‐reflexión con modulación de la

polarización (Polarization Modulation Infrared Reflection Absorption Spectroscopy,

PM‐IRRAS), la polarización del haz incidente se modula entre las dos direcciones ya

mencionadas: perpendicular (polarización s) y paralela (polarización p) respecto del

plano de incidencia. En la superficie de un metal, el campo eléctrico de la luz

s‐polarizada prácticamente desaparece, mientras que el de la luz p‐polarizada se re‐

fuerza. Por lo tanto la primera componente de la señal modulada es insensible a la

presencia de una película de moléculas sobre la superficie y se puede emplear para

obtener el espectro referencia, mientras que la otra componente se puede utilizar pa‐

ra obtener el espectro de la película. La modulación entre las polarizaciones s‐ y p‐ se

lleva a cabo a una alta frecuencia (50 kHz), y el espectro de absorción‐reflexión ΔR/<R>

se obtiene según se muestra en la ecuación [7.29].

0

RA(d) 1

R [7.28]


252

donde RS y RP representan las reflectividades de las componentes s‐ y p‐ del haz

infrarrojo modulado en la muestra. Cuando el rendimiento del arreglo experimental es

igual para ambos tipos de polarización, se eliminan aquellos modos vibracionales que

son detectados con ambas componentes. Éste es el caso de las señales correspondien‐

tes al H2O y CO2 ambientales.

En la Figura 7.23 se muestra un esquema del arreglo experimental empleado en

esta técnica. El cual consiste de un polarizador estático P y un modulador fotoelástico

(PEM). La radiación incidente puede representarse por dos componentes ortogonales,

I0V e I0H, que denotan las intensidades de las componentes vertical y horizontal de di‐

cha radiación respecto del plano del banco óptico. Cuando el haz atraviesa el polariza‐

dor P, la luz se polariza linealmente en la dirección paralela al banco óptico, indicada

por Il. El eje óptico del modulador está montado formando un ángulo de 45° con res‐

pecto al plano del banco óptico y por ende, el haz linealmente polarizado a su vez pue‐

de descomponerse en dos direcciones perpendiculares entre sí, Ilx e Ily, definidas según

el eje principal del PEM.20

Figura 7.23. Diagrama simplificado del arreglo experimental empleado en PM‐IRRAS y las orientacio‐nes de los vectores de campo eléctrico de la radiación electromagnética.

[7.29] s p

S P

R R

2

R RR

R


253

El PEM consiste de un transductor piezoeléctrico unido a un cristal de ZnSe. El

piezo convierte una onda de potencial en una onda mecánica (acústica) que comprime

o expande el cristal. Este movimiento cambia el índice de refracción en la dirección x e

impone un retardo (o una aceleración) en la componente Ilx del haz incidente lineal‐

mente polarizado. La componente Ily no es afectada y por lo tanto, se produce un des‐

fasaje entre ellas en su paso por el PEM. El retardo impuesto por el PEM depende del

potencial aplicado al mismo y de la longitud de onda del haz incidente. En general, este

potencial se elige tal que para una longitud de onda dada (λ0), la polarización de la ra‐

diación cambia y cada 90° de un período sea IP o IS la que incide en el detector. De esta

manera se pueden obtener las señales y calcular el espectro ΔR/<R>. El haz resulta

elíptica o circularmente polarizado para longitudes de onda diferentes de ゜0. En conse‐

cuencia, se puede optimizar un experimento para una sola longitud de onda (゜0) y ésta

se elige para que esté en el centro de la región espectral que se desea analizar.

La señal en el detector es la resultante de la modulación impuesta por el PEM

sobre la señal de la fuente modulada por el interferómetro de Michelson del espectró‐

grafo infrarrojo por transformada de Fourier (FT‐IR). La señal debe demodularse em‐

pleando un amplificador Lockin o un demodulador sincrónico para separar ambas con‐

tribuciones. En la Figura 7.24 se muestra un espectro PM‐IRRAS de una superficie de

a. b.

Figura 7.24. a. Espectro PM‐IRRAS de una superficie de oro modificada con ácido 16‐mercaptoundeca‐noico (línea azul) tomado con ゜0 = 2900 cm‐1. Se muestra la línea de base obtenida a partir de la res‐puesta del PEM (línea roja). b. Espectro resultante de la resta de la línea de base al espectro a.


254

oro modificada con ácido 16‐mercaptohexadecanoico antes (a) y después (b) de la co‐

rrección de la línea de base.

7.2.4. Voltametría cíclica

La voltametría cíclica (VC) es un tipo de medida electroquímica poten‐

cio‐dinámica en la que el potencial del electrodo de trabajo se barre linealmente entre

dos valores, E1 y E2, a una velocidad conocida y constante, 仝. Cuando el potencial llega

a E2, la dirección del barrido se invierte (en general, a la misma velocidad) hasta llegar

a E1 nuevamente. Este barrido puede repetirse varias veces durante un solo experi‐

mento. La corriente en el electrodo de trabajo se grafica en función del potencial apli‐

cado dando origen a un voltagrama cíclico.21 La Figura 7.25 muestra dos tipos de perfil

de potencial que se pueden emplear en voltametría cíclica.

La respuesta en corriente (onda voltamétrica) depende de la cinética del proce‐

so de electrodo. Si la especie electroactiva difunde hacia (o desde) el electrodo de tra‐

bajo desde (o hacia) el seno de la solución y la reacción de transferencia de electrones

es simple y reversible, se puede encontrar una expresión matemática de la relación

entre la corriente y el potencial, resolviendo la segunda Ley de Fick para las especies

oxidada, O, y reducida, R, ecuaciones [7.29] y [7.30].

Figura 7.25. Perfiles de potencial en el tiempo que se emplean en medidas voltamperométricas


255

donde CO y CR son las concentraciones respectivas de O y R, y DO y DR, sus coefi‐

cientes de difusión, x es la distancia a la superficie del electrodo y t es el tiempo. Supo‐

niendo que DO = DR = D, y las siguientes condiciones iniciales, pueden derivarse las re‐

laciones dadas por las ecuaciones [7.31] y [7.32].

donde E°´ es el potencial formal del par redox, R es la constante universal de los

gases, T es la temperatura, I es la densidad de corriente, F es la constante de Faraday

(9,65x104 Cmol‐1) y n es el número de electrones involucrados en la reacción. El símbo‐

lo * se utiliza para denotar condiciones iniciales.

A partir de todas estas consideraciones y con la matemática adecuada se llega a

una expresión para la corriente de pico (ip) que viene dada por la ecuación [7.33].

donde A es el área del electrodo. También se puede expresar el potencial de pi‐

co (EP) y el potencial de media onda (E1/2) según se muestra en las ecuaciones [7.34] y

[7.35].

[7.31]

[7.32]

t = 0, x > 0, CO = CO* y CR = 0 t > 0, x=∞, CO = CO* y CR = 0

OnF(E E )

O RT

R x 0

O

x 0

Ce

C

CI nFD

x

[7.29]

[7.30]

2O O

0 2

2R R

R 2

C CD

t x

C CD

t x

[7.33]P O

nFi 0,44463nFA C D

RT


256

La Figura 7.26 muestra un voltagrama cíclico típico para una reacción reversible

en la que inicialmente, sólo la especie reducida está presente en solución.

Por otro lado, cuando las especies electroactivas están adsorbidas sobre la su‐

perficie del electrodo, la forma del voltagrama se modifica, ya que ahora los reactivos y

productos no difunden hacia y desde el electrodo para transferir la carga.22

Si se considera que inicialmente, sólo la especie O está presente, la corriente

que circula por el sistema dependerá de la variación de su cubrimiento superficial. Esto

se puede expresar según las ecuaciones [7.36] y [7.37].

O

O R

O R

(t) (t) i

t t nFA

(t) (t)

12

12

P

O R

O

RTE E 1,109

nF

RT DE E ln

nF D

[7.34]

[7.35]

Figura 7.26. Voltagrama cíclico para un proceso reversible. EPA, EP

C e IPA, IP

C son los potenciales y las corrientes de pico anódico y catódico. E1/2 es el potencial de media onda y EP/2 es el potencial cuando la corriente es IP

A/2.

[7.36]

[7.37] t = 0, O* y R* = 0


257

donde O y R son los excesos superficiales de O y R, respectivamente, y O*

es el exceso superficial inicial de O. Además, si se suponen isotermas de adsorción de

Langmuir para ambas especies y que la reacción es nernstiana, es posible llegar a ex‐

presiones para la corriente en función del potencial aplicado, ecuación [7.38], el po‐

tencial y la corriente de pico, ecuaciones [7.39] y [7.40] respectivamente.

donde bO = βOO y bR = βRR con βi los parámetros de equilibrio de la isoterma

de adsorción para cada especia.

La Figura 7.27 muestra la voltametría cíclica para la oxidación y reducción de las

especies adsorbidas. En este caso la corriente es proporcional a la velocidad de barri‐

do, 仝, a diferencia del caso anterior en que es proporcional a 仝1/2.

Figura 7.27. Voltametría cíclica para un par redox reversible en el que inicialmente sólo la especie reducida está presente y se encuentra adsorbida sobre la superficie del electrodo, bajo las condicio‐nes de una isoterma de Langmuir.

OnFRTO

R

OnFRTO

R

E Eb20 b

2E Eb

b

O OP

R

2 2

P O

A enFi(E)

RT1 e

RT bE E ln

nF b

n Fi A

4RT

[7.38]

[7.39]

[7.40]


258

Es importante destacar que el área bajo los picos de oxidación y reducción re‐

presenta la carga necesaria para la oxidación y reducción completas de la película ad‐

sorbida sobre el electrodo (nFAO*) y son una medida directa de la cantidad de mate‐

rial depositado sobre la superficie. Para una reacción nernstiana ideal bajo las condi‐

ciones de una isoterma de Langmuir, los picos anódicos y catódico tienen la misma

Las determinaciones de voltametría cíclica se llevan a cabo mediante el uso de

una celda electroquímica conectada a un potenciostato, el cual aplica el potencial re‐

querido sobre la misma. La celda está compuesta por dos electrodos separados por, al

menos, una fase de electrolito. El electrodo donde ocurre la oxidación se denomina

ánodo y aquel en el que tiene lugar la reducción es el cátodo. La cantidad de carga que

circula en el cátodo debe ser igual a la que lo hace por el ánodo. Además, la electro‐

neutralidad se mantiene en todos los puntos del sistema debido a la circulación de

iones en la solución entre los electrodos y los cables externos que conectan a los últi‐

mos entre sí.

La reacción neta en la celda está dada por la suma de las hemi‐reacciones que

ocurren en cada electrodo. Cada una de ellas (y por ende, la composición química del

sistema cerca de los electrodos) responde a la diferencia de potencial interfacial en el

electrodo correspondiente. En general, sólo una de estas reacciones es de interés y el

electrodo asociado a la misma se denomina electrodo de trabajo (working electrode,

WE). Para observar sólo este proceso, se estandariza la otra mitad de la celda usando

un electrodo que tiene fases de composición esencialmente constante y, por lo tanto,

potencial constante: el electrodo de referencia (reference electrode, RE). De esta mane‐

ra, todos los cambios en la celda se pueden adjudicar al electrodo de trabajo.

En la mayoría de los experimentos electroquímicos se utiliza celdas electroquí‐

micas de tres electrodos,22,23 donde el potencial del electrodo de trabajo se mide em‐

pleando un electrodo de referencia, mientras que la corriente circula entre el primero

y un electrodo auxiliar (o contra‐electrodo, counter electrodo, CE), ver Figura 7.28.


259

El potenciostato es un dispositivo de retroalimentación negativa que aplica el

potencial requerido al electrodo de trabajo respecto de un electrodo de referencia.

Cuando la caída de potencial entre ambos se desvía de un valor pre‐seleccionado, apli‐

ca una diferencia de potencial entre el electrodo de trabajo y el electrodo auxiliar, au‐

mentando dicha caída hasta que el potencial del electrodo de trabajo respecto del de

referencia vuelve al valor deseado.

En la Figura 7.28 se muestra un esquema sencillo de un potenciostato. Consiste

en un circuito eléctrico que controla el potencial de la celda y varía en concordancia la

corriente suministrada. La medida de la corriente se realiza a través de los cambios en

la caída de voltaje sobre una resistencia (Rm en la Figura 7.28): una resistencia más

alta resultará en una disminución de la corriente y viceversa, de manera de mantener

el potencial constante. El amplificador CA es el responsable de mantener el voltaje

entre el RE y el WE lo más cerca posible del potencial de entrada de la fuente, Ei, ajusta

su salida para controlar automáticamente la corriente de la celda de manera de satis‐

facer esta condición de igualdad.22,23

Dependiendo de las características del sistema bajo análisis y del objetivo per‐

seguido, se puede requerir que el potencial de electrodo se mantenga constante o que

varíe en el tiempo en una forma predeterminada, mientras se mide la corriente resul‐

tante.

Figura 7.28. Esquema sencillo de un potenciostato acoplado a una celda electroquímica.


260

7.2.5. Espectroscopías de dispersión Raman

La espectroscopía Raman es una técnica espectroscópica basada en la disper‐

sión inelástica de luz monocromática, en general de una fuente láser de longitud de

onda en el visible o en el infrarrojo cercano. Durante este proceso se intercambia

energía entre un fotón y una molécula que es excitada a un nivel de energía virtual

producto de esta interacción. Si la molécula relaja al estado vibracional inicial, los fo‐

tones reemitidos tienen la misma energía que traían originalmente. Este proceso se

denomina dispersión Raylegh. Sin embargo, si la relajación es a un estado vibracional

de mayor o menor energía que la del estado de partida, entonces este proceso se co‐

noce como dispersión Raman y resulta en una diferencia de energía entre los fotones

incidentes y los reemitidos que es igual a la energía necesaria para excitar a las molé‐

culas vibracionalmente.24 Por lo tanto, este tipo de interacción con la luz permite ob‐

servar las vibraciones moleculares. Desde el comienzo, el trabajo teórico y experimen‐

tal se centró principalmente en los fundamentos de la dispersión inelástica y su aplica‐

ción en la compresión de la estructura molecular.

En la Figura 7.29 se muestran esquemáticamente las transiciones que originan

la dispersión Raman y la probabilidad que tiene cada una de ocurrir. Esta diferencia de

probabilidades influye en la intensidad de cada tipo de línea en un espectro Raman.

Figura 7.29. Esquema que ilustra las transiciones que originan los fenómenos de dispersión Raylegh y dispersión Stokes y anti‐Stokes. Los espesores de las flechas indican la probabilidad que tiene cada tipo de dispersión y que determinará la intensidad de cada señal en un espectro Raman.


261

En general, la diferencia de energía entre la luz incidente y la luz dispersada se

expresa en unidades de número de onda ( ). Un espectro Raman representa la in‐

tensidad de la luz reemitida en función de . Cuando la energía final es menor a la

original, es positiva y las señales que aparecen se denominan líneas Stokes. Cuan‐

do ocurre lo contrario ( < 0), las líneas del espectro se llaman anti‐Stokes y se deben

a la relajación de las moléculas a un nivel vibracional más bajo que el nivel inicial.

No todas las transiciones generan señal en un espectro Raman. Esto se debe a

las reglas de selección asociadas a este fenómeno, que establecen que sólo aquellas

transiciones que provocan un cambio en la polarizabilidad de la molécula serán obser‐

vadas. Los espectros Raman brindan información complementaria a la obtenida por

espectroscopía infrarroja.

La espectroscopía Raman se realiza convencionalmente empleando láseres

verdes, rojos o del infrarrojo cercano. Las longitudes de onda están por debajo de las

primeras transiciones electrónicas de la mayoría de las moléculas. Por otro lado, si se

ajusta la energía del láser incidente de manera que coincida con la de alguna transición

electrónica de la molécula bajo estudio, los modos vibracionales asociados pueden

aumentar la intensidad de sus señales Raman en un factor de 102‐104 permitiendo tra‐

bajar con concentraciones de analito muy bajas (hasta 10‐8 M). Ésta es la espectrosco‐

pía Raman resonante.25

Este aspecto de la espectroscopía Raman es muy útil para analizar macromolé‐

culas biológicas con cromóforos en su estructura.26,27 En este caso se puede elegir la

frecuencia de excitación de modo que coincida con la banda de absorción de dicho

cromóforo y, de esta manera, observar sólo las vibraciones localizadas dentro del

mismo. Esta selectividad es muy importante a la hora de analizar la relación teórica

entre las transiciones electrónicas y las vibraciones que se realzan por resonancia.28

La principal desventaja de emplear esta técnica en modo resonante consiste en

el riesgo de observar fluorescencia o fotodegradación de la muestra.


262

Dado que el fenómeno de dispersión Raman es altamente improbable (la pro‐

babilidad de que ocurra un evento de este tipo es 108 veces menor que para el fenó‐

meno de dispersión elástica) se han buscado métodos que permitan aumentar la efi‐

ciencia de dicho proceso. En 1974 Fleischmann y colaboradores29 observaron por pri‐

mera vez el fenómeno de la dispersión Raman aumentada por superficie (Surface‐

Enhanced Raman Spectroscopy, SERS) al intentar obtener el espectro Raman de piridi‐

na adsorbida sobre una superficie de plata cuya rugosidad fue aumentada por medios

electroquímicos. El efecto SERS consiste en la enorme intensificación de la emisión

Raman procedente de una molécula, cuando ésta se encuentra en contacto o cerca de

una superficie metálica nanoestructurada.30 La amplificación de la señal en SERS pro‐

viene de la interacción de la luz con los electrones de conducción situados en la super‐

ficie del metal. Esta interacción, originada en el rango óptico, genera una importante

amplificación del campo a través de la excitación resonante de plasmones superficiales

localizados, cuya desexcitación da lugar a una intensificación del campo electromagné‐

tico cercano a la superficie del metal.

Los metales que presentan las propiedades ópticas adecuadas para generar tal

intensificación, son principalmente la plata, el oro y el cobre, siendo los dos primeros

los que alcanzan una mayor intensificación y los más aplicados en experimentos SERS.

Las dimensiones de las nanopartículas metálicas implicadas en este fenómeno juegan

un papel importante. Éstas deben de ser de tamaño inferior a la longitud de onda de la

radiación incidente para impedir la excitación de los modos cuadrupolares en el metal.

En general, las nanoestructuras con un tamaño entre 1 y 100 nm suelen ser efectivas

en SERS.

BIBLIOGRAFIA

263

7.3. BIBLIOGRAFIA

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CONCLUSIONES GENERALES


265


El presente trabajo de tesis se ha focalizado en el desarrollo de nuevos nano‐

sensores fluorescentes para microscopías, derivados de moléculas pequeñas conjuga‐

das a nanopartículas fluorescentes y su aplicación en estrategias de marcación especí‐

fica y sensado en sistemas biológicos in vivo.

El trabajo involucró la síntesis de los sensores, su caracterización estructural, el

estudio de sus propiedades fotofísicas y su aplicación como sensores moleculares o

conjugados con Quantum Dots, a fin de validar su utilidad.

Se utilizó la familia de las tricarbocianinas como fluoróforo base para la cons‐

trucción de los nanosensores, debido a sus propiedades ópticas convenientes y la po‐

sibilidad de sintetizar precursores sintéticos extremadamente versátiles, a partir de los

cuales fue posible desarrollar diferentes sensores fluorescentes moleculares. Por ello,

en el Capítulo 1 se establecieron rutas para la síntesis de meso‐clorotricarbocianinas

simétricas con grupos funcionales que mejoren sus propiedades intrínsecas, particu‐

larmente el aumento de la solubilidad en agua o su posterior conjugación a otra espe‐

cie. Asimismo, se desarrolló la síntesis de tricarbocianinas asimétricas en la escala de

los cientos de miligramos que permitirían aprovechar ambas características.

En el capítulo 2 se describieron la síntesis y las propiedades fotofísicas de tres

nuevas aminotricarbocianinas diseñadas para su aplicación como sondas para marcado

específico o sensores fluorescentes moleculares. En primer lugar, se sintetizó una ami‐

notricarbocianina biotinilada y se estudiaron el cambio en sus propiedades fotofísicas

frente a la conjugación con estreptavidina, mostrando un apagamiento menor que

otros fluoróforos comerciales biotinilados. Asimismo, se llevó a cabo un ensayo de es‐

pecificidad de su interacción con estreptavidina observándose la ausencia de marca‐

ción inespecífica discernible mediante microscopía de fluorescencia.


266

Posteriormente, se sintetizaron dos aminotricarbocianinas para su aplicación

como sensores fluorescentes moleculares para pH o Zn2+. Se determinó el pKa de la

sonda fluorescente de pH, mediante el análisis de los cambios en la absorbancia y la

emisión de fluorescencia, así como también a través de los cambios en la longitud de

onda del máximo de absorción y emisión. Los valores de pKa obtenidos mostraron que

el sensor fluorescente resulta prometedor para su aplicación en sistemas biológicos.

También se llevó a cabo la determinación de la constante de afinidad del sensor fluo‐

rescente de Zn2+ mediante determinaciones de los cambios en la intensidad de fluo‐

rescencia y de absorbancia, obteniéndose un valor de 300±30 nM que resulta conve‐

niente para su posible aplicación en sistemas biológicos.

El Capítulo 3 estuvo orientado al desarrollo de nuevos nanosensores fluores‐

centes de pH y Zn2+ derivados de aminotricarbocianinas conjugadas sobre la superficie

de Quantum Dots mediante el uso de la interacción biotina‐estreptavidina. Para ello,

se llevó a cabo un estudio de la modulación de las propiedades ópticas de las nanopar‐

tículas funcionalizadas con estreptavidina mediante su conjugación con una aminotri‐

carbocianina biotinilada. Se analizaron los cambios en la intensidad y en los tiempos de

vida media de fluorescencia frente al agregado del fluoróforo, observándose que el par

aminotricarbocianina:QD655 resulta adecuado para la construcción de los nanosenso‐

res.

A la luz de este resultado, se sintetizaron derivados biotinilados de aminotri‐

carbocianinas asimétricas sensibles a pH o a Zn2+. Se determinó el valor de pKa para el

nanosensor de pH, el cual se encuentra en el rango de aplicación para la determinación

en sistemas biológicos in vivo. Se llevó a cabo el estudio de los cambios en los tiempos

de vida media de fluorescencia de los nanosensores sensibles a pH mediante el uso de

microscopía FLIM, observándose una excelente performance en el rango 7,0‐9,5.

Sin embargo, para el nanosensor de Zn2+ la necesidad de usar un co‐solvente

para evitar la formación de agregados no fluorescentes en agua, no permitió la cons‐

trucción de los nanosensores debido a la pérdida de la señal de los QD655‐SAv. No


267

obstante, la aminotricarbocianina biotinilada sensible a Zn2+ fue utilizada con éxito

como sensor molecular fluorescente.

Dada la fuerte tendencia que mostraron las aminotricarbocianinas a formar

agregados en fase acuosa, se procedió a estudiar su comportamiento cuando se las

confina sobre superficies. Para ello se sintetizó una aminotricarbocianina con una fun‐

cionalidad tiol, la cual resulta muy provechosa para su inmovilización sobre sustratos y

nanopartículas (12 nm) de oro. Se caracterizaron los ensamblados formados mediante

diferentes técnicas de caracterización de superficies. Los datos obtenidos a partir de

las espectroscopías XPS y Raman mostraron que las moléculas de la aminotricarbocia‐

nina se encuentran mayoritariamente unidas a la superficie de Au mediante enlaces

tiolato (S‐Au). Asimismo, las imágenes STM, espectros Raman y las estimaciones de

cobertura superficial (determinadas mediante VC) permitieron concluir que la mayoría

de las nanopartículas se encuentran sobre la superficie del sustrato como agregados J,

siempre que éstos estén presentes (aún en pequeña proporción) en la solución de in‐

cubación. Sin embargo, si la misma está formada únicamente por aminotricarbocianina

en su forma monomérica el autoensamblado formado no puede reorganizarse para

formar agregados J sobre el sustrato.

Adicionalmente, la estrategia de inmovilización de aminotricarbocianinas utili‐

zada permite extenderse a tioles de diferente longitud, con el objeto de estudiar cómo

se afectan las propiedades del ensamblado con la distancia a la superficie. Asimismo,

también es posible aprovechar los sitios de funcionalización en la aminotricarbocianina

para la inmovilización de diferentes especies con el objeto de construir sensores fluo‐

rescentes, agentes de reconocimiento específico, etc.

Finalmente, en el Capítulo 5 se presentó el desarrollo de un nuevo nanosensor

de pH derivado de Quantum Dots conjugados con estreptavidina. Dada las dificultades

observadas para la construcción de los nanosensores cuando se utiliza una aminotri‐

carbocianina biotinilada como aceptor de FRET, se decidió utilizar fluoróforos de otra

naturaleza. Para tal fin, se sintetizó un derivado biotinilado de la 5(6)‐carboxi‐


268

naftofluoresceína, el cual fue caracterizado frente a cambios en el pH del medio. Se

estudió la modulación de las propiedades ópticas de nanopartículas fluorescentes

frente al agregado del fluoróforo biotinilado en condiciones de pH donde la eficiencia

del proceso FRET es máxima. Se llevó a cabo una titulación en forma continua monito‐

reada por los cambios en la intensidad de fluorescencia de la nanopartícula frente al

agregado del fluoróforo. Con los datos obtenidos, se desarrolló un modelo fotofísico

que permitió estimar parámetros del par FRET (número de sitios activos de la

nanoapartícula, eficiencia del proceso de transferencia de energía, etc).

Asimismo, se llevó a cabo la caracterización frente a cambios en el pH mediante

determinaciones de la intensidad de fluorescencia en estado estacionario y resuelta en

el tiempo. En este último caso, se observó un comportamiento atípico obteniéndose

una relación lineal entre el tiempo de vida media del nanosensor a diferentes valores

de pH extendida con respecto a otros sensores derivados de nanopartículas fluorecen‐

tes y fluoróforos sensibles a pH que interactúan mediante diferentes procesos (FRET;

transferencia electrónica, etc). Esta propiedad resulta muy ventajosa en lo que respec‐

ta a potenciales aplicaciones para el nanosensor. Se desarrolló un modelo fotofísico de

funcionamiento de los nanosensores que permitió explicar el comportamiento obser‐

vado mediante la postulación de un proceso “retro‐FRET” desde el fluoróforo conjuga‐

do en la superficie hacia la nanopartícula central.

Finalmente, aprovechando la posibilidad de funcionalización con diferentes

conjugados, se presentó su aplicación en un sistema biológico. Para tal fin, se llevó a

cabo un estudio de marcación específica de células in vivo, pudiendo diferenciar con

resolución espacial y temporal dos etapas de la vía endocítica.

Parte del trabajo descripto en esta Tesis ha dado lugar a las siguientes publica‐

ciones:

“NIR Fluorescent biotinylated Cyanine dye: optical properties and combination with

Quantum Dots as potential sensing device”, G. O. Menéndez, M. E. Pichel, C. Spag‐


269

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