1

Estandarización de los protocolos para determinar las características cariotípicas y daño

al ADN en células de cáncer de tiroides mediante cariotipaje y ensayo cometa.

Morillo Balcázar, Andrea Estefanía

Departamento de Ciencias de la Vida y de la Agricultura

Carrera de Ingeniería en Biotecnología

Trabajo de titulación, previo a la obtención del título de Ingeniera en

Biotecnología

Torres Arias, Marbel, Ph.D

14 de Octubre de 2020

2

3

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA

CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

CERTIFICACIÓN

Certifico que el trabajo de titulación, “Estandarización de los protocolos para determinar las

características cariotípicas y daño al ADN en células de cáncer de tiroides mediante cariotipaje y

ensayo cometa ”, fue realizado por el señorita Morillo Balcázar Andrea Estefanía el cual ha sido

revisado y analizado en su totalidad por la herramienta de verificación de similitud de contenido;

por lo tanto cumple con los requisitos legales, teóricos, científicos, técnicos y metodológicos

establecidos por la Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE, razón por la cual me permito acreditar

y autorizar para que lo sustente públicamente.

Sangolquí, 14 de Octubre de 2020.

_______________________________

Torres Arias Marbel, PhD.

C. C: 1802949154

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Dedicatoria

A mis padres, Jorge Morillo y Celia Balcázar

A mis hermanos, Carolina y Jorge Luis

A mi sobrino y cuñado, Gianluca y Andrés

A mi tío, Mario Moncayo

Andrea Estefanía Morillo Balcazar

7

Agradecimientos

A mis padres Jorge y Conchita, por todo su apoyo y compresión, por todo su amor

incondicional, esfuerzo y dedicación a lo largo de este camino. Por enseñarme todos los valores y

principios que me hicieron la persona que soy hoy en día.

A mis hermanos, Carolina y Jorge, por creer en mí y estar presente en todo momento, por

los momentos buenos y malos, pero sobre todo por las alegrías. Por ser un ejemplo para mí en

todos los aspectos.

A mi tía Marta, por ser mi apoyo incondicional en todo momento, por creer en mi y

acompañarme, para estar siempre para todo.

A mis primos, Marcelo, Alex, Wendy, Diana y Mario por guiarme en mis estudios, por

apoyarme en cada decisión y ser una fuente de inspiración.

A Marbel Torres Ph.D por guiarme, por su confianza, ayuda y tiempo, por compartir su

conocimiento y darme su apoyo para realizar mi proyecto de titulación. Por creer en mi y en mi

proyecto.

A Cesar Paz y Miño por permitirme formar parte del Centro de Investigación Genética y

Genómica.

A Santiago Guerrero y Patricia Guevara, por guiarme dentro del laboratorio y compartir su

conocimiento conmigo.

A la familia CIGG: Sebas, David, Andre, Lu, Daniel, Cami, Paty y Lore, por su ayuda,

colaboración y experiencias compartidas.

A mis amigas, Belén y Kathya, por ser un apoyo incondicional en todo momento, ser su

amiga sin duda alguna fue una de las cosas más bonitas de la universidad.

8

A mis amigas, Diana, Ariel y Andrea por estar presentes siempre, por su apoyo y

constancia, para siempre y por siempre.

A mis amigos Andrea, Elio, Berenice, Luis David, Yasmin, Angy, Esteban, Abi, Sebas,

Alejandro y Carla por estar siempre presente, por ayudarnos siempre, por todos los momentos

buenos y malos, por sus consejos, por todos los viajes, son los mejores amigos que la universidad

me puedo dar.

9

Índice de contenidos

CERTIFICACIÓN ....................................................................................................................... 3

Dedicatoria ............................................................................................................................. 6

Agradecimientos .................................................................................................................... 7

Índice de contenidos .............................................................................................................. 9

Índice de tablas .................................................................................................................... 12

Índice de figuras ................................................................................................................... 13

Lista de Abreviaturas ............................................................................................................ 16

Resumen ............................................................................................................................... 18

Abstract ................................................................................................................................ 19

Capítulo I: Introducción ........................................................................................................ 20

Antecedentes ................................................................................................................... 20

Justificación del problema ............................................................................................... 22

Objetivos del proyecto ..................................................................................................... 25

Objetivo general ........................................................................................................... 25

Objetivos específicos .................................................................................................... 25

Capítulo II: Revisión Bibliográfica ......................................................................................... 26

Tiroides ............................................................................................................................. 26

Tirocitos ........................................................................................................................ 27

Función de la glándula tiroides ........................................................................................ 28

Enfermedades de la glándula tiroides .............................................................................. 29

10

Disruptores endocrinos ................................................................................................ 30

Cáncer .............................................................................................................................. 31

Clasificación del cáncer .................................................................................................... 31

Cáncer de tiroides ............................................................................................................ 32

Diagnóstico ecográfico del nódulo tiroideo ..................................................................... 34

Biopsia por aspiración con aguja fina (BAAF) ................................................................... 35

Ensayo Cometa ................................................................................................................. 38

Citogenética ..................................................................................................................... 39

Fitohemaglutinina ............................................................................................................ 42

Tipos de bandeo cromosómico ........................................................................................ 42

Cariotipo ........................................................................................................................... 44

Etiología del cáncer de tiroides ........................................................................................ 49

Genética del cáncer de tiroides........................................................................................ 50

Capitulo III: Materiales y Métodos ....................................................................................... 52

Localización Geográfica .................................................................................................... 52

Preparación de medio de cultivo ..................................................................................... 52

Cultivo de muestra ........................................................................................................... 52

Cosecha de cultivo de sangre periférica .......................................................................... 53

Cosecha de cultivo........................................................................................................ 53

Choque Hipotónico ...................................................................................................... 53

11

Fijador de Carnoy ......................................................................................................... 54

Bandeo GTG de cromosomas ....................................................................................... 56

Ensayo cometa ................................................................................................................. 58

Preparación de placas .................................................................................................. 58

Preparación de la muestra ........................................................................................... 58

Búsqueda bibliográfica de variantes genéticas en cáncer de tiroides. ............................ 62

Capítulo III: Resultados ......................................................................................................... 63

Cariotipo ........................................................................................................................... 63

Ensayo cometa ................................................................................................................. 71

Revisíon bibliografica sobre variantes geneticas del cancer de tiroides. ........................ 76

Capítulo V: Discusión ............................................................................................................ 79

Capítulo VI: Conclusiones ..................................................................................................... 89

Capítulo VII: Recomendaciones ........................................................................................... 90

Referencias ........................................................................................................................... 91

Anexos ................................................................................................................................ 104

12

Índice de tablas

Tabla 1. Preparación de Choque Hipótonoco (KCl 0.54%) ................................................... 54

Tabla 2. Preparación de Fijador de Carnoy (3:1) ................................................................. 55

Tabla 3. Soluciones usadas para Bandeo GTG de cromosomas. ......................................... 56

Tabla 4. Preparación de muestras con H2O2 al 10%. ........................................................... 59

Tabla 5. Preparación de muestras con H2O2 y LMP. ............................................................ 59

Tabla 6. Variaciones en el tiempo de Colcemid ................................................................... 63

Tabla 7. Tiempos en solución tripsina (1:250) y en tinción Giemsa ..................................... 65

Tabla 8. Tinción y bandeo de muestras de sangre periférica. ............................................. 67

Tabla 9. Condiciones del ensayo cometa con variación en capas de NMP. ........................ 72

Tabla 10. Condiciones 2, ensayo cometa variación de capas de agarosa NMP y LMP ....... 73

Tabla 11. Condiciones del ensayo cometa con 1 capa de agarosa NMP. ........................... 74

Tabla 12. Revisión bibliográfica de variantes genéticas en el cáncer de tiroides. .............. 77

13

Índice de figuras

Figura 1. Prevalencia del cáncer en las provincias del Ecuador (2001-2016) ..................... 21

Figura 2. Estructura de la glándula tiroides, vista frontal y lateral ................................. 26

Figura 3. Tiroides normal, corte transversal y longitudinal. ............................................... 27

Figura 4. Célula Tiroidea ..................................................................................................... 28

Figura 5. Tipos de cáncer de tiroides y su origen ................................................................ 33

Figura 6. A) Ecografía de tiroides extendida B) Tiroides normal, lóbulos tiroides (*),

músculos infrahioideos (→), C carótida, T tráquea, Y yugular.............................. 34

Figura 7. Biopsia por aspiración de aguja fina de un nódulo de tiroides ........................... 36

Figura 8. Algoritmo de diagnóstico de un nódulo tiroideo ................................................. 37

Figura 9. Células con daño en el ADN, detectado a través del ensayo cometa .................. 38

Figura 10. Fotografía original de Tijio y Levan donde establecen que el hombre tenía 46

cromosomas. ......................................................................................................... 39

Figura 11. Los padres de la citogenética: Theophilus S. Paiter y su cariotipo donde se

muestra el cromosoma Y. Levan y Tijo, determinaron el número de cromosomas

humanos, Lejeune determino la primera aberración cromosómica en el síndrome

de Down. ............................................................................................................... 40

Figura 12. Cromosomas 7, 21 y 22 con tinción de bandas R, Q y G.................................... 43

Figura 13. Clasificación morfológica de los cromosomas según la posición del centrómero

según Levan et al. 1964. ....................................................................................... 44

Figura 14. Cariotipo normal clasificado en los 7 grupos y el par de cromosomas sexuales

(Femenino) ............................................................................................................ 46

Figura 15. Metafase tratada con 5’ azacitidina, las flechas indican sitios con fragilidad

cromosómica. ........................................................................................................ 47

14

Figura 16. Cariotipo femenino normal, paciente de 60 años. ............................................ 48

Figura 17. Marcadores moleculares del cáncer de tiroides ................................................ 50

Figura 18. Variantes genéticas del cáncer de tiroides y sus porcentajes ........................... 51

Figura 19. Esquema ensayo cometa ................................................................................... 61

Figura 20. A) Se observa una metafase con buena dispersión, cromosomas con una buena

morfología, largos y definidos (tiempo de colcemid, 40 min); B) Metafase con

cromosomas largos y no definidos (tiempo de colcemid, 25 min); C) Metafase con

cromosomas superpuestos (tiempo de colcemid, 25 min). ................................... 64

Figura 21. A) Metafase con cromosomas cortos y presencia de ruido (tiempo de colcemid,

1 h); B) Metafase con cromosomas gruesos, superpuestos y no definidos (tiempo

de colcemid, 1 h). .................................................................................................. 64

Figura 22. A) Cromosomas con bandas no definidas y gruesas; B) Metafase con

superpuestos con bandas con bajo contraste; C) Metafase con cromosomas

quemados. ............................................................................................................ 66

Figura 23. Metafases con 43 s en solución tripsina, A) 2.40 min en tinción Giemsa, B) 2.30

min en tinción Giemsa y C) 2 min en tinción Giemsa. ........................................... 66

Figura 24. A) Metafase con 45.5 s en tripsina y 2.50 min en tinción Giemsa; B) Metafase

con 42 s en tripsina y 3 min en tinción Giemsa; C) Metafase en 44.5 s en tripsina y

3 min en tinción Giemsa; D) Metafase con más de 46 cromosomas; E) Metafase

superpuesta con más de 46 cromosomas y cromosomas superpuestos. ............. 68

Figura 25. A) Se observa un cariotipo normal femenino con 46 cromosomas (46 XX) con un

tiempo en solución tripsina 43 s y tinción Giemsa 2.45 min; B) Cariotipo femenino

con 46 cromosomas (46XX), con un tiempo en solución tripsina 44.7 s y tinción

Giemsa 2.40 min. .................................................................................................. 69

15

Figura 26. A) Cariotipo femenino, con anomalía numérica presenta 44 XX, -19, -20 con un

tiempo en solución tripsina 43 s y tinción Giemsa 3 min, B) Cariotipo masculino,

con anomalías numéricas presenta 45 XY, -18.con un tiempo en solución tripsina

44.5 s y tinción Giemsa 3 min. .............................................................................. 70

Figura 27. Cariotipo masculino con anomalías numéricas, presenta 36 cromosomas

(XXYYY), -1, -2, -3, -6, -7, -8, -14, -16, -17, -18, -19, -20, -21. El tiempo en solución

de tripsina fue de 44 s y en tinción Giemsa fue de 2.40 s. .................................... 71

Figura 28. Células con presencia de halo, variación del tampón de lisis ............................ 74

Figura 29. Células con presencia de halo, variación de condiciones de electroforesis. A)

Condiciones de electroforesis 25V, 300 mA y 20 min; B) Condiciones de

electroforesis 25V, 300 mA y 30 min. ................................................................... 75

Figura 30. Células con presencia de halo y cola. ................................................................ 76

16

Lista de Abreviaturas

ADN Ácido desoxiribonucleico

BAAF Biopsia por aspiración con aguja fina

cm Centímetros

°C Celsius

DMSO Dimetil sulfóxido

g Gramos

h Horas

HPLC Cromatografía líquida de alta eficiencia

INEC Instituto Ecuatoriano de Estadísticas y Censos

LMP Agarosa de punto bajo de fusión

mA Miliamperios

mL Mililitro

mm Milímetros

mM Milimolar

min Minutos

NMP Agarosa de punto medio de fusión

NCI Centro Nacional para la Información Biotecnológica

OMS Organización Mundial de la Salud

17

PBS Buffer fosfato salino

pH Potencial de hidrógeno

PTC Cáncer de tiroides papilar

RMPI Roswell Park Memorial Institute

rpm Revoluciones por minutos

s Segundos

µL Microlitros

T3 Triyodothyronine

TBE Buffer Tris-Borato-EDTA

18

Resumen

El cáncer de tiroides es la enfermedad más común del sistema endocrino. Según las estimaciones

actuales, el cáncer de tiroides es el octavo cáncer diagnosticado con más frecuencia entre las

mujeres en todo el mundo. La investigación sobre el tratamiento del cáncer es esencial para

mejorar la vida de los pacientes afectados por esta enfermedad. El cáncer de tiroides se puede

detectar mediante examen físico, química sanguínea, BAAF, ecografía de tiroides y exámenes

genéticos. Actualmente hay pocos estudios sobre el cariotipo del cáncer de tiroides en el país, la

estandarización del protocolo permitido determinar que el tiempo de incubación cortos producen

cromosomas largos y no definidos y tiempos de incubación largos producen cromosomas cortos y

grueso, el tiempo de exposición a tripsina es un punto clave en el bando GTG, ya que de eso

depende la calidad de bandas obtenidas. El ensayo cometa permite determinar el daño en el ADN,

es un ensayo rápido, sensible y de bajo costo. Se estableció un protocolo para determinar la

genotoxicidad en el ADN mediante el ensayo comete, se determinaron variantes que permiten un

ensayo confiable y reproducible. Se estudiaron bibliográficamente variantes genéticas del cáncer

de tiroides, estas variantes permiten establecer nuevas dianas terapéuticas, sin embargo, el cáncer

de tiroides permanece prácticamente inexplorado en cuanto a la posible influencia de variantes

genéticas en su incidencia.

Palabras clave:

ENSAYO COMETA

CARIOTIPO

VARIANTES GENÉTICAS

19

Abstract

Thyroid cancer is the most common disease of the endocrine system. According to current

estimates, thyroid cancer is the eighth most frequently diagnosed cancer among women

worldwide. Research on cancer treatment is essential to improve the lives of patients affected by

this disease. Thyroid cancer can be detected by physical exam, blood chemistry, BAAF, thyroid

ultrasound, and genetic tests. Currently there are few studies on the karyotype of thyroid cancer

in the country, the standardization of the protocol allowed to determine that the short incubation

time produces long and undefined chromosomes and long incubation times produce short and

thick chromosomes, the time of exposure to trypsin It is a key point in the GTG side, since the

quality of the bands obtained depends on that. The comet assay allows the determination of DNA

damage, it is a rapid, sensitive and inexpensive assay. A protocol was established to determine

genotoxicity in DNA through the commit assay, variants were determined that allow a reliable and

reproducible assay. Genetic variants of thyroid cancer were studied in the literature. These

variants allow establishing new therapeutic targets, however, thyroid cancer remains practically

unexplored in terms of the possible influence of genetic variants on its incidence.

Key words:

THYROID CANCER

ASSAY COMET

KARYOTYPE

GENETIC VARIANTS

20

Capítulo I: Introducción

Antecedentes

En Ecuador la tasa de incidencia de Cáncer es de 165 casos por 100 000 habitantes según

datos proporcionados por The Global Cancer Observatory perteneciente a la Organización Mundial

de la Salud (OMS). Esta enfermedad continúa progresando alarmantemente en el mundo con 1,8

millones de nuevos casos y alrededor de 9,5 millones de decesos estimados en el 2018, según

datos publicados por GloboCan. De acuerdo con datos del Instituto Ecuatoriano de Estadísticas y

Censos (INEC), el carcinoma de tiroides tiene una incidencia de 19% en el país, 40,9% son mujeres.

En Quito este es el cáncer que más afecta a la población femenina, con una frecuencia del 16.4%,

en mujeres de edades entre 50 y 60 años (Cueva, Yépez, & Tapuri, 2559).

Los países de Latinoamérica se enfrentan a un gran reto en promover la detección

temprana y oportuna para reducir la proporción de casos detectados en fases tardías cuando la

probabilidad de supervivencia es más baja y su tratamiento es más caro e invasivos (Knaul et al.,

2009).

Según las estimaciones actuales, el cáncer de tiroides es el octavo cáncer diagnosticado

con más frecuencia entre las mujeres en todo el mundo (J. Rodríguez, Boffill, & Rodríguez, 2016).

En las últimas décadas, la incidencia de este cáncer ha aumentado constantemente en algunos

países de Europa, América y Asia. (Sierra, Soerjomataram, & Forman, 2016) En Ecuador, se

reportaron 23,632 hospitalizaciones en 16 años (2001-2016), resultando en 1,539 muertes por

cáncer de tiroides. Salazar et al., (2019), menciona que Ecuador tiene una de las tasas más altas de

cáncer de tiroides en América Latina como se observa en la siguiente figura 1.

21

Figura 1. Prevalencia del cáncer en las provincias del Ecuador (2001-2016)

Nota: tomado de Salazar, (2019)

El carcinoma papilar de tiroides (PTC) es el tipo más común de cáncer de tiroides, seguido

del carcinoma folicular, el carcinoma medular, el carcinoma poco diferenciado y el carcinoma

anaplásico (Cha & Koo, 2016). La mayoría de los cánceres requieren tiroidectomía. El tratamiento

después una tiroidectomía depende de la etapa en la cual este el cáncer. El tratamiento con yodo

radioactivo (RAI) se puede usar en cáncer que se manifiestan sus síntomas tempranos y

avanzados: Triyodothyronine (T3) o tetrametiltiroxina (tiroxine T4). Si el cáncer reaparece, usa

radioterapia de haz externo, terapia dirigida o quimioterapia (Malheiros, Canberk, Poller, &

Schmitt, 2018).

22

La investigación sobre el tratamiento del cáncer es esencial para mejorar la eficacia de los

pacientes afectados por esta enfermedad. El cáncer de tiroides y su tratamiento pueden producir

síntomas y efectos secundarios, así como también efectos emocionales, sociales y económicos.

(Chala, Pava, Franco, Álvarez, & Franco, 2013). A nivel molecular, el análisis citogenético de los

tumores malignos es importante para el diagnóstico y el pronóstico de esta enfermedad. El análisis

de cariotipo permite el establecimiento de anomalías digitales y estructurales en la asignación

final digital de cada paciente (Hwang et al., 2013).

Actualmente hay pocos estudios sobre el cariotipo del cáncer de tiroides en el país. Esto

ayudará a determinar si los pacientes ecuatorianos con este tumor tienen anormalidades.

Además, en comparación con otras tecnologías (como HPLC), la prueba del cometa puede detectar

de manera eficiente y precisa el daño genético y reparar en moléculas de ADN altamente densas

(Chiganer, Ghersevich, Sánchez, & Novelli, 2011), la elución alcalina y sedimentación de nucleoides

también son ensayos que se usan pero no son eficaces (Montes, Montero, Moreno-Rosi, &

Gonzáles, 2011). El ensayo cometa es una herramienta básica para el daño y la reparación del

ADN, puede detectar varios daños en el ADN de pacientes con cáncer con alta sensibilidad. (Zúñiga

Venegas, 2009).

Justificación del problema

El cáncer es la principal causa de muerte en el mundo y la segunda causa de muerte en el

país. Según datos de la OMS en 2015, el incidente causó 8,8 millones de muertes (Álvarez

Montané, 2014). El aumento de la enfermedad se atribuye al crecimiento de la población, el

envejecimiento de la población y la evolución de los factores de riesgo, tales como: obesidad,

tabaquismo, falta de actividad física y dieta insuficiente.

23

La incidencia del cáncer de tiroides esta aumentado drásticamente en los últimos años.

Roman et al., (2017), en su investigación menciona que esto se debe a que muchos de los

pacientes que sufren esta enfermedad no se realizan biopsias agresivas o cirugías extensivas y se

evita a toda costa un tratamiento agresivo. Así, Ecuador tiene una de las tasas más altas de cáncer

de tiroides en América Latina, Salazar-Vega et al, (2019), en su investigación menciona que

Ecuador ocupa el primer lugar entre mujeres de América Latina con esta enfermedad.

Aunque la tasa de mortalidad es baja, esta es una neoplasia frecuente y se necesita

realizar un análisis más detallado de sus variantes patológicas, estado cromosómico, daño al ADN

y efectividad de tratamiento para mejorar la calidad de vida de las personas que padecen esta

enfermedad respecto al diagnóstico y tratamiento (Hercbergs, 2019).

En pacientes con neoplasias en la tiroides se presentan además de los cambios físicos y

estéticos, cambios hormonales y psicológicos que derivan de la deficiencia hormonal que causa la

extracción de este órgano, y se recurre a diversos tratamientos para suplir las funciones de la

glándula tiroidea; lo que causa un problema a nivel económico, social y psicológico afectando a su

calidad de vida (Novoa Gómez, Vargas Gutiérrez, Obispo Castellanos, Pertuz Vergara, & Rivera

Pradilla, 2010).

Investigaciones realizadas en el país, (Guerrero et al., 2018), mencionan que la población

ecuatoriana posee una gran diversidad genética, con una contribución tri-hibrida: nativos

americanos (51%), europeos (33%) y africanos (13%). En los últimos años se han demostrado que

la raza o etnia tiene un impacto en la incidencia del cáncer, la respuesta a medicamentos, el perfil

genético y la supervivencia. Así, es posible que la población ecuatoriana presente un daño

cromosómico diferente al de otras poblaciones.

24

Las anomalías cromosómicas son abundantes en varios tipos de cáncer y predecir

resultados clínicos basados en datos cromosómicos es mucho mejor en base a datos de

secuenciación de ADN (Jiang et al., 2017). Estos ensayos son necesarios sus resultados nos

permitirán entender el estado en el que se encuentra el cáncer de tiroides en el país, respecto al

cariotipo y el daño en el ADN, ya que es necesario administrar un tratamiento con pautas actuales.

Un diagnóstico temprano seguido de un tratamiento oportuno permite una recuperación

de más del 50% de casos de cáncer en general; un claro ejemplo es el cáncer papilar de tiroides

detectado en estadios temprano tiene un porcentaje de recuperación del 100% y el cáncer de

mama un porcentaje mayor del 95% (Zaharia, 2013). La investigación del tratamiento de cáncer es

fundamental para mejorar los efectos en pacientes afectados por la enfermedad, el cáncer de

tiroides y su tratamiento producen síntomas y efectos secundarios físicos, así como efectos

emocionales, sociales y económicos (Chala et al., 2013).

El cáncer sigue siendo en la actualidad un problema de salud pública a nivel mundial, es

una enfermedad con una de las tasas más altas de mortalidad, a pesar de que existen varias

investigaciones y estudios en curso no se ha logrado disminuir las consecuencias y complicaciones

que este enfermedad genera (Cajamarca-Barón, 2014).

El cáncer tiroideo es la primera causa de neoplasias en el sistema endocrino,

recientemente existen avances en su diagnóstico, causas y la biología molecular de esta

enfermedad; un mejor diagnóstico implica un tratamiento eficaz, local y sistemático (Díez et al.,

2016). La mayoría de cánceres se diagnostican por que el paciente acude a consulta por molestias

o síntomas, la detección de nódulos en muchas ocasiones se da por un examen médico de rutina y

es confirmado con análisis de sangre, ecografía de la tiroides, biopsia por punción de aguja fina y

pruebas genéticas (Ramírez, Guzmán, & Vidal, 2009).

25

En el cáncer de tiroides se identifica la mutación de un proto oncogén, RET¸ lo cual

permitirá realizar estudios genéticos para identificar personas susceptibles de padecer un

carcinoma medular o un carcinoma diferenciado de la glándula tiroides en etapas iniciales

permitiendo un tratamiento efectivo (Navarro, 2012).

Objetivos del proyecto

Objetivo general

Estandarización de los protocolos para determinar las características cariotípicas y daño al

ADN en células de cáncer de tiroides mediante cariotipaje y ensayo cometa.

Objetivos específicos

Estandarizar el protocolo de cariotipaje para obtener el cariotipo de células de cáncer de

tiroides.

Diseñar un protocolo para determinar la genotoxicidad en el ADN en células mediante

ensayos Cometa.

Buscar variantes genéticas en cáncer de tiroides a nivel mundial

26

Capítulo II: Revisión Bibliográfica

Tiroides

La tiroides es uno de los órganos endocrinos de mayor tamaño, es de color gris-rosado y

está compuesta por dos lóbulos que asemejan las alas de una mariposa (Figura 2), se encuentra en

el cuello en la parte anterior e inferior, por delante de la tráquea cervical (Martín, 2016). Los

lóbulos derecho e izquierdo están compuestos por el istmo, hay dos pares de glándulas

paratiroides en la cara posterior de los lóbulos o de bajo de ellos.

La glándula se compone de un estroma conjuntivo con una cubierta delgada y continua,

está formada por un tejido propio, representado pequeñas masas morfológicas equivalentes o

también llamados folículos tiroideos (Roman, 2017). Es la glándula endocrina más grande de

nuestro organismo su característica principal es la producción de hormonas, las células foliculares

de la glándula producen 2 hormonas tiroides principales: T3 y T4, estas juegan un papel esencial

en la regulación de la función celular durante el crecimiento, desarrollo y metabolismo (Gionfra et

al., 2019).

Figura 2. Estructura de la glándula tiroides, vista frontal y lateral

27

Nota: tomado de Uhliarova et al (2018).

Se sitúa por delante de la vía respiratoria apoyada en la tráquea y debajo de la laringe, es

una glándula blanda y friable, se encuentra muy vascularizada por dos arterias: arteria tiroidea

superior y la arteria tiroidea inferior (Martín, 2016). La tiroides es la glándula endocrina que

almacena grandes cantidades de hormonas, un aspecto importante para la homeostasis hormonal

(Brandan, Llanos, Horak, Tannuri, & Rodríquez, 2014).

La glándula tiroidea está en relación anatómica con dos nervios laríngeos; el nervio

laríngeo superior y el recurrente (Fernández, 2019). El tamaño de esta glándula varía entre

mujeres y hombres, en adultos puede llegar a medir de 40 a 60 mm de longitud y de 13 a 18 mm

de diámetro y normalmente pesa 20gr.

Figura 3. Tiroides normal, corte transversal y longitudinal.

Nota: tomado de Arancinia et. al (2002).

Tirocitos

En la glándula tiroides, su unidad estructural es el folículo que está constituido por una

capa de células epiteliales de forma cúbica llamadas tirocitos, se encuentran alrededor de una

solución coloide viscosa que es secretadas por los tirocitos (Herrera & Bernal, 2008).

28

Los tirocitos presentan una cara apical que se encuentra en contacto con la solución

coloide y su cara basal que está orientada hacia el exterior del folículo (Brandan et al., 2014). Los

tirocitos en su membrana tienen varias estructuras y enzimas intracelulares (Figura 3), que

permiten la síntesis y la liberación de las hormonas tiroideas (García, 2016).

Figura 4. Célula Tiroidea

Nota: tomado de García (2016).

Función de la glándula tiroides

La tiroides es esencial para el desarrollo, el crecimiento y el metabolismo normales de

prácticamente todos los tejidos humanos. Su papel fundamental en el metabolismo cardíaco,

cerebral, óseo y general queda ilustrado por las manifestaciones clínicas de la enfermedad tiroidea,

que afecta hasta al 10% de la población (Ramos, 2015).

29

Los niveles bajos de TH sérica en el hipotiroidismo dan como resultado un aumento de la

liberación de hormona estimulante de la tiroides (TSH) por parte de la hipófisis, bajo la influencia

de la hormona liberadora de tirotropina hipotalámica (TRH) y puede provocar aumento de peso,

colesterol alto, disfunción cognitiva, depresión e intolerancia al frío(Martínez Díaz-Guerra,

Serraclara Pla, Jódar Gimeno, & Hawkins Carranza, 2008), mientras que el hipertiroidismo, es decir

cuando los niveles de TH circulantes son altos, como se inhibe la síntesis y secreción de TRH y TSH,

pudiendo provocar pérdida de peso, taquicardia, fibrilación auricular y osteoporosis. Una variación

leve en la función tiroidea, tanto subclínica como dentro del rango normal, también se asocia con

estos resultados clínicos relacionados con la TH (J. Rodríguez et al., 2016).

Las diferencias sexuales en la regulación de la función tiroidea generalmente se han

relacionado con la influencia de las hormonas sexuales y la enfermedad tiroidea autoinmune, lo que

resulta en una mayor prevalencia de disfunción tiroidea en las mujeres, sin una comprensión clara

de los mecanismos moleculares subyacentes (Becerra & Bautista, 2020).

Enfermedades de la glándula tiroides

Se sabe que los trastornos de la hormona tiroidea alteran el eje reproductivo en los

hombres. En el hipertiroidismo de inicio en la edad adulta, las gonadotropinas a menudo están

dentro del rango normal, mientras que la SHBG (globulina fijadora de hormonas sexuales) está

invariablemente elevada (Galofré, Pineda, Toni, & Anda, 2016).

En el hipertiroidismo masculino, el aumento de SHBG conduce a un aumento en los niveles

de tT circulante. Sin embargo, el fT generalmente no se ve afectado.

30

En nuestros sujetos, todas las hormonas reproductivas estaban dentro o muy cerca del

rango de referencia, a pesar de que se observaron fluctuaciones consistentes con la normalización

de las hormonas tiroideas. Estos cambios pueden haber afectado las fracciones libres / unidas y las

proporciones de andrógenos / estrógenos (Anda, Pineda, Toni, & Galofré, 2016).

El hipotiroidismo afecta del 4% al 10% de las mujeres y aumenta con la edad. Los síntomas,

que a menudo son inespecíficos y sutiles, pueden incluir: letargo, aumento de peso leve, edema,

intolerancia al frío, estreñimiento, deterioro mental, piel seca, depresión, menstruación irregular,

ronquera, mialgias, hiperlipidemia y bradicardia. La determinación de TSH suele estar justificada

cuando algunos de estos están presentes (Pineda, Galofré, Toni, & Anda, 2016).

Disruptores endocrinos

Las hormonas T3 y T4 son de vital importancia para el desarrollo del cerebro. Por lo tanto,

la preocupación real es que una gran cantidad de sustancias químicas que se encuentran

comúnmente en el medio ambiente y en muestras de tejidos humanos y silvestres pueden dañar

la función tiroidea. Estos productos químicos van desde compuestos naturales hasta compuestos

artificiales. Cuando falta yodo en la dieta (como el yodo), o cuando está presente en la dieta (como

la sulfamida), pueden causar disfunción tiroidea (Zoeller et al., 2002).

La evidencia clínica reciente sugiere fuertemente que el desarrollo del cerebro es mucho

más sensible al exceso o al déficit de la hormona tiroidea de lo que se creía anteriormente.

Además, la investigación experimental reciente proporciona nuevos conocimientos sobre los

procesos de desarrollo afectados por la hormona tiroidea(Lee & Kim, 2015). Con base en la

investigación de los autores que se centra en la capacidad de los bifenilos policlorados para alterar

la expresión de genes que responden a la hormona tiroidea en el cerebro en desarrollo (Power et

al., 2001).

31

Cáncer

Es un crecimiento anormal de tejido producido por la proliferación continua de células

cancerígenas y tiene la capacidad de invadir y destruir de otros tejidos. Pueden tener su origen en

cualquier tipo de célula de cualquier tejido corporal, no es una enfermedad única, sino una serie

de enfermedades clasificadas según los tejido y célula de su origen (Celano & Airb, 2016).

Clasificación del cáncer

Los tipos de cáncer se clasifican tradicionalmente de cuatro formas (Carbone, 2020).

Primero, se clasifica de acuerdo con el tipo de tejido pueden ser carcinoma, si se originan en

células epiteliales de la piel, tracto gastrointestinal, órganos internos y otros sitios anatómicos.

Pueden ser de dos tipos adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas. Sarcoma si proceden

de tejido adiposo, músculos, vasos sanguíneos o hueso. Mieloma, si se originan en las células de la

médula. Leucemia, si el cáncer empieza en el tejido que forma la sangre, como la médula ósea, o

en las células del sistema inmunitario. Linfoma sí el cáncer procede del tejido linfoide (Idikio,

2011). Los tipos mezclados corresponden al cáncer en el que se presentan dos o más

componentes del cáncer.

La segunda clasificación corresponde a cáncer de tipo específico, es decir por el sitio

primario de origen, como cáncer de próstata, hígado cerebro etc. La tercera clasificación es el

sistema establecido por la OMS. En esta, el grado se expresa numéricamente, generalmente desde

un grado bajo de 1, que indica un alto nivel de diferenciación celular, hasta un grado alto de 3 que

indica poca diferenciación o indiferenciado (Vishwakarma & McManus, 2020).

32

La última clasificación está establecida por la diseminación del cáncer por todo el cuerpo

de acuerdo con el sistema de Metástasis de Nudos Tumorales. Esta clasificación califica el tamaño

o extensión del tumor primario (T), el grado de diseminación a los ganglios linfáticos (N) y la

presencia de metástasis a distancia (M)(O’Sullivan et al., 2018).

Los agentes que causan esta enfermedad son llamados carcinógenos, sin embargo existen

varios los factores que pueden afectar la probabilidad de que se desarrolle un cáncer, por lo cual

no se puede definir una causa única (Kroemer & Pouyssegur, 2008). Muchos agentes, incluidos la

radiación, los productos químicos y los virus, inducen cáncer tanto en animales de

experimentación como en seres humanos (Blackadar, 2016).

Cáncer de tiroides

El cáncer de tiroides se origina en la glándula tiroides, esta glándula está ubicada en la

parte frontal del cuello debajo de la laringe. La glándula tiroides absorbe yodo del torrente

sanguíneo para producir las hormonas T3 y T4, una glándula tiroides sana es apenas palpable, si se

desarrolla un tumor en la tiroides, se produce inflamación o agrandamiento de esta (Álvarez

Montané, 2014). Existen 5 tipos de cáncer de tiroides (Figura 5):

Cáncer papilar tiroideo: este se desarrolla a partir de las células foliculares y es de

crecimiento lento, generalmente se encuentra en un lóbulo, de 10 al 20% se presenta

en los dos lóbulos. Es el tipo más frecuente de cáncer de tiroides, es de tipo

diferenciado y se puede diseminar a los ganglios linfáticos (Pusztaszeri & Bongiovanni,

2019).

Cáncer folicular tiroideo: La neoplasia se desarrolla en las células foliculares, es un

cáncer diferenciado, pero es menos frecuente que el papilar, este tipo de cáncer

raramente se disemina a los ganglios.

33

Cáncer de células de Hurthle: también llamado carcinoma de las células de Hurthle,

surge de células foliculares, presenta mayor probabilidad de diseminarse a los ganglios

linfáticos (Khatami & Tavangar, 2018).

Cáncer medular de tiroides: el cáncer medular de tiroides se origina en las células C,

puede resultar del síndrome genético llamado neoplasia endocrina múltiple tipo 2, el

tumor tiene poca o ninguna similitud al tejido normal. Representa el 3% de todos los

cánceres de tiroides (Hercbergs, 2019).

Cáncer anaplásico de tiroides: es un cáncer raro y representa el 1% del cáncer de

tiroides, es de crecimiento rápido y poco diferenciado. Este puede comenzar a partir de

un cáncer de tiroides diferenciado o un tumor tiroideo benigno.

Figura 5. Tipos de cáncer de tiroides y su origen

Nota: tomado de Pstr, Zienmnicka & Weso (2018)

34

Diagnóstico ecográfico del nódulo tiroideo

La ecografía tiene un papel importante en una evaluación inicial del nódulo tiroideo, varios

signos ecográficos son altamente específicos (Figura 6), pero ninguno de ellos por sí solo permite

determinar la malignidad de un nódulo tiroideo (Ramírez et al., 2009).

Figura 6. A) Ecografía de tiroides extendida B) Tiroides normal, lóbulos tiroides (*), músculos infrahioideos (→), C carótida, T tráquea, Y yugular.

Nota: tomado de Chala et al., (2013)

1. Consistencia: nódulos pueden ser sólidos, quísticos y mixtos. La característica más

sensible y confiable es la consistencia sólida.

2. Ecogenicidad: los nódulos pueden ser hipoecogénicos, isoecogénicos o

hiperecogénicos; del 92 -99% de los nódulos hipoecogénicos son malignos.

3. Calcificaciones: pueden ser microcalcificaciones, calcificaciones groseras o

calcificaciones en cáscara de huevo (periféricas), las microcalcificaciones son una de las

características que representa malignidad (Mitchell, Gandhi, Scott-Coombes, & Perros, 2016).

35

4. Márgenes: los nódulos tienden a tener márgenes bien establecidos, regulares o

mal definidos o ser irregulares, incluso algunos pueden ser microlobulados. Los nódulos que

presentan márgenes irregulares tienden a ser un 91.8% malignos y la mayoría de los nódulos con

márgenes regulares son benignos (Manso, García & Velasco, Marcos, 2015).

5. Halo: es un anillo hipoecogénico debido a la pseudocápsula fibrosa, a un infiltrado

inflamatorio o a parénquima comprimido, un halo uniforme y completo es sinónimo de nódulos

benignos (Palit, 2019).

6. Forma: un nódulo ovalado con un diámetro asimétrico se asocia a malignidad con

un 93% de probabilidad.

7. Patrón de vascularización: se clasifican en flujo ausente, vasos periféricos y vasos

centrales, este patrón central de vascularización está en 74% de nódulos malignos, sin embargo, es

un signo poco especifico (Chala et al., 2013).

Biopsia por aspiración con aguja fina (BAAF)

BAAF es la prueba más precisa para la evaluación de nódulos tiroideos, se realiza bajo guía

de una ecografía. Una aguja muy fina es guiada dentro del nódulo tiroideo y una pequeña muestra

de células es aspirada por la aguja (Lim, Devesa, Sosa, Check, & Kitahara, 2017). Los nódulos

pueden ser sólidos o quísticos. Las lesiones quísticas poseen una probabilidad baja de ser malignos

(3%), en los nódulos si su componente es sólido existe una probabilidad del 10% de ser malignos

(Pan & Wang, 2018).

36

Figura 7. Biopsia por aspiración de aguja fina de un nódulo de tiroides

Nota: Tomado de Pan & Wang, (2018)

La punción por aspiración con aguja fina del nódulo tiroideo es el método de referencia

para su evaluación; este es un procedimiento seguro, rápido y de bajo costo. El BAAF puede tener

los siguientes resultados:

No diagnóstico. No existe suficientes células para dar un diagnóstico y es necesario repetir

la biopsia. En algunos casos existe una alta sospecha de cáncer o es necesario una tiroidectomía

parcial o total (Malheiros et al., 2018).

Benigno. Resultado patológico benigno, significa que no exista evidencia de cáncer, la

precisión del BAAF es del 95 al 97%.

Maligno. Un diagnóstico de cáncer en la biopsia es exacto con un 98%, puede ser cáncer

papilar de tiroides o cáncer medular de tiroides. La mayoría de los diagnósticos se tratan con un

tiroidectomía total o parcial, es recomendable hacer una extracción de algunos ganglios linfáticos

en el cuello (Manso, García & Velasco, Marcos, 2015).

37

Indeterminado. Existe un número de diferentes tipos de tumores que se consideran

indeterminados: neoplasia folicular, neoplasma de células de Hurthle y lesiones atípicas (Lee &

Kim, 2015). Una lesión indeterminada significa que las células no se observan normales, el 20% de

diagnósticos de cáncer de tiroides son lesiones indeterminadas. En la figura 8 se presenta un

diagrama para el diagnóstico de cáncer de tiroides.

Figura 8. Algoritmo de diagnóstico de un nódulo tiroideo

Nota: tomado de Ugarta, (2004).

38

Ensayo Cometa

El bioensayo cometa, electroforesis alcalina de células individuales, es una prueba que

evalúa el daño del material genético causado por diferentes agentes químicos y físicos (Rodríguez-

Rey, Noris-García, & Fundora Torres, 2016). El tipo de daño más simple detectado con este ensayo

es la rotura de cadena doble, resultan en fragmentos de ADN que pueden ser detectados

fácilmente, con una electroforesis a pH neutro, como lo realizaron Östling y Johanson (Figura 7).

En esta técnica las células son embebidas en agarosa y son añadidas en láminas de

microscopía para ser sometidas a una electroforesis neutral, tras la lisis en sales y detergentes. Las

células que presenten una elevada frecuencia de rupturas de doble cadena migran hacia el ánodo

(Zúñiga Venegas, 2009).

Figura 9. Células con daño en el ADN, detectado a través del ensayo cometa

Nota: tomado de Montes et al., (2011).

39

Citogenética

La citogenética es el estudio de los cromosomas, su estructura como y su número, como

también las enfermedades relacionadas con estos. Estas pueden ser causadas por anomalías en su

estructura o en su número (Larripa, 2011). Los primeros estudios se dieron en el siglo XIX, cuando

Flemming en 1882 publico las primeras imágenes del cromosoma humano a partir de

observaciones al microscopio, Waldeyer años más tarde describió al cromosoma como un cuerpo

coloreado (Tamar, Constanza, & Fonseca, 2008), estas descripciones llevaron a varias

interrogantes.

En 1956 Tijio y Levan, establecieron que el hombre tiene 46 cromosomas en células

somáticas normales, esto fue el punto de partida para investigaciones siguientes. En esa época se

ordenaba los cromosomas por el tamaño y la posición del centrómero en 7 grupos: A, B, C, D, E, F,

y G (Larripa, 2011).

Figura 10. Fotografía original de Tijio y Levan donde establecen que el hombre tenía 46 cromosomas.

40

Nota: tomada de Caspersson, Zech & Johansson, (1970).

Theophilus Paiter en 1921 describió un pequeño cromosoma en marsupiales y en 1923 lo

observó en células humanas, denominó a este cromosoma como “Y” (Drets, 2016). La primera

aberración cromosómica humana fue descrita en 1959, cuando Jerome Lejeune un médico

interesado en la homogeneidad de los rasgos fenotípicos de niños con síndrome de Down

determinó que el síndrome era una posible aberración cromosómica (Tamar et al., 2008).

Figura 11. Los padres de la citogenética: Theophilus S. Paiter y su cariotipo donde se muestra el cromosoma Y. Levan y Tijo, determinaron el número de cromosomas humanos, Lejeune determino la primera aberración cromosómica en el síndrome de Down.

Nota: tomado de Tamar et al., (2008).

41

Otras anomalías cromosómicas se identificaron en el mismo año, se identificaron los

primeros casos de la ausencia del cromosoma X fue determinado en el síndrome de Turner (45, X)

aneuploidías de los cromosomas sexuales y un cromosoma X adicional era el responsable de las

alteraciones fenotípicas en el síndrome de Klinefelter (47, XXY) (Soriano-Torres & Arencibia, 2010)

(Tamar et al., 2008).

En 1960 se identificó otros síndromes como el de Patau o trisomía 13 y el síndrome de

Edwards o trisomía 18, Klaus Patau determinó estas anomalías congénitas en recién nacidos

(Schubert, 2007). Morrhead en este año publicó su técnica de cultivo de leucocitos a partir de

sangre periférica obteniendo células en división mitótica, en este década ya se analizaba roturas

cromosómicas, intercambio de cromátidas para determinar el daño inducido al ADN por agentes

genotóxicos o exposición a diversos mutágenos (Larripa, 2011).

Sajiro Makino, Albert Levan y George Klein, publicaron su estudio en el cual demostraron

que líneas celulares cancerígenas tendían a ser mitóticamente inestables y presentaban un

número cromosómico variable (Drets, 2016). La primera alteración estructural descrita fue la

presencia de un cromosoma de menor tamaño, parcialmente deleccionado en la leucemia

mieloide crónica; se denominó cromosoma Philadelphia (Ph1) por la cuidad donde se hizo el

hallazgo (Villaverde, 2000). Años después se la describió con translocación 9:22 y se pensaba que

era una deleción del cromosoma Y ya que los pacientes analizados eran hombres; sin embargo,

estudios posteriores demostraron que estaba presente en mujeres con el mismo tipo de leucemia

(Calasanz, 2001).

42

Fitohemaglutinina

La fitohemaglutinina es una lectina también denominada PHA, es una proteína

parcialmente purificada que se encuentra en la mayoría de vegetales principalmente de

leguminosas como la Phaseolus vulgaris L (Romo, Díaz, & Laguardia, 1968). La PHA aglutina

eritrocitos y leucocitos; se une a oligosacáridos y estimula la mitosis en linfocitos, era usada para la

separación de células sanguíneas (Ruiz, Boffill, González, & Blanco, 2005). La fitohemaglutinica es

un inmunomodulador, permite que los linfocitos se conviertan en linfoblastos en 24 horas (L.

González, Sáenz, Rodríguez, & Porras, 2002).

Tipos de bandeo cromosómico

En los años 70, se introdujo las técnicas de bandeo cromosómico a los estudios de

citogenética, aumento así la posibilidad de diagnosticar enfermedades genéticas (Lopez, 1986).

Casperson y Col descubrieron los marcadores fluorescentes y su capacidad para teñir cromosomas

metafásicos, en 1970 se publicó el patrón de bandeo con fluorescencia, bandas Q por quinacrina

(Larripa, 2011); en los años siguientes se descartó este bando por el bandeo con Giemsa ya que

tenían una mejor resolución y tinción, mejorando así el mapeo genético de varias enfermedades

(Soriano-Torres & Arencibia, 2010).

Evans, Seabright y Lejeune en años siguientes descubrieron métodos que producían un

patrón de bandeo similar (Bandas G) o patrón de reversa (Bandas R) (Calasanz, 2001), también se

implementaron técnicas que permitían establecer bandas específicas para determinadas regiones

cromosómicas como la heterocromatina (Bandas C) o regiones teloméricas (Bandas T) y en el

nucléolo (Bandas NORs) (Villaverde, 2000).

43

Las técnicas de bandeo se puede lograr diferentes niveles de resolución dependiendo el

estado de condensación cromosómica permitiendo así un análisis adecuado de cada uno de los

cromosomas de forma individual (Rojas et al., 2012). Las bandas C y bandas R son las más usadas

por sus características, las bandas se pueden dividir morfológicamente por la heterogeneidad de la

cromatina: bandas G, bandas R, bandas Q, bandas C y bandas T (Gartler, 2006).

Las bandas G o bandas GTG se producen por la acción proteolítica de la enzima tripsina

que tiñe regiones ricas en A-T, en las bandas R se tiñen zonas ricas en G-C y se producen por

someter la placa a solución salina, temperaturas altas y tinción con Giemsa (Schubert, 2007).

Figura 12. Cromosomas 7, 21 y 22 con tinción de bandas R, Q y G.

Nota: Tomado de Tamar et al., (2008).

44

Cariotipo

Es la organización de cromosomas de acuerdo con el tamaño y posición del centrómero.

Con el descubrimiento de varias técnicas de bandeo se logró identificar los cromosomas

individualmente, Casperson et al., mediante fluorescencia obtuvo el patrón de las bandas Q y

Seabright mediante digestión enzimática obtuvo el patrón de las bandas G, estos dos patrones se

utilizaron para la clasificación de los cromosomas (Garcia-Sagredo, 2008).

Los cromosomas humanos tienen tres formas, longitud de brazos, corto (p) o largo (q), y

su posición del centrómero, los cromosomas metacéntricos presentan los brazos de la misma

longitud, submetacéntricos tiene una distinción de brazos largo y cortos y los acrocéntricos

presentan el centrómero muy cerca de los uno de los extremos de los brazos (Gomez, 2020). Los

cromosomas poseen un telómero que se encuentra en el extremo del brazo corto, está constituido

por una secuencia repetida de TTAGGG.

Figura 13. Clasificación morfológica de los cromosomas según la posición del centrómero según Levan et al. 1964.

Nota: tomado de Gomez, (2020).

45

El ser humano posee 46 cromosomas, 22 pares de cromosomas homólogos o autosomas y

un par de cromosomas sexuales, la división de estos cromosomas es la siguiente:

Grupo A: Pares de cromosomas metacéntricos 1 y 3; pares de cromosoma

submetacéntrico 2.

Grupo B: Pares de cromosomas submetacéntricos 4 y 5

Grupo C: Pares de cromosomas submetacéntricos 6,7,8,9,10,11, 12 y X.

Grupo D: Pares de cromosomas acrocéntricos 13,14 y 15.

Grupo E: Pares de cromosomas metacéntricos 16 y pares de cromosomas

submetacéntricos 17 y 18.

Grupo F: Pares de cromosomas metacéntricos pequeños 19 y 20.

Grupo G: Pares de cromosomas acrocéntricos pequeños 21,22 y Y.

46

Figura 14. Cariotipo normal clasificado en los 7 grupos y el par de cromosomas sexuales (Femenino)

Nota: tomado de Bueno, (2011).

Los estudios citogenéticos de células neoplásicas han demostrado que existen cambios

cromosómicos consistentes, los cuales no se producen de una manera fortuita y tienen un papel

importante en la transformación neoplásica (Luo, Sun, Cormack, & Boeke, 2018). El cariotipaje

permite conocer la constitución cromosómica de una célula, este es igual a la dotación

cromosómica completa de una persona; es la representación gráfica de los cromosomas

ordenados en pares homólogos (Jiang et al., 2017).

47

Figura 15. Metafase tratada con 5’ azacitidina, las flechas indican sitios con fragilidad cromosómica.

Nota: tomado de Lambí, (2007).

Entre el 3 y 5% de los nacimientos en una población y periodo establecido, presentan

alguna anomalía congénita que puede ser detectado en el nacimiento, este porcentaje aumenta

conforme crecen los recién nacidos hasta en un 10%. La mayoría de embarazos con anomalías

cromosómicas no concluyen o terminan en abortos (Descailleaux & Velasquez, 2000), la fragilidad

cromosómica se puede definir como regiones del cromosoma metafásico con tendencia a

alteraciones como fracturas, quiebres o discontinuidad (Llambí & Núñez, 2007). Los estudios de

fragilidad cromosómica permiten establecer genes implicados en la activación de oncogenes o

inactivación de genes supresores tumorales.

48

Figura 16. Cariotipo femenino normal, paciente de 60 años.

Nota: tomado de Stevens et al., (2017).

Es una prueba genética que se usa en busca de enfermedades provocadas por

irregularidades en los cromosomas, existen 44 cromosomas autosomas agrupados en 22 pares y 2

cromosomas sexuales (Stölzel et al., 2016). Para realizar la prueba es necesario una muestra de

tejido celular como: líquido amniótico, sangre, médula ósea o placenta.

49

Etiología del cáncer de tiroides

En la etiología del cáncer de tiroides intervienen varios factores genéticos como

alteraciones de las vías metabólicas intracelulares, estas alteraciones se deben a mutaciones

puntuales en genes que regulan estas vías, alteración de su expresión, cambios epigenéticos como

metilación de genes y factores ambientales (Marrero, Sinconegui, & Cruz, 2013).

La principal alteración es la activación de la vía de las proteínas quinasas activadas por

mitógenos (MAPQ), es una vía que depende de la activación de un receptor de membrana con

actividad tirosina quinasa (RET); que a su vez regula la activación de una cadena de fosforilaciones

sucesivas de varias proteínas citoplasmáticas (Chiganer et al., 2011), El oncogén RET codifica un

receptor transmembrana de las tirosinaquinasa que está involucrado en crecimiento,

diferenciación y migración de los tejidos en desarrollo.

Los marcadores moleculares de la glándula tiroides corresponden a mutaciones genéticas

que inician en las células tiroideas malignas, estas alteraciones genéticas son más comunes en la

neoplasia papilar de tiroides, son las mutaciones de los genes de la familia de quinasas tipo

serina/treonina (BRAF), mutaciones en la proteína G monomérica, una GTPasa con actividad

reguladora GTP hidrolasa (RAS), mutaciones del gen que codifica un factor de transcripción

nuclear (P53) y reordenamientos del gen RET con el gen CPT, REP/CPT (Marrero et al., 2013).

50

Figura 17. Marcadores moleculares del cáncer de tiroides

Nota: tomado de Pusztaszeri & Bongiovanni, (2019)

Genética del cáncer de tiroides

Next Generation Sequencing permite la detección de todos los tipos de variantes del ADN

humano (pequeñas sustituciones, deleciones o inserciones, inversiones o translocaciones),

permite la búsqueda de mutaciones nuevas o causantes de alteraciones en el genoma completo. El

ADN se fragmenta y mediante ligación se les añade secuencias adaptadoras a los extremos, los

fragmentos de ADN al ser amplificados clonalmente, se agrupan para ser utilizados como molde

para secuenciar, la secuenciación se realiza alternando ciclos de terminación reversible cíclica

(CRT) (Cha & Koo, 2016).

51

La reacción CRT utiliza terminadores reversibles para incorporar nucleótidos marcados

fluorescentemente, las secuencias cortas producidas a partir de los extremos de ADN son los

adaptadores se denominan lecturas o reads (Rodríguez-Santiago & Armengol, 2012). Las nuevas

secuencias generan lecturas a partir de cada uno de los extremos de un fragmento de ADN

(inserto).

Un aspecto importante en la secuenciación de nueva generación es el número de copias

de cada base del genoma presente en los reads de secuenciación producidos. La detección de

variantes genéticas a partir de datos de NGS consiste en identificar diferencias en la secuenciación

de ADN de un individuo al compararlo con un ADN de referencia (Scheijen et al., 2019).

Figura 18. Variantes genéticas del cáncer de tiroides y sus porcentajes

Nota: tomado de Mitchell et al., (2016).

52

Capitulo III: Materiales y Métodos

Localización Geográfica

El presente estudio fue realizado en conjunto el Centro de Investigación Genética y

Genómica-CIGG con la Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE, con el fin de realizar la

estandarización de protocolos para la caracterización de células de cáncer de tiroides.

El trabajo estuvo dirigido metodológicamente en tres fases: primero la estandarización del

protocolo para determinar el cariotipo de células cancerígenas, seguido del diseño de un

protocolo para la determinación de la genotoxicidad de células de cáncer y una revisión

bibliográfica para determinar variantes genéticas del cáncer de tiroides.

Preparación de medio de cultivo

Para la preparación del medio de cultivo RPMI suplementado, se limpió la cámara de flujo

laminar con alcohol y luz UV. Se utilizó 100 mL de RPMI 1640, 12.0 mL de suero fetal bovino, 1.0

mL de L-Glutamina, 1.0 mL de antibiótico-antimicótico, 1.5 mL de Hepes Buffer y 5 mL de

fitohemaglutinina.

Cultivo de muestra

Las muestras de sangre fueron tomadas en tubos vacutainer heparinizados (tapa verde),

se limpió y desinfectó la cámara de flujo laminar con alcohol y luz UV por 10 minutos. Se

descongelo las alícuotas de medio en baño maría a 37 °C.

Se rotulo con el número de muestra y fecha. Se colocó los tubos y las muestras en la

cámara de flujo laminar, así como todo lo necesario para el cultivo de linfocitos. Se colocó

aproximadamente 600 µl en el medio directamente de la muestra que fue previamente agitada. Se

incubó la muestra a 37 °C por 72 horas, se limpió la cámara de flujo laminar. La muestra sobrante

se guardó para estudios posteriores.

53

Cosecha de cultivo de sangre periférica

Cosecha de cultivo

Se añadió 200 µl de Colcemid® a cada cultivo y se incubó a 37 °C en baño maría durante

25, 40 y 60 minutos y se preparó las siguientes soluciones:

Choque Hipotónico

Se disolvió 1.35 gramos de KCl en 250 mL de agua destilada, la solución se conservó a 4 °C.

Se calentó los mL necesarios dependiendo del número de muestras. En la tabla 1, se presenta la

cantidad de choque hipotónico por el número de muestras a usarse.

54

Tabla 1. Preparación de Choque Hipótonoco (KCl 0.54%)

MUESTRA SOLUCIÓN DE CHOQUE HIPOTÓNICO (mL)

1 6

2 12

3 18

4 24

5 30

6 36

7 42

8 48

9 54

10 69

Fijador de Carnoy

Se preparo el fijador en proporciones 3:1 y se la llevó por 30 minutos a – 20 °C. Se disolvió

3 porciones de metanol por una porción de ácido acético. La tabla 2 se presenta las cantidades

usadas.

55

Tabla 2. Preparación de Fijador de Carnoy (3:1)

Muestra Metanol (ml) Ác. Acético (ml) Total, Fijador Carnoy (3:1)

1 18 6 24 2 36 12 48 3 54 18 72 4 72 24 96 5 90 30 120 6 108 36 144 7 126 42 168 8 144 48 192 9 162 54 216 10 180 60 240

Una vez preparadas las soluciones necesarias, se calentó la cantidad de choque hipotónico

necesario en baño maría a 37 °C (se comprobó con un termómetro la temperatura). Una vez

transcurrido el tiempo con colcemid, se centrifugó la muestra por 10 minutos a 2500 rpm y se

eliminó el sobrenadante. Se absorbió la muestra en la pipeta y se la mantuvo hasta colocar 6 ml de

choque hipotónico a 37 °C por 5 minutos.

Se colocó el contenido de la pipeta lentamente por las paredes del tubo, se resuspendió

hasta que la mezcla quedó homogénea y se incubó en baño maría por 25 minutos a 37 °C. Se

centrifugó por 10 minutos a 2500 rpm y se eliminó el sobrenadante. Se resuspendió de 2 a 3 veces

con 6 mL de fijador Carnoy y se llevó la muestra a -20 °C por 15 minutos.

Transcurridos los 15 minutos, se centrifugo por 10 minutos a 2500 rpm, se eliminó el

sobrenadante y se resuspendió. Se absorbió la muestra con la pipeta y se mantuvo hasta colocar 6

ml de fijador, se colocó la muestra rápidamente y se resuspendió de 2 a 3 veces. Se centrifugo la

muestra por 10 minutos a 2500 rpm, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el precipitado

hasta lograr un precipitado celular limpio y hasta que el sobrenadante (fijador) estuvo

transparente. Se llevó a 4 °C por 24 horas antes de extender la placa.

56

Una vez que se obtuvo el precipitado celular blanco y liquido fijador transparente y se dejó

reposar por 24 horas para realizar la extensión y tinción. Se preparo el portaobjeto con un 50% de

humedad, se resuspendió el precipitado con fijador de Carnoy (aproximadamente 900 μl). Se tomo

la muestra con una micropipeta (100 – 200 μl) y se dejó caer a una distancia lo más alta posible

sobre el portaobjetos para abarcar toda el área. Se realizó 3 portaobjetos por muestra: 1 para ver

estructura y número cromosómico y 2 para bandeo GTG.

Se dejó secar los portaobjetos a temperatura ambiente por 25 minutos, una vez seca las

muestras se tiño con Giemsa por 3 minutos.

Bandeo GTG de cromosomas

Se preparo las siguientes soluciones una hora antes del ensayo: Tripsina (1:250): Se diluyo

1 mg de tripsina (GIBCO) en 25 mL de H2O y se realizó alícuotas de 4 mL y se llevó a – 20 °C hasta

su uso. NaCl (0.92 %) solución salina. Se diluyo 1,38 g de NaCl en 100 ml de H2O destilada. Se

preparó en 3 frascos Coplin las siguientes soluciones:

Tabla 3.

Soluciones usadas para Bandeo GTG de cromosomas.

Solución

A Tripsina (1:250) 46 mL de solución salina

4 mL de solución tripsina

B NaCl (Lavado 1) 50 mL de solución salina

C NaCl (Lavado 2) 50 mL de solución salina

57

Antes de realizar el bandeo se secó los portaobjetos durante toda la noche a 56 °C en la

estufa. En el frasco Coplin con la solución A, se sumergió las placas y se tomó el tiempo de bandeo,

aproximadamente 45’’ (el tiempo vario de acuerdo con la calidad y observación de bandas en el

microscopio después de realizar la tinción).

Se sumergió las placas en la solución B para un primer enjuague y se agitó suavemente.

Seguido se sumergió en la solución C para un segundo enjuague. Las placas se secaron en posición

vertical a temperatura ambiente por 15 minutos. Se tiño con Giemsa por 1 min 30’’. En el caso de

que no existieran bandas se destiño la placa con metanol y se repitió el proceso desde el secado

de los portaobjetos. Los frascos Coplin permanecieron a 37 °C en el procedimiento de bandeo.

Se preparó 4 ml de solución Giemsa en 46 ml de H2O destilada en un frasco coplin, se

sumergió las placas por el tiempo deseado de acuerdo con la intensidad de coloración que se

deseaba alrededor de 3 minutos. Se retiró las placas y se enjuago con agua corriente, se dejó secar

las placas al ambiente. Se colocó 500 µL de etanol absoluto para fijar la placa y se colocó en el

microscopio.

Se utilizó un microscopio óptico de contra fase, la observación de las placas se hizo de

forma ordenada y metodológica para evitar contabilizar las mismas células. Se uso el Software

GenASIs Bandview, primero se enfocó las células con el lente 10x, se colocó una gota de aceite de

inmersión en el área de interés y se enfocó con el lente 100x.

58

Una vez enfocadas las células en metafase con los lentes de 100x se inició el modo LIVE en

el software, después de enfocar y capturar la imagen se utilizó la función B (band view) para

recortar y organizar los cromosomas para obtener su cariotipo. Se registro las metafases

observadas, se tomó las coordenadas y algún dato cromosómico relevante.

Ensayo cometa

Las soluciones se prepararon de acuerdo con el anexo 1.

Preparación de placas

Se colocó los portaobjetos y cubreobjetos en etanol al 70% un día antes a -20 °C,

transcurrido el tiempo necesario se secó las placas con aire caliente. Se calentó la agarosa NMP en

el microondas por 2 minutos y se colocó la solución en un frasco Coplin. Se sumergió las placas

previamente etiquetadas en la agarosa por 1 minuto verificando que la placa este totalmente

cubierta de un lado. Se limpió el exceso de agarosa y se dejó secar al ambiente por toda la noche.

Se realizó una segunda capa de agarosa después de las 24 horas y se dejó secar al ambiente por 25

minutos.

Preparación de la muestra

Para inducir daño celular en muestras de sangre periférica se añadió 5, 10 y 20 µL de H2O2,

se tomó 5, 10 y 20 µL de muestra (sangre + H2O2) y se mezcló con 80 y 160 µL de LMP agarosa en

tubos eppendorf de 200 µL y se resuspendio la mezcla hasta que se encuentre homogénea. En la

tabla 4 se muestran las preparaciones usadas de sangre y H2O2 y en la tabla 5 las combinaciones

de sangre y LMP 0.5% antes de colocar en las placas con NMP 0.6%.

59

Tabla 4. Preparación de muestras con H2O2 al 10%.

Muestra Sangre (µL) H2O2 10% (µL)

1 5 20

2 5 20

3 20 10

4 20 10

5 5 5

6 5 5

7 10 5

8 10 20

9 10 ----

10 10 ----

Tabla 5. Preparación de muestras con H2O2 y LMP.

Muestras Sangre + H2O2 (µL) LMP (µL)

1 5 80

2 10 80

3 5 80

4 10 80

5 5 80

6 5 160

7 10 160

8 5 80

9 10 160

10 5 160

Se colocó la mezcla (sangre + LMP, aproximadamente 80 µL) en la placa con NMP agarosa,

se colocó el cubreobjetos y se llevó a 4 °C por 12 minutos para su solidificación. Se preparó el

tampón de lisis agregando 6 mL de DMSO y 5 mL de Triton en un frasco Coplin.

60

Se sacó la placa, se dejó reposar al ambiente por 2 minutos y se retiró lentamente el

cubreobjetos deslizándolo hacia un lado. Se colocó 85 µL de LMP agarosa, se cubrió nuevamente

con un cubreobjetos y se llevó a 4 °C por 12 minutos. A partir de este momento, todo se realizó

bajo luz roja.

Fase de lisis de membranas celulares

Se sacó las placas, se retiró el cubreobjetos cuidadosamente y se sumergió las placas en la

solución de lisis por 1 hora a 4 °C y en la oscuridad. Transcurrido el tiempo necesario se sacó las

placas de la solución de lisis y se lavó las placas con la solución de electroforesis.

Fase de desnaturalización

Se utilizo una cámara de electroforesis, se colocó las placas en la cámara, en contacto unas

con otras evitando espacios, se llenó la cámara con la solución de electroforesis (600 mL) y se llevó

a 0,5 cm por encima de las placas. Se llevó a 4 °C y se dejó por 20 minutos a oscuridad.

Fase de electroforesis

Se conecto los electrodos y la fuente de poder. Las condiciones de electroforesis fueron:

4°C, 25 V y amperaje a 300 mA por 30 minutos.

Fase de neutralización

Se sacó las placas de la cámara de electroforesis y se las colocó en una bandeja para

realizar 3 lavados por 5 minutos cada uno con la solución de neutralización. Se retiró el exceso de

líquido y se colocó de forma vertical para un mejor secado.

Fase de tinción

Se agregó 50 µL de Sybr Green a cada placa.

61

Fase de análisis y observación

Se analizó 20 células por muestra, la observación se realizó en el microscopio de

fluorescencia BX3 Olympus, longitud de onda (495nm), con filtro DAPI y COMET, utilizando el

objetivo 40X y se observó si existía la presencia de cometas en las placas.

Figura 19. Esquema ensayo cometa

Nota: Creado por Andrea Morillo en BioRender.

62

Fase de deshidratación y fijación de placas

Se colocó las placas de forma horizontal y se añadió 2 mL de etanol absoluto a cada placa

por 5 minutos. Se retiró el exceso de etanol y se colocó las placas de forma vertical para que se

evapore totalmente el etanol. Se guardo las placas en un lugar oscuro a temperatura ambiente por

máximo 8 días antes de su análisis.

Búsqueda bibliográfica de variantes genéticas en cáncer de tiroides.

La revisión bibliográfica se realizó en bases de datos científicos como PubMed

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed), ScienceDirect (https://www.sciencedirect.com), SciELO

(http://scielo.isciii.es/scielo.php?lng=es), Google Scholar

(https://scholar.google.com/?oi=gsb00&lookup=0&hl=es), Science Research

(https://www.scienceresearch.com/scienceresearch/desktop/en/search.html ), entre otras. La

información obtenida fue referente a tiroides, cáncer de tiroides, variantes genéticas, genes,

frecuencia poblacional, cáncer papilar de tiroides, incidencia del cáncer de tiroides, entre otros.

63

Capítulo III: Resultados

Cariotipo

La obtención de metafases de alta calidad es esencial para obtener cromosomas definidos

y claros. En un ensayo existo es necesario obtener una buena distribución de los cromosomas

para poder distinguirlos entre sí. Un tiempo de incubación insuficiente producirá menos

extensiones de metafases con cromosomas superpuestos y largos. Se realizó variaciones en el

tiempo con colcemid, en la tabla 6 se establece las diferencias obtenidas.

Tabla 6. Variaciones en el tiempo de Colcemid

Muestras Tiempo Colcemid Observaciones

1 25 min Pocas metafases

2 25 min Cromosomas superpuestos

3 25 min Cromosomas largos y

no definidos 1 40 min Metafases claras 2 40 min Cromosomas largos

3 40 min Metafases claras y

cromosomas superpuestos

1 1 h Cromosomas superpuestos

2 1 h Cromosomas cortos 3 1 h Cromosomas gruesos

Se usó un tiempo de 40 minutos con solución de Colcemid, ya que con esta se observaron

metafases de buena calidad y dispersión con cromosomas claros y largos como se observa en la

figura 20A, se observan cromosomas largos y no definidos, no se logra diferenciar cada

cromosoma y se encuentran superpuestos, el tiempo con Colcemid fue de 25 minutos en las

figuras 20B y 20C.

64

Figura 20. A) Se observa una metafase con buena dispersión, cromosomas con una buena morfología, largos y definidos (tiempo de colcemid, 40 min); B) Metafase con cromosomas largos y no definidos (tiempo de colcemid, 25 min); C) Metafase con cromosomas superpuestos (tiempo de colcemid, 25 min).

El colcemid detiene las células en metafase, una exposición prolongada a colcemid

produce más células en metafase, pero se obtiene cromosomas más cortos y gruesos que son

difíciles de analizar. Con 1 hora en solución de Colcemid, se obtuvieron metafases superpuestas

con cromosomas cortos y más gruesos como se observan en la figura 21.

Figura 21. A) Metafase con cromosomas cortos y presencia de ruido (tiempo de colcemid, 1 h); B) Metafase con cromosomas gruesos, superpuestos y no definidos (tiempo de colcemid, 1 h).

65

Se estableció un tiempo de incubación con Colcemid de 40 minutos ya que se obtuvo

metafases claras, con cromosomas largos y diferenciados.

Se usaron 6 muestras, por cada muestra se realizó 2 placas y se analizaron 304 metafases.

En la tabla 7, se observa las variaciones en tiempo en la solución de tripsina y en la tinción giemsa.

El tiempo de exposición a tripsina es un factor importante para obtener bandas claras y con un

buen contraste.

Tabla 7. Tiempos en solución tripsina (1:250) y en tinción Giemsa

Muestra Tiempo Solución

Tripsina

Tiempo Tinción

Giemsa

Observaciones

1 43 s 3 min Bandas claras

1 41 s 3 min No se observan

bandas

2 42 s 2.40 min Bandas quemadas y

bandas claras

2 45 s 3 min Bandas quemadas

3 41 s 3 min Bandas gruesas

3 43 s 2 min Bandas claras

4 42 s 2 min Pocas bandas

4 43 s 2.30 min Bandas claras

5 42 s 3 min Bandas claras

5 41s 2.30 min No se observan

bandas

6 43 s 3.10 min Bandas quemadas

6 43 s 2 min Bandas claras y

quemadas

Nota: en realizó nuevas placas hasta obtener bandas claras y presencia de metafases.

En las Figuras 22 se observan metafases con bandas gruesas y quemadas debido al tiempo

en la solución de tripsina 0.5%.

66

Figura 22. A) Cromosomas con bandas no definidas y gruesas; B) Metafase con superpuestos con bandas con bajo contraste; C) Metafase con cromosomas quemados.

Nota: tiempo de exposición a la solución de tripsina fue de 45 s.

Los cromosomas con bandas GTG adecuadas contienen patrones característicos de bandas

claras y oscuras. Con un tiempo de 43 s en la solución de tripsina se obtuvieron las siguientes

metafases:

Figura 23. Metafases con 43 s en solución tripsina, A) 2.40 min en tinción Giemsa, B) 2.30 min en tinción Giemsa y C) 2 min en tinción Giemsa.

En la figura 23A, se observan bandas claras y definidas en cromosomas cortos y gruesos, la

figura 23B presenta una metafase con una buena dispersión de cromosomas presentan bandas

con contraste bajo, la figura 23C se observan cromosomas definidos sin bandas.

67

Se realizaron una segunda ronda de placas variando el tiempo en la solución tripsina y el

tiempo de tinción con Giemsa.

Tabla 8. Tinción y bandeo de muestras de sangre periférica.

Muestra Tiempo Solución

Tripsina

Tiempo Tinción

Giemsa

Observaciones

1 45 s 2 min Pocas bandas

1 40 s 2.30 min Pocas metafases

2 44 s 3 min Bandas claras

2 43 s 2.10 min Bandas quemadas

3 43 s 3 min Bandas gruesas

3 44.5s 3 min Bandas claras

4 45.5s 2.50 min Bandas claras

4 45 s 3 min Bandas quemadas

5 42 s 3 min Bandas claras

5 43.5s 2 min Pocas bandas

6 44 s 3 min Bandas quemadas

6 42.5 s 2.40 min Metafases

superpuestas

En la segunda ronda de placas, se pudo observar bandas más claras y cromosomas más

definidos.

68

Figura 24. A) Metafase con 45.5 s en tripsina y 2.50 min en tinción Giemsa; B) Metafase con 42 s en tripsina y 3 min en tinción Giemsa; C) Metafase en 44.5 s en tripsina y 3 min en tinción Giemsa; D) Metafase con más de 46 cromosomas; E) Metafase superpuesta con más de 46 cromosomas y cromosomas superpuestos.

En la figura 24A se observan bandas sim embargo no son claras y definas, la metafase

presenta cromosomas gruesos se debe al tiempo de exposición en tripsina ya que un tiempo

insuficiente provocas bandas con poco contraste. La figura 24B presenta cromosomas con una

dimensión correcta, tienen una buena dispersión en la placa y sus bandas no se puede distinguir

entre ellas. La figura 24C presenta una metafase con cromosomas gruesos y pequeños, sin

embargo, estos se encuentras quemados debió al tiempo de exposición prolongado a la tripsina.

Se encontraron varias metafases superpuestas, con más de 46 cromosomas y con bandas no

definidas con se muestra en las figuras 24D y 24E.

69

Se obtuvo los siguientes cariotipos a partir de metafases con bandas claras, cromosomas

definidos con tiempo en solución tripsina de 43 a 45 s y 2.40 a 3 min en tinción con Giemsa.

Figura 25. A) Se observa un cariotipo normal femenino con 46 cromosomas (46 XX) con un tiempo en solución tripsina 43 s y tinción Giemsa 2.45 min; B) Cariotipo femenino con 46 cromosomas (46XX), con un tiempo en solución tripsina 44.7 s y tinción Giemsa 2.40 min.

En los siguientes cariotipos de observa cariotipos con anomalías cromosómicas, ya que las

muestras analizadas con de pacientes con cáncer (mieloma múltiple), presentan anomalías

numéricas en su cariotipo.

70

Figura 26. A) Cariotipo femenino, con anomalía numérica presenta 44 XX, -19, -20 con un tiempo en solución tripsina 43 s y tinción Giemsa 3 min, B) Cariotipo masculino, con anomalías numéricas presenta 45 XY, -18.con un tiempo en solución tripsina 44.5 s y tinción Giemsa 3 min.

En la figura 26 se observa un cariotipo con anomalías cromosómicas, presenta la ausencia

de varios cromosomas, esto sucede en varias ocasiones. El paciente puede presentar alguna

enfermedad de tipo neoplasia o en su defecto se debe a una mala extensión de la muestra en la

placa, ya que los cromosomas se encuentran muy dispersos.

71

Figura 27. Cariotipo masculino con anomalías numéricas, presenta 36 cromosomas (XXYYY), -1, -2, -3, -6, -7, -8, -14, -16, -17, -18, -19, -20, -21. El tiempo en solución de tripsina fue de 44 s y en tinción Giemsa fue de 2.40 s.

Ensayo cometa

Se analizaron 15 muestras, por cada muestra se realizaron 3 placas. Para inducir daño en

las células se usó H2O2 al 20%. Se coloco las capas de agarosa una noche anterior al ensayo, en la

tabla 9 se observa las variaciones y observaciones que se obtuvieron:

72

Tabla 9. Condiciones del ensayo cometa con variación en capas de NMP.

Muestra Capas de NMP H2O2 + Sangre

(µL) (SP*)

SP + LMP

(µL)

Observaciones

1 2, 1 capa 24 horas antes

y 1 capa 1 hora antes

5 + 5 5 + 80 Ruido

Pocas células

2 2, 1 capa 24 horas antes

y 1 capa 1 hora antes

5 + 10 10 + 80 Ruido

Hemolisis

3 2 capas 24 horas antes 10 + 20 5 + 160 Ruido

Hemolisis

4 2 capas 24 horas antes 10 + 5 10 + 160 Ruido

5 1 capa 1 hora antes 10 + 10 10 + 160 Ruido

Pocas células

6 1 capa 1 hora antes 5 + 20 5 + 80 Pocas células

7 2 capas 1 hora antes 20 + 5 10 + 80 No se observa células

8 2 capas1 hora antes 20 + 20 10 160 Ruido

Pocas células con halo

9 1 capa 1 hora antes 0 + 5 5 + 80 Células sin presencia de

halo

10 2 capas 1 hora antes 0 + 10 10 + 160 Células sin presencia de

halo

Nota: SP*: sangre + H2O2

Se hico un cambio de marca de portaobjetos, debió a que las capas de agarosa en la fase

de electroforesis se desprendieron de las placas. Se colocó los portaobjetos en etanol al 70% a -20

°C por 24 horas y la agarosa NMP se preparó un día antes del ensayo y se mantuvo en la estufa

hasta su uso. En la tabla siguiente se detalla los resultados con los cambios anteriores

mencionados.

73

Tabla 10. Condiciones 2, ensayo cometa variación de capas de agarosa NMP y LMP

Muestra Capas de NMP H2O2 + Sangre

(µL) (SP)

SP + LMP

(µL)

Observaciones

1 2 capas 24 horas antes 5 + 5 5 + 80 Ruido

Células sin presencia

de halo

2 2 capas 24 horas antes 10 + 10 10 + 80 Ruido

3 2 capas 24 horas antes 20 + 10 5 + 160 Células superpuestas

Hemolisis

4 2 capas 24 horas antes 5 + 20 10 + 160 Ruido

5 2 capas 24 horas antes 0 + 5 5 + 80 Pocas células con halo

6 2, 1 capa 24 horas antes y 1

capa 1 hora antes

5 + 10 5 + 160 Pocas células con halo

7 2, 1 capa 24 horas antes y 1

capa 1 hora antes

10 + 5 10 + 160 Ruido

Células superpuestas

con halo

8 2, 1 capa 24 horas antes y 1

capa 1 hora antes

20 + 20 5 + 80 Hemolisis

Pocas células

9 2, 1 capa 24 horas antes y 1

capa 1 hora antes

5 + 10 10 + 80 Células con presencia

de halo

10 2, 1 capa 24 horas antes y 1

capa 1 hora antes

0 + 5 5 + 160 Pocas células

Las placas 1, 2, 4 y 7 presentaron ruido debió a la doble capa de agarosa NMP, para el

siguiente ensayo se usó una capa de agarosa 24 horas antes del ensayo. Las placas 3 y 8

presentaron hemolisis celular, en las siguientes placas se usó solamente 5 y 10 µL de H2O2, las

placas 5,6, 8 y 10 presentaron pocas células por lo que para el siguiente ensayo se usó 80 µL de

agarosa LMP.

En la tabla 11 se evidencia las condiciones usadas con 1 capa de agarosa NMP colocada un

día antes con los portaobjetos previamente colocados en etanol al 70 °C en -20 °C por 24 horas.

74

Tabla 11. Condiciones del ensayo cometa con 1 capa de agarosa NMP.

Muestra H2O2 + Sangre (µL) SP + LMP Observaciones

1 5 + 5 5 + 80 Células con halo 2 10 + 5 5 + 80 Hemolisis celular 3 5 + 10 10 + 80 Células con halo 4 10 + 10 10 + 80 Células superpuestas 5 0 + 5 5 + 80 Células sin halo

Los siguientes ensayos se realizaron con 1 capa de agarosa NMP colocada 1 noche

anterior, de esta forma se evitó ruido en las imágenes. El tampón de lisis fue evaluado, se colocó el

DMSO 10% y Trito X – 100 al 1% 12 minutos antes de la fase de lisis celular, sin embargo, las

células no presentaron lisis celular. Se realizó una variación en el tampón de lisis, se añadió DMSO

10% y Triton X-100 1 hora antes de empezar el ensayo y se mantuvo a 4°C hasta su uso.

En la figura 28 se observa células con presencia de halo con un tampón de lisis con las

variaciones mencionadas. En las zonas señaladas se puede observar la presencia halo y cola,

confirmando que las células presentan daño o rupturas de en la cadena de ADN.

Figura 28. Células con presencia de halo, variación del tampón de lisis

Nota: Tampón de lisis con DMSO 10% y Triton X-100 al 1% agregados 1 hora antes del ensayo y a -

4 °C hasta su uso.

75

En la fase de denaturalización se usó una cámara de electroforesis previamente colocada a

-4 °C en oscuridad, se colocó las placas en la cámara evitando espacios entre sí. En la figura 29 de

evidencia dos tiempos distintos de corrida de electroforética, 20 min y 30 min. En la figura 29A se

observa la presencia de halo y cola mientras que en la figura 29B se observa la presencia solo de

halo en la célula.

Figura 29. Células con presencia de halo, variación de condiciones de electroforesis. A) Condiciones de electroforesis 25V, 300 mA y 20 min; B) Condiciones de electroforesis 25V, 300 mA y 30 min.

Una de las condiciones más importantes en la fase de electroforesis en la temperatura,

debe realizarse a -4 °C. Se puede colocar la cámara dentro de una bandeja de hielo o dentro del

refrigerador sin existir variaciones en su resultado.

En la figura 30 se observa células con la presencia de halo y cola, esto se obtuvo con las

variaciones mencionadas anteriormente.

A B

76

Figura 30. Células con presencia de halo y cola.

En la figura se observa celulas en la presencia de halo y cola, sin embargo cabe señalar que

las condiciones de electroforesis depende del tipo de célula y el daño que se espera encontrar.

Revisíon bibliografica sobre variantes geneticas del cancer de tiroides.

En la siguiente tabla 12 se presenta investigaciones relevantes a variantes genéticas en

cáncer de tiroides, genes, polimorfismos, exones entre otros en varias poblaciones a nivel mundial.

77

Tabla 12. Revisión bibliográfica de variantes genéticas en el cáncer de tiroides.

Autor, revista, año

País Tipo de estudio

Población Resultados Conclusiones

Pérez, G Universitat Autònoma de Barcelona 2006

España Descriptivo 458 pacientes adultas.

Gen XRCC1, polimorfismo Arg280His, gen TG polimorfismo.

El polimorfismo Arg280His de XRCC1 se asoció con un incremento del riego de cáncer de tiroides. Mutaciones en el gen TG son relevantes en la neoplasia de tiroides.

Acquaviva, G et al., Histopathology, 2018

Italia Bibliográfico ---------------- Alteraciones en gen BRAF pV600E, mutaciones puntales en RAS y oncogén RET-PTC.

Las alteraciones moleculares son biomarcadores útiles para el diagnóstico y posibles objetivos de tratamiento del carcinoma de tiroides.

Wohlk, N. Rev Méd Chile 2005

Chile Descriptivo 50 pacientes portadores de CMT y 50 personas sanas.

Similitud en alelos G691S, L769L y S904S en los dos grupos de estudio. Sobre expresión del polimorfismo S836S en cáncer medular de tiroides.

Los polimorfismos G691S, L769L y S834S no son relevantes en el cáncer medular de tiroides en la población chilena.

78

Autor, revista, año

País Tipo de estudio

Población Resultados Conclusiones

Madrigal, P. et al. Revista Médica México, 2015

México Descriptivo 159 pacientes

Polimorfismo PD1134A del gen TJP1 está presente en los pacientes con cáncer de tiroides en población mexicana con ascendencia zapoteca.

El polimorfismo PD1134A del gen TJP1 es un marcador en la población mexica y se asocia en la neoplasia de tiroides.

Rodríguez, J. Sciendo, 2018.

México Bibliográfico ---------------- Activación de oncogenes RAS, BRAFF y RET/PTC.

El cáncer de tiroides es una enfermedad poli genética resultado de la interacción de varios factores genéticos como polimorfismos o mutaciones.

Fang, Yi, et al. Cellular Physiology and Biochemistry, 2018

China Descriptivo 11 pacientes con cáncer de tiroides papilar

Los genes alterados con mayor frecuencia son, BRAF, RAS y p53.

La vía de señalización del p53 está involucrada en la progresión y tumorigénesis en el cáncer papilar de tiroides.

Peralta, N. Universidad Politécnica Salesiana Sede Quito 2015

Ecuador 50 pacientes con cáncer de tiroides

Los polimorfismos Arg1980Trp y Ser734Ala del gen TG no se encuentran en relación con la progresión de la enfermedad en la población ecuatoriana.

La variante genética Ser734Ala tiene mayor probabilidad de presentar cáncer de tiroides papilar.

79

Capítulo V: Discusión

En los últimos años, investigaciones han demostrado que la raza o etnia es de gran

impacto en la incidencia, la supervivencia y la respuesta a fármacos en el cáncer. Guerrero (2018) ,

menciona que pese a la influencia de la etnia en el cáncer y en la calidad de la atención médica,

este aspecto no se aborda en la investigación oncológica.

Demostrando que, en modelos oncológicos derivados de pacientes, el 48% no tiene

registro de su donante en relación con la etnia; el 37.6% proviene de blancos, de asiáticos el 10% y

de afroamericanos e hispanos un 4.4%. El cáncer de tiroides crece alarmantemente a nivel

mundial, sin embargo, no existe información en Latinoamérica, y esta neoplasia ocupa el primer

lugar entre mujeres en la región.

Salazar, (2019), en su investigación menciona que durante 16 años (2001 – 2016) en

Ecuador se reportaron 23 632 casos y 1539 muertes por cáncer de tiroides con 96 muertes por

año. El país presenta la tasa más alta de cáncer de tiroides, es una enfermedad frecuente, pero

con una tasa de mortalidad baja. En Ecuador la tasa de incidencia es de 165 casos por 100 000

habitantes según The Global Cancer Observatory perteneciente a la Organización Mundial de la

Salud (OMS), el carcinoma de tiroides en el país tiene una incidencia de 19%, 40.9% son mujeres

de acuerdo con datos del Instituto Ecuatoriano de Estadística y Censos (INEC).

80

Corral, (2018), menciona en su investigación que desde 1985 hasta 2013 la neoplasia de

tiroides es más frecuente en mujeres con una tendencia a aumentar, de 10 a 35 en los últimos 10

años, el cáncer de tiroides más frecuente es el papilar, esto se confirma con Sierra, (2016),

concluye que este cáncer está aumentando rápidamente en los países de Latinoamérica y el

cáncer tiroideo papilar fue el más diagnosticado en Ecuador, Colombia, México, Perú y Panamá.

Lortet et al., (2019), confirma que existen tasas muy altas de cáncer de tiroides en país de ingresos

medios o bajos, y una tasa de mortalidad baja, sin embargo, existe un sobrediagnóstico de esta

neoplasia.

En la década de los 50’s Sajiro Makino, Albert Levan y George Klein en su investigación

demostraron que en líneas celulares cancerígenas son propensas a ser mitóticamente inestable y

encontraron números cromosómicos altamente variables.

El análisis citogenético de enfermedades neoplásicas es importante para su diagnóstico y

tratamiento adecuado y temprano. Desde aproximadamente el 2015 Roman, (2017), menciona

que se trata de mitigar el sobrediagnóstico en el alarmante crecimiento de la incidencia del cáncer

de tiroides para realizar un mejor diagnóstico y tratamiento. La Agencia Internacional para la

investigación del Cáncer menciona que, en Australia, Francia, Italia y EE. UU. en los últimos 30

años del 70 al 80% de pacientes con cáncer papilar de tiroides es sobrediagnósticos. Marzo y Vela,

(2018), menciona que en Latinoamérica en el periodo de 2003-2007 el 90% de los casos de cáncer

papilar de tiroides fueron sobrediagnóstico.

81

Albert Levan en la década de los cincuenta descubrió el efecto de la colchicina como una

sustancia capaz de inhibir la división celular (Tamar et al., 2008), el Colcemid es un análogo

sintético de la colchicina que inhibe la mitosis. En la tabla 11 se establece las variaciones que se

obtuvieron en el tiempo de incubación de Colcemid, Howe et al., (2014), menciona que varios

pasos en el ensayo son cruciales para obtener metafases de alta calidad y cromosomas bien

dimensionados y con una morfología adecuada, con un tiempo de incubación de 25 minutos se

observaron cromosomas largos y no definidos como se observa en las figuras 18 y 19, lo que

concuerda con Howe en su investigación ya que tiempos de incubación insuficientes producen

cromosomas largos y no definidos, y presencia de pocas metafases.

En la figura 20, se observan una metafase con cromosomas cortos en un tiempo de

incubación de 60 minutos, Huacuja, (2005), menciona que esto se debe a que tiempos de

incubación largos con Colcemid producen metafases superpuestas con cromosomas cortos y

gruesos que son difíciles de analizar.

Uno de los aspectos más importantes en el bandeo GTG es tiempo de exposición a la

solución de tripsina, en la investigación de Hwang, (2013), una exposición prolongada a tripsina da

cromosomas hinchados y bandas gruesas, en las figuras 22, 23 y 24 se observa cromosomas

gruesos y con bandas no definidas lo que concuerda con la investigación previa mencionada, ya

que su tiempo de exposición a tripsina fue de 45s. Tiempos de exposición cortos a tripsina

producen bandas con poco contraste e indistinguibles, (Villaverde, 2000), el tiempo de exposición

a tripsina varía dependiendo de la muestras y las condiciones de recolección.

82

Se obtuvo bandas claras y definidas con un tiempo de exposición de 45.5 s a la solución de

tripsina y un tiempo de tinción de 2.50 s en Giemsa con se observa en las figuras 25, 26 y 27; el

ángulo en el que se coloca la sedimento celular resuspendido debe ser de 45 °C ya que así se da

una extensión adecuada en la placa, Novillo, (2010), menciona que la placa debe estar a 45° y se

debe colocar la muestra desde lo más alto posible; para lograr una buena dispersión en la placa y

obtener metafases no superpuestas con se observa en la figura 28.

Los ensayos y pruebas citogenéticas son de suma importancia en la investigación

oncológica, específicamente el análisis cariotípico ya que se puede evidenciar alteraciones

cromosómicas como la transformación de una célula normal a una célula maligna, Muñeton y

Ramírez, (2002), mencionan que la citogenética del cáncer se ha especializado en identificar los

cambios numéricos y estructurales de cromosomas en diferentes neoplasias.

Realizar un buen cariotipo de una neoplasia hoy en día es esencial para un diagnóstico

temprano y pronóstico favorable para el paciente, el cariotipaje permite establecer alteraciones

cromosómicas que sirven de biomarcadores en varios tipos de cáncer. Becerra y Bautista, (2020),

corroboran que la estandarización de las técnicas de cariotipaje, específicamente, la técnica de

bandeo GTG permite la diferenciación y organización de los cromosomas de manera más efectiva.

Actualmente estamos expuestos a agentes físicos y químicos que afectan al ADN, las

pruebas de genotoxicidad son herramientas útiles para determinar daño y alteraciones en el

material genético, una de las pruebas más utilizadas es el ensayo cometa (Murillo, 2019).

Collins (2004), Azqueta y colaboradores (2013), mencionan que la sensibilidad y

especificidad del ensayo cometa depende de las cantidad de muestras analizadas y el daño que se

espera encontrar, sin embargo, mencionan que se compara con la hibridación in situ con

florescencia (FISH) con una sensibilidad del 100% y especificidad del 98.9%.

83

El ensayo de electroforesis alcalina de células individuales embebidas en microgel, o

ensayo cometa es un ensayo simple, sencillo, económico y rápido que se puede aplicar a tipo de

células para medir y determinar rupturas de cadena de ADN (Ansoar-Rodríguez, Fontanetti, &

Christofoletti, 2015); Gonzáles, (2004), menciona que este ensayo consiste en analizar

individualmente células que son sometidas a una lisis y a electroforesis, durante esta

electroforesis los fragmentos de ADN migran hacia el ánodo formando una cola.

El cáncer es una enfermedad multifactorial con tasas de mortalidad e incidencia altas,

Prieto, (1999), menciona en su investigación que establecer los niveles de daño al ADN en

individuos y poblaciones es importante para establecer el riesgo de sufrir cáncer y existen muchas

pruebas y ensayos para determinarlo pero con un costo elevado ya que a mayor sensibilidad,

mayor costo y el ensayo cometa es una prueba rápida, de bajo costo y más sensible que permite

determinar roturas de simple cadena y sitios lábiles. Siendo presentado como una nueva prueba

de diagnóstico temprano, con confiabilidad del 98% y sensibilidad del 75%, lo que se corrobora

con el estudio de Fracasso, et al., (2004).

Una de las variables que afectan a este ensayo es la concentración y las capas de agarosa

en la placa, se colocaron al inició del ensayo 2 capas de agarosa lo que ocasiono ruido de fondo,

Zuñiga (2009), en su investigación menciona que las capas de agarosa tanto NMP (0.6%) como

LMP (0.5%) aseguran un soporto estable para la manipulación de la células y obtener mínimo

ruido en la visualización, lo que corrobora nuestros resultados. La aplicación de una sola capa

obtuvo menos ruido de fondo.

84

La capa de agarosa LMP que contiene las células, se aplicaron dos diluciones obteniendo

pocas células en una mayor cantidad de agarosa, Razo (2011), establece que esto se debe a que en

aproximadamente 10 µl de muestra están presentes 10 000 células y al mezclarlas con una mayor

cantidad de agarosa no se visualiza un mayor número de células en la placa. Si se utiliza una mayor

cantidad de células se dificulta la visualización ya que puede existir células superpuestas.

Otra variable importante en el bioensayo cometa es la fase de lisis celular, Murillo (2019),

menciona que no es necesario añadir DMSO a la solución de lisis, sin embargo, en nuestro ensayo

se evidencio que se debe añadir 1 hora antes a la solución de lisis. En investigaciones antes

mencionadas, se corrobora que el uso de DMSO en el ensayo es para minimizar el daño causado

por los iones de hierro en la lisis de los eritrocitos. Esto corrobora Zúñiga (2009) en su

investigación menciona que el DMSO previene el daño en el ADN inducido por la oxidación.

El tiempo en la fase de electroforesis es otra variante importante en el ensayo cometa, el

tiempo, amperaje y voltaje depende del tipo de muestra a analizar. Se realizó una electroforesis

alcalina ya que se puede observar mayor daño en el ADN, Rodríguez (2016) menciona que la

electroforesis alcalina es conocida como el método Sing ya que emplea un pH > 13 y detecta

rupturas de simple y doble cadena de ADN y sitios alcalinos lábiles.

85

En la electroforesis del ensayo cometa se usa voltajes bajos ya que solo se necesita migrar

milímetros para obtener movilización del ADN y por lo tanto formación del cometa o cola en la

célula, Zúñiga (2009), establece que las condiciones óptimas de voltaje, amperaje y tiempo de

electroforesis depende de la migración de grupos controles y el rango de migración en la célula

tratada. Las condiciones originales descritas por Sing son de 25V, 300 mA y 20 minutos, estas

condiciones también son descritas en la mayoría de los estudios, pero tanto el tiempo de

electroforesis puede variar dependiendo del tipo de célula que se esté analizando como el daño

que se quiera detectar. Dhawan, (2007), usó un tiempo de electroforesis de 30 minutos y obtuvo

células con cometas definidos y menciona que la migración difiere para cada tipo de célula. Hable

de la calidad de la muestra y qu eno es invasiva

Una característica importante en la progresión del cáncer es la capacidad de las células

tumorales para evitar su destrucción, Ferrarri (2019), menciona que en un ambiente tumoral las

células inmunes secretan citocinas y quimicionas proinflamatorias que aumentan la proliferación

de células tumorales; el patrón molecular que generan las quimicionas y citocinas son un punto

clave en la biología del cáncer. Un conocimiento más amplio en las variantes genéticas en el

cáncer de tiroides es un objetivo importante de estudio ya que permite establecer nuevas

estrategias terapéuticas.

Por su parte, Khatami y Tavangar (2018), mencionan que es necesario comprender la

patología molecular del cáncer de tiroides y el papel que ocupa las vías de señalización y

reordenamientos cromosómicos en la progresión de esta enfermedad. En la revisión bibliográficas

encontramos que Pérez (2006), estudio en una población española con cáncer de tiroides

polimorfismos genéticos relacionados con esta neoplasia; los polimorfismos representan

alrededor del 80% de las variantes en una secuencia y estos puedes afectar genes que regulan el

metabolismo, ciclo celular y reparación del ADN.

86

En el cáncer de tiroides los polimorfismos no han sido explorados y no se conoce la posible

influencia de estos en la susceptibilidad de la enfermedad, el gen XRCC1 está involucrado en la

reparación de roturas de simple cadena e interactúa con otras proteínas de reparación, el

polimorfismo Arg280His no ha sido estudiado en este gen con relación al cáncer de tiroides sin

embargo en estudios relacionados con cáncer de pulmón se encontró que los individuos con este

polimorfismos tuvieron un 80% más de riesgo. En cáncer de vejiga y esófago se encontró que esta

variante incremente el riesgo de padecer la enfermedad, sin embargo no está claro si este

polimorfismo influye en el cáncer de tiroides, Pérez (2006), menciona que en la población

española se encontró este polimorfismo y se puede asociar con riesgo a padecer cáncer de

tiroides; cabe recalcar que en el estudio se menciona que los resultados en otra población son

diferentes y no se puede concluir que este polimorfismos esté presente a nivel mundial, por su

zona geográfica por su raza o etnia.

El desequilibrio hormonal en la glándula tiroides es una de las principales causas de

desarrollar enfermedades en esta, las variantes del gen TG puede ocasionar alteraciones

estructurales y funcionales en la proteína, se asocian con enfermedades autoinmunes. En la

investigación de Pérez, (2006), el polimorfismo Gln2511Arg se encontró que incrementa la

susceptibilidad de desarrollar cáncer de tiroides en la población estudiada.

En Ecuador, Peralta (2012), analizo en 50 pacientes con cáncer de tiroides los

polimorfismos Ser734Ala y Arg1980Trp del gen TG; estos polimorfismos interfieren en la síntesis

de cisteína y son aceptores de yodotirosina y cambios en estos podrían predisponer a patologías

de la glándula tiroides. Peralta (2012), no encontró relación entre estas variantes genéticas y la

progresión de cáncer de tiroides diferenciado, sin embargo, no se acepta por completo esta

hipótesis ya que la variante Ser734Ala tiene una mayor probabilidad de presentarse en otros tipos

de cáncer de tiroides.

87

Acquaviva (2018), en su investigación menciona que el la mutación más común en el gen

BRAFF es p.V600E, esta mutación está presente en 90% de los casos de cáncer papilar de tiroides y

es un potente marcador para su diagnóstico. La mutación p.V600E es un evento tumorogénico

temprano que induce la perdida de diferenciación y promueve la progresión del cáncer.

El oncogén RET está asociado con la exposición a la radiación ya se ambiental o

terapéutica, está presente en el 80% de los cánceres de tiroides en su mayoría en el papilar,

Acquaviva (2018), menciona que reordenamientos del oncogén RET se encontraron en pacientes

expuesto a altos niveles de radiación esto concuerda con Rodríguez y Zerón (2019), que

mencionan que RET/PTC conduce a una proliferación celular descontrolada y los reordenamientos

de este oncogén están relacionados a factores ambientales como la exposición a radiación.

El desarrollo y la progresión del cáncer papilar de tiroides esta relaciona con la

acumulación de alteraciones genéticas, Fang y colaboradores (2018), encontraron en su estudio

que el gen BRAF está presente en el 54,5% de casos de PTC ya que es la mutación más común en

este tipo de cáncer y sus variaciones activan la progresión agresiva; además relaciona los

oncogenes RAS y p53. La vía de señalización del p53 tiene un papel importante en la regulación de

la proliferación celular, el ciclo celular y la apoptosis, en el estudio antes mencionado se concluye

que alteraciones en la vía del p53 promueve la tumorigénesis en el cáncer folicular de tiroides.

88

Wohllk y colaboradores (2005), establecen que mutaciones del oncogén RET predominan

en un 50% en el PTC, en investigaciones previas encontraron similitudes en los alelos G691S, L769L

y S904S en cancer de tiroides en poblaciones alemanas y estadounidenses; en su estudio en la

población chilena encontraron estas similitudes en 8 de 9 pacientes estudiados. Sin embargo, en

Polonia, Italia y Francia no se ha encontrado relación de estos polimorfismos con el cáncer de

tiroides, Wohllk (2005), concluye que estas variantes alélicas no cumplen un rol como factor de

riesgo en la neoplasia de tiroides.

89

Capítulo VI: Conclusiones

El tiempo de incubación en Colcemid es un punto clave en la estandarización del protocolo

de cariotipaje, tiempos insuficientes producen menos extensiones de metafases y cromosomas

superpuestos y largos y tiempos de incubación largos darán como resultados cromosomas cortos y

gruesos difíciles de analizar. El tiempo óptimo en este ensayo fue de 40 minutos obteniendo

cromosomas claros y diferenciados. La preparación de la placa es fundamental para una extensión

correcta, se debe colocar el portaobjetos inclinado con un ángulo de 45° y colocar la micropipeta

lo más alto posible para que exista una dispersión correcta de los cromosomas. La exposición a

tripsina es un aspecto importante en el bando GTG, se obtuvo bandas claras y definidas con un

tiempo de exposición a tripsina de 45.5 s.

El ensayo cometa es una prueba que permite determinar el daño en el ADN, es una prueba

rápida, sensible y de bajo costo. La preparación de los portaobjetos es importante, colocar en

etanol al 70% a -20°C 24 horas antes del ensayo permita una buena adherencia de la capa de

agarosa NMP al portaobjetos. Añadir DMSO 1 hora antes a solución de lisis y llevarla a -4°C antes

del ensayo, el DMSO minimiza el daño causado por los iones del hierro en la lisis de los eritrocitos.

El factor de mayor influencia en el ensayo cometa es la fase de electroforesis, las condiciones

óptimas de voltaje, amperaje y tiempo de electroforesis depende de la migración de grupos

controles. Las condiciones usadas fueron 25V, 300 mA y 30 minutos.

Las variantes genéticas en el cáncer de tiroides permiten establecer nuevas dianas

terapéuticas para un diagnóstico temprano y oportuno. Los oncogenes BRAF, RAS, RET y las

alteraciones moleculares están relacionados en la progresión del cáncer de tiroides.

90

Capítulo VII: Recomendaciones

Para evitar ruido en la observación de las placas en el ensayo cometa, se puede usar

mayor tiempo en la fase de neutralización y usar una sola capa de agarosa NMP, calentar la

agarosa minutos antes de su uso y mantenerla en la estufa.

Se debe mantener la cámara de electroforesis dentro del enfriador y evitando la luz,

colocar las placas en la cámara evitando espacios y colocar las soluciones de neutralización y

electroforesis a -4°C hasta su uso. Colocar los portaobjetos en la estufa antes del ensayo para una

mejor adherencia de la muestra.

Preparar soluciones nuevas de tripsina y giemsa en cada ensayo para evitar ruido de fondo

en la visualización. Es preferible usar muestras frescas para obtener mejores resultados. El

cariotipaje es una herramienta útil, se la puede usar para determinar o confirmar enfermedades

neoplásicas.

Se recomienda realizar después de estos ensayos pruebas para marcadores moleculares

específicos como BRAF, RET, TG para confirmar el diagnóstico.

91

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Anexos