Obtencion de Acido Citrico a Partir de Suero de Leche Por ... · producción de ácido cítrico en...

OBTENCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO A PARTIR DE SUERO DE LECHE POR FERMENTACIÓN EN CULTIVO LÍQUIDO

ADRIANA LORENZA BETANCOURT GARCÉS

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE INGENIERIA Y ARQUITECTURA

INGENIERÍA QUÍMICA MANIZALES

2003

OBTENCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO A PARTIR DE SUERO DE LECHE POR FERMENTACIÓN EN CULTIVO LÍQUIDO

ADRIANA LORENZA BETANCOURT GARCÉS

Trabajo de grado en la modalidad de proyecto final Para optar el título de Ingeniera Química

Director OSCAR JULIÁN SÁNCHEZ TORO

Ingeniero Químico M. Sc. en Biotecnología

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE INGENIERIA Y ARQUITECTURA

INGENIERÍA QUÍMICA MANIZALES

2003

iv

Nota de aceptación

__________________________________ __________________________________ __________________________________ __________________________________

_________________________________ Jurado

_________________________________

Jurado

Manizales, Enero de 2003.

v

A Dios por darme la oportunidad de llegar hasta esta etapa de mi vida. A mi familia por su apoyo incondicional durante mis años de estudio. A todas las personas que de un modo u otro colaboraron para que este logro se hiciera realidad.

vi

AGRADECIMIENTOS

Le agradezco especialmente al Laboratorio de Microbiología General de la

Universidad de Caldas por su disponibilidad absoluta al permitirme hacer uso de

su espacio, material y equipos, como también al Laboratorio de Suelos de la

misma institución.

También hago extensivo este agradecimiento al Ingeniero Químico Oscar Julián

Sánchez coordinador de la Línea de Investigación en biotecnología de la Facultad

de Ingeniería de la Universidad de Caldas y a su grupo de trabajo por confiar en

mi la realización de esta parte del proyecto de investigación al cual pertenece este

trabajo.

Al National Center for Agricultural Utilization Research de Estados Unidos por

facilitarnos las cepas empleadas en estado liofilizado cuando fueron requeridas

durante la investigación.

A los Laboratorios de Química y Procesos Productivos de la Universidad Nacional

de Colombia sede Manizales por permitirme hacer uso de sus instalaciones y

equipos para la realización de la etapa de biosíntesis de ácido cítrico y análisis de

muestras.

A la Industria lechera de Manizales Celema por facilitarnos el suero de leche

necesario para la investigación.

vii

CONTENIDO

Pág.

INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 17

1. OBJETIVOS ................................................................................................................... 19

1.1. OBJETIVO GENERAL ................................................................................................. 19

1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................ 19

2. MARCO TEÓRICO ......................................................................................................... 20

2.1. ANTECEDENTES ........................................................................................................ 20

2.2. CONTAMINACIÓN DE LA INDUSTRIS LÁCTEA ........................................................ 24

2.3. MICROORGANISMOS COMO CATALIZADORES ..................................................... 27

2.3.1. Factores que influyen en el crecimiento microbiano ................................................. 28

2.3.2. Generalidades de los hongos del género Aspergillus ............................................... 30

2.4. SUERO DE LECHE ..................................................................................................... 32

2.4.1. Definición .................................................................................................................. 32

2.4.2. Composición ............................................................................................................. 32

2.4.3. Tratamiento del lactosuero ....................................................................................... 34

2.4.3.1. Extracción de proteínas del suero ......................................................................... 35

2.4.3.2. Determinación del punto isoeléctrico ..................................................................... 35

2.4.3.3. Método térmico para la concentración de proteínas del lactosuero ...................... 35

2.4.4. Usos del lactosuero .................................................................................................. 37

2.4.5. Fermentación del lactosuero ..................................................................................... 38

2.4.5.1. Producción de alcohol ............................................................................................ 39

2.4.5.2. Producción de enzimas .......................................................................................... 40

2.4.5.3. Producción de proteína unicelular ......................................................................... 41

2.4.5.4. Producción de levadura de panadería ................................................................... 42

2.4.5.5. Producción de ácidos orgánicos ............................................................................ 43

2.4.5.6. Otros productos ..................................................................................................... 44

2.5. MATERIAS PRIMAS .................................................................................................... 44

2.5.1. Lactosa ..................................................................................................................... 45

2.5.2. Licor de maceración de maíz .................................................................................... 46

2.6. ÁCIDO CÍTRICO .......................................................................................................... 48

viii

2.6.1. Características .......................................................................................................... 48

2.6.2. El ciclo de los ácidos tricarboxílicos o del ácido cítrico ............................................. 50

2.6.3. Obtención de ácido cítrico ........................................................................................ 50

2.6.3.1. Medio de fermentación .......................................................................................... 51

2.6.3.1.1. Azúcar ................................................................................................................. 52

2.6.3.1.2. Nitrógeno ............................................................................................................ 53

2.6.3.1.3. pH ....................................................................................................................... 53

2.6.3.1.4. Elementos traza .................................................................................................. 53

2.6.3.1.5. Aireación ............................................................................................................. 54

2.6.3.2. Procesos de producción ........................................................................................ 54

2.6.3.2.1. Producción del inóculo ........................................................................................ 54

2.6.3.2.2. Procesos en superficie ........................................................................................ 55

2.6.3.2.3. Procesos sumergidos ......................................................................................... 56

2.6.3.2.4. Producción de ácido cítrico por Aspergillus niger ............................................... 58

2.6.3.2.5. Producción de ácido cítrico por Candida lipolytica utilizando hidrolizado de

dátiles y suero de leche ...................................................................................... 60

2.6.2.2.6. Producción de ácido cítrico por Aspergillus niger con suero de leche

permeado ............................................................................................................ 61

2.7. CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN ........................................................................... 61

2.7.1. Modelos de formación de biomasa ........................................................................... 63

2.7.2. Modelos de formación de producto ........................................................................... 66

2.7.3. Modelos de consumo de sustrato ............................................................................. 67

3. METODOLOGÍA ............................................................................................................. 69

3.1. PREPARACIÓN DE LAS CEPAS ................................................................................ 69

3.1.1. Reconstitución de la cepa ......................................................................................... 70

3.1.2. Mantenimiento de la cepa ......................................................................................... 71

3.1.3. Preservación de la cepa ........................................................................................... 73

3.2.DISEÑO DEL MEDIO ÓPTIMO DE FERMENTACIÓN ................................................. 73

3.2.1. Prediseño experimental ............................................................................................ 74

3.2.1.1. Etapa de adaptación .............................................................................................. 74

3.2.1.2. Etapa de producción .............................................................................................. 76

3.2.2. Diseño experimental para el Aspergillus carbonarius NRRL 368 ............................. 77

3.2.2.1. Preparación de la cepa de Aspergillus carbonarius NRRL 368 ............................. 77



3.2.3. Diseño experimental para el Aspergillus carbonarius NRRL 67 ............................... 81

3.2.3.1. Preparación de la cepa de Aspergillus carbonarius NRRL 67 ............................... 81

ix



3.2.4. Diseño experimental para el Aspergillus niger NRRL 3 ............................................ 82

3.2.4.1. Preparación de la cepa de Aspergillus niger NRRL 3 ........................................... 82



3.3. BIOSÍNTESIS DE ÁCIDO CÍTRICO ............................................................................ 84

3.3.1. Determinación de las curvas biocinéticas ................................................................. 87

3.3.2. Modelamiento de la cinética de fermentación ........................................................... 88

4. ANÁLISIS DE RESULTADOS ........................................................................................ 89

4.1. PREPARACIÓN DE LA CEPA ..................................................................................... 89

4.1.1. Reconstitución de la cepa ......................................................................................... 89

4.1.2. Mantenimiento de la cepa ......................................................................................... 89

4.2. DETERMINACIÓN DEL MEDIO ÓPTIMO DE FERMENTACIÓN ............................... 92

4.2.1. Prediseño experimental ............................................................................................ 92

4.2.2. Diseño experimental para el Aspergillus carbonarius NRRL 368 ............................. 93

4.2.2.1. Preparación de la cepa .......................................................................................... 93

4.2.2.2. Etapa de adaptación ............................................................................................. 94


4.2.3. Diseño experimental para el Aspergillus carbonarius NRRL 67 ............................... 97




4.2.4. Diseño experimental para el Aspergillus niger NRRL 3 ............................................ 101




4.3. BIOSÍNTESIS DE ÁCIDO CÍTRICO ............................................................................ 105

4.3.1. Modelamiento de la cinética de la fermentación ....................................................... 109

4.3.1.1. Planteamiento del modelo ..................................................................................... 109

4.3.1.2. Determinación de los parámetros cinéticos ........................................................... 111

4.3.1.3. Solución del modelo ............................................................................................... 114

5. CONCLUSIONES ........................................................................................................... 117

6. RECOMENDACIONES ................................................................................................... 120

BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 123

ANEXOS ............................................................................................................................. 127

x

LISTA DE TABLAS Pág.

Tabla 1. Empresas productora de ácido cítrico .................................................................. 22

Tabla 2. Sectores consumidores de ácido cítrico ............................................................... 23

Tabla 3. Usos del ácido cítrico por sectores ....................................................................... 24

Tabla 4. Contribución de la DBO5 de efluentes lácteos ...................................................... 25

Tabla 5. Carga orgánica por producto fabricado en industrias lácteas ............................... 27

Tabla 6. Composición promedio de la leche, subproductos y desagües expresado en

mg/L ..................................................................................................................... 33

Tabla 7. Composición del lactosuero fresco ....................................................................... 34

Tabla 8. Principales procesos industriales para la obtención de proteína unicelular a

partir de suero ....................................................................................................... 41

Tabla 9. Composición del grano de maíz en base seca ..................................................... 47

Tabla 10. Condiciones que favorecen la producción de ácido cítrico ................................. 51

Tabla 11. Composición de la solución nutritiva para un cultivo en superficie ..................... 56

Tabla 12. Clasificación de la fermentación según Gaden ................................................... 62

Tabla 13. Composición del caldo de cultivo Czapeck ......................................................... 71

Tabla 14. Composición del medio de adaptación sintético 1 .............................................. 75

Tabla 15. Composición del medio de adaptación sintético 2 .............................................. 75

Tabla 16. Descripción de las cepas fúngicas con cada uno de los medios de cultivo

empleados .......................................................................................................... 90

Tabla 17. Condiciones de crecimiento de las cepas fúngicas en medios sólidos .............. 91

Tabla 18. Concentración de ácido cítrico (g/L) arrojada durante el prediseño

experimental ...................................................................................................... 92

Tabla 19. Concentración de azúcares reductores totales (g/L) y concentración de

proteína (g/L) para sueros antes de la fermentación con las diferentes cepas... 95

Tabla 20. Determinación de ácido cítrico (g/L) en suero fermentado por Aspergillus

carbonarius NRRL 368 ....................................................................................... 96


carbonarius NRRL 67 ......................................................................................... 99

Tabla 22. Determinación de ácido cítrico (g/L) en suero fermentado por Aspergillus niger

xi

NRRL 3 ............................................................................................................... 103

Tabla 23. Resultados de la prueba LSD para las concentraciones de ácido cítrico

obtenidas con el Aspergillus niger NRRL 3 ........................................................ 105

Tabla 24. Datos experimentales promedio de la formación de biomasa, consumo de

sustrato y producción de ácido cítrico en un cultivo sumergido por lotes de

Aspergillus niger NRRL 3 ...................................................................................

106

Tabla 25. Condiciones para realizar la fermentación de ácido cítrico en cultivo

sumergido a partir de suero de leche ................................................................ 116

xii

LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura 1. Consumo de ácido cítrico por destino ................................................................. 23

Figura 2. Estructura de la lactosa ....................................................................................... 45

Figura 3. El ciclo de los ácidos tricarboxílicos y sus productos sintetizados en exceso en

hongos ................................................................................................................ 52

Figura 4. Curva típica de un cultivo por lotes ...................................................................... 63

Figura 5. Montaje utilizado durante el diseño experimental ................................................ 76

Figura 6. Montaje realizado para filtrar las muestras antes de ser analizadas .................. 77

Figura 7. Montaje del biorreactor Applikon para la fermentación del ácido cítrico con A.

niger NRRL 3 ....................................................................................................... 86

Figura 8. Vista superior del Aspergillus carbonarius NRRL 368 cultivado en medio agar

Czapeck Malta modificado .................................................................................. 94

Figura 9. Vista inferior del Aspergillus carbonarius NRRL 368 cultivado en medio agar


Figura 10. Concentración de ácido cítrico en cada uno de los tratamientos de suero con

Aspergillus carbonarius NRRL 368 .................................................................... 97






Aspergillus carbonarius NRRL 67 ...................................................................... 100

Figura 14. Vista superior del Aspergillus niger NRRL 3 cultivado en medio agar

Sabouraud ......................................................................................................... 102

Figura 15. Vista inferior del Aspergillus niger NRRL 3 cultivado en medio agar

Sabouraud ......................................................................................................... 102

Figura 16. Vista del medio de adaptación ........................................................................... 102


Aspergillus niger NRRL 3 .................................................................................. 104

Figura 18. Datos experimentales de la formación de biomasa, consumo de sustrato y

xiii

producción de ácido cítrico en cultivo sumergido por lotes de Aspergillus

niger NRRL 3 .................................................................................................... 107

Figura 19. Datos experimentales del consumo de proteína durante la fermentación en

cultivo sumergido para la producción de ácido cítrico con Aspergillus niger

NRRL 3 .............................................................................................................. 108

Figura 20. Determinación de los parámetros de la ecuación logística que modela la

formación de biomasa ....................................................................................... 111

Figura 21. Determinación del parámetro de la ecuación que modela el consumo de

sustrato............................................................................................................... 112

Figura 22. Determinación del parámetro de la ecuación que modela la producción de

ácido cítrico ........................................................................................................ 113

Figura 23. Simulación de la fermentación para la producción de ácido cítrico con

Aspergillus niger NRRL 3 ................................................................................... 115

Figura 24. Simulación del producto en la fermentación para la producción de ácido

cítrico con Aspergillus niger NRRL 3 ................................................................ 116

xiv

LISTA DE ANEXOS

Pág.

Anexo A. Composición de los medios sólidos .................................................................... 127

Anexo B. Tabla de datos determinación de azúcares reductores totales en sueros

después de la fermentación con Aspergillus carbonarius NRRL 368 .................. 129

Anexo C. Tabla de datos determinación de azúcares reductores totales en sueros

después de la fermentación con Aspergillus carbonarius NRRL 67 ................... 130

Anexo D. Tabla de datos determinación de azúcares reductores totales en sueros

después de la fermentación con Aspergillus niger NRRL 3 ................................. 132

Anexo E. Tabla de datos determinación de proteína en sueros después de la

fermentación con Aspergillus carbonarius NRRL 368 ......................................... 134

Anexo F. Tabla de datos determinación de proteína en sueros después de la

fermentación con Aspergillus carbonarius NRRL 67 .......................................... 135

Anexo G. Tabla de datos determinación de proteína en sueros después de la

fermentación con Aspergillus niger NRRL 3 ....................................................... 137

Anexo H. Manual de manejo del test enzimático para la determinación de ácido cítrico ... 139

Anexo I. Determinación cuantitativa de proteína por el método de Biuret ......................... 152

Anexo J. Determinación cuantitativa de azúcares reductores totales utilizando ácido

dinitrosalicílico ...................................................................................................... 154

Anexo K. Biorreactor Applikon ............................................................................................ 156

Anexo L. Determinación de la concentración de biomasa .................................................. 159

Anexo M. Ficha técnica de la enzima MAXILACT DMS ..................................................... 160

Anexo N. Fotos de los diferentes tipos de suero después de la fermentación con

Aspergillus niger NRRL 3 .................................................................................... 164

Anexo Ñ. Fotos del biorreactor durante la fermentación con Aspergillus niger NRRL 3 .... 166

xv

RESUMEN

Uno de los problemas de la producción de derivados en el sector lácteo es el

aumento de la cantidad de suero de leche que se vierte a los cursos de agua.

Como es bien sabido, el suero de leche posee un contenido en proteínas bastante

alto, que para ser degradadas requiere un gran consumo de oxígeno haciendo que

la DBO5 de las aguas residuales de la industria lechera aumente progresivamente.

Este trabajo tiene como propósito presentar un método que permita convertir el

suero de leche en una materia prima que genere, por medio de un proceso

fermentativo, productos de alto valor agregado como lo es el ácido cítrico.

Para llevar a cabo el proceso fermentativo, se empleó el suero que sale de la

planta productora de queso de la Industria Celema (Manizales), que fue tratado de

cuatro maneras diferentes para luego ser fermentado con las cepas Aspergillus

niger NRRL 3, Aspergillus carbonarius NRRL 368 y Aspergillus carbonarius NRRL

67, buscándose con esto encontrar las condiciones que dieran el mejor

rendimiento de producción de ácido cítrico.

Con los resultados obtenidos en esta parte de la investigación, se realizó una

fermentación en un microfermentador de 3 litros para encontrar la cinética que rige

el proceso fermentativo.

xvi

ABSTRACT

One of the problems in the production of milk is the increase of whey. As we all

know, whey has a high percentage of proteins that in order to be break down it

requires a high intake of oxigen makin the DBO5 of the remaining water of the milk

industry to grow progessively.

This job has as a purpose to present a method that facilitates the conversion of

whey in raw material that generates through a fermented process products of high

value such as citric acid.

To put in practice the fermented process, Celema’s serum from the cheese factory

plant of Manizales, was used and treated in four different ways. To be fermented

later with stumps Aspergillus niger NRRL 3, Aspergillus carbonarius NRRL 368,

Aspergillus carbonarius NRRL 67, with the purpose of finding out the best

conditions in the production of citric acid.

With the results obtained in this part of the job a fermentation was realized in a

microfermentator of three liters to find out the kinetics that rules the fermentation

process

17

INTRODUCCIÓN

La biotecnología se ha constituido como uno de los campos de la actividad

científico – técnica de mayor desarrollo y aplicación en la actualidad. La

biotecnología se refiere a la aplicación de bioagentes en la producción de bienes y

servicios. Particularmente, los hongos son capaces de transformar de diferentes

materiales en productos de alto valor agregado como son los ácidos orgánicos en

general, y el ácido cítrico en particular.

El ácido cítrico es el ácido orgánico más usado en el campo de los productos

alimenticios y farmacéuticos. Su buen sabor y la facilidad con que es asimilado

favorecen su utilización como ingrediente ácido para mantener u obtener un pH

conveniente y hacer resaltar el sabor de una extensa variedad de productos.

Además de la industria alimenticia y farmacéutica, se usa en la limpieza y

pulimiento del hierro y el acero, como componente en ciertas soluciones ferrosas

para galvanoplastia, en el acondicionamiento y tratamiento de aguas residuales,

en la preparación de resinas alquídicas, pinturas y lacas, y en el estampado de

telas.

La fermentación de soluciones azucaradas por mohos, la extracción del jugo de

limones y limas y la extracción del jugo de los residuos de piña en las fábricas de

conservas son los tres métodos más importantes para la fabricación del ácido

cítrico.

Con este trabajo se aporta a la Línea de Investigación en Biotecnología industrial

de la Facultad de Ingeniería de la Universidad de Caldas. Se pretende plantear

18

otra alternativa de proceso para la obtención del ácido cítrico, que permita obtener

un producto de buena calidad implementado nuevas fuentes de producción

aprovechables, como es el caso del suero de leche. El suero de leche es un

subproducto contaminante de la industria de alimentos, el cual mediante su

fermentación, posibilita la obtención de productos de valor agregado como el ácido

cítrico, reduciendo el impacto ambiental negativo debido a la gran cantidad de

DBO que genera su vertimiento a los cursos de agua al contener niveles

considerables de lactosa, proteínas y minerales.

El ácido cítrico se biosintetiza mediante un proceso de fermentación con diferentes

microorganismos que puedan asimilar la lactosa contenida en el suero, o la

glucosa producida a partir de la lactosa hidrolizada enzimáticamente.

La realización de este trabajo posibilitará el futuro desarrollo de procesos menos

contaminantes, el menor vertido de suero a ríos y lagos, la disminución del índice

de eutrofización de los cursos de agua y un mejoramiento del entorno en el área

de influencia de empresas del sector lácteo, constituyéndose en un estudio

preliminar que conlleve al desarrollo y/o adaptación de tecnologías acordes al

medio para la obtención industrial de diferentes insumos de alto valor agregado.

19

1. OBJETIVOS

1.1. OBJETIVO GENERAL Estudiar la obtención de ácido cítrico a partir de suero de leche por fermentación

con cuatro cepas de Aspergillus.

1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Acondicionar las cepas de microorganismos más adecuadas para la

producción de ácido cítrico a partir de suero de leche.

Formular el medio de cultivo más adecuado con base en suero de leche para la

producción de ácido cítrico.

Determinar los parámetros cinéticos y las condiciones de operación del cultivo

sumergido para la obtención de ácido cítrico.

20

2. MARCO TEÓRICO

2.1. ANTECEDENTES

La producción de ácido cítrico por fermentación a escala comercial ha constituido

un gran progreso dentro del campo de la microbiología industrial: al mismo tiempo

que independizaba a los países desarrollados en el abastecimiento de este

producto ha modificado notablemente el comercio mundial de ácido cítrico y citrato

cálcico.

El ácido cítrico fue aislado por Scheele en el año 1784 del zumo de limón, en

forma de sólido cristalizado. Luego se sintetizó a partir de glicerol y de otros

compuestos químicos, para finalmente desde 1923 obtenerse por fermentación,

utilizando microorganismos que crecían sobre la superficie de los cultivos.

Wehmer en 1893 fue el primero en describir al ácido cítrico como un producto de

la fermentación por mohos. Dos de estos, que él designó como Citromyces

pfefferianus y Citromyces glaber (clasificados por Thom como penicilios),

producían el ácido a partir de soluciones nutritivas de sacarosa que contenían

carbonato cálcico. Más tarde, Wehmer dio a conocer la formación de ácido cítrico

por Penicillium luteum y Mucor piriformis, aunque creía que los aspergilos negros

solo producían ácido oxálico. Su descubrimiento condujo a extensos estudios de

los factores que influyen sobre la producción micológica del ácido cítrico, las

diversas cepas de mohos capaces de producirlo y el mecanismo por el cual se

21

forma una sustancia de cadena ramificada partiendo de compuestos azucarados

de tipo lineal (24).

En 1917, Currie, del Departamento de Agricultura de Estados Unidos, publicó los

resultados de una importante investigación sobre la producción de ácido cítrico por

una variedad de Aspergillus niger. Doelger y Prescott, en 1934, corroboraron los

resultados de Currie, contribuyendo con sus aportes al conocimiento de esta

fermentación (24).

En 1933, la producción mundial superó las 10.000 toneladas, de las cuales, más

del 80% se obtuvieron por fermentación. Inicialmente se utilizaron métodos de

cultivo en superficie con Aspergillus niger. Después de la segunda guerra mundial

se introdujeron procesos de cultivo sumergido también con A. niger y

aproximadamente en 1977 se comercializó un proceso de cultivo sumergido con

levaduras del género Candida. Con la sustitución de los polifosfatos por el citrato

de sodio en los detergentes en 1970, el mercado anual creció rápidamente (28).

La producción de ácido cítrico ha crecido notablemente en el presente siglo.

Actualmente, la capacidad instalada mundial es de 750.000 t/año, con una

producción real de 550.000 t/año. El ácido cítrico se fabrica en más de 20 países.

La Unión Europea, Estados Unidos y China reúnen el 88% del total mundial.

Recientemente, se observó un aumento importante en la capacidad productiva de

Europa Oriental y del Lejano Oriente, particularmente en China, la cual produce

proporcionalmente menor volumen de ácido cítrico de alta calidad, es decir,

purificado y refinado. Sin embargo, la capacidad de elaboración del producto crudo

representa el 24% del total mundial. La Unión Europea incrementó su elaboración

ubicándose primera en el ranking mundial debido, fundamentalmente, a su uso

como materia prima para la fabricación de detergentes biodegradables.

Se estima que la demanda de Estados Unidos, en el último quinquenio, creció

según una tasa cercana al 7% anual. Este crecimiento se relaciona con la

22

expansión de la industria de alimentos y bebidas. Las primeras firmas productoras

a nivel mundial son Bayer y ADM, cada una con el 17% del mercado

aproximadamente. Le siguen Jungunzlauter, Cargill y Citrique Belge (que produce

más de 300 toneladas de ácido cítrico diariamente). En Tabla 1, se detallan

algunas importantes firmas elaboradoras de ácido cítrico (29):

Tabla 1. Empresas productoras de ácido cítrico.

Compañía Localización Capacidad total (tn/año)

Miles Inc. EEUU, Brasil, México, Colombia 120.000 Chas Pfizer EEUU, Irlanda 115.000 A.G. Junbunzlauer Chemische fabrik

Austria, Alemania, Francia, Indonesia

100.000

Citrique Belge Bélgica 60.000 Biacor Italia 28.000 John Sturge Reino Unido 25.000 Cargill EEUU 25.000 AKTIVA República Checa 15.000 Gadot Israel 12.000

Fuente: www.alimentosargentinos.gov.ar/0-3/revistas/r_12/12_06_citrico_htm

Así mismo, países como China (50.000 t), Indonesia (25.000 t), Rusia (22.000 t),

India (10.000 t), Eslovaquia (4.500 t), Turquía (4.500 t) y Tailandia (4.000 tn),

cuentan con plantas pequeñas que permiten elaborar en algunos casos un total

significativo de toneladas de ácido cítrico.

La expansión de la demanda mundial de ácido cítrico se debe, fundamentalmente,

a su utilización como aditivo en la industria de alimentos y bebidas. Por ejemplo,

en Estados Unidos este sector demanda el 72% del total. A principios de la

década del 90´, el producto se destinaba a distintas industrias. El consumo de

ácido cítrico en el mundo crece a razón de 5-8% anual y la tendencia parece

mantenerse estable. A continuación se puede observar tanto en la Tabla 2 como

en la Figura 1, el consumo de ácido cítrico por sectores y su crecimiento anual.

23

Tabla 2. Sectores consumidores de ácido cítrico.

SECTOR CONSUMIDOR CRECIMIENTO ANUAL PORCENTUAL

Alimentos y Bebidas 5-8 Fármacos 2-3 Detergentes 6-7 Limpiadores de Metales s/d Productos Textiles s/d Cosméticos 2-3 Otros 9-10


Figura 1. Consumo de ácido cítrico por destino.

Fuente: www.alimentosargentinos.gov.ar/0-3/revistas/r_12/12_06_citrico_htm El uso que cada uno de los sectores consumidores de ácido cítrico da a éste

producto se describe en la Tabla 3.

24

Tabla 3. Usos del ácido cítrico por sectores.

SECTOR USO Bebidas Saborizante y regulador del pH; incrementa la

efectividad de los conservantes antimicrobianos Dulces y Conservas Acidulante y regulador del pH para lograr una

óptima gelificación Caramelos Acidulante y regulador del pH con el objetivo de

alcanzar la máxima dureza de los geles Verduras Procesadas En combinación con ácido ascórbico, previene la

oxidación Alimentos Congelados Ayuda a la acción de los antioxidantes; inactiva

enzimas previniendo pardeamientos indeseables; inhibe el deterioro del flavor y el color

Frutas y Hortalizas Enlatadas Disminuye el pH; al actuar como quelante; previene la oxidación enzimática y la degradación del color, resalta el sabor.

Aceites y Grasas Previene la oxidación Confitería y Repostería Se utiliza como acidulante, resaltador de sabores y

para optimizar las características de los geles Quesos Pasteurizados y Procesados

En forma de sal, como emulsificante y texturizante

Lácteos Estabilizante en cremas batidas Productos de la Pesca Para bajar el pH en presencia de otros

conservantes o antioxidantes


2.2. CONTAMINACIÓN DE LA INDUSTRIA LÁCTEA La industria láctea representa un importante sector dentro de la industria

alimentaria y su contribución material en términos de contaminación de las aguas

receptoras es significativo, lo que hace necesario y obligatorio el tratamiento

previo de sus desechos líquidos antes del vertimiento. El caudal producido por la

industria láctea depende del consumo de agua en la planta procesadora y este

depende de la naturaleza de los productos fabricados y varía de una fábrica a otra.

25

Las aguas residuales de estas industrias están constituidas esencialmente por

residuos de leche, productos lácteos diluidos y productos de limpieza como

detergentes, ácidos y álcalis fuertes. Los principales constituyentes orgánicos en

los residuos de la leche son sus sólidos naturales: grasa de la leche emulsionada,

lactosa y proteínas (caseína y lactoalbúmina), sales y oligoelementos. A menudo

también contiene sacarosa.

Las sustancias orgánicas de los efluentes de industrias lácteas provienen de los

productos desechados y en menor grado de los productos de limpieza y desagües

sanitarios. La importancia de cada una de las fuentes contaminantes se observa

en la Tabla 4.

Tabla 4. Contribución de la DBO5 de efluentes lácteos.

DESECHOS Kg DBO/L (equivalente en leche

procesada)

PORCENTAJE PRESENTE EN LOS EFLUENTES

Leche, productos lácteos y otros materiales orgánicos

3,0

94

Productos de limpieza 0,1 3 Desinfectantes Despreciable - Lubricantes Despreciable - Residuos sanitarios 0,1 3 Fuente: BAENA, Sandra et. al. Aguas residuales de la industria láctea: Naturaleza y composición de las aguas residuales. Revista Ambiente y Desarrollo, 1994, p. 85

El suero como subproducto proviene de la coagulación de la leche durante la

fabricación de quesos. Es un líquido compuesto principalmente de agua, materia

grasa, lactosa, proteínas, vitaminas y minerales. Constituye además el problema

más difícil de resolver con respecto al tratamiento de las aguas residuales de la

industria láctea y se estima que entre el 60 y 70 % de la carga orgánica total de los

efluentes industriales corresponde a suero (7).

26

La Demanda Biológica de Oxígeno (DBO), que en los efluentes industriales tiene

una variación media diaria entre 40 y 10.000 mg/L, y la DQO de los desagües de

la industria láctea varían en gran medida en función de los productos fabricados,

porque se requiere de diferentes cantidades de oxígeno para la oxidación de los

diferentes constituyentes de la leche como grasas, carbohidratos y proteínas. La

relación DBO/DQO en efluentes crudos varía de 0,07 a 1,03 con un valor

promedio aproximado de 0,57. De acuerdo con Nemerow (1971), la leche entera

presenta una DBO de 110.000 mg/L y la leche descremada un valor de 80.000

mg/L, donde aproximadamente 45 kilos de leche entera producen 4,5 kilos de

DBO. En la Tabla 5 se especifica la carga orgánica producida por productos

fabricados en la industria láctea (6).

En cuanto al pH, el valor de éste en los desechos in natura varía entre 4,2 y 9,2,

sin embargo según monitoreos realizados en desechos lácteos se han observados

valores entre 2,0 y 12,9 con un valor promedio de 7,5. Estas aguas residuales

tienen la tendencia a volverse ácidas muy rápidamente por la fermentación de la

lactosa que se transforma en ácido láctico, principalmente en ausencia de oxígeno

disuelto y el pH bajo resultante puede causar la precipitación de la caseína. Los

vertidos de las plantas de producción de queso son especialmente ácidos por la

presencia del suero (7).

La concentración de sólidos en suspensión varía en función de las operaciones

industriales y los valores oscilan entre 400 y 2.000 mg/L. En general, las aguas

residuales del procesamiento de la leche contienen poca materia en suspensión a

excepción de los desagües de la fabricación de quesos y sus efectos

contaminantes son casi enteramente debidos a la demanda de oxígeno que se

impone a la corriente receptora.

27

Tabla 5. Carga orgánica por producto fabricado en industrias lácteas.

Tipo de proceso kg DBO por 1.000 kg de leche (variación)

Kg “ equivalente” variación promedio

Estación receptora 0,02 – 1,13 0,28 Estación receptora (carga) 0,86 Mantequilla 0,19 – 1,91 0,86 Ricota 1,30 – 42,00 14,64 Queso natural 0,30 – 4,04 2,00 Helados 1,90 – 21,04 5,54 Leche condensada 0,18 – 13,30 3,67 Leche deshidratada 0,40 – 13,50 6,06 Suero condensado 0,27 – 0,31 0,29 Suero seco 3,40 – 57,20 22,33 Fuente: BAENA, Sandra et. al. Aguas residuales de la industria láctea: Naturaleza y composición de las aguas residuales. Revista Ambiente y Desarrollo, 1994, p. 88

La contaminación producida por estas aguas residuales se caracteriza por la

presencia de lodos negros con fuertes olores a ácido butírico, causado por la

descomposición de la caseína. Sin embargo, el suero constituye el problema más

difícil de resolver con respecto al tratamiento, debido a la dificultad que constituye

su rápida degradación por los métodos biológicos comúnmente usados. En cada

caso el problema debe ser analizado cuidadosamente, ya que según el tipo de

queso producido se obtendrá un suero con características diferentes (7).

2.3. MICROORGANISMOS COMO CATALIZADORES

La actividad catalítica de los microorganismos se manifiesta como su capacidad

para convertir sustratos en productos de alto valor agregado. A este proceso se le

denomina fermentación.

Durante la fermentación, una pequeña cantidad de microorganismos crece y se

multiplica tomando nutrientes del medio en donde se encuentran. Los

28

microorganismos al desarrollarse forman una serie de sustancias como resultado

de su metabolismo. La formación de estas sustancias, así como la transformación

de los nutrientes, se lleva a cabo a través de una compleja red de reacciones

bioquímicas, catalizadas todas ellas por enzimas. Por lo anterior, se pueden

considerar las células como biocatalizadores.

2.3.1. Factores que influyen en el crecimiento microbiano. Las funciones de

los microorganismos se ven modificadas por las sustancias químicas y

condiciones físicas de su medio ambiente tales como: temperatura, actividad del

agua, presión hidrostática, pH, entre otras.

a) Temperatura: La temperatura es uno de los factores más importantes a tener

en cuenta, ya que influye en la proliferación y vida de los microorganismos

afectándose en cualquiera de los sentidos. Cuando se aumenta la temperatura,

las reacciones enzimáticas y químicas se aceleran, aumentando su

crecimiento, pero las proteínas, ácidos nucleicos y otros componentes

celulares se inactivan o se destruyen irreversiblemente por su sensibilidad. Es

por esto, que los microorganismos presentan temperaturas mínimas por debajo

de la cual no hay proliferación, y temperaturas óptimas en la que el crecimiento

es más rápido.

b) Necesidades hídricas: Todos los microorganismos requieren agua para vivir.

La cantidad de ella varia según el ambiente, pero su disponibilidad no depende

solo de su contenido, sino que es una función compleja de factores de

adsorción y solución.

c) Actividad del agua: La actividad del agua se relaciona con la presión de vapor

de agua en el aire sobre una solución o sustancia. Cuando un microorganismo

se encuentra en un medio con baja actividad de agua, éste debe realizar un

29

trabajo para poder obtener agua de dicho medio; este gasto energético hace

que se reduzca la velocidad de crecimiento del microorganismo.

d) pH: El pH es un factor esencial para el crecimiento de los microorganismos, es

por eso que se determinan el pH mínimo, óptimo y máximo. La mayoría de las

especies crecen a valores casi neutros, pero algunas se ven muy favorecidas

por una reacción ácida, aunque muy pocas especies pueden crecer a valores

de pH menores de dos o mayores de 10.

e) Potencial de óxido reducción: En las diferentes reacciones biológicas de los

microorganismos, hay que tener en cuenta el aprovechamiento del oxígeno del

aire.

f) Presión osmótica: En la membrana celular que es permeable y permite el paso

de agua y algunas moléculas, el microorganismo establece un equilibrio con su

medio, estableciéndose una presión osmótica (variable según el tipo de

microorganismo).

g) Oxígeno: El oxígeno además de ser una sustancia vital para los organismos

respiratorios, es también capaz de formar derivados tóxicos aún para los

organismos que lo respiran y necesitan (el peróxido de hidrógeno es uno de

ellos). Sin embargo, los microorganismos han desarrollado enzimas que los

destruyen, tal es el caso de la catalasa y la peroxidasa.

El conocimiento de lo anterior ayuda a explicar la distribución de los

microorganismos en los alimentos y hace posible diseñar métodos para controlar

las funciones microbianas o destruir organismos que puedan alterar un producto

deseado (21).

30

2.3.2. Generalidades de los hongos del género Aspergillus. Los hongos

constituyen un complejo y fascinante grupo de organismos tan grande que se

calculan más de 300.000 especies. Los hongos mejor conocidos por todos son los

macroscópicos, denominados también setas o champiñones, con tamaño, forma y

color de lo más variado (5). Los hongos del género Aspergillus se dan en gran

variedad de hábitats en tierra, en productos almacenados, en productos

alimenticios y en vegetación decaída. Son abundantes en la región tropical y

subtropical ya que son hábiles para florecer en situaciones de baja humedad y

altas temperaturas.

Los hongos tienen como característica común la ausencia de clorofila, por tanto no

pueden realizar fotosíntesis y deben nutrirse de materias orgánicas ya elaboradas.

Pueden descomponer organismos muertos o sus productos y obtener el nutriente

de otros organismos vivos o huésped.

Las características fundamentales de los hongos son:

Todos son heterótrofos por lo que tienen que alimentarse de materia orgánica

preformada que utilizan como fuente de carbono y de energía.

Son eucariotas, es decir, presentan núcleo diferenciado con membrana bien

organizada.

Tienen una pared celular formada por quitina. Esta pared es rígida, por lo que

no pueden fagocitar alimentos sino absorben nutrientes simples y solubles que

obtienen al desintegrar polímeros mediante enzimas extracelulares llamadas

despolimerasas.

La estructura fúngica consta de un complejo llamado talo o micelio, que a su

vez está constituido por múltiples filamentos o hifas (hyphomycetes o mohos)

(5).

Estructuralmente el hongo Aspergillus consta de un conidióforo, una vesícula,

métulas, fiálides y conidias. Las hifas son multinucleadas, el conidióforo se

31

desarrolla de una hifa vertical, a partir de una célula horizontal llamada célula pie.

Sobre la vesícula pueden desarrollarse las metulas y las fialides, formando una

segunda capa. Las fiálides pueden crecer directamente sobre la superficie de la

vesícula. Los hongos del género Aspergillus son hongos filamentosos que se ven

influenciados en su crecimiento y biosíntesis por factores extrínsecos como agua,

temperatura, pH y composición gaseosa del medio (5, 33).

Para su identificación cuando crecen en medios como agar de malta o Czapeck,

las colonias se presentan extendidas, con colores que van desde el blanco al

amarillo verdoso o al café maduro o negro, ocasionalmente dominadas por

esclerotias duras, blancas al principio, transformándose a café maduras o negras

con el tiempo y alcanzando un tamaño entre 400 – 700 micras. Las cabezas

conidiales son típicamente radiadas, separadas por varias columnas, a veces poco

definidas.

Los conidióforos son paredes gruesas, incoloras, ordinariamente rugosas con 1

mm de largo y 10 – 20 micras de diámetro por debajo de la vesícula. Las vesículas

jóvenes son alargadas, transformándose de subglobosas a globosas en el tiempo

y presentan fialides de 6,5 x 103 – 5 micras.

Los hongos deben encontrar en los medios de cultivo lo necesario para su

crecimiento y desarrollo: materias nitrogenadas como la peptona, azúcares como

glucosa o maltosa que son indispensables, un soporte sólido como la gelosa que

permite a los hongos filamentosos desarrollar el micelio aéreo con hongos de

fructificación, un pH más ácido (de 5 a 6) es más conveniente (5).

Por si mismos, los hongos sirven como alimento o se utilizan en la elaboración de

otros: pan, vino, cerveza y quesos Roquefort y Cammembert. Se usan para

producir salsa de soya, fermentar la mandioca o yuca y producir tapioca. Se

emplean en procesos industriales como la producción de ácido cítrico. También

sirven para elaborar antibióticos como la penicilina, las cefalosporinas,

32

griseofulvina y ácido fusídico, así como hormonas y enzimas. Por sus usos en la

industria se ha desarrollado mucho la ingeniería genética (5).

2.4. SUERO DE LECHE 2.4.1. Definición. El lactosuero suero de leche es el líquido claro de color

amarillo verdoso, color debido al pigmento de la lactoflavina o vitamina B2, que

resulta de la coagulación de la leche durante la elaboración del queso. Tiene una

densidad un poco superior a la densidad del agua. Frecuentemente posee todos

los componentes de la leche con excepción de la caseína y un poco menos de

grasa, posee un sabor ligeramente ácido, bastante agradable. Se obtiene tras la

separación de las caseínas y de la grasa. Representa alrededor del 90% del peso

de la leche utilizada para la elaboración del queso. Contiene entre el 6% y el 6,4%

de extracto seco, es decir, la mitad de la materia seca de la leche (3).

Según el procedimiento utilizado para separar la cuajada del queso (coagulación

ácida o coagulación enzimática), se obtiene lactosuero dulce o lactosuero ácido. El

empleo de uno u otro procedimiento de separación de la cuajada del queso va a

determinar también una diferente composición del lactosuero. El lactosuero

industrial, que es otra variedad, se obtiene coagulando las proteínas por la adición

de otros ácidos como el ácido clorhídrico, sulfúrico o acético (25).

2.4.2. Composición. La composición del suero de leche varía dependiendo de

las características de la leche y de las condiciones de elaboración del queso de

que proceda, pero en términos generales se puede decir que el suero contiene

4,9% de lactosa, 0,9% de proteína cruda, 0,6% de cenizas, 0,3% de grasa, 0,2%

de ácido láctico y 93,1% de agua. Aproximadamente el 70% del nitrógeno total

(proteína cruda), corresponde a proteína verdadera, la cual tiene un valor nutritivo

33

superior al de la caseína, y está compuesta por la β-lactoglobulina, la α-

lactoalbúmina, las inmunoglobulinas, la proteosa-peptona y las enzimas nativas; el

resto lo forman aminoácidos, urea, creatina, amoníaco y ácidos nucleicos (15). En

la Tabla 6 se relaciona la composición de la leche y sus productos.

El contenido de grasa depende del que tuviera la leche empleada. Si el contenido

de grasa del lactosuero es superior al 0,1% se debe desnatar. La nata obtenida se

transforma en mantequilla o se utiliza para normalizar el contenido de grasa de los

quesos. En la Tabla 7 se presenta una descripción de la composición del

lactosuero cuando es dulce y ácido.

Tabla 6. Composición promedio de la leche, subproductos y desagües, expresado en mg/L.

Leche entera

Leche descremada

Suero de mantequilla

Suero Suero separado

Sólidos totales 125.000 82.300 77.500 72.000 54.772 Sólidos orgánicos 117.000 74.500 68.800 64.400 49.612 Cenizas 8.000 7.800 8.700 8.000 5.160 Sólidos solubles 54.656 Sólidos suspendidos 116 Azúcar de leche 45.000 46.000 43.000 44.000 Caseína 38.000 39.000 36.000 8.000 Nitrógeno orgánico total 1.300 Amoníaco libre 31 Sodio 648 Potasio 1.000 Calcio 350 Magnesio 78 Fósforo 450 D.B.O. 102.500 73.000 64.600 32.000 30.100 Oxígeno consumido 37.750 32.200 28.600 25.900 Grasas 36.000 1.000 5.000 4.000 Fuente: BAENA, Sandra et. al. Aguas residuales de la industria láctea: Naturaleza y composición de las aguas residuales. Revista Ambiente y Desarrollo, 1994, p. 88

34

Tabla 7. Composición del lactosuero fresco

Suero dulce Suero ácido Agua 93 – 94 % 94 – 95 % Extracto seco 6 – 7 % 5 – 6 % Lactosa 4,5 – 5 % 3,8 – 4,2 % Ácido láctico TRAZAS Hasta 0,8 % Proteínas 0,8 – 1 % 0,8 – 1 % Ácido cítrico 0,15 % 0,1 % Cenizas 0,5 – 0,7 % 0,7 – 0,8 % Valor de pH 6,45 Alrededor de 5

Fuente: SPREER, E. Lactología industrial. Editorial Acribia. 1991, p. 528

2.4.3. Tratamiento del lactosuero. Para tratar el suero de leche se recomienda

su enfriamiento a 7oC (o un poco menos) si se va a trabajar a dos horas de su

obtención o temperaturas de 4oC para conservaciones de más tiempo (mayores

de 24 horas), y se aconseja un desnatado previo cuando se tiene un contenido

graso mayor a 0,1%, evitando así su descomposición.

Según E. Spreer también se recomienda la adición de peróxido de hidrógeno

(0.2% en peso), como preservativo para tiempos mayores de 10 días. Éste actúa

como un desinfectante evitando la proliferación de microorganismos. El uso de

peróxido de hidrógeno no está permitido en la mayoría de los países, al actuar

éste como oxidante de los componentes de los alimentos. Por esto se plantea la

adición de sulfito de sodio o magnesio a un 0,5% (26).

El proceso de filtración del lactosuero no es necesario, ya que las miscelas de

caseína que permanecen en solución son muy pocas. Sin embargo debido al

contenido de grasa y a los tratamientos en la elaboración de queso y a elementos

no deseables para el tratamiento del lacto suero se hace útil hacerlo y así evitar

una posible contaminación.

35

2.4.3.1. Extracción de las proteínas del suero. Durante la elaboración del

queso se hace coagular la leche mediante la adición de cuajo. Con ello la leche se

descompone en dos partes: una masa semisólida compuesta de caseína, y un

líquido que es el suero de leche. Este lactosuero contiene 0,8% de proteínas

(albúminas y globulinas), aproximadamente un 20% de la cantidad total de

proteínas de la leche.

La separación de las proteínas del lactosuero puede realizarse por diferentes

procedimientos (físicos o químicos) de separación:

a) Separación por filtración: En la filtración se establece una diferencia de presión

que hace que el fluido fluya a través de poros pequeños que impiden el paso,

de las partículas sólidas las que a su vez, se acumulan sobre un medio filtrante

como torta porosa.

b) Separación por precipitación (método térmico): Es una separación física

usando un medio térmico, precipitando las proteínas debido a su

desnaturalización.

c) Separación por centrifugación: Es la filtración que se asemeja a la filtración

ordinaria, en la que un lecho se acumula y se utiliza la fuerza centrífuga para

provocar una diferencia de presión (22).

2.4.3.2. Determinación del punto isoeléctrico. Existe un determinado valor de

pH característico para cada uno de los aminoácidos y proteínas (en consecuencia

una propiedad que lo identifica) en el que los aminoácidos y proteínas

permanecen en la forma de ion dipolar o de neutralidad eléctrica.

Las proteínas son compuestos polielectrolíticos cuyas cargas dependen del valor

del pH del medio circundante. Debido al carácter iónico de las proteínas, el ajuste

36

del pH hasta el punto correspondiente a una carga neta igual a cero, denominado

punto isoeléctrico de la proteína, determina una solubilidad mínima y la posible

precipitación de la proteína, siendo este punto donde la solución alcanza la

mínima viscosidad.

Para la mayoría de los diversos tipos de lactosuero, existen diferencias marcadas

en el contenido proteico, por lo tanto en el punto isoeléctrico. Esto es debido al

origen, la forma del cuajado y las practicas tradicionales con las que se obtiene

(21).

2.4.3.3. Método térmico para la concentración de proteínas del lactosuero. Las moléculas de las proteínas sufren fácilmente alteraciones sustanciales al

variar las condiciones físicas y/o químicas del medio que las rodea.

Cuando una proteína soluble se calienta a altas temperaturas (mayores a 60oC) en

una solución neutra o ligeramente ácida, se produce un precipitado (coagulación o

desnaturalización por calor) que no se disuelve cuando se deja enfriar. Como

consecuencia la proteína nativa pierde sus estructuras originales sufriendo una

especie de desdoblamiento o despliegue.

La mayoría de las proteínas son estables en un reducido intervalo de pH, por fuera

del cual la proteína se desnaturaliza al producirse cambios en las cargas de los

grupos R, presentándose una modificación de la estructura física o intramolecular,

más no de la estructura química. Por tal razón, el pH del medio tiene gran

importancia en los fenómenos de desnaturalización de las proteínas.

Muchos investigadores coinciden en que el proceso de calentamiento es el más

simple y el de mayor rendimiento en la precipitación de las proteínas del

lactosuero, proponiendo unos intervalos de pH y temperatura muy parecidos entre

37

sí, y las diferencias entre los mismos dependen únicamente de las características

del suero (14).

2.4.4. Usos del lactosuero. El suero de leche forma parte de un gran número de

alimentos. Los reglamentos de Alimentos y Drogas permiten utilizar el lactosuero

en polvo en el pan, helado, queso fundido, charcutería y rellenos de carne, de

pescado y de pollo. También se utiliza en muchos alimentos no normalizados,

como caramelos, dulces, pasteles, etc.

Una forma de usar el lactosuero en polvo es mezclarlo con otros ingredientes para

preparar sustitutos lácteos con fines específicos. Por ejemplo se pueden añadir al

lactosuero proteínas de origen animal, vegetal o incluso lácteas, para conseguir

una mezcla con unas propiedades funcionales determinadas según la aplicación

prevista. Ejemplos de estas mezclas son:

- Lactosuero en polvo y caseinato con un contenido proteico del 20, 25 o 30%

para galletería y charcutería.

- Lactosuero en polvo, caseinato y proteínas de lactosuero, para helado

- Lactosuero en polvo y proteína de soja, para pasteles.

- Lactosuero en polvo y leche desnatada en polvo, para helado.

También se utiliza el lactosuero para producir biomasa como material proteico y en

forma líquida en la alimentación animal de porcinos, bovinos, etc., tal como se

obtiene después de su acidificación natural. Además, constituye la materia prima

para la obtención de otros subproductos importantes como la lactosa y las

proteínas del lactosuero (3).

También se produce alcohol etílico utilizando Saccharomyces fragilis o Torula

cremoris; bebidas de suero alcohólicas y no alcohólicas; mantequilla bien sea

desnatándolo mecánicamente o arrastrando las albúminas mediante un proceso

38

térmico. La cantidad de mantequilla obtenida es de mediana calidad y poca

productividad. El lactosuero es también empleado en la elaboración de queso

(requesón).

2.4.5. Fermentación del lactosuero. El suero de leche es un excelente medio

de cultivo ya que se compone aproximadamente en un 70% de lactosa que es la

principal fuente de carbono, por lo que se utiliza como sustrato para la obtención

de un buen número de productos obtenidos a través de fermentación.

Al ser la lactosa un disacárido se puede limitar su uso a ciertos microorganismos,

pero existe la posibilidad de hidrolizarla en sus componentes glucosa y galactosa

para aumentar las probabilidades de implementar microorganismos capaces de

transformar estos monosacáridos en productos fermentados. Sin embargo, el

suero no contiene mucho nitrógeno inorgánico que pueda ser utilizado por los

microorganismos, por lo cual, frecuentemente es necesario añadirle sales de

amonio. Por otra parte, el contenido de proteínas es relativamente alto; debido a

ello es un excelente medio para microorganismos que requieran aminoácidos y

sean capaces de hidrolizar las proteínas.

El lactosuero puede fermentarse directamente o fraccionarse antes de la

fermentación. Los posibles sustratos fermentables son:

a) El lactosuero crudo.

b) El permeato resultante de la ultrafiltración.

c) La melaza resultante de la cristalización de la lactosa.

d) El suero residual resultante del procedimiento Centri-Whey. Este procedimiento

ofrece la posibilidad de reintegrar las proteínas desnaturalizadas por el calor al

proceso de producción de queso.

39

La acidez de estos sustratos debe ajustarse antes de la fermentación al valor de

pH que sea favorable para le crecimiento de los microorganismos añadidos. Pocas

levaduras, si se exceptúa a Saccharomyces fragilis, son capaces de fermentar

directamente y de una forma rentable, desde el punto de vista económico, la

lactosa. El empleo de un cultivo mixto de levaduras y bacterias (por ejemplo, de

lactobacilos y de levaduras de pan) ha demostrado ser la mejor solución para

realizar la fermentación del suero. En una primera fase las bacterias fermentan la

lactosa a ácido láctico hasta alcanzar un valor de pH de 4,5-5,0. Por adición de

ácidos inorgánicos como el H2SO4 se puede bajar el pH hasta 2, creando

condiciones todavía más favorables para el crecimiento de las levaduras. En una

segunda fase las levaduras consumen el ácido haciendo que el pH ascienda

paulatinamente hasta un valor de 6,5. Simultáneamente se autolisan (se

disuelven) las células bacterianas muertas y de esta forma sirven como alimento

adicional para las levaduras. Todo el proceso de fermentación dura de 10 a 60

horas (25).

2.4.5.1. Producción de alcohol. Los primeros estudios realizados en la

producción de etanol a partir de suero de leche se dieron en los años treinta

utilizando levaduras capaces de fermentar la lactosa. Las especies más

empleadas que pueden fermentar este disacárido son Kluyveromyces marxianus

(antes Kluyveromyces fragilis), Kluyveromyces lactis y Candida kefyr (antes

Candida pseudotropicalis). Generalmente se utiliza suero desproteinizado bien sea

por termocoagulación o ultrafiltración.

La limitación principal de este proceso es la baja concentración de etanol que se

obtiene por la intolerancia de algunas cepas (aunque se han encontrado cepas

capaces de fermentar la lactosa con alta tolerancia al alcohol) y la baja

concentración de lactosa que genera como máximo entre 2% y 3% de etanol al

final de la fermentación. Dentro de las plantas industriales que operan en el ámbito

mundial se encuentra la Carbery en Irlanda, que procesa 600.000 litros de suero

40

sin concentrar con 4,5% de lactosa, obteniendo un caldo que en promedio

contiene 2,8% de etanol, el cual se destila para obtener 22.000 litros por día de

etanol potable. El etanol obtenido por fermentación de lactosuero se emplea en la

elaboración de bebidas alcohólicas del tipo cerveza y vinos (15).

2.4.5.2. Producción de enzimas. La enzima más importante que se ha

producido utilizando suero como sustrato es la β-galactosidasa o lactasa que

durante la década de los ochenta incrementó sus aplicaciones y volúmenes de

venta.

Los microorganismos productores de la lactasa comercial son las levaduras

Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces lactis y Candida kefyr, y los hongos

Aspergillus niger y A. oryzae. La lactasa es una enzima inducible, por lo tanto se

hace necesario producirla en un medio que contenga lactosa, por lo que el suero

es el mejor sustrato. La fermentación se realiza generalmente en suero

desproteinizado y suplementado con diversos nutrientes como sales inorgánicas

de nitrógeno, extracto de levadura, etc.

También se ha estudiado la posibilidad de producir enzimas pectoníticas de los

hongos Sclerotinia sclerotiorum y Aspergillus awamori utilizando suero como

sustrato, el primero se hizo crecer tanto en cultivo sumergido como en sustrato

sólido. Asimismo se ha reportado la producción de pectinasa de Kluyveromyces

marxianus a partir de suero en forma simultánea a la producción de proteína

unicelular, para lo cual se requiere adicionar pectina al medio como inductor; esta

enzima mostró ser adecuada para la clarificación de jugo de manzana.

Otras posibilidades son la obtención de proteasa alcalina de Bacillus subtilis en

medio de suero ácido, α-amilasa y proteasa de esta misma bacteria en un medio

de soya y suero, y enzimas celulolíticas del hongo Trichoderma lignorum en suero

diluido (15).

41

2.4.5.3. Producción de proteína unicelular. El suero ha sido ampliamente

usado como sustrato para la producción de proteína unicelular de diversos

microorganismos entre los cuales los más utilizados han sido las levaduras,

particularmente Kluyveromyces marxianus. Los principales procesos comerciales

se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8. Principales procesos industriales para la obtención de proteína unicelular a partir de suero.

Proceso Microorganismo Condición/ Observación Waldhof Viena SAV Wheast/Knudsen Amber Lab. Fromageries Bel.

C. utilis C. intermedia C. kefir, K. Marxianus K. marxianus K. marxianus K. marxianus, K. Lactis C. pintolopessi

Suero entero fermentación por lotes Suero entero Cultivo continuo 750 Ton/año Suero concentrado y desproteinizado, cultivo continuo 5.000 Ton/año Suero desproteinizado Cultivo continuo

Fuente: GARCÍA-GARIBY. Biotecnología alimentaria. Editorial Limusa. 1993, p. 202

Las condiciones generalmente utilizadas para la propagación de la levadura K.

Marxianus en suero son una temperatura entre 30 y 38 ºC, sin que la variación

realmente ejerza una influencia determinante de este rango; un pH entre 4,5 y 5,7,

aunque ocasionalmente se utilizan pH más bajos. El nitrógeno es un nutriente

limitante para la propagación, ya que solamente 25% de la concentración de este

elemento es utilizado por la K. Marxianus, por lo tanto se debe agregar un

suplemento de sales inorgánicas de nitrógeno y de vitaminas (normalmente se

emplean como fuentes adicionales de éstas extracto de levadura o licor de remojo

de maíz). No se requiere la esterilización del medio si se trabaja a un pH bajo, es

suficiente con pasteurizar el suero lo cual es muy conveniente para los procesos

industriales (15).

La principal limitación para la propagación de la levadura es el suministro de

oxígeno. Por lo común se reportan condiciones de aireación del orden de 1,3 a 2,1

42

vvm y agitaciones de 600 a 800 rpm cuando se trabaja a pequeña escala, porque

en procesos mayores los rendimientos disminuyen como consecuencia de la

imposibilidad de suministrar el oxígeno necesario; esto ocasiona la producción de

etanol, de ahí que muchos autores (Bernstein et al.) propongan su recuperación

como subproducto (15).

2.4.5.4. Producción de levadura de panadería. Aunque la melaza es la materia

prima tradicional para obtener la levadura de panadería, es posible sustituirla por

la lactosa del lactosuero, siempre que la lactosa sea previamente transformada en

una sustancia fermentable por Saccharomyces cerevisiae ya que ésta no es capaz

de utilizar la lactosa como fuente de carbono. Por esta razón se han propuesto

tres alternativas:

1. Hidrolizar la lactosa en sus monosacáridos glucosa y galactosa

2. Realizar una primera fermentación con bacterias lácticas para transformar la

lactosa en ácido láctico, el cual puede ser metabolizado por la levadura

3. Obtener a través de técnicas de ingeniería genética cepas capaces de

metabolizar el disacárido.

La fermentación de suero de leche ultrafiltrado con Streptococcus salivarius

ss.thermophilus permite la conversión de la lactosa en ácido láctico y galactosa, ya

que esta bacteria metaboliza sólo la parte de glucosa del disacárido; ambos

metabolitos pueden ser utilizados por cepas de S. Cerevisiae con adecuadas

características panarias. Esta estrategia es mejor que la transformación de toda la

lactosa en ácido láctico con otras especies de bacterias lácticas, ya que un exceso

de ácido láctico y la ausencia de un azúcar en el medio de cultivo resultan en una

levadura con inadecuadas características fermentativas.

Alternativamente cabe la posibilidad de utilizar como levaduras de panificación a

especies capaces de metabolizar la lactosa, como K. Marxianus. Algunas cepas

43

de esta especie han mostrado tener una adecuada capacidad para producir

bióxido de carbono (en particular a bajas actividades de agua), una adecuada

capacidad leudante en masa panaria y adecuadas características organolépticas

del pan resultante (15).

2.4.5.5. Producción de ácidos orgánicos. Un uso industrial importante e

implementado hace años del suero de leche es la obtención de ácido láctico a

partir de una fermentación con bacterias lácticas. Las especies más importantes

para esta fermentación son Lactobacillus delbrueckii ss.bulgaricus y Lactobacillus

delbrueckii ss.delbrueckii y recientemente se ha empezado a utilizar Lactobacillus

helveticus. Esta fermentación se realiza normalmente con suero desproteinizado y

entre un 85 y 90% de la lactosa se convierte a ácido láctico en solo 24 horas (15).

La producción de ácido acético se lleva a cabo realizando primero una

fermentación alcohólica y posteriormente una fermentación acética aeróbica; las

concentraciones obtenidas en estos casos son muy bajas. Se han hecho

publicaciones en las que la producción de ácido acético se realiza mediante

fermentación anaeróbica de suero con un cultivo mixto de Lactobacillus lactis

ss.lactis y Clostridium formicoacticum; la primera bacteria transforma la lactosa en

ácido láctico y la segunda a éste en ácido acético en condiciones anaerobias, con

este sistema se obtuvieron concentraciones hasta de 20 g/L en 20 horas (15).

La producción de ácido propiónico a partir de suero de leche se realiza

generalmente utilizando la especie Propionibacterium freudenreichi ss.sheimanii,

otras especies de Propionibacterium, o mezclas de ésta con Lactobacillus sp., ya

que a las primeras les resulta más fácil asimilar el ácido láctico que la lactosa. El

principal problema de esta fermentación es la baja productividad debido al lento

crecimiento de las bacterias propiónicas y a las bajas concentraciones obtenidas.

Se han obtenido resultados más prometedores con sistemas de separación de

células por filtración para su recirculación.

44

También se ha propuesto la obtención de ácido glucónico con Gluconobacter

oxydan, pero debido a que este microorganismo es incapaz de metabolizar la

lactosa es necesario primero hidrolizarla mediante un tratamiento con β-

galactosidasa. La producción de ácido cítrico con Aspergillus niger a partir de

suero ultrafiltrado también ha sido probada (15).

2.4.5.6. Otros productos. Otros productos que pueden que pueden obtenerse

de la fermentación del suero incluyen: grasa con hongos de los géneros Penicillum

y Aspergillus y aceite de las levaduras Candida curvata y Trichosporon cutaneum,

siendo más efectiva la primera. Esta última posibilidad ha sido estudiada a nivel de

planta piloto con el fin de producir un sustituto de manteca de cacao.

Se ha propuesto la producción de glicerol con K. Marxianus en condiciones

anaeróbicas y en presencia de sulfito de sodio. También ha sido propuesta la

producción de otros compuestos químicos como: butanol y acetona en permeado

de suero mediante células libres o inmovilizadas de Clostridium acetobutylicum;

producción de metano mediante fermentaciones anaeróbicas con cultivos mixtos.

Se ha reportado la posibilidad de producir polisacáridos extracelulares con

microorganismos capaces de utilizar lactosa como fuente de carbono como

Alcaligenes viscosus y Zooglea ramigera, o bien utilizando suero con lactosa

hidrolizada, como es en el caso de Xanthomonas campestris.

También se pueden producir vitaminas como la riboflavina (vitamina B2) con

Eremothecium ashbyii y de vitamina B12 con Propionibacterium freudnreichi

ss.shermanii y otras especies de Propionibacterium (15).

2.5. MATERIAS PRIMAS

45

2.5.1. Lactosa. Se encuentra en concentración de 5%, aproximadamente, en la

leche de todos los mamíferos investigados, salvo la foca de California cuya leche

parece que contiene glucosa y no lactosa. Se ha aislado también del fruto maduro

del chicozapote (Achras zapota), árbol del que se obtiene el chicle. Se prepara

comercialmente a partir del suero de la leche (23).

La lactosa además de ser el único glucósido libre que existe en cantidad

importante en la leche es también el más abundante, más simple y más constante

en proporción. En la leche de vaca el contenido de lactosa varia poco (entre 48 y

50 g/L), lo que determina una gran confiabilidad de su presencia en el suero.

Mediante experimentos de metilación y degradación se ha establecido que su

estructura es 4-O-(β-D-galactopiranosil)-D-glucopiranosa (ver Figura 2).

Figura 2. Estructura de la lactosa.

Fuente: www.infocarne.com/comunes/imágenes/Compos1.gif

La lactosa (azúcar de la leche) es un disacárido reductor de D-galactosa y D-

glucosa, unidos mediante un enlace glucosídico β 1-4. La glucosa queda con el

carbono anomérico libre, pudiendo por lo tanto presentar las configuraciones α y β,

siendo la forma α la más abundante. Es un azúcar reductor y sufre mutarrotación,

que es el cambio gradual en la rotación especifica de una solución del

monosacárido hasta alcanzar un valor final estable.

Por hidrólisis ácida o enzimas, la lactosa produce una molécula de galactosa y una

molécula de glucosa. Si primero se oxida a ácido lactónico y luego se hidroliza, los

46

productos son galactosa y ácido glucónico. Por consiguiente, la unidad de glucosa

contiene la parte reductora de la molécula (23).

La degradación de la lactosa se logra cuando se alcanza los 110 – 130 ºC, donde

pierde el agua de cristalización. A los 150 ºC se torna de un color amarillento y a

los 175 ºC se oscurece y carameliza (21).

La lactosa es poco soluble en comparación al azúcar ordinario. Presenta un poder

edulcorante seis veces menor que el del azúcar (sacarosa). En la leche, éste

sabor dulce está enmascarado por la caseína. La lactosa se hidroliza por β-

galactósido y, por lo tanto, el enlace entre las porciones galactosa y glucosa se

cree ha de ser β. La hidrólisis se realiza de la siguiente forma:

C12H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6

Lactosa Agua Glucosa Galactosa

La transformación más importante de la lactosa es la de producir ácido láctico, la

cual la realizan una gran cantidad de bacterias homo y heterofermentativas. La

transformación es en realidad compleja; en general por cada 100 partes de lactosa

transformada por las bacterias, se obtienen 96 partes de ácido láctico y cuatro de

productos diversos (CO2, ácidos orgánicos, etc.).

Para la determinación de la lactosa, se han utilizado métodos como, los

colorimétricos, la reducción del licor cupro-alcalino de Fehling, la cromatografía

gaseosa, la cromatografía liquida de alta resolución (HPLC), y la

espectrofotometría.

2.5.2. Licor de maceración de maíz. Es usado como fuente de derivados

solubles de proteínas, oligoelementos y otros minerales, así como de sustancias

activadoras del crecimiento que aceleran la fermentación. El contenido óptimo de

47

licor de remojo de maíz es de 0,15% en volumen y debe contener un 40% de

sólidos suspendidos (2).

Hay más de 3.500 usos diferentes para los productos que se extraen del maíz. En

muchas ocasiones los productos finales conseguidos son más ecológicos que

otros derivados del petróleo.

Dentro de los productos que llevan derivados del maíz en sus composiciones se

tienen: jabones, geles y cosméticos con derivados de maíz en su formulación; la

mayor parte de las pastas de dientes contienen hasta un 50% de sorbitol (derivado

del maíz) líquido, con el cual se logra un control de la humedad y la absorción de

la humedad en el aire; las pinturas y barnices llevan aceite de maíz; las cabezas

de los cilindros, las bujías, los neumáticos, muchos acabados sintéticos de los

automóviles; papel, cartones, maderas, pegamentos y otros adhesivos, tintas,

tejidos y tintes con los que se tratan muchas telas; cerca de 85 tipos diferentes de

antibióticos llevan maíz en sus fórmulas; la capa fina que recubre las aspirinas y

otros analgésicos está hecha de almidón de maíz (35).

La composición química del grano de maíz es muy compleja. Reducida a un

esquema, contiene alrededor de un 10% de sustancias nitrogenadas, entre el 60 y

el 70% de almidón y azúcares, y del 4 al 8% de materias grasas. El resto, hasta

las 100 partes, es agua, celulosa, sustancias minerales, etc. En la Tabla 9 se

observa la composición del maíz en base seca.

Tabla 9. Composición del grano de maíz en base seca.

Componentes Promedio (%) Rango típico (%) Fécula 71,3 64 – 78 Proteína 9,91 8 – 14 Grasa 4,45 3,1 – 5,7 Fibra cruda 2,66 1,8 – 3,5 Ceniza 1,42 1,1 – 3,9

Fuente: www.sagpya.mecon.gov.ar/agricu/publicaciones/aceite/composición.htm

48

Entre las materias nitrogenadas, se encuentra la zeína, edestina (una globulina), la

maisina (en tres formas: a, b, g), etc. En números, de las 60 partes de fécula, el

maíz dulce sólo contiene 20, otras 20 se hallan convertidas en dextrina, y la

porción restante, en glucosa y sacarosa casi a partes iguales.

2.6. ÁCIDO CÍTRICO

El ácido cítrico es un ácido orgánico que abunda en la naturaleza muy extendido

en el reino vegetal y animal, encontrándose en considerable cantidad en los frutos

cítricos. Como ácido libre o como sal, se encuentra en las semillas y los jugos de

gran variedad de flores y plantas. Es un componente del vino (0,4 g/L), la leche (1

a 4 g/L), los productos lácteos, y los tejidos y líquidos animales.

El ácido cítrico se comercializa como ácido cítrico monohidrato o como ácido

cítrico anhidro. Se emplea en la industria farmacéutica (10% de la utilización total),

cosmética y alimenticia (60% de la producción total). Su buen sabor y la facilidad

con que es asimilado favorecen su utilización como ingrediente ácido para

mantener el pH o para obtener un pH conveniente y hacer resaltar el sabor de una

extensa variedad de productos en esas industrias. Recientemente se ha

convertido en materia prima importante para usos industriales de carácter general

como pulimiento y limpieza del hierro y acero, tratamiento y acondicionamiento de

aguas industriales, y en la preparación de resinas alquídicas, pinturas y lacas, y en

el estampado de telas.

2.6.1. Características. El ácido cítrico es el ácido 2-hidroxi-1,2,3-propanotri-

carboxílico, con fórmula molecular HOOCCH2C(OH) (COOH)CH2COOH, con un

peso molecular de 192.12. Tiene dos formas estables: el ácido cítrico monohidrato

con un 91,42% de ácido cítrico anhidro y 8,58% de agua, y el ácido cítrico anhidro.

49

Se presenta en forma de cristales incoloros, translúcidos, o polvo fino o granular,

blanco, inodoro y con un sabor ácido agradable.

El ácido cítrico cristaliza de soluciones acuosas en forma del monohidrato. El

monohidrato del ácido cítrico es estable en el aire de humedad normal, pero en

aire seco o en vacío sobre ácido sulfúrico pierde agua. Calentando poco a poco

los cristales monohidratados se ablandan a la temperatura aproximada de 70 – 75

ºC con pérdida de agua y se funden completamente entre 135 y 152 ºC.

Calentando rápidamente los cristales, se funden a 100 ºC, se solidifican al

convertirse en anhidros y se funden a 153 ºC.

El ácido cítrico anhidro cristaliza de soluciones acuosas concentradas y calientes:

la temperatura de transición media de monohidrato a la forma anhidra es 36,3 ±

0,15 ºC. La temperatura de fusión es 153 ºC. Es ópticamente inactivo y no

manifiesta piezoelectricidad.

El ácido cítrico es bastante soluble en agua, medianamente en alcohol y poco en

éter. La forma anhidra es insoluble en cloroformo, benceno, sulfuro de carbono,

tetracloruro de carbono y tolueno.

Cuando se calienta el ácido cítrico a 175 ºC, se convierte parcialmente en ácido

aconítico por eliminación de agua, y en ácido acetondicarboxílico por pérdida de

dióxido de carbono y agua, ácido que a su vez se descompone para formar

acetona y dióxido de carbono. Por encima de 35 ºC, la oxidación con

permanganato potásico produce ácido oxálico. El ácido cítrico se descompone en

ácido oxálico y ácido acético cuando se funde con hidróxido de potasio o se oxida

con ácido nítrico.

El ácido cítrico es tribásico y manifiesta las propiedades usuales de un ácido

polibásico. Forma sales neutras, dos sales diferentes monoalcalinas y dos sales

diferentes dialcalinas. Las diferentes sales de los metales alcalinos son bastante

50

solubles, pero las sales neutras de los metales alcalinotérreos son poco solubles.

Forma sales complejas solubles con muchos iones metálicos, por lo cual muchos

hidróxidos metálicos no son precipitados por los álcalis en presencia de ácido

cítrico (20, 34).

2.6.2. El ciclo de los ácidos tricarboxílicos o del ácido cítrico. Antes de que

los sustratos puedan desembocar en esta ruta metabólica para llegar a la

degradación oxidativa final en la respiración, tienen que ser escindidos en

fragmentos de C2 en forma de acetil-CoA. Estos de unen entonces al último ácido

del ciclo, al oxalacético (C4) por acción de la enzima citrato-sintetasa para formar

el ácido cítrico (C6). Durante este ciclo, los dos átomos de C del acetil-CoA se

oxidan a CO2, se liberan 2 4 ⋅ átomos de hidrógeno que son transportados a la

cadena respiratoria pro coenzimas transportadores de hidrógeno (FAD, flavina

adenina dinucleótido, y NAD, nicotinamida-adenina dinucleótido), para ser

degradados allí a CO2 y H2O (ver Figura 3). Durante la escisión del ácido

succínico-CoA también se genera energía bioquímica, pero en este caso en forma

de guanosina trifosfato (GTP), rica en energía (18).

2.6.3. Obtención de ácido cítrico. El ácido cítrico es fundamentalmente

producido por 2 especies de aspergillus llamadas Aspergillus niger y Aspergillus

wentii, aunque también se han utilizado levaduras, como Saccharomycopsis

lipolytica, para la producción de ácido cítrico sobre sustratos no azucarados. otras

especies empleadas son A. clavatus, Penicillium citrinum, Paecelomyces

divaricatum, Candida guillermondii, Trichodrema viridae, Arthrobacter paraffineus y

Corynebacterium sp.

Los métodos normales de producción de ácido cítrico emplean bien fermentación

en superficie o tecnología de fermentación sumergida, siendo las fuentes de

carbono preferidas las melazas de remolacha o de caña y los jarabes de glucosa.

51

Cuando se utilizan melazas los niveles de contaminación por metales pesados en

el medio tienen que ser controlados estrictamente, bien sea por resinas de

intercambio iónico o eliminándolos mediante un agente quelante como el

ferrocianuro (27).

La materia prima empleada como fuente de carbono es un carbohidrato,

principalmente el azúcar impuro en forma de melazas, utilizándose también la

remolacha, la harina de trigo, el agar, la malta de cebada, la xilosa (azúcar de

madera), etc. Además del carbono, el oxígeno y el hidrógeno suministrados por el

carbohidrato, el organismo necesita como elementos nutritivos nitrógeno, potasio,

fósforo, magnesio y azufre. Otros factores importantes para la conversión de

soluciones azucaradas en ácido cítrico por los hongos son la concentración de la

solución, las técnicas de cultivo e inoculación, la temperatura, el pH y la aireación.

En gran parte la influencia de cada factor está determinada por la cepa de hongo

empleada (20).

2.6.3.1. Medio de fermentación. Los medios utilizados para la producción de

ácido cítrico han sido muy perfeccionados a lo largo de los muchos años que se

lleva a cabo el proceso comercial. Los constituyentes del medio que tienen efecto

sobre la fermentación cítrica se listan en la Tabla 10.

Tabla 10. Condiciones que favorecen la producción de ácido cítrico

Alta concentración de azúcar Bajas concentraciones de fosfatos Bajo pH, por debajo de 2,0 Alta tensión de oxígeno Ausencia de metales taza: Mn+2, Fe+2, Zn+2

Fuente: DELLWEG, H. Biotechnology: A comprehensive treatise in 8 volumes. By H-J Rehm and G. Reed, p. 424

52

Figura 3. El ciclo de los ácidos tricarboxílicos y sus productos sintetizados en exceso en hongos.

Fuente: JAGNOW, Gerhard. Biotecnología: Introducción con experimentos modelo. Editorial Acribia. 1991, p. 90 2.6.3.1.1. Azúcar. Como fuente de carbohidrato puede ser utilizada una serie de

materias primas: almidón de papa, hidrolizados de almidón, jarabe de glucosa de

almidón sacarificado, sacarosa de diferentes niveles de pureza, jarabe de caña

con dos tercios de sacarosa convertida en azúcar invertido, melazas de caña de

azúcar, melazas de azúcar de remolacha. Si se utiliza almidón, éste es hidrolizado

a azúcares por las amilasas formadas por el hongo productor o añadidas al caldo

de fermentación. Si se utilizan hidrolizados o jarabes debe ser llevado a cabo un

tratamiento preliminar con precipitantes o cambiadores de iones para separar los

53

cationes (10). Para obtener una producción máxima de ácido cítrico, la

concentración de azúcar debe ser de 14 a 22% (w/v) (12).

2.6.3.1.2. Nitrógeno. Convencionalmente, el nitrógeno es suplido en las formas

de nitrato o sulfato de amonio. Los compuestos de amonio son preferidos porque

durante su uso el pH decrese, lo que es un prerrequisito para la fermentación

cítrica. Esto excluye el uso de nitratos de sodio o potasio o a la úrea como fuentes

de nitrógeno. En general la concentración del ion amonio durante la fermentación

del ácido cítrico no debe estar limitada, variando en un amplio rango (0,3 a 1,5 g

NH4+/L) (12, 16).

2.6.3.1.3. pH. Mantener el valor de pH bajo es extremadamente importante para

un progreso exitoso en la fermentación. Durante la idiofase los valores de pH

menores a 3 dan una mayor producción de ácido cítrico al suprimir la formación de

ácidos glucónico y oxálico, ya que éstos se pueden producir a valores de pH altos,

pero durante la trofofase el pH inicial es generalmente 5,0. Durante las primeras

48 horas de la trofofase el pH desciende por debajo de 3 como resultado del

metabolismo de los iones amonio. Para controlar mejor el rendimiento en cultivos

sumergidos, la trofofase y la idiofase pueden ser separadas reduciendo el pH por

debajo de 2, una vez se ha finalizado el crecimiento (8, 10). El pH óptimo de

producción está entre 1,7 y 2,0 (12).

2.6.3.1.4. Elementos traza. El cobre, manganeso, magnesio, hierro, zinc y

molibdeno son necesarios para el crecimiento óptimo en un rango de ppm, sin

embargo, un exceso de las concentraciones óptimas puede tener un efecto tóxico.

Mientras que para un crecimiento óptimo se requiere una concentración alta de

hierro, sólo 0,05 – 0,5 ppm de hierro son necesarias para la producción máxima de

ácido cítrico. La sensibilidad de las cepas a metales pesados como zinc, hierro,

54

manganeso y cobre desciende al descender la temperatura. Además, el cobre

revierte el efecto inhibitorio del hierro (10, 16, 30).

2.6.3.1.5. Aireación. En procesos de fermentación sumergida, la aireación es

extremadamente crítica: la producción de ácido cítrico es estimulada por el

incremento del aire. Si el suministro de aire es parado por unos pocos minutos, la

producción de ácido cítrico se detiene irreversiblemente, así se reanude la

aireación. El efecto de parar la aireación depende en parte de la fase en la cual

haya ocurrido la interrupción y el tiempo que ésta haya durado. Así, durante la

fase de producción una interrupción en el flujo de oxígeno por cerca de 2 minutos

decrese al rendimiento del ácido cítrico apreciablemente. Simultáneamente no se

inhibe la producción de biomasa pero se desestimula ligeramente.

2.6.3.2. Procesos de producción. El ácido cítrico se produce tanto en procesos

en superficie como en procesos sumergidos. Los procesos en superficie pueden

ser subdivididos de acuerdo con el estado del medio de cultivo que se utilice:

sólido o líquido. Se utilizan dos tipos de procesos sumergidos: fermentadores

agitados o fermentadores de elevación por aire.

La fermentación continua para la producción de ácido cítrico no ha sido todavía

llevada a cabo. La complejidad de la formación de las bolas de micelio y el control

de los requerimientos de la idiofase pueden ser satisfechos solamente mediante

un sistema en etapas múltiples con fermentadores conectados en serie, sin

embargo, por razones económicas tales sistemas no tendrían sentido, incluso si

pudieran resolverse los problemas microbiológicos y de esterilidad (10).

2.6.3.2.1. Producción del inóculo. El material utilizado como inóculo para la

producción de ácido cítrico es una suspensión de esporas. Las esporas se logran

55

después de 10 – 14 días de incubación de las cepas en medio sólido. Cuando se

va a inocular un fermentador sumergido, se induce la germinación de las esporas

en una fermentación previa. En este fermentador de siembra se utiliza una

solución de nutrientes que contenga 15% de azúcar y para producir la formación

de micelio en forma de bolas se añaden iones de cianuro. Si se añade demasiado

poco cianuro el crecimiento continúa bien, pero el rendimiento de ácido cítrico en

la producción posterior a escala de fermentador es baja. Las esporas germinan a

32 ºC y forman bolas de 0,2 – 0,5 mm de diámetro en 24 horas. Durante este

periodo el pH cae a 4,3. Estas bolas se utilizan como inóculo para fermentadores

de producción. La velocidad de conversión y la eficiencia en el fermentador de

producción son extremadamente dependientes de la forma en la que se produzcan

las esporas y las bolas de micelio (10).

2.6.3.2.2. Procesos en superficie. Los procesos en superficie que emplean

sustratos sólidos pueden utilizar miga de pan o pulpa de almidón de papa dulce

como medio de cultivo. En este proceso las cepas de A. niger no son tan sensibles

a los elementos traza como en otros procesos. El pH se reduce hasta 4 – 5 antes

de la esterilización, después de la esterilización el material se inocula con esporas,

se extiende sobre bandejas en capas de 3 – 5 cm de grosor y se incuba a 28 ºC.

El proceso en superficie sólida dura 90 horas, al final de las cuales la solución

entera se extrae con agua caliente para aislar el ácido cítrico. Los procesos en

superficie que utilizan medio líquido son los métodos más antiguos y se emplean

por su baja inversión, bajo coste de energía y tecnología sencilla. El proceso de

fermentación se detiene después de 8 – 14 días. Si hay demasiado hierro se

produce ácido oxálico y se forma un pigmento amarillo que más tarde entorpece el

proceso de recuperación del ácido cítrico.

El rendimiento del proceso en superficie utilizando solución nutritiva líquida

asciende a 1,2 – 1,5 kg de ácido cítrico monohidrato/ m2 de superficie de

fermentación por hora. Durante la recuperación se separan el micelio y la solución

56

de nutrientes de la cámara. Debido a su volumen, el micelio debe ser lavado

cuidadosamente en secciones. En algunos casos se utilizan prensas mecánicas

para obtener más ácido cítrico de las células.

En la Tabla 11 se muestra la composición de una solución típica de nutrientes, en

procesos en superficie la sacarosa se suministra como melazas de remolacha más

que como melazas de caña de azúcar (10).

Tabla 11. Composición de la solución nutritiva para un cultivo en superficie.

Sustrato g/L Sustrato Sacarosa 160 – 200 ca. 320 – 400 g melazas Nitrato de amonio 1,6 – 3,2. No se necesita con melazas KH2PO4 0,3 – 1,0 MgSO4. 7H2O 0,2 – 0,5. No se necesita con melazas ZnSO4 0,01 – 0,10 Ferrocianuro de potasio 0,4 – 2,0

Fuente: CRUEGER, Wulf. Biotecnología: Manual de microbiología industrial. Editorial Acribia. 1993, p. 42.

Cuando se ha transformado un 90% de la sacarosa del medio nutritivo, disminuye

la velocidad de incremento de la acidez total. También disminuye cuando la

concentración de ácido cítrico es mayor, aproximadamente del 7%. En una

fermentación normal la acidez aumenta hasta el noveno o décimo día y entonces

habrá del 7 al 8% de ácido cítrico y menos del 1% de ácido oxálico. Una

concentración de ácido cítrico al 8% es equivalente a una solución 1,2 N. El ácido

cítrico se degrada a menos que sea recuperado con suficiente rapidez tras su

producción (24).

2.6.3.2.3. Procesos sumergidos. Este proceso aunque lleva más tiempo (8

días) tiene varias ventajas: menor inversión en la construcción, 25% menos

inversión total y costes más bajos de mano de obra. Las desventajas son los

57

costes más altos de energía y la tecnología de control más sofisticada que

requiere personal más entrenado. Tres factores son especialmente importantes en

procesos sumergidos:

a) La calidad del material utilizado para construir el fermentador: Los

fermentadores deben ser protegidos de los ácidos o construidos en acero

inoxidable. A valores de pH entre 1 – 2 los metales pesados se liberan de las

paredes de los fermentadores normales de acero y pueden inhibir la formación

de ácido cítrico. Con fermentadores de hasta 1.000 L, las cámaras de acero

inoxidable deben llevar un recubrimiento de plástico debido a la gran relación

de superficie a volumen. En fermentadores grandes no es necesario el

recubrimiento si se utiliza acero inoxidable (10).

b) La estructura del micelio: La estructura del micelio que se forma en el cultivo

sumergido durante la trofofase es vital para un proceso de producción con

éxito. Si el micelio es laxo y filamentoso, con ramificaciones limitadas y sin

clamidosporas, se produce poco ácido cítrico en la idiofase. Para conseguir

una velocidad óptima de producción, el micelio debe estar formado por bolas

sólidas muy pequeñas. La relación de hierro a cobre en el medio determina la

estructura del medio (10).

c) El suministro de oxígeno: Aunque el A. niger requiere relativamente poco

oxígeno, es sensible a la deficiencia de éste. A través del periodo entero de

fermentación existe una concentración mínima de oxígeno de 20 – 25% del

valor de saturación. Interrupciones cortas del suministro de oxígeno originan la

detención irreversible de la producción. Las velocidades de aireación en

fermentadores profundos deberían ser de 0,2 – 1,0 volumen/volumen/minuto

(vvm) durante la fase de producción de ácido. Debido a la baja viscosidad no

se requiere agitación, aunque algunas plantas utilizan fermentadores agitados,

también pueden ser utilizados los fermentadores elevados mediante aire.

58

La formación de espuma es un problema en los fermentadores sumergidos.

Se necesita una cámara de espuma de 1/3 del tamaño del volumen del

fermentador tanto en los fermentadores elevados por aire como en los

biorreactores agitados. A intervalos frecuentes pueden ser añadidos agentes

antiespumantes, como aceite de tocino y también pueden ser utilizados

dispositivos antiespumantes (10).

2.6.3.2.4. Producción de ácido cítrico por Aspergillus niger. Las cepas de

Aspergillus niger utilizadas por los fabricantes constituyen un secreto muy

conservado, así como lo son las variaciones menores y las mejoras en la

tecnología del proceso. Esto se debe a que la producción de ácido cítrico es

relativamente sencilla, de forma que solamente se obtiene ventajas competitivas

explotando astucias relacionadas con el tipo de cepa o mejoras en la eficiencia de

los métodos de producción.

La producción bioquímica de citrato por A. niger se caracteriza por:

Una actividad elevada de los enzimas glicolíticos y de la piruvato carboxilasa

inducida por los carbohidratos que conducen a la síntesis de citrato. Esto

debido a la alta concentración azúcar.

La inhibición de un enzima del ciclo del ácido tricarboxílico que podría causar la

descomposición del citrato.

La producción mediada por una deficiencia de manganeso de una

concentración elevada de NH4+ intracelular que contrarresta la inhibición de la

fosfofructoquinasa por el citrato.

Una tensión de oxígeno elevada y suministro continuo de oxígeno para

mantener activa la respiración sensible al SHAM para la reoxidación del NADH.

Un pH bajo para inactivar la glucosa oxidasa.

59

Aunque hay muchos hongos o levaduras tipo Candida que sintetizan ácido cítrico

a partir de azúcares o de n-alcanos, se ha impuesto de forma generalizada la

producción con Aspergillus niger, que a pH 2 y en los caldos de cultivo adecuados

a base de glucosa o sacarosa sintetizan un 70 – 95% en peso de ácido cítrico

monohidrato, lo que supone en términos generales un 57 – 77% del rendimiento

teórico. Las soluciones nutritivas contienen 16 – 20% de sacarosa procedente en

su mayor parte de melaza diluida de remolacha azucarera, 2,3 g de NH4NO3, 0,3 –

1,0 g de KH2PO4, 0,2 – 0,5 g de MgSO4.7H2O, 0,01 – 0,1 g de ZnSO4 además de

0,4 – 2,0 de K4[Fe(CN)6] (18).

La producción de ácido cítrico por Aspergillus niger es fuertemente sensible a la

presencia de iones manganeso en el medio, la velocidad de producción se reduce

dramáticamente si hay manganeso presente a una concentración incluso tan baja

como 3µg/mL. Por consiguiente es necesario pretratar el medio conteniendo

melazas con agentes como hexaferrocianuro o con cobre para inhibir la toma de

manganeso, contrarrestando de esta manera sus efectos inhibitorios (27). Cuando

la concentración de manganeso aumenta, la morfología fúngica se vuelve

filamentosa, incrementando drásticamente la viscosidad del cultivo y disminuyendo

rápidamente la tensión del oxígeno disuelto (28).

La temperatura juega también un papel muy importante en la producción de ácido

cítrico. El rango de temperaturas empleado es de 25 a 30 ºC, ya que a 35 ºC se

inhibe la producción de ácido cítrico por la formación de subproductos ácidos, se

inhibe el crecimiento y desarrollo del cultivo (31). Cuando se utilizan melazas

como sustrato, su pH se ajusta primero a 5 ó 7. El pH inicial debe ser superior a 2

para que los conidios puedan germinar. El pH del medio debe ser mantenido por

encima de 3,5 durante la fase de crecimiento para evitar la formación de ácidos

oxálico y glucónico (27).

60

2.6.3.2.5. Producción de ácido cítrico por Candida lipolytica utilizando hidrolizado de semillas de dátiles y suero de leche. Para la formación de ácido

cítrico por Candida lipolytica se utilizaron como ingredientes del medio natural

nitrógeno orgánico, carbohidratos, lípidos y minerales, que se obtuvieron del

hidrolizado de semillas de dátiles y suero de leche, empleándose como biomasa la

levadura que se encuentra estrechamente asociada con formación de ácido

cítrico. El rendimiento de ácido cítrico se incrementó con el aumento del período

de fermentación, alcanzando su valor máximo a las 96 horas.

Se empleó glucosa a una concentración óptima de 25 mg/mL como la mejor

fuente de carbono, lo que impulsó la producción de ácido cítrico a altas

concentraciones. Como fuentes de nitrógeno inorgánico se utilizó (NH4)2SO4,

NH4CL y NH4NO3, donde el microorganismo asimiló el nitrógeno en la forma

amoniacal y no nitrada.

La adición de diferentes concentraciones de hidrolizado de semillas de dátiles al

medio incrementó la producción de ácido cítrico, lo cual se vio reflejado por la

presencia de ciertos elementos como magnesio, hierro, calcio, manganeso, zinc y

níquel.

El medio líquido para inocular la levadura contenía 20 g de glucosa, 5 g de

extracto de levadura, 2 g de NH4CL, 0,5 g de MgSO4. 7H2O, 1 g de KH2PO4, 0,05

g de MnSO4. 4H2O, 0,005 g de FeSO4. 7H2O y 1 L de agua destilada. El medio fue

esterilizado con un pH inicial de 5,5, y dispuesto con la levadura en erlenmeyers

de 250 mL en condiciones asépticas que fueron puestos en un agitador rotatorio a

30 ºC por 72 horas.

El medio de fermentación contenía 30 g de hidrolizado de dátiles, 15 g de suero de

leche, 1 g de KH2PO4, 0,25 g de MgSO4. 7H2O, 0,05 g de MnSO4. 4H2O, 0,005 g

de FeSO4. 7H2O y 1 L de agua destilada. El medio fue esterilizado con un pH

inicial de 5,5, y dispuesto con el inóculo en erlenmeyers de 250 mL en condiciones

61

asépticas que fueron puestos en un agitador rotatorio a 30 ºC por 120 horas. El

porcentaje de inóculo fue de 5%, lográndose hasta 50 mg/mL de ácido cítrico al

final de la fermentación (1).

2.6.3.2.6. Producción de ácido cítrico por Aspergillus niger con suero de leche permeado. Para esta investigación se uso la caseína láctica del suero

permeado como un sustrato para la producción de ácido cítrico fermentándolo con

un mutante del Aspergillus niger IMI 41874, observándose una concentración de

ácido cítrico de 8,3 g/L que representa un rendimiento de 19% (p/p) basado en

lactosa utilizada. Complementado el suero permeado con lactosa (concentración

final 140 g/L) aumentó la producción a 14,8 g/L (rendimiento de 23%). El pH

natural del permeado (pH 4.5) fue el pH inicial más conveniente para el proceso,

no siendo necesario controlar el pH durante la fermentación. La adición de

metanol (concentración final 3% v/v) a la fermentación aumentó la producción de

ácido cítrico 25 g/L (rendimiento del 33% basado en lactosa utilizada).

El medio líquido se inoculó con una suspensión de esporas en agua destilada

(aprox. 1 X 108 esporas), y se dispuso en erlenmeyers de 250 mL que fueron

esterilizados y puestos en un agitador rotatorio a 180 rpm y 30 ºC. La fermentación

se realizó en un microfermentador de 6 litros donde el volumen de trabajo fue de 5

litros de suero permeado que fueron inoculados al 10 % v/v con el medio líquido.

Durante la fermentación se midió el pH, controlándolo cuando fuera necesario con

NaOH 1M. La velocidad de agitación durante las primeras 48 horas de

fermentación fue de 200 rpm para luego ser incrementada a 300 rpm, con una

velocidad de aireación para las primeras 48 horas fue de 3 L/min y luego

aumentada a 5 L/min (17).

2.7. CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN

62

Durante la fermentación, el sustrato se consume, los microorganismos crecen y se

multiplican y se forma el producto. La biocinética de las fermentaciones estudia los

procesos de consumo de sustrato, de formación de biomasa y de biosíntesis de

productos.

Las fermentaciones se pueden clasificar en dependencia de los perfiles de

formación de biomasa y de producto. Para los tipos II y III de fermentaciones se

distinguen la tropofase y la idiofase. La tropofase es el periodo inicial de la

fermentación, durante la cual la biomasa crece con gran velocidad y el producto no

se forma o se forma en bajas concentraciones. La idiofase es el periodo de la

fermentación en el cual la velocidad de formación del producto es alta. En la Tabla

12 se puede observar la forma en que se clasifican las fermentaciones (2).

Tabla 12. Clasificación de la fermentación según Gaden.

Tipo Relación específica de velocidad Ejemplo I Formación de producto relacionada directamente

con la utilización del carbohidrato Etanol

II Formación de producto indirectamente relacionada con el uso del carbohidrato

Ácido cítrico

III Formación de producto aparentemente no relacionada con el uso del carbohidrato

Penicilina

Fuente: KAFAROV, V. Modelirovaniye Biojimicheskij Reaktorov. 1979, p. 342

Los procesos de fermentación que transcurren dentro de los biorreactores son

bastante complejos, ya que involucran procesos biocinéticos de transferencia de

masa y calor, y en el caso de biorreactores de gran tamaño fenómenos

hidrodinámicos. Para analizar el régimen de trabajo de los biorreactores y su

diseño s necesario utilizar modelos matemáticos. Una de las etapas principales del

modelamiento matemático de un reactor biológico es la etapa de elaboración del

modelo biocinético.

63

El modelo biocinético consiste en un conjunto de expresiones matemáticas que

describen la velocidad de crecimiento del cultivo de microorganismos y la

influencia sobre ellos de las condiciones del medio en que éstos se desarrollan.

Durante el proceso de cultivo microbiano cambia la composición cualitativa del

mismo lo que influye a su vez sobre la velocidad de acumulación de biomasa y de

productos del metabolismo (19).

2.7.1. Modelos de formación de biomasa. En un cultivo por lotes se observan

diferentes fases de crecimiento celular. Durante la fase de latencia que se verifica

inmediatamente después de la inoculación, la tasa de crecimiento es

esencialmente nula. Las células aprovechan la fase latente para adaptarse a las

nuevas condiciones ambientales: sintetizar nuevas enzimas o nuevos

componentes estructurales. Le sigue a esta fase, la fase de crecimiento

exponencial. Debido al consumo de nutrientes o a la acumulación de productos

inhibidores, el crecimiento decae y las células entran en la fase estacionaria en la

que no ocurre ningún crecimiento. En la Figura 4 se muestra una curva para un

cultivo por lotes.

Figura 4. Curva típica de un cultivo por lotes.

Fuente: AGUDELO MOTATO, María Alejandra. Obtención de ácido itacónico por fermentación con Aspergillus terreus. Manizales. 1999, p. 70.

64

Durante la fase de crecimiento la velocidad o tasa de crecimiento celular se

describe por el modelo de Malthus:

Xrx ⋅= µ Ec.1

donde

rx: Tasa o velocidad volumétrica de formación de biomasa, g/(L.h) ó kg/(m3.h)

µ: Velocidad específica de crecimiento, h-1

X: Concentración de biomasa, g/L ó kg/m3

En un proceso por lotes, que se considera un sistema cerrado y donde el

crecimiento es el único factor del proceso que afecta la concentración,

reemplazando en la ecuación anterior dtdXrx = , derivando la ecuación resultante

e integrando se llega a la ecuación 2 que representa el crecimiento exponencial de

la biomasa.

teXX ⋅= µ0 Ec. 2

Durante la fase exponencial de crecimiento celular en un cultivo por lote, la

velocidad específica de crecimiento depende de la concentración de los nutrientes

en el medio. Frecuentemente, un único sustrato ejerce una influencia dominante

sobre la tasa de crecimiento y es denominado sustrato limitante. Para modelar la

dependencia de la velocidad de crecimiento en función de la concentración de

sustrato limitante se utiliza el modelo de Monod:

SKS

S +⋅

= máxµµ Ec. 3

donde:

S: Concentración del sustrato limitante.

µmáx: Velocidad específica de crecimiento celular máxima, h-1.

65

KS: Constante de saturación que tiene las mismas unidades de S.

Los valores típicos de KS son muy pequeños, del orden de mg/L para sustratos

con base en carbohidratos y de µg/L para otros compuestos como aminoácidos.

Normalmente el nivel de sustrato limitante en los medios de cultivo es mucho más

grande que KS.

La ecuación de Monod es la más utilizada para expresar la relación entre

velocidad de crecimiento y la concentración de sustrato, sólo que no es aplicable a

condiciones ambientales que cambien rápidamente, a niveles de sustrato

extremadamente bajos, y cuando se presenta inhibición de por sustrato o producto

se deben agregar términos adicionales para que el modelo tenga en cuenta estos

aspectos (2).

La ecuación 1 proporciona un modelo simple que se utiliza para describir la

velocidad de crecimiento de los microorganismos en función de su concentración

en el medio. Sin embargo, la velocidad de crecimiento específica no es constante

y sobre ella influye la concentración del sustrato limitante. Al realizarse un análisis

más estricto, es necesario considerar la influencia de las condiciones ambientales

de la fermentación sobre el cultivo microbiano y la interacción de las células, que

en últimas, conduce a un déficit de sustrato para las células aisladas. La ecuación

que tiene en cuenta esta situación se relaciona a continuación (19):

2XXdtdX βε −= Ec. 4

Donde ε caracteriza la velocidad máxima de crecimiento de las células en el

cultivo en ausencia de sus interacciones, es decir, limitación por sustrato o

inhibición por productos del metabolismo. El coeficiente β cuantifica el grado de

interacción de las células debido al déficit de sustrato y a la inhibición por

66

productos metabólicos y caracteriza el efecto de desaceleración de la tasa de

crecimiento celular.

2.7.2. Modelos de formación de producto. Se han propuesto muchos modelos

para la producción de diferentes metabolitos, tres de ellos han servido para

explicar el comportamiento de sistemas simples:

1. Modelo asociado con el crecimiento: Cuando el sustrato (S) se convierte

estequiométricamente en un producto (P), la tasa de formación está

relacionada con la velocidad de crecimiento por la siguiente expresión:

dtdX

dtdP α= Ec. 5

Donde α es la constante estequiométrica.

2. Modelo no asociado con el crecimiento: En la ecuación 6 se muestra una

contante β muy similar a la actividad enzimática (la célula tiene un sistema

enzimático constitutivo que controla la tasa de formación del producto) y

representa la unidad de actividad formadora del producto por masa de célula:

dtdX

dtdP β= Ec. 6

Donde β es la constante de proporcionalidad.

3. Modelo combinado: Este modelo propone expresar la producción como la

suma de ambas ecuaciones:

67

XdtdX

dtdP

⋅+= βα Ec. 7

ó

βµα +⋅==dtdP

Xv 1 Ec. 8

Donde v es la tasa específica de formación de producto (2).

Se considera que los modelos más útiles serán aquellos que envuelvan factores

ambientales como temperatura, pH, oxígeno disuelto, tasa de alimentación del

sustrato, etc., pues además de representar mejor el sistema pueden usarse para

controlar la fermentación por computador. Pirt, empleando un método diferente,

considera que el producto formado durante el crecimiento en un cultivo batch con

un tiempo infinitamente pequeño, dt, esta dado por:

XqdtdP

P= Ec. 9

Donde qP es igual a la tasa específica de formación del producto (2).

2.7.3. Modelos para el consumo de sustrato. Se considera que el sustrato

limitante del crecimiento es consumido por los microorganismos para su

crecimiento, para sintetizar los productos que su metabolismo requiera y para

mantener su metabolismo endógeno, es decir, todas las funciones vivas que no

están relacionadas con el crecimiento o reproducción. Esta situación se refleja en

la ecuación 10:

68

XkdtdP

YdtdX

YdtdS

eSPSX

⋅−−−

=11 Ec. 10

donde:

YX/S: Número de moles (o gramos) de biomasa formada por mol (o gramo) de

sustrato consumido.

YP/S: Número de moles (o gramos) de producto sintetizado a partir de una mol (o

gramo) de sustrato consumido.

Ke: Coeficiente de metabolismo endógeno.

Cada uno de los términos del miembro derecho de la ecuación anterior va a tener

mayor o menor influencia sobre la velocidad de consumo del sustrato, por lo tanto

se pueden sugerir diferentes modelos de consumo de sustrato (2):

dtdX

YdtdS

SX

1−= Ec. 11

dtdX

YdtdS

SP

1−= Ec. 12

XkdtdS

e ⋅−= Ec. 13

69

3. METODOLOGÍA

3.1. PREPARACIÓN DE LAS CEPAS

Para la realización de esta parte de la investigación se emplearon como

microorganismos productores de ácido cítrico las cepas fúngicas de Aspergillus

niger NRRL 3, Aspergillus carbonarius NRRL 368, Aspergillus carbonarius NRRL

67, las cuales fueron proporcionadas por el National Center for Agricultural

Utilization Research de Estados Unidos, y una cepa de Aspergillus niger

proveniente de la Universidad de los Andes de Santafé de Bogotá. Estas tres

primeras cepas se encontraban en estado liofilizado, por lo que se hizo necesario

reconstituirlas para sacarlas de su estado latente. La última cepa se encontraba

conservada en nevera en el Laboratorio de Microbiología General de la

Universidad de Caldas en tubos de ensayo con aceite mineral con fecha del 16 de

junio de 1999, razón por la cual esta cepa no fue reconstituida.

La ejecución global de todos los procedimientos para el cultivo de las cepas

incluye cuatro fases, las cuales se llevan a cabo en forma secuencial:

1. Esterilización: Si las normas de preparación no indican otra cosa, la

esterilización se realiza en autoclave a 15 libras de presión y 121 ºC, durante

15 minutos. Esta esterilización es preferible realizarla en los recipientes donde

se va a trabajar, excepto las cajas de petri.

70

2. Inoculación: Consiste en la siembra del material vivo en el medio de cultivo

donde se va a desarrollar bajo condiciones de asepsia para evitar su

contaminación. Entre las precauciones más importantes que se toman están:

Desinfectar previamente el mesón de trabajo con medios desinfectantes

(desinfectante comercial y solución de hipoclorito de sodio).

Rodear el sitio con mecheros de gas, preferiblemente encendidos con

anterioridad.

La inoculación se lleva a cabo con aguja curva esterilizada a la flama.

Uso de tapabocas y guantes previamente desinfectados.

El material a inocular lo constituye el tejido micelial o las esporas

resultantes del raspado superficial de las colonias de la cepa fúngica en

cultivo sólido.

3. Incubación: Posterior a la inoculación, el sistema se somete a incubación a la

temperatura de crecimiento del hongo en períodos de tiempo que dependen

del rendimiento en crecimiento micelial y en formación de esporas. 4. Preservación del sistema: Las condiciones de conservación se garantizan

con la exposición del sistema a enfriamiento a 4 ºC inhibiendo de esta manera

el crecimiento micelial y la actividad enzimática del microorganismo. 3.1.1. Reconstitución de la cepa. La reconstitución de las cepas se requiere

para llevar el hongo de su estado latente a un estado en el cual pueda desarrollar

su potencial de reproducción bajo diferentes condiciones.

Para la activación inicial de las 3 cepas que se encontraban en estado liofilizado

se hizo necesario llevarlas a un caldo de cultivo Czapeck (12) cuya composición

71

se muestra en la Tabla 13, y mantenerlas por unas horas antes de ser sembradas

en las cajas de petri, con el fin de potenciar su actividad enzimática.

Tabla 13. Composición del caldo de cultivo Czapeck.

Componente Concentración (g/L) Sacarosa 30 Nitrato de sodio 3 Fosfato dipotásico 1 Sulfato de magnesio 0,5 Cloruro de potasio 0,5 Sulfato ferroso 0,001

Fuente: Manual DIFCO. 1998

Para la activación inicial se empleó una cámara de flujo laminar, que previamente

fue desinfectada y mantenida bajo la acción de la luz ultravioleta. Dentro de la

cámara se rompió la cápsula de vidrio en la que venía el liofilizado de cada una de

las cepas. Paso a seguir se dispuso la cepa dentro de un tubo de ensayo tapa

rosca que contenía el caldo de cultivo Czapeck previamente esterilizado, a una

temperatura ambiente.

3.1.2. Mantenimiento de la cepa. El objetivo de esta etapa es el de disponer de

material de siembra fresco y listo para la etapa de fermentación. El desarrollo de

esta etapa permite que el hongo pueda encontrar el medio sólido capaz de

proporcionarle las condiciones necesarias para reproducirse de manera suficiente,

lo cual se traduce en la disponibilidad permanente de esporas requeridas en la

etapa de fermentación cítrica.

Para poder desarrollar esta parte del trabajo, se sembraron las cuatro cepas en

diferentes medios de cultivo con el fin de determinar cuál era el que otorgaba

mejores condiciones de crecimiento y producción de conidias. Para esto sólo se

emplearon las cepas de Aspergillus niger NRRL 3, Aspergillus carbonarius NRRL

72

368 y la cepa de Aspergillus niger proveniente de la Universidad de los Andes.

Debido a que el Aspergillus carbonarius NRRL 67 es una variación del Aspergillus

carbonarius NRRL 368, se utilizó la misma información encontrada para su

homólogo. La cepa de Aspergillus niger NRRL 3 empleada para este estudio se

encontraba bajo refrigeración en el Laboratorio de Microbiología General de la

Universidad de Caldas en tubos de ensayo con aceite mineral con fecha del 25 de

agosto de 2000.

Los medios de cultivo recomendados por la bibliografía para la incubación y

crecimiento de las cepas se nombran a continuación relacionándose su

composición en el Anexo A:

Aspergillus niger: Medio Agar Czapeck y Medio Agar Sabouraud.

Aspergillus carbonarius: Medio Agar Czapeck, Medio Agar Sabouraud, Medio

Agar PDA, Medio Agar Extracto Malta (MEA), Medio Agar Czapeck Yeast

Autolysate (CYA), Medio Agar Czapeck Dox, Medio Agar Czapeck Malta,

Medio Agar Czapeck Malta Modificado.

Para el Aspergillus carbonarius se estudiaron más medios porque la información

disponible de esta cepa era mínima, por lo que se trabajó mas tiempo en ella.

Todos los medios mencionados anteriormente se sembraron con la cepa de

microorganismos que fueron incubados a las temperaturas recomendadas, estas

temperaturas fueron 27 ºC y 37 ºC, de las cuales se seleccionó la temperatura

que mejor crecimiento de conidias presentó en cada cepa en el menor tiempo.

La siembra de la cepa reconstituida se realizó agregando caldo nutritivo en el

centro de las cajas de petri realizando un barrido central en ellas, y la siembra de

las otras cepas se realizó extrayendo una porción de hongo de los tubos de

ensayo para enterrarlas en las cajas de petri. Después de sembrarse las cajas se

sellaron con vinilpel, se rotularon y llevaron a la incubadora a las temperaturas

mencionadas anteriormente.

73

Para preparar los medios sólidos, se diluyeron las cantidades en un erlenmeyer

con agua destilada mezclándolas intensamente. Luego se prosiguió a calentar en

estufa cada uno de los erlenmeyer hasta que hirvieran por lo menos 2 veces para

disolver completamente los reactivos, agitando frecuentemente. Paso a seguir, se

taparon los erlenmeyer con unos tapones biológicos (con el fin de evitar la

contaminación después de ser esterilizados) y se llevaron al autoclave hasta que

alcanzaran una presión de 15 libras y 121 ºC, por 15 minutos. Cuando los

erlenmeyer tuvieron una temperatura aproximada de 40 ºC, se dispusieron unos

20 mL de cada medio en las cajas de petri estériles y se dejaron solidificar, luego

se refrigeraron para evitar que se contaminaran y deshidrataran.

3.1.3. Preservación de la cepa. Esta es una etapa muy importante porque se

logra disponer en todo momento de la cepa original en estado latente,

manteniendo las características fisico-químicas de la especie evitando la mutación

del microorganismo debido a los continuos repiques.

Para preservar la cepa, se prepararon junto con las cajas de petri unos tubos con

medio inclinado (los que también fueron esterilizados), que se sembraron con

cepa reconstituida y estuvieron en la incubadora el mismo tiempo que las cajas.

Después de cumplido el tiempo de incubación, los tubos de ensayo se llenaron

con aceite mineral estéril y se llevaron a la nevera a 4 ºC, al igual que las cajas de

petri. Todo esto con el fin de mantener la cepa viva durante todo el trabajo y para

evitar la deshidratación de los medios.

3.2. DETERMINACIÓN DEL MEDIO ÓPTIMO DE FERMENTACIÓN

La determinación del medio óptimo de fermentación en cultivo sumergido se

realizó en erlenmeyers de 250 mL con un volumen de medio líquido de 100 mL por

74

cada erlenmeyer obteniéndose una relación de caldo con respecto al espacio

ocupado por el aire de 1:5. A partir de los resultados obtenidos en estos ensayos

se establecen las condiciones de operación para la puesta en marcha de la

fermentación en el biorreactor de 3 L

Cuando la cepa pasa del medio de mantenimiento, en el que se encuentran los

requerimientos nutricionales necesarios para un desarrollo micelial y conidial

óptimo manteniéndose la actividad catalítica de síntesis en estado de latencia, a

un estado de generación del producto deseado en el medio de producción, es

necesario realizar una etapa de adaptación donde el hongo absorba los nutrientes

y desarrolle su crecimiento en las condiciones de producción establecidas.

La determinación del medio óptimo de fermentación se llevó a cabo por bloques

de cepas, es decir, que se trabajaron todos los tipos de sueros por cada cepa,

realizando tres réplicas de cada uno. Cada erlenmeyer con suero se inoculó con 5

mL (5%) de caldo de adaptación.

3.2.1. Prediseño experimental. Después de haber desarrollado el procedimiento

de reconstitución, mantenimiento y preservación de la cepa, eligiendo el mejor

medio de cultivo, se procedió a probar experimentalmente si las cuatro cepas eran

realmente productoras de ácido cítrico. Para esto se emplearon dos medios

sintéticos cuya fuente de carbono era glucosa, ya que este carbohidrato es el más

fácilmente asimilable por los microorganismos. El proceso de fermentación se

dividió en 2 etapas.

3.2.1.1. Etapa de adaptación. En esta etapa se realizó la adecuación de las

conidias y micelio provenientes del medio sólido de mantenimiento a nuevas

condiciones ambientales en un cultivo líquido, permitiéndose el desarrollo de los

pellets que son inoculados en el medio de producción. La composición de los

75

medios líquidos empleados en esta etapa se muestra en las Tablas 13 y 14. El

licor de remojo de maíz se preparó dejando en remojo durante 24 horas 20 g de

maíz blanco en 100 mL de agua destilada.

Luego de preparar, ajustar el pH con HCl 1N y NaOH 1 N, y esterilizar, estos

medios fueron sembrados a temperatura ambiente realizando un raspado de las

conidias de Aspergillus carbonarius NRRL 368, Aspergillus niger NRRL 3 y de la

cepa de Aspergillus niger de la Universidad de los Andes, procedentes de los

respectivos medios de mantenimiento. Los erlenmeyer ya inoculados se llevaron a

un baño termostatado con agitación a 30 ºC y 150 rpm por 7 días. El caldo así

obtenido se denominó caldo de adaptación.

Tabla 14. Composición del medio de adaptación 1.

Componente Concentración (g/L) Glucosa 145 Nitrato de amonio 2,23 Fosfato ácido dipotásico 1,00 Sulfato de magnesio heptahidratado 0,23

Fuente: AGUDELO MOTATO, María Alejandra. Obtención de ácido itacónico por fermentación con Aspergillus terreus. Universidad Nacional de Colombia. Manizales. 1999. Tabla 15. Composición del medio de adaptación 2.

Componente Concentración (g/L) Glucosa 60 Sulfato de amonio 3,0 Sulfato de magnesio heptahidratado 0,8 Licor de remojo de maíz 1,5 mL

Fuente: CAMPO, Carlos; DUQUE VÉLEZ, Hugo Alexander. Determinación de parámetros para la obtención de ácido itacónico en un biorreactor de tanque con agitación. Universidad Nacional de Colombia. Manizales. 2000, p. 37

76

El montaje utilizado es el que se muestra en la Figura 5, considerando que el

espacio existente entre el medio líquido y el borde del erlenmeyer era suficiente

para permitir la transferencia de oxígeno al medio de cultivo.

Figura 5. Montaje utilizado durante el diseño experimental.

3.2.1.2. Etapa de producción. En esta etapa se determinó la cantidad de ácido

cítrico producida por cada uno de los tratamientos planteados para el suero con

cada una de las cepas. Se emplearon los mismos medios líquidos de la etapa de

adaptación (Tablas 13 y 14), los cuales fueron inoculados con 10 mL

(correspondiente al 10%) del respectivo caldo de adaptación. Los erlenmeyer se

llevaron al baño termostatado con una agitación de 150 rpm y 30 ºC de

temperatura por un período de 10 días.

Terminado este tiempo, se procedió a analizar las muestras usando un Kit

enzimático de bioanálisis, distribuido por Boehringer Manheim / R-biopharm (ver

Anexo H). El procedimiento para preparar las muestras y poder aplicar el Kit fue el

siguiente:

1. Se filtraron las muestras empleando un filtro de gasa para separar la biomasa

del caldo de cultivo (ver Figura 6).

77

2. Se calentó en un baño María el filtrado anterior a 80 ºC por 15 minutos con el

fin de detener la actividad enzimática e inactivar los posibles rastros de

biomasa que hayan pasado el filtro.

3. Se alcalinizaron las muestras a un pH de aproximadamente 8,0.

Figura 6. Montaje realizado para filtrar las muestras antes de ser analizadas.

3.2.2. Diseño experimental para el Aspergillus carbonarius NRRL 368.

3.2.2.1. Preparación de la cepa de Aspergillus carbonarius NRRL 368. La

reconstitución se llevó a cabo tal como se describió en el apartado 3.1.1. Para el

mantenimiento de la cepa se prepararon 150 mL de medio Czapeck Malta

Modificado que fueron esterilizados y repartidos en cajas de petri y tubos

inclinados, puestos en incubadora a 27 ºC por 10 días.

3.2.2.2. Etapa de adaptación. Se prepararon 300 mL de medio líquido 2

ajustando su pH a 5,2 (9, 10). Luego se repartieron en porciones de 100 mL en

tres erlenmeyers de 250 mL (tapándolos con tapones de gasa y algodón para

evitar su contaminación), y se esterilizaron en el autoclave a 121 ºC y 15 psi de

presión por 15 minutos. Cuando los erlenmeyers estuvieron a temperatura

ambiente se procedió a sembrar la cepa que ya tenía 10 días de crecimiento en

medio sólido.

78

Teniendo los erlenmeyer sembrados se llevaron al baño termostatado con

agitación a 30 ºC y 200 rpm, por un período de 8 días.

3.2.2.3. Etapa de producción. Se utilizaron 2 L de suero que se trajeron de la

planta productora de quesos de la Industria Celema cuando se completaban 7

días de la etapa de adaptación. De estos 2 L de suero fresco se separaron 350 mL

como suero entero, 350 mL para desproteinizar, 350 mL para hidrolizar y 750 mL

para evaporar.

El procedimiento de preparación de los cuatro tipos de tratamientos de suero fue

el siguiente:

1. Suero entero: Es el suero traído de la planta procesadora de leche sin ningún

tipo de modificación, el cual tenía un pH de 6,6. Mientras se llegaba el

momento de la esterilización este suero se refrigeró en un erlenmeyer tapado

para que no se contaminara.

2. Suero desproteinizado: Se tomó el suero restante porque los otros 2

tratamientos también tienen suero desproteinizado. Para desproteinizar el

suero se ajustó su pH a 6,0 (pH de su punto isoeléctrico) y se llevó a un baño

María por 1 hora a 90 ºC. Terminado este tiempo se centrifugó todo el suero a

3.500 rpm durante 8 minutos. De todo el suero centrifugado se separaron 350

mL como suero desproteinizado que fueron guardados en nevera en un

erlenmeyer tapado hasta el momento de su esterilización.

3. Suero desproteinizado e hidrolizado: Del suero desproteinizado se sacaron 350

mL para hidrolizar. El procedimiento de la hidrólisis se realizó utilizando la

enzima lactasa (Maxilact de DMS, ver Anexo M), para lo cual se debió ajustar

el pH a 6,7 (el rango de pH requerido según la ficha técnica de la enzima es

6,6 – 6,8). Como se deseaba tener una hidrólisis del 80% en el menor tiempo

79

posible, se adicionaron 1,54 mL de la enzima después de haber ajustado el pH,

y se llevó el erlenmeyer a un baño María a 40 ºC por 1 hora. Terminada esta

hora se esperó que se enfriara para llevarlo a la nevera hasta que se

esterilizara.

4. Suero desproteinizado, hidrolizado y evaporado: El suero desproteinizado

restante se repartió en varios beakers de 100 mL que se pusieron sobre la

estufa en un baño María por un periodo de tiempo aproximado de 2 ½ horas

para poder reducirlos a la mitad de su volumen, con el fin de tener una

concentración del 50% del suero. Terminado este proceso se procedió a

centrifugar el suero a 3.500 rpm durante 8 minutos para separar las proteínas

que se desnaturalizaron con el calentamiento. Cuando el suero estuvo a

temperatura ambiente se ajustó su pH a 6,6 para poder adicionar 1,54 mL de la

enzima lactasa (Maxilact de DMS, ver Anexo M) e iniciar el proceso de

hidrólisis, que se realizó a las mismas condiciones que el suero anterior.

Cuando todos los sueros estuvieron preparados, se procedió a ajustar el pH a un

valor aproximado de 3,0 que es el requerido para la etapa de fermentación. Luego

de ajustar el pH, se procedió a esterilizar los sueros que se taparon con tapones

de gasa y algodón para evitar su contaminación. Estos tapones también permiten

el paso de aire que se necesita para la fermentación. En el momento en que los

erlenmeyer estuvieron a la temperatura ambiente se inocularon con 5 mL de

pellets provenientes de la etapa de adaptación, y se llevaron al baño termostatado

con agitación a 30 ºC y 200 rpm, por un período de 10 días.

Pasado el tiempo de la fermentación, las muestras se filtraron e inactivaron para

ser guardadas en el congelador hasta que se determinaran la cantidad de ácido

cítrico producido, los azúcares reductores como lactosa (ver Anexo B) y proteína

(ver Anexo E). Estos mismos análisis se realizaron a los sueros sin fermentar.

80

Diseño experimental: Fue de un factor a cuatro niveles y con tres réplicas por

nivel (tratamiento).

Factor: Tipo de suero.

Tratamientos: Suero entero, Suero desproteinizado, Suero desproteinizado

hidrolizado, Suero desproteinizado, hidrolizado y evaporado.

Variables fijas: pH inicial (3,0), temperatura (30 ºC), agitación (200 rpm), tiempo

de adaptación (8 días) y el tiempo de fermentación (10 días).

Variable de respuesta: Concentración de ácido cítrico en g/L.

Para el análisis de los datos obtenidos se utilizó el paquete estadístico

Statgraphics versión 5 Plus. Se realizó un análisis de varianza donde se tiene 1

factor, 4 tratamientos y 1 respuesta. Las hipótesis empleadas para el análisis de

varianza fueron:

Hipótesis nula (Ho): La media de todos los tratamientos es igual.

Hipótesis alterna (Ha): Alguna de las medias es diferente.

Los principales supuestos evaluados en el análisis de varianza fueron:

Normalidad de los errores por Shapiro – Wilk (11).

Homoscedasticidad de la varianza por Bartlett (11).

Independencia de los errores por un Método gráfico (11).

Mínima diferencia significativa (LSD) por Fisher, que equivale a la prueba de

Tukey (11).

Para la prueba de Normalidad se utilizaron las siguientes hipótesis:

81

Ho: Los datos provienen de una distribución normal.

Ha: Los datos no provienen de una distribución normal.

Para la prueba de Homoscedasticidad las hipótesis fueron:

Ho: Las varianzas de todos los tratamientos es igual.

Ha: Alguna de las varianzas es diferente.

3.2.3. Diseño experimental para el Aspergillus carbonarius NRRL 67.

3.2.3.1. Preparación de la cepa de Aspergillus carbonarius NRRL 67. La

reconstitución se llevó a cabo utilizando las mismas condiciones de medio de

cultivo, esterilización y días de incubación, empleadas para el Aspergillus

carbonarius NRRL 368.


ajustando su pH a 5,0. Luego se distribuyó esta cantidad en porciones de 100 mL

en tres erlenmeyers de 250 mL (tapándolos con tapones de gasa y algodón para

evitar su contaminación), y se esterilizaron en el autoclave a 121 ºC y 15 psi de

presión por 15 minutos. Cuando los erlenmeyer estuvieron a temperatura

ambiente se procedió a sembrar la cepa que ya tenía 10 días de crecimiento. El

resto del procedimiento fue igual al descrito en el apartado 3.2.2.


agitación a 30 ºC y 200 rpm, por un periodo de 8 días.

82

3.2.3.3. Etapa de producción. Al igual que para la etapa de producción del

Aspergillus carbonarius NRRL 368, se utilizaron 2 L de suero que se trajeron de la

planta productora de quesos de la Industria Celema cuando se completaban 7

días de la etapa de adaptación. Además, se realizó el mismo procedimiento para

tratar y preparar los sueros. La preparación de los sueros se trabajó igual a los

procedimientos descritos en el apartado 3.2.2.3.








con agitación a 30 ºC y 200 rpm, por un periodo de 10 días.

Pasado el tiempo de la fermentación, se llevó a cabo los análisis correspondientes

a la concentración de ácido cítrico, concentración de azúcares reductores como

lactosa y concentración de proteína.

El diseño experimental se planteó de la misma manera descrita en el apartado

3.2.2.3. De igual manera se realizó el análisis de varianza.

3.2.4. Diseño experimental para el Aspergillus niger NRRL 3.

3.2.4.1. Preparación de la cepa de Aspergillus niger NRRL 3. La reconstitución

se llevó a cabo tal como se describió en el apartado 3.1.1, y para el

mantenimiento de la cepa se prepararon 150 mL de medio Czapeck que fueron

83

esterilizados y repartidos en cajas de petri y tubos inclinados, puestos en

incubadora a 37 ºC por 10 días.


ajustando su pH a 4,5. Luego se repartieron en porciones de 100 mL en tres

erlenmeyer de 250 mL (tapándolos con tapones de gasa y algodón para evitar su

contaminación), y se esterilizaron en el autoclave a 121 ºC y 15 libras de presión

por 15 minutos. Cuando los erlenmeyer estuvieron a temperatura ambiente se

procedió a sembrar la cepa que ya tenía 10 días de crecimiento.


agitación a 30 ºC y 200 rpm, por un periodo de 8 días.

3.2.4.3. Etapa de producción. Al igual que para la etapa de producción de las

cepas anteriores, se utilizaron 2 L de suero que se trajeron de la empresa lechera

de Manizales Celema cuando se completaban 7 días de la etapa de adaptación.

Además, se realizó el mismo procedimiento para tratar y preparar los sueros. La

preparación de los sueros se trabajó igual a los procedimientos descritos en el

apartado 3.2.2.3.








con agitación a 30 ºC y 200 rpm, por un periodo de 10 días.

84

Pasado el tiempo de la fermentación, se llevó a cabo los análisis correspondientes

a la concentración de ácido cítrico, concentración de azúcares reductores como

lactosa y concentración de proteína.

El diseño experimental se planteó de la misma manera descrita en el apartado

3.2.2.3. De igual manera se realizó el análisis de varianza.

3.3. BIOSÍNTESIS DE ÁCIDO CÍTRICO

El objetivo de esta etapa fue construir las curvas biocinéticas de consumo de

sustrato, crecimiento de biomasa y biosíntesis de ácido cítrico. Esta parte de la

investigación se pudo realizar únicamente después de tener los resultados

obtenidos en la determinación del medio óptimo de fermentación, que arrojaron la

cepa de hongo y el tipo de suero a utilizar.

Lo primero que se realizó fue la preparación de los medios de cultivo para incubar

microorganismo de acuerdo con lo descrito en el numeral 3.1.

Para la etapa de adaptación de la cepa se prepararon 300 mL de medio líquido 2

(Tabla 14) ajustando su pH a 4,98 (9,10). Luego se repartieron en porciones de

100 mL en tres erlenmeyer de 250 mL (tapándolos con tapones de gasa y algodón

para evitar su contaminación), y se esterilizaron en autoclave a 121°C y 15 libras

de presión por 15 minutos. Cuando los erlenmeyers estuvieron a temperatura

ambiente se sembraron con cepa que tenía 10 días en incubadora, y se llevaron al

baño termostatado a 30 °C y 200 rpm por un período de 10 días.

Para la etapa de producción se emplearon 4 litros de suero de la planta productora

de quesos de la empresa lechera de Manizales para preparar 1,5 litros de suero

desproteinizado, hidrolizado y evaporado, que serían dispuestos en el

85

microfermentador Applikon (ver Anexo K) para realizar el estudio de la cinética del

proceso de fermentación.

El suero tenía un pH inicial de 6,57, que se ajustó a 6,02 para realizar la

desproteinización por 1 hora a 90 °C en el baño María. Este suero desproteinizado

se pasó por un filtro de gasa y se dispuso en varios beakers para realizar la

evaporación hasta la mitad de su volumen. Cuando se tuvo el suero evaporado se

pasó por la centrífuga a 3.500 rpm por 8 minutos con el fin de separar los residuos

de proteína que alcanzaron a decantar durante este proceso. Teniendo el suero

(1.640 mL) a temperatura ambiente se ajustó su pH a 6,6 para adicionar 7,2 mL de

enzima lactasa (Maxilact DMS) y poder iniciar la hidrólisis en el baño María a

40 °C por 1 hora.

El pH al cual se dejó el suero para iniciar la fermentación fue de 3,05. Terminado

este proceso se esterilizó el suero en autoclave a 121°C y 15 psi de presión por 15

minutos, tapando los erlenmeyers con tapones de algodón y gasa para evitar su

contaminación. De este suero preparado se tomó una muestra para determinar la

cantidad de azúcares reductores y proteína.

Mientras se realizaba esta esterilización, se esterilizó el microfermentador

(incluyendo todos sus accesorios) con el vapor de la caldera del Laboratorio de

Plantas Piloto de la Universidad Nacional de Colombia sede Manizales por 1 ½

hora. A la manguera de suministro de aire al equipo se le adaptó un filtro de lana

de vidrio, buscando la purificación del aire durante todo el proceso de

fermentación.

Luego de tener todo el equipo esterilizado junto con el medio de cultivo, se

procedió a realizar la siembra del suero en el microfermentador, agregando 80 mL

de caldo de adaptación. Este volumen de caldo se consiguió mezclando dos de los

erlenmeyer que mejores pellets produjeron durante la etapa de adaptación,

86

dejando decantar para lograr mayor concentración de hongo. Para eliminar la

formación de espuma se adicionaron antiespumantes.

El proceso de fermentación se inició inyectando aire a razón de 0,33 vvm

(volumen de aire por volumen de caldo en un minuto), 200 rpm y 30 °C durante los

dos primeros días de la fermentación. Durante los siguientes 8 días se inyectó aire

a razón de 0,62 vvm y 300 rpm, manteniendo la temperatura entre 28 y 34 ºC, ya

que el baño termostatado no nos permitió tener un control exacto de la misma. En

la Figura 7 se muestra el montaje del equipo para esta etapa.

Figura 7. Montaje del biorreactor Applikon para la fermentación del ácido cítrico con A. niger NRRL 3.

1. Baño termostatado con mangueras de entra y salida de agua para controlar la temperatura. 2. Microfermentador Applikon. 3. Motor agitador. 4. Motor de aire regulable conectado a una manguera para suministrar el oxígeno al

Microfermentador. 5. Controlador manual para el agitador. 6. Tomamuestras que consta de dos pipetas de 10 mL despuntadas conectadas a los extremos

de una manguera de látex. 7. Pinzas para sellar los extremos de la manguera del tomamuestras. 8. Manguera de látex para la salida de oxígeno. 9. Erlenmeyer de 1 litro para controlar el burbujeo de oxígeno dentro del Microfermentador. 10. Pera para succionar las muestras.

87

Las muestras se tomaron empleando una pera como medio de succión que se

ponía en la pipeta de salida cada vez que se realizaba una toma para evitar que

se contaminara. El volumen de muestra por toma fue de 10 mL, los cuales se

dispusieron en un tubo de ensayo tapa rosca que se llevó a un baño María por 15

minutos (para detener la actividad enzimática y crecimiento microbiológico) y luego

se enfrió con agua para poder ser refrigerado. Se recogieron tres muestras por día

con un lapso de 6 horas para determinar la cantidad de biomasa, azúcares

reductores totales y ácido cítrico durante 10 días.

Terminada la toma de muestras se lavaba la pipeta con alcohol para evitar que se

contaminara con otros microorganismos y la proliferación del hongo en la misma.

3.3.1. Determinación de las curvas biocinéticas. Para la construcción de las

curvas biocinéticas experimentales que determinaban la cinética de la

fermentación del ácido cítrico empleando suero de leche, se midió periódicamente

el consumo de sustrato, crecimiento celular y producción de ácido cítrico,

realizando pruebas específicas para la determinación de estas variables durante el

transcurso de la fermentación. Los datos obtenidos con las mediciones sirvieron

para encontrar los parámetros de las ecuaciones que mejor se ajustaban a las

curvas experimentales.

➢ Concentración de sustrato (S): Se refiere al consumo de azúcares reductores

totales presentes en el suero de leche desproteinizado, hidrolizado y

evaporado. Su valor disminuye con el tiempo debido al metabolismo de la cepa

fúngica ya que éste se va transformando en biomasa y ácido cítrico. Esta

variable se mide en g/L. Su determinación se llevó a cabo por el método

mostrado en el Anexo J.

➢ Concentración de biomasa (X): Es la cantidad de masa celular del hongo

filamentoso presente en el medio por unidad de volumen. Esta variable crece a

88

medida que el tiempo de fermentación aumenta, y se mide en g/L, su

determinación se realizó por el método de peso seco que se describe en el

Anexo L.

➢ Concentración de producto (P): Con esta variable se obtiene la producción de

ácido cítrico en g/L. Su concentración va aumentando con el tiempo a medida

que el microorganismo en su proceso metabólico transforma el sustrato y

expulsa el ácido. Su determinación se realizó con el Kit enzimático de

bioanálisis de Boehringer que se describe en el Anexo H.

3.3.2. Modelamiento de la cinética de la fermentación. Para desarrollar el

modelo biocinético se llevaron a cabo los siguientes pasos:

1. Planteamiento del modelo: Se escogieron las ecuaciones que de acuerdo a la

literatura y a determinados criterios basados en su mayoría en el tipo de curva

que muestre el crecimiento celular, modele con la mayor precisión las curvas

biocinéticas.

2. Determinación de parámetros: En esta parte se establecieron los parámetros

de las ecuaciones escogidas anteriormente.

3. Solución del modelo: Luego de tener las ecuaciones con los parámetros

definidos se procedió a solucionar el modelo.

89

4. ANÁLISIS DE RESULTADOS

4.1. PREPARACIÓN DE LA CEPA 4.1.1. Reconstitución de la cepa. Para reconstituir la cepa se realizaron dos

ensayos:

1. Se diluyó el liofilizado en agua destilada para luego sembrarlo en las cajas de

petri con medio de cultivo.

2. Se diluyó el liofilizado en agua destilada y se pasó a un caldo nutritivo Czapeck

con el fin de “desestresar” la cepa, para luego disponerla en el medio de

cultivo.

Con el primer ensayo el crecimiento del hongo fue muy lento (15 días) y con poca

esporulación. En el segundo, el hongo creció en el tiempo recomendado por la

bibliografía (5), con una muy buena esporulación. Por esta razón se decidió que la

reconstitución de las cepas se iba a realizar utilizando el caldo nutritivo antes de

disponerlas en los medios de cultivo sólido.

4.1.2. Mantenimiento de la cepa. Con base en los datos bibliográficos y en los

medios disponibles se procedió a realizar la siembra de los hongos. Los resultados

obtenidos se muestran en la Tabla 16.

90

Tabla 16. Descripción de las cepas fúngicas con cada uno de los medios de cultivo empleados.

Cepa Medio agar Temperatura Observaciones A. niger NRRL 3 Czapeck 37 ºC Presentó un crecimiento regular

en un tiempo de incubación de 4 días

A. niger (Bogotá) Czapeck 37 ºC Presentó un crecimiento regular en un tiempo de incubación de 4 días

A. carbonarius NRRL 368 Czapeck 37 ºC No creció A. niger NRRL 3 Sabouraud 37 ºC Presentó un mejor crecimiento

en un tiempo de incubación de 4 días

A. niger (Bogotá) Sabouraud 37 ºC Presentó un mejor crecimiento en un tiempo de incubación de 4 días

A. carbonarius NRRL 368 Sabouraud 37 ºC No creció A. niger NRRL 3 Czapeck 27 ºC Tuvo un crecimiento muy lento,

el tiempo de incubación fue de 10 días sin mucha proliferación de conidias

A. niger (Bogotá) Czapeck 27 ºC Tuvo un crecimiento muy lento, el tiempo de incubación fue de 10 días sin mucha proliferación de conidias

A. carbonarius NRRL 368 Czapeck 27 ºC No creció A. niger NRRL 3 Sabouraud 27 ºC El crecimiento fue bueno pero

en un tiempo no inferior a 4 días y no superior a 10

A. niger (Bogotá) Sabouraud 27 ºC El crecimiento fue bueno pero en un tiempo no inferior a 4 días y no superior a 10

A. carbonarius NRRL 368 Sabouraud 27 ºC No creció A. carbonarius NRRL 368 PDA 37 ºC No creció A. carbonarius NRRL 368 MEA 37 ºC No creció A. carbonarius NRRL 368 CYA 37 ºC No creció A. carbonarius NRRL 368 Czapeck Dox 37 ºC No creció A. carbonarius NRRL 368 Czapeck Malta 37 ºC Presentó un crecimiento

regular con poca proliferación de conidias en un tiempo de incubación de 10 días

A. carbonarius NRRL 368 Czapeck Malta Modificado

37 ºC Presentó un crecimiento un poco mejor que en malta en un tiempo de incubación de 10 días

A. carbonarius NRRL 368 PDA 27 ºC Tuvo un crecimiento regular con poca proliferación de conidias en un tiempo de incubación de 15 días

A. carbonarius NRRL 368 MEA 27 ºC Tuvo un crecimiento regular con un poco más de conidias que el PDA en un tiempo de incubación de 15 días

91

Cepa Medio agar Temperatura Observaciones A. carbonarius NRRL 368 CYA 27 ºC No creció A. carbonarius NRRL 368 Czapeck Dox 27 ºC No creció A. carbonarius NRRL 368 Czapeck Malta 27 ºC Buen crecimiento con buena

proliferación de conidias en un tiempo de incubación de 8 días

A. carbonarius NRRL 368 Czapeck Malta Modificado

27 ºC Muy buen crecimiento y una excelente proliferación de conidias en un tiempo de 8 días

Los medios de cultivo que mejor crecimiento y esporulación presentaron fueron el

Czapeck y el Sabouraud para el Aspergillus niger, pero por disponibilidad se

escogió el Czapeck. En el caso del Aspergillus carbonarius, los mejores resultados

se dieron con el medio Czapeck Malta Modificado. Para el A. niger las mejores

condiciones de tiempo fueron 4 días, por unificación de datos se escogió el mismo

tiempo de incubación que tuvo el Aspergillus carbonarius, lo cual inclusive

benéfica la conidiogénesis y la formación de micelio. Las condiciones a las cuales

se trabajaron las cepas se muestran en la Tabla 17.

Tabla 17. Condiciones de crecimiento de las cepas fúngicas en medios sólidos.

Cepa Medio agar Temperatura Tiempo incubación

A. niger NRRL 3 Czapeck 37 ºC 10 días A. niger (Bogotá) Czapeck 37 ºC 10 días A. carbonarius NRRL 368

Czapeck Malta Modificado

27ºC 10 días

A. carbonarius NRRL 368


27ºC 10 días

Los datos obtenidos demuestran los requerimientos de fuente de carbono

(sacarosa) y de sales de sodio, potasio, magnesio y hierro que tiene el A. niger

para su desarrollo y mantenimiento en medios sólidos. Igualmente se demuestra

los mayores requerimientos del A. carbonarius para su crecimiento en medios

sólidos en comparación con el A. niger. En particular se obtuvo que es necesario

complementar la fuente de carbono con extracto malta, además de que este

92

hongo tiene unos requerimientos mayores en sales (sales de zinc y cobre),

adicionales a las formuladas para el medio sólido del A. niger.

4.2. DETERMINACIÓN DEL MEDIO ÓPTIMO DE FERMENTACIÓN 4.2.1. Prediseño experimental. Antes de iniciar el diseño experimental se

realizaron análisis para conocer si verdaderamente las cuatro cepas producían

ácido cítrico. El pH utilizado inicialmente en las 2 etapas del proceso de

fermentación fue de 2,0 ± 0,1, pero como no dio buenos resultados se decidió que

para la etapa de adaptación se emplearía un pH de 5,0 ± 0,1, pH al que se da un

crecimiento óptimo del hongo, y para la etapa de producción se utilizaría un pH de

3,0 ± 0,1, en el que se da una buena producción de ácido cítrico según la

bibliografía (9, 10).

Con esta modificación en el pH, se procedió a realizar el análisis que determinaría

si las cepas tenían la capacidad de producir ácido cítrico. Los resultados obtenidos

se muestran en la Tabla 18.

Tabla 18. Concentración de ácido cítrico (g/L) arrojada durante el prediseño experimental.

Medio de adaptación Cepa Concentración de ácido cítrico

Medio 1 A. niger de los Andes 0 Medio 2 A. niger de los Andes 0 Medio 1 A. niger NRRL 3 0,23 Medio 2 A. niger NRRL 3 3,9126 Medio 1 A. carbonarius NRRL 368 0,0303 Medio 2 A. carbonarius NRRL 368 0,8423

Observaciones: Los medios anotados en la primera columna corresponden a los que se describen en las Tablas 13 y 14.

93

Estos resultados nos indican que la cepa de Aspergillus niger proveniente de la

Universidad de los Andes había perdido su capacidad productora, por lo cual no

fue posible utilizarla en las siguientes fases del diseño experimental. El mejor

medio para adaptar la cepa fúngica fue el medio 2 al tenerse una fuente adicional

de nitrógeno orgánico (en forma de aminoácidos libres y proteínas) para el

crecimiento del hongo contenida en el licor de remojo de maíz. Por ello se decidió

seguir utilizando el medio 2 durante todas las posteriores preparaciones del medio

de adaptación.

Antes de iniciar el diseño experimental que definió el mejor medio de producción

de ácido cítrico, se realizó un ensayo utilizando suero en la etapa de producción

con el fin de determinar el volumen del inóculo a utilizar en los experimentos

subsiguientes. Se repartieron 100 mL de cada uno de los sueros en erlenmeyers

de 250 mL, que se inocularon con 10 mL (10% del medio de producción) de caldo

de adaptación, dando como resultado una copiosa formación de biomasa,

consumiéndose todo el sustrato antes de terminar el tiempo de fermentación. Por

esta razón se tomó la decisión de disminuir la cantidad de inóculo a 5 mL (5% del

medio de fermentación).

4.2.2. Diseño experimental para el Aspergillus carbonarius NRRL 368. 4.2.2.1. Preparación de la cepa. La cepa se sembró tal como se especificó en el

apartado 3.1. Cuando el hongo comenzó a crecer, primero formó una peluza de

color blanco que luego se tornó de color negro carbón (ver Figura 8), lo cual

corresponde a las conidias formadas durante la esporulación del hongo. En el

revés de la caja de petri se observó un crecimiento radial de color blanco, que por

la tonalidad del medio se vio de color ámbar (ver Figura 9). De esta manera se

obtuvo suficiente material para la siembra de los medios de adaptación.

94

Figura 8. Vista superior del Aspergillus carbonarius NRRL 368 cultivado en medio agar Czapeck Malta Modificado.

Figura 9. Vista inferior del Aspergillus carbonarius NRRL 368 cultivado en medio agar Czapeck Malta Modificado.

4.2.2.2. Etapa de adaptación. En la adaptación de esta cepa al medio sintético,

se pudo observar aglomeraciones de materia oscura amorfa de color verde oscuro

de aspecto no muy compacto, que corresponde a aglomeraciones del hongo

cultivado en medio líquido sometido a agitación constante. El crecimiento se

orientó mayoritariamente a la formación de micelio y no a la formación de conidias.

95

4.2.2.3. Etapa de producción. Los resultados de las pruebas de azúcares

reductores totales y de proteína de los diferentes tipos de sueros preparados para

los diseños experimentales se muestran en la Tabla 19.

Tabla 19. Concentración de azúcares reductores totales (g/L) (Anexo J) y Concentración de Proteína (g/L) (Anexo I), para sueros antes de la fermentación con las diferentes cepas.

Tipo de suero Azúcares

reductores Proteína

Entero 52,282 38,27 Desproteinizado 50,329 5,57 Desproteinizado, hidrolizado 82,566 6,00 Desproteinizado, hidrolizado, evaporado 165,132 9,29

Con los datos presentados en la Tabla 19 se puede mostrar la efectividad del

procedimiento empleado para la desproteinización del suero. Igualmente se

observa el aumento en la concentración de azúcares reductores con la hidrólisis

de la lactosa y con la evaporación del medio.

Al realizar la siembra de los sueros con el inóculo del caldo de adaptación, se

mezcló el contenido de los tres erlenmeyers y se dejó decantar con el fin de

obtener la mayor cantidad posible de pellets para garantizar que se estaba

inoculando la cantidad suficiente de los mismos.

Los resultados de ácido cítrico obtenidos durante el diseño experimental se

pueden observar en la Tabla 20 y se encuentran representados en la Figura 10.

Como se puede observar en la Tabla 20 y en la Figura 10, la dispersión de los

datos fue muy alta a pesar del método altamente preciso utilizado para la

determinación de la concentración de ácido cítrico. El análisis estadístico realizado

nos indica que se acepta la hipótesis nula, al no encontrarse diferencia

96

significativa entre los tratamientos a un nivel de significancia del 5% (Pvalue*=

0,876).


carbonarius NRRL 368

Muestra Tipo de suero pH inicial pH final Concentración 1 Entero 2,96 2,77 4,6952 2 Entero 2,96 3,59 2,2003 3 Entero 2,96 2,43 13,2571 4 Desproteinizado 3,04 2,20 3,8988 5 Desproteinizado 3,04 2,15 12,6127 6 Desproteinizado 3,04 2,52 9,5746 7 Desproteinizado hidrolizado 2,95 2,52 5,3396 8 Desproteinizado hidrolizado 2,95 2,88 23,9365 9 Desproteinizado hidrolizado 2,95 3,21 2,2463

10 Desproteinizado hidrolizado evaporado

3,00 2,77 14,2698


3,00 2,91 13,0730


3,00 3,21 6,1222

Lo anterior indica que desde el punto de vista de la biosíntesis de ácido cítrico, el

hongo metaboliza los diferentes tipos de suero independientemente de la forma

como esté presente la fuente de carbono (lactosa o lactosa hidrolizada).

Igualmente la desproteinización del suero no representa una ventaja en la

biosíntesis de ácido cítrico por Aspergillus carbonarius NRRL 368.

Al aplicar la prueba de Shapiro – Wilk para comprobar el supuesto de normalidad

de los errores, se obtuvo como resultado que se acepta la hipótesis nula, al no

haber diferencia significativa en la distribución de los datos a un nivel de

significancia del 5% (Pvalue= 0,132161).

* Pvalue corresponde al área a la derecha del estadístico calculado.

97

Figura 10. Concentración de ácido cítrico en cada uno de los tratamientos de suero con Aspergillus carbonarius NRRL 368.

Al aplicar la prueba de Bartlett para comprobar la homoscedasticidad nos dio

como resultado que se acepta la hipótesis nula, al no haber diferencia significativa

en las varianzas a un nivel de significancia del 5% (Pvalue= 0,487086). Estos

resultados nos demuestran la validez del diseño experimental utilizado.

Los resultados obtenidos nos llevan a la necesidad de profundizar el estudio de

este hongo, y la influencia que pueden tener las condiciones de la etapa de

mantenimiento y adaptación sobre la capacidad de biosintetizar ácido cítrico. La

continuación de este estudio puede potencialmente mostrar la influencia del tipo

de suero utilizado durante la etapa de producción, en dependencia de las

condiciones anteriores de mantenimiento y adaptación. Por todo ello el Aspergillus

carbonarius NRRL 368 no puede descartarse como potencial productor de ácido

cítrico a partir de suero de leche.

4.2.3. Diseño experimental para el Aspergillus carbonarius NRRL 67

1 2 3

0

5

10

15

20

25

Concentración (g/L)

Réplicas

Suero enteroSuero desproteinizado

Suero hidrolizado, desproteinizado

Suero evaporado, hidrolizado, desproteinizado

98

4.2.3.1. Preparación de la cepa. La cepa se sembró tal como se especificó en el

apartado 3.1. Al igual que el Aspergillus carbonarius NRRL 368, este hongo

cuando comenzó a crecer formó una peluza de color blanco que luego se tornó de

color negro carbón (ver Figura 11), lo cual corresponde a las conidias formadas

durante la esporulación del hongo. En el revés de la caja de petri se observó un

crecimiento radial de color blanco, que por la tonalidad del medio se vio de color

ámbar (ver Figura 12). De esta manera se obtuvo suficiente material para la

siembra de los medios de adaptación.

Figura 11. Vista superior del Aspergillus carbonarius NRRL 67 cultivado en medio agar Czapeck Malta Modificado.

Figura 12. Vista inferior del Aspergillus carbonarius NRRL 67 cultivado en medio agar Czapeck Malta Modificado.

99

4.2.3.2. Etapa de adaptación. El comportamiento de esta cepa en la adaptación

al medio líquido fue muy similar al del Aspergillus carbonarius NRRL 368, solo que

en este caso se observó una mejor aglomeración de microorganismos aunque de

manera amorfa. De esta forma, el crecimiento se orientó mayoritariamente a la

formación de micelio y no a la formación de conidias.

4.2.3.3. Etapa de producción. Al realizar la siembra de los sueros con el inóculo

del caldo de adaptación, también se mezcló el contenido de tres erlenmeyer y

dejándolos decantar, para tener la mayor cantidad posible de pellets al momento

de realizar la inoculación.



Los datos de azúcares reductores y proteína se muestran en los Anexos C y F

respectivamente.


carbonarius NRRL 67 Muestra Tipo de suero pH inicial pH final Concentración

1 Entero 3,04 2,19 0,0524 2 Entero 3,04 2,13 12,6587 3 Entero 3,04 2,40 6,8126 4 Desproteinizado 2,96 2,08 3,8344 5 Desproteinizado 2,96 2,09 1,8600 6 Desproteinizado 2,96 2,10 15,6968 7 Desproteinizado hidrolizado 3,03 2,84 0,7411 8 Desproteinizado hidrolizado 3,03 2,71 0,0460 9 Desproteinizado hidrolizado 3,03 2,23 1,9931


2,98 2,42 10,7714


2,98 2,32 7,9634


2,98 2,80 4,0047

100

Figura 13. Concentración de ácido cítrico en cada uno de los tratamientos de suero con Aspergillus carbonarius NRRL 67.

Como se puede observar en la Tabla 21 y en la Figura 13, la dispersión de los

datos es muy alta a pesar del método altamente preciso utilizado para la

determinación de la concentración de ácido cítrico. El análisis estadístico realizado

nos indica que se acepta la hipótesis nula, al no encontrarse diferencia

significativa entre los tratamientos a un nivel de significancia del 5% (Pvalue=

0,4156).

Al igual que con el Aspergillus carbonarius NRRL 368, el hongo metaboliza los

diferentes tipos de suero independientemente de la forma como esté presente la

fuente de carbono (lactosa o lactosa hidrolizada). Tampoco se muestra una

ventaja al desproteinizar el suero para la biosíntesis del ácido cítrico.

Al aplicar la prueba de Shapiro – Wilk para comprobar el supuesto de normalidad

de los errores, se obtuvo como resultado que se acepta la hipótesis nula, al no

haber diferencia significativa en la distribución de los datos a un nivel de

significancia del 5% (Pvalue= 0,170348).

1 2 3

02468

10121416


Réplicas

Suero entero

Suero desproteinizadoSuero hidrolizado, desproteinizado


101



en las varianzas a un nivel de significancia del 5% (Pvalue= 0,166383). Estos

resultados nos demuestran la validez del diseño experimental utilizado.

Al igual que con el Aspergillus carbonarius NRRL 368, los resultados obtenidos

nos llevan a la necesidad de profundizar el estudio con el A. carbonarius NRRL 67,

mirando la influencia que pueden tener las condiciones de la etapa de

mantenimiento y adaptación sobre la capacidad de biosintetizar ácido cítrico, como

también, la influencia del tipo de suero utilizado durante la etapa de producción, en

dependencia de las condiciones anteriores de mantenimiento y adaptación. Por

todo ello el Aspergillus carbonarius NRRL 67 tampoco puede descartarse como

potencial productor de ácido cítrico a partir de suero de leche.

4.2.4. Diseño experimental para el Aspergillus niger NRRL 3 4.2.4.1. Preparación de la cepa. La cepa se sembró tal como se especificó en el

apartado 3.1. Como las cepas anteriores, el Aspergillus niger NRRL 3 cuando

comenzó a crecer formó una peluza de color blanco pero al final las conidias

fueron de color negro café cuando crecieron en el medio Czapeck, pero con el

medio Sabouraud las esporas fueron de color negro (ver Figura 14),

presentándose en el revés de la caja de petri un crecimiento radial de color blanco

(ver Figura 15).

4.2.4.2. Etapa de adaptación. Al final de la etapa de adaptación el Aspergillus

niger NRRL 3 presentó una formación de los pellets de color negro aunque

amorfos. El líquido en el que se encontraban suspendidos tenía una coloración

negro-café (ver Figura 16). Lo anterior indica un crecimiento de micelio mas no de

102

conidias. Es de anotar que la forma de los agregados fue condicionada por la

intensidad de la agitación.

Figura 14. Vista superior del Aspergillus niger NRRL 3 cultivado en medio agar Sabouraud.

Figura 15. Vista inferior del Aspergillus niger NRRL 3 en medio de cultivo Sabouraud.

Figura 16. Vista del medio de adaptación antes de ser inoculado el suero con Aspergillus niger NRRL 3.

103

4.2.4.3. Etapa de producción. Como en las etapas anteriores al momento de

realizar la siembra de los sueros con el inóculo del caldo de adaptación se mezcló

el contenido de tres erlenmeyers y se dejó decantar para tener la mayor cantidad

posible de pellets. Una visión clara de la formación de los pellets al final de la

fermentación se puede observar en el Anexo N



Los datos de azúcares reductores y proteína se muestran en los Anexos D y G.


niger NRRL 3 Muestra Tipo de suero pH inicial pH final Concentración

1 Entero 3,02 1,89 0,0151 2 Entero 3,02 2,57 0,7319 3 Entero 3,02 1,95 0,2803 4 Desproteinizado 2,96 2,04 0,1629 5 Desproteinizado 2,96 1,90 0,0052 6 Desproteinizado 2,96 1,76 0,0244 7 Desproteinizado hidrolizado 2,97 2,39 3,1643 8 Desproteinizado hidrolizado 2,97 2,37 3,3419 9 Desproteinizado hidrolizado 2,97 2,29 2,7066


3,00 2,59 5,6619


3,00 2,46 6,7206


3,00 2,97 4,9253

Como se puede observar en la Tabla 22 y en la Figura 17, los mejores resultados

de biosíntesis de ácido cítrico se obtuvieron con el suero desproteinizado,

hidrolizado y evaporado con un promedio de concentración de 5,769 g/L, lo que

indica que conforme se va aumentando la concentración de sustrato (azúcares

reductores totales) aumenta también la concentración de ácido.

104

Figura 17. Concentración de ácido cítrico en cada uno de los tratamientos de suero con Aspergillus niger NRRL 3.

El Aspergillus niger no asimila adecuadamente la lactosa, lo que se puede

comprobar al observar las bajas concentraciones obtenidas con los tipos de suero

no hidrolizados. No obstante, cuando se hidroliza este carbohidrato los

rendimientos son mayores. Igualmente, la desproteinización del suero no parece

tener un efecto significativo en las concentraciones de ácido al no notarse

diferencias relevantes en las concentraciones obtenidas con suero entero o con

suero desproteinizado. Se sugiere por lo tanto adelantar ensayos con suero

hidrolizado y evaporado desproteinizándolo o no, lo que permitiría dilucidar el

efecto de las proteínas originales del lactosuero sobre la producción de ácido

cítrico.

El análisis estadístico realizado corrobora las anteriores conclusiones al indicar

que se acepta la hipótesis alterna, al encontrarse diferencia significativa entre los

tratamientos a un nivel de significancia del 5% (Pvalue= 0,0000).

Al realizar la prueba de LSD (mínima diferencia significativa), equivalente a la

prueba de Tukey para examinar cuáles son los tratamientos que presentan

diferencias significativas, se observa que entre los sueros 1 y 2 no hay una

1 2 3

0

1

2

3

4

5

6

7


Réplicas

Suero entero

Suero desproteinizado

Suero hidrolizado, desproteinizado


105

diferencia significativa, mientras que los tratamientos 3 y 4 son diferentes entre sí,

y diferentes con los tratamientos 1 y 2. Estos resultados se pueden observar en la

Tabla 23.

Tabla 23. Resultados de la prueba LSD para las concentraciones de ácido cítrico obtenidas con el Aspergillus niger NRRL 3.

Suero Media Grupos homogéneos 2 1 3 4

0,0643333 0,342333 3,07167

5,769

X X X X

Contraste Diferencia Límite +/- 1 – 2 1 – 3 1 – 4 2 – 3 2 – 4 3 – 4

0,278 *-2,72933 *-5,42667 *-3,00733 *-5,70467 *-2,69733

0,968603 0,968603 0,968603 0,968603 0,968603 0,968603



en las varianzas a un nivel de significancia del 5% (Pvalue= 0,0805712).

Considerando los resultados obtenidos, se decidió utilizar la cepa del hongo A.

niger NRRL3 y el tipo de suero desproteinizado, hidrolizado y evaporado par la

fermentación en el biorreactor.

4.3. BIOSÍNTESIS DE ÁCIDO CÍTRICO

En la Tabla 24 se relacionan los valores obtenidos experimentalmente que se

evalúan como el promedio de los datos tomados por día de fermentación,

correspondientes a una sola corrida. En la Figura 18 se muestran los datos de

106

consumo de sustrato que se determinó por la concentración de azúcares

reductores totales, la formación de biomasa y la producción de ácido cítrico,

correspondientes a la fermentación por lotes con Aspergillus niger NRRL 3.

Tabla 24. Datos experimentales de la formación de biomasa, consumo de sustrato y producción de ácido cítrico en un cultivo sumergido por lotes de Aspergillus niger NRRL 3.

Tiempo (días) Sustrato (g/L) Biomasa (g/L) Producto (g/L)

0 168,674 3,101 0 1 150,282 7,4500 0,052 2 150,7 10,2566 0,007 3 145,738 12,3966 0,201 4 129,663 24,6800 0,996 5 102,89 24,5533 2,7020 6 90,182 26,1333 2,7089 7 42,759 26,7566 3,1619 8 46,995 29,1000 2,2693 9 46,666 25,3500 2,7573

10 34,49 28,5600 3,3050 11 59,321 22,4600 3,7331

La cantidad de ácido cítrico producida en la biosíntesis fue mucho menor que la

lograda en el diseño experimental, ya que en esta parte se presentó una alta

formación de espuma debido a la inyección de aire. Esta formación de espuma no

permitió tener un flujo de aire mayor, debido a que un aumento progresivo en la

cantidad de espuma implica una disminución del medio de cultivo y una

obstrucción de las vías de salida de gases, con los consecuentes peligros de

contaminación de todo el montaje (ver Anexo Ñ). Lo anterior se constituyó en una

restricción del proceso de fermentación, que no se presenta en gran medida en el

caso de medios sintéticos y semi-sintéticos. El control de espuma fue difícil a pesar de la adición de antiespumantes como el

glicerol, por ejemplo, en algunos momentos se tuvo que aumentar la agitación

hasta el máximo del agitador para poder romper la capa de espuma y biomasa

107

que se formó en la parte superficial del medio, con el fin de permitir un mejor flujo

de aire y disponer de unas muestras más homogéneas. Figura 18. Datos experimentales de la formación de biomasa, consumo de sustrato y producción de ácido cítrico en un cultivo sumergido por lotes de Aspergillus niger NRRL 3.

Otra posible limitante es que el control de temperatura se realizó con un

termostato que presentaba oscilaciones de ± 3 ºC en la temperatura del agua en la

chaqueta del biorreactor, lo que necesariamente influye en el desempeño de la

biosíntesis de ácido cítrico.

Como podemos observar en la Figura 19 el consumo de proteína durante la

fermentación no tuvo cambios significativos durante todo el proceso, indicando

que el mayor consumo de nitrógeno se llevó a cabo durante el primer día de

fermentación, manteniéndose constante este consumo en los días siguientes.

Con base en los datos experimentales se calcularon los rendimientos aparentes

de biomasa y ácido cítrico, expresados como gramos de biomasa o ácido cítrico

producidos por gramo de sustrato consumidos. El rendimiento aparente se obtiene

a partir de los datos experimentales de la cinética de la fermentación y siempre es

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (días)

Con

cent

raci

ón (g

/L)

SustratoBiomasaProducto

108

menor al rendimiento estequiométrico, ya que tiene en cuenta el consumo de

sustrato tanto para la formación de nueva masa celular como para el

mantenimiento de la misma, mientras el rendimiento estequiométrico está basado

en la estequiometría de la fermentación.

Figura 19. Datos experimentales del consumo de proteína durante la fermentación en cultivo sumergido para la producción de ácido cítrico con A. niger NRRL 3.

Rendimiento aparente de biomasa

SSXXY SX−−

=0

0' Ec. 14

donde

X: Concentración final de biomasa, g/L

X0: Concentración inicial de biomasa, g/L

S: Concentración final de sustrato, g/L

S0: Concentración inicial de sustrato, g/L

• Rendimiento aparente de producto

SS

PY SP−

=0

' Ec. 15

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (días)

Con

cent

raci

ón (g

/L)

109

donde P es la concentración final de producto en g/L.

Los rendimientos aparentes obtenidos son:

Y’X/S = 0,1770 g biomasa/g sustrato

Y’P/S = 0,0341 g ácido cítrico/g sustrato

4.3.1. Modelamiento de la cinética de la fermentación. Para modelar la

biocinética se partió de los datos experimentales de la fermentación en cultivo

sumergido, que debido a su dispersión se decidió trabajar con las curvas

suavizadas. Las curvas suavizadas se obtuvieron utilizando el programa de

Microsoft Excel 2000, a través de curvas de ajuste polinómico.

4.3.1.1. Planteamiento del modelo. Para la curva de formación de biomasa se

escogió la ecuación logística (Ecuación 4) que describe mejor el comportamiento

de los datos experimentales. Una de las ventajas del empleo de esta ecuación es

que describe tanto la fase de crecimiento exponencial como la fase estacionaria.

Los valores de consumo de sustrato (azúcares reductores totales) fueron descritos

mejor mediante la ecuación 10, indicando que la velocidad de consumo de

sustrato es directamente proporcional a la velocidad de formación de biomasa.

Para analizar la formación de producto se utilizó la ecuación 9 que describe la

biosíntesis del ácido para el caso cuando la formación de producto está asociada

indirectamente al crecimiento celular, que es el tipo de fermentación característica

para ácidos orgánicos. De esta forma la velocidad de formación de producto es

directamente proporcional a la concentración de biomasa. Esta suposición se

110

fundamenta en que cuando el cultivo se encuentra en su fase estacionaria, la

acumulación del producto en el medio de cultivo es mayor.

Por lo tanto, el modelo cinético planteado con tres ecuaciones diferenciales

ordinarias con tres variables, quedó de la siguiente manera:

XqdtdP

dtdX

YdtdS

XXdtdX

P

SX

⋅=

⋅−=

−=

1

2βε

Sistema 1

Para un ajuste más adecuado de los datos experimentales, se utilizaron las

siguientes aproximaciones polinómicas, lo cual permitió suavizar las curvas

experimentales. Los coeficientes de determinación fueron adecuados teniendo en

cuenta la naturaleza netamente experimental de los datos.

Para la biomasa:

101363540233923922001880 234 ,,,,, +++−= xxxxy Ec. 16

Para el sustrato:

67168934803481429290 23 ,,,, ++−= xxxy Ec. 17

Para el producto:

003600933000630 23 +++−= xxxy ,,, Ec. 18

111

4.3.1.2. Determinación de los parámetros cinéticos. Para resolver el sistema 1

se hace necesario conocer los coeficientes de cada una de las ecuaciones, los

cuales corresponden a los parámetros del modelo cinético. En el caso de modelos

no estructurados y no segregados, el valor de estos parámetros es único para

cada sistema de fermentación, por lo que se deben encontrar a partir de los datos

experimentales de las curvas biocinéticas.

Para encontrar los parámetros de la ecuación logística que simula la formación de

biomasa, se linearizó dicha ecuación graficando los valores obtenidos de dtdX

X⋅

1

vs X, tomándose el término independiente y la pendiente de la línea recta

resultante de la linearización. La regresión lineal obtenida se muestra en la Figura

20.

Figura 20. Determinación de los parámetros de la ecuación logística que modela la formación de biomasa.

De acuerdo con la Figura 20, el intercepto con el eje y corresponde al parámetro ε

y la pendiente al valor de β. Por lo tanto la ecuación que simula la biomasa es:

y = -0.0286x + 0.8069R2 = 0.9855

00.1

0.20.3

0.40.5

0.60.7

0.8

0 5 10 15 20 25 30X (g/L)

(1/X

)*(d

X/dt

)

112

20286080690 XXdtdX ,, −= Ec. 19

Para determinar el parámetro cinético de la ecuación utilizada para modelar el

consumo de sustrato, se graficó dtdS vs

dtdX . La línea obtenida se muestra en la

Figura 21.

Figura 21. Determinación del parámetro de la ecuación que modela el consumo de sustrato.

Donde el valor de la pendiente corresponde al valor del término S

XY1 . Por lo tanto

la ecuación que simula el consumo de sustrato es:

dtdX

dtdS 90614,−= Ec. 20

Según el modelo propuesto, el valor del rendimiento de biomasa teórico es de:

y = -4.9061x + 13.183R2 = 0.9164

-18-16-14-12-10-8-6-4-20

0 1 2 3 4 5 6

dX/dt

dS/d

t

113

20380906141 ,

,==

SXY

que es mayor al rendimiento aparente.

De igual manera, el parámetro de la ecuación que modela la producción de ácido

cítrico se calcula graficando dtdP vs X. La línea obtenida se muestra en la Figura

22.

Figura 22. Determinación del parámetro de la ecuación que modela la producción de ácido cítrico.

Donde la pendiente de esta recta linealizada corresponde al parámetro qP. Por lo

tanto la ecuación que simula la producción de ácido cítrico es:

XdtdP 01630,= Ec. 21

y = 0.0163x + 0.1336R2 = 0.9399

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 5 10 15 20 25 30

X (g/L)

dP/d

t

114

De acuerdo con lo anterior, las ecuaciones que modelan el sistema de

fermentación son:

XdtdP

dtdX

dtdS

XXdtdX

01630

89541

0286080690 2

,

,

,,

=

−=

−=

Sistema 2

4.3.1.3. Solución del modelo. El sistema 2 está conformado por un sistema de

ecuaciones diferenciales ordinarias simultáneas que se resolvió utilizando la rutina

Runge – Kutta de cuarto orden de paso fijo mediante el programa Turbo Basic.

Las condiciones iniciales establecidas para resolver el sistema fueron:

Tiempo cero: t0 = 0 horas

Biomasa en t0: X0 = 3,101 g/L

Sustrato en t0: S0 = 168,674 g/L

Producto en t0: P0 = 0 g/L

Los resultados de la solución del modelo se muestran en las Figuras 23 A y 23 B.

Como podemos observar en la Figura 23, el modelo para la formación biomasa

planteado describe adecuadamente los datos experimentales, mientras que el

modelo encontrado para el consumo de sustrato se aproxima a los datos

experimentales.

115

Figura 23. Simulación del sustrato y la biomasa en la fermentación para la producción de ácido cítrico con Aspergillus niger NRRL 3.

Nota: Las líneas continuas corresponden a los datos calculados por el modelo, las curvas

con puntos discretos corresponden a los datos experimentales.

Se recomienda explorar la posibilidad de utilizar modelos matemáticos más

complejos, lo que implicaría la necesidad de determinar más parámetros cinéticos

y mayor número de datos experimentales para lograr un mejor ajuste en el modelo

del sustrato. Otra opción, es utilizar modelos estructurados, pero sería necesario

un estudio exhaustivo de las vías metabólicas de biosíntesis de ácido cítrico en la

especie de microorganismo que se utilizó.

Como podemos observar en la Figura 24, el modelo para la formación de producto

planteado describe adecuadamente los datos experimentales.

Considerando lo anterior se recomiendan las condiciones de cultivo sumergido

para la obtención de ácido cítrico a partir de suero de leche que aparecen en la

Tabla 25.

020

406080

100120140

160180

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (días)

Con

cent

raci

ón (g

/L)

Modelo para el sustrato Modelo para la biomasaSustrato Biomasa

116

Figura 24. Simulación del producto en la fermentación para la producción de ácido cítrico con Aspergillus niger NRRL 3.

Nota: Las líneas continuas corresponden a los datos calculados por el modelo, las curvas

con puntos discretos corresponden a los datos experimentales.

Tabla 25. Condiciones para realizar la fermentación del ácido cítrico en cultivo sumergido a partir de suero de leche.

Condición Valor Unidades Temperatura 30 ºC Agitación en la adaptación 200 rpm Agitación fermentación en las primeras 48 horas 200 rpm Agitación fermentación en las horas siguientes 300 rpm pH al iniciar la adaptación 5,0 -o- pH al iniciar la fermentación 3,0 -o- Duración de la etapa de adaptación 8 Días Duración de la etapa de producción 11 Días

00.5

1

1.52

2.53

3.54

4.5

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (días)

Con

cent

raci

ón (g

/L)

Moldeo para el producto Producto

117

5. CONCLUSIONES

En esta etapa inicial del trabajo se pudo comprobar que el suero de leche es

un medio que ofrece los nutrientes necesarios para producir ácido cítrico

utilizando como microorganismos transformadores del proceso Aspergillus

carbonarius y Aspergillus niger.

El suero de leche es un medio rico en nutrientes, necesarios para permitir el

crecimiento de las cepas utilizadas.

El Aspergillus carbonarius es un hongo que requiere una mayor cantidad de

sales y fuentes adicionales de carbono para su mantenimiento en medios

sólidos, como las ofrecidas por el medio sólido Czapeck Malta Modificado.

Las condiciones a las que mejor crecen en medios sólidos las cepas de

Aspergillus carbonarius y Aspergillus niger son 27 ºC y 37 ºC, respectivamente,

en un tiempo de 10 días, permitiendo una mejor conidiogénesis y formación de

micelio.

Para adaptar el hongo a la fermentación se debe utilizar un medio líquido que

tenga fuentes de nitrógeno orgánicas como el licor de maceración de maíz

para permitir un mejor crecimiento de la cepa.

La etapa de adaptación se realiza a 200 rpm durante un tiempo de 10 días, por

ser el tiempo en el que se obtiene la suficiente cantidad de hongo en el medio

líquido para inocular el caldo de fermentación. El pH inicial del medio líquido de

118

adaptación debe ser de 5,0 para permitir el adecuado crecimiento del

microorganismo.

Desde el punto de vista de la biosíntesis de ácido cítrico, el Aspergillus

carbonarius es un hongo que metaboliza los tipos de suero

independientemente de la cantidad de proteína que contenga éste y la forma

en que se encuentre la fuente de carbono.

Las cepas de Aspergillus carbonarius NRRL 368 y Aspergillus carbonarius

NRRL 67 tienen un comportamiento similar en cuanto a la producción de ácido

cítrico debido a que uno es homólogo del otro. Por esta razón se hace

independiente el uso de uno de los dos para iniciar un estudio en particular con

respecto a la producción de ácido cítrico.

Se pudo comprobar la poca asimilación que tiene el Aspergillus niger NRRL 3

hacia la lactosa cuando esta se encuentra en su forma no hidrolizada.

Se presentaron diferencias significativas en el diseño experimental del A. niger

NNRL 3 ya que las mejores condiciones de biosíntesis correspondieron al

suero desproteinizado, hidrolizado y evaporado, lo cual indica que este hongo

requiere una alta concentración de sustrato para la biosíntesis de ácido cítrico,

de ahí la necesidad de hidrolizar la lactosa del suero y concentrar el medio.

Cuando se provee de aire el suero de leche produce una gran cantidad de

espuma, que se constituye en una limitante del proceso fermentativo al

provocar una disminución en el volumen del medio de cultivo y no permitir un

adecuado suministro de aire al mismo.

En el empleo del A. niger para producir ácido cítrico a partir de suero de leche

hay un gran campo por investigar ya que los rendimientos son muy inferiores a

los obtenidos en la industria.

119

El modelo cinético planteado para la fermentación en cultivo sumergido del

ácido cítrico se ajusta adecuadamente a los datos experimentales, aunque no

se descarta que con un mayor número de datos, el empleo de modelos

cinéticos más complejos y un estudio detallado de las vías metabólicas se

pueda lograr un ajuste mayor.

No se tuvo en cuenta el efecto del contenido de agua en el suero de leche

porque no hacía parte de éste trabajo el analizar la influencia de ciertos

compuestos en la biosíntesis del ácido cítrico.

120

6. RECOMENDACIONES

Se recomienda explorar la posibilidad de utilizar cepas industriales o

patentadas de A. niger que garanticen un alto nivel de producción de ácido

cítrico, ya que las cepas disponibles son naturales y no mutadas

genéticamente, lo que influye directamente en los rendimientos obtenidos. Se

requiere una interacción entre la industria y la universidad que garantice el

secreto industrial para llevar a cabo estos estudios con las cepas

mencionadas.

Se sugiere utilizar el mismo suero como medio de adaptación o incluir una

etapa de preadaptación en medio nutritivo líquido con una posterior adaptación

en suero de leche.

Para dilucidar el efecto de las proteínas originales del lactosuero sobre la

producción de ácido cítrico con Aspergillus niger se aconseja adelantar

ensayos con suero hidrolizado y evaporado retirando y manteniendo las

proteínas.

Se invita a continuar los estudios de obtención de ácido cítrico con Aspergillus

niger en erlenmeyer con diferentes grados de hidrólisis de lactosa y de

agitación, para definir otras condiciones de cultivo en el biorreactor, que

posibiliten un aumento del rendimiento del producto.

Los resultados obtenidos con el Aspergillus carbonarius NRRL 368 y NRRL 67

llevan a la necesidad de profundizar el estudio de este hongo, analizando la

121

influencia que pueden tener las condiciones de la etapa de mantenimiento y

adaptación sobre la capacidad de biosintetizar ácido cítrico, mostrando

potencialmente la influencia del tipo de suero utilizado durante la etapa de

producción. Por lo tanto, el A. carbonarius NRRL 368 y NRRL 67 no pueden

descartarse como potenciales productores de ácido cítrico a partir de suero de

leche.

Se propone utilizar un mejor control de temperatura en la biosíntesis del ácido

cítrico, como por ejemplo un dispositivo electrónico, ya que este es un factor

que afecta el rendimiento en la producción de ácido cítrico.

Se recomienda evaluar diferentes tipos de antiespumantes naturales y

sintéticos (comerciales) a fin de neutralizar el efecto negativo de la formación

de espuma sobre la producción de ácido cítrico.

Se indica utilizar otro tipo de análisis para determinar ácido cítrico debido a los

altos costos del Kit enzimático. En particular se recomienda implementar el

análisis de ácidos orgánicos por cromatografía de gases.

Se aconseja el empleo de un método analítico que discrimine el nitrógeno

orgánico del inorgánico, para poder evaluar los efectos la desproteinización y

de la formulación del medio de cultivo.

Al aplicar el método de azúcares reductores mostrado en este trabajo, sobre

muestras que contengan buffer citrato, se deben acidificar a un pH aproximado

de3,0, ya que el citrato cuando se tiene a un pH por encima de 8,0 disminuye

el color de la muestra alterando la lectura.

Para evaluar el efecto de la hidrólisis sobre la producción de ácido cítrico se

propone adelantar estudios para implementar en método de análisis que

permita determinar cuantitativamente la concentración de lactosa, glucosa y

122

galactosa de forma independiente en un medio de cultivo que contenga una

mezcla de estos tres carbohidratos.

Se recomienda analizar la influencia de compuestos como el agua en estudios

posteriores acerca de la biosíntesis de ácido cítrico.

123

BIBLIOGRAFÍA

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35. www.sagpya.mecon.gov.ar/agrico/publicaciones/aceite/composición.htm

127

ANEXO A COMPOSICIÓN DE LOS MEDIOS SÓLIDOS

Medio de cultivo Composición (g/L) Condiciones de preparaciónCzapeck Sacarosa: 30

Nitrato de sodio: 2 Hidrógeno Fosfato Dipotásico: 1 Sulfato de magnesio: 0,5 Cloruro de potasio: 0,5 Sulfato ferroso: 0,01 Agar 15 g

Disolver 49 g de medio en 1 L de agua destilada. Especial para hongos filamentosos.

Sabouraud Concentrado enzimático de caseína: 10 Dextrosa: 40 Agar:15

Disolver 65 g de medio en 1 L de agua destilada. Especial para hongos filamentosos

Agar Dextrosa –Papa (PDA)

Extracto de papa: 230 mL. Glucosa :20 Agar – Agar: 20 Agua destilada: 770 mL

Este extracto se prepara licuando en 300 mL de agua destilada 100 g de papa, refrigerando de un día para otro. En el momento de usar se debe filtrar, y ese filtrado es el que se emplea como extracto. Especial para Aspergillus carbonarius

Agar Extracto Malta (MEA)

Extracto malta: 20 Peptona bacteriológica: 1 Glucosa: 20 Agar: 15

Disolver los compuestos en 1 L de agua destilada. Especial para Aspergillus carbonarius

Agar Czapeck Yeast Autolysate (CYA)

Fosfato dipotásico: 1 Extracto levadura: 5 Sacarosa: 30 Agar: 15 Concentrado Czapeck: 10 mL

Este concentrado esta compuesto por: Nitrato de sodio 30 g, Cloruro de potasio 5 g, Sulfato de magnesio heptahidratado 5 g, Sulfato de hierro heptahidratado 0,1 g, Agua destilada 100 mL Especial para Aspergillus carbonarius

128

Medio de cultivo Composición (g/L) Condiciones de preparaciónCzapeck Dox Solución A: 50 mL

Solución B: 50 mL Sacarosa 30 Agar: 15 Agua destilada: 900 mL

Solución A compuesta por: Nitrato de sodio 40 g, Cloruro de potasio 10 g, Sulfato de magnesio heptahidratado 0,2 g, Agua destilada 1000 mL. Solución B compuesta por: Agua destilada 1000 mL, Fosfato dipotásico 20 g Especial para Aspergillus carbonarius

Czapeck Malta Agar Czapeck: 49 Extracto malta: 40

Especial para Aspergillus carbonarius


Agar Czapeck: 49 Extracto malta: 40 Sulfato de zinc heptahidratado (1g/100mL): 1 mL Sulfato de cobre pentahidratado (0,5g/100mL): 1 mL

Especial para Aspergillus carbonarius

129

ANEXO B TABLA DE DATOS

DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES EN SUEROS DESPUÉS DE LA FERMENTACIÓN CON Aspergillus carbonarius NRRL 368

Fecha de la determinación: Agosto 14 de 2002

Cepa utilizada en la fermentación: Aspergillus carbonarius NRRL 368

Equipo utilizado: Espectrofotómetro UV Perkin-Elmer Lambda 20 Serial Nº:

101N8021921

Método: LACTO_02

Longitud de onda: 540 nm

Observaciones: Estas lecturas se realizaron contra el blanco, por lo que el equipo realizó

los cálculos.

Nomenclatura empleada en las tablas:

Nº: Número de la muestra

F: Factor de dilución

C (g/L): Concentración de azúcares reductores totales determinados como lactosa, en g/L

A: Absorbancia

Nº Tipo de suero F A C (g/L) 1 Entero 100 0,0822 10,442 2 Entero 100 0,1751 17,413 3 Entero 100 -0,010 3,520 4 Desproteinizado 100 -0,011 3,445 5 Desproteinizado 100 -0,005 3,895 6 Desproteinizado 100 0,0640 9,0763 7 Desproteinizado hidrolizado 100 -0.013 3294 8 Desproteinizado hidrolizado 100 -0.003 4,045 9 Desproteinizado hidrolizado 100 0,1787 17,680

10 Desproteinizado hidrolizado evaporado 100 0,1132 12,768 11 Desproteinizado hidrolizado evaporado 100 0,0763 10,0 12 Desproteinizado hidrolizado evaporado 100 0,0675 9,3391

130

ANEXO C TABLA DE DATOS

DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES EN SUEROS DESPUÉS DE LA FERMENTACIÓN CON Aspergillus carbonarius NRRL 67

Fecha de la determinación: Octubre 10 y 21, y Noviembre 19 de 2002



101N8021921

Método: LACTO_02


Observaciones: Para éstas determinaciones, se realizaron las lecturas contra agua

destilada con el fin de poder observar el comportamiento del blanco. Por tal razón los

cálculos se realizaron manualmente. Los cálculos que se realizaron con el Blanco 1

fueron 4, 5, 6, 8, 10 y la 11. Los cálculos realizados con el Blanco 2 fueron los de las

muestras 3, 7, 9 y 12. Con el Blanco 3 se realizaron los cálculos de las muestras 1 y 2.

Nomenclatura empleada en las tablas:



C (g/L): Concentración de azúcares reductores totales determinados como lactosa, en mg/L

A: Absorbancia

Nº Tipo de suero F A C (g/L) Blanco 1 0 0,0188 0,0567 Blanco 2 0 0,0181 0,0562 Blanco 3 0 0,0172 0,0555

1 Entero 25 0,0213 0,0779 2 Entero 25 0,0223 0,097

131

Nº Tipo de suero F A C (g/L) 3 Entero 50 0,0191 0,4015 4 Desproteinizado 100 0,0335 1,1073 5 Desproteinizado 100 0,0941 5,6536 6 Desproteinizado 100 0,0775 4,4096 7 Desproteinizado hidrolizado 50 0,0218 13,925 8 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0195 0,06 9 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0195 0,11


132

ANEXO D TABLA DE DATOS

DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES EN SUEROS DESPUÉS DE LA FERMENTACIÓN CON Aspergillus niger NRRL 3

Fecha de la determinación: Noviembre 19 de 2002

Cepa utilizada en la fermentación: Aspergillus niger NRRL 3


101N8021921

Método: LACTO_02


Observaciones: Estas determinaciones se realizaron haciendo las lecturas contra agua


cálculos se realizaron manualmente. Las 11 primeras muestras se calcularon con el

Blanco 1, y la última con el Blanco 2 por tener que hacer una dilución mayor.

Nomenclatura empleada en la tabla:



C (g/L): Concentración de azúcares reductores totales determinados como lactosa, en mg/L

A: Absorbancia

Nº Tipo de suero F A C (g/L) Blanco 1 0 0,0172 0,0555 Blanco 2 0 0,0211 0,0585

1 Entero 100 0,0227 0,4145 2 Entero 100 0,0463 2,1893 3 Entero 100 0,0429 1,9295 4 Desproteinizado 100 0,0578 3,0534 5 Desproteinizado 100 0,1030 6,4453 6 Desproteinizado 100 0,2379 16,5683

133

Nº Tipo de suero F A C (g/L) 7 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0194 0,1652 8 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0443 2,0376 9 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0901 5,4783


134

ANEXO E TABLA DE DATOS

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA EN SUEROS DESPUÉS DE LA FERMENTACIÓN CON Aspergillus carbonarius NRRL 368

Fecha de la determinación: Agosto 14 de 2002



101N8021921

Método: BIURET2


Observaciones: Estas lecturas se realizaron contra el blanco, por lo que el equipo realizó

los cálculos.




C (g/L): Concentración de proteína, en g/L

A: Absorbancia

Nº Tipo de suero F A C (g/L) 1 Entero 100 0,0129 4,53 2 Entero 100 0,0109 3,80 3 Entero 100 0,0025 0,70 4 Desproteinizado 100 0,0012 0,22 5 Desproteinizado 100 -0,000 0,2 6 Desproteinizado 100 0,0034 1,04 7 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0035 1,08 8 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0057 1,89 9 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0085 2,91


135

ANEXO F

TABLA DE DATOS DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA EN SUEROS

DESPUÉS DE LA FERMENTACIÓN CON Aspergillus carbonarius NRRL 67

Fecha de la determinación: Octubre 10 de 2002



101N8021921

Método: BIURET2


Observaciones: Para estas determinaciones, se realizaron las lecturas contra agua


cálculos se realizaron manualmente.





A: Absorbancia

Nº Tipo de suero F A C (g/L) Blanco 0 0,0311 0,1122

1 Entero 100 0,0335 0,89 2 Entero 100 0,0315 0,12 3 Entero 100 0,0399 3,22 4 Desproteinizado 100 0,0323 0,44 5 Desproteinizado 100 0,0348 1,36 6 Desproteinizado 100 0,0391 2,94 7 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0360 1,79 8 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0417 3,9

136

Nº Tipo de suero F A C (g/L) 9 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0405 3,43


137

ANEXO G TABLA DE DATOS

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA EN SUEROS DESPUÉS DE LA FERMENTACIÓN CON Aspergillus niger NRRL 3

Fecha de la determinación: Noviembre 19 de 2002

Cepa utilizada en la fermentación: Aspergillus niger NRRL 3


101N8021921

Método: BIURET2


Observaciones: Las lecturas de estas determinaciones se realizaron contra agua


cálculos se realizaron manualmente.





A: Absorbancia

Nº Tipo de suero F A C (g/L) Blanco 0 0,0242 0,0867

1 Entero 100 0,0314 2,64 2 Entero 100 0,0319 2,82 3 Entero 100 0,305 2,3 4 Desproteinizado 100 0,0284 1,55 5 Desproteinizado 100 0,0284 1,55 6 Desproteinizado 100 0,0360 4,35 7 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0275 1,23

138

Nº Tipo de suero F A C (g/L) 8 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0310 5,52 9 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0385 5,27


139

ANEXO H MANUAL DE MANEJO DEL TEST ENZIMÁTICO

PARA LA DETERMINACIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO

A. PRINCIPIO El ácido cítrico (citrato) es convertido a oxaloacetato y acetato en la reacción catalizada por la enzima citrato liasa (CL) (1). acetatotooxaloacetaCitrato CL +→ (1) En presencia de la enzima L-mamto deshidrogenasa (L-MDH) y L-lactato deshidrogenasa (L-LDH), el oxalato y el producto de decarboxilación piruvato son reducidos a L-malato y L-lactato, respectivamente, por reducción de nicotinamida-adenina dinucleotido (NADH) (2, 3). +−+ +− →++ NADmalatoLHNADHtoOxaloaceta LDHL (2) +−+ +− →++ NADlactatoLHNADHPiruvato LDHL (3) La cantidad de NADH oxidado en las reacciones (2) y (3) es estequiométrica a la cantidad de citrato. El NADH es determinado por mediciones de luz absorbancia a 334, 340 ó 365 nm. Nota: El piruvato libre en la muestra no es medido debido al orden de pipeteo de reactivos. B. CONTENIDO DE LA PRUEBA 1. Tres frascos marcados con el 1. Cada uno con aproximadamente 1,4 g de liofilizado

con el siguiente contenido: Buffer de glicilglicina de aproximadamente 7,8 de pH; L-malato deshidrogenasa con aproximadamente 136 U; L-lactato deshidrogenasa con aproximadamente 280 U; aproximadamente 5 mg de NADH; estabilizantes.

2. Tres frascos marcados con el 2. Cada uno con aproximadamente 50 mg del liofilizado

de citrato liasa, aproximadamente 12 U. 3. Solución estándar de ácido cítrico para control de análisis (la medición de la solución

estándar no es necesaria para el cálculo de los resultados). Use la solución estándar sin diluir.

140

C. PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES PARA 10 DETERMINACIONES 1. Disolver el contenido de un frasco marcada con 1 en 12 mL de agua redestilada. 2. Disolver el contenido de un frasco marcada con 2 en 0,3 mL de agua redestilada. D. ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS El contenido de los frascos marcados con 1 y 2 es estable a 2 – 8 ºC. La solución 1 es estable durante 2 semanas a 2 – 8 ºC, o durante 4 semanas entre –20 y –25 ºC. Antes de usar la solución 1 debe ser llevada a temperatura ambiente (20 – 25 ºC). La solución 2 es estable durante 1 semana a 2 – 8 ºC, o durante 4 semanas entre –20 y –25 ºC. E. PROCEDIMIENTO Longitud de onda: 340 nm, 365 nm Hg ó 334 nm Hg (el máximo de absorción del

NADH se encuentra en 340 nm. En espectrofotómetros, las mediciones se toman en el máximo de absorción. Si se usa fotómetro de línea espectral equipado con lámpara de vapor de mercurio, las mediciones se toman a una longitud de onda igual a 365 ó 334 nm.

Cubetas de vidrio de 1 cm de paso de luz (si se desea se pueden usar cubetas

desechables en lugar de las de vidrio). Temperatura: 20 a 25 ºC.

Volumen final: 3,020 mL

Leer contra aire (sin cubeta en el paso de luz) o agua.

Solución muestra: 1 – 80 µg de ácido cítrico por ensayo (en un volumen de muestra de

0,200 a 2,000 mL)

Pipetear en las cubetas Blanco Muestra Solución 1 Solución muestra Agua destilada

1 mL -

2 mL

1 mL 0,2 mL 1,8 mL

Mezcle *, lea las absorbancias de las soluciones (A1) después de aproximadamente 5 minutos y empiece la reacción con la adición de: Solución 2 0,020 mL 0,020 mL Mezcle **, cuando se complete la reacción (aproximadamente 5 minutos) lea las absorbancias de las soluciones (A2). *Enjuague la pipeta de la enzima o la punta de la pipeta con la solución muestra antes de dispensar dicha solución. **Por ejemplo, con una espátula plástica o con agitación suave después de haber sellado la cubeta con Parafilm.

141

Determine las diferencias de absorbancias (A1 – A2) para el blanco y para la muestra. Reste de la diferencia de absorbancias de la muestra, la diferencia de absorbancias del blanco.

( ) ( )blancomuestra AAAAA 2121 −−−=∆

Eventualmente, se puede obtener un valor negativo de (A1 – A2)blanco. En este caso, este valor se debe adicionar a (A1 – A2)muestra, de acuerdo a la fórmula de cálculo. Como regla, la diferencia de absorbancias medida debe ser de al menos 0,1000 unidades de absorbancia, para alcanzar unos resultados suficientemente precisos (vea Instrucciones para la realización del análisis). Si la diferencia de absorbancias de la muestra (∆Amuestra) es mayor de 1,000 (medida a 340 nm, o a 334 nm Hg) o a 0,5000 (medida a 365 nm Hg) respectivamente, la concentración de ácido cítrico en la solución muestra es demasiado alta. En tal caso, la solución muestra debe ser diluida de acuerdo a la tabla de diluciones. F. CÁLCULOS De acuerdo a la ecuación general para el cálculo de la concentración:

[ ]g/L 1000

AvdPMVc ∆××××

×=ε

V: Volumen final, mL v: Volumen de la muestra, mL PM: Peso molecular de la sustancia que se analiza, g/mol d: Paso de luz, cm ε: Coeficiente de extinción del NADH a: 340 nm = 6,3 (L/mmol cm) 365 nm Hg = 3,4 (L/mmol cm) 334 nm Hg = 6,18 (L/mmol cm) Entonces, para ácido cítrico calculado como anhidro:

muestra) de cítrico/L ácido (g 90021000200000111920203 AAc ∆×=∆××××

×=

εε,

,,,,

Para ácido cítrico calculado como monohidrato:

muestra) de o/Lmonohidrat cítrico ácido (g 17331000200000112100203 AAc ∆×=∆×

××××

=εε

,,,

,,

Si la muestra fue diluida durante la preparación, el resultado debe ser multiplicado por el factor de dilución F.

142

Cuando se analizan muestras sólidas o semisólidas que han sido pesadas para su preparación, los resultados deben ser calculados a partir de la cantidad pesada:

( )( ) ( )gg

muestrasolucióndeLgpesomuestrasolucióndeLgc

Contenidocítricoácido

cítricoácidocítricoácido 100100

/

//

×=

1. INSTRUCCIONES PARA LA REALIZACIÓN DEL ANÁLISIS La cantidad de ácido cítrico presente en la cubeta tiene que estar entre 1 y 80 µg. Para obtener una diferencia de absorbancias adecuada, la muestra debe ser diluida de tal manera que la concentración de ácido cítrico esté entre 0,04 y 0,4 g/L. Tabla de dilución Cantidad estimada de ácido

cítrico por litro Dilución con agua Factor de dilución F

< 0,4 g 0,4 – 4,0 g 4,0 – 40 g

> 40 g

- 1 + 9

1 + 99 1 + 999

1 10

100 1000

Si la diferencia de absorbancias medida (∆A) es muy baja (p ej. < 0,100), la muestra debe ser preparada nuevamente (pese más muestra o haga una dilución menor) o se puede incrementar hasta 2 mL el volumen de la muestra que se pipetea en la cubeta. En este último caso, el volumen de agua se debe reducir de tal manera que se obtenga el mismo volumen final para el blanco y para la muestra. El nuevo volumen de la muestra v se debe tener en cuenta para el cálculo. 2. INFORMACIÓN TÉCNICA 2.1. Para llevar a cabo los cálculos, se debe dar una indicación clara de si se expresan

los resultados como ácido cítrico anhidro o monohidrato, o como ión citrato (en las determinaciones enzimáticas se mide el ión citrato).

2.2. En la evaluación de los resultados analíticos se debe tener en cuenta que en la

determinación acidimétrica de "ácido total calculado como ácido cítrico", se miden los protones, mientras que en las determinaciones enzimáticas se miden los iones citrato. Por lo tanto, no es posible comparar estos resultados directamente.

3. ESPECIFICIDAD El método es específico para ácido cítrico. 4. SENSIBILIDAD Y LÍMITE DE DETECCIÓN

143

La diferencia más pequeña de absorbancia para el procedimiento es de 0,005 unidades de absorbancia. Esto corresponde a un volumen máximo de muestra de v = 2,000 mL y medida a 340 nm de una concentración de ácido cítrico de la solución de muestra (si el v = 0,200 mL, esto corresponde a 2,5 mg/L de solución de muestra). El límite de detección de 0,5 mg/L se deriva de la diferencia de absorbancia de 0,010 (medida a 340 nm) y un volumen máximo de muestra de v = 2,000 mL. 5. LINEALIDAD La linealidad de la determinación existe desde 1 µg de ácido cítrico por ensayo (0,5 mg ácido cítrico / L solución de muestra, volumen de muestra v = 2,000 mL) hasta 80 µg de ácido cítrico por ensayo (0,4 g ácido cítrico / L solución de muestra, volumen de muestra v = 2,000 mL). 6. PRECISIÓN En una determinación doble que usa una solución de muestra, puede ocurrir una diferencia de 0,005 a 0,010 unidades de absorbancia. Con un volumen de muestra de v = 2,000 mL y medida de 340 nm, esto corresponde a una concentración de ácido cítrico de aproximadamente 3 – 5 mg/L (si la muestra se diluye durante su preparación, el resultado se multiplica por el factor de dilución F. Si la muestra se pesa para su preparación, por ejemplo, usando 1 g muestra/100 mL = 10 g/L, se puede esperar una diferencia de 0,03 – 0,05 g/100 g). Los siguientes datos han sido publicados en literatura (Ref. 1.3): CV = 4,4 % n =10 Extracto de hígado de conejo CV = 1,3 % n =10 Vino Jugo de frutas (Ref. 2.3):

( )

( ) Lg

Lg

cítrico.ác

Lg

Lg

cítrico.ác

en C•054,0+13,0=R

en C•025,0+095,0=r

Para datos más amplios ver referencias (Ref. 2.13, 2.14) Vino: Ácido cítrico < 400 mg/L: r = 14 mg/L R = 39 mg/L Ácido cítrico > 400 mg/L: r = 28 mg/L R = 65 mg/L 7. INTERFERENCIAS / FUENTES DE ERROR

144

Si la solución de muestra contiene ácido pirúvico libre, el NADH se consume antes de la medida de A1. En este caso se recomienda agregar NADH a la muestra, y adicionalmente (por ejemplo, 0,100 mL solución NADH, 5 mg/L)4 usar menos agua redestilada. 8. RECONOCIENDO INTERFERENCIAS DURANTE EL PROCEDIMIENTO DE

ENSAYO 8.1. Si la conversión de ácido cítrico se ha completado según un tiempo menor al dado

para la determinación, se puede concluir que en general no ha ocurrido ninguna interferencia.

8.2. En la realización de la reacción, la determinación puede reiniciarse agregando

ácido cítrico o citrato de sodio (cualitativo o cuantitativo): si la absorbancia se altera subsecuente a la adición del material estándar, es también una indicación de que no ha ocurrido ninguna interferencia.

8.3. Errores del operador o interferencias en la determinación por la presencia de

sustancias contenidas en la muestra pueden ser reconocidas llevando a cabo una determinación doble usando 2 diferentes volúmenes de muestra (por ejemplo, 0,100 mL y 0,200 mL): Las diferencias en la medida de la absorbancia deben ser proporcionales a los volúmenes de muestra usados.

Cuando se analizan muestras sólidas, se recomiendan diferentes cantidades (por ejemplo 1 g y 2 g) pesados en frascos volumétricos de 100 mL. Las diferencias en las medidas de la absorbancia y los pesos de las muestras usados deben ser proporcionales para los volúmenes de la muestra idénticos.

8.4. Posibles interferencias causadas por sustancias contenidas en la muestra pueden

ser reconocidas usando un estándar interno como control: en la adición de la muestra, determinaciones estándar y blanco, se puede llevar a cabo otra determinación con muestra y solución estándar en el mismo ensayo. La recuperación puede calcularse entonces de las diferencias de las medidas de absorbancia.

8.5. Las posibles pérdidas durante la determinación pueden ser reconocidas llevando a

cabo test de recuperación: la muestra debe prepararse y analizarse con y sin el material estándar. El aditivo debe recuperarse cuantitativamente dentro del rango de error del método.

9. EL RIESGO DEL REACTIVO Los reactivos usados en la determinación de ácido cítrico no son materiales peligrosos en el sentido de la Regulación de Sustancias Peligrosas (Hazardous Substance Regulations), La Ley Química (The Chemicals Law) o Regulación EC 67/548/EEC (EC Regulation 67/548/EEC) y subsecuente alteración, suplementación y pautas de adaptación. Sin embargo, las medidas de seguridad generales que se aplican a toda sustancia química deben tenerse en cuenta.

145

Después de usarse, los reactivos pueden ser dispuestos con desechos de laboratorio, pero las regulaciones locales deben tenerse presente. El material empacado puede ser dispuesto como desecho para reciclaje. 10. INFORMACIÓN GENERAL SOBRE PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Llevando a cabo el ensayo: ✓ Use la muestra de líquido clara, descolorida y prácticamente neutra directamente,

o después de la dilución según la tabla de dilución, y de un volumen mayor a 2,000 mL.

✓ Filtrar las soluciones turbias. ✓ Degasificar muestras que contengan dióxido de carbono (por ejemplo, por

filtración). ✓ Ajustar muestra débilmente coloreadas y ácidas a pH 8 adicionando soluciones de

hidróxido de sodio o potasio e incubar aproximadamente 15 minutos. ✓ Ajustar muestras ácidas a aproximadamente pH 8 adicionando soluciones de

hidróxido de sodio o potasio. ✓ Tratar muestra "fuertemente coloreadas" usadas sin diluir o con un volumen de

muestra muy alto con polivinilpolipirrolidona (PVPP) o con poliamida (por ejemplo 1 g/100 mL).

✓ Machacar u homogenizar muestras sólidas o semisólidas, extraer con agua o

disolver en agua y filtrar si es necesario. ✓ Desproteinizar muestras que contengan proteína con ácido perclórico. ✓ Extraer grasas de muestras que contengan grasa con agua caliente (extraer a una

temperatura que esté por encima del punto de fusión de la grasa involucrada). Dejar enfriar para separar la grasa, realizar una marca, poner el frasco volumétrico en un baño de hielo por 15 minutos y filtrar.

Nota importante: La Clarificación de Carrez no puede ser utilizada en la preparación de muestras para determinar ácido cítrico debido a una muy baja velocidad de recuperación (adsorción de ácido cítrico) Si se va a determinar la adición de ácido cítrico libre, ácido cítrico esterificado – por ejemplo ésteres de ácido cítrico de polifenoles o antocianinas – el éster puede ser convertido a ácido libre por hidrólisis alcalina. Proceda como se muestra abajo en el “vino”. 11. EJEMPLOS DE APLICACIONES

146

✓ Determinación de ácido cítrico en jugos de frutas, bebidas refrescantes, té y bebidas similares: Remover turbiedades por filtración y diluir la muestra para obtener una concentración de ácido cítrico entre 0,04 y 0,4 g/L. La solución diluida puede usarse para el ensayo aún cuando está coloreada. Únicamente los jugos intensamente coloreados pueden ser decolorados cuando se usen sin diluir para los ensayos por su baja concentración de ácido cítrico. En tales casos, el procedimiento a seguir es: Mezclar 10 mL de jugo y 0,1 g de poliamida o polivinilpolipirrolidona (PVPP), agitar por 1 minuto y filtrar. Usar el clarificador, colorear levemente la solución para el ensayo, neutralizar, si es necesario.

✓ Determinación de ácido cítrico en vino: Colorear levemente el vino a usar

directamente para el ensayo o después de la dilución de acuerdo con la tabla de dilución. Los vinos de coloración oscura tienen que ser decolorados cuando se usan directamente para el ensayo, especialmente con un incremento del volumen de muestra porque su concentración de ácido cítrico es baja: Mezclar 10 mil de vino y 0,1 g de poliamida o PVPP, agitar por 1 minuto y filtrar. Usar el clarificador o colorear la solución levemente para el ensayo.

✓ Determinación de ésteres de ácido cítrico en vino: Calentar 20 mL de muestra y 6 mL de hidróxido de potasio alcohólico (aproximadamente 2 mol/L de metanol o etanol) por 10 minutos a condensador de reflujo mientras se agita, dejar enfriar a temperatura ambiente y neutralizar con ácido sulfúrico (2 mol/L). Transferir cuantitativamente 50 mL a un frasco volumétrico y hasta la marca con agua destilada. Usar directamente la muestra para el ensayo o después de la dilución, si es necesario (= ácido cítrico total, el cual es la suma del libre y ácido cítrico esterificado).

✓ Determinación de ácido cítrico en cerveza: Para remover el ácido carbónico, agitar aproximadamente 5 - 10 mL de cerveza por 1 minuto con un agitador de vidrio o filtro. La muestra de cerveza libre de CO2 es usada para los ensayos sin diluir.

✓ Determinación de ácido cítrico en pan, productos de carne, queso, vegetales y productos de frutas: Triturar aproximadamente 20 – 50 g del material de muestra (usando por ejemplo, un mortero, un triturador de carne o un homogenizador). Pesar exactamente aproximadamente 10 g de la muestra bien mezclada dentro de un beaker homogenizador y adicionar 50 mL de ácido perclórico (1 mol/L); homogenizar por 2 minutos (por encima de 10 minutos) con el homogenizador. El resultado calentarlo hasta 35 ºC. Centrifugar para homogenizar. Ajustar 20 mL del sobrenadante a pH 8 – 10 con aproximadamente 4 mL (medido del volumen de HOH que fue necesario) de solución de hidróxido de potasio (5 mol/L). Llevar la solución al refrigerador por 15 minutos para la precipitación cuantitativa del perclorato de potasio formado, filtrar y desechar los primeros mL. Usar el filtrado directamente para el ensayo o después de la dilución de acuerdo con la tabla de diluciones. Para calcular el contenido (en g/100 g) conforme a la fórmula mencionada (ver cálculos) se necesita el contenido de la muestra en la solución muestra. Aplicando la preparación de la muestra mencionada arriba y considerando el contenido de agua de la muestra, el peso de la muestra se calcula por la siguiente fórmula:

147

( ) ( ) ( )muestra de soluciónmuestra L/g e+b×w×a+b

d×1000×a=Peso

a: Peso de la muestra, g b: Volumen de ácido perclórico, mL d: Volumen de sobrenadante para ajustar el pH, mL e: Volumen de KOH para ajustar pH a 8 – 10, mL w: Contenido de agua en la muestra

100ww%;

1000: Factor para expresar g en mg (La gravedad específica del agua para la muestra a temperatura ambiente es aproximadamente 1 g/mL. Esto puede ser despreciado para los cálculos).

✓ Determinación de ácido cítrico en margarina, aceites comestibles y ungüentos: Pesar exactamente aproximadamente 5 g de muestra homogénea en un beaker, adicionar aproximadamente 70 mL de agua destilada y agitar vigorosamente por un rato en una placa calefactora con agitación magnética, llevar a ebullición. Transferir la fase acuosa con una pipeta en un frasco volumétrico de 100 mL. Repetir la extracción con aproximadamente 20 mL de agua destilada. Dejar enfriar el frasco a temperatura ambiente y completar hasta la marca con agua destilada. Llevar el frasco por 15 minutos a un baño de hielo o en el refrigerador. Filtrar a través de un papel filtro. De acuerdo con la concentración de ácido cítrico esperada. Usar el filtrado diluido o sin diluir para el ensayo.

✓ Determinación de ésteres de ácido cítrico (por ejemplo agentes emulsificantes, ésteres glicérido ácido cítrico): El ácido cítrico que está ligado con monoglicérido o diglicérido al éster ácido cítrico, respectivamente, se puede determinar en presencia de ácido cítrico libre (citratos) si la muestra es extraída con cloroformo y el éster es subsecuentemente saponificado con hidróxido de potasio. En este caso el procedimiento es el siguiente: Ebullir la muestra bien picada y homogenizada que contiene aproximadamente 120 mg de éster ácido monoglicérido (por ejemplo éster monooleilcitril glicérido, MW aproximado 550) o 170 mg de éster ácido cítrico diglicérido (por ejemplo éster diooleilcitril glicérido, MW aproximado 810) con aproximadamente 50 mL de cloroformo bajo condensación a reflujo por aproximadamente 2 horas en un frasco de fondo redondo. Filtrar y lavar con agua el cloroformo. Evaporar el cloroformo en un evaporador rotatorio. Ebullir el residuo hasta casi secarlo con 25 mL de hidróxido de potasio metanólico (1 mol/L) por 10 minutos en condensador a reflujo. Dejar enfriar a temperatura ambiente y neutralizar o acidificar levemente, respectivamente, con aproximadamente 5 mL de ácido hidroclórico (5 mol/L). Transferir cuantitativamente a un frasco volumétrico de 100 mL, hasta la marca con agua destilada, mezclar y filtrar. Use la solución casi clara para el ensayo. Para la determinación del volumen debe tenerse en cuenta el peso molecular del glicérido.

12. APLICACIONES ADICIONALES

148

El método puede ser usado también en la inspección de papel, cosméticos, detergentes (Ref. 3.6), farmacéutica, como también en una investigación cuando se está analizando plasma (Ref. 4.1) suero y orina (Ref. 4.2, 4.3), plasma seminal o esperma (Ref. 4.4, 4.5), respectivamente, y otros materiales. Para especificaciones de muestra, tratamiento y estabilidad de la muestra ver Ref. 1.3 y 1.5. 12.1. Determinación de ácido cítrico en orina (Ref. 4.2, 4.3, 4.8): Filtrar o centrifugar la muestra para separar ingredientes insolubles de la orina. Usar el filtrado o sobrenadante respectivamente, diluir de acuerdo con la tabla de dilución, si es necesario, para el ensayo (factor de dilución = F).

Cálculos:

( )

( )muestracítrico ácido

muestracítrico ácido

L/mmol e

F×A∆×10,15=c

L/g e

F×A∆×900,2=c

Longitud de onda 365 nm Hg 340 nm 334 nm Hg

C (g/L) 0,8529 x ∆A x F 0,4603 x ∆A x F 0,4693 x ∆A x F C (mmol/L) 4,441x ∆A x F 2,397 x ∆A x F 2,443 x ∆A x F

12.2. Determinación de ácido cítrico en suero:

a) Con desproteinización de la muestra (Ref. 4.2, 4.3, 4.8): Mezclar 1 mL de suero con 1 mL de ácido perclórico helado (1 mol/L) y centrifugar. Neutralizar 1 mL de sobrenadante con 0,500 mL de solución de carbonato de potasio (0,3 mol/L). Incubar por 10 minutos a 0 – 4 ºC y filtrar. Usar el filtrado para el ensayo (volumen de muestra v = 0,200 mL, si es necesario incrementar el volumen de muestra, tomar en cuenta el volumen de muestra alterado). El factor de dilución F (dependiendo de la preparación de la muestra) se obtiene del volumen de muestra (1 mL), el volumen de ácido perclórico (1 mL), el volumen de sobrenadante (1 mL), el volumen de la solución de carbonato de potasio (0,5 mL), la gravedad específica del material de muestra (1,03 g/mL suero) y la fracción de líquido (0,92 en el caso del suero):

92,2=1

5,0+1×

000,11+92,0×03,1×1

=F

Cálculos:

149

( )



L/mmol ε

F×A∆×10,15=c

L/g e

F×A∆×900,2=c


c (g/L) 2,491 x ∆A 1,344 x ∆A 1,370 x ∆A c (mmol/L) 12,97x ∆A 6,999 x ∆A 7,135 x ∆A

b) Sin desproteinización de la muestra (Ref. 4.1): Usar suero o plasma para el

ensayo, diluido con solución de cloruro de sodio fisiológico, si es necesario (factor de dilución = F)

Cálculos:

( )



L/mmol ε

F×A∆×10,15=c

L/g ε

F×A∆×900,2=c


c (g/L) 0,8529 x ∆A x F 0,4603 x ∆A x F 0,4693 x ∆A x F c (mmol/L) 4,441x ∆A x F 2,397 x ∆A x F 2,443 x ∆A x F

c) Después de filtrar por membrana la muestra (Ref 4.8): Filtrar el suero usando un filtro de membrana para retener proteínas con una masa molecular por encima de 40000 Daltons. Usar el filtrado para el ensayo después de la dilución acorde con la tabla de dilución, si es necesario (Factor de dilución = F).

Cálculos:

( )



L/mmol ε

F×A∆×10,15=c

L/g ε

F×A∆×900,2=c


c (g/L) 0,8529 x ∆A x F 0,4603 x ∆A x F 0,4693 x ∆A x F c (mmol/L) 4,441x ∆A x F 2,397 x ∆A x F 2,443 x ∆A x F

Nota: La fracción de líquido de suero es 0,92, y la fracción sólida es 0,08. De este modo el resultado obtenido después de la filtración por membrana es superior al resultado obtenido sin desproteinización de la muestra.

150

12.3. Determinación de ácido cítrico en plasma seminal o esperma, respectivamente:

a) Con desproteinización de la muestra (Ref 4.4, 4.5): Mezclar 0,100 mL de esperma

con 3,900 mL de ácido perclórico (0,3 mol/L), poner la mezcla en un baño de hielo por 5 – 10 minutos y centrifugar. Mezclar 2 mL de sobrenadante con 1 mL de solución de carbonato de potasio (0,75 mol/L), poner la mezcla nuevamente en un baño de hielo por 15 minutos y volver a centrifugar. Usar el sobrenadante para la determinación de ácido cítrico (y D-fructosa). El factor de dilución (F = 60) se obtiene de la preparación de la muestra llevada a cabo arriba. La gravedad específica del material de muestra y la fracción de líquido son despreciados, también la fracción sólida del precipitado (perclorato de potasio).

Cálculos:

( )



L/mmol ε

F×A∆×10,15=c

L/g ε

F×A∆×900,2=c


C (g/L) 51,18 x ∆A 27,62 x ∆A 28,16 x ∆A C (mmol/L) 266,5x ∆A 143,8 x ∆A 146,6 x ∆A

b) Sin desproteinización de la muestra (Ref. 4.7): Centrifugar el esperma y diluir el sobrenadante con agua destilada en una relación de 1:20 (1+19). La muestra diluida es usada para la determinación de ácido cítrico (y D-fructosa). Factor de dilución F = 20.

Cálculos:

( )



L/mmol ε

F×A∆×10,15=c

L/g ε

F×A∆×900,2=c


C (g/L) 17,06 x ∆A 9,206 x ∆A 9,385 x ∆A C (mmol/L) 88.82x ∆A 47,94 x ∆A 48,87 x ∆A

12.4. Determinación de ácido cítrico en muestras de fermentación y medio de cultivo celular: Poner la muestra (después de centrifugar, si es necesario) en un baño de agua a 80 ºC por 15 minutos para detener la reacción enzimática. Centrifugar y usar el sobrenadante (diluir de acuerdo con la tabla de dilución si es necesario) para

151

el ensayo. Alternativamente, la desproteinización puede llevarse a cabo con ácido perclórico. Ver los ejemplos mencionados arriba.

152

ANEXO I DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNA POR EL

MÉTODO DE BIURET

1. REACTIVOS 1,5 g de CuSO4.5H2O

6 g de NaKC4H4O6

Solución de NaOH ó KOH al 10%

Agua destilada

Albúmina de suero de bovino o albúmina de huevo estandarizada (disolver 100

mg de proteína en 10 mL de agua destilada) para realizar la curva patrón.

2. PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR LA SOLUCIÓN DE BIURET 1. Disolver los 1,5 g de CuSO4.5H2O y los 6 g de NaKC4H4O6 en 500 mL de agua

destilada.

2. Adicionar a la solución anterior 300 mL de NaOH ó KOH al 10% agitando

constantemente.

3. Diluir a 1 L con agua destilada y guardar en una botella de polietileno.

3. PROCEDIMIENTO PARA LA CURVA PATRÓN.

153

1. Pipetear una cantidad conocida de proteína estandarizada y una de agua

destilada tal como se muestra en la siguiente tabla, y llevar a un tubo de

ensayo.

Tubo Volumen estándar (mL)

Volumen de agua (mL)

Concentración estándar (mg/mL)

O.D.550

1ª 2 3 4 5 6

0 0,10 0,25 0,50 0,75 1,00

1,00 0,90 0,75 0,50 0,25

0

0 1,0 2,5 5,0 7,5

10,0

Poner a 0

a Reactivo blanco. 2. Adicionar 4 mL de solución Biuret, mezclar y dejar reposar por 30 minutos a

temperatura ambiente.

3. Leer la densidad óptica a 550 nm en un espectrofotómetro.

4. Graficar la absorbancia a 550 nm contra la concentración de proteína

estandarizada.

154

ANEXO J DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES

UTILIZANDO ÁCIDO DINITROSALICÍLICO

1. REACTIVOS 15,7 g de NaOH ó KOH

8,8 g de DNS (ácido dinitrosalicílico)

32,5 g de Tartrato de sodio y potasio tetrahidratado

10 g de Fenol en cristales

5 g de NaHSO3

Agua deionizada

2. PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES Solución A: disolver 13,5 g de NaOH ó KOH en 300 mL de agua deionizada.

Solución B: disolver 8,8 g de DNS con 32,5 g de Tartrato de sodio y potasio en

800 mL de agua deionizada.

Solución C: mezclar las soluciones A y B.

Solución D: disolver 2,2 g de NaOH ó KOH con 10 g de fenol en cristales en

100 mL de agua deionizada.

Solución de bisulfito de sodio: disolver 5 g de NaHSO3 en 25 mL de agua

deionizada.

155

Reactivo DNS: adicionar 69 mL de la solución D y 23,2 mL de la solución de

bisulfito a la solución C.

3. PROCEDIMIENTO 1. Tomar 0,5 mL de la solución muestra y ponerlos en un tubo de ensayo tapa

rosca.

2. A este tubo adicionar 0,5 mL de KOH 1m Y 1,5 de reactivo DNS

3. Calentar en agua a ebullición por 5 minutos, inmediatamente poner en un baño

de agua – hielo por 5 minutos.

4. Pasado este tiempo adicionar 9,5 mL de agua destilada, mezclar y dejar

reposar por 30 minutos a temperatura ambiente.

5. Leer la absorbancia en un espectrofotómetro a 540 nm, utilizando siempre el

blanco.

4. PROCEDIMIENTO CURVA DE CALIBRACIÓN BASA EN LACTOSA 1. Preparar soluciones patrones de lactosa de 100, 200, 300, 400, 500 y 600

mg/L.

2. Realizar los pasos anteriormente mostrados, leyendo la absorbancia a 540 nm.

156

ANEXO K BIORREACTOR APPLIKON

Este biorreactor, es un microfermentador esterizable, enchaquetado y con

agitación. El recipiente está construido en vidrio, y la tapa con todos sus

accesorios en acero inoxidable 316.

Descripción:

La tapa tiene orificios especiales para cada uno de los accesorios, y esos son:

➢ Un orificio central para ensamblar el agitador, el cual se acopla directamente al

motor, esta operación es libre de contaminación. Este debe ser

desensamblado, limpiado y lubricado dos veces al año.

➢ Un orificio de 6,75 in para el sensor de oxígeno disuelto.

➢ Trece orificios de diferentes dimensiones para otro tipo de sensores: pH, nivel,

temperatura, etc., y accesorios como pipetas y mangueras.

➢ Un orifico roscado especial para conectar el condensador por el cual son

eliminados los gases producidos, para así evitar la contaminación del medio y

sobrepresionamiento del equipo.

➢ Otro orificio roscado más pequeño para ensamblar el tubo tomamuestras por el

cual se puede extraer la muestra libre de células.

157

➢ Seis orificios especiales para los tornillos de ensamble entre la tapa y el

recipiente de vidrio.

➢ Un pozo que tiene contacto directo con el medio al cual se le agrega un líquido

con buena transferencia de calor para introducir el termómetro y hacer las

lecturas a la temperatura interna.

Especificaciones:

➢ Capacidad:

- Volumen total: 3,2 L

- Volumen óptimo de trabajo: 2,7 L

- Volumen mínimo de trabajo: 0,47 mL

- Volumen interno de la chaqueta: 1.3 L

➢ La chaqueta puede ser usada para calentamiento o enfriamiento y gracias a

esta el control de la temperatura puede ser más exacto.

➢ La esterilización debe hacerse en autoclave a 121 °C durante 30 minutos, y

este solo puede abrirse cuando la temperatura sea menor de 90 °C, para evitar

cambios bruscos de presión que puedan dañar el equipo.

➢ La limpieza del equipo debe hacerse con etanol al 70% u otro limpiador

sustituto, no utilizar material abrasivo.

Procedimiento de esterilización:

Llenar el nivel con medio de cultivo, este no debe exceder el volumen total de 3 L

que es especificado, siendo este volumen suficiente para las adiciones posteriores

a la esterilización (inoculación, separación de nutrientes, etc.). Cerrar con la mano

seis de las tuercas en forma cruzada.

158

Verifique que se encuentre en su lugar todos los soportes de los niples y demás

auxiliares. Se debe hacer antes de llevar a cabo esta operación, las conexiones

adicionales entre el aire y el líquido y la salida de condensados con manguera de

silicona u otro material esterilizable. Debe de utilizarse en la salida y entrada de la

corriente de aire, filtros apropiados y se debe evitar que durante la esterilización

penetre agua a los filtros. Con tal fin se debe usar una abrazadera entre la

manguera que comunica la entrada y salida de gases del intercambio y los filtros.

Se debe cerrar todas las conexiones, excepto la salida de aire evitando así el

sobrepresionamiento del equipo.

Procedimiento para la toma de muestras:

Se debe adecuar el biorreactor con una línea de toma de muestras, la cual puede

ser una manguera esterilizable de diámetro interno pequeño, creándose vacío con

una jeringa estéril para succionar la muestra. Es recomendable tomar siempre un

volumen constante de muestra para crear homogeneidad en los datos.

Esta operación debe hacerse con guantes, tapa boca y mecheros encendidos

alrededor, para garantizar condiciones asépticas y así evitar contaminaciones en

el caldo de cultivo.

159

ANEXO L DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE BIOMASA

Cuando se va a determinar la población celular de un microorganismo filamentoso,

se recomiendan los siguientes pasos:

1. Tomar una muestra de 10 mL del líquido de fermentación y centrifugarla en

unos tubos de ensayo previamente pesados, por 15 minutos para recuperar la

biomasa contenida en ella.

2. Separar el sobrenadante de la biomasa utilizando un gotero.

3. Secar en estufa a 100 ºC por unas 12 horas hasta peso constante.

160

ANEXO M FICHA TÉCNICA DE LA ENZIMA MAXILACT DMS

DESCRIPCIÓN MAXILACT es una preparación líquida purificada de lactasa aislada a partir de la

levadura láctea Kluyveromyces maxianus var lactis.

CARACTERÍSTICAS Y DATOS TÉCNICOS MAXILACT hidroliza el azúcar de la leche – lactosa disacárido en 2

monosacáridos: glucosa y galactosa. Las condiciones de la reacción como

temperatura, acidez (pH), tiempo de proceso, concentración de lactosa y

dosificación de MAXILACT determiann la viscosidad de la reacción.

Como MAXILACT se deriva de una levadura láctea, las condiciones óptimas de

reacción son las de una leche natural:

pH = 6,6 –6,8

Temperatura = 35 – 40 ºC

No obstante MAXILACT es también activa a bajas temperaturas de hasta 4 ºC, lo

que permite hidrolizar la leche o suero durante el almacenaje nocturno.

CARACTEÍSTICAS FÍSICAS

161

Es un líquido de color ámbar claro, opaco y viscoso, con una densidad de 1,20

g/mL.

De acuerdo al comité de expertos FAO/WHO, sobre aditivos alimenticios, las

especificaciones generales para preparaciones enzimáticas empleadas en la

industria procesadora de alimentos son:

CALIDAD MICROBIOLÓGICA

Recuento total viable ≤ 5*104 UFC en 1 g

Coliformes ≤ 30 en 1 g

Salmonella Neg. en 25 g

E. coli Neg. en 25 g

Actividad antimicrobiana Neg. a la prueba

ESPECIFICACIONES QUÍMICAS Arsénico No más de 3 ppm

Plomo No más de 10 ppm

Metales pesados No más de 40 ppm

El MAXILACT es un producto bajo la norma ISO9002 de aseguramiento de la

calidad.

INHIBIDORES Zinc, calcio en altas concentraciones,

cobre y sodio.

ACTIVADORES Magnesio, potasio y fosfatos.

162

APLICACIONES Leche y productos lácteos.

Leche hidrolizada.

Uso en panadería y bizcochería.

Dulcería.

ALMACENAMIENTO

Debe almacenarse bajo refrigeración.

Si se almacena a una temperatura ≤ 5 ºC mantiene su actividad declarada por

seis meses.

No se debe congelar.

PRECAUCIONES DE MANEJO

No debe manipularse con las manos ni inhalarse. Puede causar sensibilización, es

decir, debe evitarse el contacto directo con el producto. En caso de derramamiento

o contacto con la piel o los ojos, enjuagarse con abundante agua inmediatamente.

DOSIFICACIÓN

La dosis de la enzima depende del producto a fabricar, del grado de hidrólisis

deseado y de las condiciones del proceso. Las dosis estimadas que se dan a

continuación están calculadas para un contenido del 5% de lactosa en leche o

suero, que es el contenido normal de lactosa en la leche. Para concentraciones

más elevadas de lactosa se debe aumentar la cantidad de MAXILACT

proporcionalmente.

163

Dosificación de Maxilact L 2000

(ml/L)

Tiempo de reacción (Horas)

Temperatura de reacción (ºC)

Grado de hidrólisis (%)

0,3 - 0,5 10 5 20 0,1 - 0,2 24 5 20 0,5 - 0,9 1 30 20 0,1 - 0,2 4 30 20 0,2 - 0,4 1 40 20

0,05 - 0,1 4 40 20 1,0 - 1,6 10 5 50 0,5 - 0,7 24 5 50 2,1 - 3,1 1 30 50 0,5 - 0,8 4 30 50 0,9 - 1,4 1 40 50 0,2 - 0,4 4 40 50 3,5 - 5,4 10 5 80 1,5 - 2,2 24 5 80

6,9 - 10,4 1 30 80 1,7 - 2,6 4 30 80 2,9 - 4,4 1 40 80 0,7 - 1,1 4 40 80

164

ANEXO N FOTOS DE LOS DIFERNTES TIPOS DE SUERO DESPUÉS DE LA

FERMENTACIÓN CON Aspergillus niger NRRL3

Vista frontal de los sueros entero y desproteinizado

Vista superior del suero entero Vista superior del suero desproteinizado

165

Vista frontal de los sueros desproteinizado, hidrolizado, y desproteinizado, hidrolizado y

evaporado

Vista superior del suero desproteinizado, Vista superior del suero desproteinizado,

hidrolizado. hidrolizado, evaporado.

166

ANEXO Ñ FOTOS DEL BIORREACTOR DURANTE LA FERMENTACIÓN

Vista frontal del biorreactor al segundo día de la fermentación, donde se aprecia en la

parte superior del medio de cultivo una gruesa capa de espuma y biomasa.

167

En esta fotografía se puede observar la calidad de la biomasa formada al segundo días de

la fermentación.

En la siguiente fotografía se puede observar cómo se ha disminuido el nivel del medio de

cultivo al 6 día de fermentación, como consecuencia de la formación de espuma en la

etapa inicial del proceso fermentativo (el nivel del medio se encontraba en la parte

superior de la marca).

168

En la fotografía se puede observar el aumento de la cantidad de biomasa al sexto día de

fermentación.

Obtencion de Acido Citrico a Partir de Suero de Leche Por ... · producción de ácido cítrico en...

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