Opioide-hartzaileak (d, k, m) eta kannabinoide-hartzaileak (CB1, CB2) giza espermatozoideetan espresatzen dira eta haien mugikortasunean eragiten dute

Jakintza-arloa: Medikuntza

Egilea: EKAITZ AGIRREGOITIA MARCOS

Urtea: 2008

Zuzendaria: JON IRAZUSTA ASTIAZARAN

Unibertsitatea: UPV-EHU

ISBN: 978-84-8438-395-6

Hitzaurrea

Opioide-hartzaileak (δ, κ, μ) eta kannabinoide-hartzaileak (CB1, CB2) giza espermatozoideetan espresatzen dira eta haien mugikortasunean eragiten dute izenburua duen tesia 2003ko udaberrian hasi zen eta 2008ko apirilaren 25ean defendatu zen. Euskal Herriko Unibertsitateko, Medikuntza fakultateko, Fisiologia saileko Jon Irazustaren zuzendaritzapean egin zen. Tesia aurrera eramateko, Carmen Ochoa doktorearekin eta Madrilgo Unibertsitate Konplutenseko Manolo Guzmán doktorearen taldearen laguntzarekin egina izan zen. Ordura arte ezezaguna zen helburu bat ebatzeari ekin zioten: sistema opioidea eta sistema kannabinoidea espermatozoideen gaineko eragina, alegia. Emaitza oso interesgarriak lortu ziren, izan ere, giza espermatozoideetan osagai opioideentzako eta kannabinoideentzako hartzaileak deskribatu zituzten lehenetarikoak izan ziren. Eta horren ondorioz, tesiak eman dituen artikulu zientifikoak zientzia-aldizkari prestigiotsuetan publikatu dira eta oso aipatuak izan dira beste ikertzaileengatik. Emaitza haiek, gaur egun, egilearen ikerketa-lerroaren oinarria dira, hala ere, tesiaren egilearen gaur egungo helburua emakumeen ugalkortasuna ikertzean datza.

Ekaitz Agirregoitia Marcos, 2012

Ekaitz Agirregoitia Marcos Doktore-tesia Leioa, 2008

Opioide-hartzaileak (δ, κ, µ) eta kannabinoide-hartzaileak

(CB1, CB2) giza espermatozoideetan espresatzen dira eta

haien mugikortasunean eragiten dute

Opioide-hartzaileak (δ, κ, µ) eta kannabinoide-hartzaileak

(CB1, CB2) giza espermatozoideetan espresatzen dira eta

haien mugikortasunean eragiten dute

Ekaitz Agirregoitia Marcos

Leioa, 2008ko apirila

Doktore-tesi honen zuzendaria

Jon Irazusta Astiazaran

Fisiologia Saila

Medikuntza eta Odontologia Fakultatea

Euskal Herriko Unibertsitatea

Doktore-tesi hau 2003ko udaberrian hasi zen eta 2008ko urtaro berdinean bukatu da.

Eskerrik asko bost urte hauetan doktore-tesi hau, zuzenean edo zeharka, aurrera

eramatea ahalbidetu duzuen norbanako, talde eta erakunde guztiei. Eta barkatu doktore-

tesi hau aurrera eramatean kale egin dizuedanoi. Nire hitzek ezin dute zuen bost urteko

lana eta pazientzia saritu, izan ere zuek gabe ez nintzateke ezer izango...

Gora zuek!

Nire familia guztientzat... aurrera bolie!

Aita, Ama, Naia, maite zaituztet!!!

Bertze jendek uste zuten ezin eskriba zaiteien

orai dute phorogatu enganatu zirela.

Heuskara ialgi adi mundura.

(Bernard Etxepare, 1545)

Edozein ekintzak indar berdineko eta kontrako noranzko erreakzioa eragiten du

(Isaac Newton, 1687)

LABURDUREN ZERRENDA

2-AG: 2-arakidonoilglizerola

AC: adenilato ziklasa

ACEA: arakidonoil-2´-kloroetilamida

ACTH: hormona adrenikortikotropikoa

ADH: hormona antidiuretikoa

ADP: adenosina 5´-difosfatoa

AEA: N-arakidonoiletanolamina

(anandamida)

ALH: buruaren albo-

desplazamenduaren anplitudea

AM251: 1-(2,4-diklorofenil)-5-(4-

iodofenil]])-4-metil-N-(1-

piperidil)pirazol-3-karboxamida

AM630: [(6-iodo-2-metil-1-[2-(4-

morfolinil)etil]-1H-indol-3-yl)(4-

metoxifenil)metanona],

AMP: adenosina 5´-monofosfatoa

ANOVA: bariantzaren analisia;

APN: N aminopeptidasa

ATP: adenosina 5´-trifosfatoa

BCF: zeharkatze-maiztasuna

BOP: barne-peptido opioideak

BSA: behi-serum albumina

CB1: 1 motako kannabinoide-hartzailea

CB2: 2 motako kannabinoide-hartzailea

CaM: kalmodulina

CaMK: kalmodulina kinasa

cAMP: AMP ziklikoa

CASA: ordenagailu bidezko haziaren

analisia

CBD: kannabidiola

CBN: kannabinola

cDNA: DNA osagarria

DAMME: D-ala2-Mephe4-Met-(O)-OI-

entzefalina

DEPC: dietilpirokarbonatoa

DMSO: dimetil sulfoxidoa

DNA: azido desoxirribonukleikoa

dNTP: deoxirribonukleotido trifosfato

DPDPE: [D-Pen2,5]-Entzefalina

ECL: kimioluminiszentzia-areagotzailea

EDTA: azido diaminoetanotetraazetikoa

FAAH: gantz-azidoen amida hidrolasa

FSH: hormona folikulu-estimulatzailea

GAPDH: glizeraldehido 3-fosfato

deshidrogenasa

GDP: guanosina 5'-difosfatoa

GH: hazkuntza-hormona

GnRH: hormona gonadotropina-

askatzailea

GTP: guanosina 5'-trifosfatoa

IZK: immunozitokimika

JNK: Jun N-bukaera kinasa

JWH-015: (2-Metil-1-propil-1H-indol-3-

il)-1-naftalenil-metanona

LH: hormona luteinizatzailea

LIN: linealtasuna

LPH: lipotropina

LSD: desberdintasun minimo adierazgarria

MAP: mitogenoz aktibaturiko proteina

MAPK: MAP kinasa

MGL: monoazilglizerollipasa

mRNA: RNA mezularia

MSH: melanotropina

NAPE: N-

arakidonoilfosfatidiletanolamina

NAT: N-aziltransferasa

NEP: endopeptidasa neutroa

OME: Osasunerako Munduko

Erakundea

PAGE: poliakrilamidazko gel

elektroforesia

PBS: fosfato/gatz-indargetzailea

PE: proentzefalina

PD: prodinorfina

PI3K: fosfatidilinositol-3 kinasa

PCR: polimerasaren kate-erreakzioa

PKA: cAMParen menpeko proteina

kinasa

PLD: D fosfolipasa

POMC: proopiomelanokortina

PRL: prolaktina

PVDF: polibinilideno difluoroa

RNA: azido erribonukleikoa

RT: alderantzizko transkripzioa

SDS: Sodio dodezil sulfatoa

SR141716a:N-piperidino-5-(4-

klorofenil)-1-(2,4-diklorofenil)-4-metil-

3-pirazol-karboxamida

SR144528: N-[(1S)-endo-1,3,3-trimetil

biziklo[2.2.1] heptan-2-il]-5-(4-kloro-3-

metilfenil)-1-(4-metilbenzil)-pirazol-3-

karboxamida]

STR: zuzentasuna

TAE: Tris/azetato indargetazailea

TBEK: Tyrode-BSA eraldatu ez-

kapazitantea

TBS: tris/gatz-indargetzailea

TEK: Tyrode eraldatu ez-kapazitantea

TEMED: N,N,N,N'-

tetrametiletilenodiamina

THC: Δ9-tetrahidrokannabinola

TRPV1: 1 motako baniloide-hartzailea

U-50488: 3,4-Dikloro-N-metil-N-[2-(1-

pirrolidinil)ziklohexil]benzeneazetamida

VAP: batez besteko ibilbidearen abiadura

VCL: abiadura lerromakurra

VSL: abiadura lerrozuzena

WB: western blot

WOB: oszilazioa

ZP: mintz peluzidoa

AURKIBIDEA Orrialdea

SARRERA 1

1. GIZONEZKOEN UGALTZE-APARATUA 3

1.1. Ugaltze-aparatu arraren anatomia fisiologikoa 3

1.2. Gameto arra (espermatozoidea) 6

2. ERNALKETA 15

2.1. Espermatozoide eta obozitoen garraioa 15

2.2. Espermatozoideen kapazitazioa 16

2.3. Espermatozoideen akrosomaren erreakzioa 17

2.4. Espermatozoidearen eta obozitoaren arteko lotura 17

3. ESPERMATOZOIDEEN MUGIKORTASUNA 19

3.1. Espermatozoideen mugikortasunaren azterketa molekularra 19

3.2. Mugikortasunaren azterketa fisiologikoa 21

4. SEINALEEN TRANSDUKZIO-BIDEAK GIZA

ESPERMATOZOIDEETAN 25

5. SISTEMA OPIOIDEA ETA KANNABINOIDEA 27

5.1. Sistema opioidea 27

5.2. Sistema kannabinoidea 36

HELBURUAK 45

MATERIALAK ETA METODOAK 49

1. MATERIALAK 51

1.1. Gailuak 51

1.2. Erreaktiboak 51

1.3. Soluzioak 52

2. METODOAK 57

2.1. Laginak lortzea 57

2.2. Espermatozoideak prestatzea 57

2.3. Hartzaileen espresio genikoa 58

2.4. Hartzaileen proteinen presentzia 63

2.5. Hartzaileen proteinak kokatzea 69

2.6. Espermatozoideen behaketa fisiologikoa 71

2.7. Analisi estatistikoa 76

EMAITZAK ETA EZTABAIDA 77

1. helburua: δ, κ eta µ opioide-hartzaileen espresioa eta kokapena giza

espermatozoideetan 79

1.1. Opioide-hartzaileen proteinaren espresioa giza espermatozoideetan 79

1.2. Opioide-hartzaileen kokapena giza-espermatozoideetan 80

1.3. Opioide-hartzaileen mRNAren espresioa giza espermatozoideetan 82

2. helburua: CB1 eta CB2 kannabinoide-hartzaileen espresioa eta kokapena giza

espermatozoideetan. 85

2.1. Kannabinoide-hartzaileen mRNAren espresioa giza espermatozoideetan 85

2.2. Kannabinoide-hartzaileen proteinaren espresioa giza espermatozoideetan 86

2.3. Kannabinoide-hartzaileen kokapena giza espermatozoidetan 87

3. helburua: Opioide- eta kannabinoide-hartzaileen aktibazioaren eragina

espermatozoideen mugikortasunean. 89

3.1. Agonista eta antagonista opioideen eragina espermatozoideen

Mugikortasunean 89

• δ opioide-hartzailearen agonista (DPDPE) eta antagonista (naltrindol)

opioideen eragina mugikortasunean 89

• κ opioide-hartzailearen agonista (U-50488) eta antagonista (nor-

binaltorfimina) opioideen eragina mugikortasunean 94

• µ opioide-hartzailearen agonista (morfina) eta antagonista (naloxona)

opioideen eragina mugikortasunean 94

3.2. Agonista eta antagonista kannabinoideen eragina espermatozoideen

Mugikortasunean 98

• CB1 kannabinoide-hartzailearen agonista (ACEA) eta antagonista

(SR 141716A) kannabinoideen eragina mugikortasunean 98

• CB2 kannabinoide-hartzailearen agonista (JWH-015) eta antagonista

(SR144528) kannabinoideen eragina mugikortasunean 101

EZTABAIDA OROKORRA ETA HIPOTESIAK 105

1. Garrantzitsua al da opioide- eta kannabinoide-hartzaileen mRNA mantentzea

espermatozoide helduetan? 107

2. Opioide eta kannabinoide-hartzaileen kokalekua: beren funtzioaren adierazle? 109

3. Opioide eta kannabinoideek espermatozoideen ugaltze-traktuetan zeharreko

bidaia erregulatzen dute? 110

ONDORIOAK 115

BIBLIOGRAFIA 119

ERANSKINAK 141

1. Eranskina: Denbora errealean egindako PCR kuantitatiboa (qRT-PCR) 143

2. Eranskina: PCRan anplifikatutako anplikoien sekuentziazioa 145

3. Eranskina: Mugikortasun parametroak 147

DOKTORE-TESI HONETATIK ERATORRITAKO ARTIKULUA 151

Sarrera

Sarrera 3

1. GIZONEZKOEN UGALTZE-APARATUA

1.1 Ugaltze-aparatu arraren anatomia fisiologikoa

1. irudiak gizonezkoen ugaltze-aparatua osatzen duten atalak erakusten ditu. Jarraian,

atal bakoitzaren kokalekua eta funtzioa aztertuko dugu banan-banan:

1.1.1 Testikuluak

Testikuluak (A) espermatozoideak sortu eta metatzeko eta androgenoak jariatzeko

organo espezializatuak dira. Eskrotoan biltzen dira, bertako tenperatura gorputzaren

ohikoa baino 2-3 ºC baxuago mantentzeko. Izan ere, testikuluen tenperatura altuagoa

denean, espermatogenesia kaltetua gertatzen da (Munkelwitz and Gilbert, 1998;

Zorgniotti, 1980). Barrabilak zenbait atalez osatuta daude:

a) Tubulu seminiferoak

Tubulu seminiferoak (B), testikuluen barneko ehunka hodixka bihurri eta era oso

trinkoan paketatuak dauden egiturak dira. Tubuluak zenbait lobulutan banatzen dira,

baina guztiek sare testikularrean bukatzen dute. Tubuluetan, espermatogenesia gertatzen

da; aurrerago azalduko dugu (Rhoades eta Tanner, 1995).

b) Sare testikularra

Tubulu seminiferoek sare testikularra (D) izeneko gune biltzailera igortzen dute beren

edukia, eta barrabiletako hoditxo eferenteetatik (E1) epididimora eramaten dute

(Guyton eta Hall, 1997).

1.1.2 Epididimoa

Epididimoa (E), testikuluen atzealdean kokatzen den hodia da; haren funtzioa hodi

deferentea eta testikuluak lotzea da. Epididimo bi dauzkate gizonek; bat testikuluko.

Doktore-tesia

Sarrera 4

Epididimoa, klasikoki, hiru zatitan banatu izan da: epididimoaren burua (E1), gorputza

(E2) eta isatsa (E3) (Rhoades eta Tanner, 1995). Gizakian, epididimoa 4-5 metro luze

da, eta espermatozoideek, bide hori egiteko, 3 egunetik gora ematen dute (Wen eta

Yang, 2000). Geroxeago ikusiko dugun bezala, organo hau oso garrantzitsua da

espermatozoideen heltze-prozesuan eta mugikortasunean (Cosentino eta Cockett, 1986).

Testikuluen eta epididimoaren jariakina hazi-likidoaren % 5 da, baina gametoen

ugaltze-prozesurako ezinbestekoak diren zenbait propietate bereganatzen laguntzen dute

(Jequier eta Crich, 1986).

1.1.3 Hodi Deferenteak

Hodi deferentea (F) epididimoaren edukia jaso eta hodi isurlera (H) eramaten duen

hodia da. Bide horretan dauden anpuluak (G) haziaren biltegi gisa jokatzen du. Hori da,

hain zuzen, basektomietan mozten den hodia.

(B) tubuluseminiferoak

(I) guruin besikularra

GERNU-MASKURIA (K)

(E) epididimoa

(E3) epid. isatsa (cauda)

(D) sare testikularra

(F) hodi deferentea

(L) uretra

(J) prostata

(A) TESTIKULUA

(E1) hoditxo eferenteak + epid. burua (caput)

(E2) epid. gorputza (corpus)

(M) guruin bulbo-uretrala

(H) Hodi isurlea

(G) hodi deferentearen anpulua(O) gorputz leizetsu

(N) gorputz arola

(P) glandea

1. irudia. gizonezkoen ugaltze-aparatuaren atalak. Azalpena testuan. (Debuse, 1998-tik moldatua).

1.1.4 Guruin Osagarriak

Espermatozoideak epididimotik uretraraino garraiatzeko ekintzari emisio deritzo, eta

bide horretan nahasten dira espermatozoideak eta guruin osagarrien jariakin guztiak.

Ekintza hori epididimo, hodi deferente eta hodi isurleen muskuluen uzkurketek eragiten

Doktore-tesia

Sarrera 5

dute (Rhoades eta Tanner, 1995). Beraz, guruin osagarriak uretrarekin konektatuta

daude, eta haien jariakinek espermatozoideen iraupena eta ugalkortasuna mantentzen

dute (Jequier eta Crich, 1986).

a) Guruin besikularra

Guruin besikularraren (I) jariakin gelatinakara horixka hazi-likidoaren % 46-80 izaten

da. Jariatzen dituzten gaien artean fruktosa (espermatozoideen elikagai energetiko

nagusia), azido askorbikoa, fibrinogenoa, bikarbonatoa eta prostagladinak daude,

besteak beste, eta ahalmen indargetzaile handia du (Jequier eta Crich, 1986).

b) Prostata

Prostata (J) gernu-maskuriaren (K) azpialdean dagoen guruina da, eta uretrarekin (L)

konektatuta dago (Rhoades eta Tanner, 1995). Prostataren jariakin urtsu eta

koloregabekoa hazi-likidoaren % 13-33 izaten da, eta zinkez eta hainbat entzimaz

(proteasa, fosfatasa azidoak...) osatua dago. Prostataren jariakin horrek pH azidoa du,

eta ugalkortasunaren zenbait prozesu garrantzitsu erregulatzen duten prostasoma

izeneko mintzezko besikulak ditu (Jequier eta Chrich, 1986). Prostasometan, osagai

lipidiko (kolesterola, esfingomielina...), ioi eta molekula txiki (Ca++, Zn++, GDP, ADP,

ATP...) eta proteina ugari (% 33,8 entzimak, % 19 proteina garraiatzaileak, % 17,3

seinaleen transdukziorako proteinak, % 14,4 GTP proteinak eta % 5,8 proteina

txaperonak) identifikatu dira (Utleg eta lank., 2003).

d) Guruin bulbo-uretrala

Guruin bulbo-uretralak (M) hazi-likidoari azken bi jariakinak gehitzen dizkio. Bi

jariakinek —gelatinakara, alde batetik, eta urtsua, bestetik— hazi-likidoaren % 2-5

osatzen dute, eta glukoproteinatan aberatsak dira (Jequier eta Crich, 1986).

1.1.5 Uretra

Testikuluaren eta kanpo-ingurunearen arteko azken egitura da. Zati prostatikoa, zati

menbranosoa eta zati arola ditu (L). Uretraren zati arola zakilaren barnean dago, eta

Doktore-tesia

Sarrera 6

gorputz arolak (N) inguratzen du. Haren gainean zakilaren trenkadak bitan banatzen

dituen gorputz leizetsua (O) dago, eta zakilaren gorputz arol distal zabaldua zakilaren

glandea (P) da. Egitura muskular horiek guztiek parte hartzen dute zakilaren tentetzean.

Hazi-isurtzea hazia uretratik kanporatzea da (Guyton eta Hall, 1997).

1.2 Gameto arra (espermatozoidea)

1.2.1 Espermatogenesia

Zelula ama germinaletatik espermatozoideetara doan desberdintze-prozesua da

espermatogenesia (2. irudia). Prozesu hori testikuluetan gertatzen da, tubulu

seminiferoetan hain zuzen ere. Haurtzaroan, gametoen sorrera atsedenean mantentzen

da, baina pubertaroan, hormona gonadotropikoen (FSH eta LH) kontzentrazioaren

igoerarekin batera, testikuluetako Leydig zelulek testosterona hormona jariatuko dute

eta, horrekin batera, espermatogenesia hasiko da. Prozesua bizitza osoan mantenduko

da, baina zahartzaroan urritze txiki bat nabaritzen da (Sadler, 2004).

Espermatogenesia, edo zelula germinal arren sorrera-prozesua, 3 zatitan banatu ohi da

(Dudek eta Fix, 2004):

a) Espermatozitogenesia

Zelula germinatibo primordialak (46, 2N), bitelo-zakuaren paretetan agertzen dira

garapen enbrionarioaren hirugarren astean eta, zatiketa mitotikoak jasaten dituzten

bitartean, mugimendu ameboideen bidez, 4. eta 5. asteen artean gonadetara heltzen dira.

Pubertaroan, zelula germinatibo primordialak A motako espermatogoniara (46, 2N)

desberdintzen dira.

A motako espermatogoniek etengabe mitosiak pairatzen dituzte, arra zelula amez

hornitzeko. Baina horietako hainbat zelula B motako espermatogonietara diferentziatzen

dira (46, 2N).

Doktore-tesia

Sarrera 7

b) Meiosia

B motako espermatogoniak lehenengo meiosian sartzen dira eta, DNA erreplikatzen

dutenean, espermatozito primario bihurtzen dira (46, 4N). Espermatozito primario

horiek lehenengo meiosia bukatzen dute, eta bakoitzak 2 espermatozito sekundario

sortzen ditu (23, 2N). Espermatozito sekundario horiek, bigarren meiosia eginda,

bakoitzak 2 espermatida sortzen ditu (23, 1N).

espermatozito I

espermatozito II

espermatogonia B

espermatogonia A

Mitosia(16 egun)

I. meiosia(24 egun)

II. meiosia(orduak)

espermatidak

espermatozoideak

hondakin-gorputzak

Espe

rmio

gene

sia

Espe

rmat

ozito

gene

sia

Desberdin-tzapena

Mei

osia

2. irudia. Espermatogenesiaren eskema. Zelula ama germinaletatik eratorritako A motako espermatogoniak, espermatogenesia prozesuaren lehenengo zelulak dira. Zelulen zatiketaren bidez zelula-klonak eratzen dira eta zelula berri horiek guztiak, zubi zitoplasmatikoen bidez, lotuak geratzen dira espermatozoideak hondakin-gorputzetatik banatzen diren arte. Zelula elkarlotuen kopurua, eskeman irudikatzen direnak baino askoz gehiago dira (Miller eta Ostermeier, 2006-tik moldatua).

d) Espermiogenesia

A motako espermatogoniek espermatogenesia egiten hasten direnetik espermatidak

sortu arte, zitozinesia osatugabea da. Hori dela eta, zelula batetik eratorritako zelula-

Doktore-tesia

Sarrera 8

klon luzeak zubi zitoplasmatikoen bidez lotuak agertzen dira. Zelula germinatibo heldu

(espermatozoideak) independiente bilakatzeko, espermatidek zenbait aldaketa

morfologiko pairatzen dituzte. Aldaketa horiek, besteak beste, hauek dira: akrosoma

garatzea, nukleoa kondentsatzea, zitoplasmaren zati nagusia desagertzea eta burua,

erdiko zatia eta isatsa eratzea. Dena den, espermatozoide horiek ez dute ernaltzeko

gaitasunik emearen ugaltze-traktuan kapazitazioa eta erreakzio akrosomikoa pairatu

arte.

Gizakietan, ziklo espermatogeniko bakoitzak 64 egun irauten ditu. Hala ere, ziklo

bakoitza bukatu baino lehen, 2-3 asteko erregulartasunez, beste ziklo batzuk hasten dira.

Ondorioz, tubulu seminifero bakoitzean garapen-egoera desberdinetan dauden zelulak

izango ditugu, eta garatuenak tubulu horien argiune edo lumen aldera kokatuko dira (3.

irudia). Tubulu horien alde basalean espermatogenesia erregulatzen duten Sertoli

zelulak ere kokatzen dira, eta odolaren eta tubuluaren arteko hesia edo muga dira

(Browder eta lank., 2000).

Tubuluseminiferoen

pareta

Espermatogonia

I. Espermatozitoa

II. Espermatozitoa

Espermatida

Espermatozoidea

GAR

APEN

AREN

SEK

UEN

TZIA

Tubuluseminiferoen

lumena

3. irudia. Espermatozitoen garapena tubulu seminifero baten zehar-ebakian. Xafla basalean, zelula ama germinalen populazioa dago (espermatogoniak). Zelula horiek zatitzean sortzen diren zelula alabak lumen aldera migratuko dute eta 64 egun eta gero, espermatozoideetara desberdintzen dira (irudia The McGraw-Hill Companies egindakotik moldatua dago).

Doktore-tesia

Sarrera 9

1.2.2 Espermatozoideen egitura

Espermatozoideen funtzioa ugaltze-zelula emeraino (obozitoa) iritsi eta hura ernaltzea

da. Helburu hori lortzeko, oso morfologia zehatza dute. Ugaztunen espermatozoidea bi

zati nagusitan banatu ohi da: burua eta isatsa (4. irudia).

4. irudia. Espermatozoidearen eta isatsaren ultraegituraren irudi eskematikoa. A) Ugaztunen espermatozoidea buruaz (akrosoma, nukleoa eta zitoplasma) eta isatsaz (lepoa, tarteko zatikia, zatiki nagusia eta bukaerako zatikia) osaturik dago. B) Tarteko zatiaren zehar-ebakiaren eskema. Bertan, kanpotik barrura, mintz plasmatikoa (MP), mitokondrien geruza (MG), 9 kanpo-zuntz dentso (KZD) eta axonema eratzen duten egiturak [mikortubulu-bikoteen eraztuna (MBE), dineinazko besoak (DB) eta erdiko mikrotubulu-bikotea (EMB)] daude. D) Zatiki nagusiaren zehar-ebakiaren eskema. Bertan, mintz plamatikoa (MP), 7 kanpo-zuntz dentso (KZD) eta 2 zuntzezko mintz zutabe (ZMZ) daude. Axonemako osagaiak ez dira aldatzen. E) Bukaerako zatiaren zehar-ebakiaren eskema. Bertan, mintz plamatikoa (MP) eta axonema agertzen dira. Azalpena testuan. (Turner, 2006-tik moldatua).

MBE EMB

DB

MP

MP

Tarteko zatia

Zatiki nagusia

Bukaerako zatikia

LepoaMG

KZD

MP

KZD

ZMZ

Zitoplasma

Akrosoma

Nukleoa

A

B

D

E

Burua

Buru barruko egitura aipagarrienak akrosoma, nukleoa eta zitoplasma — oso murritza—

dira (Browder eta lank., 2000):

Doktore-tesia

Sarrera 10

a) Akrosoma: Buruaren alde apikalean kokatzen den besikula handi bat da. Egitura

horren barruan, obozitoaren matrize estrazelularra (mintz peluzidoa)

zeharkatzeko beharrezkoak diren entzima hidrolitikoak daude. Entzima horiek,

akrosomaren exozitosiagatik (erreakzio akrosomikoa) askatzen dira.

b) Nukleoa: Akrosomaren atzetik geratzen den buruaren zatian kokatzen da,

eskualde post-akrosomalean hain zuzen. Espermatozoidearen nukleoan, DNA

oso kondentsatua dago espermatogenesian zehar protaminek histonak

ordezkatzen dituztelako. Nukleoan ere, oraindik guztiz ezagunak ez diren

zenbait funtzio bete ditzakeen RNA dago. Nukleoa obozitora sartu behar den

zatia da.

d) Zitoplasma: Espermatozoide helduek oso zitoplasma murritza dute.

Zitoplasmaren galera nagusia, espermatozoideak tubulu seminiferoen epiteliotik

askatzera doazenean gertatzen da. Askatzen duten zitoplasma zatiari hondakin-

gorputz deritzo; gorputz horietan, RNA paketatua, Golgi aparatua, erretikulu

endoplasmikoa, lisosomak eta peroxisomak daude. Sertoli zelulek fagozitatzen

dituzte hondakin gorputzak.

Nukleoko kromatinaren kondentsazio handiagatik, ez da mRNArik de novo sortuko, eta

zitoplasmaren presentzia murritza eta organuluen galera direla eta, mRNA hori ez da

itzultzen proteinetara, eta besikulen garraiorik ez da gertatzen. Espermatozoide helduek,

beraz, proteinen espresioa eta besikulen garraioa galdua dute (Miller eta Ostermeier,

2006). Horrek esan nahi du espermatozoideek ez dituztela konposatu berriak

sintetizatuko eta, beraz, espermatogenesian sortutakoarekin heldu beharko dutela

obozitora. Dena den, epididimoan zeharreko garraioan, likido seminalarekin kontaktuan

dauden bitartean edota emearen ugaltze-bidean zehar, espermatozoideen mintz

plasmatikoko proteina eta lipidoen trukea gertatzen da (Schuel eta Burkman, 2005).

Modu horretan, gerta daiteke espermatozoideek, ingurunearen arabera, jarduera

aldatzea. Bestalde, duela gutxi, proposatu da proteina jakin batzuen mRNAren itzulpen

mitokondriala gerta daitekeela (Miller eta Ostermeier, 2006). Beraz, gai horrek

eztabaida sortzen du oraindik.

Doktore-tesia

Sarrera 11

Isatsa

Espermatozoidearen isatsak egitura konplexua eta espezializatua osatzen du gametoaren

mugimendua ahalbidetzeko. Morfologikoki, lau zatitan banatzen da: lepoa, tarteko

zatikia, zatiki nagusia eta bukaerako zatikia (Mortimer, 1997):

Zelula eukariotikoen flageloetan, mugimendua sortzeko motorra axonema da.

Axonemaren egitura espermatozoideen isatsaren zatiki guztietan mantentzen den egitura

komuna da, eta mikrotubuluz eta haiei lotutako proteinez osatua dago. Zehazki,

tubulinaz eraturiko 9 mikrotubulu bikotek eraztun bat osatzen dute eta, erdian, beste bi

mkrotubulu paratzen dira. Mikrotubulu bikoteei lotutako egitura proteiko

garrantzitsuenak dineinazko besoak dira. Izan ere, proteina horrek ATPasa jarduera

duenez, energia kimikoa energia mekaniko bihurtzen du eta, ondorioz, konformazio-

aldaketa jasaten du. Beraz, mugimendua “mikrotubuluen arteko irristadura” bidez

gertatzen da, tubulina/dineina motorren funtzionamenduari esker (Marigomez eta

Cajaraville, 1999).

a) Lepoa: Buruaren eta isatsaren arteko giltzadura da.

b) Tarteko zatikia: Axonemaren inguruan, 9 kanpo-zuntz dentso daude; haien

inguruan, mitokondriaz osaturiko geruza; eta, azkenik, dena inguratzen mintz

plasmatikoa. Zatiki honetan sortzen da gametoaren mugimendurako beharrezkoa

den ATPa.

d) Zatiki nagusia: Hemen ere, axonema inguratzen duten kanpo-zuntz dentsoak

daude, baina 3.a eta 8.a luzetara kokatutako bi zuntzezko mintz-zutabek

ordezkatzen dituzte. Bi zutabeak elkarri lotuak agertzen dira. Azkenik, dena

inguratzen duen mintz plasmatikoa dago. Zatiki honetan ere ATPa sortzen da.

e) Bukaerako zatikia: Axonema eta haren inguruan, mintz plasmatikoa dago.

Doktore-tesia

Sarrera 12

1.2.3) Espermatozoideen heltzea

Espermatogenesia bukatu ostean, espermatozoideak tubulu seminiferoko argiunera

askatzen dira (espermiazioa). Espermatozoide askeak, obozitoa ernaltzeko gai izateko,

lehen aipatutako aldaketa morfologikoaz gain, aldaketa fisiologiko eta biokimiko

sakonak ere jasan behar izango ditu. Aldaketa horiei guztiei espermatozoidearen heltze-

prozesu deritze (Yanagimachi, 1994).

Beraz, mugimendu peristaltikoen bidez, espermatozoideak sare testikularra igaro ostean,

hoditxo eferenteetatik epididimora igarotzen dira; han, heltze-prozesuak jarraitzen du.

Alde batetik, epididimoaren burutik isatserainoko bidean, espermatozoideek

mugikortasuna bereganatzen dute (zitosoleko cAMP eta ATParen igoerarekin loturiko

prozesua) eta epididimoaren isats horretan metatzen dira. Bestalde, bide osoan zehar,

espermatozoideek zenbait molekula trukatzen dituzte ingurunearekin (gluzido, proteina

eta lipido ugari mintzetik erauzi, eraldatu edota bereganatu egiten dira) (Yanagimachi,

1994). Heltze-prozesuaren helburu nagusiak, beraz, mugikortasuna lortzea eta obozitoa

ezagutu eta berarekin fusionatzeko beharrezkoak diren konposatuak lortzea dira (Gatti

eta lank., 2004). Hala ere, lehen aipatu dugunez, ernalketarako gaitasun osoa

emakumezkoen ugaltze-aparatuan bukatzen da, kapazitazioarekin eta erreakzio

akrosomikoarekin (Sadler, 2004).

1.2.4) Espermatozoideen isurtzea

Espermatozoideak, kanporatuak izan arte, hodi deferentean eta haren anpuluan denbora

luzean metatu daitezke. Gizonezkoaren kitzikatze eta erekzioarekin batera, emisio

deituriko prozesua hasten da. Prozesu horretan, espermatozoideak likido seminala

osatzen duten zenbait jariakinekin elkartzen dira. Uretra, haziarekin betetzean,

zentzumen-seinaleak sortzen dira eta hazia isurtzen da. Isurtzen den hazia osagai

zelularrek (espermatozoideek) eta osagai jariatuek (likido seminalak) osatzen dute.

Likido seminala espermatozoideak emearen ugaltze-aparatuan barrena garraiatzeaz

arduratzen da, baina, gainera haren osagaiek badituzte beste zeregin asko ere: ATPa

ekoizteko substratu energetikoak (fruktosa...) gehitzen ditu. Isuritako haziaren

koagulazioa gertatzen da (fibrinogeno eta semenogelinaren bidez), hasiera batean haziak

Doktore-tesia

Sarrera

Doktore-tesia

13

baginatik alde egin ez dezan eta baginaren alde sakonetan (umetoki-lepoaren aldean)

manten dadin. Koagulua 15-20 minutuan disolbatzen da (fibrinolisinari esker), eta,

horregatik, espermatozoideen mugikortasuna areagotzen da. Likido seminalean dauden

faktore inhibitzaileei esker, geldotu egiten da espermatozoideen jarduera (kapazitazioa

eta erreakzio akrosomikoa saihestuz), eta, modu horretan, beren bideragarritasuna

mantentzen da. Haziaren pH-a 7,2 eta 7,8 artean egon ohi da, eta horrek

espermatozoideen mugikortasunean laguntzen du. Gizon emankor batek 2-6 ml hazi

isurtzen ditu, eta hazi horrek 50-250 milioi espermatozoide ditu mililitroko (Guyton eta

Hall, 1997).

Sarrera 15

2. ERNALKETA

Espermatozoidearen eta obozitoaren arteko loturari ernalketa deritzo. Prozesu hori

umetoki-tronparen anpuluan gertatzen da. Beraz, ernalketa gertatzeko,

espermatozoideek emearen umetoki-tronpara heldu behar dute eta obuluak obariotik

askatu eta umetoki-tronpara iritsi behar du (Mortimer, 1997).

2.1 Espermatozoide eta obozitoen garraioa

Espermatozoideei dagokienez, lehenik eta behin, isuritako hazia baginara heltzen da.

Likido seminalaren babesagatik, espermatozoideek baginako pH azidoa jasan dezakete.

Espermatozoideak likido seminaletik askatzen dira, eta umetoki-lepoaren hodira

garraiatuak dira. Lepoko mukosak lagunduta, espermatozoideak umetokira igarotzen

dira, eta, handik, umetokiko tronpara (Fallopioren tronpa) heltzen dira. Baginan,

umetokian eta umetokiaren eta tronparen arteko loturako bidean, espermatozoideen

galera handia gertatzen da, eta baginara askatutako espermatozoideen % 1 soilik heltzen

da tronpara. Umetoki-tronparen istmora ailegatzean, espermatozoideek mugikortasuna

murrizten dute; leku horretan amaitzen da espermatozoideen migrazioa obulazioa

gertatu arte (Sadler, 2004) (5. irudia).

Obozitoari dagokionez, oso ondo erregulatuta dagoen obulazioa gertatu eta gero,

obozitoa, kumulu ooforoko zelulez inguratua, obulutegitik askatzen da eta, zerrenda

obarikoen mugimenduak lagunduta, umetoki-tronparen anpulura heltzen da.

Aipatutako obulazio-prozesua gertatzen denean, agian kumulu ooforoko zelulek

askatutako substantzia kimioerakarleek eraginda, istmoan zeuden espermatozoideen

mugikortasuna berriro aktibatzen da eta umetoki-tronparen istmotik anpulura igeri

egiten dute (Sadler, 2004). Mugimenduaren hiperaktibazio hori, espermatozoideek

ernaltzeko gaitasuna bereganatzeko jasaten duten kapazitazioa eta ondoriozko erreakzio

akrosomikoaren hasiera da (Bedford, 1983) (5. irudia).

Doktore-tesia

Sarrera 16

Ernalketa

Obozitoa

Obarioa

Anpulua Istmoa

Umetoki-tronpa

5. irudia. Espermatozoide eta obozitoen garraioaren eskema umetoki-tronpan. Espermatozoideak umetoki-tronparen istmora ailegatzean, mugikortasuna txikitzen dute. Obulazioa gertatzean, obozitoa umetoki-tronpara kanporatzen da eta espermatozoideak hiperaktibatzen dira. Ernalketa, anpuluan gertatzen da. Azalpen zabaldua testuan (Schuel, 2006-tik moldatua).

2.2 Espermatozoideen kapazitazioa

Espermatozoideek ernalketaren azkeneko pausoak aurrera eramateko emearen ugaltze-

aparatuan jasaten duten aldaketa multzoari kapazitazio deritzo (Sadler, 2004). Aldaketa

horiek espermatozoideak likido seminaletik askatzen direnean eta emearen ugaltze-

aparatuko likidoekin harremanetan jartzen direnean hasten dira. Zehazki, umetoki-

tronpako likidoek espermatozoideen jardueraren inhibizioa eragiten zuten faktoreak

(proteina, glukoproteina, lipido...) kentzen dituztenean (Mortimer, 1997). Esate

baterako, espermatozoidearen mintzetik kolesterola erauzten da, eta, horren ondorioz,

espermatozoidearen buruaren mintz plasmatikoa desegonkortu egiten da (Cross, 1996).

Mintzaren jariakortasun-aldaketa horrek bikarbonatoa eta kaltzioaren sarrera eta beste

ioien irteera eragiten du, besteak beste, eta espermatozoideen metabolismoaren aldaketa

dakar (Flesch eta Gadella, 2000). Kapazitazioa prozesu itzulezina da.

Doktore-tesia

Sarrera 17

2.3 Espermatozoideen akrosomaren erreakzioa

Espermatozoideen kapazitazioa gertatzen denean, akrosomaren kanpo-mintza eta

espermatozoidearen buruko mintz plasmatikoa fusionatzen dira (Flesch eta Gadella,

2000). Horrek (1) akrosomako entzimen askapen txikia ekarriko du eta koroa

erradiatuko zelularteko bidea irekiko dio espermatozoideei. Espermatozoideak mintz

peluzidora lotzean (ZP3 proteinari esker), (2) akrosomaren kanpo-mintza erabat

disolbatzen da; akrosoma barruko entzima guztien exozitosia gertatzen da, eta mintz

peluzidoa digeritzen da (Guyton eta Hall, 1997) (6. irudia).

Umetoki-tronparen inguruneko substantziek bideratutako kapazitazioa eta erreakzio

akrosomikoa leku eta une zehatzean gertatzen ez badira, espermatozoideek ez dute

ernaltzeko gaitasunik izango (Harrison, 1996).

6. irudia. Erreakzio akrosomikoa eta ernalketa (espermatozoide eta obuluaren loturaren xehetasuna). Espermatozoideen kapazitazioa gertatzen denean akrosoma barruko entzimek (1) granulosako zelulak eta (2) mintz peluzidoa digerituko dute eta (3) espermatozoidea eta obozitoaren arteko mintzen fusioa gertatzen da. (irudia The McGraw-Hill Companies egindakotik moldatua dago).

2.4 Espermatozoidearen eta obozitoaren arteko lotura

Koroa erradiatuko zelulak eta mintz peluzidoa zeharkatzea lortzen duen

espermatozoidea obozitoaren mintz plasmatikoarekin (oolema) kontaktuan jartzen da,

eta (3) bi zelulen arteko mintzen fusioa gertatzen da (6. irudia). Espermatozoide horren

material genetikoa obozitoaren barnean sartuta, ernalketa gauzatzen da. Sortutako

Doktore-tesia

Sarrera 18

zigotoa aktibatu egiten da (agian, espermatozoideak eramandako faktoreek eraginda) eta

haren segmentazioa hasten da. 3 egunetan blastomeraz osatutako morula umetoki-

tronpatik umetokira garraiatuko da, eta, blastozisto-egoeran dagoenean, umetokian

ezarriko da. Hortik aurrera, enbrioia garatuko da (Sadler, 2004). (7. irudia).

1

Obarioa

Anpulua Istmoa

Umetoki-tronpa

2 3

45

6

7

8

9

10

7. irudia. Giza garapenaren lehenengo asteko gertaerak. 1) Obulazio osteko obozitoa. 2) Ernalketa, obulaziotik 12-24 ordu beranduago. 3) Zigotoa, DNAren bikoizketa unea. 4) 2 zelula-aldia (30 orduko adina). 5) 4 zelula-aldia (40 orduko adina). 6) 8 zelula-aldia. 7) Morula, 12-16 zelula-aldia (3 eguneko adina). 8) Morula berantiarra, umetokira heltzean (4 eguneko adina). 9) Blastozisto goiztiarra (4 egun eta erdiko adina), mintz peluzidoa desagertu da. 10) Ezarpen fase goiztiarra (6 eguneko adina). (Salder, 2004; Schuel, 2006-tik moldatua).

Doktore-tesia

Sarrera 19

3. ESPERMATOZOIDEEN MUGIKORTASUNA

Orain arte, gizonezkoen gametoetatik abiatuz, ugaltze-fisiologia aztertu dugu. Zehazki,

gameto arren sorrera (gametogenesia), egitura, heltzea, isurtzea, emearen ugaltze-

traktuan zeharreko garraioa eta ernalketa-prozesuak azaldu ditugu.

Jakin behar da ezen, gizonezkoak, ugalkorra izateko, aurrean aipatutako prozesu horiek

guztiak era egokian egiteko gai izan behar duela; zeren eta gizonezkoari ernalketa

gertatu arteko prozesuren batek huts egiten badio, ugalkortasun-gaitasuna murriztua

edukiko du.

Beraz, ugalkortasunik ezaren ikerketa egitean, ernalketa gauzatzeko beharrezkoa den

edozein prozesu fisiologiko edota biokimikoren erregulazioa aztertzen da, eta, behin

erregulazioa ulertuta, gai izango gara ugalkortasunik ezaren zergatiak errazago

ulertzeko.

Gizonezkoen ugalkortasuna aztertzeko, arruntki onartzen da prozesu fisiologiko

garrantzitsuenetariko bat espermatozoideen mugikortasuna dela. Hori horrela da, batez

ere, espermatozoideen mugikortasun urriak edo mugikortasunik ezak, ia beti,

ugalkortasunik eza dakarrelako (Turner 2006). Baina espermatozoideen mugikortasun

urriari loturiko ugalkortasunik ezaren erantzulea emea zein arra izan daiteke, hau da,

arazoa espermatozoidean (osagai maskulinoa), espermatozoideak zeharkatu behar duen

emearen ugaltze-traktuan (osagai femeninoa) edo bietan egon daiteke.

3.1 Espermatozoideen mugikortasunaren azterketa

molekularra

Espermatozoideak, mugitzeko, flageloaren mugimenduez baliatzen dira. Flageloaren

mugimenduaren oinarrian dauden erreakzio kimikoak ugariak izan arren, laburki baino

ez ditugu azalduko.

Espermatozoidearen isatsaren egitura aztertu dugunean, aipatu dugu flageloen

mugimendua axonemak sorturiko astinduran datzala; axonemaren “mikrotubuluen

Doktore-tesia

Sarrera 20

arteko irristaduran”, hain zuzen ere (Marigomez eta Cajaraville, 1999). Axoneman, 250

bat proteina daude, hala nola proteina zitoeskeletikoak (tubulina...), proteina motorrak

(dineina...), proteina txaperonak, kaltzioa lotzen duten proteinak eta proteina kinasak

zein fosfatasak... (Inaba, 2003). Axonemaren dineina-besoei ATPa lotzean, dineinaren

ATPasa aktibatzen da, eta, ATParen hidrolisiagatik, dineiak konformazio-aldaketa

jasaten du eta ondoz ondoko mikrotubuluen gainean mugitzen da. Baina axonemaren

dineina molekula guztiak ez dira batera aktibatzen; oinaldeko molekulak aktibatzen dira

lehenik, eta aktibazio hori hedatu egiten da pixkanaka axonemaren puntarantz, proteinaz

proteina motako elkarrekintzen bitartez. (Marigomez eta Cajaraville, 1999; Turner,

2006). Espermatozoideek, tarteko zatikiaren mitokondrietan gertatzen den fosforilazio

oxidatiboak eraginda, ATPa eskuratzen dute. Baina, isatsean zehar, mitokondriarik ez

dagoen tarteetan, ATPa lortzeko, oso garrantzitsua da batez ere zatiki nagusiaren

zuntzezko mintzetan gertatzen den glikolisia (Turner, 2006).

Espermatozoideen mugikortasuna erregulatzeko seinaleztatze-biderik garrantzitsuenak

cAMP/PKA eta kaltzioari loturikoak dira (Yanagimachi 1994, Ho 2002, Turner 2006).

Kaltzio ioia kanpotik zelulara barneratzean edota espermatozoideak barneko kaltzio-

biltegia hustutzean: (1) kaltzioak, kalmodulinara (CaM) lotzean, kalmodulina kinasa

(CaMK) aktibatzen du eta, ondorioz, mugikortasuna aktibatzen da (Ignotz Suarez 2005;

Turner, 2006); (2) bestalde, kaltzioak ezohiko adenilato ziklasa “disolbagarria” (sAC)

aktibatzen du (bikarbonatoak ere eragin berdina du) eta sAC-k AMP ziklikoa (cAMP)

sortzen du. (3) ATPtik sortzen den cAMPk, cAMParen menpeko proteina kinasa (PKA)

aktibatuko du eta, ondorioz, PKAk eta berak aktibatutako tirosina kinasak flageloaren

proteinak (dineinak,...) fosforilatuko dituzte, eta mugimendua sorraraziko dute (Tash

1989; Turner, 2006) (8. irudia).

Kaltzioa edota bikarbonatoak sorturiko seinaleztatze-bide horretaz gain,

espermatozoideen pH-an gertatutako aldaketek, GTPa lotzen duen proteina eraentzaile

(G proteina; ingelesezko GTP binding regulatory protein) txikiek edota

heterotrimerikoez gidaturiko seinaleztatzeak ere zerikusia dute mugikortasunaren

erregulazioan (Yanagimachi 1994, Wang 2003, Turner, 2006). Hala ere, mekanismo

horiek ez dira oraindik oso ondo ezagutzen.

Doktore-tesia

Sarrera 21

(1) (2)

(3)

Mugikortasuna Mugikortasuna

Tyrosina kinasa

Ser/Thr fosfatasak

Tyrosina fosfatasak

Barneerreserbak

Mintzeanzeharreko

kanala

(2)

8. irudia. Ugaztunen espermatozoideen mugikortasunaren erregulazioan parte hartzen duten hainbat seinaleztatze-bideen eskema. 1) CaM menpeko bidea. 2) sAC menpeko bidea. 3) cAMP/PKA bidezko seinaleztatzea. Azalpena testuan. (Turner, 2006-tik moldatua).

3.2 Mugikortasunaren azterketa fisiologikoa

Espermatozoideek, zeharkatzen duten ingurunearen arabera eta behar funtzionalen

arabera, mugikortasun-patroi desberdinak dituzte. Hala, plasma seminalean dauden

espermatozoide isuri berrien ibilbide lerrozuzenak, emearen lepoko mukosara heltzean,

fisiologikoki aurkeztuko lituzketen ibilbide lerrozuzen berdinak dira.

Espermatozoideek, plasma seminaletik askatzean eta emearen ugaltze-traktutik gora

abiatzean, mugikortasun-ezaugarriak aldatzen dituzte. Lehen aipatu dugun bezala,

umetoki-tronparen istmoan, espermatozoideen mugikortasuna motelduz doa eta,

kapazitazioa gertatzearekin batera, flageloaren uhin-luzera berriz handitzen da;

ondorioz, buruaren albo-desplazamendu handiko ibilbideak sortzen hasten dira (Álvarez

C, 2003; Mack eta lank., 1988; Roberson eta lank., 1988). Azkenean, uhinaren

anplitudea asimetriko bihurtzen da, eta mugimendu ez-progresibo eta indartsua

sumatzen da; horri espermatozoidearen hiperaktibazio deritzo (Álvarez C, 2003;

Burkman, 1984). Espermatozoideen ernaltzeko gaitasuna lortzea eta mugikortasuna

garatzea modu paraleloan gertatzen direnez, mugikortasuna erabili izan da

espermatozoide-populazio batek ernaltzeko duen gaitasuna zeharka neurtzeko (Álvarez

C, 2003; Holland-Moritz eta Krause 1992).

Doktore-tesia

Sarrera 22

Mugikortasuna kontuan harturik, Osasunerako Munduko Erakundeak lau taldetan

sailkatu zituen espermatozoideak (WHO, 1999):

- a motako mugikortasuna: higidura progresiboa (lerrozuzena) eta azkarra duten

espermatozoideak.

- b motako mugikortasuna: higidura ez-progresiboa (sigi-sagakoa) edota motelegia

duten espermatozoideak.

- c motako mugikortasuna: tokitik mugitzen ez diren edota ibilbide zirkular hertsia

duten espermatozoide mugikorrak.

- d motako mugikortasuna: mugimendurik ez duten espermatozoideak (geldiak).

Mugikortasunaren azterketa fisiologikoa egitean, mugikortasun hitzak bi kontzeptu

adierazten ditu: alde batetik, “espermatozoidearen mugikortasun lerrozuzen aktiboa”

[adibidez, gizonezkoen espermatozoideen batez besteko abiadura-lerro zuzena

segundoko 25 µm-koa da 37 ºC-an, eta tenperaturaren arabera aldatzen da (Kraemer eta

lank., 1998)]; bestetik, “espermatozoide mugikorren portzentaje totala” [adibidez,

Osasunerako Munduko Erakundearen arabera, hazi-lagina normaltzat hartzeko,

espermatozoideen % 25ek baino gehiagok a motako mugikortasuna izan behar dute edo,

gutxienez, espermatozoideen % 50ek a+b mugikortasuna izan behar dute (WHO,

1999)].

Diagnostikoa egiteko, mugikortasun-parametroaren erabilera handituz joan den heinean,

espermatozoideen abiadura eta espermatozoide mugikorren portzentajeaz gainera,

espermatozoideen ibilbideak edo mugimendu motak aztertzeko tresnak sortu dira

(Álvarez C, 2003). Hala, gaur egun, mikroskopioei loturiko neurketa-sistema

automatikoen bidez (CASA; ingelesezko computer assisted sperm analysis),

espermatozoidearen buruak bi planoetan egiten duen denboran zeharreko higidura azter

dezakegu. Aztertzen diren parametro nagusiak abiadura eta ibilbidea adierazten dutenak

dira (Mortimer, 2000):

a) Abiadura-parametroak:

VCL = abiadura lerromakurra (µm/s)

VSL = abiadura lerrozuzena (µm/s)

VAP = batez besteko ibilbidearen abiadura (µm/s)

Doktore-tesia

Sarrera

Doktore-tesia

23

b) Ibilbide-parametroak (abiaduren konparaketaz lortuak):

LIN = linealtasuna (VSL/VCL) X 100 (%)

STR = zuzentasuna (VSL/VAP) X 100 (%)

WOB = oszilazioa (VAP/VCL) X 100 (%)

d) Bestelako parametroak:

ALH = buruaren albo-desplazamenduaren anplitudea (µm)

BCF = zeharkatze-maiztasuna (Hz)

Bukatzeko, aipatu behar da Osasunerako Munduko Erakundeak espermatozoideen

mugikortasuna, kontzentrazioa eta morfologia irizpidetzat hartuta eratu zuela haziaren

patologien terminologia (WHO, 1999):

- Normozoospermia: eiakulatu normala, lehen aipatutako erreferentzia-balioa

betetzean.

- Oligozoospermia: Espermatozoideen kontzentrazioa erreferentzia-balioa baino

txikiagoa denean.

- Astenozoospermia: Espermatozoideen mugikortasuna erreferentzia-balioak baino

txikiagoak direnean.

- Teratozoospermia: Espermatozoide (morfologikoki) normalen kopurua erreferentzia-

balioa baino urriagoa denean.

- Nekrozoospermia: Espermatozoide bizien kopurua % 50 baino baxuagoa denean.

- Azoospermia: Espermatozoiderik ez eiakulatuan.

- Aspermia: Eiakulaturik ez.

Sarrera 25

4. SEINALEEN TRANSDUKZIO-BIDEAK GIZA

ESPERMATOZOIDEETAN

Gure gorputzeko organo eta ehunen integrazio funtzionalean, ezinbestekoa da zelula-

zelularen eta zelula-ingurunearen arteko komunikazio-sistema egokia izatea. Zenbait

zelula (zelula miokardikoak) komunikazio elektriko zuzenaz komunikatzen dira euren

artean. Hala ere, komunikabiderik hedatuenek oinarri kimikoa dute; adibidez, nerbio-

sistemaren sinapsietako neurotransmisoreak, sistema endokrinoaren hormonak edota

sistema immunearean bitartekari kimikoak. Komunikazio kimikoan parte hartzen duten

substantzia motak asko dira eta izaera kimiko desberdina dute (lipidoak, aminoazido

eraldatuak,...). Substantzia kimikoek seinale zehatzak eragiten dituzte zelulan eta,

modulaturiko transdukzio-bidearen arabera, zelula-barneko eraldaketa zehatza gertatzen

da. Gorputzean gertatzen den seinaleztatze modu hori ugaltze-sisteman ere gertatzen da

(Guyton eta Hall, 1997).

Lehenago aztertu dugun bezala, espermatozoideen sorrera-prozesutik obozitoa ernaldu

arte, espermatozoideek zenbait ingurune zeharkatu behar dituzte. Zehazki,

espermatozoideentzat duten garrantzi fisiologikoagatik, ingurune horietako

aipagarrienak dira tubulu seminiferoak (espermatogenesia han gertatzen delako),

epididimoa (heltze-prozesua han gertatzen delako), likido seminala (jardueraren

inhibitzailea eta bideragarritasunaren erantzulea delako) eta umetoki-tronpa

(kapazitazioa, hiperaktibazioa, erreakzio akrosomikoa eta gametoen mintzen fusioa han

gertatzen direlako). Espermatogenesia burutu ahal izateko, gameto arraren eta

ingurunearen arteko elkarrekintzak gertatzen dira; era berean, espermatozoideen heltze-

prozesua aurrera joateko, espermatozoideen eta gizonezkoaren ugaltze-traktuko

ingurunearen arteko elkarrekintzak gertatzen dira. Hazi-isurtzearekin, espermatozoideak

emearen ugaltze-traktura heltzen dira, eta likido seminaletik askatzen dira. Hortik

aurrera, espermatozoide horien funtzioak, emearen ugaltze-traktuko ingurunearekin

dituzten elkarrekintzek erregulatzen dituzte. Emearen ugaltze-traktuan, konposizio

biokimiko desberdineko inguruneak zeharkatzean, lehen aipatu ditugun elkarrekintzei

esker, espermatozoideen mintz eta zelula barruko transformazioa gertatzen da.

Eraldaketa horiek ahalbidetuko dute, hain zuzen, ingurune bakoitzean dauden eragile

fisiologikoei erantzuteko gaitasuna bereganatzea. Modu horretan, ernalketarako

Doktore-tesia

Sarrera 26

beharrezkoak diren prozesuak (kapazitazioa, hiperaktibazioa, erreakzio

akrosomikoa,...), bata bestearen ondorio gisa (modu sekuentzialean) gertatzen dira. Hala

ere, elkarrekintza eta aldaketa horiek oso ondo erregulatuak egon behar dute, zeren eta,

aipatutako gertaerak leku desegokian eta une desegokian gertatzen badira, murriztu

egingo baita ugaltzeko gaitasuna.

Laburtuz, ernalketa gauzatzeko, espermatozoideetan gertatu behar duten aldaketa eta

prozesu horiek guztiak (mugikortasuna barne), zelulen arteko eta zelularen eta

ingurunearen arteko seinaleen transdukzio-sistemek erregulatuko dituzte (Baldi eta

lank., 2002).

Badakigu zelula somatikoetan dauden seinaleztatze-bide asko, nukleoaren jarduera

eragiten duten bideak izan ezik, espermatozoideetan ere agertzen direla. Izan ere, azken

urteetan asko ikertu dira espermatozoideen mintz plasmatikoari loturiko hartzaileek

gidaturiko transdukzio-bideak. Eta, zehatzago adierazita, deskribatu da nerbio-sisteman

oso sakon ikertutako komunikazio zelularreko sistema askok espermatozoidearen

kapazitazioan, erreakzio akrosomikoan, mugikortasunean, arnasketan edota kimiotaxian

eragiten dutela (Meizel, 2004; Schuel eta Burkman; 2005).

Alde horretatik, hainbat ornogabe eta ugaztunen espermatozoideek hormona,

neurotransmisore eta neuromoduladoreak lotzen dituzten hartzaileak espresatzen

dituzte; substantzia horien artean, serotonina eta katekolaminak (Meizel eta Turner,

1983; Nelson eta Cariello, 1989; Bandivdekar eta lank., 1991), adenosina eta ATPa

(Minelli eta lank., 1995; Fraser eta Adeoya-Osiguwa, 1999; Meizel, 2004), azetilkolina

(Baccetti eta lank., 1995), prostaglandina eta leukotrienoak (Basuray eta lank., 1990;

Schaefer eta lak., 1998), gonadotropinak, progesterona, estrogenoak eta androgenoak

(Luconi eta lank., 1998; Lee eta lank., 2000; Solakidi eta lank., 2005), glizina (Meizel

eta Son, 2005), tazikininak (Ravina eta lank., 2007) eta beste substantzia batzuk daude

(berrikuspenerako, Meizel, 2004; Naz eta Sellamuthu, 2006).

Doktore-tesia

Sarrera 27

5. SISTEMA OPIOIDEA ETA KANNABINOIDEA

Opioideak eta kannabinoideak bi droga-talde psikoaktiboak dira. Opioideak peptidoak

dira, eta kannabinoideak lipidoak dira, baina profil farmakologiko antzekoa dute.

Fisiologikoki, biek eragiten dute analgesia, katalepsia, hipotermia, depresio motorra,

hipotentsioa, immunosupresioa, sedazioa eta beste hainbat efektu. Zelulan, substantzia

bakoitzak hartzaile desberdinak aktibatzen ditu, baina opioide-hartzaileak zein

kannabinoide-hartzaileak G proteinei lotuta daude, zehazki Gi/Go motako G proteinei

lotuak daude. Hartzaile horien aktibazioak, oro har, adenilato ziklasaren (AC) jarduera

eta tentsioaren mendeko kaltzio-kanalak inhibitu, potasio-kanalak aktibatu eta MAP

kinasen transdukzio-bidea estimulatzen du (Viganó eta lank., 2004). Azkenaldian,

opioide eta kannabinoideen arteko modulazio gurutzatua gertatzen dela proposatu da.

Orain arte lortu diren emaitzetan oinarrituta, modulazio gurutzatu hori azaltzeko,

hipotesi bat baino gehiago proposatu da; kannabinoideek peptido opioideak askatzea

edo alderantziz (Corchero eta lank., 1999), kannabinoideek opioide-hartzaileak

espresatzea edo alderantziz (Börner eta lank., 2006), hartzaile-mailako edota

transdukzio-bideen elkarrekintzak (Shapira eta lank., 2000) eta abar (berrikuspenerako,

Viganó eta lank., 2004; Fattore eta lank., 2005), baina oraindik ikerketa gehiago behar

dira hipotesietatik teorietara pasatzeko.

5.1 Sistema opioidea

Opioa lo-belarraren (Papaver Somniferum L.) fruituetatik ateratako erretxina da, eta

haren ondorioen arduradun nagusia morfina da (Lorenzo eta lank., 1999). Opioaren

eragin psikoaktiboak direla eta, beste edozein narkotiko baino gehiago erabili izan da,

alkohola alde batera utzita. Izan ere, opioak beti izan du toki gailena medikuntzan, eta,

gutxienez azken 4000 urteotan, terapeutikan ugari erabili da (Snyder, 1993). Opioaren

osagai aktiboak isolatzerakoan hasi ziren opiazeoen eragin kimikoak zientifikoki

ulertzen. 1805ean, Friedrich Sertürner izeneko kimikari alemaniar batek lo-belarretik

morfina hutsa lortu zuen, eta substantzia hori morphium izenaz bataiatu zuen, Morfeo

edo loaren jainko grekoaren oroimenez. Oro har, lo-belar landare batek eman dezakeen

opio gordin kantitatea 5-10 gramokoa da. Opioaren % 75-80 substantzia inaktiboak dira,

eta beste % 20-25 substantzia aktiboek osatzen dute. Garrantzitsuenak morfina (% 10),

Doktore-tesia

Sarrera 28

narkotina (% 6), papaverina (% 1) eta kodeina (% 0,5) dira. Heroina morfinari talde

azetilo bi gehituz lorturiko eratorri erdisintetikoa da, eta talde azetilo horiei esker,

lipodisolbagarritasun handia du. Horren ondorioz, ehunetara errazago heltzen da, eta

sortutako efektuak morfinak sortutakoak baino biziagoak dira.

Opioideak peptidoak dira, eta peptido horien hartzaileak, estekatzaileekiko duten

itxurazko afinitatearen arabera, hiru mota farmakologikoki desberdinetan sailkatu dira:

δ opioide-hartzailea (δ = delta, “deferens” hitzagatik, saguaren hodi deferentean

identifikatu zelako; DOP-R), κ opioide-hartzailea (κ = kappa, ketoziklazozinagatik;

KOP-R) eta μ opioide-hartzailea (μ = mu, morfinagatik; MOP-R) (Lord eta lank., 1977).

Hartzaile metabotropiko horiek, izatez, monomerikoak dira, mintz plasmatikoa

zeharkatzen duten 7 α-helizez eratuta daude, eta gai dira Gi/o proteinetara lotzeko

(Picatoste eta lank., 1996). Hartzaile horien artean, aminoazido-sekuentzien

antzekotasuna oso handia da [% 60 orotara eta % 73-76 mintzean zeharreko aldeetan

(Minami eta Satoh, 1995)]. Azken hamarkadan, opioide-hartzaileekin antzekotasun

handia duen nozizeptina lotzen duen opioide-hartzailea (nozizptina dinorfinaren antzeko

peptidoa da; NOP-R) deskribatu izan da (Wick eta lank., 1994; Mollereau eta lank.,

1994). Opioide-hartzaileak izaki bizidun ornogabeetan zein ornodunetan espresatzen

dira (Waldhoer eta lank., 2004).

5.1.1 δ opioide-hartzailea

Gizakiaren nerbio-sistema zentralari dagokionez, δ-hartzaileen dentsitate handia ikus

daiteke kortexean eta kaudatu-putamenean (Pilapil eta lank., 1987). δ-hartzailearen

mRNA, kortexean, kaudatu-putamenean, hipokanpoan eta amigdalan banatzen da

(Simonin eta lank., 1994). δ-hartzaileak, batez ere, axoietan kokatzen dira; beraz, ziur

aski gune presinaptikoan funtzionatzen dute gehienetan (Elde eta lank., 1995). Ehun

periferikoetan, δ-hartzailea, besteak beste, linfozitoetan (Sharp eta lank., 1998), hestean

eta guruin adrenalean (Wittert eta lank., 1996) espresatzen da.

5.1.2 κ opioide-hartzailea

Nerbio-sistema zentralean, κ opioide-hartzaileak kortexean, amigdalan eta klaustroan

ikus daitezke (Pilapil eta lank., 1987). κ-mRNA, besteak beste, kortexean, talamoan,

Doktore-tesia

Sarrera 29

hipotalamoan, gorputz ildaskatuan eta accumbens nukleoan agertzen da (Peckys eta

Landwehrmeyer, 1999). κ-hartzaileak dendritetan eta gorputz zelularrean kokatzen dira

gehienbat, eta, ziur aski, postsinaptikoki funtzionatzen dute (Elde eta lank., 1995). Ehun

periferikoei dagokienez, κ-hartzailea hestean (Wittert eta lank., 1995) eta, batez ere,

zelula immuneetan agertzen da (Rivière, 2004).

5.1.3 μ opioide-hartzailea

Nerbio-sistema zentralari dagokionez, δ-hartzaile eta μ-hartzaileen mRNAren banaketa

nahiko antzekoa den arren, badira ezberdintasunak. Kortexean, δ-mRNAren maila

handia da; μ-mRNAren maila, ostera, nahiko eskasa da (klase bietako hartzaileak

ugariak izan arren). Talamoan eta hipotalamoan, berriz, δ-mRNA gutxi (baita δ-

hartzaileak ere) eta μ-mRNA ugari agertzen da. Gorputz ildaskatuan (kaudatu-

putamenean) eta accumbens nukleoan, mRNA eta hartzaile mota biak azaltzen diren

arren, δ-mRNA lausotuago banatzen da (Mansour eta lank., 1994). μ-hartzaileak

dendritetan eta gorputz zelularrean kokatzen dira gehienbat, eta, ziur aski,

postsinaptikoki funtzionatzen dute (Elde eta lank., 1995). μ-hartzailea ehun

periferikoetan ere deskribatu da, besteak beste, arratoiaren hodi deferentean (Lemaire

eta lank., 1978), barean, guruin adrenalean eta giltzurrunean (Wittert eta lank., 1995) eta

saguaren hestean (Pol eta lank., 2001).

5.1.4 Barne-sistema opioidea

Opioide-hartzaileek, haien barne-estekatzaileek (barne-peptido opioideak; BPO) eta

sintesi- eta andeakuntza-prozesuetan parte hartzen duten molekulek barne-sistema

opioidea eratzen dute.

Nerbio-sistema zentralean ezagutzen diren peptido guztiak (karnosina dipeptidoa eta

glutation tripeptidoa izan ezik) gorputz neuronaleko erribosometan (erretikulu

endoplasmiko bikortsuan), molekula aitzindari peptidiko handi edo pre-pro-proteina

moduan sintetizatzen dira (Siegel eta lank., 1993). Metalo-endopeptidasa batek

hidrolizatu ondoren, pro-proteina moduan garraiatzen dira Golgi aparatura; handik,

pikor batzuetan, axoian zehar amaiera presinaptikoraino heltzen dira. Bide horretan

Doktore-tesia

Sarrera 30

zehar, hidrolisi eta aldaketa berri batzuk jasaten dituzte, peptido aktibo bihurtu arte.

Neurona peptidergikoa kitzikatzean, mintz presinaptikoaren despolarizazioa gertatzen

da, eta, ondorioz, tentsioaren menpeko kaltzio-kanalak zabalduko dira eta ioi horren

kontzentrazio zelularra igoko da (Thorn eta lank., 1978). Modu horretan, neuropeptidoz

beterik dauden besikulak, exozitosi bidez, gune sinaptikora askatzen dira.

Barne-sistema opioidearen kasuan, opioide-hartzaileak aurkitu ondoren, haien barneko

estekatzaileak eta horien aitzindariak sortzen dituzten hiru geneak identifikatu ziren:

a) Proentzefalina (PE) (Comb eta lank., 1982); nerbio-sistema zentralean eta muin

adrenalean sintetizatzen da. Tripsina, endopeptidasa eta N-karboxipeptidasa motako

entzimen eraginez, 243 aminoazidoko proteina horretatik, zazpi peptido opioide sor

daitezke. Garrantzitsuenak bost aminoazidoz eratutako entzefalinak (met- edo leu-

entzefalina) dira. Pentapeptido horien sintesiaren arduraduna garunean isolatutako

entzefalina konbertasa izeneko karboxipeptidasa bat da (Hughes, 1983).

b) Prodinorfinak (PD) (Kakidani eta lank., 1982); besteak beste, dinorfina A (1-17),

dinorfina B (1-13) eta β-neo-endorfina sortzen ditu.

d) Proopiomelanokortina (POMC) (Nakanishi eta lank., 1979); aitzindari honek

barne-opioideak ez diren peptidoak ere gordetzen ditu. Izan ere, β-endorfina peptido

opioideaz gainera, hormona adrenikortikotropikoa (ACTH), α eta β-lipotropina (LPH),

α eta β-melanotropina (MSH), eta beste zenbait peptidoren aitzindaria da. Molekula

horiek sintetizatzen dituen entzima POMC entzima bihurtzailea da (Turner eta lank.,

1987).

Gaur egun, 20 barne-peptido opioide ezagutzen dira eta 5-32 aminoazido arteko luzera

izan dezakete. Guztien ezaugarri komuna amino muturretik karboxi muturrera

errepikatutako aminoazido-sekuentzia da (“Tyr-Gly-Gly-Phe-Met” edo “Tyr-Gly-Gly-

Phe-Leu”), Met eta Leu-entzefalina alegia. Salbuespenak nozizeptina eta endomorfina

dira; azkenak 4 aminoazido baino ez ditu. Ugaztunen peptido opioide naturalak Met-

entzefalina, Leu-entzefalina, β-endorfina, Dinorfina A, Dinorfina B, α-Neoendorfina,

Nozizeptina eta Endomorfina dira (Florez, 1998).

Doktore-tesia

Sarrera 31

Oro har, entzefalinak δ-hartzailearen lotugai natural gisa ezagutzen dira, baina μ-

hartzaileei ere lotzen zaizkie. Dinorfinak κ-hartzaileari lotzen zaizkio, eta β-endorfinak

μ-hartzailea eta baita δ-hartzailea ere ia afinitate berez ezagut ditzake (Roques, 1999). 1.

taulan, peptido opioideek hartzaile bakoitzekiko dituzten afinitateak azaltzen dira.

1. taula. Estekatzaile opioideen afinitate-profilak, binding esperimentu bidez lortuak.

Ki (nM) Estekatzailea

δ κ µ Erreferentzia

Barne-opioideak

[Met5]-entzefalina 0,9 4440 9,5 Leslie, 1987

[Leu5]-entzefalina 3 835 20 Chang eta lank., 1981

Dinorfina A (1-17) 3,2 0,12 0,7 Leslie, 1987

Dinorfina B (1-8) 4,4 9 3,4 Leslie, 1987

β-endorfina 2,7 57 2 Leslie, 1987

α-Neoendorfina 0,57 0,20 1,3 Leslie, 1987

Endomorfina >500 >500 0,67 Goldberg eta lank., 1998

Opioide sintetikoak

DPDPE 1,4

19 (Kd)

790

-

>10000

>3000 (Kd)

Hunter eta lank., 1990

Fukuda eta lank., 1995

Naltrindol 0,13 >5000 >10000 Fang eta lank., 1994

U50,488 8690 0,72 941 Leslie, 1987

Nor-binaltorfimina 10,2 0,038 16,7 Metcalf eta Coop, 2005

Morfina* >1000

390 (Kd)

163

-

1,4

23 (Kd)

Satoh eta Minami, 1995

Fukuda eta lank., 1995

Naloxona 27 17,2 1,78 Leslie, 1987

*Morfina ez da gizakion barne-opioidea ezta opioide sintetikoa ere, izan ere, lo-belarraren erretxinatik eratorritako alkaloide opioidea da.

Peptido opioideen inaktibazioa, batez ere, peptidasa izeneko entzimek buruturiko

andeakuntza metabolikoaren bitartez gertatzen da. Biologikoki aktiboak diren peptidoak

apurtzean, zatiki inaktiboak sortzen dira (Iversen, 1987). Entzefalinaren (BPO ia guztien

sekuentzia errepikakorra) andeakuntza, bi entzimak katalizatzen dute batez ere: alanina

aminopeptidasa N (APN), entzefalinaren Tyr-Gly lotura apurtzen duena (Waksman eta

lank., 1985), eta endopeptidasa neutroa (NEP), entzefalinaren Gly-Phe lotura apurtzen

duena (Relton eta lank., 1983). Andeakuntza horien bidez, entzefalinaren jarduera

erregula daiteke.

Doktore-tesia

Sarrera 32

5.1.5 Opioide-hartzaileen aktibazioa

Opioide-hartzaileen moten artean, mintzean zeharreko domeinu eta zelula barnean

geratzen diren bukleen homologia handia izan arren (% 73-76 eta % 86-100, hurrenez

hurren), N- zein C- muturren eta zelulaz kanpoko 2. eta 3. bukleen homologia txikia da

(% 9-10, % 14-72 eta % 14-20, hurrenez hurren) (Chen eta lank., 1993). Beraz, erraz

uler daiteke hartzaile moten arteko homologia txikiko leku horiek peptido desberdinen

ezagupenean inplikaturik egongo direla (Jordan eta Devi, 1998) (10.A irudia).

Bideratutako aminoazidoen mutagenesiaren bidez jakin izan da ezen, δ-hartzaileetan

hondar baten (Lys108) ordezkapena egiten bada, µ-agonista espezifikoak, δ-hartzaile

mutatu horietara lot daitezkeela (Minami eta lank., 1996). Era berean, hiru opioide-

hartzaileetan serina-hondar bat ordezkatzean (Ser177 δ-n, Ser187 κ-n eta Ser196 µ-n),

naloxona antagonista ez-espezifikoak agonista gisa jokatzen du (Claude eta lank.,

1996).

Mintzean zeharreko hirugarren domeinu zitoplasmatikoa, 2. eta 3. barne-bukleak eta C-

muturreko zatiren bat G proteina heterotrimerikora lotzen dira

5.1.6 Seinaleztatzea opioide-hartzaileen bidez

Opioide-hartzaileak nagusiki G proteina inhibitzaileetara elkartzen dira. Agonistek G

proteina horiek aktibatzean, oro har, AC entzimaren inhibizioa gertatzen da eta, horren

ondorioz, cAMParen kontzentrazio-mailak txikitzen dira eta PKAren aktibazioa

murrizten da. Horrek, neuronetan, zelula barneko eta nukleoko proteina askoren

fosforilazio-egoeran eragingo du; ondorioz, badirudi transkripzio-prozesu askoren

aldaketak gerta daitezkeela, eta, epe batean, opiazeoekiko tolerantziaren edota

abstinentzia-sindromearen prozesuen errudun bihurtzen dira (Lorenzo eta lank., 1999).

Nerbio-ehunari dagokionez, opioideek sorturiko erantzuna, maiz, (1) aktibitate

bioelektrikoaren inhibizioa eta (2) neurotransmisoreen askapenaren inhibizioa da.

Erantzun molekularrari dagokionez, μ- eta δ-hartzaileen aktibazioak mintzaren

hiperpolarizazioa eta jarduera bioelektriko neuronalaren inhibizioa dakar, era zuzenean

Doktore-tesia

Sarrera 33

potasio-kanalen irekiera gertatzen delako (ioi horren konduktantzia igoz) edota

agonistak, zelula barneko kaltzioa askatzen duelako eta ioi horrek, zeharka, potasio

kanalen irekiera eragiten duelako (Williams eta lank., 1982). Bestalde, κ-hartzailearen

aktibazioak tentsioaren menpeko kaltzio-kanalen inaktibazioa ekar dezake; horren

ondorioz, kaltzioa neurona barnera sartzea ekiditen da eta neurotransmisoreen

askapenaren inhibizioa gertatzen da (Surprenant eta lank., 1990; Lorenzo eta lank.,

1999). Dena den, deskribatu da opioide-hartzaileak AC aktibatzen duten G proteinetara

(Gs) ere elkartu daitezkeela (Crain eta Shen, 1990, Ammer eta Schulz, 1997).

Azpimarratzekoa da δ- eta µ-agonisten kontzentrazio txikiek (nM) bide estimulatzailea

indartzen dutela eta kontzentrazio handiagoetan (µM) bide inhibitzailea aktibatzen dela

(Fields eta Sarne, 1997).

5.1.7 Opioide-hartzaileen ekintza fisiologikoak

Opioide-hartzaileak aktibitate fisiologiko askoren modulazioarekin erlazionatu dira. Oro

har, peptido opioideak edo alkaloide opiazeoak —morfina, adibidez— nerbio-sistema

zentralean edo nerbio-sistema periferikoan sartzean sortzen den ekintza-espektroa

antzekoa da. Hala ere, eragin horien intentsitatea ezberdina da eratorri opioide motaren

eta aktibatutako hartzailearen arabera (2. taula).

2. Taula. Opiazeoen ekintzak eta hartzaileak. (Flórez, 1998).

Ekintza Hartzaileak Ekintza Hartzaileak

Minaren inhibizioa μ, δ, κ Diuresia

Arnas depresioa μ, δ Inhibizioa μ

Menpekotasun psikikoa μ > κ Aktibazioa κ

Menpekotasun fisikoa μ > κ; δ? Bradikardia μ > δ = κ

Tolerantzia μ, δ, κ Hipotentsioa δ = κ > μ

Euforia eta sedazioa μ Akzio endokrinologikoak

Disforia κ PRL askatzea μ

Miosia μ, κ GHa askatzea δ > μ

Gihar-zurruntasuna μ ACTHa askatzea μ, κ

Mugikortasun gastrointestinala μ, δ? ADHa inhibitzea κ

Puxikaren mugikortasuna μ LHa inhibitzea μ, δ

Doktore-tesia

Sarrera 34

5.1.8 Sistema opioidearen inplikazioa ugalkortasunean

Peptido opioideek, zenbait lekutan arituz, ugaltze-sisteman eragiten dute (Fabri eta

lank., 1989). Peptido opioideek, nerbio-sistema zentralaren bidez, jokabide sexuala

inhibitzeaz gainera, ugaltze-funtzioa ere inhibitzen dute, alde batetik, hipotalamoko

GnRHaren jariapena ekidinez, hipofisiko hormona gonadotropikoen jariapena

inhibitzen dutelako (Kalra eta lank., 1988), eta, bestetik, guruin pituitarioa bera

zuzenean inhibitzen dutelako. Ehun periferikoetan, lyeding zelulek sortutako β-

endorfinek tubulu seminiferoen funtzioa inhibitzen dute (Fabri eta lank., 1989).

Horretaz gainera, substantzia opioide exogenoen kontsumoak (heroina, metadona)

emakumezkoetan amenorrea eragiteaz gainera (Santen eta lank., 1975), kalteak sortzen

ditu hazi-parametroetan eta, bereziki, espermatozoideen mugikortasunean (Cicero eta

lank., 1975; Ragni eta lank., 1985). Beraz, ikertzen hasi ziren ea opioideek

espermatzoideetan nerbio-sistema zentralaren bidez edota ehun periferikoen bidez

zeharka eragiteaz gainera zuzeneko efektua ere ba ote zuten.

Alde horretatik, badakigu peptido opioideak ugaltze-egituretan daudela hala nola

lyeding zeluletan, epididimoan eta prostatan (Gerendai, 1991). Bestalde, likido

seminalean ere, hainbat peptido opioideren kontzentrazio handiak deskribatu dira: esate

baterako, β-endorfina (Fraioli eta lank., 1984; Davidson eta lank., 1989), met-

entzefalina (Sastry eta lank., 1982; Fujisawa eta lank., 1996) eta leu-entzefalina (Sastry

eta lank., 1982). Izan ere, peptido horien kontzentrazioa handiagoa da plasma

seminalean, plasma periferikoan baino. Azkenik, espermatozoideetan ere, askotariko

peptido opioideak topatu dira, hala nola β-endorfina, met-entzefalina, leu-entzefalina

(Sastry eta lank., 1982; Foresta eta lank., 1986) eta proentzefalinatik eratorritako

produktuak (Kew eta lank., 1990).

Ugaltze-sisteman, δ-, κ- eta µ-hartzaileen mRNAk arratoien testikuluetako Sertoli eta

Leydig zeluletan eta espermatogenesiko zenbait zelula motatan deskribatu dira (Fabbri

eta lank., 1985; Wittert eta lank., 1996; Jenab eta Morris, 2000). Horretaz gainera, bi

arrain motaren espermatozoidetan ere, hiru opioide-hartzaileen lokalizazioa deskribatu

da (Aiudi eta lank., 2004), eta zaldien espermatozoideetan µ-hartzailearen presentzia

ikusi da (Albrizio eta lank., 2005). Datu horiekin guztiekin, pentsatzekoa da

espermatozoideen gaineko opioideen efektu zuzena gerta zitekeela.

Doktore-tesia

Sarrera 35

Hala, opioideen kontzentrazio desberdineko inguruneak erabilita, frogatu da opioide

horiek espermatozoideen mugikortasunean eragiten dutela; opiazeo-drogazaleetan

gertatzen zen bezala, alegia. Dena den, peptido motaren, kontzentrazioaren eta

inkubazio-denboraren arabera, efektu bat baino gehiago deskribatu dira:

Alde batetik, leu-entzefalina, edo met-entzefalinaren D-ala2-Mephe4-Met-(O)-OI-

enkephalin (DAMME) analogoa erabiltzean, mugikortasunaren inhibizioa ikusi da

(Sastry eta lank., 1991; Foresta eta lank., 1985); met-entzefalina erabiltzean, berriz, ez

da efekturik ikusi edo mugimendua mantentzen duela deskribatu da (Fraioli eta lank.,

1984; Fujisawa eta lank., 1996).

Bestetik, lan batzuetan β-endorfina erabiltzean dosiaren menpeko mugikortasunaren

inhibizioa ikusi arren, peptido hori naloxonarekin batera inkubatzean, bi efektu

kontrajarri deskribatu dira; mugikortasunaren inhibizioa ez ekiditea eta ekiditea (Fraioli

eta lank. 1984; Mari eta lank., 2005). Dena den, badirudi β-endorfinaren kontzentrazioa

ez dela adierazle ona gizonezko ez-ugalkor eta ugalkorren artean desberdintzeko (El-

Haggar eta lank., 2006).

Azkenik, deskribatu da naloxona antagonistaren kontzentrazio baxuak mugikortasuna

mantentzen laguntzen duela (Albrizio eta lank., 2005; Mari eta lank., 2005) baina

kontzentrazio handiagoak mugikortasuna murriztu (Albrizio eta lank., 2005) edo

areagotu egin dezakeela denboran zehar (Sastry eta lank., 1991).

Gauza azpimarragarria da hazi astenozoospermikoan topatutako met-entzefalina eta β-

endorfinaren kantitatea normozoospermikoan topatutakoa baino txikiagoa dela

(Fujisawa eta lank., 1996; El-Haggar eta lank., 2006).

Barne-sistema opioidea osatzeko, entzima degradatzaileen eginkizunari buruz hitz

egitea falta zaigu. Entzimen-jarduerari dagokionez, APNa espermatozoideetan, likido

seminalean eta prostasometan agertzen da; NEPa, berriz, soilik prostasometan. Gainera,

bestelako ehunetan baino jarduera handiagoa ikusi da (Fernandez eta lank., 2002). Datu

horiek entzimen kokalekuaren deskribapenarekin bat datoz, nahiz eta NEPa, modu

ahulean, espermatozoideetan ere ikusi den (Subiran eta lank., 2008). APNa eta NEPa

inhibitzean, espermatozoideen mugikortasuna mantentzen da denboran zehar, eta efektu

Doktore-tesia

Sarrera 36

hori naloxonak ekiditen du (Subiran eta lank., 2008). Bestalde, astenozoospermikoek,

normozoospermikoekin alderatuta, APN-jarduera txikiagoa dute (Irazusta eta lank.,

2004).

Mugikortasunaz aparteko faktoreak aztertuz, proentzefalinatik eratorritako peptidoak

akrosoman mantentzen dira eta, erreakzio akrosmikoa gertatzean, ingurunera askatzen

dira; horren ondorioz, ernaltze-prozesuan nolabaiteko garrantzia izan dezakeela

proposatu da (Kew eta lank., 1990). Bukatzeko, naloxona antagonistaren kontzentrazio

baxuak kapazitazioa areagotzen du (Albrizio eta lank., 2005).

Argi geratzen da, beraz, peptido opioideen efektu oso kontrajarriak deskribatu direla eta

asko geratzen dela argitzeko. Gainera, oso ikerketa gutxi egin dira giza hazia erabilita,

eta orain arte ez da deskribatu opioide-hartzaileen presentzia giza espermatozoideetan.

5.2 Sistema kannabinoidea

Kannabinoideak kalamu landareak (Cannabis sativa L.) sintetizatutako metabolito

sekundarioen multzo gisa definitzen dira. Efektu bioaktiboen arduradun nagusia Δ9-

tetrahydrokannabinola (THC) da. Kalamua, azken milurtekoetan medikuntzan, helburu

espiritualekin edota dibertimendurako erabili izan da. Marihuanaren osagai aktiboak

isolatutakoan hasi zen zientifikoki ulertzen kannabinoideen eragin kimikoa. Dena den,

bestelako sendabelarrekin alderatuta, kannabinoideen purifikazioa berandu gertatu zen,

konposatu horien izaera lipofilikoa dela eta. 1940ko hamarkadan lortu zen lehenengo

kannabinoide purua (Todd, 1946); geroago, 1960ko hamarkadan, THCa purifikatu eta

egitura deskribatu zen (Gaoni eta Mechoulan, 1964). THCa kannabinoide indartsuena

eta ugariena da, baina marihuanak dibenzopiranetik eratorritako 70 konposatu inguru

ditu. Garrantzitsuenak Δ9-tetrahydrokannabibarina (THCaren efektua antagonizatzen

duena), kannabidiola (CBD) eta kannabinola (CBN) dira (Elsohly eta Slade, 2005).

Esan bezala, marihuanatik eratorritako kannabinoideek izaera oso lipofilikoa dute.

Ezaugarri horregatik, hasiera batean, bestelako konposatu ez-hidrodisolbagarrien

(anestesikoak, disolbatzaileak...) moduan jokatzen zutela pentsatu zen, hau da, efektua

mintz zelularren jariakortasunean eragindako aldaketengatik sortzen zela (Lawrence eta

Gill, 1975).

Doktore-tesia

Sarrera 37

Hipotesi hori bertan behera geratu zen 1990eko hamarkadan, estekatzaile

kannabinoideekiko afinitatea zuten mintz-hartzaileak deskribatu zirenean (Matsuda eta

lank. 1990, Munro eta lank, 1993). Gaur egun arte, egitura heptahelikoidala eta Gi/o

proteinei lotutako bi kannabinoide-hartzaile mota klonatu dira. Hartzaile mota biek

sekuentzien antzekotasun handia erakusten dute [% 44 orotara eta % 68 mintzean

zeharreko aldeetan (Munro eta lank, 1993)]. Dena den, aurrerago ikusiko dugun bezala,

adierazpen-eredu oso desberdina dute. Bestalde, aipatzekoa da kannabinoide-hartzaileak

izaki bizidun ornogabeetan zein ornodunetan espresatzen direla (McPartland, 2004,

Begg eta lank., 2005).

5.2.1 CB1 kannabinoide-hartzailea

CB1-a oso kontserbatua agertzen da espezie batzuetan. Esate baterako, arratoiaren eta

gizakiaren CB1 hartzailearen aminoazidoen % 98an antzekotasuna dago. Banaketari

dagokionez, animalia helduan, batez ere, nerbio-sistema zentralean aurkitzen da eta

dentsitate handia du hipokanpoan, zerebeloan, amigdalan edo garun-enborrean.

Garuneko zelula mota guztiek [neuronak (Herkenham eta lank., 1990), astrozitoak

(Sanchez eta lank., 1998), oligodendrozitoak (Molina-Holgado eta lank., 2002) eta

mikrogliak (Cabral eta lank., 2001)], CB1 hartzailea espresatzen dute. Bestalde, CB1-a

ehun periferikoetan ere espresatzen da, hala nola bare, birika, hezur-muin, amigdala,

bihotz, prostata, umetoki, obario (Galiegue eta lank., 1995), heste (Di Carlo eta Izzo,

2003), ehun adiposo (Cota eta lank., 2003), erretina (Buckley eta lank., 1998), gibel

(Osei-Hyiaman eta lank., 2005) eta endotelio baskularrean (Liu eta lank., 2000).

Arratoi-enbrioiaren garapenean, CB1 hartzaile funtzionala ernaldiaren 11. eta 14.

egunaren artean agertzen da, gainerako neurotransmisoreen espresioarekin batera

(Pertwee, 2005a). Badirudi fase goiztiarretan aktibatzearen arrazoiak gene

garrantzitsuen indukzioa, metabolismo energetikoaren aktibazioa, azido

arakidonikoaren mobilizazioa eta nerbio-garapena direla (Ramos eta lank, 2002).

Kannabinoide-hartzaileen espresioari buruzko informazioa giza enbrioiaren garapenean

oso mugatua da, eta soilik dakigu hartzaile funtzionalak haurdunaldiaren 19. astean

agertzen direla (Mato eta lank 2003).

Doktore-tesia

Sarrera 38

5.2.2 CB2 kannabinoide-hartzailea

Gaur egun, informazio gutxiago dugu CB2-ari buruz CB1-ari buruz baino. Espezie

batetik bestera, CB2-a ez da CB1-a bezain ondo kontserbatu [arratoiaren eta gizakiaren

arteko antzekotasuna % 81 da (Munro eta lank., 1993, Shire eta lank., 1996)] eta

banaketa oso desberdina dauka. Nerbio-sistema zentralari dagokionez, CB2-a, zelula

mikroglialetan (Nunez eta lank., 2004), garunaren hainbat neurona-azpipopulaziotan

(Skaper eta lank., 1996, Ashton eta lank., 2006) eta garun-enborrean espresatzen da

(Van Sickle eta lank., 2005, Ashton eta lank., 2006). Ehun periferikoetan, CB2-a batez

ere barean, amigdaletan, B eta T zeluletan, monozitoetan, zelula dendritikoetan

(Galiegue eta lank., 1995, Schatz eta lank., 1997), erretinan (Croxford eta Yamamura,

2005) eta endotelio baskularrean (Blazquez eta lank., 2003, Golech eta lank., 2004)

kokatzen da. Zelula immuneen aktibazioak, mikroglialak barne, CB2-aren espresio-

maila areagotzen du (Kaminski eta lank., 1992, Croxford eta Yamamura, 2005).

5.2.3 Barne-sistema kannabinoidea

Kannabinoide-hartzaileek, haien barne-estekatzaileek (endokannabinoideak) eta sintesi-,

andeakuntza- eta rekaptazio-prozesuetan parte hartzen duten molekulek barne-sistema

kannabinoidea eratzen dute. Endokannabinoideak kate luzeko gantz-azido

poliasegabeen eratorriak dira (nagusiki, azido arakidonikoa) eta talde polar batekin

amida edo ester lotura sortzen dute. Endokannabinoideen artean, N-

arakidonoiletanolamina [anandamida, AEA (Devane eta lank., 1992)] eta 2-

arakidonoilglizerola [2-AG (Mechoulam eta lank., 1995)] azpimarratzekoak dira. Bi

konposatu horiek, CB1 zein CB2 hartzaileetara lotzeko gaitasuna dute. 3. taulan,

konposatu kannabinoideek hartzaile bakoitzarekiko dituzten afinitateak azaltzen dira.

Kaltzioaren menpeko bi entzimaren ekintzagatik sintetizatzen da AEA. Hasiera batean,

N-aziltransferasa (NAT) batek hondar arakidonilo bat transferitzen dio

fosfatidiletanolaminaren –NH2 taldeari (Sugiura eta lank., 1996), eta N-

arakidonoilfosfatidiletanolamina (NAPE) sortzen da. Gero, fosfolipasa D (PLD) batek,

AEA eta azido fosfatidikoa askatuko ditu (Di Marzo eta lank., 1994), nahiz eta azken

erreakzio hori eztabaidagarria den (Leung eta lank., 2006). Estimulu baten erantzun

gisa, zitoplasman kaltzioa metatzen denean, endokannabinoideak sintetizatzeko

makineria aktibatzen da eta konposatu horien sorkuntza areagotzen da. Behin lipido

Doktore-tesia

Sarrera 39

horiek sortuta, zelulatik kanpora garraiatuak izaten dira, agian proteina garraiatzaile

baten bidez (Wang eta lank., 2006), eta bi bide har ditzakete: (1) hartzaile

espezifikoetara lotu edo (2) birkaptatuak eta andeatuak izan. Endokannabinoideen

andeakuntza, bi entzimak katalizatzen dute, batez ere: gantz-azidoen amida hidrolasa

(FAAH), AEArentzat (Giang eta Cravatt, 1997, Cravatt eta lank., 2001) eta

monoazilglizerollipasa (MGL), 2-AGarentzat (Dinh eta lank., 2002). Kannabinoideen

kanporatzea eta birkaptazioari buruzko gaia eztabaidagarria da, zeren eta, oraindik,

molekula horientzako proteina garraiatzailerik ez baita klonatu, eta balizko proteina

horren existentzia nola gabezia babesten duten datuak argitaratu dira (Beltramo eta

lank., 1997, Hillard eta lank., 1997, Glaser eta lank., 2003, Hillard y Jarrahian, 2003).

3. taula. Estekatzaile kannabinoideen afinitate-profilak binding esperimentu bidez lortuak.

Ki (nM) Estekatzailea

CB1 CB2 Erreferentzia

Barne-kannabinoideak

AEA 78 >500 Pertwee, 2005a

2-AG 58 145 Pertwee, 2005a

Kannabinoide sintetikoak

ACEA 1,4 >2.000 Howlett eta lank., 2002

SR141716a 11,8 13.200 Howlett eta lank., 2002 JWH-015 383 13,8 Howlett eta lank., 2002 SR144528 >10.000 5,6 Howlett eta lank., 2002 Kannabinoide klasikoak Δ9-THC 80,3 32,2 Howlett eta lank., 2002

5.2.4 Kannabinoide-hartzaileen aktibazioa

Estekatzaile kannabinoideak hartzaileetara lotzeko modua oso gai interesgarria da,

agonista eta antagonista berrien diseinuan lagundu dezakeelako. Gaur arte ditugun

datuen arabera, kannabinoideak mintz lipidikoan sartu eta, albo-difusioari esker,

hartzaileetara lotuko lirateke (Makriyannis eta lank., 2005) (10.B irudia). Badirudi

prozesu horrentzako faktore garrantzitsuenetariko bat estekatzaile kannabinergikoen

talde polarren kokalekua dela. Izan ere, talde horietan gertatutako leku-aldaketek aldatu

egin ditzakete estekatzaileek mintz lipidikoan duten konformazioa, kokapena eta

orientazioa, eta, modu horretan, aktibitate biologikoa modula daiteke (berrikuspenerako,

Doktore-tesia

Sarrera

Doktore-tesia

40

COOH

NH2

CB

CBCB

Difusio laterala

Talde polarra

Talde polarrak

Zelula barnealdea

Zelula kanpoaldea

Glikozilazioak

OP

A B

10. irudia: Opioideak eta kannabinoideak hartzaileetara lotzeko proposatutako ereduak. A) Peptido opioideen lotunea opioide-hartzailearen mintzaren zeharreko domeinuek, N-muturrak eta bestelako kanpo-bukleek eratzen dute. B) Estekatzaile kannabinoidea mintz plasmatikoan barneratzen da eta albo-difusioaz proteina heptahelikoidalera lotzen da. Irudian agertu ez arren, kannabinoide-hartzaileak ere glikosila daitezke N- muturrean. OP: Opioide; CB: Kannabinoide. (Carracedo, 2006b-tik moldatua).

Makriyannis eta lank., 2005). Kannabinoide-hartzaileen jarduerari dagokionez, badirudi

hartzaileak ez daudela egoera basal ez-aktiboan. Izan ere, CB1 antagonistak,

SR141716ak (Pertwee, 2005b) eta AM251-ak, eta CB2 antagonistak, SR144528-ak eta

AM630-ak gai dira agonista kannabinoideek sortutakoen alderantzizko efektu

kannabinomimetikoak sortzeko (berrikuspenerako, Pertwee, 2005a). Eta antagonista

horien efektu batzuk, tonu endokannabinoidearen blokeoagatik sor daitezkeen arren,

badirudi beste efektu batzuek ez dutela zerikusirik blokeo horrekin. Hipotesirik

onartuenak dio kannabinoide-hartzaileak konformazio (aktibazio-egoera) desberdinetan

egon daitezkeela: (1) hartzaileak aktibatuak egongo liratekeen “ON” egoera bat

(efektoreei akoplatuak), eta (2) hartzaileak ez-akoplatuak egongo liratekeen “OFF”

egoera bat edo gehiago. Hala, agonistek “ON” egoerako hartzaileen kopurua handituko

lukete, alderantzizko agonistek “OFF” egoerakoak areagotuko lituzkete eta antagonista

neutroek konformazio bakoitzaren proportzioa mantenduko lukete (berrikuspenerako,

Pertwee, 2005b). Azkenik, kannabinoideen hainbat efektu ez dira CB1 edo CB2-aren

aktibazioari lotu eta, horregatik, kannabinoideetarako afinitatea duten bestelako

hartzaile batzuen existentzia proposatu da: (1) Vanilloide-hartzaileak; kapsaizina

(agonista) eta kapsazepina (antagonista) estekatzaile vanilloideak lotzen dituzte, baina

AEA bezalako kannabinoideen bidez ere aktiba daitezke (Di Marzo, 1998, Zygmunt eta

Sarrera 41

lank., 1999, Begg eta lank., 2005). (2) CB3-a; balizko kannabinoide-hartzaile berri bat

klonatu da, GPR55 hartzaile “umezurtza” (Baker eta lank., 2006).

5.2.5 Seinaleztatzea kannabinoide-hartzaileen bidez

Kannabinoide-hartzaileak, nagusiki, G proteina inhibitzaileetara elkartzen dira. G

proteina horien aktibazioak αi eta βγ azpiunitateen banaketa dakar. αi azpiunitateak AC

inhibitzen du, eta cAMPren ekoizpena txikitzen. Horren ondorioz, PKAren aktibazioa

ere murrizten da. Bestalde, βγ dimeroak seinaleztatze-bide desberdinak aktiba ditzake,

hala nola fosfatidilinositol-3 kinasa (PI3K)-Akt eta mitogenoek aktibaturiko kinasak

(MAPK) p38 MAPK eta Jun N-bukaera kinasa (JNK) (Liu eta lank., 2000, Rueda eta

lank., 2000, Herrera eta lank., 2005). Dena den, deskribatu da kannabinoide-hartzaileak

AC aktibatzen duten G proteinetara (Gs) ere elkartu daitezkeela (adibidez, Gq eta G13)

(Bonhaus eta lank., 1998, Lauckner eta lank., 2005). Bukatzeko, kannabinoide-

hartzaileek G proteinetatik independente diren efektuak sor ditzakete, hala nola

esfingomielinaren FAN bidezko hidrolisia (Sanchez eta lank., 2001) edo zenbait kanal

ionikoren erregulazioa (berrikuspenerako, Pertwee 2005a).

5.2.6 Kannabinoide-hartzaileen ekintza fisiologikoak

Sistema kannabinoidearen funtzioak, animalia-ereduetan, in vitro sistemetan eta

kannabisaren erabilera ludikoak sortutako efektuetan ikertu dira. Sistema horren paper

garrantzitsuenetariko bat neuromodulatzailearena da; izan ere, CB1 hartzailea G

proteinei loturiko hartzailerik ugariena da nerbio-sistema zentralean (Herkenham eta

lank., 1990). Sistema kannabinoidearen ekintza, nerbio sistema zentralean eta ehun

periferkoan deskribatu da (4. taula).

5.2.7 Sistema kannabinoidearen inplikazioa ugalkortasunean

Kannabinoideek, leku desberdinetan arituz, ugaltze-sisteman eragiten dute.

Kannabinoideek ugaltze-funtzioa inhibitzen dute hipotalamoko GnRHa (Gammon eta

lank., 2005) eta hipofisiko prolaktina (PRL) eta hormona luteinizatzaileen (LH) mailak

jaitsiz (Vescovi eta lank., 1992; de Miguel eta lank., 1998) eta, ondorioz, Leyding

zeluletan sortutako testosterona-maila ere jaisten da (Harclerode, 1984). Baina, badirudi

Doktore-tesia

Sarrera 42

Leyding zeluletan dauden CB1 hartzaileen bidez testosteronaren jaitsiera zuzenean

gertatzen dela (Wenger eta lank., 2001). Horretaz gainera, substantzia kannabinoide

exogenoen kontsumoak (THC), emakumezkoen hilekoan eta haurdunaldian

ezegonkortasunak sortzeaz gainera (Smith and Asch, 1987), kalteak sortzen ditu hazi-

parametroetan eta, bereziki, espermatogenesian eta espermatozoideen mugikortasunean

(Hembree eta lank., 1976; Hong eta lank., 1982). Beraz, ikertzen hasi ziren ea

kannabinoideek espermatozoideetan nerbio-sistema zentralaren bidez edota ehun

periferikoen bidez zeharka eragiteaz gainera zuzeneko efektua ere ba ote zuten.

4. taula. Barne-sistema kannabinoidearen ekintza garrantzitsuenak (Carracedo, 2006b).

Ehuna Ekintza

Nerbio-sistema zentralean Babes neuronala

Kontrol motorra

Termorregulazioa

Oroimenaren modulazioa

Nozizepzioa

Gosearen kontrola

Oka egitearen kontrola

Erregulazio neuroendokrinoa

Begian Begi-barneko presioaren murrizpena

Digestio-sisteman Gosearen kontrola

Obesitatearen tratamendua

Heste-mugimenduen kontrola

Ugaltze-sisteman Ugalkortasunaren kontrola

Hezurrean Hezurren berrosatzearen kontrola

Sistema immunean Immunomodulazioa

Sistema baskularrean Hipotentsioa

Alde horretatik, badakigu AEA saguen umetokian eta emakumezkoen umetoki-tronpan

(Schmid eta lank., 1997) eta arratoien testikuluetan (Sugiura eta lank., 1996) agertzen

dela. Bestalde, giza espermatozoideek zeharkatu behar dituzten likido batzuetan ere

AEA deskribatu da, hala nola likido seminalean, umetoki-tronpako likidoan eta likido

folikularrean (Schuel eta lank., 2002).

Doktore-tesia

Sarrera

Doktore-tesia

43

Ugaltze-sisteman, CB1 hartzailea prostata (Ruiz-Llorente eta lank., 2003), testikulu

(Galiegue eta lank., 1995) eta Lyeding zeluletan (Gye eta lank., 2005) deskribatu da eta

CB2 hartzailea prostata (Sarfaraz eta lank., 2005), testikulu (Brown eta lank., 2002) eta

Sertoli zeluletan (Macarrone eta lank., 2003). Espermatozoideetan, CB1 kannabinoide-

hartzailearen lehenengo ebidentziak itsas trikuan deskribatu ziren (Chang eta lank.,

1993) eta, geroago, giza (Schuel eta lank., 2002; Rossato eta lank., 2005) txerri-

(Maccarrone eta lank., 2005), sagu-, arratoi- eta igel-espermatozoideetan (Gye eta lank.,

2005; Cobellis eta lank., 2006) deskribatu dira. Datu horiekin guztiekin, pentsatzekoa da

gerta daitekeela kannabinoideek zuzeneko efektua eragitea espermatozoideetan.

Ildo horretan, kannabinoideek (THC, AM 356), erreakzio akrosomikoaren blokeoaren

bidez (Schuel eta lank., 1994), itsas trikuen espermatozoideen ugaltzeko gaitasuna

inhibi dezakete (Schuel eta lank., 1991; Berdyshev, 1999). Era berean, AEA barne-

kannabinoideak espermatozoideen mugikortasuna eta erreakzio akrosomikoa inhibitzen

du CB1 hartzailearen aktibazioaren bidez (Schuel eta lank., 1994; Rossato eta lank.,

2005; Macarrone eta lank., 2005; Cobellis eta lank., 2006). Eta deskribatua dago txerri-

espermatozoideek AEA sintetizatu (NAPE-PLD), lotu (CB1, TRPV1) eta andeatzeko

(FAAH) beharrezkoa den makinaria biokimiko guztia dutela (Maccarrone eta lank.,

2005).

Bukatzeko, interesgarria da aipatzea ezen saguen enbrioian eta umetoki-tronpan,

AEAren sintesi eta andeakuntzagatik, ugaltze-traktuaren zati horretan “AEA-tonu”

desberdinak ezarriko direla. Eta badirudi “AEA-tonu” hori oso garrantzitsua izan

daitekeela espermatozoideek ernaltzeko gaitasuna eskuratzeko eta geroko enbrioia

garatzeko (berrikuspenerako, Schuel, 2006; Wang eta lank., 2006).

Gaur egun arte, kannabinoideek espermatozoideetan duten eraginaren azterketa, batez

ere, CB1 hartzailean egin da. Aitzitik, nahiz eta autore batzuek ez duten baztertzen CB2

hartzailea espermatozoideetan egotea (Schuel eta Burkman, 2005; Maccarrone, 2007),

hartzaile mota horrek espermatozoideetan duen eraginari buruzko lanik ez da egin

oraindik.

Helburuak

Helburuak 47

Azkeneko hamarkadetan, zelula-zelula edota zelula-ingurune seinaleen transdukzio-

sistemak ikertzen dituzten laborategi askotan ohartu dira ustez neuronetako espezifikoak

ziren mintz-hartzaileak bestelako zelula somatikoetan ere badaudela. Horren ondorioz,

hartzaile horientzako estekatzaileak eta ehun bakoitzean dituzten funtzioak deskribatuz

joan dira.

Ildo horretatik, azkeneko urteetan, ar zein emeen ugaltze-sistemako osagaietan

konposatu “neuroaktiboak” (neurotransmisoreak eta neuromoduladoreak) lotzen

dituzten hartzaileen presentzia zabala aurkitzeaz gainera, ikusi da ugalkortasunerako

garrantzitsuak diren gertaeretan parte hartzen dutela. Izan ere, ugaltze-aparatuetan,

sistema “neuronal” klasiko batzuk osorik deskribatu dira.

Opiazeoak eta kannabinoideak (alkohola alde batera utzita), droga psikoaktibo

erabilienetakoak izan dira aspalditik. Barne-sistema opioide eta kannabinoidea

deskribatu zirenean eta, beraz, barnetik zein kanpotik eratorritako substantzia horien

ekintza modua ulertuz joan zen heinean, aukera asko zabaldu ziren medikuntzaren

garapenerako. Hasiera batean, sistema opioide eta kannabinoidearen eragina nerbio-

sistema zentralean ikertu zen eta, nahiz eta substantzia oso desberdinak izan, duten

ekintza-moduagatik eta sortzen duten efektuengatik, bi sistemak erlazionatzeko joera

izan da beti. Lehenengo ikerketen arabera sistema neuronaltzat hartuak izan baziren ere,

bi sistema horien osagaiak ehun periferikoetan deskribatuz joan dira eta, gaur egun,

emakumezko eta gizonezkoen ugaltze-aparatuetan partzialki deskribatuak izan dira.

Hala ere, substantzia opioide eta kannabinoideen efektu batzuk deskribatu diren arren,

oso informazio gutxi dago opioide-hartzaileek eta kannabinoide-hartzaileek giza

espermatozoideetan duten eraginari buruz.

Aurrekariak kontuan hartuta eta giza ugalkortasuna hobeto ulertzeko asmoarekin, tesi

honetarako, 3 helburu nagusi proposatu ditugu:

1. δ, κ eta µ opioide-hartzaileen espresioa eta kokapena giza espermatozoideetan.

2. CB1 eta CB2 kannabinoide-hartzaileen espresioa eta kokapena giza

espermatozoideetan.

3. Opioide- eta kannabinoide-hartzaileen aktibazioaren eragina espermatozoideen

mugikortasunean.

Doktore-tesia

Materialak eta Metodoak

Materialak eta metodoak 51

1. MATERIALAK

Ikerketa honetan, honelako gailuak, erreaktiboak eta soluzioak erabili genituen:

1.1 Gailuak - Abiadura handiko zentrifuga hozgarria. Sorvall RC 28S. - Angelu finkoko Sorvall SM-24 errotorea. - Ultrazentrifuga. Kontron Centrikon T2070. - Angelu finkoko Kontron TFT 45.6 errotorea. - Bolumen aldakorreko pipeta automatikoak. Nychiryo. - Espektrofotometroa. Shimadzu UV-2401 PC. - Homogeneizagailua, teflonezko enboloduna. Heidolph. - Inkubagailu lehorra. Hotcold S, 0º-60ºC bero-tartea. Selecta. - Inkubagailu hezea. Unitronic 320 OR. Selecta. - pH-metroak, Micro-pH 2001 eta Micro-pH 2002. Crison. - Zehaztasunezko balantza. R180D. Sartorius. - Termoegonkortutako irabiagailu magnetikoa. Agimatic. - Mikroskopio fase-kontrasteduna. Nikon H550S. - Laser-mikroskopio fokukidea. Olympus Fluoview FV500. - Bideokamera. Basler. - Elektroforesi- eta transferentzia-euskarriak. Mini Trans-Blot III. Bio-Rad. - Termozikladorea. Mastercycler. Eppendorf. - RT-PCR sistema. 7900. Applied Biosystems. - Densitometroa. Molecular Imager GS-800. Bio-Rad. 1.2 Erreaktiboak 1.2.1 Opioideak

Morfina hidroklorida (Alcaliber S.A.) DPDPE: [D-Pen2,5]-Entzefalina (Sigma-Aldrich) U-50488: 3,4-Dikloro-N-metil-N-[2-(1-pirrolidinil)ziklohexil]benzeneazetamida (Sigma-Aldrich) Naloxona (Sigma-Aldrich) Naltrindola (Sigma-Aldrich) Nor-binaltorfimina (Sigma-Aldrich) 1.2.2 Kannabinoideak

ACEA: arakidonil-2-kloroetilamida (Tocris Bioscience) JWH-015: (2-Metil-1-propil-1H-indol-3-il)-1-naftalenil-metanona (Sigma-Aldrich) SR141716a: N-piperidino-5-(4-klorofenil)-1-(2,4-diklorofenil)-4-metil-3-pirazol-karboxamida (Manolo Guzman doktoreak utzia, Madrilgo Unibertsitate Konplutentsea, UCM) SR144528: N-[(1S)-endo-1,3,3-trimetil biziklo[2.2.1] heptan-2-il]-5-(4-kloro-3-metilfenil)-1-(4-metilbenzil)-pirazol-3-karboxamida] (Manolo Guzman doktoreak utzia, UCM)

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak 52

1.2.3 Beste erreaktibo batzuk

Pisu molekular ezaguneko proteinak (Invitrogen) TRIZOL® (Invitrogen) RNasa inhibitzailea (Promega) Transcriptor RT + erreakzio-indargetzailea (Roche) Azarezko hexameroak (Amersham) GoTaq® polimerasa + erreakzio-indargetzailea (Promega) Pisu molekular ezaguneko nukleotidoak (Bioline) Nukleotidoentzako karga-indargetzailea (Biolina) Fluoromount G (EMS) Gainerako erreaktiboak (Sigma-Aldrich) 1.3 Soluzioak 1.3.1 Tyrode-BSA

100 mM NaCl 21,7 mM sodio-laktato 20 mM Hepes 15 mM NaHCO3 5 mM glukosa 3 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM sodio-pirubato 0,4 mM MgSO4 0,3 mM KH2PO4 100 µg/ml kanamizina 7 mg/ml BSA (Behi-serum albumina) H2O-a bolumena bete arte Prestakin hori 0,22 µm-ko iragazkitik iragazi behar da, eta 7,4 pH-an eta 285-300 mOsm-ean mantendu behar da. 1.3.2 Tyrode-BSA eraldatu ez-kapazitantea (TBEK)

Tyrode-BSA inguruneari, bikarbonatoaren (15 mM NaHCO3) ordez, NaCl hein berean gehitzen zaio osmolaritatea mantentzeko. 1.3.3 Tyrode eraldatu ez-kapazitantea (TEK)

Tyrode inguruneari, bikarbonatoaren (15 mM NaHCO3) eta BSA-ren (7 mg/ml) ordez, NaCl hein berean gehitzen zaio osmolaritatea mantentzeko. 1.3.4 Fosfato/gatz-indargetzailea (Phosphate buffered saline; PBS)

137 mM NaCl 2,7 mM KCl 1,5 mM KH2PO4 8,1 mM Na2HPO4 H2O-a bolumena bete arte

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak 53

1.3.5 Lisi-indargetzailea

PBS % 1 (b/b) Triton X-100 % 1 (b/b) Proteasen inhibitzaileen koktela 1.3.6 Tris-HCl 10 mM pH-a:7,4

1000 ml H2O 12,11 g Tris-Base HCl-aren pH-a 7,4-ra heldu arte 1.3.7 Tris-HCl / 1M / pH 8,8 Tris

1000 ml H2O 121,14 g Tris-Base HCl-aren pH-a 8,8-ra heldu arte 1.3.8 Tris-HCl 0,5M pH:6,8

1000 ml H2O 62,07 g Tris-Base HCl-aren pH-a 6,8-ra heldu arte 1.3.9 Homogeneizazio-soluzio indargetzailea

10 mM Tris-HCl, pH 7,4 % 1 (b/b) Proteasen inhibitzaileen koktela H2O-a bolumena bete arte 1.3.10 Bradford erreaktiboa

0,117 mM Coomasie urdin distiratsua % 5 (b/b) Etanola % 15 (p/b) Azido ortofosforikoa H2O bolumena bete arte Prestakina nahastu egiten da bi orduz, irabiatuz. Disolbatu ez den koloratzailea erauzteko, disoluzioa birritan iragazten da iragazpaperez. 1.3.11 Sodio dodezil sulfatoa (SDS) - % 10

100 ml H2O 10 g SDS 1.3.12 Persulfato amonikoa - % 10

10 ml H2O 1 g persulfato amoniko

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak 54

1.3.13 Proteinentzako karga-indargetzailea (Laemmli sample buffer) - 5X

% 10 (p/b) SDS % 25 (b/b) Tris-HCl 250 mM pH 6,8 % 0,025 (p/b) bromofenol urdin % 50 (b/b) glizerol % 5 β-merkaptoetanol H2O-a bolumena bete arte Karga-indargetzaileak 5 aldiz diluitua geratu behar du laginean. 1.3.14 Gel banatzailea

% 30 akrilamida / % 1 bisakrilamida: akrilamida, % 30etik nahi den %-ra eramateko, diluitu egin behar da (adibidez, % 12rako, 2,5 aldiz diluitu). Tris-HCl 1 M pH 8,8: % 25 (bol) % 10 SDS: % 1 (bol) H2O-a bolumena bete arte % 10 (p/b) Persulfato amonikoa: 50 µl TEMED: 10 µl 1.3.15 Gel kontzentratzailea

% 30 akrilamida / % 1 bisakrilamida: akrilamida % 4ra (7,5 aldiz diluitu) Tris-HCl 0.5 M pH 6.8: % 25 (bol) % 10 SDS: % 1 (bol) H2O: bolumena bete arte % 10 (p/b) persulfato amonikoa: 25 µl TEMED: 5 µl 1.3.16 Elektroforesi-indargetzailea - 10X

250 mM Trizma-Base % 1 (p/b) SDS 2 M Glizina H2O-a bolumena bete arte pH 8,3 doitua atera behar da, ez ukitu Erabiltzeko, H2O-arekin10 aldiz diluitu behar da. 1.3.17 Transferentzia-indargetzailea - 10X

250 mM Trizma-Base % 0,25 (p/b) SDS 1,92 M Glizina H2O-a bolumena bete arte pH 8,3 doitua atera behar da, ez ukitu Erabiltzeko, H2O-arekin 10 aldiz diluitu behar da. Diluitzean, % 20 (b/b) metanol gehitu behar zaio. 1.3.18 Ponceau gorria

% 1 (p/b) Ponceau gorria % 5 (b/b) Azido azetiko glazial H2O-a bolumena bete arte

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak

Doktore-tesia

55

1.3.19 Tris/gatz-indargetzailea (Tris buffered saline; TBS)

50 mM Tris-HCl pH 7,5 150 mM NaCl H2O-a bolumena bete arte 1.3.20 Blotto soluzioa

TBS % 0,1 Triton X-100 1.3.21 Blokeo soluzioa

Blotto % 5 esne gaingabetua 1.3.22 Luminola (250 mM)

10 ml DMSO 0,44 g luminol 1.3.23 Azido p-kumarikoa (90 mM)

10 ml DMSO 0,15 g azido p-kumariko 1.3.24 Kimioluminiszentzia-areagotzailea (Enhanced chemiluminesence; ECL)

1,25 mM luminol 0,2 mM azido p-kumariko 0,1 M Tris-HCl pH: 8.5 H2O-a bolumena bete arte Nahastura hori 4 ºC-an eta iluntasunean gordetzen da erabilia izan arte. Erabiltze-egunean, iluntasunean gordeta dugun nahasturara % 0,3 (b/b) H2O2 (%30) gehitu behar zaio. 1.3.25 Tris/azetato indargetazailea + EDTA (TAE)

0,4 M Tris-Base % 5,7 (b/b) Azido azetiko glazial 10 mM EDTA pH 8 1.3.26 Agarosa-gela

% 2 agarosa 100 ml TAE (DEPC) Irakiten jarri (1-2 min) % 1 etidio bromuro Gel-euskarrira bota, eta orraziak jarri polimerizatu arte (20 min)

Materialak eta metodoak 57

2. METODOAK

2.1 Laginak lortzea

Giza haziaren laginak Euskalduna-Bilbao Klinikan jasotzen ziren, Euskalduna-Bilbao

Klinikaren Hazi-bankuko Laborategiak eta Lagunduriko Ugalketa Unitateak eta Euskal

Herriko Unibertsitateak (UPV/EHU) xedatu zuten hitzarmenari esker. Emaile guztiak

(25-40 urte bitartekoak) osasuntsuak eta, Osasunerako Munduko Erakundearen (OME)

irizpideen arabera (OMS, 1999), normozoospermikoak ziren. Emaileak ez ziren opio

edota kannabinoideen ohiko erabiltzaileak. Ikerketa, lagin biologikoen eta giza laginen

erabilera dela eta, UPV/EHUren eta Osakidetzaren Ikerkuntza Klinikoaren Batzorde

Etikoaren oniritziaz egin zen. Hazi-laginak masturbazio bidez lortzen ziren 2 edo 3

eguneko abstinentzia eta gero. Ontzi esteriletan isurtzen ziren eta gutxienez 30

minutuan 37 ºC-an mantentzen ziren hazia likidotu arte. Lagin bakoitza prozesatzen hasi

baino lehen, hazi-bolumena zein espermatozoideen kontzentrazioa eta mugikortasuna

neurtzen ziren.

2.2 Espermatozoideak prestatzea

Swim-up

Espermatozoide ez-mugikorrak eta hazian egon zitezkeen bestelako zelulak kentzeko,

swim-up deritzon teknika aplikatu zitzaien hazi-lagin guztiei (1.A irudia). Klinikatik

jasotako hazi berria Eppendorf saio-hodi batzuetan banatzen zen (250 µl eppendorf-

eko). Haren gainean, Tyrode-BSA eraldatu ez-kapazitantearen (TBEK) (Flesch, 1999)

500-600 µl emeki gehitu eta 2 fase eratzen ziren. Espermatozoide mugikorrenak hazitik

TBEKra mugi zitezen, eppendorf saio-hodiak 60 minutuz 37 ºC-an mantentzen ziren,

eta, denbora horren ostean, eppendorf saio-hodi bakoitzaren goiko geruzako (TBEK +

espermatozoide mugikorrenak) zati gehiena berreskuratzen zen, eta espermatozoide-

kontzentrazioa neurtzen zen fase-kontraste bidezko mikroskopioan. Eppendorf saio-

hodi guztietatik berreskuratutako goiko geruzak 15 ml-ko zentrifuga-saio-hodietan

batzen ziren eta 800 g-an zentrifugatzen ziren 10 minutuz. Hauspeakinean agertutako

espermatozoide mugikorrak ondoren azalduko diren prozeduretan erabiltzen ziren.

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak 58

Azkenik, espermatozoide ez zen bestelako zelularik ez zegoela baieztatzeko, lagin

guztiak fase-kontraste bidezko mikroskopioan aztertzen ziren (1.B irudia).

A B

Hazi berria (250 µl)

TBEK gehitu(500-600 µl)

Goiko geruza kendu(espermatozoide

mugikorrak)

TBEK kendu

Swim-up60 min 37 ºC

Goiko geruza(k)zentrifugatu

(800 g / 10 min)

WBIZKRT-PCR

Mugikortasuna

1. irudia: Espermatozoideen prestaketa. A) Espermatozoide mugikorrenak berrezkuratzeko Swim-up teknikaren pausuak. TBEK: Tyrode eraldatu ez-kapazitantea WB: western-blot, IZK: immunozitokimika, RT-PCR: Real-Time Polymerase Chain Reaction. B) Espermatozoide-laginaren purutasunaren azterketa fase-kontraste bidezko mikroskopiopean. Argazkian, espermatozoide ez den bestelako zelularik ez da ikusten.

2.3 Hartzaileen espresio genikoa

2.3.1 RNA: erauztea, kalitatea behatzea eta kontzentrazioa neurtzea

a) RNA erauztea

Swim-up teknikaren bidez isolatutako giza espermatozoide, garun-kortex eta Jurkat

zelulak TRIZOL® erreaktiboarekin lisatzen ziren. Ehunak mililitro bat TRIZOL®-ean

eta enbolo txiki batekin homogeneizatzen ziren, eta espermatozoide-zelulak zuzenean

pipetarekin homogeneizatzen ziren. Homogeneizatu horren gainean, kloroformoa

gehitzen zitzaion (0,2 ml kloroformo : 1 ml TRIZOL®) eta 2-3 minutuan giro-

tenperaturan nahasten zen. Zentrifugazioaz (10.000 g / 10 min / 4 ºC) faseak eratzen

ziren; goiko fase gardena RNA zen; interfasea zuria DNA zen; beheko fase arrosa

TRIZOL®-a zen.

Fase gardena berreskuratzen zen (guztia ez, ziurtatzeko hurrengo faseko DNA hartzen

ez zela) eta isopropanola (1:1) gehitu eta nahasten zen. 10 minutuan giro tenperaturan

mantendu eta gero, zentrifugatu egiten zen (10.000 g / 10 min / 4 ºC). Gainjalkineko

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak 59

isopropanola kentzen zitzaion hauspeakina hartu gabe eta hauspeakin horren gainean

500 µl etanol (% 70) gehitu eta nahasten ziren. Hurrengo zentrifugazio baten ondoren

(10.000 g / 5 min / 4 ºC), etanol guztia kentzen zen hauspeakin gardena kendu gabe

(etanol guztia ondo kentzeko, 2-3 minutuan berogailu batean lehortzen zen). Azkenik,

lortutako hauspeakina urarekin (10-50 µl-rekin, lagin kantitatearen arabera)

homogeneizatzen zen.

DNA genomikoaren kutsadura ekidin nahi zenean, DNasa digestio-pausoa zeukan

RNeasy Protect Kit (Quiagen) erabili zen fabrikatzailearen argibideak jarraituz.

Hartzaile bakoitzaren azterketa egiteko, batez beste 5 espermatozoide-laginen mRNA

erabili zen.

b) RNAren kalitatea behatzea

Erauzitako RNAren kalitatea neurtzeko, RNA % 1,5-2 agarosa-gel batean korriarazten

zen. Lagineko RNA kalitatekoa izateko, gelean korriaraztean, 28S eta 18S RNA

erribosomikoen banda diskretuak eta 2:1 proportzioan agertzea gomendatzen zen. Hala

ere, garun-kortex eta Jurkat zelulek baldintza hori bete arren, espermatozoideek 28S eta

18S RNA erribosomikoak galtzen dituzte (2.A irudia) eta, beraz, DNA genomikoaren

interferentziarik egongo ez zela ziurtatzeko, RNA-ren erauzketan DNAsa digestio-

pauso bat egin edota PCRan, exoi desberdinetan kokaturiko primer-ak erabili ziren.

c) RNA-ren kontzentrazioa espektrofotometro bidez neurtzea

Ur puruarekin, lortutako RNAren 1/20 diluzioa egin eta, 200-350 nm artean, espektro-

ekorketa egiten zen. Espektrofotometroak ohiko kurba sortu behar zuen (2.B irudia).

Kurba horretan, 280 nm-an (proteina) eta 260 nm-an (RNA) absorbantzia-puntu

maximoak agertzen ziren. Teorikoki, laginaren purifikazioa ontzat emateko, RNA-

puntuaren absorbantziak proteina-puntaren bikoitza izan behar zuen. RNArentzat,

absorbantzia unitate bat 40 µg/ml direla jakinda, RNA kantitatea (µg/ml) kalkulatzeko,

[absorbantzia x diluzio-faktorea x konbertsioa] aplikatzen zen.

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak 60

SpKx / Jr PMPM

A B

2. irudia: A) Erauzitako RNAren kalitatearen behaketa. PM: nukleotidoen pisu molekularreko standarra; Kx: garun-kortexa; Jr: Jurkat; Sp: espermatozoideak. B) Erauzitako RNA-ren absorbantzia-kurba espektrofotometroaren bidez neurtua. 260 nm-an absorbantzia-puntu maximoa agertzen da; RNAri dagokiona alegia.

2.3.2. RT-PCR

a) Oinarria

DNA zati zehatz baten kopia kopuru handia lortzeko, polimerasaren kate-erreakzioa

(Polymerase Chain Reaction; PCR) erabiltzen da, oligonukleotido espezifikoak (primer-

ak) erabiliz. Baina RNA mezularien (mRNA) azterketa egin nahi bada, lehenik eta

behin, DNA osagarria (cDNA) eratu behar da alderantzizko transkriptasa baten bidez.

Prozesu horri alderantzizko transkripzioa (Retro-Transcription; RT) deritzo. Beraz,

lagin bateko mRNA guztien cDNA eratu eta gero, anplifikatu nahi den genearen

sekuentzia-tartea mugatuko duten 2 primer-ak erabiliz, PCRa egingo da. Hori dela eta,

teknika osoari RT-PCR deritzo.

b) Protokoloa

b.1 Alderantzizko transkripzioa (RT)

0,2 ml-ko Eppendorf saio-hodi batean nahasten ziren 1 µg RNA total, 2 µl azarezko

hexamero eta ur purua (RNasa-rik gabe) 13 µl arte. Azarezko hexameroak RNAra

lotzeko, nahasketa 10 minutuan 65 ºC-an berotzen zen, eta, horren ostean, izotzean

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak 61

uzten zen minutu batean (RNAren egitura sekundarioak desegiteko). Zentrifuga-pultsu

batekin lagina berreskuratzen zen, eta 4 µl Transcriptor RT erreakzio-indargetzaile (8

mM MgCl2), 0,5 µl RNasa inhibitzaile (20 U), 1 µl dNTP (deoxirribonukleotido

trifosfato) (0,5 mM bakoitzeko) eta 0,35-0,5 µl (7-10 U) alderantzizko transkriptasa

(Transcriptor RT) gehitzen zitzaizkion. Bortex-az ondo nahastu eta gero, zentrifuga-

pultsu batekin lagina berreskuratzen zen. Alderantzizko transkripzioa egiteko, lagina 10

minutuan 25 ºC-an, 60 minutuan 55 ºC-an (cDNA eratzeko), 5 minutuan 85 ºC-an (RT

inhibitzeko) eta, azkenean, izotzean mantentzen zen. Lortutako cDNA -20 ºC-an gorde

zen erabilia izan arte. (3.A irudia).

B A

+ primers+ dNTP+ GoTaq

5´ 3´

(f)(r)

5´ 3´

5´ 3´

3´ 5´

5´ 3´

3´ 5´

5´ 3´

3´ 5´

5´

11

22

33

22

33

11

cDNA

2211

33

5´ 3´

3´ 5´

2ziklo = kopiak

Ziklo 1 = 2 kopia

Ziklo 2 = 4 kopia

5´ 3´mRNA

hexameroak

+ dNTP+ RT

mRNA

cDNA

5´ 3´3´ 5´

cDNA

3. irudia: RT-PCR. A) Alderantzizko transkripzioaren eskema. Azarezko hexameroak mRNAra lotzen dira eta RT-ak dNTP-ak gehitzen joango da cDNA eratuz. B) Polimerasaren kate erreakzioaren eskema. Desnaturalizazioa, hibridazioa (anneling), primer espezifikoak, cDNA-ren tarte konkretuetan lotuko dira, katearen hedapena GoTaq DNA polimerasaren bidez. Inkubazio denborak eta tenperaturak testuan azaltzen dira. RT: Retrotranskriptasa, dNTP: deoxirribonukleotido trifosfato, cDNA: DNA osagarria.

b.2 Polimerasaren kate-erreakzioa (PCR )

PCRa egiteko 0,2 ml-ko Eppendorf saio-hodiak erabiltzen ziren. Lagin bakoitzeko,

erreakzio-nahastura berdina sortzen zen aurrera (forward; f) eta atzerako (reverse; r)

primer-ak (1.taula) izan ezik:

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak 62

1 µl cDNA (< 0,5 µg)

10 µl GoTaq® polimerasa erreakzio-indargetzailea (1,5 mM MgCl2)

1 µl dNTP (0,2 mM bakoitzeko)

2,5 µl aurrerako primer-a (1 µM) (X. Taula)

2,5 µl atzerako primer-a (1 µM) (X. Taula)

0,25 µl GoTaq® polimerasa (1,25 U)

50 µl arte, ura

1. taula. RT-PCR bidez egindako mRNAren analisian erabilitako primer-ak. hDOR: giza δ opioide-hartzailea; hKOR: giza κ opioide-hartzailea; hMOR: giza µ opioide-hartzailea; hCB1: giza CB1 kannabinoide-hartzailea; hCB2: giza CB2 kannabinoide-hartzailea; GAPDH: Glizeraldeido 3-fosfato deshidrogenasa.

Genea Sekuentzia (5´- 3´) Anplikoia (bp) Erreferentzia

hDOR (f) ACGTGCTTGTCATGTTCGGCATCGT (r) ATGGTGAGCGTGAAGATGCTGGTGA 222 Börner eta lank., 2004

hKOR (f) AGATACACAAAGATGAAGACAGCAACCAAC (r) TCCCTGACTTTGGTGCCTCCAAGGACTATT 352 Neudeck eta lank., 2003

hMOR (f) GCAGATGCCTTAGCCACCAGTA (r) GAGGCGCAAGATCATCAGTCCATA 440 Kraus eta lank., 2003

hCB1 (f) CGTGGGCAGCCTGTTCCTCA (r) CATGCGGGCTTGGTCTGG 408 Carracedo eta lank., 2006a

hCB2 (f) CGCCGGAAGCCCTCATACC (r) CCTCATTCGGGCCATTCCTG 522 Carracedo eta lank., 2006a

GAPDH (f) GGGAAGCTCACTGGCATGGCCTTCC (r) CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC 322 Carracedo eta lank., 2006a

Nahastura prest zegoenean, lagin bakoitza termozikladorean sartzen zen, eta, PCRa

gauzatzeko, denbora-tarte, tenperatura eta ziklo egokiak ezartzen ziren (2.taula). Hasiera

batean, lagina (cDNA) desnaturalizatu behar zen . Gero, primer-ak eta DNA

polimerasa cDNAra lotzeko, tenperatura jaisten zen (tenperatura hori enpirikoki

topatu behar zen) eta, behin hibridazioa emanda, tenperatuta igotzen zen DNA

polimerasak lan egin ahal izateko . Prozesu hori behin eta berriz errepikatuz,

cDNAren tarte espezifikoaren anplifikazio esponentziala gertatzen zen (3.B irudia).

Anplifikatutako laginak nukleotidoentzako karga-indargetzailearekin nahasten ziren, eta

etidio bromurodun agarosa-geleko kaleetan kargatzen ziren. Geleko kale batean,

nukleotidoen pisu molekularreko estandarra kargatzen zen. Gela, 15 V-eko

korrontearekin korriarazten zen, eta argi ultramorearen pean argazkia ateratzen zen.

Bukatzeko, argazkiaz baliatuz, lagin bakoitzean lortutako anplikoiak (anplifikatutako

zatia) sortzen zuen banda pisu molekularreko estandarrarekin alderatzen zen. Espero

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak 63

ziren base pareak lortzen baziren, lagin horretan hartzailearen mRNAren presentzia

ondorioztatzen zen.

2. taula. PCRaren ezaugarriak.

Prozesua Denbora Tenperatuta Ziklo zk. Hasierako desnaturalizazioa 2´ 95 ºC 1

Desnaturalizazioa 30´´ 95 ºC Hibridazioa (anneling) 30´´ 58 ºC Katearen hedapena 1´ 72 ºC

40

Azken hedapena 5´ 72 ºC 1 Mantenua - 4 ºC 1

2.4 Hartzaileen proteinen presentzia

2.4.1 Espermatozoideen mintzak prestatzea

Swim-up teknikatik eratorritako espermatozoideei lisi-indargetzailea gehitzen zitzaien,

eta, ordu batean kulunkatu ondoren, izotzean lisatzen ziren. Denbora hori igarota, %

40ko anplitudera sonikatzen ziren (0,5 segundoko 10 ziklo) eta lortutako

homogeneizatuak 600 g-ra zentrifugatzen ziren, 10 minutuan eta 4 ºC-an. Lortutako

hauspeakina (apurtu ez ziren zelulak eta nukleoak) kendu eta gainjalkina 100.000 g-an

ultrazentrifugatzen zen, 45 minutuan eta 4 ºC-an. Azkeneko zentrifugaziotik

eratorritako hauspeakina (mintz zelularrak), immunoblota egiteko, -80 ºC-ra gordetzen

zen (4. irudia).

Lisi-bufferragehitu

Kulunka60 min / 4 ºC

Zentrifugatu600 g / 10 min / 4 ºC

Ultrazentrifugatu100000 g / 45 min / 4 ºC

Mintzzelularr

Gainjalkinaak

Sonikatu

4. irudia: Espermatozoideen mintzen prestaketaren eskema pausoz pauso.

Hartzaile bakoitzaren azterketa egiteko, batez beste 5 espermatozoide-laginen proteinak

erabili ziren.

2.4.2 Garun-kortexeko zelulen eta Jurkat zelulen mintzak prestatzea

Giza garunaren kortex prefrontalaren materia grisa homogeneizazio-soluzio

indargetzailean homogeneizatu zen tefloizko enboloa zuen homogeneizagailu mekaniko

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak 64

baten bidez, minutuko 800 birako abiaduran, gutxienez minutu batean eta 4 ºC-an.

Jurkat zelulek prozesamendu berdina jasan zuten. Homogeneizatuak 1.500 g-an

zentrifugatu ziren, 5 minutuan eta 4 ºC-an. Lortutako hauspeakina (apurtu ez ziren

zelulak eta nukleoak) kendu eta gainjalkina 100.000 g-ra ultrazentrifugatu zen, 35

minutuan eta 4ºC-an (5. irudia). Azkeneko zentrifugaziotik eratorritako hauspeakinaren

(mintz zelularrak) proteina-kontzentrazioa neurtzeko, homogeneizazio-soluzio

indargetzailean berreseki zen.

Zentrifugatu1500 g / 10 min / 4 ºC

5. irudia: Garunaren kortexaren eta Jurkat zelulen mintzen prestaketaren eskema pausoz pauso.

Jurkat hilezkor bilakatu diren T linfozitoen lerro zelularra da. 1976an odol

periferikoaren T leuzemia pairatzen zuen 14 urteko mutiko baten odoletik eratortzen

dira (Schneider, 1977). Giza garunaren kortex prefrontalaren materia grisa zein Jurkat

zelulak, Guillermo Velasco doktorearen (UCM) eta Leyre Urigüen doktorearen

(UPV/EHU) adeitasunez lortu ziren.

2.4.3 Proteinen kontzentrazioa neurtzea (Bradford metodoa)

a) Oinarria

Laginetan dagoen proteina-kontzentrazioa kalkulatzeko metodoa Coomasie urdin

distiratsuak polipeptidoekiko duen afinitatean oinarritzen da (Bradford, 1976). Teknika

kolorimetrikoa da, hau da, zenbait konposatu kimikok argia xurgatzeko duten

gaitasunean oinarritzen da. Koloratzailea proteinetara lotzean, gai kimiko horren

xurgapenaren uhin-luzeran aldaketa sortzen da: 465 nm-tik 595 nm-ra pasatzen da.

Koloratzailea asetzailea denez, xurgapenaren gehikuntza proteina-kontzentrazioarekiko

zuzenki proportzionala da. Hala, xurgapenaren gehikuntza espektrofotometroan neurtuz,

proteina kantitate ezagunekin egindako xurgapen patroi-zuzen batean interpola daiteke.

Ultrazentrifugatu100000 g / 35 min / 4 ºC

Homogeneizatu800 rpm / 1 min / 4 ºC

Mintzzelularrak

GainjalkinaHomogeneizazio-bufferra gehitu

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak 65

b) Protokoloa

Patroi-zuzena egiteko, 10 mM Tris-HCl + BSA (1 mg/ml) soluzioaren bolumen batzuk

(0 µl-tik, 25 µl-ra) eta 2,5 ml Bradford erreaktiboa nahastu eta 10 minutuan inkubatzen

genituen. Xurgapenaren uhin-luzera kontrolatzen duen monokromadorea 595 nm-an

finkatuz, hodi bakoitzaren edukiaren absorbantzia neurtzen zen. Ikusi behar genuen

lortutako absorbantzia-emaitzak kontzentrazioarekiko proportzionaltasun zuzena

azaltzen duen Y = aX + b funtzio zuzenera doitzen zirela. Beraz, behin eskala eginda,

esperimentuetarako erabiliko ziren lagin bakoitzaren 10 µl, 2,5 ml Bradford

erreaktiborekin inkubatzen ziren 10 minutuan (3 erreplika) eta espektrofotometroan

neurtzen ziren 595 nm-an. Lagin bakoitzaren proteina-kontzentrazioa jakiteko,

absorbantziaren balioak patroi-zuzenean interpolatzen genituen.

2.4.4 Western Blot (WB): Elektroforesia (SDS-PAGE), transferentzia eta

immunodetekzioa

a) Oinarria

Elektroforesia proteinen nahasketa konplexuak banatzeko erabili ohi da, gero proteinak

identifikatzeko edo purifikatzeko helburuarekin. SDSren presentzian egindako

dimentsio bateko poliakrilamidazko gel elektroforesian (SDS-PAGE), proteinak, eremu

elektriko bati esker, geleko poroetan zehar barreiatzen dira. Akrilamida-kontzentrazioa

handitzean, poroen tamaina txikituko da. Beraz, gelaren poroen tamainak eta

proteinaren karga, neurri eta itxurek proteinen migrazio-abiadura mugatuko dute.

Gelean korriarazitako proteinak nitrozelulosa, nylon edo PVDF (Polyvinylidene

difluoride) mintz baten azalari itsasteari deritzo transferentzia. Prozesu hori

elektroforesiz egiten da, eta, behin prozesua bukatua, proteinen tindaketa itzulgarria

egiteko aukera dago.

Immunodetekzioa antigorputz monoklonal edo poliklonal bidez antigeno espezifikoa

ezagutzeko erabiltzen da. Kasu honetan, bilatzen dugun proteina espezifikoa bilatzeko

erabiliko da.

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak 66

b) Protokoloa

b.1 Elektroforesia

Gela prestatzea

Bi kristal-laukirekin 0,75 mm-ko tarteko sandwicha sortu eta beheko aldea ixten zen.

Kristalek sortutako tartean, gelaren zati banatzailea (beheko partean) eta

kontzentratzailea (goiko partean) sortzen ziren:

Gel banatzailea: proteinak negatiboki kargatu (SDSagatik) eta desnaturalizatzen

zirenez (SDS, β-merkaptoetanol eta beroagatik), pisu molekularraren arabera soilik

banatuko ziren. Akrilamidaren portzentajea aztertu nahi genuen proteinaren pisu

molekularraren arabera erabaki zen. Gure proteinak, teorikoki, 40 kDa-etik 100 kDa-era

agertzeko aukera zegoenez, taula teoriko batez baliatuz (6.A irudia), % 12-ko

bereizmena zuten gelak egitea erabaki zen. Beste portzentajeko gelak egin nahi izanez

gero, erabakitako portzentajearen arabera aldatzen ziren akrilamida eta ur kantitatea

(materialak eta metodoak 1.3.14 atala).

Erlenmeyer batean, gel banatzailea eratzeko konposatu guztiak gehitzen ziren (amonio

persulfatoa eta TEMED azkenean) eta lasai nahasten ziren. Pipeta batez, nahasketa

kristalen artean sartzen zen (~7 cm) eta, gela zuzen geratzeko, nahasketaren gainean

isopropanola gehitzen zen (~0,5 cm). Gela polimerizatzen zenean (10-20 min), goiko

partetik isopropanola ondo kentzen zitzaion.

Gel kontzentratzailea: proteinak gel banatzailera igaro baino lehen

lerrokatu/kontzentratu behar ziren gel kontzentratzailean. Gel hori eratzeko, akrilamida-

portzentajea beti % 4 izan zen (materialak eta metodoak 1.3.15 atala).

Gel banatzailea bezala eratzen zen (osagai desberdin bakarra Tris-HCl pH 6,8 zen).

Pipeta batekin, eratutako nahasketa gel banatzaile polimerizatuaren gainean botatzen

zen kristalen tartea goraino bete arte eta orrazia jartzen zitzaion kaleak era zitezen. Gela

polimerizatzen zenean (10-20 min), orrazia kendu eta elektroforesi-indargetzaileaz

beteriko elektroforesi-euskarrian jartzen zen.

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak 67

Laginak prestatzea, kargatzea eta gel-korriaraztea

Zentrifugazio bidez lortutako mintz zelularren hauspeakina (espermatozoideetan) edo

homogeneizatua (garun-kortexeko zeluletan eta Jurkat zeluletan), proteinentzako karga-

indargetzailearekin berreseki edo diluitzen zen eta 3-5 minutuan irakiten jartzen zen

(100 ºC). Gelaren kale bakoitzeko ~500x106 zelula/ml espermatozoide eta, garun-

kortexeko zelulen edo Jurkat zelulen 30 µg proteina kargatzen ziren % 12ko

bereizmenarekin eratutako gelean. Kale batean pisu molekular ezaguneko proteinak

kargatzen ziren. Proteinak 100 V-ean korriarazten ziren kontzentrazio-gela zeharkatu

arte eta, hortik aurrera, korrontea 200 V-ean eramaten zen bromofenol urdina gelaren

bukaeraraino heldu arte.

Kuxinak

Whatmanpaperak

GelPVDF

+

-

A B

6. irudia: A) Poliakrilamidazko Tris-HCl/Glizina/SDS buffer gelen bereizmen portzentajeen hautaketarako taula teorikoa. Proteinen bandak, pisu molekularraren (KDa) arabera kokatzen dira. B) Transferentzia sandwich-eko muntaiaren ordena, polo negatibotik polo positibora.

b.2 Transferentzia-metodo hezea

Sandwicharen muntaia

Transferentzia-sandwich-aren muntaiaren ordena, polo negatibotik polo positibora, hau

izan zen: kuxina, Whatman paperak (x3), gela (zati kontzentratzailerik gabe),

transferentzia-mintza (PVDF), Whatman paperak (x3) eta kuxina (6.B irudia).

Burbuilak kentzeko, azkeneko Whatman paperen gainetik zilindro bat pasatzen zen.

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak 68

Gela, Whatman paperak, PVDFa eta kuxinak, transferentzia-indargetzailean

egonkortzen ziren (5-10 min).

Geletik mintzerainoko transferentzia

Transferentzia-sandwich-a itxi eta transferentzia-cassette-an orientazio egokian jarri

ostean (gela anodoari eta PVDFa katodoari begira), cassette-a transferentzia-

indargetzailez beteriko transferentzia-euskarrian sartzen zen eta proteinak 100 V-ean

transferitzen ziren 1,5 orduan.

Mintza tindatzea (itzulgarria)

Transferentzia ondo gertatu zela baieztatzeko, PVDFa Ponceau gorrian murgiltzen zen

5 minutuan eta, gero, urarekin hainbat garbiketa egiten zen. Horren ostean, PVDFa

Blotto soluzioan egonkortzen zen.

b.3 Immunodetekzioa

Lotura ez-espezifikoak ekiditeko, PVDFa blokeo-soluzioan ordu batean murgiltzen zen

giro-tenperaturan. Garbiketa arin baten ostean, gizakientzako untxi-antigorputz

poliklonal primario espezifikoekin inkubatzen zen gau osoan 4 ºC-an (3. taula).

3. taula. Western blot eta immunozitokimikan erabilitako antigorputzak. hDOR: giza δ opioide-hartzailea; hKOR: giza κ opioide-hartzailea; hMOR: giza µ opioide-hartzailea; hCB1: giza CB1 kannabinoide-hartzailea; hCB2: giza CB2 kannabinoide-hartzailea.

ANTIGENOA OSTALARIA DILUZIOA (WB)

DILUZIOA(IZK)

ETXE KOMERTZIALA

hDOR Untxia 1/2500 1/800 Chemicon hKOR Untxia 1/300 1/50 Santa Cruz hMOR Untxia 1/2500 1/800 Chemicon hCB1 Untxia 1/250 1/400 Affinity BioReagents hCB2 Untxia 1/200 1/400 Cayman

Anti-Rabbit IgG : HRP Astoa 1/2500 - Affinity BioReagents

Anti-Rabbit IgG : Alexa Fluor 488 Ahuntza - 1/500 Molecular Probes

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak 69

Horren ostean, garbiketak egiten ziren Blotto soluzioarekin (3x5 min) eta

peroxidasarekin konjugatutako untxiaren IgG-aren kontrako asto-antigorputz

sekundarioarekin inkubatzen zen ordu batean giro-tenperaturan. Blotto soluzioarekin

PVDFaren azkeneko garbiketak egin ondoren (3x5 min), PVDFa ECLan murgiltzen zen

minutu batean. PVDFa azetato-paperen tartean sartu eta argazki-filma gainean jartzen

zen (1-5 min). Azkenik, bandak ikusarazteko, filma errebelatzen zen. Bukatzeko,

argazkiaz baliatuz, kale bakoitzean lortutako banda pisu molekularreko estandarrarekin

alderatzen zen. Hartzaile bakoitzerako espero ziren kDa-ak lortzen baziren, lagin

horretarako hartzailearen presentzia ondorioztatzen zen.

b.4 Stripping-a

PVDFtik antigorputzak erauzteko eta mintza berrerabiltzeko, stripping deituriko teknika

erabili zen. PVDFa, guanidina-tiozianatoan (6 M) 5-10 segundoan murgiltzen zen

(PVDFa gardendu arte) eta, Blotto soluzioarekin garbiketak egin eta gero (3x5 min),

PVDFa berrerabili egiten zen beste immunodetekzio baterako.

2.5 Hartzaileen proteinak kokatzea

2.5.1 Immunozitokimika (IZK)

a) Oinarria

Immunozitokimika zeluletan dauden antigeno jakinak lokalizatzeko erabiltzen da.

Immunodetekzio ez-zuzena antigorputz primario espezifikoa gehi antigorputz

sekundario markatua erabiliz egiten da. Antigorputzen marka fluorogenikoa bada,

antigeno espezifikoak fluoreszentzia-mikroskopio bidez detektatu eta lokalizatuko dira.

b) Protokoloa

Immunofluoreszentzia bidez hartzaile bakoitzaren kokalekua zehazteko, swim-up

teknikarekin isolatutako espermatozoideak PBSan esekitzen ziren. Mikroskopio-estalki

baten gainean, Poly-L-lisina jartzen zen, espermatozoideak euskarri horretan itsas

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak 70

zitezen. Zelulak finkatzeko, paraformaldehido % 3-rekin (10 min) eta metanol

hotzarekin (10 min) erabili zen. Estalkiak PBSarekin garbitzen ziren (3x5 min) pauso

bakoitzaren bukaeran. Finkatze-prozesua amaituta, espermatozoideak PBS + % 10

(bol/bol) behi-umekiaren serumarekin blokeatzen ziren 20 minutuan.

Tindaketa immunofluoreszente ez-zuzena egiteko, espermatozoideak untxi-antigorputz

poliklonal primario espezifiko bakoitzarekin inkubatzen ziren gau osoan 4 ºC-an

(3.taula). Horren ostean, PBSarekin garbitzen zen (3x5 min) eta konposatu

fluorogenikoz konjugatutako untxiaren IgG-en kontrako ahuntz-antigorputz

sekundarioarekin inkubatzen zen (3. taula) iluntasunean, bi orduan eta giro-

tenperaturan. Estalkien azkeneko garbiketa egin ondoren (3x5 min), Fluoromont G-

rekin muntatu ziren porta baten gainean. Espermatozoideak mikroskopio fokukidearen

bidez aztertu ziren argon ioi bidezko laserrarekin 488 nm-an (urdina) kitzikatuz eta 505-

520 nm-an (berde) jasoz (7. irudia).

7. irudia: Immunozitokimikako esperimentuaren eskema pausoz pauso. Estalkiek 12 mm-ko diametroa dute eta inkubaketak egiteko, hazkuntza zelularrerako erabiltzen diren 24 putzuko plakak erabiltzen dira; irudian 24 putzutik bat irudikatzen da. Azalpen zabaldua testuan.

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak 71

Espermatozoideen nukleoak markatu nahi zirenean, azkenaurreko garbiketan Hoestch

33342 koloratzailea (3 µM) erabiltzen zen. Argon ioi bidezko laserrarekin 405 nm-an

(UV) kitzikatuz, 440 nm-an (urdina) jasotzen zen, baina, kasu honetan, modu

sekuentzialean, Alexa-488 eta Hoestch 33342-ren seinaleak nahas ez zitezen.

Antigorputz primarioarekin egindako inkubaketa kenduta, kontrol negatiboak modu

berdinean egin ziren.

Hartzaile bakoitzaren azterketa egiteko, batez beste 3 espermatozoide-lagin erabili

ziren.

2.6 Espermatozoideen behaketa fisiologikoa

2.6.1 Espermatozoideen inkubaketa-ingurunea

a) Opioideekin egindako inkubaketak

Swim-up bidez berreskuratutako espermatozoideak TEK ingurunearekin berreseki ziren

~30x106 zelula/ml kontzentraziora. Inkubaketa-ingurunea TEKa izan zen, eta bertara

konposatu opioideak gehitzen ziren: µ-agonista morfina eta antagonista naloxona; δ-

agonista DPDPE eta antagonista naltrindola; κ-agonista U-50488 eta antagonista nor-

binaltorfimina. Konposatu horien stock-a TEKean egin zen.

Eppendorf saio-hodi batzuetan 180 µl TEK + espermatozoide jartzen ziren eta,

amaierako bolumena 200 µl izateko, TEKa + opioide konposatua 10 aldiz

kontzentratuagoa zeukan stock-etik 20 µl gehitzen ziren. Kontrol orokorra egiteko,

eppendorf saio-hodi batean opioiderik gabeko 20 µl TEK gehitzen ziren. Opioide-

hartzaile bakoitzaren aktibazioa agonista espezifikoaren kontzentrazio desberdinak

erabilita aztertzen zen; 10-5, 10-6 eta 10-7 M. Antagonismoa aztertzeko, laginak

antagonista espezifikoarekin preinkubatzen ziren 30 minutuan eta, gero, agonista

gehitzen zitzaien. Antagonistaren kontzentrazioa agonistarena baino hamar aldiz

handiagoa izan zen kasu bakoitzean (kasu honetan, eppendorf saio-hodi batera 160 µl

TEK + 20 µl antagonista + 20 µl agonista botatzen ziren). Azkenik, antagonista

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak 72

espezifikoaren dosi altuenak (10-4M) espermatozoideetan efekturen bat sorrarazten ote

zuen ikusteko, kontrol bat egin zen antagonista bakoitzerako (8. irudia).

TEKan berreseki30x106 sp / ml

180 µlAgonista (10X)

TEK

20 µl

20 µl

Antagonista (10X)

160 µl

180 µl

180 µl

20 µl

20 µl20 µl

Agonista (1X) Antagonista (1X) + 30 min

+ agonista (1X)

Antagonista (1X) Kontrola

8. irudia: Espermatozoideak agonista eta antagonista opioideekin inkubatzeko diseinu esperimentala.

b) Kannabinoideekin egindako inkubaketak

Swim-up bidez berreskuratutako espermatozoideak TEK ingurunearekin berreseki ziren

~60x106 zelula/ml kontzentraziora. Inkubaketa-ingurunea TEKa izan zen, eta bertara

konposatu kannabinoideak gehitu ziren: CB1-agonista ACEA eta antagonista SR

141716a; CB2-agonista JWH-015 eta antagonista SR144528. Konposatu horien stock-a

etanol eta DMSOan egin zen.

Eppendorf saio-hodi batzuetan TEK 80 µl + kannabinoide konposatua 10 aldiz

kontzentratuagoa zeukan stock-etik 20 µl gehitzen ziren eta vortex-arekin ondo

irabiatzen ziren. Kasu honetan, 2 kontrol orokor egiten ziren; alde batetik, eppendorf

saio-hodi batean kannabinoiderik gabeko 20 µl TEK gehitzen ziren; bestetik, 20 µl

kannabinoide disolbatzaile huts (etanol edo DMSO) gehitzen ziren. Bolumen finala 200

µl izateko, aurretik lortutako 100 µl-etara, TEKean berresekitutako 100 µl

espermatozoide gehitzen ziren. Kannabinoide-hartzaile bakoitzaren aktibazioa agonista

espezifikoaren kontzentrazio desberdinak erabilita aztertzen zen; 10-5, 10-6 eta 10-7 M.

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak 73

Kasu honetan, laginak ez ziren antagonista espezifikoarekin pre-inkubatu, zeren eta,

kannabinoideak lipidoak izanik, irabiaketa bortitza behar baitute ingurunean

homogeneoki zabaltzeko. Beraz, behin espermatozoideak ingurunean zeudela, ezin zen

irabiaketa bortitz hori egin. Beraz, antagonismoa aztertzeko, antagonistaren eta

agonistaren kontzentrazio ekimolekularrak batera nahastu ziren kasu bakoitzerako (kasu

honetan, eppendorf saio-hodi batera 60 µl TEK + 20 µl agonista + 20 µl antagonista

botatzen ziren eta, kontrol espezifikorako, 60 µl TEK + 40 µl kannabinoide

disolbatzaile huts jartzen ziren). Azkenik, antagonista espezifikoaren dosiek, bakarrik,

espermatozoideetan efekturen bat sorrarazten zuten ikusteko, kontrol bat egin zen

antagonista bakoitzerako eta dosi bakoitzerako (10-5, 10-6 eta 10-7 M) (9. irudia).

BORTEX

TEKan berreseki60x106 sp / ml

100 µlAgonista (10X)

Etanol / DMSO

20 µl

20 µl

Antagonista (10X)

100 µl

100 µl

20 µl

20 µl20 µl

Agonista (1X) Antagonista (1X) + agonista (1X)

Antagonista (1X) Kontrola

BORTEX

TEK 80 µl

TEK 80 µl

100 µl

9. irudia: Espermatozoideak, agonista eta antagonista kannabinoideekin inkubatzeko diseinu esperimentala. 2.6.2 Espermatozoideen mugikortasunaren analisia

Mugikortasunaren analisia fase-kontrastedun mikroskopioarekin eta ordenagailu

bidezko Sperm Class Analyzer 2005® softwarearekin (10.a irudia) neurtu zen, 4. taulako

konfigurazioa erabiliz. Aztertu beharreko konposatua espermatozoideekin kontaktuan

jarri ondoren, espermatozoideen mugikortasuna zenbait denboratan neurtzen zen;

opioideentzat, 0, 0,5, 1 eta 3,5 orduak eta kannabinoideentzat, 0, 0,5, 1 eta 2 orduak

erabili ziren.

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak 74

4. taula: erabilitako CASA sistemaren konfigurazioa.

Parametroak

Frame/segundoko: eskuratutako irudiak segundoko 25

Frame zenbatekoa: grabatutako irudiak 25

LVV muga (µm/s): espermatozoide geldo baten abiadura maximoa 10

MVV muga (µm/s): espermatozoide ertain baten abiadura maximoa; hortik 35

gora, azkartzat hartuko da

STR minimoa (%): azkarrak ez ezik, progresibotzat hartzen diren 80

espermatozoideen kopurua adierazteko balioa

Fase-kontrastea: mikroskopioak erabilitakoa irudiak grabatzean PH+

Handiagotzea x20

Espermatozoideen kontzentrazioa eta mugikortasuna neurtzeko, lagin bakoitzetik, 37

ºC-an zegoen Makler zenbaketa-kameran (10.B irudia) 7,5 µl jartzen ziren. Lagin

bakoitzetik, 2 tanta desberdinetatik eratorritako 100 espermatozoide neurtzen ziren

gutxienez. Espermatozoideen mugikortasuna adierazteko, Osasunerako Munduko

Erakundearen irizpideen araberako nomenklatura erabili zen (10.D irudia): A motako

A B

D

10. irudia: Sperm Class Analyzer 2005®. A) Fase kontrastedun mikroskopioa eta ordenagailua. B) Makler zenbaketa-kamera. D) Espermatozoideen mugikortasunaren argazkia Sperm Class Analyzer 2005® softwarearekin neurtua (a mota: gorri, b mota: berde, c mota: urdin eta d mota: hori).

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak 75

mugikortasuna (abiadura ≥ 25 µm/s): higidura progresiboa (lerro zuzena) eta azkarra

erakusten duten espermatozoideen proportzioa; B motako mugikortasuna (abiadura ≥ 10

µm/s, baina ≤ 25 µm/s): higidura motel/makala (sigi-sagakoa) erakusten duten

espermatozoideen proportzioa; C motako mugikortasuna (abiadura < 10 µm/s):

mugikortasun ez-progresiboa duten espermatozoide mugikorren proportzioa. D motako

mugikortasuna (geldirik): mugimendurik ez duten espermatozoideen proportzioa.

Bestalde, espermatozoideek egindako ibilbideen arabera, mugikortasun-parametro

hauek neurtu ziren:

VCL: abiadura lerromakurra (kurbolineala) (µm/s): frame bakoitzean, buruaren zentroa

agertzen den lekuak elkarri lotuz lortzen da. Irudia eskuratzen den denbora osoa hartu

behar da kontuan.

VSL: abiadura lerrozuzena (µm/s): irudia eskuratzen den denboran, lehenengo eta

bukaerako puntuak elkarri lotuz lortzen da.

VAP: batez besteko ibilbidearen abiadura (µm/s): VCLa sortzen duten puntuen

estrapolazioz lortzen da.

Ibilbideerreala

Ibilbideerreala

11. irudia. Espermatozoideen hainbat mugikortasun-parametroen irudikapena (Ibilbide erreala, VCL, VSL, VAP eta ALH). Espermatozoideek egindako ibilbide errealetik kalkulatzen dira. (Tablado eta lank., 1996-tik moldatua).

LIN: linealtasuna (VSL/VCL) X 100: ibilbide lerromakurraren zuzentasuna adierazten

du.

STR: zuzentasuna (VSL/VAP) X 100: batez besteko ibilbidearen zuzentasuna

adierazten du.

WOB: oszilazioa (VAP/VCL) X 100: ibilbide lerromakurraren oszilazioa batez besteko

ibilbidearen gainean adierazten du.

ALH: buruaren albo-desplazamenduaren anplitudea (µm): buruaren desplazamenduaren

anplitudea batez besteko ibilbidearen gainean adierazten du.

Doktore-tesia

Materialak eta metodoak

Doktore-tesia

76

BCF: zeharkatze-maiztasuna (Hz): buruak batezbesteko ibilbidea zenbat alditan

zeharkatzen duen adierazten du.

2.7 Analisi estatistikoa Emaitzen analisi estatistikoa bariantzaren analisia (Analysis of variance; ANOVA)

eginez aztertu zen. Adierazgarritasunaren muga minimoa p<0,05-ean ezarri zen. Hala

konparatu zen espermatozoideen mugikortasunaren batez bestekoaren aldaketa

tratamenduen artean eta denboran zehar. Post-hoc analisirako, Student t testean

oinarritutako desberdintasun minimo adierazgarriaren testa erabili zen (Least Significant

Difference t test; LSD). Analisi estatistikorako, SPSS 14.0 (Statistical Package for the

Social Sciences) softwarea erabili zen.

Emaitzak eta eztabaida

Emaitzak eta eztabaida 79

1. helburua: δ, κ eta µ opioide-hartzaileen espresioa eta

kokapena giza espermatozoideetan

1.1 Opioide-hartzaileen proteinaren espresioa giza espermatozoideetan

1.irudia (A, B eta D) espermatozoide eta giza garun-kortexeko mintz plasmatikoak

erabilita egindako western bloten erakusgarria da.

KDa

A DB

100

70

35

Sp Kx

7050

35

KDa Sp Kx

70

50

KDa Sp Kx

50

1. irudia: δ opioide-hartzailea (A), κ opioide-hartzailea (B) eta µ opioide-hartzailea (D) western bloten analisia giza espermatozoideetan (Sp) eta garun-kortexean (Kx). Pisu molekularreko markatzaileak (kDa) bloten ezkerrean agertzen dira. n = 5.

Anti-δ antigorputz poliklonalak ~50 kDa-eko banda agerrarazi zuen espermatozoideen

proteina-erauzkinean. Garun-kortexean, ~50 kDa-eko banda ez ezik, 70 eta 36 kDa-eko

bandak ere aurkitu ziren (1.A irudia). Datu horiek bibliografian topatutako hainbat

lanekin bat datoz. Adibidez, argitaratutako lan batean, δ opioide-hartzailearentzat, 46

kDa-eko masa molekular teorikoa ondorioztatu izan da, nahiz eta SDS-PAGE eta gero,

δ opioide-hartzailearekiko immunorreaktibotasuna masa molekular batzuetan (50-tik 70

kDa-era) agertu (Christoffers, 2005). Bestalde, Persson-ek eta lankideek arratoiaren

garunean hiru banda desberdin immunokokatu zituzten 72, 48 eta 36 kDa-ean (Persson,

2005). Azken lan horretan, 48 kDa-eko banda proteina osoa izango zela ondorioztatu

zuten. Era berean, proposatu zuten 36 kDa-eko banda itzulpen ondoko prozesamenduan

C-muturra moztuta edukiko lukeen zatia izango zela eta dimeroak (72 kDa) sortzeko

ahalmena edukiko zuela. Beraz, ondoriozta genezake espermatozoideetan, kontrol

positiboarekin (kortexa) alderatuz, proteinaren forma bakarra agertzen dela.

Doktore-tesia

Emaitzak eta eztabaida 80

Anti-κ antigorputz poliklonala erabiliz, espermatozoideetan ~100, 65, 56 eta 36,5 kDa-

eko 4 banda detektatu ziren. Garun-kortexean, ~65 eta 56 kDa arteko

immunorreaktibotasuna detektatu zen (1.B irudia). Hau da, kontrol positibo moduan

erabilitako kortexean antzemandako bandak espermatozoideetan ere agertu ziren. Banda

horiek, lehenago egindako lanetan, arratoiaren eta igelaren garunetan eta giza plazentan

ere deskribatuak izan dira (Simon 1987, Ahmed 1989, Mejean 1992). κ opioide-

hartzailearentzat ondorioztatutako masa molekular teorikoa 43 kDa izan arren, lan

guztietan 55-65 kDa arteko immunorreaktibotasuna topatu izan da, agian, itzulpen

ondoko aldaketak direla eta (Arvdisson 1995). 100 kDa-eko banda dimero bat izan

daitekeela deskribatu da (Arvidsson 1995, Jordan 2001) eta 36,5 kDa-eko banda ez da

deskribatua izan.

Azkenik, anti-µ antigorputz poliklonalak ~70 eta 50 kDa-eko bandak agerrarazi zituen

espermatozoideen proteina-erauzkinean, baina, garun-kortexean, gehienbat ~50 kDa-

eko banda detektatu zen (1.D irudia). Albriziok eta lankideek antzeko banda ez-

glikosilatuak (65 eta 50 kDa) aurkitu zituzten zaldi- eta giza espermatozoideetan

(Albrizio 2005, Albrizio 2006). µ opioide-hartzailearen 49,8 kDa-eko masa molekular

teorikoa (Christoffers 2003) bat dator espermatozoideetan eta garun-kortexean lortu

genituen bandekin. Dena den, hainbat lanetan, gure laginean bezala, pisu molekular

altuagoko bandak ere aurkitu izan dira, ziurrenik, itzulpen ondoko aldaketak direla eta

(Christoffers 2003).

Western blot-eko PVDF mintzak δ-, κ- zein µ-antigorputz poliklonal primarioekin

inkubatzen ez zirenean, antigorputz sekundarioak ez zuen inolako seinalerik eman

(aurkeztu gabeko datuak).

1.2 Opioide-hartzaileen kokapena giza-espermatozoideetan

Azterketa immunozitokimikoen bidez, hiru opioide-hartzaileen presentzia baieztatu zen.

Gainera, hartzaile bakoitzaren kokapena zehaztu eta elkarren artean konparatu ahal izan

ziren.

δ opioide-hartzailea espermatozoideen mintz plasmatikoan detektatu zen buruaren

aurrealdean (akrosoma aldearen gainean), lepoan, tarteko zatian eta isatsean (2.A

Doktore-tesia

Emaitzak eta eztabaida 81

irudia). Kew-ek eta lankideek, nagusiki, µ zein δ opioide-hartzailera lotzen den

[Met5]entzefalina-Arg6-Phe7 peptidoaren kontrako antigorputza erabiliz, akrosoma

aldearen gainean aurkitu genuen immunokokapen berdina aurkitu zuten (Kew 1990).

Gure kasuan, behatutako zelulen % 20an, buruko seinalea akrosoma osteko hasierako

zatira arte hedatzen zen (2.B irudia).

κ opioide hartzailearen immunotindaketa espermatozoideen mintz plasmatikoan aurkitu

zen buruaren aurrealdean, lepoan, tarteko zatian —nabarmena— eta isatsean (2.D

irudia). Aztertutako zelula guztien % 17ren seinalea, buruaren aurrealdean aurkitu

beharrean, ekuatorean edo akrosoma osteko zatian aurkitu zen (2.E irudia).

Azkenik, µ opioide-hartzailearen seinalea espermatozoideen mintz plasmatikoaren

buruan (ekuatore/akrosoma osteko zatian), tarteko zatian eta isatsean zehar agertu zen

(2.F irudia). Tindaketa patroi hori zaldien espermatozoideetan topatutakoarekin bat

dator, gutxi gorabehera (Albrizio 2005).

Espermatozoideak oso zelula zatikatuak dira; horregatik uste da proteina bakoitza

beharrezkoa den egituran bakarrik aurkitzen dela. Hala baldin bada, erreakzio

akrosomikoan parte hartzen duten proteinek akrosoman kokatu behar dute; obozitoen

mintz plasmatikora lotzen diren proteinek ekuatorean egon behar dute; eta

mugikortasunerako beharrezkoak diren proteinek, espezifikoki, espermatozoide helduen

isatsean kokatu behar dute (Turner 2006). Beraz, teoria hori aintzat hartuz eta goian

azaldu dugun opioide-hartzaile bakoitzaren banaketa kontuan hartuz, hiru opioide-

hartzaileek kokalekua partekatzen dutenean, funtzio berean parte har dezaketela

ondoriozta genezake. Aitzitik, hiruak kokaleku desberdinetan topatuz gero, funtzio

espezifiko desberdinetan ere parte har dezaketela ondoriozta genezake.

Bestalde, immunotindaketa-prozedura berdina jasan duten zeluletan aurkitutako seinale

patroi desberdinaren arrazoia mintz plasmatikoa egoera funtzional desberdinean

aurkitzearen ondorioa izan daiteke. Izan ere, espermatozoideek, obozitoa ernaltzeko

gaitasuna eskuratzeko jasaten duten aktibazio-prozesuan zehar, zeina batzuetan berez

gerta baitaiteke (Maccarrone 2005), mintz plasmatikoaren berrantolaketa pairatzen dute

(Flesch eta Gadella 2000).

Doktore-tesia

Emaitzak eta eztabaida 82

δ-, κ- zein µ-antigorputz poliklonal primarioekin egin beharreko inkubaketa egiten ez

zenean, antigorputz sekundarioak ez zuen inolako seinalerik ematen (2.G irudia).

2. irudia: Opioide-hartzaileen azterketa immunozitokimikoa giza espermatozoideetan. A eta B) δ opioide-hartzailearen kokapena. D eta E) κ opioide-hartzailearen kokapena. F) µ opioide-hartzailearen kokapena. G) kontrol negatiboa (Hoechst 33342-ak nukleoa markatzen du urdinez). n = 3. Gezitxoek hartzaile bakoitzaren tindaketa patroiaren aldakortasuna (B eta E) edo kontrol negatiboaren nukleoa (G) seinalatzen dute. Eskala-barra, 10 µm.

1.3 Opioide-hartzaileen mRNAren espresioa giza espermatozoideetan

Giza espermatozoideetatik erauzitako RNArekin egindako RT-PCR bidez µ eta κ

opioide-hartzaileen mRNAk detektatu ziren arren, ez zen δ opioide-hartzailearena

aurkitu. µ eta κ opioide-hartzaileentzat, espermatozoideetan zein kontrol positibo

moduan erabilitako giza garunaren kortexean, espero genuen bezala, 352 bp eta 440 bp-

ko zatiak topatu genituen, hurrenez hurren. δ opioide-hartzailearentzat, espero genuen

222 bp-ko zati anplifikatua giza garunaren kortexean aurkitu genuen baina ez

espermatozoideetan. Barne-kontrol moduan erabilitako GAPDH genea ondo anplifikatu

zen (3. irudia). [RT-PCRaren bidez lortutako espermatozoideen µ eta κ opioide-

hartzaileen anplikoien sekuentziak bat datoz NCBI-BLAST (National Center for

Biotechnology Information - Basic Local Alignment Search Tool) datu-baseko mRNA

sekuentziekin (1. eranskina)]

Doktore-tesia

Emaitzak eta eztabaida 83

DELTA

Sp

KAPPA

MU

Kx

GAPDH

3. irudia: RT-PCRaren produktuen etidio bromurodun % 2 agarosa-gelaren elektroforesia giza espermatozoideentzat (Sp) eta garun-kortexarentzat (Kx). DELTA, δ opioide-hartzailearentzako primer espezifikoekin lortutako anplikoia (222 bp) soilik garunaren kortexean topatu zen. KAPPA, κ opioide-hartzailearentzako primer espezifikoekin lortutako anplikoia (352 bp). MU, µ opioide-hartzailearentzako primer espezifikoekin lortutako anplikoia (440 bp). GAPDH, barne-kontrol moduan erabili zen (322 bp). n = 5.

Emaitza horiek bat datoz µ- eta κ-hartzaileen proteina-datuekin. Baina espermatozoide

helduetan, δ opioide-hartzailearen immunorreaktibotasuna detektatu genuen arren,

opioide-hartzaile horren mRNAren presentziarik ez zen ikusi, ez RT-PCR erabilita (3.

irudia) ezta RT-PCR kuantitatiboa erabilita ere (2. eranskina).

Alde batetik, badakigu espermatozoide helduek ez dutela transkripzioa eta itzulpen-

prozesua egiteko gaitasunik (Flesh eta Gadella, 2000). Espermatogenesiaren azkeneko

urratsetan espermatozoideek beren zitoplasmaren zati handi bat (organulu gehienak eta

mRNAren gehiengoa barne) galtzen dutelako gertatzen da (Miller, 2005). Hori dela eta,

RNAren presentzia nukleo/perinukleora edota mitokondrietara mugatzen da, in situ

hibridazio bidez frogatu den bezala (Pessot1989, Kumar 1993, Wykes 1997).

Beste alde batetik, RNAren andeakuntza selektiboa gertatzen denez, giza

espermatozoideen RNA-populazio jakinak babestuak egongo liratekeela deskribatu da.

Azken horrek adieraziko luke espermatozoide helduetan RNA-populazio egonkorrak

egon daitezkeela (Ostermeier, 2005).

Ondorioz hipotetiza dezakegu espermatozoideek, espermatogenesia bukatu eta hurrengo

faseetan δ opioide-hartzailearen mRNA behar izango ez luketenez, ez luketela gordeko

mRNA hori. Horrek azalduko luke zergatik agertzen den espermatogenesian zehar

espresatu den hartzailearen proteina espermatozoide helduetan δ-hartzailearen mRNA

Doktore-tesia

Emaitzak eta eztabaida 84

azaltzen ez den arren. Ildo beretik, Ravinak eta lankideek, tazikininen hartzaileak

aztertzean, ondorio berdina proposatu zuten (Ravina, 2007).

Proposatutako ondorio hori egia bada, µ- eta κ-hartzaileen mRNAk, “mezulari hautatu”

moduan, funtzio bat eduki lezake zigoto goiztiarraren garapenean, bestelako

espermatozoide-transkriptoreentzat proposatu den bezala (Ostermeier, 2002;

Ostermeier, 2004).

Dena den, espermatozoidearen mRNAren funtzioen inguruan sortutako eztabaidak

oraindik pizturik dirau (Miller, 2005).

Doktore-tesia

Emaitzak eta eztabaida 85

2. helburua: CB1 eta CB2 kannabinoide-hartzaileen espresioa

eta kokapena giza espermatozoideetan.

2.1 Kannabinoide-hartzaileen mRNAren espresioa giza espermatozoideetan

Giza espermatozoideetatik erauzitako RNArekin egindako RT-PCR bidez, CB1 zein

CB2 kannabinoide-hartzaileen mRNAk detektatu ziren. CB1 kannabinoide-hartzailearen

408 bp-ko anplikoia espermatozoideetan eta kontrol positibo moduan erabilitako giza

garuneko kortexean aurkitu zen, baina ez, ordea, kontrol negatibo moduan erabilitako

Jurkat zeluletan. Bestalde, CB2 kannabinoide-hartzailearen kasuan espero genuen 522

bp-ko zatia, espermatozoideetan eta kontrol positibo moduan erabilitako Jurkat

zeluletan topatu genuen, baina ez kontrol negatibo moduan erabilitako giza garuneko

kortexean (4. irudia).

CB1

Sp Kx

GAPDH

Jr

CB2

4. irudia: RT-PCRaren produktuen etidio bromurodun % 2 agarosa-gelaren elektroforesia giza espermatozoideentzat (Sp), garun-kortexarentzat (Kx) eta Jurkat zelulentzat (Jr). CB1, CB1 kannabinoide-hartzailearentzako primer espezifikoekin lortutako anplikoia (408 bp) ez zen Jurkat zeluletan topatu. CB2, CB2 kannabinoide-hartzailearentzako primer espezifikoekin lortutako anplikoia (522 bp) ez zen giza garuneko kortexean topatu. GAPDH, barne-kontrol moduan erabili zen (322 bp). n = 5.

Hartzaileen mRNA espermatozoide helduetan agertzeak adieraziko luke CB1 eta CB2

hartzaileak, opioide-hartzaileak bezala, testikuluetako zelula espermatikoetan sortuko

liratekeela. Hau da, ez lirateke epididimoan zeharreko bidaian eskuratuko,

ernalkuntzarako beharrezkoak diren beste mintz-proteinekin gertatzen den bezala

(Focarelli, 1998; Scuell eta Burkman, 2005), eta ez lirateke prostasometatik

bereganatuko (Arienti 1997a, Arienti 1997b) ere, zeren eta, ez opioide-hartzaileak, ez

kannabinoideak, ez baitira prostasometan deskribatuak izan (Utleg 2003).

Doktore-tesia

Emaitzak eta eztabaida 86

µ eta κ opioide-hartzaileen kasuan adierazi dugun bezala, kasu honetan ere, CB1 eta CB2

hartzaileen mRNA espermatozoide helduetan selektiboki mantendu badira, uste

izatekoa da ernalkuntzaren ondoren zenbait funtzio beteko dituztela.

2.2 Kannabinoide-hartzaileen proteinaren espresioa giza espermatozoideetan

5. irudia espermatozoideen, giza garuneko kortex prefrontalaren materia grisaren eta

Jurkat zelulen mintz plasmatikoak erabilita egindako western blot-en erakusgarria da.

Anti-CB1 antigorputz poliklonalak ~58 kDa-eko banda agerrarazi zuen

espermatozoideetan eta garun-kortexean (5.A irudia). Pisu molekular hori bat dator

espermatozoideetan (Rossato, 2005) eta beste zeluletan (de Jesus, 2006; Xu, 2005)

lehenago egindako hainbat lanekin. Bestalde, mRNArekin gertatu zen bezala, kontrol

negatibo moduan erabilitako Jurkat zelulen proteina-erauzkinean ez zen seinalerik

aurkitu (5.A irudia); izan ere, zelula mota horien CB1 genearen transkripzioa oso txikia

da, eta, beraz, proteina ez da ia detektatzen (Herrera 2006, Börner 2007).

B

kDa Sp Kx Jr

50

60

40

A

kDa Sp Kx Jr

50

60

40

5. irudia: CB1 kannabinoide-hartzailea (A) eta CB2 kannabinoide-hartzaileentzako (B) western blot-en analisia giza espermatozoideetan (Sp), garun-kortexean (Kx) eta Jurkat zeluletan (Jr). Pisu molekularreko markatzaileak (kDa) blot-en ezkerrean agertzen dira. n = 5.

Anti-CB2 antigorputz poliklonala erabiliz, espermatozoideetan eta kontrol positibo

moduan erabilitako Jurkat zeluletan, 44 kDa-eko banda detektatu zen (5.B irudia) eta,

gutxi gorabehera, lehenago deskribatutako pisu molekular teorikoarekin bat dator

(Filppula, 2004). Espermatozoideekin egindako lanetan, CB2 proteinaren existentzia

kolokan jarri da (Rossato, 2005; Maccarrone, 2005). Dena den, Schuel eta Burkman-ek

idatzitako berikuspenean (Schuel eta Burkman, 2005) ondo adierazi zuten bezala,

Maccarrone-k eta lankideek basurde-espermatozoideekin egindako lanean (Maccarrone,

2005), alde batetik, western blot bidez CB2 hartzailearen seinale ahula ikus daiteke, eta,

Doktore-tesia

Emaitzak eta eztabaida 87

bestetik, SR144528 CB2 antagonista espezifikoak [3H]CP55.940aren lotura espezifikoa

~% 15 blokeatzen duela ere ikus daiteke. Aipagarria da Maccarrone bera, CB2

hartzaileari buruzko 2007ko berrikuspen batean (Maccarrone, 2007), CB2-aren

presentziaz mintzatzen dela 2005ean egin zuen lanean oinarrituta. Laburbilduz, gure

emaitzek aurreko datuak indartu eta CB2-aren presentzia baieztatzen dute.

Bestalde, mRNArekin gertatzen zen bezala, giza garunaren kortexean ez zen CB2

proteinaren seinalerik detektatu (5.B irudia), bestelako lanetan dagoeneko ikusita

dagoen bezala (Herrera, 2006; Blazquez, 2006).

Western blot-eko PVDF mintzak CB1 zein CB2 antigorputz poliklonal primarioekin

inkubatzen ez zirenean, antigorputz sekundarioak ez zuen inolako seinalerik ematen

(aurkeztu gabeko datuak).

2.3 Kannabinoide-hartzaileen kokapena giza espermatozoidetan

Azterketa immunozitokimikoen bidez, CB1 eta CB2 kannabinoide-hartzaileen presentzia

baieztatu zen. Horretaz gain, kokalekua zehaztu eta elkarren artean aldaratu ahal izan

zen.

CB1 kannabinoide-hartzailea espermatozoideen buruaren aurrealdean (akrosoma

aldearen gainean) eta tarteko zatian aurkitu zen (6.A irudia). Emaitza horiek lehenago

egindako beste lanen aurkikuntzak baieztatu zituzten (Rossato, 2005). Hala ere, gure

kasuan, isatsean ere seinalea topatu zen (6.A irudia). Behatutako zelula guztien %

15ean, buruko seinalea akrosoma osteko zatiraino hedatzen zen (6.B irudia). Basurde-

espermatozoideetan egindako ikerketetan, CB1 hartzailearen presentzia akrosoma

osteko zatira eta isatsera mugatzen zen (Maccarrone, 2005).

CB2 kannabinoide-hartzailearen immunotindaketa, ostera, buruaren akrosoma osteko

zatian, tarteko zatian eta, intentsitate txikiagoarekin, isatsean aurkitu zen (6.D irudia).

Aztertutako zelula guztien % 20ren seinalea buruaren aurreko zatiraino hedatzen zela

ikusi zen (6.E irudia).

Doktore-tesia

Emaitzak eta eztabaida 88

Opioide-hartzaileen kokalekua eztabaidatu dugunean ondorioztatukoaren harira,

proteina bakoitza espermatozoidean erabilgarria den egituran bakarrik aurkitzen bada

(Turner, 2006), CB1 eta CB2 hartzaileen arteko kokalekuen desberdintasunak iradoki

lezake prozesu fisiologiko desberdinetan parte hartzen dutela.

6. irudia: Kannabinoide-hartzaileen azterketa immunozitokimikoa giza espermatozoideetan. A eta B) CB1 kannabinoide-hartzailearen kokapena. D eta E) CB2 kannabinoide-hartzailearen kokapena. F) kontrol negatiboa. G) F irudia, fase-kontraste bidezko mikroskopiarekin. n = 3. Gezitxoek (B eta E) hartzaile bakoitzaren tindaketa patroiaren aldakortasuna seinalatzen dute. Eskala-barra, 10 µm.

Azkenik, immunotindaketa-prozedura berdina jasan duten zeluletan aurkitu dugun

seinale patroi desberdina opioide-hartzaileetan eta beste hainbat hartzaile eta proteina

immunokokatzean behatu izan da (Meizel, 2004; Subiran, 2007). Berretsi egiten dugu

gertaera hori zelulen mintza egoera-funtzional desberdinean egoteagatik gerta daitekeela

(Maccarrone, 2005; Flesch eta Gadella, 2000).

CB1 zein CB2 antigorputz poliklonal primarioekin egin beharreko inkubaketa egiten ez

zenean, antigorputz sekundarioak ez zuen inolako seinalerik ematen (6.F irudia).

Doktore-tesia

Emaitzak eta eztabaida 89

3. helburua: Opioide- eta kannabinoide-hartzaileen

aktibazioaren eragina espermatozoideen mugikortasunean.

3.1 Agonista eta antagonista opioideen eragina espermatozoideen

mugikortasunean

Sarreran ikusi dugun bezala, farmakologikoki, gutxienez hiru opioide-hartzaile mota

desberdintzen dira estekatzaileekiko duten itxurazko afinitatearen arabera. Baina

badakigu, halaber, konposatu opioide bakoitzak hartzaile mota bakoitzarekiko

selektibotasun-maila desberdina daukan arren, edozein opioide-hartzailetara lot

daitekeela kontzentrazioa handitzen bada. Hala, aztertu dugun hartzaile bakoitzaren

aktibazioaren emaitzak banatuak emango ditugun arren, hartzaileen arteko

elkarrekintzak azaldu ahal izateko, emaitzen eztabaida orokorra egingo dugu.

• δ opioide-hartzailearen agonista (DPDPE) eta antagonista (naltrindol)

opioideen eragina mugikortasunean

OMEk zehaztutako espermatozoideen mugikortasun motak aztertuz, ikus daiteke

DPDPEaren kontzentrazio altuenak (10-5 M) ez zuela aldaketa adierazgarririk sortu

denboran zehar (7.A irudia). Era berean, inkubaketa-denborarik luzeenean (3,5 ordu),

DPDPE agonistaren kontzentrazio desberdinek ez zuten elkarren arteko ezberdintasun

adierazgarririk erakutsi OMEk zehaztutako mugimendu motetan (7.A' irudia).

Aipagarria da naltrindol 10-4 M-a gehitu eta berehala (0 ordu) a eta b motako

espermatozoideen ehunekoak modu adierazgarrian jaitsi eta, horren ondorioz, d

motakoa igo zela naltrindol gabeko inkubaketekin alderatuz (8.A, B eta D irudiak).

Gainera, naltrindola bakarrik egonda edo naltrindola zeukan laginari DPDPEa (10-5 M)

gehituz, mugikortasun patroi antzekoak ikusi ziren denboran zehar mugimendu mota

guztietan (8.A, B, C eta D irudiak). Beraz, ematen du antagonista 10-4 M denean

mugikortasun patroia antagonistaren presentziak gidatzen duela denboran zehar. Dena

den, 3,5 ordu igaro ostean, naltrindol 10-4 M-aren presentziak soilik A motako

mugikortasunaren ehunekoa mantendu zuen era adierazgarrian aldatua, naltrindol

gabeko inkubaketekin alderatuz (8.A eta A' irudia). Naltrindolak ere VCL, VSL, VAP,

Doktore-tesia

Emaitzak eta eztabaida

Doktore-tesia

90

0

20

40

60

0 0.5 1 3.50

20

40

60

a b c d a+b

0

20

40

60

a b c d

0

20

40

60

a b c d0

20

40

60

0 0.5 1 3.5

A´

Mug

ikor

tasu

na(%

)

Mugikortasun mota (OME)

B´

0

20

40

60

0 0.5 1 3.5

Mug

ikor

tasu

na(%

)

Mugikortasun mota (OME)

AM

ugik

orta

suna

(%)

Denbora (orduak)

B

Mug

ikor

tasu

na(%

)

Denbora (orduak)

D´

Mug

ikor

tasu

na(%

)

Mugikortasun mota (OME)

D

Mug

ikor

tasu

na(%

)

Denbora (orduak)

#$

*

*

*

KontrolaDPDPE 10-7 MDPDPE 10-6 MDPDPE 10-5 M

KontrolaDPDPE 10-7 MDPDPE 10-6 MDPDPE 10-5 M

ab

cd

U-50488 10-5 Mab

cd

U-50488 10-5 M

ab

cd

DPDPE 10-5 Mab

cd

DPDPE 10-5 M

a+bab

cd

Morfina 10-7 Ma+ba

bcd

Morfina 10-7 M

KontrolaU-50488 10-7 MU-50488 10-6 MU-50488 10-5 M

KontrolaU-50488 10-7 MU-50488 10-6 MU-50488 10-5 M

KontrolaMorfina 10-7 MMorfina 10-6 MMorfina 10-5 M

KontrolaMorfina 10-7 MMorfina 10-6 MMorfina 10-5 M

#

$

7. irudia: Opioide-hartzaileen agonista eta antagonista opioideen eragina giza espermatozoideen mugikortasunean. A) DPDPE 10-5M gehitzean a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna denboran zehar. B) U-5048810-5M gehitzean a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna denboran zehar. D) Morfina 10-5M gehitzean a, b, c, d eta a+b motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna denboran zehar (*P<0,05 versus gainontzeko orduak; $P<0,05 versus 0 eta 0,5 orduak). A´) DPDPEren hainbat dosik a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna 3,5 orduko inkubazioa eta gero. B´) U-50488ren hainbat dosik a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna 3,5 orduko inkubazioa eta gero. D´) Morfinaren hainbat dosik a, b, c, d eta a+b motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna 3,5 orduko inkubazioa eta gero (#P<0,05 versus kontrola).

Emaitzak eta eztabaida

Doktore-tesia

91

0

10

20

30

40

50

60

0

10

20

30

0 0.5 1 3.50

10

20

30

0

10

20

30

40

50

0

5

10

15

20

25

30

10-7 10-510-6

Kontzentrazioa (M)

Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6

Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6

Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6

10

30

50

0 0.5 1 3.5

A

a m

ota

(%)

B

b m

ota

(%)

C

c m

ota

(%)

D

d m

ota

(%)

10

30

50

0 0.5 1 3.5

B´

b m

ota

(%)

Denbora (orduak)

D´

d m

ota

(%)

Denbora (orduak)

C´c

mot

a (%

)

Denbora (orduak)

0

10

20

30

0 0.5 1 3.5

A´

a m

ota

(%)

Denbora (orduak)

*

*

*

##

*

8. irudia: δ opioide-hartzailearen agonistaren (DPDPE) eta antagonistaren (naltrindol) efektua giza espermatozoideen mugikortasunean. A, B, C eta D) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna denboran zehar. Kontrola; naltrindol 10-4 M

DPDPE 10-5M + naltrindol 10-4 M; DPDPE 10-5M (*P<0,05 versus ordu bereko naltrindolgabeko tratamenduak). A´, B´, C´ eta D´) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna DPDPEren kontzentrazio aldakorrekin eta 3,5 orduko inkubazioaeta gero (naltrindolaren kontzentrazioa DPDPErena baino 10 aldiz handiagoa izan zen beti).

Kontrola; naltrindol 10-4 M; DPDPE + naltrindol; DPDPE (#P<0,05 versus kontzentraziobereko naltrindol gabeko tratamenduak).

Emaitzak eta eztabaida

Doktore-tesia

92

0

10

20

30

0

10

20

30

0

10

20

30

40

50

60

10

30

50

0 0.5 1 3.5

0

10

20

30

0 0.5 1 3.5

10-7 10-510-6

Kontzentrazioa (M)

Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6

Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6

Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6

A

a m

ota

(%)

B

b m

ota

(%)

C

c m

ota

(%)

D

d m

ota

(%)

B´

b m

ota

(%)

Denbora (orduak)

D´

d m

ota

(%)

Denbora (orduak)

C´

c m

ota

(%)

Denbora (orduak)

A´

a m

ota

(%)

Denbora (orduak)

0

10

20

30

0 0.5 1 3.5

0

10

20

30

40

10

30

50

0 0.5 1 3.5

9. irudia: κ opioide-hartzailearen agonistaren (U-50488) eta antagonistaren (nor-binaltorfimina) efektua giza espermatozoideen mugikortasunean. A, B, C eta D) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna denboran zehar. Kontrola; nor-binaltorfimina 10-4 M; U-50488 10-5M + nor-binaltorfimina 10-4 M; U-50488 10-5M. A´, B´, C´eta D´) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna U-50488ren kontzentrazio aldakorrekin eta 3,5 orduko inkubazioa eta gero (nor-binaltorfiminarenkontzentrazioa U-50488rena baino 10 aldiz handiagoa izan zen beti). Kontrola; nor-binaltorfimina 10-4 M; U-50488 + nor-binaltorfimina; U-50488.

Emaitzak eta eztabaida

Doktore-tesia

93

15

35

55

75

0 0.5 1 3.5

0

5

10

15

20

0

10

20

30

40

50

0

10

20

30

0

10

20

30

40

50

0

10

20

30

40

50

60

10-7 10-510-6

Kontzentrazioa (M)

Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6

Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6

Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6

A

a m

ota

(%)

B

b m

ota

(%)

C

c m

ota

(%)

D

d m

ota

(%)

B´

b m

ota

(%)

Denbora (orduak)

D´

d m

ota

(%)

Denbora (orduak)

C´

c m

ota

(%)

Denbora (orduak)

A´

a m

ota

(%)

Denbora (orduak)

Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6

E

a+b

mot

a (%

)

E´

a+b

mot

a (%

)

Denbora (orduak)

0

10

20

30

0 0.5 1 3.5

0

10

20

30

0 0.5 1 3.5

10

30

50

0 0.5 1 3.5

10

30

50

0 0.5 1 3.5

*

#

$

$

$

*

*

*

*

***

10. irudia: µ opioide-hartzailearen agonistaren (morfina) eta antagonistaren (naloxona) efektua giza espermatozoideen mugikortasunean. A, B, C, D eta E) hurrenez hurren a, b, c, d eta a+b motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna denboran zehar. Kontrola; naloxona 10-4 M

morfina 10-7M + naloxona 10-6 M; morfina 10-7M (*P<0,05 versus 0 ordu). A´, B´, C´, D´ eta E´) hurrenez hurren a, b, c, d eta a+b motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna morfinaren kontzentrazio aldakorrekin eta 3,5 orduko inkubazioa eta gero (naloxonarenkontzentrazioa morfinarena baino 10 aldiz handiagoa izan zen beti). Kontrola; naloxona 10-4

M; morfina + naloxona; morfina (#P<0,05 versus morfina 10-7M + naloxona 10-6 M; $P<0,05 versus kontzentrazio horretan konparatutako gainontzeko tratamenduak ).

Emaitzak eta eztabaida 94

LIN, STR, ALH eta BCF parametroak jaitsi zituen modu adierazgarrian (3. eranskinna).

• κ opioide-hartzailearen agonista (U-50488) eta antagonista (nor-

binaltorfimina) opioideen eragina mugikortasunean

Mugikortasun motak aztertuz, ikus daiteke U-50488ren kontzentrazio altuenak (10-5 M)

ez zuela aldaketa adierazgarririk sortu denboran zehar (7.B irudia). Era berean,

inkubaketa-denborarik luzeenean (3,5 ordu), U-50488 agonistaren kontzentrazio

desberdinek ez zuten elkarren arteko ezberdintasun adierazgarririk erakutsi OMEk

zehaztutako mugimendu motetan (7.B' irudia).

κ opioide-hartzailearen antagonista nor-binaltorfimina 10-4 M-ak ere ez zuen inolako

aldaketa adierazgarririk sortu aztertutako kontzentrazio, denbora eta mugimendu

motetan (9. irudia). Bestelako parametroetan ere ez zen aldaketarik ikusi (3. eranskina).

• µ opioide-hartzailearen agonista (morfina) eta antagonista (naloxona)

opioideen eragina mugikortasunean

Morfina 10-7 M-aren presentziak OMEk zehaztutako mugimendu mota guztietan

aldaketa adierazgarriak sortu zituen inkubazioaren hirugarren orduan (inkubazio

totalaren 3,5 orduan). Zehazki, a eta b motako espermatozoideen ehunekoa jaitsi eta c

eta d motako espermatozoideena handitu zen (7.D irudia). Erabilitako morfina-

kontzentrazioen ekintza 3,5 orduko inkubazio-denboran aztertuz, dosiaren menpeko

alderantzizko joera ikusi zen. Hau da, kontrolarekin alderatuz, a eta b motako

espermatozoideen ehunekoen jaitsiera agerikoena morfina-kontzentrazio txikienean (10-

7 M) gertatu zen; era berean, c eta d motako espermatozoideen ehunekoen handipen

nabariena morfina-kontzentrazio berdinean (10-7 M) gertatu zen (7.D' irudia). Hala ere,

dosiaren menpeko alderantzizko joerak nabariak izan arren, soilik d motako

espermatozoideen ehunekoaren handipena izan zen kontrolarekiko ezberdina modu

adierazgarrian (44,9 ± 10,7 vs 25,9 ± 4,6; P < 0,05; 7.D' irudia). Dena den, aipagarria da

a eta b mugikortasunak batuz gero (mugikor progresiboak) morfina 10-7 M-ak sortutako

a+b motako espermatozoideen ehunekoen jaitsiera era adierazgarrian desberdina izan

zela, kontrolarekin alderatuta, (27,1 ± 9,3 vs 45,8 ± 6,7; P < 0,05; 7.D' irudia).

Doktore-tesia

Emaitzak eta eztabaida 95

Morfina 10-7 M-ak mugimenduan sortutako aldaketa horiek, µ opioide-hartzailearen

antagonista den naloxonak (10-4 M) saihestu zituen, inkubaketa-denborarik luzeenean

(3,5 ordu) (10. A´, B´, D´ eta E´ irudiak). Alde batetik, d motako espermatozoideen

ehunekoaren handipena ekidin zuen (44,9 ± 10,7 vs 25,7 ± 3,4; P < 0,05; 10. D eta D´

irudiak); bestetik, a zein b motako espermatozoideen ehunekoaren jaitsiera ere saihestu

zuen (a motarako: 4,6 ± 1,9 vs 13,8 ± 2,9; P < 0,05; 10.A eta A´ irudiak. b motarako:

22,5 ± 7,9 vs 36,4 ± 7,1; P = 0,07; 10.B eta B´ irudiak). Kasu horretan ere, naloxonak

(10-4 M) era nabariagoan saihestu zuen espermatozoide progresiboen baturaren (a+b)

ehunekoaren jaitsiera (27,1 ± 9,6 vs 50,3 ± 6,5; P < 0,05; 10.E eta E´ irudiak).

Morfinak (10-7 M) VCL, VSL eta VAP parametroak jaitsi zituen, eta naloxonak (10-4

M) efektu hori lehengoratu zuen. Bestalde, ibilbidearekin zerikusia duten parametroak

ez ziren aldatu morfinarekin (3. eranskina).

Emaitzen eztabaida hasteko, gogoratuko dugu argitaratu diren hainbat ikerketatan

efektu kontraesankorrak deskribatu izan direla entzefalina edo haren analogoek [oro har,

µ-hartzailearekin alderaturik δ-hartzailearekiko afinitate handiagoa duten peptido

opioideak (Leslie, 1987)] espermatozoideen funtzioan duten eragina aztertzean. Lan

horien arabera, entzefalina-dosi altuak espermatozoideen mugikortasuna jaisten bazuen

ere (Sastry eta lank., 1991; Foresta eta lank., 1985), mugikortasuna mantentzeko,

peptido horren dosi txikia behar zen (Fujisawa eta lank., 1996).

Gure emaitzek, hein batean, paradoxa hori azaldu dezakete. Alde batetik, egia izan

daiteke entzefalina-kontzentrazio minimo bat beharrezkoa izatea mugimendua

mantentzeko (Fujisawa eta lank., 1996), zeren eta, gure esperimentuetan, naltrindolak

(10-4M) espermatozoideen mugikortasunaren jaitsiera eragin zuen eta, agian,

naltrindolak δ-hartzaileari lotuta zeuden barne-entzefalinak desplazatu zituelako gertatu

zen jaitsiera hori. Bestalde, litekeena da, halaber, entzefalina-kontzentrazio altua

erabiltzean mugikortasunaren inhibizioa gertatzea (Sastry eta lank., 1991; Foresta eta

lank., 1985) baina, beharbada, inhibizio hori ez dago δ-hartzaileei lotua, zeren eta, nahiz

eta entzefalinen selektibotasuna δ > µ izan, barne-peptido horiek δ- zein µ-hartzaileei

lot baitaitezke (Jordan eta lank., 2000). Beraz, entzefalina-kontzentrazio batetik aurrera,

µ opioide-hartzailera lotzen hasiko ziren eta, gure emaitzen arabera, badakigu µ

opioide-hartzailearen aktibazioak mugikortasunaren jaitsiera dakarrela. Bukatzeko, gure

Doktore-tesia

Emaitzak eta eztabaida 96

emaitzetan ikusi dugu guk erabilitako δ-antagonistak (DPDPE) ez zituela sortu beste

lanetan deskribatutako entzefalinaren efektuak. Horren zergatia izan daiteke, DPDPEa,

δ-hartzailearekiko oso espezifikoa denez (Ki = 1,4 nM / Kd = 19 nM), kontzentrazio

altuagoak behar izatea (Ki > 10000 nM / Kd > 3000 nM) µ-hartzailearen bidez efektua

sortzeko (Hunter eta lank., 1990; Fukuda eta lank., 1995).

µ opioide-hartzailearekin jarraituz, ikusi dugu µ opioide-hartzailearen agonistak

(morfina, 10-7 M) espermatozoide geldien kopurua igo zuela eta antagonistak

(naloxona), berriz, ekintza hori saihestu zuela. Emaitza hori bat dator giza eta zaldi-

espermatozoideekin egindako inkubazioekin. Bi lan horietan, espermatozoideak µ-

opioide-hartzailearen beste agonista batekin (β-endorfina) eta guk erabilitako

antagonista berdinarekin (naloxona) inkubatu ziren. Horietako lan batean, agonistarekin

5 minutuko inkubazioa egin eta gero, mugikortasunaren dosiaren menpeko jaitsiera

ikusi zuten, baina naloxonak ez zuen efektua ekidin (Fraioli eta lank., 1984). Beste

lanean, β-endorfinarekin 24 orduko inkubazioa egin eta gero, mugikortasunaren

dosiaren menpeko inhibizioa ikusi zuten eta naloxonak (10-8 M) ekintza hori ekidin

zuen. Gainera, azken lan horretan, naloxonarekin bakarrik inkubatzean, ikusi zuten

espermatozoideek mugikortasunari eusten ziotela (Mari eta lank., 2005).

Zaldi-espermatozoideekin egindako beste lan batean, bost orduz inkubatu eta gero,

naloxona 10-8 M-ak mugikortasun progresiboan eragin positiboa zuen; naloxona 10-3 M-

ak, berriz, ekintza negatiboa sortu zuen (Albrizio, 2005). Naloxonak µ opioide-

hartzaileekiko afinitate handiagoa dauka δ-hartzaileekiko baino (Leslie, 1987;

Chacrabarti, 1997). Beraz, naloxona-kontzentrazio txikiak, µ opioide-hartzailearen

antagonizazioaren bidez, mugikortasunean lagunduko du; naloxona-kontzentrazio altua,

aldiz, δ-hartzaileen estekatzaileak ere desplazatzen has daiteke eta mugikortasuna inhibi

dezake (naltrindolaren efektu berdina). Hala eta guztiz ere, gure taldean egindako

lanetan eta tesi honetan, naloxona 10-4 M-arekin ez dugu efektu kaltegarririk ikusi

mugikortasunean (Subiran, 2007). Bestalde, naloxona-kontzentrazio altuaren (10-4 M)

efektu positiboak ere deskribatu dira (Sastry eta lank., 1991). Beraz, argi dago gai

eztabaidagarria dela oraindik.

Jakingarria da nola daitekeen µ opioide-hartzailearen agonistek, β-endorfinak [10-9 M

eta 10-8 M (Mari eta lank., 2005)] eta morfinak (10-7 M) espermatozoideen

Doktore-tesia

Emaitzak eta eztabaida 97

mugikortasunean efektu negatiboa sortzea eta kontzentrazio handiagoetan (morfina 10-6

M eta 10-5 M) efektu adierazgarririk ez sortzea. Alde horretatik, litekeena da 10-7 M

baino kontzentrazio altuagoetan morfina µ opioide-hartzaileari (Ki = 1,4 nM / Kd ~ 23

nM) zein δ opioide-hartzaileari (Ki > 1000 / Kd ~ 390 nM) lotzea (Satoh eta lank.,

1995; Fukuda eta lank., 1995) eta, horren ondorioz, δ-efektua sorraraztea, zeinak, ikusi

dugunaren arabera, espermatozoideen mugikortasuna manten baitzezakeen.

Dena den, heroinazaleen (µ-agonista) patologia espermatiko nagusia mugikortasunaren

jaitsiera izatea bat dator guk aurkitutako morfinaren efektu negatiboarekin. Beraz,

opiazeozale gizonezkoen artean atzemandako hazi-kalitate eskasa eta ugalkortasunik

eza ez zen izango soilik hipotalamoan (Stansfield eta Cunningam, 1987; Fabbri eta

lank., 1989; Giri eta Kaufman, 1994) eta guruin pituitarioan (Kalra eta lank., 1988)

sortutako efektuengatik; aitzitik, espermatozoideen opioide-hartzaileen bidez zuzenean

eragindako ekintza ere izango zen.

κ opioide-hartzailearen agonistak zein antagonistak espermatozoideen mugikortasunean

efektu adierazgarririk sortu ez zuten arren, hartzaile hori espermatozoideen hainbat

aldetan agertu izanak iradokitzen du mugikortasuna ez den beste eginkizunen bat eduki

lezakeela.

Beraz, laburbilduz: hiru hartzaileek erakutsi duten elkarren arteko banaketa desberdina

izateak, batetik, eta agonista- zein antagonista-dosi bakoitzak espermatozoideen

mugikortasunean ekintza bat baino gehiago sortu izanak, bestetik, aditzera ematen

digute ezen, benetan, hartzaile bakoitzak funtzio espezifiko desberdinak bete

ditzaketela. Izan ere, espermatozoideek hain egitura eta funtzio polarizatua dutenez,

seinaleztapen-sistema bakoitza beharrezkoa den zelularen alde espezifikoan kokatuko

da (Aquila eta lank., 2004; Turner, 2006).

CASAk neurtutako bestelako parametroei begiratuta, esan dezakegu µ-hartzailearen

aktibazioak espermatozoideen abiaduran eragiten duela baina ibilbideak edo higidura

motak ez dituela aldatzen eta δ-hartzailearen inaktibazioak (antagonistarekin), aldiz,

espermatozoideen abiaduraren eta ibilbideen aldaketa sortzen duela.

Doktore-tesia

Emaitzak eta eztabaida 98

3.2 Agonista eta antagonista kannabinoideen eragina espermatozoideen

mugikortasunean

• CB1 kannabinoide-hartzailearen agonista (ACEA) eta antagonista (SR

141716A) kannabinoideen eragina mugikortasunean

ACEAk, CB1 kannabinoide-hartzailearen agonista espezifikoak, denboraren eta

dosiaren menpeko eran jaitsi zuen a motako espermatozoideen ehunekoa (11.A eta B

irudiak), eta, ondorioz, d motakoen ehunekoa igo zuen. (11.A eta B irudiak). A eta D

motako mugikortasunetan aurkitutako diferentziak inkubazioaren 2. orduan (11.A

irudia) eta 10-5 M-eko kontzentrazioan (11.B irudia) adierazgarriak izan ziren. b eta c

motako mugikortasunen ehunekoek ez zuten aldaketa adierazgarririk jasan inkubazio

denboran zehar, ezta erabilitako ACEA-dosiekin ere (11.A eta B irudiak).

Gure esperimentuetan ACEAk sortutako espermatozoide ez-mugikorren ehunekoaren

igoerak hainbat lanetan CB1 hartzaileari egotzitako zeregin inhibitzailea baieztatuko

luke (Schuell and Burkman, 2005) zeren eta, ACEA oso selektiboa baita CB1

hartzailearekiko (Howlett, 2002).

Bestalde, nahiz eta denboran zehar SR 141716a CB1 antagonistaren kontzentrazio

altuenak (10-5M) b, c eta d mugikortasunetan aldaketa adierazgarririk ez zuen eragin

(12.B', C' eta D' irudiak), a motako mugimenduan eragin negatiboa sortu zuen (12.A'

irudia). Eta SR 141716a, ACEArekin batera inkubatzean, ACEAren efektu negatiboa

saihestu beharrean, a, b eta d motako mugikortasunetan dosiaren menpeko eran indartu

zuen efektu hori (12.A, B eta E irudiak).

Aurretik publikatutako beste lan batzuetan, anandamida (AEA) eta SR141716arekin

egindako inkubaketetan, AEAk efektu inhibitzailea sortu zuen eta SR 141716ak ez zuen

eraginik sortu espermatozoideen mugikortasunean. Gainera, biak batera inkubatzean,

SR 141716ak AEAren efektua saihestu zuen (Rossato, 2005; Cobellis, 2005).

Lehen komentatu dugun bezala, gure lanean SR 141716ak ez du ACEAren eragina

ekidin, eta horrek azalpen bat izan behar du. Zenbait ehunetan egindako CB1

hartzailearekiko afinitate-azterketetan, hauxe ondorioztatu da: (1) ACEA CB1-

selektiboa da eta, CB1 hartzailearekiko, SR 141716a antagonista baino afinitate

Doktore-tesia

Emaitzak eta eztabaida

Doktore-tesia

99

-5

5

15

25

35

45

55

65

0 0.5 1 2

0

10

20

30

40

50

60

0 0.5 1 20

20

40

60

a b c d

0

20

40

60

a b c d

B

Mug

ikor

tasu

na(%

)

Mugikortasun mota (OME)

E

Mug

ikor

tasu

na(%

)

Mugikortasun mota (OME)

AM

ugik

orta

suna

(%)

Denbora (orduak)

D

Mug

ikor

tasu

na(%

)

Denbora (orduak)

KontrolaACEA 10-7 MACEA 10-6 MACEA 10-5 M

KontrolaACEA 10-7 MACEA 10-6 MACEA 10-5 M

ab

cd

JWH-015 10-5 Mab

cd

JWH-015 10-5 M

ab

cd

ACEA 10-5 Mab

cd

ACEA 10-5 M

KontrolaJWH-015 10-7 MJWH-015 10-6 MJWH-015 10-5 M

KontrolaJWH-015 10-7 MJWH-015 10-6 MJWH-015 10-5 M

#

#

$

#

*

*

**

*

**

$

#

$

11. irudia: Kannabinoide-hartzaileen agonista eta antagonista kannabinoideen eragina giza espermatozoideen mugikortasunean. A) ACEA 10-5M gehitzean a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna denboran zehar (*P<0,05 versus 0 ordu; $P<0,05 versus 0 eta 0,5 orduak). B) ACEAren hainbat dosik a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna 2 orduko inkubazioa eta gero (#P<0,05 versus kontrola eta ACEA 10-7M; $P<0,05 versus mugikortasun mota horretan konparatutako gainontzeko tratamenduak). D) JWH-015 10-5M gehitzean a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna denboran zehar (*P<0,05 versus 0 ordu). E) JWH-015aren hainbat dosik a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna 2 orduko inkubazioa eta gero (#P<0,05 versus kontrola; $P<0,05 versus mugikortasun mota horretan konparatutako gainontzeko tratamenduak).

handiagoa du (Howlett, 2002). (2) AEA CB1/CB2-selektiboa da, eta, CB1

hartzailearekiko, SR 141716a baino afinitate txikiagoa du (Howlett, 2002).

Emaitzak eta eztabaida

Doktore-tesia

100

10-7 10-510-6

Kontzentrazioa (M)

Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6

Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6

Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6

A

a m

ota

(%)

B

b m

ota

(%)

C

c m

ota

(%)

D

d m

ota

(%)

B´

b m

ota

(%)

Denbora (orduak)

D´

d m

ota

(%)

Denbora (orduak)

C´

c m

ota

(%)

Denbora (orduak)

A´

a m

ota

(%)

Denbora (orduak)

0

10

20

30

40

0

10

20

30

0

10

20

30

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0

5

10

15

20

25

0 0.5 1 2

0

10

20

30

40

50

0 0.5 1 2

0

5

10

15

20

25

30

35

0 0.5 1 2

10

20

30

40

50

60

70

80

0 0.5 1 2

**

*

*

*

*

#

#

$

&

#

$

#

12. irudia: CB1 kannabinoide-hartzailearen agonistaren (ACEA) eta antagonistaren (SR141716a) efektua giza espermatozoideen mugikortasunean. A, B, C eta D) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna denboran zehar. Kontrola SR14171610-5 M; ACEA 10-5M + SR141716a 10-5 M; ACEA 10-5M (*P<0,05 versus 0 ordu). A´, B´, C´eta D´) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna kontzentrazio aldakorrekin eta 2 orduko inkubazioa eta gero (SR141716aren eta ACEArenkontzentrazio ekimolekularrak erabili ziren). Kontrola; SR141716a; ACEA + SR141716a;

ACEA (#P<0,05 versus kontzentrazio horretan konparatutako gainontzeko tratamenduak; $P<0,05 versus kontrola eta ACEA 10-5M + SR141716a 10-5 M; &P<0,05 versus kontrola eta SR141716a 10-5

M).

Emaitzak eta eztabaida 101

Beraz, afinitate horiek kontuan hartuz, erraz uler dezakegu AEA eta SR 141716a erabili

duten lanetan (Rossato, 2005; Cobellis, 2005) antagonismoa gertatzea, are gehiago

espermatozoideak antagonistarekin preinkubatu ahal izan zituztela kontuan hartzen

badugu. Aitzitik, gure lanean, ACEA eta SR 141716a (ekimolekularki) batera inkubatu

genituen. Modu horretan, ACEAk CB1 hartzaileei lotu eta aktibatu ahal izan zituen,

baina SR 141716ak CB1 hartzaileari lotzeko zailtasunak izango zituen eta, hortaz,

antagonismoa ez zen gertatu.

Dena den, alde batetik, SR 141716aren kontzentrazio altuenak (10-5 M) A

mugikortasunean eragindako efektu negatiboak adieraziko lituzke; bestetik, ACEArekin

batera inkubatzean sortutako efektu negatibo horren indarpenak SR 141716aren efektua

adieraziko luke. Horren alde, deskribatua izan da SR 141716ak, berak bakarrik, itsas

trikuaren ugalkortasunean efektu negatiboa sortzeko ahalmena duela, eta, are gehiago,

THCaren efektu negatiboa indartzeko gaitasuna duela (Berdyshev, 1998).

CASAk neurtutako bestelako parametroak aztertuz, ikus dezakegu ACEAk (10-5 M)

aldaketa sortzen zuela parametro guztietan, ibilbidearekin zerikusia zutenekin izan ezik

(LIN, STR eta WOB). Dena den, SR 141716a ACEArekin batera inkubatzean, aurrean

ikusi dugun eragin indartzaile berdina eduki zuen parametro horietan guztietan,

(3.eranskina). Beraz, badirudi CB1 hartzailearen aktibazioak, batez ere,

espermatozoideen abiaduran eragiten duela.

• CB2 kannabinoide-hartzailearen agonista (JWH-015) eta antagonista

(SR144528) kannabinoideen eragina mugikortasunean

JWH-015, CB2 kannabinoide-hartzailearen agonista espezifikoak, denboraren eta

dosiaren menpeko eran jaitsi zuen a motako espermatozoideen ehunekoa (11.D eta E

irudiak), eta b motakoen ehunekoa igo zuen. (11.D eta E irudiak). a eta b motako

mugikortasunetan aurkitutako alde horiek adierazgarriak izan ziren inkubazioaren 2.

orduan (11.D irudia) eta 10-5 M-eko kontzentrazioan (11.E irudia). c eta d motako

mugikortasunen ehunekoek ez zuten aldaketarik jasan inkubazio-denboran zehar, ezta

JWH-015 dosiekin ere (11.D eta E irudiak).

Doktore-tesia

Emaitzak eta eztabaida

Doktore-tesia

102

20

30

40

50

10

20

30

40

0 0.5 1 2

0

5

10

15

20

0 0.5 1 2

10

20

30

40

0 0.5 1 2

10-7 10-510-6

Kontzentrazioa (M)

Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6

Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6

Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6

A

a m

ota

(%)

B

b m

ota

(%)

C

c m

ota

(%)

D

d m

ota

(%)

B´

b m

ota

(%)

Denbora (orduak)

D´

d m

ota

(%)

Denbora (orduak)

C´

c m

ota

(%)

Denbora (orduak)

A´

a m

ota

(%)

Denbora (orduak)

** #

10

20

30

40

50

0

5

10

15

20

0

10

20

30

40

**

*#

20

30

40

50

60

0 0.5 1 2

13. irudia: CB2 kannabinoide-hartzailearen agonistaren (JWH-015) eta antagonistaren (SR144528) efektua giza espermatozoideen mugikortasunean. A, B, C eta D) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna denboran zehar. Kontrola SR14452810-4 M; JWH-015 10-5M + SR144528 10-5 M; JWH-015 10-5M (*P<0,05 versus 0 ordu). A´, B´, C´ eta D´) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna kontzentrazio aldakorrekin eta 2 orduko inkubazioa eta gero (SR144528ren eta JWH-015aren kontzentrazio ekimolekularrak erabili ziren). Kontrola; SR144528; JWH-015 + SR144528; JWH-015 (#P<0,05 versus kontzentrazio horretan konparatutako gainontzeko tratamenduak; $P<0,05 versus kontrola eta JWH-015 10-5M + SR144528 10-5 M; &P<0,05 versus kontrola eta SR144528 10-5 M).

Emaitzak eta eztabaida

Doktore-tesia

103

Baina, JWH-015 CB2 agonista espezifikoa SR 144528 antagonista espezifikoarekin

batera inkubatzean, agonistak sorturiko a eta b mugikortasunen ehunekoen aldaketarik

ez genuen topatu (13.A' eta B' irudiak), hau da, SR 144528 10-5 M-ak, agonistak

sorturiko eragina ekidin zuen. Gainera, SR 144528 antagonistak, bakarrik inkubatuta, ez

zuen eraginik sortu denboran zehar (13.A, B, C eta D irudiak), ezta edozein dosi

erabilita ere (13. A', B', C' eta D' irudiak). Kasu horretan ere, azpimarratu behar da

JWH-015a CB2-selektiboa dela eta, CB2 hartzailearekiko, SR 144528 antagonista baino

afinitate txikiagoa duela (Howlett, 2002).

Beraz, CB1 zein CB2 kannabinoide-hartzailearen aktibazioak A motako

espermatozoideen galera ekarri zuen. Hala ere, CB1 agonistak igo egin zuen

espermatozoide geldien kopurua, eta CB2 agonistak, berriz, B motako mugikortasuna

handitu zuen.

Beraz, laburbilduz: bi hartzaileek erakutsi duten elkarren arteko banaketa desberdinak,

batetik, eta agonista bakoitzak espermatozoideen mugikortasunean ekintza desberdina

sortu izanak, bestetik, aditzera ematen digute ezen, benetan, hartzaile bakoitzak funtzio

espezifiko desberdinak bete ditzaketela. Izan ere, opioide-hartzaileentzat esaten genuen

bezala, espermatozoideek hain egitura eta funtzio polarizatua dutenez, seinaleztapen-

sistema bakoitza beharrezkoa den zelularen alde espezifikoan kokatuko da (Aquila eta

lank., 2004; Turner, 2006).

CASAk neurtutako bestelako parametroei begiratuta, ikus dezakegu JWH-015ak (10-5

M) eragin negatiboa sortu zuela VCL eta BCFn eta ibilbidearekin lotutako LIN, STR

eta WOB parametroetan, baina SR 144528ak (10-5 M), modu adierazgarrian, soilik

VCL-ko eragina lehengoratu zuen, nahiz eta LIN, STR eta WOB parametroetan,

lehengoratzeko joera oso markatua egon (3. eranskina). Hau da, CB2 hartzaileen

aktibazioak, espermatozoideen abiadura lerromakurra jaisteaz gainera, zelula horien

ibilbideak erregula ditzake.

Eztabaida orokorra eta hipotesiak

Eztabaida orokorra eta hipotesiak 107

Tesi honen helburu orokorra izan da sistema opioide eta kannaboinoideak ugaltze-

prozesuko faseetan eduki lezaketen eraginaren inguruko ezagupena handitzea: (1)

espermatozoideetan, konposatu horientzako hartzaileen presentzia ba ote dagoen

aztertzea eta (2) espermatozoideen mugikortasunean, hartzaile horien eginkizuna zein

den jakitea. Jarraian, gaiari buruz dauden eztabaidak berrikusiz, tesian lortutako ondorio

nagusiak eztabaidatuko ditugu, eta etorkizunean zabaldu litezkeen lan-lerroak aztertuko

ditugu.

1. Garrantzitsua al da opioide- eta kannabinoide-hartzaileen mRNA mantentzea

espermatozoide helduetan?

Espermatogenesian zehar, espermatozoideek RNA espresatzen dute eta proteinatara

itzultzen dute (Boerke eta lank., 2007). Baina, behin espematogenesia bukatua,

transkripzioa isildua dute, alde batetik, nukleoko DNA oso paketatua dutelako eta,

bestetik, proteinatara itzultzeko makineria galdu dutelako (Miller eta Ostermeier, 2006).

Hala ere, ikusi dugu espermatozoide helduetan opioide- eta kannabinoide-hartzaileen

mRNA agertzen dela. Eta badirudi espermatozoide helduetan agertzen den RNA

espermatogenesian eratutako RNA izan daitekeela baina espermatozoideetan gordeta

mantendu dela (Miller eta lank., 2005).

Espermatozoide helduetan, δ opioide-hartzailearen mRNA ez da agertzen, baina κ-, µ-,

CB1 eta CB2 hartzaileen mRNAk, berriz, agertzen dira. Aldiz, proteinaren azterketa

egitean, argi frogatzen da espermatozoide helduetan aztertutako hartzaile guztiak

daudela. Horrek adieraziko luke opioide- eta kannabinoide-hartzaileen mRNAk eta

proteinak espermatogenesian zehar sortzen direla eta espermatogenesiaren azken

faseetan κ-, µ-, CB1 eta CB2 hartzaileen mRNAk gordeak izan direla baina δ-

hartzailearen mRNA, ostera, andeatu edo zitoplasmarekin batera desagertu dela.

Gainera, ez dirudi zoriz gertatzen den prozesu bat denik, zeren eta erabilitako

gizabanako guztietan agertu baita patroi berdina. Wykes-ek eta lankideek (1997) eta

Ostermeier-ek eta lankideek (2005), besteak beste, hainbat generekin egindako lanetan,

guk aipatutako RNAren andeakuntza edo galera selektiboa deskribatu zuten giza

espermatozoideetan. Lan horietan, andeakuntzatik babestuak dauden RNA-populazio

egonkorrak existitzen direla ondorioztatu zuten. Beraz, δ opioide-hartzailearen mRNA

ondorengo faseetan behar ez delako desagertuko litzateke; aldiz, κ-, µ-, CB1 eta CB2

Doktore-tesia

Eztabaida orokorra eta hipotesiak 108

hartzaileen mRNAk, betebeharren baterako beharrezkoak izan daitekeenez,

espermatozoideetan mantenduko lirateke (Miller eta lank., 2005).

Iradoki da espermatozoide helduetan gordeta geratzen den RNA horrek funtzio bat

baino gehiago izan ditzakeela: (1) kromatinaren paketatzean lagundu; (2) impronta

genomikoan parte hartu (antisense-RNA bezala); (3) proteinatara itzuli mitokondrietako

polisomen bidez; (4) obozitoaren RNA-erreserbekin batera, zigotoaren aktibazioan

lagundu ernalkuntzaren ondoren; eta (5) enbrioiaren patroi espaziala markatu (Miller eta

Ostermeier, 2006).

Ikuspegi aplikatua:

Aurrean aztertutakoaren arabera eta ikuspegi aplikatuari helduz, opioide- eta

kannabinoide-hartzaileen mRNAri dagokionez, interesgarria izan daiteke zenbait gauza

ikertzea:

- Obozitoetan, opioide- eta kannabinoide-hartzaileen mRNA eta proteinen

presentzia azter liteke. Izan ere, deskribatu da obozitoek espresatzen ez dituzten

mRNA batzuk espermatozoideek pasatzen dizkietela eta, agian, horrek aktibatu

dezakeela enbrioiaren garapena (Ostermeier eta lank., 2004). Beraz,

garrantzitsuak al dira guk aztertutako hartzaileen mRNAk enbrioien garapena

aktibatzeko?

- Halaber, aztertzekoa litzateke gizonezko batzuen espermatozoide helduetan

opioide- eta kannabinoide-hartzaileen mRNA eta proteinen presentzia. Zeren

eta, espermatozoideetan gertatzen den mRNAren galera benetan zoriz gertatzen

ez bada, hainbat “mRNA-giltza” aztertuz, gizon ugalkor eta ez-ugalkorren

“mRNA profilak” sortu ahal izango lirateke (Ostermeier eta lank., 2005).

Hortaz, garrantzitsuak al dira guk aztertutako hartzaileen mRNAk enbrioia

bideragarria izateko? Eta, beraz, garrantzitsuak al dira mRNA horiek

ugalkortasun-profilak sortzeko?

- Aurrean aipatutako mRNAren ideia hori egia bada, agian, horrek jatorri

ezezaguneko abortuei buruz zerbait argitu liezaguke.

Doktore-tesia

Eztabaida orokorra eta hipotesiak 109

2. Opioide- eta kannabinoide-hartzaileen kokalekua: beren funtzioaren adierazle?

δ-, κ-, µ-, CB1 eta CB2 hartzaileak espermatozoideen isatsean agertzeak

mugikortasunean parte hartu behar zutela pentsatzera eraman gintuen. Eta, ikusi dugun

bezala, κ opioide-hartzailearentzat susmo hori bete ez den arren, δ-, µ-, CB1 eta CB2

hartzaileek parte hartzen dute mugikortasunaren erregulazioan. Horrek baieztatu egingo

luke Turner-en berrikuspenean (2006) azaldutakoa; hau da, espermatozoideak oso

zelula zatikatuak izanda, proteina bakoitza, funtzio zehatza betetzeko, beharrezkoa den

egituran aurkitzen dela.

Bestalde, hartzaile bakoitzak kokapen-patroi nagusi bat eduki arren, beti agertzen da

espermatozoideen portzentaje bat kokapen-patroi desberdinarekin, agian,

espermatozoideen mintz plasmatikoa egoera-funtzional desberdinean aurkitzen delako,

baina, oraingoz, baieztapen hori ez dugu frogatu.

Ikuspegi aplikatua:

Aurrean aztertutakoaren arabera eta ikuspegi aplikatuari helduz, opioide- eta

kannabinoide-hartzaileen kokapenari dagokionez, interesgarria izan daiteke zenbait

gauza ikertzea:

- Erreakzio akrosomikoan parte hartzen duten proteinek akrosomaren aldean

kokatu behar badute (Turner, 2006), δ-, κ-, eta CB1 hartzaileek, erreakzio

akrosomikoan duten parte-hartzea azter liteke. Horrela bada, garrantzitsuak al

dira aipatutako hartzaileak erreakzio akrosomikoan?

- Obozitoen mintz plasmatikora lotzen diren proteinek espermatozoideen

ekuatorean egon behar badute (Solakidi eta lank., 2005; Turner, 2006), µ- eta

CB2 hartzaileek obozitoaren ezagupenean duten parte-hartzea azter liteke. Beraz,

garrantzitsuak al dira aipatutako hartzaileak obozitoaren ezagupenean?

- Azkenik, interesgarria suerta daiteke hartzaile baten kokapen-patroi

desberdinaren arrazoia zehaztea; izan ere, arrazoi fisiologikoa (espermatozoidea

aktibazio-egoera desberdinean egoteagatik) edo arrazoi patologikoa (hartzailea

Doktore-tesia

Eztabaida orokorra eta hipotesiak 110

leku desegokian kokatu delako) izan daiteke. Beraz, garrantzitsua al da

hartzaileen kokapena aztertzea, ugalkortasunik eza detektatzeko?

3. Opioide eta kannabinoideek espermatozoideen ugaltze-traktuetan zeharreko

bidaia erregulatzen dute?

Espermatozoideak testikuluetan sortzen dira, epididimoan heldu egiten dira eta, plasma

seminalarekin elkartzean, isuri egiten dira. Isuritako hazi hori baginara heltzen da, eta

espermatozoideek igeri egiten dute umetokiaren lepoko mukian gora. Umetokia

zeharkatu ostean, umetoki-tronpara sartzen dira, eta anpulura ailegatzen dira. Ibilbide

horretan espermatozoideak kapazitatu badira, anpuluan ernalketa gertatuko da

(Yanagimachi, 1994). Zeharkatzen duten ingurune bakoitzean, espermatozoideen

aktibazio- eta mugikortasun-patroia aldatuz doa espermatozoideek topatzen duten

mikroingurune bakoitzaren ezaugarri fisiko-kimikoen arabera (Mortimer, 1997). Oro

har, hau onartzen da: plasma seminalean eta umetokian (mikroinguruneak),

espermatozoideak egonkortu eta kapazitazio goiztiarra saihestuko duten molekulak

egongo dira. Gero, espermatozoideak, modu sekuentzialean, umetoki-tronpako

likidoekin, likido folikularrarekin eta granulosako zelulen jariakinekin

(mikroinguruneak) kontaktuan jarriko dira (Schuel eta lank., 2002). Leku horietan,

“kapazitazioaren aurkako” molekulen kontzentrazioa jaitsiz joango da (Cross, 1996) eta

espermatozoideak “erdikapazitazio” egoeran geratuko dira. Obulazioa gertatzean,

espermatzoideak, pixkanaka-pixkanaka, kapazitatuz joango dira ernalketa gertatu ahal

izateko (Mortimer, 1997).

Prozesu horretan guztian molekula askok parte hartzen duten arren, opioide eta

kannabinoideek ere zerikusia dutela espekula daiteke (Jin eta lank., 1988; Wang eta

lank., 2006). Hala, ugaltze-traktuko likidoetan dauden opioide eta kannabinoideen

kontzentrazio-gradienteak ikusita, iradoki dezakegu zer eginkizun bete lezaketen.

1. taulan ikus dezakegunez, espermatozoideak, likido seminalean daudenetik emearen

ugaltze-traktura heldu arte, gero eta AEA-kontzentrazio baxuagoak aurkitzen ditu, eta

horrek ahalbidetuko luke CB1 hartzailearen bidez inhibituak zeuden kapazitazioa eta

mugikortasuna aktibatzea (Maccarrone eta lank., 2005). Gainera, gure datuen arabera,

Doktore-tesia

Eztabaida orokorra eta hipotesiak 111

CB2 hartzailearen bidez inhibitua zegoen mugikortasuna ere aktiba daiteke AEAren

kontzentrazio-jaitsiera progresibo horregatik.

1. taula: Kannabinoide eta opioideen kontzentrazioak animalien gorputz-likidoetan; a) Habayeb eta lank., 2004: gizakian; b) Schuel eta lank., 2002: gizakian; d) Fraioli eta lank., 1984: gizakian; e) Sharp eta Pekary, 1980: gizakian; f) Zalata eta lank., 1995: gizakian; g) Petraglia eta lank., 1986: behian.

β-endorfina (pM)

Met-entzefalina (pM)

AEA (nM)

-

-

1,68 ± 0,16a

0,87 ± 0,09a

Plasma periferikoa♀ ♂

308,5 ± 44,5g39,7 ± 15,5g151 ± 37,7g82,5 ± 37e

12,9 ± 1,2d

44,4f2,8 ± 0,4d

471,5 ± 58,1g29,5 ± 10,1g197,5 ± 43,5g139,2 ± 8d41,3 ± 0,6d

2,9 ± 0,9b10,7 ± 2,5b-12,1 ± 2,1b-

Likido folikularra

Umetoki-tronpa

Umetokia(endometrio)

Likido seminala

β-endorfina (pM)

Met-entzefalina (pM)

AEA (nM)

-

-

1,68 ± 0,16a

0,87 ± 0,09a

Plasma periferikoa♀ ♂

308,5 ± 44,5g39,7 ± 15,5g151 ± 37,7g82,5 ± 37e

12,9 ± 1,2d

44,4f2,8 ± 0,4d

471,5 ± 58,1g29,5 ± 10,1g197,5 ± 43,5g139,2 ± 8d41,3 ± 0,6d

2,9 ± 0,9b10,7 ± 2,5b-12,1 ± 2,1b-

Likido folikularra

Umetoki-tronpa

Umetokia(endometrio)

Likido seminala

Opioideei dagokienez, alde batetik, gizakien likido seminalean eta umetokiko

endometrioan dauden Met-entzefalina eta β-endorfinaren kontzentrazioak odol plasman

daudenak baino handiagoak dira eta, bestetik, Met-entzefalinaren kontzentrazioa, β-

endorfinarena baino handiagoa da (1. taula). Behietan egindako neurketekin ikus

dezakegu, ez dagoela opioideen beheranzko kontzentrazio-gradienterik

(kannabinoideetan bezala); izan ere, umetokiko endometrioan eta likido folikularrean

baino opioide-kontzentrazio txikiagoa dago umetoki-tronpan (1. taula). Beraz,

espermatozoideek, umetoki-tronpara heltzean, opioide-kontzentrazio baxuagoa topatuko

dute, eta horrek hainbat eragin sor dezake espermatozoideetan; adibidez, deskribatu da

opioideek muskulu leunaren uzkurketa inhibitzen dutela (Kilpatrick eta Rosenthal,

1986); beraz, opioide-kontzentrazioa txikiagoa denez, umetoki-tronpako muskuluaren

uzkurketa ez da inhibituko, eta espermatozoideak errazago garraia daitezke. Gainera, µ-

hartzailearen aktibazioa jaitsiko da, eta, dauzkagun datuen arabera, mugikortasunaren

inhibizioa geldituko da. Baina harrigarria da ikustea likido folikularrean opioide-

kontzentrazioa berriro igotzen dela (1. taula) eta, gainera, handitu egiten da β-

endorfinaren kontzentrazioa, batez ere, obulazioa gertatzen denean (Petraglia eta lank.,

1985; Petraglia eta lank., 1987; Facchinetti eta lank., 1988). Beraz, badirudi β-endorfina

garrantzitsua dela obozitoaren garapenerako eta obulaziorako (Petraglia eta lank., 1985),

baina, obulazioa hastean, likido folikularra askatzen da eta umetoki-tronpara doa

(Schuel eta lank., 2002). Beraz, jakin beharko genuke nola eragiten duten opioideek

kapazitazioan eta erreakzio akrosomikoan, zeren eta, hala, ugaltze-traktuko opioideen

kontzentrazio-aldaketen zergatia ulertuko genuke.

Doktore-tesia

Eztabaida orokorra eta hipotesiak 112

Ernalketa gertatu eta gero, enbrioia umetokira garraiatu behar da, eta endometrioan

ezarriko da (Sadler, 2004). Hilekoaren faseetan eta ernaldian zehar umetokiko

endometrioan opioide eta kannabinoideek duten presentzia aztertu dutenean,

kontzentrazio-gradientearen patroi aldakorrak topatu dituzte.

Alde batetik, fase folikularretik fase luteora bitartean, AEAk odolean duen

kontzentrazioa jaisten doa eta FAAHrena handitzen doa (Habayeb eta lank., 2004;

Lazzarin eta lank., 2004). Dena den, ez dago argi kontzentrazio periferiko horiek

eragina duten ugaltze-traktuko kontzentrazioetan (Schuel eta Burkman., 2005). Baina

badirudi umetokiko “AEA-tonuak” zerikusia eduki lezakeela enbrioiaren ezarpenarekin.

Izan ere, ernalduta ez dauden saguen umetokian eta ezargunearen inguruan, AEA-maila

altuenak ikusi dira, eta AEA-maila baxuenak, berriz, enbrioiaren ezargunean eta sagu

ernalduen umetokian (Schmid eta lank., 1997). Gainera, badirudi enbrioiaren FAAH

entzima bidezko mekanismo bat dela (Habayeb eta lank., 2002). Beraz, oro har, AEA-

kontzentrazio baxuak ezarpenean laguntzen du, baina kontzentrazio altua, ordea,

kaltegarria da (Wang eta lank., 2006).

Endometrioan opioideen kontzentrazioa fase folikularretik fase luteoa arte igotzen doa

(1. taula). Gainera, proentzefalinaren mRNAren espresioa asko igotzen da umetokiko

ezargunearen inguruko zeluletan ernalketa aurrera joan ahala, baina, era berean,

txikiagoa da proentzefalinaren mRNA ezargunearen inguruko aldean ezargunearen

aldean baino (Jin eta lank., 1988; Rosen eta lank., 1990). Dena den, β-endorfinaren

mRNA ez da igotzen, eta ez dakigu mRNAren balioak peptido opioidekin bat datozen.

Beraz, oraindik ez dago guztiz argi ezarpenean opioideek duten eginkizuna.

Azaldutako guztiarekin, argi geratzen da sistema opioideak eta kannabinoideak parte

hartzen dutela ugalkortasunaren hainbat faseren erregulazioan.

Ikuspegi aplikatua:

Aztertutakoaren arabera eta ikuspegi aplikatuari helduz, ugaltze-traktuetako hartzaile

eta substantzia opioide eta kannabinoideei dagokienez, interesgarria izan daiteke zenbait

gauza ikertzea:

Doktore-tesia

Eztabaida orokorra eta hipotesiak

Doktore-tesia

113

- Emakumezkoen eta gizonezkoen (batez ere, likido seminala) ugaltze-traktuko

“tonu-opioidea” eta “tonu-kannabinoidea” ugalkortasunik ezarekin erlazionatzen

saiatzea. Opioideen kasuan, gutxien ikertutako peptidoak dinorfinatik eratorriak

dira, eta, kannabinoideen kasuan, 2AG barne-kannabinoideari buruz ia ez da

lanik egin.

- Jarraitzeko, opiazeo eta kannabinoideak aisialdi-droga moduan kontsumitzen

dutenen “ugalkortasun-egoera” azter liteke, zeren eta, odolean ez ezik agian

ugaltze-traktuan ere, opioide eta kannabinoideen tonu-aldaketak gerta

baitaitezke.

- Ildo beretik jarraituz, aztertzekoa litzateke opiazeo edo kannabinoideen erabilera

klinikoak ugalkortasunean ekar ditzakeen aldaketak.

- Azkenik, substantzia opioide eta kannabinoideek hartzaileen bidez eragiten

dutenez, ugaltze-traktuetako ehun eta zeluletako opioide- eta kannabinoide-

hartzaile mota bakoitzaren presentzia eta kopurua azter liteke eta ugalkortasunik

ezarekin erlazionatu liteke.

Azkenaldian, asko ikertzen ari da kannabinoideek ugaltze-prozesuan duten eginkizuna

eta hainbat ikerlari berrikuspen asko egiten ari dira. Aldiz, opioideek ugaltze-prozesuan

duten eginkizunaren ikerketa alboratua geratu da, eta ona litzateke 1980ko hamarkadako

lanak berreskuratu eta berrikuspen zabala egitea. Hala ere, eta bukatzeko, oso zaila da

sistema bakar batek edo bik ugalkortasunik ezaren edo ugalkortasunaren arrakastaren

zergatia azaltzea. Nolanahi ere, pauso bat izan liteke sistema horien eginkizunak

aztertzea eta konparatzea, ugaltze-prozesuaren orokortasuna ulertzeko.

Ondorioak

Ondorioak 117

1. Espermatozoide helduetan, κ eta µ opioide-hartzaileen mRNA agertzen da. Aldiz, δ

opioide-hartzailearen mRNA ez da agertzen zelula horietan.

2. Espermatozoide helduetan, δ, κ eta µ opioide-hartzaileen proteina dago, eta, isatsean

eta tarteko zatian kokatzeaz gainera, espermatozoideen buruan era bereizgarrian

kokatzen dira: buruaren aurrealdean, aurrean eta atzealdean eta atzealdean, hurrenez

hurren.

3. µ opioide-hartzailearen agonista morfina 10-7 M-ak, 3,5 orduan, modu adierazgarrian

jaisten du a+b motako mugikortasuna duten espermatozoideen ehunekoa. Horren

ondorioz, handitu egiten da espermatozoide geldien kopurua. Aldiz, µ opioide-

hartzailearen antagonista naloxona 10-4 M-ak saihestu egiten du efektu hori.

4. δ opioide-hartzailearen agonista DPDPEk ez du eraginik sortzen espermatozoideen

denboran zeharreko mugikortasunean. Aitzitik, naltrindol antagonista 10-4 M-ak,

ingurunera gehitu eta berehala, a eta b motako espermatozoideen ehunekoak modu

adierazgarrian jaisten ditu eta, horren ondorioz, igo egiten da espermatozoide geldien

ehunekoa.

5. κ opioide-hartzailearen agonista U-50488ak eta antagonista nor-binaltorfiminak ez

dute eraginik sortzen espermatozoideen denboran zeharreko mugikortasunean.

6. Espermatozoide helduetan, CB1 eta CB2 kannabinoide-hartzaileen mRNA agertzen

da.

7. Espermatozoide helduetan, CB1 eta CB2 kannabinoide-hartzaileen proteina dago eta,

isatsean eta tarteko zatian kokatzeaz gainera, espermatozoideen buruan era bereizgarrian

kokatzen dira: CB1, batez ere, buruaren aurrealdean eta CB2, batik bat, buruaren

atzealdean.

8. ACEAk, CB1 kannabinoide-hartzailearen agonista espezifikoak, a motako

espermatozoideen ehunekoa denboraren eta dosiaren menpe jaisten du, eta, horren

ondorioz, espermatozoide geldien ehunekoa igotzen du. Bestalde, CB1 antagonista SR

Doktore-tesia

Ondorioak

Doktore-tesia

118

141716 10-5M-ak, ACEArekin batera inkubatzean, agonista horren efektu negatiboa

indartzen du.

9. JWH-015ak, CB2 kannabinoide-hartzailearen agonista espezifikoak, a motako

espermatozoideen ehunekoa denboraren eta dosiaren menpe jaisten du, eta, horren

ondorioz, b motako espermatozoideen ehunekoa igotzen du. Aldiz, CB2 antagonista SR

144528ak, JWH-015-arekin batera inkubatzean, saihestu egiten du agonista horren

efektua.

Bibliografia

Bibliografia 121

Ahmed M. S., Zhou D. H., Cavinato A. G., Maulik D.: Opioid Binding-Properties of the Purified Kappa-Receptor from Human-Placenta. Life Sciences 1989, 44(13):861-871.

Aiudi G., Albrizio M., Guaricci A. C., Centoducati G., Minoia P.: Localization of

mu, delta, and kappa opioid receptors on Sparus aurata and Dicentrarchus labrax sperm cells. Book of abstracts of the Aquaculture Europe 2004, Barcelona, Spain, 2004, p 102

Albrizio M., Guaricci A. C., Maritato F., Sciorsci R. L., Mari G., Calamita G.,

Lacalandra G. M., Aiudi G. G., Minoia R., Dell'Aquila M. E., Minoia P.: Expression and subcellular localization of the mu-opioid receptor in equine spermatozoa: evidence for its functional role. Reproduction 2005, 129(1):39-49.

Albrizio M., Guaricci A. C., Calamita G., Zarrilli A., Minoia P.: Expression and

immunolocalization of the mu-opioid receptor in human sperm cells. Fertil Steril 2006, 86(6):1776-1779.

Álvarez C.: Análisis integrado de morfología y movilidad espermática humana

con el uso del Sperm Class Analyzer. Tesis Doctoral. Servei de publicacions. Universitat de València, València; 2003.

Ammer H., Schulz R.: Chronic morphine treatment increases stimulatory beta-2

adrenoceptor signaling in A431 cells stably expressing the mu opioid receptor. J Pharmacol Exp Ther 1997, 280(1):512-520.

Aquila S., Sisci D., Gentile M., Middea E., Catalano S., Carpino A., Rago V., Ando

S.: Estrogen receptor (ER)alpha and ER beta are both expressed in human ejaculated spermatozoa: evidence of their direct interaction with phosphatidylinositol-3-OH kinase/Akt pathway. J Clin Endocrinol Metab 2004, 89(3):1443-1451.

Arienti G., Carlini E., Verdacchi R., Cosmi E. V., Palmerini C. A.: Prostasome to

sperm transfer of CD13/aminopeptidase N (EC 3.4.11.2). Biochim Biophys Acta 1997a, 1336(3):533-538.

Arienti G., Polci A., Carlini E., Palmerini C. A.: Transfer of CD26/dipeptidyl

peptidase IV (E.C. 3.5.4.4) from prostasomes to sperm. FEBS Lett 1997b, 410(2-3):343-346.

Arvidsson U., Riedl M., Chakrabarti S., Vulchanova L., Lee J. H., Nakano A. H.,

Lin X. Q., Loh H. H., Law P. Y., Wessendorf M. W., Elde R.: The Kappa-Opioid Receptor Is Primarily Postsynaptic - Combined Immunohistochemical Localization of the Receptor and Endogenous Opioids. Proc Natl Acad Sci USA 1995, 92(11):5062-5066.

Ashton J. C., Friberg D., Darlington C. L., Smith P. F.: Expression of the

cannabinoid CB2 receptor in the rat cerebellum: An immunohistochemical study. Neurosci Lett 2006, 396(2):113-116.

Doktore-tesia

Bibliografia 122

Baccetti B., Burrini A. G., Collodel G., Falugi C., Moretti E., Piomboni P.: Localization of 2 Classes of Acetylcholine Receptor-Like Molecules in Sperms of Different Animal Species. Zygote 1995, 3(3):207-217.

Baker D., Pryce G., Davies W. L., Hiley C. R.: In silico patent searching reveals a

new cannabinoid receptor. Trends Pharmacol Sci 2006, 27(1):1-4. Baldi E., Luconi M., Bonaccorsi L., Forti G.: Signal transduction pathways in

human spermatozoa. J Reprod Immunol 2002, 53(1-2):121-131. Bandivdekar A. H., Segal S. J., Koide S. S.: Demonstration of Serotonin Receptors

in Isolated Spisula Oocyte Membrane. Invertebr Reprod Dev 1991, 19(2):147-150. Basuray R., Dejonge C., Zaneveld L. J. D.: Evidence for a Role of Cysteinyl

Leukotrienes in Mouse and Human Sperm Function. J Androl 1990, 11(1):47-51. Bedford J. M.: Significance of the Need for Sperm Capacitation before

Fertilization in Eutherian Mammals. Biol Reprod 1983, 28(1):108-120. Begg M., Pacher P., Batkai S., Osei-Hyiaman D., Offertaler L., Mo F. M., Liu H.,

Kunos G.: Evidence for novel cannabinoid receptors. Pharmacol Therapeut 2005, 106(2):133-145.

Beltramo M., Stella N., Calignano A., Lin S. Y., Makriyannis A., Piomelli D.:

Functional role of high-affinity anandamide transport, as revealed by selective inhibition. Science 1997, 277(5329):1094-1097.

Berdyshev E. V.: Inhibition of sea urchin fertilization by fatty acid ethanolamides

and cannabinoids. Comp Biochem Phys C 1999, 122(3):327-330. Blazquez C., Casanova M. L., Planas A., del Pulgar T. G., Villanueva C.,

Fernandez-Acenero M. J., Aragones J., Huffman J. W., Jorcano J. L., Guzman M.: Inhibition of tumor angiogenesis by cannabinoids. FASEB J 2003, 17(1):529-531.

Blazquez C., Carracedo A., Barrado L., Real P. J., Fernandez-Luna J. L., Velasco

G., Malumbres M., Guzman M.: Cannabinoid receptors as novel targets for the treatment of melanoma. FASEB J 2006, 20(14):2633-2635.

Boerke A., Dieleman S. J., Gadella B. M.: A possible role for sperm RNA in early

embryo development. Theriogenology 2007, 68:S147-S155. Bonhaus D. W., Chang L. K., Kwan J., Martin G. R.: Dual activation and

inhibition of adenylyl cyclase by cannabinoid receptor agonists: Evidence for agonist-specific trafficking of intracellular responses. J Pharmacol Exp Ther 1998, 287(3):884-888.

Borner C., Kraus J., Schroder H., Ammer H., Hollt V.: Transcriptional regulation

of the human mu-opioid receptor gene by interleukin-6. Mol Pharmacol 2004, 66(6):1719-1726.

Doktore-tesia

Bibliografia 123

Borner C., Hollt V., Kraus J.: Cannabinoid receptor type 2 Agonists induce transcription of the mu-opioid receptor gene in Jurkat T cells. Mol Pharmacol 2006, 69(4):1486-1491.

Borner C., Hollt V., Sebald W., Kraus J.: Transcriptional regulation of the

cannabinoid receptor type 1 gene in T cells by cannabinoids. J Leukocyte Biol 2007, 81(1):336-343.

Bradford M. M.: Rapid and Sensitive Method for Quantitation of Microgram

Quantities of Protein Utilizing Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry 1976, 72(1-2):248-254.

Browder L. W., Erickson, C. A., Jeffery, W. R.: Developmental Biology, 3.

argitalpena. Saunders College Publishing argitaletxea, New York; 1991. Brown S. M., Wager-Miller J., Mackie K.: Cloning and molecular characterization

of the rat CB2 cannabinoid receptor. Biochim Biophys Acta 2002, 1576(3):255-264. Buckley N. E., Hansson S., Harta G., Mezey E.: Expression of the CB1 and CB2

receptor messenger RNAs during embryonic development in the rat. Neuroscience 1998, 82(4):1131-1149.

Burkman L. J.: Characterization of Hyperactivated Motility by Human-

Spermatozoa During Capacitation - Comparison of Fertile and Oligozoospermic Sperm Populations. Arch Andrology 1984, 13(2-3):153-165.

Cabral G. A., Harmon K. N., Carlisle S. J.: Cannabinoid-mediated inhibition of

inducible nitric oxide production by rat microglial cells: Evidence for CB1 receptor participation. Adv Exp Med Biol 2001, 493:207-214.

Carracedo A., Gironella M., Lorente M., Garcia S., Guzman M., Velasco G.,

Iovanna J. L.: Cannabinoids induce apoptosis of pancreatic tumor cells via endoplasmic reticulum stress-related genes. Cancer Research 2006a, 66(13):6748-6755.

Carracedo A.: Acción antitumoral de los cannabinoides: implicación de p8 y la

vía de estrés de retículo endoplásmico. Tesis Doctoral. Universidad Complutense de Madrid, Madrid; 2006b.

Chakrabarti S., Yang W. L., Law P. Y., Loh H. H.: The mu-opioid receptor down-

regulates differently from the delta-opioid receptor: Requirement of a high affinity receptor G protein complex formation. Mol Pharmacol 1997, 52(1):105-113.

Chang M. C., Berkery D., Schuel R., Laychock S. G., Zimmerman A. M.,

Zimmerman S., Schuel H.: Evidence for a cannabinoid receptor in sea urchin sperm and its role in blockade of the acrosome reaction. Mol Reprod Dev 1993, 36(4):507-516.

Chang K. J., Hazum E., Cuatrecasas P.: Novel Opiate Binding-Sites Selective for

Benzomorphan Drugs. P Natl Acad Sci-Biol 1981, 78(7):4141-4145.

Doktore-tesia

Bibliografia 124

Chen Y., Mestek A., Liu J., Yu L.: Molecular-Cloning of a Rat Kappa-Opioid Receptor Reveals Sequence Similarities to the Mu-Opioid and Delta-Opioid Receptors. Biochem J 1993, 295:625-628.

Christoffers K. H., Li H., Keenan S. A., Howells R. D.: Purification and mass

spectrometric analysis of the mu opioid receptor. Mol Brain Res 2003, 118(1-2):119-131.

Christoffers K. H., Li H., Howells R. D.: Purification and mass spectrometric

analysis of the delta opioid receptor. Mol Brain Res 2005, 136(1-2):54-64. Cicero T. J., Meyer E. R., Wiest W. G., Olney J. W., Bell R. D.: Effects of Chronic

Morphine Administration on Reproductive-System of Male Rat. J Pharmacol Exp Ther 1975, 192(3):542-548.

Claude P. A., Wotta D. R., Zhang X. H., Prather P. L., McGinn T. M., Erickson L.

J., Loh H. H., Law P. Y.: Mutation of a conserved serine in TM4 of opioid receptors confers full agonistic properties to classical antagonists. Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93(12):5715-5719.

Cobellis G., Cacciola G., Scarpa D., Meccariello R., Chianese R., Franzoni M. F.,

Mackie K., Pierantoni R., Fasano S.: Endocannabinoid system in frog and rodent testis: type-1 cannabinoid receptor and fatty acid amide hydrolase activity in male germ cells. Biol Reprod 2006, 75(1):82-89.

Comb M., Seeburg P. H., Adelman J., Eiden L., Herbert E.: Primary Structure of

the Human Met-Enkephalin and Leu-Enkephalin Precursor and Its Messenger-Rna. Nature 1982, 295(5851):663-666.

Corchero J., Romero J., Berrendero F., Fernandez-Ruiz J., Ramos J. A., Fuentes J.

A., Manzanares J.: Time-dependent differences of repeated administration with Delta(9)-tetrahydrocannabinol in proenkephalin and cannabinoid receptor gene expression and G-protein activation by mu-opioid and CB1-cannabinoid receptors in the caudate-putamen. Mol Brain Res 1999, 67(1):148-157.

Cosentino M. J., Cockett A. T.: Structure and function of the epididymis. Urol Res

1986, 14(5):229-240. Cota D., Marsicano G., Lutz B., Vicennati V., Stalla G. K., Pasquali R., Pagotto U.:

Endogenous cannabinoid system as a modulator of food intake. Int J Obesity 2003, 27(3):289-301.

Crain S. M., Shen K. F.: Opioids Can Evoke Direct Receptor-Mediated Excitatory

Effects on Sensory Neurons. Trends Pharmacol Sci 1990, 11(2):77-81. Cravatt B. F., Demarest K., Patricelli M. P., Bracey M. H., Giang D. K., Martin B.

R., Lichtman A. H.: Supersensitivity to anandamide and enhanced endogenous cannabinoid signaling in mice lacking fatty acid amide hydrolase. Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98(16):9371-9376.

Doktore-tesia

Bibliografia 125

Cross N. L.: Human seminal plasma prevents sperm from becoming acrosomally responsive to the agonist, progesterone: cholesterol is the major inhibitor. Biol Reprod 1996, 54(1):138-145.

Croxford J. L., Yamamura T.: Cannabinoids and the immune system: Potential for

the treatment of inflammatory diseases? J Neuroimmunol 2005, 166(1-2):3-18. Davidson A., Vermesh M., Paulson R. J., Graczykowski J. W., Lobo R. A.:

Presence of immunoreactive beta-endorphin and calcitonin in human seminal plasma, and their relation to sperm physiology. Fertil Steril 1989, 51(5):878-880.

De Jesus M. L., Salles J., Meana J. J., Callado L. F.: Characterization of CB1

cannabinoid receptor immunoreactivity in postmortem human brain homogenates. Neuroscience 2006, 140(2):635-643.

de Miguel R., Romero J., Munoz R. M., Garcia-Gil L., Gonzalez S., Villanua M. A.,

Makriyannis A., Ramos J. A., Fernandez-Ruiz J. J.: Effects of cannabinoids on prolactin and gonadotrophin secretion: involvement of changes in hypothalamic gamma-aminobutyric acid (GABA) inputs. Biochem Pharmacol 1998, 56(10):1331-1338.

Devane W. A., Hanus L., Breuer A., Pertwee R. G., Stevenson L. A., Griffin G.,

Gibson D., Mandelbaum A., Etinger A., Mechoulam R.: Isolation and Structure of a Brain Constituent That Binds to the Cannabinoid Receptor. Science 1992, 258(5090):1946-1949.

Di Carlo G., Izzo A. A.: Cannabinoids for gastrointestinal diseases: potential

therapeutic applications. Expert Opin Inv Drug 2003, 12(1):39-49. Di Marzo V.: 'Endocannabinoids' and other fatty acid derivatives with

cannabimimetic properties: biochemistry and possible physiopathological relevance. Bba-Lipid Lipid Met 1998, 1392(2-3):153-175.

Dimarzo V., Fontana A., Cadas H., Schinelli S., Cimino G., Schwartz J. C., Piomelli

D.: Formation and Inactivation of Endogenous Cannabinoid Anandamide in Central Neurons. Nature 1994, 372(6507):686-691.

Dinh T. P., Carpenter D., Leslie F. M., Freund T. F., Katona I., Sensi S. L., Kathuria

S., Piomelli D.: Brain monoglyceride lipase participating in endocannabinoid inactivation. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99(16):10819-10824.

Dudeck W. R., Fix J. D.: High-Yield (Embryology) 3. argitalpena. Lippincott

Williams & Wilkins argitaletxea, Philadelphia; 2004. El-Haggar S., El-Ashmawy S., Attia A., Mostafa T., Roaiah M. M. F., Fayez A.,

Ghazi S., Zohdy W., Roshdy N.: Beta-endorphin in serum and seminal plasma in infertile men. Asian J Androl 2006, 8(6):709-712.

Elde R., Arvidsson U., Riedl M., Vulchanova L., Lee J. H., Dado R., Nakano A.,

Chakrabarti S., Zhang X., Loh H. H., Law P. Y., Hokfelt T., Wessendorf M.:

Doktore-tesia

Bibliografia 126

Distribution of Neuropeptide Receptors - New Views of Peptidergic Neurotransmission Made Possible by Antibodies to Opioid Receptors. Ann Ny Acad Sci 1995, 757:390-404.

ElSohly M. A., Slade D.: Chemical constituents of marijuana: The complex

mixture of natural cannabinoids. Life Sciences 2005, 78(5):539-548. Fabbri A., Tsaimorris C. H., Luna S., Fraioli F., Dufau M. L.: Opiate Receptors Are

Present in the Rat Testis - Identification and Localization in Sertoli Cells. Endocrinology 1985, 117(6):2544-2546.

Fabbri A., Jannini E. A., Gnessi L., Ulisse S., Moretti C., Isidori A.:

Neuroendocrine control of male reproductive function. The opioid system as a model of control at multiple sites. J Steroid Biochem 1989, 32(1B):145-150.

Facchinetti F., Storchi A. R., Petraglia F., Volpe A., Genazzani A. R.: Expression of

Proopiomelanocortin-Related Peptides in Human Follicular-Fluid. Peptides 1988, 9(5):1089-1092.

Fang L., Knapp R. J., Horvath R., Matsunaga T. O., Haaseth R. C., Hruby V. J.,

Porreca F., Yamamura H. I.: Characterization of [H-3] Naltrindole Binding to Delta-Opioid Receptors in Mouse-Brain and Mouse Vas-Deferens - Evidence for Delta-Opioid Receptor Heterogeneity. J Pharmacol Exp Ther 1994, 268(2):836-846.

Fattore L., Deiana S., Spano S. M., Cossu G., Fadda P., Scherma M., Fratta W.:

Endocannabinoid system and opioid addiction: Behavioural aspects. Pharmacol Biochem Be 2005, 81(2):343-359.

Fernandez D., Valdivia A., Irazusta J., Ochoa C., Casis L.: Peptidase activities in

human semen. Peptides 2002, 23(3):461-468. Fields A., Same Y.: The stimulatory effect of opioids on cyclic amp production in

SK-N-SH cells is mediated by calcium ions. Life Sciences 1997, 61(6):595-602. Filppula S., Yaddanapudi S., Mercier R., Xu W., Pavlopoulos S., Makriyannis A.:

Purification and mass spectroscopic analysis of human CB2 cannabinoid receptor expressed in the baculovirus system. J Pept Res 2004, 64(6):225-236.

Flesch F. M., Colenbrander B., van Golde L. M., Gadella B. M.: Capacitation

induces tyrosine phosphorylation of proteins in the boar sperm plasma membrane. Biochem Biophys Res Commun 1999, 262(3):787-792.

Flesch F. M., Gadella B. M.: Dynamics of the mammalian sperm plasma

membrane in the process of fertilization. Biochim Biophys Acta 2000, 1469(3):197-235.

Florez J.: Farmacología humana, 3. argitalpena, Masson argitaletxea. Barcelona;

1998.

Doktore-tesia

Bibliografia 127

Focarelli R., Giuffrida A., Capparelli S., Scibona M., Fabris F. M., Francavilla F., Francavilla S., Giovampaola C. D., Rosati F.: Specific localization in the equatorial region of gp20, a 20 kDa sialylglycoprotein of the capacitated human spermatozoon acquired during epididymal transit which is necessary to penetrate zona-free hamster eggs. Mol Hum Reprod 1998, 4(2):119-125.

Foresta C., Tramarin A., Scandellari C., Arslan P.: Effects of a met-enkephalin

analogue on motility, O2 consumption, and ATP content of human spermatozoa. Arch Androl 1985, 14(2-3):247-252.

Foresta C., Caretto A., Indino M., Betterle C., Scandellari C.: Localization of met-

enkephalin on human spermatozoa and evidence for its physiological role. Arch Androl 1986, 17(1):19-24.

Fraioli F., Fabbri A., Gnessi L., Silvestroni L., Moretti C., Redi F., Isidori A.: Beta-

endorphin, Met-enkephalin, and calcitonin in human semen: evidence for a possible role in human sperm motility. Ann N Y Acad Sci 1984, 438:365-370.

Fraser L. R., Adeoya-Osiguwa S.: Modulation of adenylyl cyclase by FPP and

adenosine involves stimulatory and inhibitory adenosine receptors and G proteins. Mol Reprod Dev 1999, 53(4):459-471.

Fujisawa M., Kanzaki M., Okada H., Arakawa S., Kamidono S.: Metenkephalin in

seminal plasma of infertile men. Int J Urol 1996, 3(4):297-300. Fukuda K., Kato S., Mori K.: Location of Regions of the Opioid Receptor Involved

in Selective Agonist Binding. J Biol Chem 1995, 270(12):6702-6709. Galiegue S., Mary S., Marchand J., Dussossoy D., Carriere D., Carayon P.,

Bouaboula M., Shire D., Le Fur G., Casellas P.: Expression of central and peripheral cannabinoid receptors in human immune tissues and leukocyte subpopulations. Eur J Biochem 1995, 232(1):54-61.

Gammon C. M., Freeman G. M., Xie W. H., Petersen S. L., Wetsel W. C.:

Regulation of gonadotropin-releasing hormone secretion by cannabinoids. Endocrinology 2005, 146(10):4491-4499.

Gaoni Y., Mechoulam R.: Isolation Structure + Partial Synthesis of Active

Constituent of Hashish. J Am Chem Soc 1964, 86(8):1646-1647 Gatti J. L., Castella S., Dacheux F., Ecroyd H., Metayer S., Thimon V., Dacheux J.

L.: Post-testicular sperm environment and fertility. Anim Reprod Sci 2004, 82-83:321-339.

Gerendai I.: Modulation of testicular functions by testicular opioid peptides. J

Physiol Pharmacol 1991, 42(4):427-437. Giang D. K., Cravatt B. F.: Molecular characterization of human and mouse fatty

acid amide hydrolases. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94(6):2238-2242.

Doktore-tesia

Bibliografia 128

Giri M., Kaufman J. M.: Opioidergic Modulation of in-Vitro Pulsatile Gonadotropin-Releasing-Hormone Release from the Isolated Medial Basal Hypothalamus of the Male Guinea-Pig. Endocrinology 1994, 135(5):2137-2143.

Glaser S. T., Abumrad N. A., Fatade F., Kaczocha M., Studholme K. M., Deutsch

D. G.: Evidence against the presence of an anandamide transporter. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100(7):4269-4274.

Goldberg I. E., Rossi G. C., Letchworth S. R., Mathis J. P., Ryan-Moro J.,

Leventhal L., Su W., Emmel D., Bolan E. A., Pasternak G. W.: Pharmacological characterization of endomorphin-1 and endomorphin-2 in mouse brain. J Pharmacol Exp Ther 1998, 286(2):1007-1013.

Golech S. A., McCarron R. M., Chen Y., Bembry J., Lenz F., Mechoulam R.,

Shohami E., Spatz M.: Human brain endothelium: coexpression and function of vanilloid and endocannabinoid receptors. Mol Brain Res 2004, 132(1):87-92.

Guyton A.C., Hall J. E.: Tratado de fisiología médica, 9. argitalpena. McGraw-Hill

interamericana argitaletxea, Madrid; 1997. Gye M. C., Kang H. H., Kang H. J.: Expression of cannabinoid receptor 1 in

mouse testes. Arch Androl 2005, 51(3):247-255. Habayeb O. M. H., Bell S. C., Konje J. C.: Endogenous cannabinoids: Metabolism

and their role in reproduction. Life Sciences 2002, 70(17):1963-1977. Habayeb O. M. H., Taylor A. H., Evans M. D., Cooke M. S., Taylor D. J., Bell S.

C., Konje J. C.: Plasma levels of the endocannabinoid anandamide in women - A potential role in pregnancy maintenance and labor? J Clin Endocr Metab 2004, 89(11):5482-5487.

Harclerode J.: Endocrine effects of marijuana in the male: preclinical studies.

NIDA Res Monogr 1984, 44:46-64. Harrison R. A. P.: Capacitation mechanisms, and the role of capacitation as seen

in eutherian mammals. Reprod Fert Develop 1996, 8(4):581-594. Hembree W., Nahas G., Zeidenberg P.: Oligospermia in Cannabis Smokers. Sem

Hop Therapeut 1976, 52(7-8):425-425. Herkenham M., Lynn A. B., Little M. D., Johnson M. R., Melvin L. S., Decosta B.

R., Rice K. C.: Cannabinoid Receptor Localization in Brain. Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87(5):1932-1936.

Herrera B., Carracedo A., Diez-Zaera M., Guzman M., Velasco G.: P38 MAPK is

involved in CB2 receptor-induced apoptosis of human leukaemia cells. FEBS Lett 2005, 579(22):5084-5088.

Doktore-tesia

Bibliografia 129

Herrera B., Carracedo A., Diez-Zaera M., del Pulgar T. G., Guzman M., Velasco G.: The CB2 cannabinoid receptor signals apoptosis via ceramide-dependent activation of the mitochondrial intrinsic pathway. Exp Cell Res 2006, 312(11):2121-2131.

Hillard C. J., Edgemond W. S., Jarrahian A., Campbell W. B.: Accumulation of N-

arachidonoylethanolamine (anandamide) into cerebellar granule cells occurs via facilitated diffusion. J Neurochem 1997, 69(2):631-638.

Hillard C. J., Jarrahian A.: Cellular accumulation of anandamide: consensus and

controversy. Brit J Pharmacol 2003, 140(5):802-808. Hollandmoritz H., Krause W.: Semen Analysis and Fertility Prognosis in

Andrological Patients. International J Androl 1992, 15(6):473-484. Hong C. Y., Desaintonge D. M. C., Turner P., Fairbairn J. W.: Comparison of the

Inhibitory-Action of Delta-9-Tetrahydrocannabinol and Petroleum Spirit Extract of Herbal Cannabis on Human-Sperm Motility. Hum Toxicol 1982, 1(2):151-154.

Howlett A. C., Barth F., Bonner T. I., Cabral G., Casellas P., Devane W. A., Felder

C. C., Herkenham M., Mackie K., Martin B. R., Mechoulam R., Pertwee R. G.: International Union of Pharmacology. XXVII. Classification of cannabinoid receptors. Pharmacol Rev 2002, 54(2):161-202.

Hughes J., Kosterlitz H. W.: Opioid-Peptides - Introduction. Brit Med Bull 1983,

39(1):1-3. Hunter J. C., Leighton G. E., Meecham K. G., Boyle S. J., Horwell D. C., Rees D.

C., Hughes J.: Ci-977, a Novel and Selective Agonist for the Kappa-Opioid Receptor. Brit J Pharmacol 1990, 101(1):183-189.

Ignotz G. G., Suarez S. S.: Calcium/calmodulin and calmodulin kinase II

stimulate hyperactivation in demembranated bovine sperm. Biol Reprod 2005, 73(3):519-526.

Inaba K.: Molecular architecture of the sperm flagella: Molecules for motility and

signaling. Zool Sci 2003, 20(9):1043-1056. Irazusta J., Valdivia A., Fernandez D., Agirregoitia E., Ochoa C., Casis L.:

Enkephalin-degrading enzymes in normal and subfertile human semen. J Androl 2004, 25(5):733-739.

Iversen L. L.: Overview: peptides in the nervous system. Neuropeptides and their

peptidases-ean. Turner A. J. Ellis Horwood Ltd. argitaletxea, Chichester; 1987. Jenab S., Morris P. L.: Interleukin-6 regulation of kappa opioid receptor gene

expression in primary Sertoli cells. Endocrine 2000, 13(1):11-15. Jequier A. M., Crich J.: Semen analysis: a practical guide. Blackwell Scientific

publications, Oxford; 1986.

Doktore-tesia

Bibliografia 130

Jin D. F., Muffly K. E., Okulicz W. C., Kilpatrick D. L.: Estrous Cycle-Related and Pregnancy-Related Differences in Expression of the Proenkephalin and Proopiomelanocortin Genes in the Ovary and Uterus. Endocrinology 1988, 122(4):1466-1471.

Jordan B., Devi L. A.: Molecular mechanisms of opioid receptor signal

transduction. Brit J Anaesth 1998, 81(1):12-19. Jordan B. A., Cvejic S., Devi L. A.: Opioids and their complicated receptor

complexes. Neuropsychopharmacology 2000, 23(4):S5-S18. Jordan B. A., Trapaidze N., Gomes I., Nivarthi R., Devi L. A.: Oligomerization of

opioid receptors with beta(2)-adrenergic receptors: A role in trafficking and mitogen-activated protein kinase activation. Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98(1):343-348.

Kakidani H., Furutani Y., Takahashi H., Noda M., Morimoto Y., Hirose T., Asai M.,

Inayama S., Nakanishi S., Numa S.: Cloning and Sequence-Analysis of Cdna for Porcine Beta-Neo-Endorphin Dynorphin Precursor. Nature 1982, 298(5871):245-249.

Kalra S. P., Allen L. G., Sahu A., Kalra P. S., Crowley W. R.: Gonadal-Steroids

and Neuropeptide-Y Opioid Lhrh Axis - Interactions and Diversities. J Steroid Biochem Mol Biol 1988, 30(1-6):185-193.

Kaminski N. E., Abood M. E., Kessler F. K., Martin B. R., Schatz A. R.:

Identification of a Functionally Relevant Cannabinoid Receptor on Mouse Spleen-Cells That Is Involved in Cannabinoid-Mediated Immune Modulation. Mol Pharmacol 1992, 42(5):736-742.

Kew D., Muffly K. E., Kilpatrick D. L.: Proenkephalin products are stored in the

sperm acrosome and may function in fertilization. Proc Natl Acad Sci U S A 1990, 87(23):9143-9147.

Kilpatrick D. L., Rosenthal J. L.: The Proenkephalin Gene Is Widely Expressed

within the Male and Female Reproductive Systems of the Rat and Hamster. Endocrinology 1986, 119(1):370-374.

Kraemer M., Fillion C., Martin-Pont B., Auger J.: Factors influencing human

sperm kinematic measurements by the Celltrak computer-assisted sperm analysis system. Hum Reprod 1998, 13(3):611-619.

Kraus J., Borner C., Giannini E., Hollt V.: The role of nuclear factor kappa B in

tumor necrosis factor-regulated transcription of the human mu-opioid receptor gene. Mol Pharmacol 2003, 64(4):876-884.

Kumar G., Patel D., Naz R. K.: C-Myc Messenger-Rna Is Present in Human

Sperm Cells. Cell Mol Biol Res 1993, 39(2):111-117. Lauckner J. E., Hille B., Mackie K.: The cannabinoid agonist WIN55,212-2

increases intracellular calcium via CB1 receptor coupling to G(q/11) G proteins. Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102(52):19144-19149.

Doktore-tesia

Bibliografia 131

Lawrence D. K., Gill E. W.: Effects of Delta1-Tetrahydrocannabinol and Other

Cannabinoids on Spin-Labeled Liposomes and Their Relationship to Mechanisms of General Anesthesia. Mol Pharmacol 1975, 11(5):595-602.

Lee C. Y. G., Ho J., Chow S. N., Yasojima K., Schwab C., McGeer P. L.:

Immunoidentification of gonadotropin releasing hormone receptor in human sperm, pituitary and cancer cells. Am J Reprod Immunol 2000, 44(3):170-177.

Lemaire S., Magnan J., Regoli D.: Rat Vas-Deferens - Specific Bioassay for

Endogenous Opioid Peptides. Brit J Pharmacol 1978, 64(3):327-329. Leslie F. M.: Methods Used for the Study of Opioid Receptors. Pharmacol Rev

1987, 39(3):197-249. Leung D., Saghatelian A., Simon G. M., Cravatt B. F.: Inactivation of N-acyl

phosphatidylethanolamine phospholipase D reveals multiple mechanisms for the biosynthesis of endocannabinoids. Biochemistry 2006, 45(15):4720-4726.

Liu J., Gao B., Mirshahi F., Sanyal A. J., Khanolkar A. D., Makriyannis A., Kunos

G.: Functional CB1 cannabinoid receptors in human vascular endothelial cells. Biochem J 2000, 346:835-840.

Lord J. A. H., Waterfield A. A., Hughes J., Kosterlitz H. W.: Endogenous Opioid

Peptides - Multiple Agonists and Receptors. Nature 1977, 267(5611):495-499.

Lorenzo P, Ladero J. M., Leza J. C., Lizasoain I.: Drogodependencias. Panamericana argitaletxea, Madrid; 1999.

Luconi M., Bonaccorsi L., Maggi N., Pecchioli P., Krausz C., Forti G., Baldi E.:

Identification and characterization of functional nongenomic progesterone receptors on human sperm membrane. J Clin Endocr Metab 1998, 83(3):877-885.

Maccarrone M., Cecconi S., Rossi G., Battista N., Pauselli R., Finazzi-Agro A.:

Anandamide activity and degradation are regulated by early postnatal aging and follicle-stimulating hormone in mouse Sertoli cells. Endocrinology 2003, 144(1):20-28.

Maccarrone M., Barboni B., Paradisi A., Bernabo N., Gasperi V., Pistilli M. G.,

Fezza F., Lucidi P., Mattioli M.: Characterization of the endocannabinoid system in boar spermatozoa and implications for sperm capacitation and acrosome reaction. J Cell Sci 2005, 118(Pt 19):4393-4404.

Maccarrone M.: CB(2) receptors in reproduction. Br J Pharmacol 2007. Makriyannis A., Tian X. Y., Guo H. X.: How lipophilic cannabinergic ligands

reach their receptor sites. Prostag Oth Lipid M 2005, 77(1-4):210-218.

Doktore-tesia

Bibliografia 132

Mansour A., Fox C. A., Thompson R. C., Akil H., Watson S. J.: Mu-Opioid Receptor Messenger-Rna Expression in the Rat Cns - Comparison to Mu-Receptor Binding. Brain Research 1994, 643(1-2):245-265.

Mari G., Rizzato G., Iacono E., Merlo B., Minoia R., Belluzzi S.: Effects of beta-

endorphin and naloxone on motility of cooled equine spermatozoa. Anim Reprod Sci 2005, 89(1-4):223-225.

Marigomez I., Cajaraville M. P.: Zelula. Udako Euskal Unibertsitatea argitaletxea,

Bilbo. 1999. Mato S., Del Olmo E., Pazos A.: Ontogenetic development of cannabinoid receptor

expression and signal transduction functionality in the human brain. Eur J Neurosci 2003, 17(9):1747-1754.

Matsuda L. A., Lolait S. J., Brownstein M. J., Young A. C., Bonner T. I.: Structure

of a cannabinoid receptor and functional expression of the cloned cDNA. Nature 1990, 346(6284):561-564.

McPartland J. M.: Phylogenomic and chemotaxonomic analysis of the

endocannabinoid system. Brain Res Rev 2004, 45(1):18-29. Mechoulam R., Benshabat S., Hanus L., Ligumsky M., Kaminski N. E., Schatz A.

R., Gopher A., Almog S., Martin B. R., Compton D. R., Pertwee R. G., Griffin G., Bayewitch M., Barg J., Vogel Z.: Identification of an Endogenous 2-Monoglyceride, Present in Canine Gut, That Binds to Cannabinoid Receptors. Biochem Pharmacol 1995, 50(1):83-90.

Meizel S., Turner K. O.: Serotonin or Its Agonist 5-Methoxytryptamine Can

Stimulate Hamster Sperm Acrosome Reactions in a More Direct Manner Than Catecholamines. J Exp Zool 1983, 226(1):171-174.

Meizel S.: The sperm, a neuron with a tail: 'neuronal' receptors in mammalian

sperm. Biol Rev Camb Philos Soc 2004, 79(4):713-732. Meizel S., Son J. H.: Studies of sperm from mutant mice suggesting that two

neurotransmitter receptors are important to the zona pellucida-initiated acrosome reaction. Mol Reprod Dev 2005, 72(2):250-258.

Mejean A., Hawkinson J., Guthapfel R., Goeldner M., Hirth C.: A Photoactivatable

Naltrexone Derivative Labels Glycoproteins of Different Molecular-Weight Corresponding to the Mu-Opioid and Kappa-Opioid Receptors. Biochemistry 1992, 31(40):9685-9693.

Metcalf M. D., Coop A.: Kappa opioid antagonists: Past successes and future

prospects. Aaps J 2005, 7(3):E704-E722. Miller D., Ostermeier G. C., Krawetz S. A.: The controversy, potential and roles of

spermatozoal RNA. Trends Mol Med 2005, 11(4):156-163.

Doktore-tesia

Bibliografia 133

Miller D., Ostermeier G. C.: Towards a better understanding of RNA carriage by ejaculate spermatozoa. Hum Reprod Update 2006, 12(6):757-767.

Minami M., Satoh M.: Molecular-Biology of the Opioid Receptors - Structures,

Functions and Distributions. Neurosci Res 1995, 23(2):121-145. Minami M., Nakagawa T., Seki T., Onogi T., Aoki Y., Katao Y., Katsumata S.,

Satoh M.: A single residue, Lys108, of the delta-opioid receptor prevents the mu-opioid-selective ligand [D-Ala(2),N-MePhe(4),Gly-ol(5)]enkephalin from binding to the delta-opioid receptor. Mol Pharmacol 1996, 50(5):1413-1422.

Minelli A., Miscetti P., Proietti A., Luzi L., Mezzasoma I.: Adenosine-Triphosphate

Catabolism in Bovine Spermatozoa. Comp Biochem Phys B 1995, 110(3):605-611. Molina-Holgado E., Vela J. M., Arevalo-Martin A., Almazan G., Molina-Holgado

F., Borrell J., Guaza C.: Cannabinoids promote oligodendrocyte progenitor survival: Involvement of cannabinoid receptors and phosphatidylinositol-3 kinase/Akt signaling. J Neurosci 2002, 22(22):9742-9753.

Mollereau C., Parmentier M., Mailleux P., Butour J. L., Moisand C., Chalon P.,

Caput D., Vassart G., Meunier J. C.: Orl1, a Novel Member of the Opioid Receptor Family - Cloning, Functional Expression and Localization. FEBS Lett 1994, 341(1):33-38.

Mortimer S. T.: A critical review of the physiological importance and analysis of

sperm movement in mammals. Hum Reprod Update 1997, 3(5):403-439. Mortimer S. T.: CASA--practical aspects. J Androl 2000, 21(4):515-524. Munkelwitz R., Gilbert B. R.: Are boxer shorts really better? A critical analysis of

the role of underwear type in male subfertility. J Urol 1998, 160(4):1329-1333. Munro S., Thomas K. L., Abu-Shaar M.: Molecular characterization of a

peripheral receptor for cannabinoids. Nature 1993, 365(6441):61-65. Nakanishi S., Inoue A., Kita T., Nakamura M., Chang A. C. Y., Cohen S. N., Numa

S.: Nucleotide-Sequence of Cloned Cdna for Bovine Corticotropin-Beta-Lipotropin Precursor. Nature 1979, 278(5703):423-427.

Naz R. K., Sellamuthu R.: Receptors in spermatozoa: Are they real? J Androl

2006, 27(5):627-636. Nelson L., Cariello L.: Adrenergic-Stimulation of Sea-Urchin Sperm Cells.

Gamete Res 1989, 24(3):291-302. Neudeck B. L., Loeb J., Buck J.: Activation of the kappa-opioid receptor in Caco-2

cells decreases interleukin-8 secretion. Eur J Pharmacol 2003, 467(1-3):81-84. Nunez E., Benito C., Pazos M. R., Barbachano A., Fajardo O., Gonzalez S., Tolon

R. M., Romero J.: Cannabinoid CB2 receptors are expressed by perivascular

Doktore-tesia

Bibliografia 134

microglial cells in the human brain: An immunohistochemical study. Synapse 2004, 53(4):208-213.

Osei-Hyiaman D., DePetrillo M., Pacher P., Liu J., Radaeva S., Batkai S., Harvey-

White J., Mackie K., Offertaler L., Wang L., Kunos G.: Endocannabinoid activation at hepatic CB1 receptors stimulates fatty acid synthesis and contributes to diet-induced obesity. J Clin Invest 2005, 115(5):1298-1305.

Ostermeier G. C., Dix D. J., Miller D., Khatri P., Krawetz S. A.: Spermatozoal RNA

profiles of normal fertile men. Lancet 2002, 360(9335):772-777. Ostermeier G. C., Miller D., Huntriss J. D., Diamond M. P., Krawetz S. A.:

Reproductive biology - Delivering spermatozoan RNA to the oocyte. Nature 2004, 429(6988):154-154.

Ostermeier C. G., Goodrich R. J., Diamond M. P., Dix D. J., Krawetz S. A.: Toward

using stable spermatozoal RNAs for prognostic assessment of male factor fertility. Fertil Steril 2005, 83(6):1687-1694.

Peckys D., Landwehrmeyer G. B.: Expression of mu, kappa, and delta opioid

receptor messenger RNA in the human CNS: A P-33 in situ hybridization study. Neuroscience 1999, 88(4):1093-1135.

Persson A. I., Thorlin T., Eriksson P. S.: Comparison of immunoblotted delta

opioid receptor proteins expressed in the adult rat brain and their regulation by growth hormone. Neurosci Res 2005, 52(1):1-9.

Pertwee, R.: Cannabinoids, Handbook of Experimental Pharmacology-ean.

Springer argitaletxea, Germany; 2005a. Pertwee R. G.: Inverse agonism and neutral antagonism at cannabinoid CBI

receptors. Life Sciences 2005b, 76(12):1307-1324. Pessot C. A., Brito M., Figueroa J., Concha I. I., Yanez A., Burzio L. O.: Presence

of Rna in the Sperm Nucleus. Biochem Bioph Res Co 1989, 158(1):272-278. Petraglia F., Segre A., Facchinetti F., Campanini D., Ruspa M., Genazzani A. R.:

Beta-Endorphin and Met-Enkephalin in Peritoneal and Ovarian Follicular Fluids of Fertile and Postmenopausal Women. Fertil Steril 1985, 44(5):615-621.

Petraglia F., Facchinetti F., Mfuta K., Ruspa M., Bonavera J. J., Gandolfi F.,

Genazzani A. R.: Endogenous Opioid-Peptides in Uterine Fluid. Fertil Steril 1986, 46(2):247-251.

Petraglia F., Dimeo G., Storchi R., Segre A., Facchinetti F., Szalay S., Volpe A.,

Genazzani A. R.: Proopiomelanocortin-Related Peptides and Methionine Enkephalin in Human Follicular-Fluid - Changes During the Menstrual-Cycle. Am J Obstet Gynecol 1987, 157(1):142-146.

Doktore-tesia

Bibliografia 135

Picatoste F., Sarri E., Claro E.: Proteinas G y sistema adenilil ciclasa. Monografías de Neurociencias (7): Receptores para Neurotransmisores-ean. Ediciones en Neurociencias, J. A. Garcia – Sevilla argitaletxea. Barcelona. 1996.

Pilapil C., Welner S., Magnan J., Gauthier S., Quirion R.: Autoradiographic

Distribution of Multiple Classes of Opioid Receptor-Binding Sites in Human Forebrain. Brain Res Bull 1987, 19(5):611-615.

Pol O., Alameda F., Puig M. M.: Inflammation enhances mu-opioid receptor

transcription and expression in mice intestine. Mol Pharmacol 2001, 60(5):894-899. Ragni G., De Lauretis L., Gambaro V., Di Pietro R., Bestetti O., Recalcati F.,

Papetti C.: Semen evaluation in heroin and methadone addicts. Acta Eur Fertil 1985, 16(4):245-249.

Ramos J. A., De Miguel R., Cebeira M., Hernandez M. and Fernandez-Ruiz J.:

Exposure to cannabinoids in the development of endogenous cannabinoid system, Neurotox Res 2002, 4(4):363-372.

Ravina C. G., Seda M., Pinto F. M., Orea A., Fernandez-Sanchez M., Pintado C. O.,

Candenas M. L.: A role for tachykinins in the regulation of human sperm motility. Hum Reprod 2007, 22(6):1617-1625.

Relton J. M., Gee N. S., Matsas R., Turner A. J., Kenny A. J.: Purification of

Endopeptidase-24.11 (Enkephalinase) from Pig Brain by Immunoadsorbent Chromatography. Biochem J 1983, 215(3):519-523.

Rhoades R. A., Tanner G. A.: Fisiología médica. Masson argitaletxea, Barcelona;

1997. Riviere P. J. M.: Peripheral kappa-opioid agonists for visceral pain. Brit J

Pharmacol 2004, 141(8):1331-1334. Roques B. P., Noble F., Fournie-Zaluski M. C.: Endogenous opioid peptides and

analgesia. Opioids in pain control. Basic and clinical aspects-ean. Stein C. Cambridge University Press argitaletxea, Cambridge; 1999.

Rosen H., Itin A., Schiff R., Keshet E.: Local-Regulation within the Female

Reproductive-System and Upon Embryonic Implantation - Identification of Cells Expressing Proenkephalin-A. Mol Endocrinol 1990, 4(1):146-154.

Rossato M., Ion Popa F., Ferigo M., Clari G., Foresta C.: Human sperm express

cannabinoid receptor Cb1, the activation of which inhibits motility, acrosome reaction, and mitochondrial function. J Clin Endocrinol Metab 2005, 90(2):984-991.

Rueda D., Galve-Roperh I., Haro A., Guzman M.: The CB1 cannabinoid receptor

is coupled to the activation of c-Jun N-terminal kinase. Mol Pharmacol 2000, 58(4):814-820.

Doktore-tesia

Bibliografia 136

Ruiz-Llorente L., Sanchez M. G., Carmena M. J., Prieto J. C., Sanchez-Chapado M., Izquierdo A., Diaz-Laviada I.: Expression of functionally active cannabinoid receptor CB1 in the human prostate gland. Prostate 2003, 54(2):95-102.

Sadler T. W.: Langman. Embriología médica, 9. argitalpena. Panamericana

argitaletxea, Madrid; 2004. Sanchez C., Galve-Roperh I., Rueda D., Guzman M.: Involvement of

sphingomyelin hydrolysis and the mitogen-activated protein kinase cascade in the Delta(9)-tetrahydrocannabinol-induced stimulation of glucose metabolism in primary astrocytes. Mol Pharmacol 1998, 54(5):834-843.

Sanchez C., de Ceballos M. L., del Pulgar T. G., Rueda D., Corbacho C., Velasco

G., Galve-Roperh I., Huffman J. W., Cajal S. R. Y., Guzman M.: Inhibition of glioma growth in vivo by selective activation of the CB2 cannabinoid receptor. Cancer Research 2001, 61(15):5784-5789.

Santen R. J., Sofsky J., Bilic N., Lippert R.: Mechanism of Action of Narcotics in

Production of Menstrual Dysfunction in Women. Fertil Steril 1975, 26(6):538-548. Sarfaraz S., Afaq F., Adhami V. M., Mukhtar H.: Cannabinoid receptor as a novel

target for the treatment of prostate cancer. Cancer Res 2005, 65(5):1635-1641. Sastry B. V., Janson V. E., Owens L. K., Tayeb O. S.: Enkephalin- and substance

P-like immunoreactivities of mammalian sperm and accessory sex glands. Biochem Pharmacol 1982, 31(21):3519-3522.

Sastry B. V., Janson V. E., Owens L. K.: Significance of substance P- and

enkephalin-peptide systems in the male genital tract. Ann N Y Acad Sci 1991, 632:339-353.

Schaefer M., Hofmann T., Schultz G., Gudermann T.: A new prostaglandin E

receptor mediates calcium influx and acrosome reaction in human spermatozoa. Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95(6):3008-3013.

Schatz A. R., Lee M., Condie R. B., Pulaski J. T., Kaminski N. E.: Cannabinoid

receptors CB1 and CB2: A characterization of expression and adenylate cyclase modulation within the immune system. Toxicol Appl Pharm 1997, 142(2):278-287.

Schmid P. C., Paria B. C., Krebsbach R. J., Schmid H. H. O., Dey S. K.: Changes in

anandamide levels in mouse uterus are associated with uterine receptivity for embryo implantation. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94(8):4188-4192.

Schneider U., Schwenk H. U., Bornkamm G.: Characterization of Ebv-Genome

Negative Null and T-Cell Lines Derived from Children with Acute Lymphoblastic Leukemia and Leukemic Transformed Non-Hodgkin Lymphoma. Int J Cancer 1977, 19(5):621-626.

Doktore-tesia

Bibliografia 137

Schuel H., Chang M. C., Berkery D., Schuel R., Zimmerman A. M., Zimmerman S.: Cannabinoids inhibit fertilization in sea urchins by reducing the fertilizing capacity of sperm. Pharmacol Biochem Behav 1991, 40(3):609-615.

Schuel H., Goldstein E., Mechoulam R., Zimmerman A. M., Zimmerman S.:

Anandamide (arachidonylethanolamide), a brain cannabinoid receptor agonist, reduces sperm fertilizing capacity in sea urchins by inhibiting the acrosome reaction. Proc Natl Acad Sci U S A 1994, 91(16):7678-7682.

Schuel H., Burkman L. J., Lippes J., Crickard K., Forester E., Piomelli D., Giuffrida

A.: N-Acylethanolamines in human reproductive fluids. Chem Phys Lipids 2002, 121(1-2):211-227.

Schuel H., Burkman L. J.: A tale of two cells: endocannabinoid-signaling regulates

functions of neurons and sperm. Biol Reprod 2005, 73(6):1078-1086. Schuel H.: Tuning the oviduct to the anandamide tone. J Clin Invest 2006,

116(8):2087-2090. Shapira M., Vogel Z., Sarne Y.: Opioid and cannabinoid receptors share a

common pool of GTP-binding proteins in cotransfected cells, but not in cells which endogenously coexpress the receptors. Cell Mol Neurobiol 2000, 20(3):291-304.

Sharp B., Pekary A. E., Meyer N. V., Hershman J. M.: Beta-Endorphin in Male-

Rat Reproductive-Organs. Biochem Bioph Res Co 1980, 95(2):618-623. Sharp B. M., Roy S., Bidlack J. M.: Evidence for opioid receptors on cells involved

in host defense and the immune system. J Neuroimmunol 1998, 83(1-2):45-56. Shire D., Calandra B., RinaldiCarmona M., Oustric D., Pessegue B.,

BonninCabanne O., LeFur G., Caput D., Ferrara P.: Molecular cloning, expression and function of the murine CB2 peripheral cannabinoid receptor. Bba-Gene Struct Expr 1996, 1307(2):132-136.

Siegel G. J., Agranoff B. W., Albers R. W., Molinoff P. B.: Basic neurochemestry.

Raven press argitaletxea, New York. 1993. Simon J., Benyhe S., Hepp J., Khan A., Borsodi A., Szucs M., Medzihradszky K.,

Wollemann M.: Purification of a Kappa-Opioid Receptor Subtype from Frog Brain. Neuropeptides 1987, 10(1):19-28.

Simonin F., Befort K., Gaveriauxruff C., Matthes H., Nappey V., Lannes B.,

Micheletti G., Kieffer B.: Molecular Characterization of the Human Delta-Opioid Receptor. Regul Peptides 1994, 54(1):279-280.

Skaper S. D., Buriani A., DalToso R., Petrelli L., Romanello S., Facci L., Leon A.:

The ALIAmide palmitoylethanolamide and cannabinoids, but not anandamide, are protective in a delayed postglutamate paradigm of excitotoxic death in cerebellar granule neurons. Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93(9):3984-3989.

Doktore-tesia

Bibliografia 138

Smith C. G., Asch R. H.: Drug-Abuse and Reproduction. Fertil Steril 1987, 48(3):355-373.

Snyder S. H.: Drogas y cerebro. Biblioteca Scientific American. Prensa Científica

argitaletxea, Barcelona; 1993. Solakidi S., Psarra A. M. G., Nikolaropoulos S., Sekeris C. E.: Estrogen receptors

alpha and beta (ER alpha and ER beta) and androgen receptor (AR) in human sperm: localization of ER beta and AR in mitochondria of the midpiece. Hum Reprod 2005, 20(12):3481-3487.

Stansfield S. C., Cunningham F. J.: Involvement of Opiate Receptor Subtypes in

the Modulation of Lhrh Secretion by the Cockerel (Gallus-Domesticus) Mediobasal Hypothalamus Invitro. J Endocrinol 1987, 114(1):111-117.

Subiran N., Agirregoitia E., Valdivia A., Ochoa C., Casis L., Irazusta J.: Expression

of enkephalin-degrading enzymes in human semen and implications for sperm motility. Fertil Steril 2007.

Sugiura T., Kondo S., Sukagawa A., Tonegawa T., Nakane S., Yamashita A., Waku

K.: Enzymatic synthesis of anandamide, an endogenous cannabinoid receptor ligand, through N-acylphosphatidylethanolamine pathway in testis: Involvement of Ca2+-dependent transacylase and phosphodiesterase activities (vol 218, pg 113, 1996). Biochem Bioph Res Co 1996, 221(1):206-206.

Surprenant A., Shen K. Z., North R. A., Tatsumi H.: Inhibition of Calcium

Currents by Noradrenaline, Somatostatin and Opioids in Guinea-Pig Submucosal Neurons. J Physiol-London 1990, 431:585-608.

Tablado L., Perez-Sanchez F., Soler C.: Is sperm motility maturation affected by

static magnetic fields? Environ Health Persp 1996, 104(11):1212-1216. Tash J. S.: Protein-Phosphorylation - the 2nd Messenger Signal Transducer of

Flagellar Motility. Cell Motil Cytoskel 1989, 14(3):332-339.

Thorn N. A., Russell J. T.: Torp-Pedersen C., Treiman M.: Calcium and neurosecretion. Ann N Y Acad Sci 1978, 307: 618-639.

Todd A. R.: Hashish. Experientia 1946, 2(2):55-60.

Turner A. J. Endopeptidase-24.11 and neuropeptide metabolism. Neuropeptides

and their peptidases-ean. Turner A. J., Ellis Horwood Ltd., Chichester; 1987. Turner R. M.: Moving to the beat: a review of mammalian sperm motility

regulation. Reprod Fertil Dev 2006, 18(1-2):25-38. Utleg A. G., Yi E. C., Xie T., Shannon P., White J. T., Goodlett D. R., Hood L., Lin

B.: Proteomic analysis of human prostasomes. Prostate 2003, 56(2):150-161.

Doktore-tesia

Bibliografia 139

Van Sickle M. D., Duncan M., Kingsley P. J., Mouihate A., Urbani P., Mackie K., Stella N., Makriyannis A., Piomelli D., Davison J. S., Marnett L. J., Di Marzo V., Pittman Q. J., Patel K. D., Sharkey K. A.: Identification and functional characterization of brainstem cannabinoid CB2 receptors. Science 2005, 310(5746):329-332.

Vescovi P. P., Pedrazzoni M., Michelini M., Maninetti L., Bernardelli F., Passeri

M.: Chronic Effects of Marijuana Smoking on Luteinizing-Hormone, Follicle-Stimulating-Hormone and Prolactin Levels in Human Males. Drug Alcohol Depen 1992, 30(1):59-63.

Vigano D., Rubino T., Parolaro D.: Molecular and cellular basis of cannabinoid

and opioid interactions. Pharmacol Biochem Be 2005, 81(2):360-368. Waksman G., Bouboutou R., Devin J., Bourgoin S., Cesselin F., Hamon M.,

Fourniezaluski M. C., Roques B. P.: Invitro and Invivo Effects of Kelatorphan on Enkephalin Metabolism in Rodent Brain. Eur J Pharmacol 1985, 117(2):233-243.

Waldhoer M., Bartlett S. E., Whistler J. L.: Opioid receptors. Annu Rev Biochem

2004, 73:953-990. Wang D., King S. M., Quill T. A., Doolittle L. K., Garbers D. L.: A new sperm-

specific Na+/H+ Exchanger required for sperm motility and fertility. Nat Cell Biol 2003, 5(12):1117-1122.

Wang H., Dey S. K., Maccarrone M.: Jekyll and hyde: two faces of cannabinoid

signaling in male and female fertility. Endocr Rev 2006, 27(5):427-448. Wen X. H., Yang Z. W.: Quantitative (stereological) study on the spermatozoal

storage capacity of epididymis in rats and monkeys. Asian J Androl 2000, 2(1):73-77. Wenger T., Ledent C., Csernus V., Gerendai I.: The central cannabinoid receptor

inactivation suppresses endocrine reproductive functions. Biochem Biophys Res Commun 2001, 284(2):363-368.

World Health Organization: Collection and examination of human semen. WHO

laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction 4. argitalpenean. Cambridge University Press argitaletxea, Cambridge; 1999.

Wick M. J., Minnerath S. R., Lin X. Q., Elde R., Law P. Y., Loh H. H.: Isolation of

a Novel Cdna-Encoding a Putative Membrane-Receptor with High Homology to the Cloned Mu-Opioid, Delta-Opioid, and Kappa-Opioid Receptors. Mol Brain Res 1994, 27(1):37-44.

Williams N., Clouet D. H.: The Effect of Acute Opioid Administration on the

Phosphorylation of Rat Striatal Synaptic Membrane-Proteins. J Pharmacol Exp Ther 1982, 220(2):278-286.

Doktore-tesia

Bibliografia

Doktore-tesia

140

Wittert G., Hope P., Pyle D.: Tissue distribution of opioid receptor gene expression in the rat. Biochem Bioph Res Co 1996, 218(3):877-881.

Wykes S. M., Visscher D. W., Krawetz S. A.: Haploid transcripts persist in mature

human spermatozoa. Mol Hum Reprod 1997, 3(1):15-19. Xu W., Filppula S. A., Mercier R., Yaddanapudi S., Pavlopoulos S., Cai J., Pierce

W. M., Makriyannis A.: Purification and mass spectroscopic analysis of human CB1 cannabinoid receptor functionally expressed using the baculovirus system. J Pept Res 2005, 66(3):138-150.

Yanagimachi R.: Mammalian fertilization. The Physiology of reproduction 2.

argitalpenean. Raven Press Ltd, New York argitaletxea; 1994. Zalata A., Hafez T., VanHoecke M. J., Comhaire F.: Evaluation of beta-endorphin

and interleukin-6 in seminal plasma of patients with certain andrological diseases. Hum Reprod 1995, 10(12):3161-3165.

Zorgniotti A. W., Sealfon A. I., Toth A.: Chronic scrotal hypothermia as a

treatment for poor semen quality. Lancet 1980, 1(8174):904-906. Zygmunt P. M., Petersson J., Andersson D. A., Chuang H. H., Sorgard M., Di

Marzo V., Julius D., Hogestatt E. D.: Vanilloid receptors on sensory nerves mediate the vasodilator action of anandamide. Nature 1999, 400(6743):452-457.

Eranskinak

Eranskinak 143

1. ERANSKINA

PCRan anplifikatutako anplikoien sekuentziazioa

1. Helburua: Opioide-hartzaileentzako RT-PCRan lortutako datuak egiaztatzea.

2. Oinarria

RT-PCRa egin eta gero lortutako anplikoien sekuentzia jakinda, baiezta dezakegu

agarosako geletan ikusitako bandak benetan guk pentsatzen ditugun sekuentziak

dauzkatela.

Sekuentziazioa egiteko, lehenik eta behin, PCRtik lortutako produktuak araztu behar

dira kit bat erabilita (High pure PCR product purification kit, Roche) eta, gero,

araztutakoa sekuentziazten da. Lortutako sekuentziazio-emaitzak NCBI-BLAST datu-

baseko (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) mRNA guztiekin konparatzen dira.

Hala baieztatu dugu PCRtik lortutako produktuaren sekuentzia ea bat ote datorren

bilatzen ari garen mRNArekin.

3. Protokoloa

100 µl PCR Binding buffer 500 µl gehitu

Ondo nahastu eta “High Pure”tutu filtrodunetara pasa,

zentrifugatu 13.000 g / 1 min

Zentrifugatu 13.000 g / 1 min

Iragazitako likidoa baztertu

Zentrifugatu 13.000 g / 1 min

Zentrifugatu 13.000 g / 1 min

Wash buffer 500 µl gehitu

Wash buffer 200 µl gehitu

Elution buffer 500 µl gehitu

Iragazitako likidoa baztertu

Iragazitako likidoa baztertu

PCR produktua araztua

2. irudia: PCRaren produktua arazteko prozeduraren eskema.

Doktore-tesia

Eranskinak 144

Araztutako parte bat % 1,5-2ko agarosako gel batean korriarazten da (putzuko,

araztutako 5 µl + 1µl karga-buffer), arazketa ondo egin dela baieztatzeko. Beste partea

sekuentziazio-zerbitzura eramaten da.

4. Emaitzak eta eztabaida

Emaitzen arabera, PCRtik lortutako produktuaren sekuentzia bat dator datu-basetako κ

eta µ opioide-hartzaileen mRNArekin.

hKOR

5´TAATATTTACCTGGCTTTGGCAGATGCTTTAGTTACTACAACCATGCCCTTTCAGAGTACGGTCTACTTGATGAATTCCTGGCCTTTTGGGGATGTGCTGTGCAAGATAGTAATTTCCATTGATTACTACAACATGTTCACCAGCATCTTCACCTTGACCATGATGAGNGTGGACCGCTACATTGCCGTGTGCCACCCCGTGAAGGCTTTGGACTTCCGCACACCCTTGAAGGCAAAGATCATCAATATCTGCATCTGGCTGCTGTCGTCATCTGTTGGCATCTCTGCAATAGTCCTTGGAGGCACCAAAGGTCAGGGAA 3´

hMOR

5´CGTCTCGAGGTGAATTACCTAATGGGAACATGGCCATTTGGAACCATCCTTTGCAAGATAGTGATCTCCATAGATTACTATAACATGTTCACCAGCATATTCACCCTCTGCACCATGAGTGTTGATCGATACATTGCAGTCTGCCACCCTGTCAAGGCCTTAGATTTCCGTACTCCCCGAAATGCCAAAATTATCAATGTCTGCAACTGGATCCTCTCTTCAGCCATTGGTCTTCCTGTAATGTTCATGGCTACAACAAAATACAGGCAAGGTTCCATAGATTGTACACTAACATTCTCTCATCCAACCTGGTACTGGGAAAACCTGCTGAAGATCTGTGTTTTCATCTTCGCCTTCATTATGCCAGTGCTCATCATTACCGTGTGCTATGGACTGATGATCTTGCGCCTCA 3´

3. irudia: κ (hKOR) eta µ opioide-hartzaileentzako (hMOR) RT-PCRaren produktuen sekuentziak giza espermatozoideetan. hKOR anplikoiaren sekuentzia NCBI-BLAST datu-baseko BC099912.1, Homo sapiens-aren Kappa 1 opioide-hartzailearen mRNArekin bat dator. hMOR anplikoiaren sekuentzia NCBI-BLAST datu-baseko NM_001008505.1, Homo sapiens-aren mu 1 opioide-hartzailearen MOR-1X transkriptoaren mRNA-rekin bat dator.

Doktore-tesia

Eranskinak 145

2. ERANSKINA

Denbora errealean egindako PCR kuantitatiboa (qRT-PCR)

1. Helburua: Opioide-hartzaileentzako RT-PCRan lortutako datuak balioztatzea.

2. Oinarria

Roche-ren “Universal Probe Library” sistema denbora errealean egindako Taqman-PCR

sistema klasikoan oinarritzen da, baina hiru primer erabiltzen dira. Horietako bi primer

ohiko PCRa egiteko kontzeptua erabiliz diseinatzen dira (forward eta reverse primer-

ak). Hirugarren primer-ak talde fluoreszentea du, eta anplifikaziora gehitzen denean

(sortzen ari den anplikoira gehitzean), emisio fluoreszentea handitzen du (primer horrek

aldaketa kimikoak ditu, eta, polimerasak primer-aren muturretan nukleotidoak gehitzen

dituenean, fluoreszentzia igortzen da). Sistema honek anplifikazioaren espezifizitatea

areagotzen du (hiru primer erabiltzeagatik) eta DNA-harizpi bikoitz ez-espezifikoen

detekzioa baztertzen ditu, fluoreszentzia primer bati lotua dagoelako. Termozikladore

espezifiko batekin, anplifikazio-ziklo bakoitzean, fluoreszentzia jaso eta kuantifikatu

egiten da. Hala, zikloz ziklo lorturiko fluoreszentziaren datuak irudikatuz bilatzen

dugun mRNA anplifikatzen bada, fluoreszentziaren portaera sigmoideoa lortuko dugu.

Anplifikazio-kurbaren alde lineala analizatzeko, mozte-marra bat egiten da erreakzio

guztietarako; hala, laginen arteko anplifikazio-zikloen desberdintasunak analiza

daitezke. Datu horiekin, erreferentzia-lagin bat hartuta, lagin bakoitzaren espresio-datu

erlatiboak lor daitezke.

3. Protokoloa

a) cDNA Transcriptor kit (Roche) erabiliz sortu zen. b) Introien artean sortutako primer-ak “Roche Universal Probe Library” metodoaz sortu ziren (www.roche-applied-science.com). Primer bikote hauek erabili ziren: - Giza δ opioide-hartzailerako (f) primer: 5´-ttgtcatgttcggcatcg-3´ (r) primer: 5´-aaggccaggttgaagatgtaga-3´ Probe: Human #49

Doktore-tesia

Eranskinak 146

- Giza κ opioide-hartzailerako (f) primer: 5´-ccttgaaggcaaagatcatca-3´ (r) primer: 5´-tgcaaggagcactcaatgac-3´ Probe: Human #71 - Giza µ opioide-hartzailerako (f) primer: 5´-cggccaatacagtggatagaa-3´ (r) primer: 5´-gttagggcaacggagcagt-3´ Probe: Human #38 d) 96 edo 384 putzuko plaketan gehitu behar dena putzu bakoitzeko - Lagina: 1-5 µl - Master mix: 5 µl (Roche Faststart Taqman Probe Master 1,25 ml + ROX 8,5 µl) - Primer-ak (f-r): 0,1 µl (200 nM) - Roche Primera (Probe): 0,1 µl (100 nM) - H2O 10 µl arte e) Anplifikazioa eta datuen analisia 7900 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) gailuan egin ziren.

4. Emaitzak eta eztabaida

qRT-PCRa erabiliz, δ opioide-hartzailearen mRNAren anplifikaziorik ez da topatzen

espermatozoide helduetan. Aitzitik, κ eta µ opioide-hartzaileen mRNAren anplifikazioa

topatzen da zelula horietan (Ct = 36,4 ± 0,3 eta 30,7 ± 0,3 hurrenez hurren).

hDOR

hKOR hMOR

1. irudia: Opioide-hartzaileentzako qRT-PCR analisiaren anplifikazio-kurbak giza espermatozoideetan. hKOR: giza κ opioide-hartzailea; hMOR: giza µ opioide-hartzailea; hDOR: giza δ opioide-hartzailea. hKOR-en eta hMOR-en mRNA anplifikatzen da eta hDOR-en mRNA ez da anplifikatzen.

Doktore-tesia

Eranskinak

Doktore-tesia

147

3. ERANSKINA

Mugikortasun-parametroak

Helburua: Tesi honetako “Emaitzak eta eztabaida” atala ez luzatzeko, soilik

espermatozoideen mugikortasun parametro esanguratsuen grafikoak erakutsi dira.

Jarraian, Sperm Class Analyzer 2005® softwarearekin neurtutako mugikortasun-

paramtro guztiak erakusten dira.

DEL

TA o

pioi

de-h

artz

aile

aren

ago

nist

aren

(DPD

PE) e

ta a

ntag

onis

tare

n (N

altr

indo

l) er

agin

a es

perm

atoz

oide

en m

ugik

orta

sun-

para

met

roet

an

18.4

84.

6241

.98

1.31

16.2

91.

5723

.27

5.71

60.4

54.

7452

.27

1.40

20.1

91.

6331

.72

.97

38.7

03.

3863

.42

3.63

60.7

41.

751.

98.0

39.

12.2

9.5

3.3

525

.75

6.95

20.7

64.

2652

.97

10.9

526

.28

7.19

41.3

34.

6212

.63

.62

28.8

12.

5231

.12

1.74

44.2

21.

5470

.22

1.60

.37

.12

1.95

.74

16.3

36.

3342

.46

2.67

16.9

32.

4824

.28

6.14

58.7

95.

8649

.06

1.84

18.0

02.

1530

.34

1.28

36.6

34.

0659

.17

6.39

61.8

51.

251.

81.1

58.

82.5

64.

501.

4246

.95

6.28

19.6

61.

6628

.90

6.14

51.4

46.

7646

.52

2.31

14.5

01.

1129

.07

2.55

31.0

5.7

950

.02

1.33

62.2

12.

421.

17.1

04.

141.

02.5

3.3

525

.75

6.95

20.7

64.

2652

.97

10.9

526

.28

7.19

41.3

34.

6212

.63

.62

28.8

12.

5231

.12

1.74

44.2

21.

5470

.22

1.60

.37

.12

1.95

.74

18.4

84.

6241

.98

1.31

16.2

91.

5723

.27

5.71

60.4

54.

7452

.27

1.40

20.1

91.

6331

.72

.97

38.7

03.

3863

.42

3.63

60.7

41.

751.

98.0

39.

12.2

918

.48

4.62

41.9

81.

3116

.29

1.57

23.2

75.

7160

.45

4.74

52.2

71.

4020

.19

1.63

31.7

2.9

738

.70

3.38

63.4

23.

6360

.74

1.75

1.98

.03

9.12

.29

18.4

84.

6241

.98

1.31

16.2

91.

5723

.27

5.71

60.4

54.

7452

.27

1.40

20.1

91.

6331

.72

.97

38.7

03.

3863

.42

3.63

60.7

41.

751.

98.0

39.

12.2

922

.37

7.49

37.4

21.

6617

.31

2.20

22.9

05.

4059

.79

7.24

48.9

9.8

420

.25

1.09

30.3

3.2

541

.49

2.95

66.7

83.

5561

.97

1.13

2.06

.10

8.55

.33

2.19

.90

34.5

34.

4619

.02

4.02

44.2

79.

1036

.72

5.22

45.1

94.

1012

.81

.75

30.4

73.

3628

.72

2.02

42.9

83.

7267

.11

1.34

.70

.18

2.78

.60

11.9

71.

5244

.41

1.13

21.2

52.

7422

.38

3.27

56.3

71.

9347

.74

4.57

17.1

21.

0428

.79

2.16

36.1

81.

0959

.65

1.12

60.6

61.

591.

81.0

78.

05.7

315

.17

2.71

47.7

73.

3015

.07

2.80

22.0

03.

5062

.94

3.27

53.4

73.

6818

.33

.91

31.2

01.

9234

.78

3.00

59.3

54.

5458

.53

1.59

2.02

.09

7.89

.72

3.70

2.30

34.4

65.

0721

.23

2.18

40.6

17.

6138

.17

6.38

45.8

82.

5413

.67

1.16

30.4

21.

4629

.72

1.56

44.8

82.

9466

.44

1.75

1.00

.36

3.13

1.04

19.3

56.

3435

.52

1.45

18.8

82.

5526

.26

6.18

54.8

77.

1548

.31

2.36

19.1

12.

0830

.07

1.40

39.3

73.

0263

.18

4.64

62.2

7.4

82.

25.0

78.

70.2

010

.83

4.44

35.8

15.

8219

.33

1.18

34.0

410

.35

46.6

39.

3445

.57

4.43

17.1

91.

0528

.42

2.19

38.1

92.

2460

.94

3.58

62.7

11.

541.

50.2

76.

90.7

417

.91

2.43

40.2

22.

4419

.75

2.12

22.1

35.

0258

.13

3.94

45.9

51.

9818

.07

.98

29.1

01.

4039

.46

2.32

62.3

93.

8763

.29

.42

1.90

.06

8.08

.29

13.4

02.

5238

.88

3.61

20.2

02.

7327

.51

4.85

52.2

95.

1847

.95

4.13

18.0

51.

7630

.00

1.92

37.6

41.

6859

.91

2.76

62.8

81.

282.

10.1

38.

05.4

8.6

4.4

326

.99

3.66

21.2

22.

6751

.15

5.58

27.6

34.

0642

.43

5.20

12.7

4.9

228

.87

2.44

30.6

12.

0444

.39

2.18

68.8

62.

27.5

0.0

61.

67.5

89.

493.

9235

.28

.99

19.7

52.

8935

.49

4.08

44.7

73.

3845

.10

3.34

16.0

41.

5128

.92

2.11

35.6

42.

6555

.53

3.84

64.1

3.4

31.

57.1

67.

08.7

55.

021.

7840

.64

4.58

22.4

02.

7431

.94

2.98

45.6

65.

5845

.35

5.87

15.0

31.

2428

.94

2.72

33.7

42.

1052

.14

1.96

64.5

72.

161.

28.2

66.

27.9

12.

28.9

933

.48

5.30

21.2

81.

7942

.97

7.37

35.7

66.

2041

.01

1.95

13.6

1.8

128

.93

1.04

33.2

51.

5847

.08

2.36

70.6

71.

07.7

6.1

74.

22.1

719

.19

4.50

41.3

42.

0716

.85

.94

22.6

26.

4860

.53

5.63

49.0

12.

9519

.59

.82

30.7

31.

1140

.61

3.83

64.1

24.

1863

.00

1.91

1.88

.11

8.85

.20

9.61

2.75

37.4

84.

7319

.67

2.28

33.2

47.

5647

.09

6.30

45.8

53.

9316

.93

.80

28.0

81.

5837

.57

2.96

60.6

43.

1961

.74

1.99

1.98

.32

7.35

.79

10.1

63.

4534

.72

1.16

20.8

95.

2634

.23

8.31

44.8

83.

7943

.43

1.79

15.5

11.

2827

.03

1.20

35.9

53.

4457

.68

5.12

62.2

1.6

61.

54.2

96.

181.

2018

.44

6.40

38.0

8.4

518

.38

1.76

25.1

05.

2556

.52

6.24

51.4

12.

3720

.09

1.64

31.6

1.6

339

.07

2.80

63.4

04.

4761

.71

1.67

2.16

.25

7.88

.63

1.61

1.51

37.6

610

.80

17.4

32.

1443

.31

12.2

939

.27

12.1

647

.76

2.51

13.5

51.

8931

.85

2.13

28.1

52.

8941

.98

3.28

66.6

82.

58.6

1.4

92.

101.

448.

773.

1034

.96

3.59

22.9

04.

5233

.37

8.29

43.7

36.

6346

.78

4.12

16.1

0.5

628

.33

1.21

34.9

42.

0856

.99

1.90

61.2

92.

822.

23.2

27.

60.4

212

.00

4.81

37.5

37.

4714

.30

1.33

36.1

712

.18

49.5

312

.01

53.6

94.

1118

.26

1.66

32.0

91.

1234

.02

2.06

56.6

84.

0860

.35

2.63

1.87

.48

6.86

1.42

1.98

1.08

38.3

84.

9318

.39

2.33

41.2

65.

6040

.35

5.84

52.2

14.

9415

.31

.79

34.6

52.

2729

.77

1.76

44.4

52.

0467

.00

2.56

.62

.21

2.64

.91

15.2

46.

2235

.31

1.23

15.5

01.

3133

.96

7.15

50.5

57.

2550

.12

1.58

19.6

71.

6931

.35

.84

39.1

32.

6362

.57

4.41

62.6

21.

352.

25.2

18.

16.3

914

.24

6.74

39.4

42.

1714

.48

1.63

31.8

56.

5853

.68

6.84

53.8

23.

9419

.45

1.79

32.2

61.

0636

.35

3.27

60.1

84.

8960

.46

2.49

1.95

.39

8.14

.79

19.0

45.

3042

.65

2.02

15.8

12.

4022

.50

4.69

61.6

96.

7752

.69

3.16

20.3

91.

9231

.68

1.30

38.4

01.

3363

.86

3.50

60.4

41.

582.

24.1

48.

93.3

9

Kont

rola

Nal

trind

ol 1

0-4

MD

PDPE

10-

7 M

+ n

altri

ndol

10-

6 M

DPD

PE 1

0-6

M +

nal

trind

ol 1

0-5

MD

PDPE

10-

5 M

+ n

altri

ndol

10-

4 M

DPD

PE 1

0-7

MD

PDPE

10-

6 M

DPD

PE 1

0-5

M

0 or

du

Kont

rola

Nal

trind

ol 1

0-4

MD

PDPE

10-

7 M

+ n

altri

ndol

10-

6 M

DPD

PE 1

0-6

M +

nal

trind

ol 1

0-5

MD

PDPE

10-

5 M

+ n

altri

ndol

10-

4 M

DPD

PE 1

0-7

MD

PDPE

10-

6 M

DPD

PE 1

0-5

M

0,5

ordu

Kont

rola

Nal

trind

ol 1

0-4

MD

PDPE

10-

7 M

+ n

altri

ndol

10-

6 M

DPD

PE 1

0-6

M +

nal

trind

ol 1

0-5

MD

PDPE

10-

5 M

+ n

altri

ndol

10-

4 M

DPD

PE 1

0-7

MD

PDPE

10-

6 M

DPD

PE 1

0-5

M

1 or

du

Kont

rola

Nal

trind

ol 1

0-4

MD

PDPE

10-

7 M

+ n

altri

ndol

10-

6 M

DPD

PE 1

0-6

M +

nal

trind

ol 1

0-5

MD

PDPE

10-

5 M

+ n

altri

ndol

10-

4 M

DPD

PE 1

0-7

MD

PDPE

10-

6 M

DPD

PE 1

0-5

M

3,5

ordu

Bate

zbe

stek

oEr

rore

a

A (%

)Ba

tez

best

eko

Erro

rea

B (%

)Ba

tez

best

eko

Erro

rea

C (%

)Ba

tez

best

eko

Erro

rea

D (%

)Ba

tez

best

eko

Erro

rea

AB (%

)Ba

tez

best

eko

Erro

rea

VCL

(µm

/s)

Bate

zbe

stek

oEr

rore

a

VSL

(µm

/s)

Bate

zbe

stek

oEr

rore

a

VAP

(µm

/s)

Bate

zbe

stek

oEr

rore

a

LIN

(%)

Bate

zbe

stek

oEr

rore

a

STR

(%)

Bate

zbe

stek

oEr

rore

a

WO

B (%

)Ba

tez

best

eko

Erro

rea

ALH

(µm

)Ba

tez

best

eko

Erro

rea

BCF

(Hz)

KA

PPA

opi

oide

-har

tzai

lear

en a

goni

star

en (U

-504

88) e

ta a

ntag

onis

tare

n (N

or-b

inal

torf

imin

a) e

ragi

na e

sper

mat

ozoi

deen

mug

ikor

tasu

n-pa

ram

etro

etan

29.2

78.

3135

.27

4.98

17.0

94.

0618

.37

2.87

64.5

55.

8357

.28

6.42

27.6

35.

3236

.91

4.63

46.1

34.

3071

.58

5.40

64.2

12.

082.

07.2

79.

34.9

618

.20

6.33

42.2

46.

0214

.50

3.95

25.0

64.

4460

.44

6.85

57.4

26.

0521

.38

2.68

32.8

42.

4937

.03

1.60

64.0

54.

1458

.35

2.24

2.03

.35

8.53

.79

21.7

46.

8237

.68

5.60

15.8

22.

9424

.77

4.23

59.4

16.

7952

.37

4.88

21.8

03.

0331

.95

2.72

41.0

72.

7467

.29

5.16

61.4

41.

921.

93.1

78.

99.5

730

.17

5.98

36.4

74.

0413

.49

3.23

19.8

83.

0066

.64

4.70

58.0

75.

0125

.24

2.62

34.9

22.

5943

.46

2.37

71.8

43.

7360

.57

1.66

2.07

.22

9.07

.77

18.2

06.

3342

.24

6.02

14.5

03.

9525

.06

4.44

60.4

46.

8557

.42

6.05

21.3

82.

6832

.84

2.49

37.0

31.

6064

.05

4.14

58.3

52.

242.

03.3

58.

53.7

929

.27

8.31

35.2

74.

9817

.09

4.06

18.3

72.

8764

.55

5.83

57.2

86.

4227

.63

5.32

36.9

14.

6346

.13

4.30

71.5

85.

4064

.21

2.08

2.07

.27

9.34

.96

29.2

78.

3135

.27

4.98

17.0

94.

0618

.37

2.87

64.5

55.

8357

.28

6.42

27.6

35.

3236

.91

4.63

46.1

34.

3071

.58

5.40

64.2

12.

082.

07.2

79.

34.9

629

.27

8.31

35.2

74.

9817

.09

4.06

18.3

72.

8764

.55

5.83

57.2

86.

4227

.63

5.32

36.9

14.

6346

.13

4.30

71.5

85.

4064

.21

2.08

2.07

.27

9.34

.96

23.0

96.

1733

.54

3.68

15.9

63.

0827

.42

4.42

56.6

35.

5856

.11

6.62

24.5

54.

0034

.62

3.65

42.7

72.

7168

.78

4.74

62.3

91.

622.

01.2

98.

86.7

016

.42

5.81

34.8

16.

4720

.61

4.06

28.1

64.

3151

.23

7.20

50.8

45.

2920

.44

2.86

31.5

32.

7939

.58

2.06

63.5

84.

4162

.67

1.44

2.09

.29

8.15

.84

28.1

58.

9533

.06

6.44

15.4

03.

4323

.40

4.69

61.2

17.

8155

.22

6.37

24.7

63.

7434

.10

3.38

44.5

53.

8871

.14

5.76

62.5

42.

002.

09.2

38.

99.7

124

.10

6.32

30.3

82.

9216

.32

3.98

29.2

13.

3954

.48

6.89

52.4

65.

7022

.17

3.13

31.9

22.

8741

.60

1.80

67.8

73.

9961

.72

2.01

2.02

.32

8.99

.60

19.9

75.

5332

.98

4.00

17.5

24.

5529

.54

2.39

52.9

46.

7452

.38

6.15

20.0

62.

7031

.08

2.89

38.0

91.

6463

.45

3.65

60.4

02.

002.

11.2

78.

22.6

422

.87

7.67

32.4

55.

4617

.41

3.34

27.2

83.

7155

.32

5.94

50.1

84.

4022

.17

3.32

31.8

12.

5743

.55

3.75

68.2

45.

4263

.84

1.95

1.86

.19

8.90

.64

27.5

09.

5127

.43

5.20

17.7

63.

3827

.30

4.76

54.9

47.

8351

.97

5.19

23.8

74.

2132

.67

3.35

44.9

24.

9670

.67

5.97

63.1

92.

671.

98.1

88.

81.8

923

.59

5.82

31.2

85.

5317

.04

2.66

28.0

94.

4654

.87

6.76

54.3

65.

2223

.13

3.42

33.6

22.

7541

.98

3.55

67.2

65.

4362

.43

1.65

2.00

.20

8.84

.54

24.5

97.

2829

.42

3.96

16.7

43.

7829

.26

3.82

54.0

06.

9749

.17

5.67

23.4

04.

0831

.60

3.43

46.2

23.

2271

.59

5.01

64.8

52.

191.

88.2

59.

08.8

123

.14

9.17

28.1

83.

6221

.93

5.51

26.7

43.

5751

.33

7.20

45.0

04.

4119

.73

3.26

28.1

02.

3742

.57

3.14

68.0

65.

9463

.05

1.96

1.81

.27

7.60

.93

25.2

36.

9829

.85

4.56

15.7

03.

7129

.23

4.94

55.0

87.

9752

.63

5.32

23.6

83.

1132

.78

2.81

44.1

81.

7570

.71

4.37

63.0

41.

981.

84.3

48.

29.7

726

.68

8.64

29.7

36.

0917

.32

4.48

26.2

84.

4756

.40

7.39

51.5

94.

9823

.52

4.12

32.6

43.

1544

.35

4.55

69.5

25.

9263

.53

2.02

1.83

.26

8.10

1.09

16.1

86.

1136

.30

4.71

17.4

43.

5230

.08

2.95

52.4

85.

9249

.78

4.75

19.1

02.

5029

.97

2.01

38.1

62.

6962

.74

5.16

61.3

02.

451.

83.2

87.

72.8

232

.88

9.06

27.4

56.

2113

.25

4.62

26.4

24.

4860

.34

8.59

53.9

86.

4225

.75

4.41

33.5

53.

9146

.88

3.74

74.7

35.

0362

.76

2.60

2.12

.25

9.27

.78

24.6

27.

4729

.60

2.75

19.5

74.

2726

.21

3.45

54.2

27.

2348

.97

5.58

21.8

43.

5430

.01

3.09

43.5

52.

1970

.74

4.34

61.9

01.

802.

05.2

18.

91.7

122

.83

7.21

31.0

33.

6415

.83

3.90

30.3

13.

5453

.86

7.24

50.0

85.

7223

.19

3.93

31.7

83.

5145

.12

3.40

70.7

34.

8563

.82

1.99

1.85

.24

8.37

.79

20.2

25.

9229

.07

3.64

17.8

53.

2732

.87

6.63

49.2

98.

2651

.43

5.84

22.0

73.

3730

.65

3.40

42.2

72.

5070

.43

3.49

60.1

52.

632.

36.3

28.

33.9

315

.39

6.31

27.8

24.

5516

.09

2.73

40.7

07.

9343

.21

9.39

45.7

74.

8218

.43

2.71

28.6

32.

9039

.52

1.94

63.2

23.

5362

.89

2.71

1.83

.31

6.91

.65

16.7

65.

8227

.00

6.50

16.4

94.

1339

.75

12.2

643

.76

11.0

745

.06

9.93

18.0

74.

2925

.82

5.33

37.3

53.

2665

.57

4.71

56.8

23.

161.

82.4

06.

431.

3815

.93

6.78

23.1

46.

7817

.60

3.51

43.3

410

.90

39.0

712

.23

41.8

66.

7417

.60

3.73

24.9

94.

2140

.04

3.21

67.3

24.

1459

.37

3.02

1.59

.36

6.88

1.29

10.7

63.

8925

.90

7.56

15.5

23.

8647

.82

11.2

836

.65

10.5

741

.23

8.82

15.0

93.

1424

.30

4.53

36.0

22.

7360

.04

3.72

60.1

73.

521.

79.4

95.

771.

3117

.14

6.10

25.8

52.

3019

.53

3.60

37.4

85.

8442

.99

7.00

47.0

85.

9119

.91

3.32

27.6

63.

2541

.60

2.22

70.3

03.

3759

.47

3.04

2.16

.28

8.47

.74

13.9

47.

5324

.62

8.13

15.9

65.

1745

.48

12.5

838

.57

12.7

241

.73

10.7

517

.06

4.91

25.4

66.

1433

.31

6.93

53.9

111

.52

51.8

610

.53

1.52

.43

6.27

1.59

18.8

66.

0827

.82

5.20

20.1

44.

4333

.18

7.30

46.6

89.

4648

.58

6.75

20.3

53.

4828

.31

3.62

41.0

52.

1970

.08

3.69

58.7

82.

182.

04.2

67.

40.7

5

Kon

trola

Nor

-bin

alto

rfim

ina

10-4

MU

-504

88 1

0-7

M +

Nor

10-

6 M

U-5

0488

10-

6 M

+ N

or 1

0-5

MU

-504

88 1

0-5

M +

Nor

10-

4 M

U-5

0488

10-

7 M

U-5

0488

10-

6 M

U-5

0488

10-

5 M

0 o

rdu

Kon

trola

Nor

-bin

alto

rfim

ina

10-4

MU

-504

88 1

0-7

M +

Nor

10-

6 M

U-5

0488

10-

6 M

+ N

or 1

0-5

MU

-504

88 1

0-5

M +

Nor

10-

4 M

U-5

0488

10-

7 M

U-5

0488

10-

6 M

U-5

0488

10-

5 M

0,5

ordu

Kon

trola

Nor

-bin

alto

rfim

ina

10-4

MU

-504

88 1

0-7

M +

Nor

10-

6 M

U-5

0488

10-

6 M

+ N

or 1

0-5

MU

-504

88 1

0-5

M +

Nor

10-

4 M

U-5

0488

10-

7 M

U-5

0488

10-

6 M

U-5

0488

10-

5 M

1 or

du

Kon

trola

Nor

-bin

alto

rfim

ina

10-4

MU

-504

88 1

0-7

M +

Nor

10-

6 M

U-5

0488

10-

6 M

+ N

or 1

0-5

MU

-504

88 1

0-5

M +

Nor

10-

4 M

U-5

0488

10-

7 M

U-5

0488

10-

6 M

U-5

0488

10-

5 M

3,5

ordu

Bat

ezbe

stek

oE

rror

ea

A (%

)B

atez

best

eko

Err

orea

B (%

)B

atez

best

eko

Err

orea

C (%

)B

atez

best

eko

Err

orea

D (%

)B

atez

best

eko

Err

orea

AB

(%)

Bat

ezbe

stek

oE

rror

ea

VC

L (µ

m/s

)B

atez

best

eko

Err

orea

VS

L (µ

m/s

)B

atez

best

eko

Err

orea

VA

P (µ

m/s

)B

atez

best

eko

Err

orea

LIN

(%)

Bat

ezbe

stek

oE

rror

ea

STR

(%)

Bat

ezbe

stek

oE

rror

ea

WO

B (%

)B

atez

best

eko

Err

orea

ALH

(µm

)

Med

iaE

rror

ea

BC

F (H

z)

Doktore-tesia

148 Eranskinak

Eranski

MU

opi

oide

-har

tzai

lear

en a

goni

star

en (M

orfin

a) e

ta a

ntag

onis

tare

n (N

alox

ona)

era

gina

esp

erm

atoz

oide

en m

ugik

orta

sun-

para

met

roet

an

22.2

25.

0941

.63

4.76

17.9

61.

9718

.19

3.12

63.8

54.

4148

.08

1.10

19.7

01.

4129

.90

1.04

41.1

43.

3066

.50

5.78

62.2

31.

831.

70.2

58.

36.8

819

.18

4.75

49.3

65.

5017

.38

3.30

14.0

91.

9468

.54

4.28

50.8

42.

1819

.48

1.42

31.2

81.

4338

.31

2.38

62.1

63.

2461

.51

.70

1.93

.05

8.58

.27

19.1

84.

7549

.36

5.50

17.3

83.

3014

.09

1.94

68.5

44.

2850

.84

2.18

19.4

81.

4231

.28

1.43

38.3

12.

3862

.16

3.24

61.5

1.7

01.

93.0

58.

58.2

719

.18

4.75

49.3

65.

5017

.38

3.30

14.0

91.

9468

.54

4.28

50.8

42.

1819

.48

1.42

31.2

81.

4338

.31

2.38

62.1

63.

2461

.51

.70

1.93

.05

8.58

.27

19.1

84.

7549

.36

5.50

17.3

83.

3014

.09

1.94

68.5

44.

2850

.84

2.18

19.4

81.

4231

.28

1.43

38.3

12.

3862

.16

3.24

61.5

1.7

01.

93.0

58.

58.2

722

.22

5.09

41.6

34.

7617

.96

1.97

18.1

93.

1263

.85

4.41

48.0

81.

1019

.70

1.41

29.9

01.

0441

.14

3.30

66.5

05.

7862

.23

1.83

1.70

.25

8.36

.88

22.2

25.

0941

.63

4.76

17.9

61.

9718

.19

3.12

63.8

54.

4148

.08

1.10

19.7

01.

4129

.90

1.04

41.1

43.

3066

.50

5.78

62.2

31.

831.

70.2

58.

36.8

822

.22

5.09

41.6

34.

7617

.96

1.97

18.1

93.

1263

.85

4.41

48.0

81.

1019

.70

1.41

29.9

01.

0441

.14

3.30

66.5

05.

7862

.23

1.83

1.70

.25

8.36

.88

16.5

95.

0640

.72

2.88

19.8

11.

4322

.89

4.11

57.3

04.

6546

.07

2.06

18.2

91.

6429

.54

1.46

40.0

43.

8162

.54

5.93

64.0

6.5

91.

40.3

17.

061.

5323

.64

5.50

44.6

23.

8913

.54

3.68

18.2

12.

0268

.26

4.84

50.3

93.

4819

.77

1.78

31.0

12.

3039

.42

3.02

63.9

43.

9361

.51

1.46

1.70

.21

7.34

.93

17.1

54.

2740

.14

4.36

23.3

13.

7619

.40

3.96

57.2

94.

6948

.25

2.40

18.9

51.

3829

.11

1.30

39.2

52.

0064

.90

2.66

60.4

51.

541.

85.1

78.

12.8

628

.74

7.18

37.2

43.

6814

.88

.47

19.1

44.

0465

.98

4.45

48.4

62.

0221

.38

1.59

30.4

4.9

444

.65

4.31

70.4

85.

5962

.97

1.21

1.86

.05

7.85

.95

22.4

86.

8142

.76

5.09

16.5

41.

7918

.23

2.52

65.2

33.

0849

.52

2.44

20.2

52.

2231

.06

1.77

40.7

93.

4364

.92

4.68

62.6

51.

081.

82.2

07.

931.

1820

.61

7.46

42.1

42.

8519

.63

2.57

17.6

13.

0262

.76

5.09

47.4

72.

3620

.01

2.22

30.0

51.

8141

.96

3.46

66.5

15.

5663

.17

.95

1.64

.33

7.08

1.53

21.7

11.

1040

.41

5.20

19.9

51.

8217

.93

4.58

62.1

25.

8847

.05

2.89

19.3

2.6

429

.17

1.74

41.3

91.

5466

.69

2.15

62.0

5.9

21.

86.0

78.

18.7

022

.48

6.79

39.1

64.

5617

.91

2.23

20.4

53.

5761

.64

5.43

47.2

22.

2619

.88

1.95

29.7

41.

8241

.90

2.81

66.7

54.

4262

.92

1.86

1.85

.15

8.51

.57

19.2

35.

7534

.72

1.89

22.0

52.

8924

.00

2.51

53.9

54.

8543

.21

2.03

18.7

51.

8727

.66

1.22

43.1

73.

2067

.48

5.06

64.0

41.

021.

65.1

48.

34.4

916

.67

5.40

38.8

73.

8117

.94

2.01

26.5

14.

2455

.54

5.10

45.5

32.

5019

.43

1.70

28.9

61.

6342

.66

2.86

67.1

14.

4463

.59

.66

1.89

.20

7.69

.84

19.9

44.

5834

.17

1.60

19.2

81.

1526

.61

3.70

54.1

13.

6645

.09

2.60

19.7

01.

8628

.09

1.42

43.5

82.

9469

.76

4.06

62.3

8.9

11.

99.1

38.

64.2

023

.01

5.58

37.2

76.

4119

.39

3.20

20.3

24.

2160

.29

7.01

48.6

83.

7120

.85

2.06

30.7

41.

5443

.25

3.90

67.8

35.

4063

.84

2.94

1.82

.38

7.47

1.13

14.8

94.

3735

.92

2.28

19.0

42.

2230

.15

2.67

50.8

13.

4447

.00

1.15

18.1

81.

1529

.09

.92

38.5

91.

9262

.60

3.93

61.8

81.

061.

78.2

77.

961.

2823

.50

4.11

35.1

41.

8218

.81

1.13

22.5

64.

1958

.63

5.24

44.0

02.

0220

.53

1.61

28.3

11.

2046

.57

2.46

72.3

33.

6864

.38

.45

1.82

.12

8.39

.73

20.9

46.

8434

.55

2.77

22.3

72.

1922

.14

3.93

55.5

05.

1543

.05

1.94

19.2

31.

4527

.66

.78

44.8

53.

3969

.35

4.19

64.5

31.

991.

72.1

07.

64.9

617

.40

7.72

31.1

64.

2620

.74

4.25

30.7

05.

9948

.56

9.55

44.7

04.

1117

.18

2.78

27.6

32.

2138

.15

3.84

61.2

05.

3362

.18

2.00

1.65

.22

7.12

1.28

9.67

2.98

36.1

63.

1128

.27

2.40

25.9

13.

5945

.83

5.25

44.2

54.

2216

.88

1.34

27.9

11.

9738

.55

1.34

60.4

21.

4863

.89

2.28

1.63

.29

7.07

.91

7.72

1.37

40.2

62.

9125

.85

1.52

26.1

83.

1247

.97

4.18

45.2

82.

7316

.07

.87

27.8

41.

1135

.60

.96

57.7

32.

1061

.81

1.51

1.61

.30

6.69

1.12

13.8

42.

2436

.48

5.50

23.9

53.

2225

.74

2.62

50.3

14.

7645

.39

4.00

17.8

1.9

227

.94

1.80

40.2

13.

2164

.39

3.53

62.2

02.

121.

98.2

28.

31.7

58.

111.

8734

.82

5.98

23.4

03.

7933

.66

3.85

42.9

47.

1841

.67

5.98

16.1

41.

4926

.66

2.89

39.7

72.

1260

.89

1.14

65.2

12.

711.

60.1

17.

09.7

510

.85

3.30

46.8

63.

7522

.80

2.47

19.4

93.

0257

.71

3.43

51.6

65.

0718

.41

1.72

30.8

01.

7335

.74

1.14

59.5

23.

3060

.54

2.66

1.98

.53

6.40

1.37

4.59

1.44

22.5

36.

0828

.00

2.49

44.8

88.

3227

.12

7.45

30.1

54.

5812

.17

1.46

20.2

42.

6841

.53

2.15

60.9

53.

1268

.47

3.43

1.37

.27

6.57

1.32

8.39

2.24

32.9

95.

5423

.13

4.53

35.4

85.

4541

.38

7.69

42.6

65.

3616

.33

1.46

27.5

42.

6239

.30

2.51

59.5

11.

8965

.94

2.98

1.40

.29

5.84

.95

11.6

73.

6235

.01

4.92

22.0

22.

7431

.32

6.56

46.6

78.

2543

.15

4.05

17.8

41.

9128

.35

2.42

41.4

01.

9462

.60

1.87

66.1

22.

361.

84.2

77.

51.5

5

kont

rola

Nal

oxon

a 10

-4 M

Mor

fina

10-7

M +

Nal

oxon

a 10

-6 M

Mor

fina

10-6

M +

Nal

oxon

a 10

-5 M

Mor

fina

10-5

M +

Nal

oxon

a 10

-4 M

Mor

fina

10-7

MM

orfin

a 10

-6 M

Mor

fina

10-5

M

0 or

du

kont

rola

Nal

oxon

a 10

-4 M

Mor

fina

10-7

M +

Nal

oxon

a 10

-6 M

Mor

fina

10-6

M +

Nal

oxon

a 10

-5 M

Mor

fina

10-5

M +

Nal

oxon

a 10

-4 M

Mor

fina

10-7

MM

orfin

a 10

-6 M

Mor

fina

10-5

M

0,5

ordu

kont

rola

Nal

oxon

a 10

-4 M

Mor

fina

10-7

M +

Nal

oxon

a 10

-6 M

Mor

fina

10-6

M +

Nal

oxon

a 10

-5 M

Mor

fina

10-5

M +

Nal

oxon

a 10

-4 M

Mor

fina

10-7

MM

orfin

a 10

-6 M

Mor

fina

10-5

M

1 or

du

kont

rola

Nal

oxon

a 10

-4 M

Mor

fina

10-7

M +

Nal

oxon

a 10

-6 M

Mor

fina

10-6

M +

Nal

oxon

a 10

-5 M

Mor

fina

10-5

M +

Nal

oxon

a 10

-4 M

Mor

fina

10-7

MM

orfin

a 10

-6 M

Mor

fina

10-5

M

3,5

ordu

Bate

zbe

stek

oEr

rore

a

A (%

)Ba

tez

best

eko

Erro

rea

B (%

)Ba

tez

best

eko

Erro

rea

C (%

)Ba

tez

best

eko

Erro

rea

D (%

)Ba

tez

best

eko

Erro

rea

AB (%

)Ba

tez

best

eko

Erro

rea

VCL

(µm

/s)

Bate

zbe

stek

oEr

rore

a

VSL

(µm

/s)

Bate

zbe

stek

oEr

rore

a

VAP

(µm

/s)

Bate

zbe

stek

oEr

rore

a

LIN

(%)

Bate

zbe

stek

oEr

rore

a

STR

(%)

Bate

zbe

stek

oEr

rore

a

WO

B (%

)Ba

tez

best

eko

Erro

rea

ALH

(µm

)

Med

iaEr

rore

a

BCF

(Hz)

nak 149

Doktore-tesia

CB

1 ka

nnab

inoi

de-h

artz

aile

aren

ago

nist

aren

(AC

EA) e

ta a

ntag

onis

tare

n (S

R14

1716

a) e

ragi

na e

sper

mat

ozoi

deen

mug

ikor

tasu

n-pa

ram

etro

etan

46.2

16.

4617

.54

4.89

9.54

2.10

26.7

14.

3963

.75

2.86

72.1

73.

8153

.02

5.00

58.9

45.

2373

.02

3.40

89.8

51.

5381

.21

3.01

2.03

.02

10.1

7.2

547

.37

5.52

14.1

74.

7510

.70

1.12

27.7

51.

8561

.55

1.41

69.8

11.

5846

.12

4.07

51.2

83.

3666

.05

5.77

89.4

62.

3773

.49

4.78

2.34

.17

10.0

8.5

038

.41

4.78

14.3

04.

1710

.80

1.78

36.5

07.

9152

.71

6.30

66.4

64.

9343

.06

5.83

49.6

35.

6463

.92

4.31

86.0

82.

3274

.10

3.69

2.30

.20

10.3

8.3

937

.07

7.26

14.7

22.

4310

.59

2.02

37.6

25.

7651

.80

5.09

58.4

14.

1038

.17

6.07

42.8

95.

6864

.36

5.55

88.2

62.

5672

.61

4.31

2.13

.12

10.6

4.2

336

.04

1.17

23.7

84.

1017

.22

2.54

22.9

62.

0159

.82

4.19

65.6

74.

8837

.24

4.35

45.3

85.

1056

.26

2.73

82.0

31.

3168

.54

2.78

2.60

.06

9.40

.42

39.5

42.

2820

.39

1.76

10.4

61.

1729

.61

1.82

59.9

31.

9266

.28

2.57

40.3

42.

8246

.64

3.08

60.7

12.

5386

.45

1.08

70.1

82.

382.

40.1

29.

71.1

426

.77

3.48

19.6

04.

3416

.27

2.05

37.3

74.

7146

.38

6.19

55.9

28.

2931

.27

4.85

38.0

95.

9255

.64

1.66

82.1

41.

5367

.78

2.04

2.27

.20

9.45

.19

38.4

42.

4314

.70

3.07

14.0

61.

6632

.80

6.70

53.1

35.

3955

.53

3.46

37.2

93.

6242

.72

4.36

66.7

83.

6287

.42

1.06

76.3

94.

021.

97.0

99.

83.2

342

.34

5.34

15.4

42.

5613

.24

4.04

28.9

82.

2657

.78

3.58

55.5

17.

1237

.68

7.30

42.4

27.

3066

.09

4.78

87.8

72.

3075

.00

3.81

1.95

.07

10.2

1.4

425

.10

3.58

18.7

83.

3614

.39

3.06

41.7

33.

4943

.89

3.67

52.7

92.

1428

.97

2.92

34.7

62.

6954

.58

3.98

82.8

42.

2365

.65

3.25

2.26

.22

9.11

.71

36.9

35.

9127

.45

4.42

10.7

51.

4524

.88

2.86

64.3

83.

5073

.65

6.22

45.3

46.

5154

.18

7.02

60.8

55.

1583

.14

2.78

72.9

14.

402.

45.1

68.

95.6

130

.76

2.63

22.5

52.

5513

.97

2.88

32.7

34.

7453

.31

3.13

58.3

74.

2430

.37

3.93

37.5

63.

4851

.62

4.73

79.9

43.

5564

.22

3.30

2.30

.22

9.11

.27

21.1

44.

5625

.83

6.08

9.39

1.96

43.6

46.

6746

.97

6.69

58.2

77.

7527

.54

5.21

35.8

35.

4946

.89

5.48

75.8

43.

6161

.26

4.01

2.28

.19

8.85

.55

24.8

13.

1619

.47

3.00

18.8

33.

8736

.89

4.42

44.2

83.

0250

.22

6.67

24.8

52.

7930

.95

3.10

50.0

33.

0080

.08

1.75

62.4

23.

042.

37.3

48.

67.3

831

.34

5.44

23.5

04.

8711

.84

1.67

33.3

33.

4054

.84

4.27

59.6

36.

1229

.77

4.70

37.2

44.

7549

.40

3.83

79.2

03.

0762

.10

2.41

2.54

.19

8.04

.41

28.8

04.

0222

.49

1.89

14.2

22.

5034

.50

2.57

51.2

92.

3454

.56

3.78

27.5

42.

6535

.34

2.49

50.6

24.

3277

.60

3.37

64.9

12.

952.

18.1

09.

06.2

221

.84

3.14

21.8

94.

0915

.30

3.58

40.9

86.

3043

.72

3.43

53.1

24.

7225

.65

4.01

33.2

93.

6447

.48

3.67

75.9

14.

2262

.33

1.51

2.32

.14

9.01

.77

23.3

22.

9324

.28

2.17

17.3

12.

0135

.10

3.86

47.6

02.

7450

.91

6.12

23.2

82.

6230

.56

3.27

45.9

82.

3276

.14

2.57

60.3

21.

402.

21.1

98.

75.6

629

.85

2.15

18.2

02.

5613

.21

1.71

38.7

55.

2148

.05

3.96

53.2

24.

6026

.64

3.19

32.7

23.

2949

.55

1.91

80.8

51.

8661

.22

1.00

2.42

.16

8.92

.62

12.9

96.

6920

.28

3.01

17.5

93.

6849

.15

4.05

33.2

73.

7746

.81

6.87

19.1

64.

1427

.35

4.43

40.2

13.

9668

.90

5.19

58.0

81.

312.

04.2

56.

95.9

531

.95

4.48

26.9

14.

3314

.42

1.56

26.7

22.

0458

.87

1.19

67.5

86.

4739

.28

7.20

48.8

57.

0356

.79

5.71

79.1

84.

1871

.27

3.78

2.33

.10

9.62

.16

34.1

94.

2319

.67

1.21

10.8

71.

1235

.28

4.87

53.8

64.

4356

.94

7.47

31.8

85.

4437

.66

5.70

55.1

03.

2283

.82

1.94

65.5

82.

472.

24.0

89.

79.5

325

.35

6.46

22.7

52.

4413

.36

2.22

38.5

54.

5148

.10

5.61

59.0

57.

3227

.66

4.36

36.0

14.

9246

.68

4.45

76.3

13.

4260

.80

2.95

2.46

.12

8.88

.49

18.3

95.

0823

.72

4.06

13.9

93.

5043

.91

7.73

42.1

06.

7449

.85

6.14

22.5

14.

0630

.51

4.33

45.0

95.

4373

.06

5.58

61.1

73.

121.

90.3

67.

59.7

729

.39

4.17

29.6

07.

1015

.93

1.25

25.0

93.

7158

.98

3.05

61.2

03.

9130

.47

5.72

39.5

34.

5649

.39

7.83

75.4

15.

1464

.45

5.49

2.26

.31

8.74

.92

24.0

02.

7823

.49

3.74

17.1

82.

3435

.33

5.89

47.4

94.

5050

.01

5.19

24.6

13.

0731

.90

3.54

49.1

32.

6576

.91

1.91

63.7

51.

862.

33.2

08.

59.3

921

.13

7.39

18.1

7.8

015

.05

2.92

45.6

56.

5739

.31

6.60

50.0

06.

3921

.55

3.08

29.7

63.

0443

.83

5.97

72.2

26.

8660

.10

2.71

2.27

.32

7.53

.47

24.0

96.

8727

.03

4.99

14.3

51.

6734

.55

8.17

51.1

17.

0655

.38

4.89

25.5

74.

7234

.13

3.52

45.9

27.

4773

.09

6.68

61.7

54.

412.

31.2

68.

96.8

720

.00

4.55

23.4

82.

0424

.50

1.58

32.0

34.

9643

.47

3.51

46.6

63.

7020

.68

2.43

27.7

22.

6944

.07

2.68

74.3

12.

6659

.17

1.60

2.27

.12

9.07

.59

6.22

2.71

11.0

61.

9915

.91

3.38

66.8

13.

8017

.28

4.58

39.8

47.

2616

.14

3.73

23.3

54.

2939

.78

1.99

68.0

43.

6958

.52

.52

2.16

.51

6.28

.79

32.0

92.

6024

.44

3.56

15.4

13.

2828

.07

3.48

56.5

33.

8564

.12

4.75

33.2

32.

9241

.92

3.99

51.8

62.

5379

.46

1.53

65.2

32.

672.

88.1

78.

93.2

631

.54

5.25

22.1

74.

1310

.10

1.13

36.2

05.

7653

.70

5.33

62.2

65.

8932

.39

5.38

40.0

84.

4451

.81

7.00

79.3

84.

9364

.49

4.75

2.61

.23

9.15

.39

26.3

55.

5118

.04

6.15

17.2

91.

5038

.32

5.25

44.3

96.

1557

.99

6.38

28.3

94.

0536

.08

4.56

49.1

55.

5578

.43

4.17

62.1

33.

672.

41.2

09.

22.5

112

.34

5.12

17.7

23.

7414

.28

2.53

55.6

63.

7030

.06

2.14

51.3

54.

6522

.45

3.63

31.2

03.

1343

.83

5.67

71.3

66.

1360

.76

2.60

1.88

.32

7.10

1.17

25.6

75.

1921

.93

3.03

12.3

01.

7940

.10

4.43

47.6

04.

6964

.45

7.26

29.7

26.

1338

.67

6.11

44.9

54.

2175

.45

3.98

59.2

52.

622.

80.0

88.

90.8

225

.17

1.02

26.3

9.8

816

.52

3.38

31.9

23.

8551

.56

.53

52.2

83.

5524

.49

2.27

31.8

92.

2546

.65

1.72

76.4

52.

2060

.98

.50

2.49

.21

8.61

.40

17.0

55.

2426

.16

5.47

14.5

5.6

942

.25

7.56

43.2

08.

2047

.16

3.96

19.8

52.

0028

.22

2.19

42.6

94.

2971

.09

6.76

59.9

4.6

01.

96.4

06.

951.

3120

.03

6.49

19.0

7.8

121

.08

4.57

39.8

23.

8539

.11

5.71

45.3

34.

8619

.86

2.74

26.8

92.

6543

.82

3.78

73.1

64.

3259

.68

2.40

2.34

.36

8.44

.60

14.1

82.

9930

.40

3.18

17.8

41.

5337

.58

4.25

44.5

84.

5047

.77

2.46

18.8

91.

7727

.88

1.75

39.6

43.

5767

.56

3.76

58.3

51.

992.

43.1

87.

28.5

81.

391.

119.

461.

5012

.64

3.39

76.5

25.

0510

.84

1.97

35.6

92.

4413

.11

1.56

21.1

81.

4236

.38

2.04

61.3

03.

6259

.40

1.19

.52

.32

1.19

.79

Kon

trola

AC

EA

10-

7 M

AC

EA

10-

6 M

AC

EA

10-

5 M

SR

1417

16a

10-7

MS

R14

1716

a 10

-6M

SR

1417

16a

10-5

MA

CE

A 1

0-7

M +

SR

1417

16a

10-7

MA

CE

A 1

0-6

M +

SR

1417

16a

10-6

MA

CE

A 1

0-5

M +

SR

1417

16a

10-5

M

0 or

du

Kon

trola

AC

EA

10-

7 M

AC

EA

10-

6 M

AC

EA

10-

5 M

SR

1417

16a

10-7

MS

R14

1716

a 10

-6M

SR

1417

16a

10-5

MA

CE

A 1

0-7

M +

SR

1417

16a

10-7

MA

CE

A 1

0-6

M +

SR

1417

16a

10-6

MA

CE

A 1

0-5

M +

SR

1417

16a

10-5

M

0,5

ordu

Kon

trola

AC

EA

10-

7 M

AC

EA

10-

6 M

AC

EA

10-

5 M

SR

1417

16a

10-7

MS

R14

1716

a 10

-6M

SR

1417

16a

10-5

MA

CE

A 1

0-7

M +

SR

1417

16a

10-7

MA

CE

A 1

0-6

M +

SR

1417

16a

10-6

MA

CE

A 1

0-5

M +

SR

1417

16a

10-5

M

1 or

du

Kon

trola

AC

EA

10-

7 M

AC

EA

10-

6 M

AC

EA

10-

5 M

SR

1417

16a

10-7

MS

R14

1716

a 10

-6M

SR

1417

16a

10-5

MA

CE

A 1

0-7

M +

SR

1417

16a

10-7

MA

CE

A 1

0-6

M +

SR

1417

16a

10-6

MA

CE

A 1

0-5

M +

SR

1417

16a

10-5

M

2.00

Bat

ezbe

stek

oE

rrore

a

A (%

)B

atez

best

eko

Erro

rea

B (%

)B

atez

best

eko

Erro

rea

C (%

)B

atez

best

eko

Erro

rea

D (%

)B

atez

best

eko

Erro

rea

AB

(%)

Bat

ezbe

stek

oE

rrore

a

VC

L (µ

m/s

)B

atez

best

eko

Erro

rea

VS

L (µ

m/s

)B

atez

best

eko

Erro

rea

VA

P (µ

m/s

)B

atez

best

eko

Erro

rea

LIN

(%)

Bat

ezbe

stek

oE

rrore

a

STR

(%)

Bat

ezbe

stek

oE

rrore

a

WO

B (%

)B

atez

best

eko

Erro

rea

ALH

(µm

)

Med

iaE

rrore

a

BC

F (H

z)

Doktore-tesia

150 Eranskinak

CB

2 ka

nnab

inoi

de-h

artz

aile

aren

ago

nist

aren

(JW

H-0

15) e

ta a

ntag

onis

tare

n (S

R14

4528

) era

gina

esp

erm

atoz

oide

en m

ugik

orta

sun-

para

met

roet

an

50.7

22.

8021

.35

2.98

8.56

2.39

19.3

72.

1980

.63

2.19

89.6

63.

0261

.82

2.27

70.2

82.

4269

.08

2.73

87.9

4.4

378

.53

2.78

2.45

.07

10.1

0.3

347

.79

2.91

24.5

12.

947.

981.

3619

.74

2.83

80.2

72.

8384

.71

2.84

50.7

23.

0559

.64

2.58

59.8

22.

5984

.88

1.69

70.4

21.

992.

70.1

310

.56

.73

41.6

45.

9027

.60

8.28

8.47

1.95

22.2

92.

1477

.71

2.14

76.6

55.

0044

.29

3.22

53.7

81.

5359

.11

7.01

82.0

94.

1271

.20

5.48

2.60

.37

10.3

4.5

655

.77

3.38

17.4

31.

705.

791.

0921

.02

3.76

78.9

93.

7679

.80

4.13

52.9

04.

3959

.07

4.69

66.0

32.

2789

.49

.30

73.7

72.

332.

41.0

610

.79

.08

46.2

82.

8224

.24

2.35

6.61

.86

22.8

64.

7077

.14

4.70

81.6

22.

4051

.10

2.95

60.1

23.

1462

.72

3.74

84.9

41.

5073

.71

3.42

2.55

.21

10.5

6.3

545

.92

7.95

26.4

96.

509.

722.

2817

.87

4.06

82.1

34.

0675

.97

2.47

44.8

54.

0653

.64

3.38

59.2

75.

7583

.18

3.52

70.7

64.

482.

53.2

610

.38

.69

49.9

92.

7119

.91

3.76

10.8

62.

1219

.25

4.78

80.7

54.

7872

.57

2.35

49.8

21.

3456

.37

2.04

68.6

91.

1088

.50

1.71

77.6

4.6

12.

13.0

610

.30

.17

46.7

02.

8320

.76

3.57

10.6

82.

2221

.86

2.53

78.1

42.

5366

.47

2.53

44.1

61.

6849

.93

2.36

66.4

91.

5388

.55

1.00

75.1

01.

752.

16.0

910

.69

.28

45.9

75.

4019

.65

3.97

9.15

2.11

25.2

35.

6974

.78

5.69

75.5

84.

5750

.96

3.51

57.8

03.

6667

.36

1.67

88.0

91.

6776

.45

.63

2.21

.04

10.3

4.4

750

.79

4.90

21.9

92.

2811

.20

2.39

16.0

32.

7283

.97

2.72

72.9

83.

5946

.78

5.32

54.9

65.

5363

.56

4.64

84.8

01.

7074

.78

4.27

2.28

.14

10.6

8.2

043

.25

4.26

22.7

12.

4310

.96

1.11

23.0

92.

4076

.91

2.40

79.6

72.

2051

.28

4.50

60.6

54.

1764

.06

4.22

84.1

92.

0775

.88

3.44

2.49

.03

9.89

.69

39.5

97.

4221

.62

2.65

10.5

81.

2828

.22

5.32

71.7

85.

3273

.19

5.64

39.8

21.

7547

.77

2.14

55.6

15.

5983

.48

2.69

66.2

34.

812.

78.4

210

.30

.43

37.8

47.

4920

.70

4.79

11.0

41.

4730

.42

2.76

69.5

82.

7675

.00

3.42

42.9

56.

3150

.90

5.48

57.1

37.

1683

.49

3.02

67.8

66.

162.

52.3

19.

46.2

830

.38

5.85

29.5

15.

0614

.07

1.82

26.0

53.

3973

.96

3.39

74.9

15.

4034

.06

2.98

43.3

52.

2246

.36

5.72

78.2

73.

7058

.61

4.45

3.14

.43

10.2

0.2

842

.40

4.79

20.0

04.

8710

.71

1.60

26.9

03.

0073

.10

3.00

71.7

91.

5340

.19

2.00

48.1

1.9

256

.14

3.54

83.4

12.

8667

.12

2.05

2.50

.15

10.2

8.3

341

.83

2.65

20.5

84.

1410

.03

2.20

27.5

74.

2772

.44

4.27

72.8

85.

8443

.54

3.17

51.3

63.

2460

.18

3.68

84.6

82.

0470

.91

2.78

2.42

.23

10.2

5.4

640

.11

1.41

18.1

63.

8811

.51

2.42

30.2

25.

1069

.78

5.10

66.9

74.

7142

.28

3.47

48.6

93.

7463

.48

4.22

86.8

42.

1773

.01

3.97

2.28

.30

9.92

.31

45.2

21.

4418

.93

4.22

10.2

52.

0825

.61

2.04

74.4

02.

0470

.33

5.09

41.1

52.

0148

.45

2.30

58.8

31.

7184

.94

1.55

69.2

81.

782.

55.1

810

.00

.67

42.8

24.

4317

.34

2.83

10.1

21.

8829

.72

3.99

70.2

83.

9972

.49

6.74

42.3

33.

1150

.35

4.12

58.9

63.

5084

.28

1.91

69.8

12.

872.

54.2

110

.24

.49

32.6

25.

9425

.25

4.55

13.4

21.

1228

.72

2.67

71.2

82.

6769

.18

4.53

35.2

33.

9143

.77

3.04

51.7

46.

9079

.89

3.79

63.9

85.

602.

58.2

810

.14

.78

39.0

82.

2626

.12

3.62

14.3

23.

4020

.49

3.28

79.5

13.

2877

.48

4.73

46.5

13.

5655

.44

4.27

60.2

23.

5783

.96

1.52

71.7

13.

922.

69.1

710

.08

.48

36.2

82.

1922

.85

2.62

14.1

22.

6026

.75

1.35

73.2

51.

3571

.49

7.37

40.1

03.

9248

.26

4.15

56.5

03.

6782

.87

1.91

68.0

43.

282.

57.2

49.

60.5

047

.58

5.55

22.1

33.

708.

391.

0821

.91

2.09

78.1

02.

0978

.53

6.79

46.2

65.

2553

.74

4.92

59.3

35.

7985

.61

2.91

68.8

54.

672.

71.3

89.

99.2

330

.56

6.12

31.9

17.

7411

.08

2.37

26.4

54.

6473

.55

4.64

79.2

54.

1435

.53

5.31

45.9

13.

4745

.33

7.28

76.3

25.

7758

.29

4.90

3.35

.38

9.18

.53

39.0

35.

9130

.96

5.54

8.33

2.78

21.6

83.

0978

.33

3.09

77.2

35.

6741

.45

1.85

50.5

3.9

054

.75

5.46

82.0

43.

4766

.30

4.14

2.76

.28

9.33

.45

38.7

54.

7824

.30

6.20

9.86

2.96

27.1

03.

1572

.90

3.15

75.1

67.

2244

.02

1.59

52.0

4.8

960

.47

6.88

84.7

33.

8570

.74

5.38

2.60

.33

10.1

3.5

443

.24

5.84

18.5

21.

7012

.07

1.49

26.1

85.

5473

.82

5.54

71.8

32.

2940

.19

2.02

47.3

81.

8956

.05

2.94

84.7

51.

5966

.05

2.52

2.74

.28

10.5

9.3

042

.52

3.05

22.2

23.

6712

.36

1.97

22.9

03.

9377

.11

3.93

72.9

14.

4641

.22

2.49

49.4

12.

8256

.54

.33

83.4

51.

7767

.85

1.44

2.72

.22

9.72

.32

41.2

53.

7921

.52

2.91

10.5

13.

6026

.71

6.29

73.2

96.

2975

.60

5.02

43.3

22.

4151

.18

2.88

57.7

03.

3184

.70

1.77

68.0

12.

892.

74.2

79.

89.2

735

.24

3.52

28.3

14.

9814

.65

1.30

21.8

01.

7978

.20

1.79

79.3

25.

3238

.73

2.87

48.7

42.

5549

.51

5.09

79.2

22.

3662

.08

4.57

3.31

.35

10.3

2.5

237

.82

3.42

25.3

54.

3913

.52

2.85

23.3

02.

8676

.70

2.86

68.7

44.

5939

.38

4.95

47.2

74.

7257

.01

4.62

82.7

82.

2368

.57

3.73

2.63

.14

9.74

.30

46.6

32.

1622

.96

.72

9.80

.79

20.6

22.

2379

.39

2.23

74.9

54.

2139

.16

1.48

47.2

01.

1452

.80

3.76

82.8

91.

3563

.58

3.84

3.05

.36

9.67

.20

28.9

01.

7932

.76

1.89

13.9

01.

2524

.45

3.28

75.5

53.

2870

.33

4.09

35.0

61.

2044

.72

2.17

50.2

22.

7178

.67

2.61

63.7

51.

692.

84.2

19.

61.4

624

.31

1.35

41.3

82.

3710

.64

.87

23.6

92.

0076

.31

2.00

89.1

96.

4832

.82

.72

45.1

01.

2837

.24

2.04

72.8

2.5

451

.10

2.51

3.80

.41

8.71

.20

41.5

72.

9919

.67

1.55

12.8

51.

6225

.91

2.35

74.0

92.

3573

.81

6.45

42.4

13.

5949

.93

3.38

57.7

03.

4984

.61

2.08

68.1

03.

082.

73.2

49.

91.3

131

.68

3.91

23.3

93.

9215

.26

.91

29.6

82.

9270

.32

2.92

69.6

82.

6835

.42

2.27

43.5

11.

1651

.41

5.29

81.1

83.

0862

.88

3.98

2.86

.19

9.65

.16

33.4

45.

9324

.17

5.29

15.2

41.

8427

.15

4.96

72.8

64.

9668

.74

3.31

35.4

23.

4343

.53

2.69

51.2

12.

8180

.85

2.90

63.2

51.

593.

02.2

99.

94.2

635

.70

2.29

23.7

3.4

815

.71

1.08

24.8

82.

9375

.13

2.93

64.6

73.

8333

.96

.81

41.2

31.

2652

.88

2.19

82.4

2.5

964

.13

2.32

2.83

.36

9.79

.45

38.2

53.

3330

.56

3.79

12.3

73.

3918

.83

2.70

81.1

72.

7069

.35

4.58

35.3

32.

8344

.01

2.24

51.0

02.

9779

.92

2.54

63.7

42.

402.

72.1

99.

69.2

329

.98

2.80

33.1

42.

9511

.62

1.44

25.2

72.

3274

.74

2.32

74.9

51.

7534

.37

1.45

44.4

41.

3446

.07

2.97

77.2

91.

5659

.51

3.14

3.25

.28

9.13

.37

Kon

trola

JWH

-015

10-

7 M

JWH

-015

10-

6 M

JWH

-015

10-

5 M

SR

1445

28 1

0-7

MS

R14

4528

10-

6 M

SR

1445

28 1

0-5

MJW

H-0

15 1

0-7

M +

SR

1445

28 1

0-7

MJW

H-0

15 1

0-6

M +

SR

1445

28 1

0-6

MJW

H-0

15 1

0-5

M +

SR

1445

28 1

0-5

M

0 or

du

Kon

trola

JWH

-015

10-

7 M

JWH

-015

10-

6 M

JWH

-015

10-

5 M

SR

1445

28 1

0-7

MS

R14

4528

10-

6 M

SR

1445

28 1

0-5

MJW

H-0

15 1

0-7

M +

SR

1445

28 1

0-7

MJW

H-0

15 1

0-6

M +

SR

1445

28 1

0-6

MJW

H-0

15 1

0-5

M +

SR

1445

28 1

0-5

M

0,5

ordu

Kon

trola

JWH

-015

10-

7 M

JWH

-015

10-

6 M

JWH

-015

10-

5 M

SR

1445

28 1

0-7

MS

R14

4528

10-

6 M

SR

1445

28 1

0-5

MJW

H-0

15 1

0-7

M +

SR

1445

28 1

0-7

MJW

H-0

15 1

0-6

M +

SR

1445

28 1

0-6

MJW

H-0

15 1

0-5

M +

SR

1445

28 1

0-5

M

1 or

du

Kon

trola

JWH

-015

10-

7 M

JWH

-015

10-

6 M

JWH

-015

10-

5 M

SR

1445

28 1

0-7

MS

R14

4528

10-

6 M

SR

1445

28 1

0-5

MJW

H-0

15 1

0-7

M +

SR

1445

28 1

0-7

MJW

H-0

15 1

0-6

M +

SR

1445

28 1

0-6

MJW

H-0

15 1

0-5

M +

SR

1445

28 1

0-5

M

2 or

du

Bat

ezbe

stek

oE

rrore

a

A (%

)B

atez

best

eko

Erro

rea

B (%

)B

atez

best

eko

Erro

rea

C (%

)B

atez

best

eko

Erro

rea

D (%

)B

atez

best

eko

Erro

rea

AB

(%)

Bat

ezbe

stek

oE

rrore

a

VC

L (µ

m/s

)B

atez

best

eko

Erro

rea

VS

L (µ

m/s

)B

atez

best

eko

Erro

rea

VA

P (µ

m/s

)B

atez

best

eko

Erro

rea

LIN

(%)

Bat

ezbe

stek

oE

rrore

a

STR

(%)

Bat

ezbe

stek

oE

rrore

a

WO

B (%

)B

atez

best

eko

Erro

rea

ALH

(µm

)B

atez

best

eko

Erro

rea

BC

F (H

z)