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ESPECIAL UVA DE MESA Y PARA VINO Julio 202150

L DR. SEBASTIÁN MOLINETT1 Y DRA. DANAE RIQUELME2.

1 CENTRO REGIONAL DE INVESTIGACIÓN INIA LA CRUZ. 2 CENTRO REGIONAL DE INVESTIGACIÓN INIA LA PLATINA.

OPORTUNIDADES Y DESAFÍOSPARA ALTERNATIVAS DE CONTROL DE ORIGEN

NATURAL Y HERRAMIENTAS NANOTECNOLÓGICAS

a pudrición gris o pudrición del racimo, como se conoce a la en-fermedad causada por Botrytis cinerea, es el problema de ma-yor relevancia fitosanitario en

uva de mesa. Si bien es frecuente las pérdidas asociadas a esta enfermedad en campo y en embalaje, la inciden-cia aumenta sustancialmente cuando existen condiciones favorables de in-fección, como primaveras húmedas y precipitaciones desde pinta.

El control de esta enfermedad nor-malmente se realiza a través de mane-jos culturales, con fungicidas sintéticos convencionales en conjunto con el al-macenamiento en frío e incorporación de generadores de anhídrido sulfuroso. Sin embargo, han surgido diversas al-ternativas de control que pueden ofre-cer soluciones sostenibles, teniendo un origen natural (ya sean compuestos obtenidos de fuente de carbono bioló-gico o sintético), y con un mayor grado de inocuidad para el consumidor que los fungicidas tradicionales que, a tra-vés de tecnologías de nanoencapsula-ción, pueden lograr un efecto fungici-da para el control de patógenos.

El presente artículo discute acerca de la potencial contribución de estas tec-nologías al desarrollo de soluciones fi-tosanitarias, particularmente en el caso de la pudrición gris en uva de mesa, identificando las oportunidades y de-safíos para la implementación de esta clase de tecnologías en la uva de mesa.

EL PROBLEMA: LA PUDRICIÓN GRISEn la actualidad, son más de tres espe-cies de Botrytis las que han sido iden-tificadas produciendo pudrición en uva a nivel mundial; sin embargo, la frecuencia de aislamiento indica que B. cinerea es la principal especie asocia-da, por lo que el control debe dirigirse en esa dirección. La pudrición gris, causada por B. cine-rea, se caracteriza por comenzar como un pardeamiento violáceo en la zona de infección de la baya, dejando la piel suelta y pulpa intacta. Este síntoma

avanza sobre la baya observándose rápidamente crecimiento micelial gri-sáceo y esporulación del hongo. Otros síntomas frecuentes son las manchas marrones forma de ‘V’ de las hojas, junto con necrosis de brotes, y lesio-nes pardas en el raquis de los racimos. Estos forman parte de las fuentes de

Pudrición gris en uva de mesa

inóculo del hongo, en donde se mul-tiplicará y diseminará a través de co-rrientes de aire.Esta enfermedad se puede desarrollar en precosecha, asociándose a racimos apretados que generan un microclima de alta humedad relativa cercano a la baya. B. cinerea no requiere de heridas

para infectar, aunque las heridas facili-tan su entrada. Un ejemplo de ello fue la alta incidencia por pudrición de raci-mo asociada a partidura de bayas, que se observó en la zona central del país luego de la lluvia de fines de enero de este año. Principalmente se observa-ron microfisuras y partiduras, ubicadas principalmente en la zona distal y late-ral de la baya, lo que generó una entra-da directa del patógeno a la fruta. Esto coincidió con época cercana a cosecha de variedades como Thompson Seed-less, observándose rápidamente una pudrición y esporulación del hongo, con la formación de nidos de Botrytis (Figura 1). El nivel de incidencia de la partidura estuvo asociado al estado de madurez y variedad de la fruta, dado por la cantidad de azúcar contenida que genera un diferencial de concen-tración que favorece el ingreso de agua a la baya.

Como es conocido, el control de esta enfermedad se basa la integración de manejos culturales que aumentan la ventilación cerca del racimo, como la regulación de la carga, raleo y arre-glo de racimo, deshoje, desbrote y apertura de ventanas. La aplicación de estas prácticas es intransable, y en ellas se debe apoyar todo manejo. Sin embargo, la aplicación de productos químicos botryticidas es recomendada para la disminución de la densidad de inóculo los cuales pueden ser comple-mentados con plaguicidas microbianos y extractos vegetales.

Debido a la capacidad de Botrytis de crecer e infectar desde 0 °C, infeccio-nes latentes no desarrolladas en pre-cosecha a menudo se activan durante el almacenamiento en frío, cuando las condiciones de la uva son favorables su desarrollo. Los fungicidas no son del todo efectivos en el control de in-fecciones latentes, por lo que la apli-cación con anhídrido sulfuroso, como gasificación y mediante generadores es considerada como una medida eficaz para la inactivación de estas y nuevas infecciones.Figura 1. Nido de Botrytis sp. en el huerto producido posterior a un evento de precipitaciones cercano a cosecha.

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EL DESAFÍO DE INCORPORARSOLUCIONES INOCUASLa alta incidencia de pudrición ob-servada este año planteó el desafío de incorporar soluciones inocuas, de efecto inmediato y de liberación con-trolada, de baja o nula carencia para el control de esta enfermedad. Además, dada las restricciones de los mercados de destino, existe un número limitado de aplicaciones e ingredientes activos que se pueden utilizar. Por lo tanto, se observa una brecha en las tecnologías disponibles para el control de la pudri-ción gris en vid, extrapolable a otros cultivos.

En postcosecha, la fumigación con anhídrido sulfuroso (SO2) y el uso de generadores de este compuesto, es una práctica frecuente y se aplica de forma exitosa para el control de la pudrición gris. Sin embargo, presenta ciertas desventajas por sus efectos residuales sobre la baya a nivel organoléptico (alteración del sabor) y de aspecto (le-siones por blanqueamiento) cuando se utiliza en forma inadecuada. Por ello, es necesario el desarrollo de alterna-tivas a este compuesto, idealmente de liberación gaseosa controlada durante el tiempo de almacenamiento y con una visión más inocua para el trata-miento de los racimos.

ALTERNATIVAS AL ANHÍDRIDO SULFUROSO Como métodos alternativos de control, en la literatura se ha reportado que la fumigación con ácido acético ha logra-do disminuir el deterioro de las bayas por Botrytis y Penicillium de forma sig-nificativa y que podría constituir una alternativa al tratamiento con SO2; sin embargo también presenta ciertos problemas relacionados con su impac-to organoléptico en la baya. Por otra parte, la aplicación de dosis sub-letales de etanol, en formato de soluciones hi-droalcohólicas combinada con sales de potasio, podrían ser efectivas en con-trolar la pudrición gris. También, se ha estudiado el uso de (E)-2-hexenal, compuesto con propiedades antifún-gicas producido significativamente de forma natural por el tejido vegetal, disminuye el deterioro por Botrytis en diversos modelos de fruta, incluyendo uva de mesa. Además, la aplicación en postcosecha de jasmonato -una hor-mona que participa de la respuesta de defensa de las plantas contra el ataque de fitopatógenos- ha mostrado buenos resultados en el control de la pudri-ción gris. Otros compuestos que han sido evaluados con resultados prome-tedores para el control de enfermeda-des fúngicas en uva de mesa son gases como el ozono, biopolímeros como el

quitosano, sales de carbonato y bicar-bonato, entre otros productos antimi-crobianos.

Otro tipo de productos alternativos son los extractos de plantas y aceites esenciales. El extracto de Aloe vera, una planta tropical y subtropical usada por siglos por sus propiedades medici-nales y terapéuticas, ha sido probado con éxito para su uso como recubri-miento antimicrobiano para preservar la calidad en la post-cosecha de diver-sas frutas y vegetales, incluyendo uva de mesa, e inhibiendo la proliferación de esporas de B. cinerea. Además, ex-tractos de Satureja hortensis (Ajedrea de jardín) han mostrado ser efectivos contra Alternaria mali y B. cinerea. También, extractos de semillas de Xylo-pia aethiopica (pimienta etíope) y Zin-giber officinale (jengibre) fueron efecti-vos contras Aspergillus niger y A. flavus. Por otra parte, el interés en los aceites esenciales y su aplicación en conserva-ción de alimentos ha aumentado du-rante los últimos años debido al incre-mento de la percepción negativa de los preservantes sintéticos por parte de los consumidores. Los aceites esenciales de canela y clavo han mostrado resul-tados exitosos para el control en uva de enfermedades causadas por diver-sos hongos tales como Aspergillus, Al-ternaria, Colletotrichum, Lasiodiplodia, Botrytis, entre otros. Además, aceites esenciales de orégano y romero por sí solos y en combinación fueron capaces de inhibir el crecimiento de los hongos tales como Aspergillus y Botrytis. Tam-bién, componentes activos de diversos aceites esenciales, tales como eugenol, carvacrol, timol, entre otros han mos-trado ser efectivos en el control de la pudrición gris, causada por B. Cinerea.

Un aspecto técnico a resolver por estos productos tiene relación con que

Dr. Sebastián Molinett, Centro Regional de Investigación INIA La Cruz.

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na fijación, estabilidad, liberación con-trolada; además de poseer bajo o nulo impacto organoléptico sobre la fruta.

¿QUÉ ES LA NANOTECNOLOGÍA? La nanotecnología es una disciplina científico-tecnológica que es capaz de generar mediante diversas técnicas una gran variedad de materiales con tamaños de partículas en el rango de 1 a 100 nm, con múltiples aplicaciones en las distintas áreas de nuestra socie-dad debido a las diversas propiedades que se pueden lograr con un material formulado a nanoescala.

Cabe señalar que entre las diferen-tes aplicaciones se encuentran los compuestos antibacterianas y anti-fúngicas empleados sobre productos hortofrutícolas y alimentos frescos en general. Estas tecnologías presentan una mayor efectividad debido a una mayor superficie reactiva por unidad de volumen, respecto a los materiales bioactivos originales, reduciendo las dosis requeridas. Además, mejoran la fijación, estabilidad y liberación de las dosis de bioactivos utilizadas para un determinado fin, disminuyendo la pro-

sus mecanismos de liberación a la fruta permitan que estos sigan entregando estos compuestos por todo el período de exportación. Finalmente, otra limi-tación importante que enfrentan estas alternativas es el que su aplicación sobre la fruta no altere sus propieda-des organolépticas al momento del consumo. Además, algunos de estos productos mencionados deben resol-ver limitaciones acerca su escalabili-dad a nivel industrial y comercial que permitan conseguir un producto final con precios competitivos a alternativas que están disponibles comercialmente, como es el caso de SO2.

En los últimos años ha surgido una nueva clase de alternativas basada en compuestos naturales formulados mediante el uso de herramientas de la nanotecnología, como fruto del tra-bajo de investigación y desarrollo en esta temática a nivel mundial. En ese contexto, tales herramientas preten-den ofrecer alternativas efectivas (con baja o nula carencia para controlar la enfermeda), junto con resolver la li-mitantes planteadas mediante de las capacidades de ser inocuas, tener bue-

babilidad de contaminación del medio ambiente.

POTENCIALES SOLUCIONES NANOTECNOLÓGICAS PARA EL MANEJODE ENFERMEDADES DE UVA DE MESAEn los últimos años se ha avanzado en el estudio de la incorporación de agentes antimicrobianos naturales en recubrimientos comestibles, para controlar la difusión y liberación de compuestos activos y mantener sus concentraciones a un nivel adecuado en la superficie de frutas y hortalizas durante su proceso de almacenamien-to-envío hacia los mercados de des-tino. Recientemente, los sistemas de administración de nanoencapsulados y nanolaminados-multicapa han surgido como herramientas prometedoras para mejorar la funcionalidad de los recu-brimientos comestibles aplicados en el control de la contaminación microbia-na de productos hortofrutícolas. El uso de nanoestructuras que poseen propie-dades antimicrobianas podría mejorar la inocuidad y la calidad de frutas y hortalizas mediante el control de la contaminación y el crecimiento de

Figura 3. Crecimiento micelial de Botrytis cinerea en contacto con distintos nanocompósitos. a) Testigo, b) T, c) C y, d) TA.

Figura 2. Sistema de nanoencapsulamiento por generación de nanoemulsiones en base aceites esenciales antimicrobianos, emulsificantes y biopolímeros. (Adaptado de Aloui y Khwaldia, 2016).

patógenos (bacterias y hongos), ade-más de la eliminación de poblaciones de microorganismos en los productos hortofrutícolas. Una de las principales ventajas de utilizar nanoestructuras por sobre micro o macroestructuras es su capacidad para cubrir una mayor área de superficie, lo que aumenta la eficiencia antimicrobiana de los pro-ductos nanocompuestos. El desarrollo de nanoemulsiones ‘in situ’ a partir de formulaciones para recubrimientos co-mestibles a base de aceites esenciales, emulsificantes y biopolímeros, se ha investigado como una estrategia eficaz para inmovilizar agentes antimicrobia-nos en la superficie de frutas y hortali-zas frescas y mínimamente procesadas

Entre los sistemas de nanoencap-sulación, que se utilizan actualmente como sistemas de administración de antimicrobianos naturales para aplica-ción en productos hortofrutícolas, las nanoemulsiones han recibido especial atención porque pueden formularse con ingredientes naturales de grado alimenticio y su proceso de producción es factible de escalar en la industria mediante procesos de homogeneiza-

Agente lipofílico antimicrobiano

Núcleo enriquecido de bioactivos

Cubierta enriquecida de bioactivos

Agente antimicrobiano

Capaemulsificante

Gota de aceite

Cizalla

Nanoemulsión

Adición de emulsificante/biopolímero

Aceite

Agua Agua

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICASAloui, H., & Khwaldia, K. 2016. Natural Antimicrobial Edible Coatings for Microbial Safety and Food Quality Enhancement. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 15 (6): 1080-1103. https://doi.org/10.1111/1541-4337.12226

IQonsulting. 2020. Anuario del mercado de uva de mesa 2018-2019.

Ramos, O. L., Pereira, R. N., Cerqueira, M. A., Martins, J. R., Teixeira, J. A., Malcata, F.X., António A. Vicente, A.A. 2018. Chapter 8 - Bio-Based Nanocomposites for Food Packaging and Their Effect in Food Quality and Safety. In Handbook of Food Bioengineering, Food Packaging and Preservation, Academic Press, P271-306, ISBN 9780128115169. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-811516-9.00008-7.

Sonker, N., Pandey, A. K., & Singh, P. 2016. Strategies to control post-harvest diseases of table grape: a review. Journal of Wine Research. DOI: 10.1080/09571264.2016.1151407.

AGRADECIMIENTOSProyecto Subsecretaría de Agricultura 503002: “Apoyo para la iniciación en la investigación en Biotecnología agroalimentaria”.

ción a alta presión. Las nanoemulsiones se definen como sistemas heterogéneos dentro de un tamaño nanométrico (inferior a los 100 nm) compuestos por 2 líquidos inmis-cibles (aceite y agua) que se mezclan para formar una fase homogénea y/o estable me-diante el uso de un emulsificante apropiado. En particular, las nanoemulsiones de aceite en agua, que han atraído la atención gene-ralizada como sistemas de liberación contro-lada (para frutas, hortalizas y toda clase de alimentos), consisten en gotitas nanométri-cas de aceite dispersas en una fase continua acuosa, donde cada nanogota está rodeada por una fina capa de interfase consistente en un emulsificante de grado alimenticio y/o biopolímero (Figura 2; Adaptado de Aloui y Khwaldia, 2016). Se ha demostrado que este tipo de desarrollos tienen gran efectividad para inhibir un amplio espectro de bacterias y hongos; sin embargo, a la fecha se han re-portado pocos desarrollos de esta clase para su aplicación en uva de mesa. Particularmen-te, se ha mostrado del desarrollo de nanoe-mulsiones basadas en aceite esencial de ci-tronela (lemongrass) formulada con cera de carnauba y usando Tween-80 como emulsifi-cante, la cual mostró ser efectiva para inhi-bir en uva la proliferación de bacterias como Salmonella typhimurium y Escherichia coli. Por este motivo, es necesario avanzar en el

desarrollo de nuevas nanoemulsiones capa-ces de controlar la pudrición gris, y especifi-camente de inhibir su agente fúngico causal Botrytis cinerea.

TRABAJO EN PROGRESO Y PROYECCIONESCon la finalidad de contribuir con el desa-

rrollo de soluciones nanotecnológicas para el control de la pudrición gris en uva, el labora-torio de Bionanotecnología para la hortofru-ticultura de INIA la Cruz, junto con el labora-torio de Fitopatología de INIA La Platina, han estado trabajando en tres nanocompuestos, formulados como nanoemulsiones basadas en diversos aceites esenciales, emulsificantes y biopolímeros; todos ellos de origen natural y de grado alimenticio. Los primeros testeos de los prototipos indican que es posible una reducción estadísticamente significativa del crecimiento micelilal del hongo B. cinerea tanto por contacto como por acción de meta-bolitos volátiles, con resultados auspiciosos en especial del nanocompuesto C (Figura 3), aunque a futuro podrían ser mejorables en cuanto a sus efectividades. Además, el efecto de los compuestos sobre B. cinerea fue corro-borado en una prueba in vivo sobre bayas, donde el compuesto C inhibió en un 61% la colonización por el hongo, siendo una for-mulación promisoria para el control inocuo y sustentable de la enfermedad causada por

este hongo.En vista de los resultados obtenidos, se

continuará con este trabajo interdisciplinario para incrementar la efectividad antifúngica de los nanocompósitos contra estos patóge-nos. Ello se llevará a cabo a través de nue-vas rondas de iteración en las formulaciones de sus componentes bioactivos, para mejo-rar principalmente la superficie de contacto de las partículas y su cinética de liberación controlada de los compuestos antifúngi-cos formulados. Además, se espera realizar nuevas pruebas de efectividad de los nuevos compuestos contra los patógenos estudiados, tanto in vitro como in vivo en fruta desafiada con sus inóculos. También, se desarrollarán pruebas en condiciones piloto, replicando las condiciones de almacenamiento y trasporte de la uva de mesa de exportación. De esta manera, el equipo de INIA espera continuar contribuyendo en la búsqueda de nuevas al-ternativas y estrategias de control para estos importantes problemas que afectan seria-mente a la industria de la uva de mesa.