ORGANIZACIÓN Y EXPRESIÓN DE LOS GENES DE INMUNOGLOBULINA

Linfocito B Reconocer antígeno

Inmunoglobulinas de superficie

Células plasmáticas

Sintetizar y secretar inmunoglobulinas

Ribosomas de células plasmáticas

Traducción de RNAm de las cuatro cadenas peptídicas

Glicosilación y secreción de dichas cadenas

Heterogeneidad de inmunoglobulinas por sus diversas clases

Variabilidad estructural de su parte variables

Necesidad de conocer a nivel génico su

regulación y síntesis

Modelos genéticos compatibles con la estructura de la inmunoglobulina, debían tener en cuenta:

•La basta diversidad de especificidades de anticuerpo

•La presencia en las cadenas pesadas y ligeras de la Ig de una región variable y una región constante

•Existencia de isotipos con la misma especificidad antigénica

• Teoría de la línea germinal: que el genoma contenía gran cantidad de genes de Ig, y que el inmenso valor del Sistema Inmune para la supervivencia justificaba la asignación de un segmento considerable del genoma a la codificación de anticuerpos.

• Teoría de la variación somática: el genoma posee una cantidad pequeña de genes de Ig, a partir de los cuales se generan especificidades de anticuerpo en las células somáticas por mutación o recombinación.

• Dreyer y Bennette: dos genes separados codificaban una misma cadena pesada o ligera de Ig, un gen para la región V (variable) y el otro para la región C (constante). Estos debían reunirse a nivel del DNA para formar un mensaje continuo que pudiera transcribirse y traducirse a una cadena pesada o ligera de Ig única.

• Tonegawa y N. Hozumi en 1976, aparece un acumulo de conocimientos por los que se sabe que genes separados codifican las regiones V y C de las Ig, y que los genes se reordenaban en el curso de la diferenciación de la célula B.

• Empleando técnicas de digestión enzimática del DNA de células B y posterior hibridación con sondas de DNA complementario (cDNA), mediante la técnica de Southern Blot.

• Durante diferenciación de linfocitos desde etapa embrionaria hasta célula plasmática, los

genes V y C experimentan reordenamiento.

• En el embrión, genes V y C separados por segmento grande de DNA. Durante

diferenciación, genes V y C se acercan y eliminan secuencia intermedia de DNA.

Organización multigénica de genes de inmunoglobulina

• Familias multigénicas separadas en diferentes cromosomas codifican cadenas ligeras κ y λ y las pesadas.

• Cada familia contiene secuencias de codificación “segmentos génicos”, separadas por regiones que no codifican

• Cadenas ligeras κ y λ contienen segmentos génicos V, J y C; segmentos VJ reordenados codifican región variable de cadenas ligeras.

• Cadenas pesadas posee segmentos génicos V, D , J y C; VDJ codifican región variable.

• Segmentos génicos C codifican regiones constantes.

Familia multigénica de la cadena L

• El segmento Vλ y los 3 segmentos génicos funcionales Jλ codifican región variable de cadena ligera, y cada uno de los 3 segmentos génicos Cλ codifica la región constante de cada uno de los 3 subtipos de cadena λ (λ1, λ2 y λ3).

Familia multigénica de la cadena κ

• 5 segmentos génicos Jκ (un seudogen) y un segmento génico Cκ único.

• Los segmentos génicos Vκ y Jκ codifican la región variable de la cadena ligera κ, y el segmento génico Cκ codifica la región constante.

Familia multigénica de la cadena pesada

• Un segmento génico adicional codifica parte de la región variable de la cadena pesada, se designó D por diversidad, y su contribución a la generación de diversidad de anticuerpos.

REORDENAMIENTOS GÉNICOS DE REGIÓN VARIABLE

REORDENAMIENTOS GÉNICOS…

• Ocurren en una secuencia ordenada• Maduración de las células B • Médula ósea• Reordenamiento de la cadena pesada (H) cadena ligera (L)• Produce células B maduras

inmunocompetentes

• Las cadenas H y L de las Ig están codificadas por distintos grupos de genes.

• En los linfocitos B maduros, los genes que codifican el dominio V de las Ig están cerca delos que codifican la porción constante (C).

REORDENAMIENTO VJ EN LA CADENA LIGERA

El dominio V de la cadena Ligera esta codificado por dos genes diferentes:

• Gen VL

• Gen JL

La asociación VL- JL, esta separada de la región CL por un intrón.

Esta configuración es la que se transcribe a mRNA.

ORGANIZACIÓN DE LOS GENES

• Dos clusters para la cadena L– Lκ: ubicado en el cromosoma 2– Lλ: ubicado en el cromosoma 22

• Para la cadena Lκ existen 40 genes funcionales Vκ y 5 genes Jκ y un gen Cκ.

• Para la cadena Lλ, existen 30 genes funcionales Vλ y 4 genes Jλ, de los cuales cada uno esta asociado con un gen Cλ.

Los genes κ y λ reordenados contienen:

Exón líder intrón Segmento VJ

2° intrón Región constante

• los intrones en el transcrito primario son eliminados por enzimas de procesamiento del RNA

• Los mRNA de cadena ligera se une a ribosomas y se traduce en la proteína de cadena ligera.

• La secuencia líder en el extremo amino terminal dirige la cadena polipeptidica creciente hacia la luz del retículo y se escinde, de modo que NO existe en el producto proteínico de cadena ligera terminado.

REORDENAMIENTO VDJ EN LA CADENA PESADA

• El dominio V de la cadena H esta codificada por tres genes:– VH, DH y JH

• El proceso de recombinación somática involucra dos etapas:– Asociación del gen DH con el JH

– Porción DH -JH rearreglada se asociará con el gen VH para generar el exón completo (VH DH JH) que codifica el dominio VH.

• La asociación de la región VH con la región CH se produce por corte y empalme del mRNA.

El reordenamiento de la región variable produce un gen reordenado que consta de las siguientes secuencias:

Exón líder intrónSegmento

VDJ2° intrón Segmentos génicos C

• Una vez terminado el reordenamiento, la polimerasa de RNA puede unirse a la secuencia promotora y transcribir la totalidad del gen de cadena pesada incluidos los intrones.

• La poliadenilación diferencial y el empalme de RNA eliminan los intrones y procesa el transcrito Cμ y Cδ.

• Se traducen estos dos mRNA y permite que la célula B madura exprese IgM e IgD.

MECANISMO DE LOS REORDENAMIENTOS DE DNA DE REGIÓN VARIABLE

SECUENCIAS SEÑAL DE RECOMBINACIÓN (RSS)

• La recombinación solo ocurre entre fragmentos génicos que se encuentran en el mismo cromosoma y esta guiada por un RSS.

• Un RSS:– Se ubica en el lado 3’ de cada segmento génico V– En el lado 5’ de cada segmento génico J– Ambos lados de cada segmento génico D

• Un bloque heptámero palindrómico, contiguo a la secuencia codificante

• Secuencia espaciadora de 12 0 23 nucleótidos de longitud– Corresponden a los giros de la hélice del DNA– Un giro o dos giros respectivamente

• Seguida por otro bloque nonámero

• La recombinación somática suele seguir la “regla 12/23”

• Esta regla asegura la asociación correcta de fragmentos VH-DH-JH ya que los genes VH-JH

pueden asociarse con los fragmentos DH, pero no pueden asociarse entre si.

RECOMBINASAS

La recombinacion V(D)J, que se lleva a cabo en las uniones entre RSS y secuencias de codificacion, son catalizadas por enzimas que se denominan RECOMBINASAS V(D)J.

• En 1990 David Schatz identificó dos genes activadores de la recombinación

– RAG-1– RAG-2

• Son necesarias para medir la unión V(D)J.• Forman parte de esas recombinasas.• Actividad de endonucleasa• Se expresan en linfocitos en desarrollo.

RECOMBINACIÓN DE SEGMENTOS GÉNICOS

1. Reconocimiento de secuencias señal de recombinación (RSS) por enzimas recombinasa seguida de sinapsis

2. Escisión de una cadena de DNA por RAG-1 Yrag-2

3. El grupo OH 3’ libre en la cadena de DNA, ataca el enlace fosfodiester que une la cadena opuesta a la RSS formando una horquilla

4. Corte de la horquilla con objeto de generar sitios para la adición de nucleótidos de región P.

5. Adición de nucleótidos de región N, en los extremos cortados de las secuencias de codificación por la transferasa de desoxinucleotidilo terminal

6. Reparación y ligadura para unir secuencias de codificación, catalizadas por enzimas reparadoras de rotura de doble cadena normal (DSBR)

• La recombinación tiene como consecuencia la formación de una UNION CODIFICADORA, situada entre las secuencias de codificación, y una unión señal entre las RSS.

• Cuando los dos segmentos génicos se encuentran en la misma orientación transcripcional, la unión da lugar a la eliminación de la unión señal.

REORDENAMIENTOS PRODUCTIVOS E IMPRODUCTIVOS

• PRODUCTIVO: la unidad VJ o VDJ resultante puede traducirse en su totalidad y producir un anticuerpo completo

• IMPRODUCTIVO: la unidad resultante contenga múltiples codones de detención, que interrumpen la traducción.

• Si no se producen un gen de cadena pesada y uno de cadena ligera reordenados en fase, la célula B muere por apoptosis.

Generación de diversidad de anticuerpos

Existen siete medios de diversificación de anticuerpos

•Múltiples segmentos génicos de la línea germinal•Unión combinatoria V(D)J•Flexibilidad de Unión•Adición de nucleótido de la región P (adición P)•Adición de nucleótido de región N (adición N)•Hipermutación Somática•Asociación combinatoria de cadenas ligeras y pesadas

Segmentos génicos V, D y J y su combinación

•48 VH, 23 D y 6 JH de cadena pesada•41 Vκ, 5 Jκ, de cadena ligera κ•34 Vλ, 5 Jλ de cadena ligera K

Combinación VJ y VDJ

La contribución de múltiples segmentos génicos de la línea germinal a la diversidad de anticuerpos es amplificada por el reordenamiento aleatorio de estos segmentos•Los segmentos génicos de cadena pesada VDJ pueden formar 6624 combinaciones•Los segmentos génicos de cadena ligera κ generan 205 combinaciones•Los segmentos génicos de cadena ligera λ forman 170 combinaciones

Flexibilidad de unión•Se lleva durante la unión señal y unión codificadora•La unión señal es solida pero en la unión codificadora muchas veces es imprecisa•La flexibilidad de unión produce muchos reordenamientos improductivos pero también productivos•Los reordenamientos productivos codifican aminoácidos alternativos lo que incrementa la diversidad•Las variaciones están dentro de la tercera región hipervariable (CDR3)•CDR3 contribuye a la unión antígeno por la molécula de anticuerpo

Adición P•Se da en el rompimiento de la horquilla en el reordenamiento•Puede ocurrir cuando se rompe en una posición que deja corta una cadena al final de la secuencia codificadora•Cuando se añaden nucleótidos por las enzimas reparadoras (adición P) se crea una secuencia palindrómica en la unión de codificación (nucleótidos P)•La variación en que se corta la horquilla da la variación de la secuencia de la unión codificadora.

Adición N

•Solo ocurre en la cadena pesada•Se da por la adición de nucleótidos durante la unión D-J y A-DJ•Es catalizada por una transferasa de desoxinucleotidilo terminal•Se pueden añadir asta 15 nucleótidos•Son completamente aleatorias•Al final un región variable se da por VhNDhNJh•Ocurre en la CDR3

Hipermutación somática•Se da en la regiones V ya reordenadas•Son nucleótidos individuales en unidades VJ o VDJ que sustituyen a otros nucleótidos•Altera potencialmente la especificidad•Ocurre normalmente en centros germinales tras una semana de inmunización con un antígeno en una reacción de la célula B dependiente de célula T•Se dirige a regiones VJ o VDJ con secuencias de DNA de alrededor de 1500 nucleótidos

•Su frecuencia es de 10 a la menos 3 por par de bases por generación•100000 mas frecuente que la mutación espontanea•La longitud combinada de la cadena pesada y la cadena ligera es de alrededor de 600 pb por lo que se puede dar al menos una mutación por cada dos divisiones celulares en el par de genes Vh y Vl.•La mayoría de las mutaciones son sustituciones•En gran medida es aleatoria •Los “puntos calientes” son secuencias de nucleótidos y ciertas secuencias palindrómica dentro de las regiones Vh y Vl que son susceptibles a la hipermutación somática

•Las hipermutaciones ocurren a lo largo de los segmentos VDJ y VJ, pero en células B maduras están agrupadas dentro de las CDR de las secuencias de Vh y Vl en donde es mas probable que modifiquen la afinidad total para antígenos•El resultado es el incremento de la afinidad por antígeno•Se seleccionan de manera preferencial las células B con los receptores mas afines•Este proceso se llama maduración de afinidad.

Combinación de cadenas pesadas y ligeras

•Se pueden generar 6624 genes de cadena pesada y 375 de cadena ligera de la región variable•Si todos esto se combinan podrían dar 2 484 000 combinaciones•No es probable que todas se combinen•La combinación no es del toda aleatoria•No todos los segmentos génicos se utilizan con la misma frecuencia

No se puede calcular con precisión el numero de combinaciones totales de inmunoglobulinas aunadas a este ultimo evento están las combinaciones que podrían darse con la unión flexible, la adición P y la N y la hipermutabilidad.

Cambio de genes de la región constante•Después de la estimulación antigénica de la célula B, el DNA de cadena pesada puede experimentar un reordenamiento adicional en el que la unidad VDJ suele combinarse con cualquier segmento Ch•Se le llama cambio de clase o de isotipo•Se da debido al cambio de secuencias laterales de DNA conocidas como regiones de cambio ubicadas a 2 a 3 Kb hacia 5´ de cada segmento Ch•En estas regiones de cambio de 2 a 10 Kb se integran múltiples copias de repeticiones cortas GAGCT y TGGGG.•Una hipótesis sostiene que una proteína recombinasa reconoce estas secuencias y llevan a cabo la recombinación•Las citosinas actúan como factores de cambio hacia una clase particular de inmunoglobulina

•Por ejemplo la interleucina 4 induce el cambio de clase Cμ a Cϒ o Cϵ•En el cambio de clase se crea un producto de escisión circular que contiene Cμ con el extremo 5´ de la región de cambio ϒ1 (Sϒ1) y el extremo 3´de la región de cambio μ (Sμ)•En el cambio de Cϒ1 a CЄ los productos de escisión contienen porcienes de cambio μ, ϒ y Є junto.•El cambio de clase depende de 3 elementos Regiones de cambioUna recombinasa de cambioLas señales de la citocina que determinan el isotipo al cual cambia la célula B y una enzima llamada desaminasa de citidina inducida pro activación (AID)

Desaminasa de citidina inducida por activación (AID)

•Es la mediadora clave de la hipermutación y la recombinación por cambio de clase•Pertenece a una familia de enzimas llamada editoras de RNA•La AID desamina citosinas selectas en determinados mRNA al cambiar las citosinas por uracilos modificando las instrucciones de codificación•Puede modificar el DNA directamente por medio de la desaminación de citosinas, cuyo resultado es la formación de uracilo, el sitio de desaminación puede ser reparado por un par A-T en vez de G-C o el uracilo puede eliminarse y sustituirse por cualquier base

Expresión de genes de inmunoglobulina

•Los transcritos primarios de genes de cadena pesada y reordenados contienen secuencias de DNA intermedias que incluyen intrones que no codifican y segmentos J que se pierden durante el reordenamiento de V(D)J•El transcrito primario debe procesarse para eliminar la secuencias de DNA intermedias y los exones restantes conectarse por un proceso llamado empalme de RNA, los sitios de empalme se encuentran en los limites de intrones y exones y señalan donde ocurrirá el empalme•El transcrito primario en el núcleo elimina cada una de esta secuencias intermedias para formar el producto final el mRNA•El mRNA sale del núcleo y es traducido por ribosomas en cadenas H o L completas

Transcrito primario diferencial de la cadena pesada

•El transcrito primario de la cadena pesada de inmunoglobulina puede generar diferentes mRNA•Puede crear formas secretadas o unidas a membrana•Puede expresar de manera simultanea la IgM e IgD

Expresión de la inmunoglobulina de membrana o secretada

•Una inmunoglobulina puede existir en forma unida a membrana o secretada•Difieren en la secuencia de aminoácidos de los dominios carboxilo terminales de la cadena pesada (CH3/ CH3 en IgA, IgD e IgG y CH4/CH4 en IgE e IgM•La forma secretada tiene un secuencia hidrófoba de unos 20 aminoácidos en el dominio carboxilo terminal•En la forma unida a membrana la reemplaza una secuencia de 40 aminoácidos que contiene un segmento hidrófilo que se extiende fuera de la célula, un segmento hidrófobo transmembranal y un segmento hidrófilo corto en extremo carboxilo terminal que se extiende hacia el interior del citoplasma

•La secuenciación del DNA del segmento génico Cμ posee cuatro exones (Cμ 1, 2, 3 y 4) que corresponden a los dominios de la IgM•El exón Cμ4 contiene una secuencia nucleótido (S) en su extremo 3’ que codifica la secuencia hidrófila en el dominio CH4 de la IgM secretada•Dos exones adicionales M1 y m2 se localizan hacia 3¨del exón Cμ4•El exón M1 codifica el segmento transmembrana y el M2 el citoplasmático del dominio CH4 de la IgM unido a membrana•Los elementos génicos CH tiene dos exones M1 y M2 adicionales•El transcrito primario de cadena pesada μ tiene dos secuencia de poliadenilacion (poli-A) •El sitio uno esta en el segmento Cμ en el extremo 3´del exon Cμ4•El sitio dos en el extremo 3´del exón M2

•Si ocurre la escisión del transcrito primario y la adición de la cola de poli-A en el sitio uno, se pierden los exones M1 y M2.•La escisión de los entrones y el empalme de los exones restantes crean entonces mRNA que codifica la forma secretada de la cadena H•Si la segmentación y poliadenilacion del transcrito primario suceden en el sitio dos, entonces resulta un patrón de superposición. La superposición elimina la secuencia S en el extremo 3´del exón Cμ4 y une el resto del exón Cμ4 con los exones M1 y M2 lo que produce mRNA para la forma membranal de cadena pesada.•Las células B vírgenes maduras sólo liberan anticuerpo unido a membrana y las células plasmáticas anticuerpos secretados

Expresión simultanea de IgM e IgD•El proceso diferencial del RNA también sustenta la expresión simultanea de IgM e IgD unidas a membrana por células B maduras•Segmentos génicos Cμ y Cδ estan cerca entre si en el gen reordenado y debido ala ausenca de un sitio de cambio entre ellos posibilita que se transcriba toda la región VDJCμ•Este transcrito contiene cuatro sitios de Poli-A•Los sitios uno y dos se relacionan con Cμ y el tres y cuatro con Cδ

• Si se escinde el sitio dos el mRNa codifica la cadena pesada μ

• Si es en el sitio cuatro despues de los exones C δ la superposición anula los exones Cδ y produce mRNa que codifica la cadena pesada de IgM

• Si la escisión y la poliadenilacion es en el sitio uno o tres en celulas plasmaticas y la superposición ulterior dan lugar a la forma secretada de las cadenas pesadas de μ y δ

Síntesis, ensamblaje y secreción de inmunoglobulinas

Se presentan varios problemas para esta fase•Los mecanismos de reordenamiento génicos, unión imprecisa V(D)J y la adición de nucleótidos generan codones de detención prematuros o producen inmunoglobulinas que no se pliegan o ensamblan•Las células plasmáticas producen 1000 moléculas de anticuerpo por segundo que tiene que desplazar hasta la membrana plasmática•Se necesita mucho control y coordinación del trafico intracelular

•Los polipétidos se sintetizan en el RER•Los mRNA de cadenas pesadas y ligeras se trasladan a los polirribosomas del RER separados•Las cadenas recién sintetizadas contienen una secuencia líder amino terminal que guía las cadenas hacia la luz del RER donde se escinde•El ensamblaje varía ente las clases de inmunoglobulina•En IgM las cadenas H y L se ensamblan dentro del RER y la resultante se ensambla ocn otra igual para formar una completa•En la IgG se une H2L y luego se configura a H2L2•Las enzimas catalizan los enlaces disulfuro intercadena par ensamblar los polipéptidos y los enlaces SS intracadena para el plegamiento

• La glucosilación también son por enzimas en el RR• Los anticuerpos son enviados a su destino dependiendo

de su domino carboxilo terminal (hidrófobo o hidrófilo)• La hidrófoba se ancla en la membrana y toma

residencia aquí• La hidrófila se secreta como molécula libre pro medio

de vesículas• El RE tiene mecanismos de control • La proteína de unión a cadenas pesadas BiP se une

moléculas de anticuerpo que no se ensamblaron pro completo y las retiene en el RE

• Estas proteínas son marcadas con ubicuitina y se sometidas a proteólisis

Regulación de la transcripción de genes de inmunoglobulina

•Los genes de inmunoglobulina sólo se expresan en la células del linaje B y dentro de este se expresan en diferentes proporciones durante distintas etapas del desarrollo•Promotores: secuencia de nucleótidos que promueven el comienzo de la transcripción de ENA en un sentido especifico•Intensificadores: secuencias nucleótidos que activan la transcripción de la secuencia promotora en una forma independiente de la orientación•Cada segmento génico VH y VL tiene un promotor localizado hacia 5´ de la secuencia líder•Una secuencia rica en AT ( caja o vagón) TATA sirve para el inicio de la transcripción de RNA•El proceso se lleva mediante la RNA polimerasa II

•Los promotores contienen un octámero que confiere especificidad •El cot-1 se encuentran en muchas células peor el Oct-2 solo en células B•Los intensificadores, constituyen sitios de unión para varias proteínas las cuales muchas son factores de transcripción.•El gen E2A codifica dos proteínas que pueden experimentar un empalme alternado para generar dos proteínas, que se unen a intensificadores de κ y μ esenciales para el desarrollo de la célula B

El reordenamiento del DNA acelera en gran medida la transcripción•La línea germinal están muy distantes de los promotores, el reordenamiento coloca un promotor y un intensificador lo bastante cerca para que el intensificador modifique la transcripción del promotor cercano

Inhibición de expresión de genes de inmunoglobulina en las células T

• A pesar de la similitud de los procesos, el reordenamiento completo de las cadenas H y L de los genes solo ocurre en células B y el reordenamiento completo del gen de TCR se limita a células T

• La unión de una proteína expresada por células T al intensificador de la cadena que se unen a intensificadores de la cadena κ no mutada previene en condiciones normales de la unión Vκ -Jκ en condiciones normales