Péptidos fotomodulables para aplicaciones biológicas³n, calor y luz, y su culto prevaleció...

Eduardo Santamaría Aranda

Diego Sampedro Ruiz

Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática

Grado en Química

2014-2015

Título

Director/es

Facultad

Titulación

Departamento

TRABAJO FIN DE GRADO

Curso Académico

Péptidos fotomodulables para aplicaciones biológicas

Autor/es

© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2015

publicaciones.unirioja.esE-mail: [email protected]

Péptidos fotomodulables para aplicaciones biológicas, trabajo fin de gradode Eduardo Santamaría Aranda, dirigido por Diego Sampedro Ruiz (publicado por la

Universidad de La Rioja), se difunde bajo una LicenciaCreative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.

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Trabajo Fin de Grado

Péptidos fotomodulables para aplicaciones biológicas

Universidad de La Rioja Facultas de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática

Grado en Química Alumno: Eduardo Santamaría Aranda

Tutor: Diego Sampedro Ruiz Junio 2015

hν, 370 nm

Δ, 50 ºC

i Índice

ÍNDICE

Resumen / Abstract iii

Abreviaturas v

1. Introducción..................................................................................................... …- 1 -

2. Antecedentes ................................................................................................ ……- 5 -

2.1. Máquinas moleculares: definición y características.

2.2. Tipos de máquinas moleculares y ejemplos naturales.

2.3.2 Rotores y motores moleculares.

3. Objetivos ..................................................................................................... ……- 15 -

4. Estudio fotoquímico ............................................................................................- 17 -

4.1. Síntesis de un interruptor molecular basado en la PSB-retinal.

4.2. Síntesis de fragmentos peptídicos de la PAMP.

4.3. Acoplamientos péptido-interruptor.

4.4. Estudio fotoquímico de péptidos fotomodulables.

5. Conclusiones .......................................................................................................- 27 -

6. Parte experimental .............................................................................................- 29 -

6.1. Consideraciones generales.

6.2. Síntesis de un interruptor molecular basado en la PSB-retinal.

6.3. Síntesis de fragmentos peptídicos de la PAMP.

6.4. Acoplamientos péptido-interruptor.

ANEXO. Espectros de RMN ..................................................................................- 41 -

iii Resumen / Abstract

RESUMEN

El péptido de 20 aminoácidos N-terminal de la proadrenomedulina (PAMP) incrementa

la velocidad de la kinesina tanto in vitro como in vivo. Este Trabajo Fin de Grado se centra en

modular fotoquímicamente la actividad biológica de la PAMP mediante la incorporación de un

interruptor molecular que permita controlar su estructuración secundaria.

Tras una breve introducción a la fotoquímica (Capítulo 1), se presentan los principales

antecedentes bibliográficos tanto del interruptor empleado como de la proteína objeto de estudio

(Capítulo 2). Seguidamente, en el Capítulo 3, se plantean los objetivos específicos a cumplir

durante el desarrollo de la investigación.

En el Capítulo 4 se explica la preparación de sistemas péptido-interruptor, su estudio

fotoquímico y se discuten los resultados obtenidos. Las conclusiones más importantes obtenidas

a partir de este estudio se reflejan en el Capítulo 5.

Finalmente, en el Capítulo 6 se detalla el procedimiento experimental a seguir para llevar

a cabo cada una de las etapas del proyecto.

ABSTRACT

Proadrenomedullin N-terminal 20 peptide increases kinesin’s velocity both in vitro and

in vivo. This work focuses on linking a photoactive molecular switch to this protein in order to

control its secondary structure and thus its biological activity by light.

After a brief introduction to photochemistry (Chapter 1), the main background of both the

molecular switch and the protein under study are presented (Chapter 2). Later, the specific aims

of the investigation are described in Chapter 3.

Chapter 4 explains the preparation of the cross-linked peptide with the molecular switch

and its photochemical study. Then, the results obtained are discussed and the most important

conclusions from this study are reflected in Chapter 5.

Finally, Chapter 6 describes the experimental procedure to carry out this research project.

v Abreviaturas

ABREVIATURAS

µm micrómetro 1H RMN resonancia magnética nuclear de 1H 1H-1H COSY espectroscopia de correlación A alanina Å angstrom Ac acetilo aq. acuoso ATP adenosín trifosfato Boc tert-butiloxicarbonilo BP benciliden-pirrolina Bu butilo C cisteína CCD dispositivo de carga acoplada CIBIR centro de investigación biomédica de La Rioja d doblete (en RMN) D ácido aspártico DIEA diisopropiletilamina DMF dimetilformamida DMP peryodinano de Dess Martin DVB divinilbenceno E ácido glutámico EDP 1,2-etanoditiol equiv. equivalente ESI-MS (+) electrospray-espectrometría de masas en modo de ión positivo Et etilo F fenilalanina Fmoc 9-fluorenilmetiloxicarbonil g/mol gramos/mol gr. griego HBTU hexafluorofosfato de O-1H-benzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’- tetrametiluronio HPLC cromatografía líquida de alta resolución Hz hertzio hν luz, fotones, radiación J constante de acoplamiento (en RMN) K lisina L leucina M molaridad m/z masa/carga MBHA 4-metil-benzhidrilamina Me metilo min. minuto mL mililitro

Abreviaturas vi

mmol milimoles N asparagina nm nanómetro PAMP péptido de 20 aminoácidos N-terminal de la proadrenomedulina pN picoNewton ppm partes por millón PSB base de Schiff protonada R arginina r.t. temperatura ambiente s singlete (en RMN) S serina SPPS síntesis de péptidos en fase sólida t triplete (en RMN) tBu tert-butilo TCEP tris(2-carboxietil)fosfina TFA ácido trifluoroacético THF tetrahidrofurano TIS triisopropilsilano UV-vis ultravioleta-visible V valina W triptófano, vatio δ desplazamiento químico Δ calor ε coeficiente molar de extinción λ longitud de onda

CAPÍTULO 1

Introducción

1. Introducción

- 2 -

Desde la antigüedad se le ha dado una importancia capital a la luz ya que es imprescindible para la sustentación y el mantenimiento de la vida en la Tierra. En este sentido, la luz solar ha fascinado a la humanidad desde sus albores al estar envuelta en la mayoría de las transformaciones químicas producidas en la biota.1 Por esta razón las deidades solares han sido veneradas en la mayoría de las antiguas civilizaciones. Por ejemplo la cultura inca tenía como deidad más importante al Dios Sol, mientras que para los egipcios el Sol representaba germinación, calor y luz, y su culto prevaleció durante siglos.

A pesar de ello, los estudios científicos que abordan el comportamiento de la materia tras su exposición a la luz son muy recientes. Es probable que los efectos que provoca esta radiación sobre sustancias puras fueran descubiertos por Sala en 1614, el cual observa que la luz procedente del sol ennegrecía cristales de nitrato de plata. Un siglo más tarde, en 1777, Scheele comprueba que un papel embebido en una solución de cloruro plata también se oscurecía cuando era expuesto a la radiación solar. En cuanto a la química orgánica, la observación del primer proceso fotoquímico se le atribuye a Trommsdorff. Este científico describe en 1834 el cambio de color que sufren los cristales de α-santonina a consecuencia de su exposición a la luz.2

A finales del siglo XIX los estudios fotoquímicos sólo ocupaban una modesta parte en el desarrollo de la química, y los mecanismos por los que tienen lugar este tipo de procesos permanecían pobremente entendidos. El primer intento de relacionar el color de los compuestos orgánicos con su estructura data de 1876, año en el que Otto Witt proporciona los fundamentos para comprender la base molecular del color. De acuerdo con la teoría del color de Witt un colorante está constituido por dos partes esenciales, cromóforos y auxocromos. Los cromóforos (gr. khroma, color y phoros, portador) son grupos cuya presencia es esencial para producir color en un compuesto. Por su parte, los auxocromos (gr. auxanein, aumentar) son grupos que intensifican el color en presencia de los citados cromóforos. Sin embargo, a partir de la mecánica cuántica molecular esta teoría de partida ha sido sustituida por modernas teorías electrónicas. Por tanto se considera que la teoría de la fotoquímica no comienza hasta el 1900, momento en el que Planck propone que la radiación puede ser descrita en términos de pequeños “paquetes” de energía denominados cuantos. Posteriormente, en 1905, Einstein postula que estos cuantos no poseen masa, y que son absorbidos (o emitidos) por átomos o moléculas. Más tarde, en 1913, Bohr sostiene que estos procesos implican cambios en las energías de los electrones de las moléculas, que absorben o emiten la radiación a través de transiciones electrónicas. Por último, Lewis da la denominación de fotones a estos paquetes de energía en 1928.

Una década después se confirma la existencia del estado triplete de las moléculas orgánicas. Además, sobre el 1950 se establecen algunas teorías de orbitales moleculares como la teoría de orbitales moleculares de Hückel, el modelo de interacción de configuraciones de Pople, o el modelo del electrón libre de Platt. De este modo se desarrollan las líneas generales para el entendimiento de la reactividad de las moléculas electrónicamente excitadas.

1 Griesbeck, A. G. Angew. Chem., Int. Ed. 2009, 48, 4671. 2 Trommsdorff, H. Ann. Pharm. 1834, 11, 190.

1. Introducción

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La fotoquímica es por tanto la ciencia que estudia el comportamiento de la materia tras la absorción de fotones. En los procesos fotoquímicos la luz proporciona la energía necesaria para que electrones del nivel fundamental de una molécula puedan pasar a estados excitados de mayor energía. La radiación que posee la energía necesaria para producir estas transiciones electrónicas pertenece a las regiones visible y ultravioleta del espectro electromagnético.

En la naturaleza aparecen procesos fotoquímicos de gran importancia como el que permite la visión en organismos superiores, descrito en la Sección 2.3.1. Otro ejemplo relevante es la fotosíntesis, que permite sintetizar compuestos orgánicos a partir de materia inorgánica en presencia de luz solar (Figura 1.1).

Figura 1.1. Esquema simplificado del proceso de la fotosíntesis.

Esta diversidad en la reactividad fotoquímica natural se fundamenta en la capacidad de fotorrespuesta que presentan algunas proteínas y que regula la actividad biológica de muchos seres vivos.3 La característica común en este tipo de proteínas que les permite absorber luz visible consiste en un pequeño fragmento de la estructura denominado cromóforo.4 Cuando el cromóforo en su estado fundamental capta un fotón, éste pasa a un estado excitado desde el cual puede dar lugar a unos determinados productos a través de las correspondientes reacciones fotoquímicas. Estos procesos que tienen lugar tras la excitación del cromóforo pueden ser de diversos tipos: ruptura de enlaces,5 isomerización de dobles enlaces,6 o formación de nuevos enlaces.7 Una vez que estas transformaciones tienen lugar, el cambio estructural provocado en el cromóforo es transferido a la proteína provocando por tanto un cambio en su conformación. Este cambio estructural lleva asociado un cambio en la función de la proteína irradiada.

El control del funcionamiento de sistemas complejos a través de la luz ha sido objeto de numerosos estudios en los últimos años. La incorporación de moléculas fotoactivas en sistemas biológicos permite el desarrollo de aplicaciones en multitud de campos como la optogenética y la bioimagen. En estos casos la luz presenta ciertas ventajas sobre el resto de formas de energía de modo que su uso resulta especialmente recomendado. Por un lado presenta una gran resolución espacial que permite controlar con precisión la zona en la cual se quiere llevar a cabo la irradiación. Por otro lado, presenta una alta resolución temporal que posibilita la producción de estímulos en tiempos muy cortos. Además no genera productos de desecho por lo que el sistema de estudio no se ve afectado por reactivos añadidos o subproductos. En cuanto a sus limitaciones, cabe destacar que la radiación empleada debe ser de baja energía para no causar daños en el entorno biológico. Este hecho supone una dificultad añadida a la hora de diseñar moléculas fotoactivas ya que la energía disponible para llevar a cabo su activación es limitada.

3 Krauss, U.; Drepper, T.; Jaeger, K.-E. Chem. - Eur. J. 2011, 17, 2552. 4 En este caso la definición de cromóforo es diferente a la expuesta anteriormente. Por ejemplo, en moléculas biológicas que son capaces de captar o detectar energía lumínica, el cromóforo es el fragmento de la estructura que causa el cambio conformacional de la molécula cuando es irradiada. 5 Kaplan, J. H.; Forbush, B., 3rd; Hoffman, J. F. Biochemistry 1978, 17, 1929. 6 Dugave, C.; Demange, L. Chem. Rev. 2003, 103, 2475. 7 Losi, A.; Gaertner, W. Photochem. Photobiol. Sci. 2008, 7, 1168.

CAPÍTULO 2

Antecedentes

2. Antecedentes

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2.1. MÁQUINAS MOLECULARES: DEFINICIÓN Y CARACTERÍSTICAS

“¡Hay mucho espacio al fondo!”, dijo en 1959 el Premio Nobel de Física Richard Feynman en el congreso anual de la Sociedad Americana de Física.8 Con el término “fondo” hizo referencia al ámbito molecular de la materia, y esta famosa cita se ha convertido en la bandera de multitud de científicos cuya investigación se centra en el diseño y construcción de máquinas y materiales moleculares funcionales.

Una máquina molecular, o nanomáquina, puede definirse como el ensamblado de un conjunto de componentes moleculares que han sido diseñados para realizar movimientos mecánicos (output) como resultado de una estimulación externa (input). 9 Por tanto, las máquinas moleculares son sistemas cuya función es transformar la energía en trabajo mecánico. Estos sistemas funcionan a través de movimientos electrónicos o nucleares controlados a su vez por movimientos de tipo Browniano. 10 Por tanto las nanomáquinas deben ser cuidadosamente diseñadas de manera que se maximicen los movimientos deseados y se minimicen aquellos que no interesan con el fin de obtener dispositivos eficientes. Además, si se logra anclar la máquina a un soporte sólido se puede logran un movimiento concertado y totalmente dirigido difícilmente alcanzable en disolución.11

A semejanza de sus equivalentes macroscópicos, las nanomáquinas se caracterizan por el tipo de energía suministrada para hacerlas funcionar (Sección 2.1.1), la naturaleza del movimiento de sus componentes (Sección 2.2), el modo en que su funcionamiento puede ser controlado y monitorizado, y el propósito de este funcionamiento.

2.1.1. Fuentes de energía

Al igual que las máquinas tradicionales precisan de una fuente de energía convencional, las máquinas moleculares requieren de un suministro energético a medida para llevar a cabo su correspondiente función. La naturaleza de este suministro energético es un factor clave ya que determina tanto la naturaleza química de la maquina como el tipo de movimiento y el control del mismo. Los estímulos externos más empleados para inducir movimientos mecánicos en las máquinas moleculares son: energía térmica, energía electroquímica, energía química y energía fotoquímica. A continuación se describen brevemente las características más importantes de cada uno de ellos.

La mayoría de las máquinas moleculares presentes en la naturaleza se activan mediante estímulos de carácter químico. Por ejemplo la concentración de protones, los gradientes de carga iónica o diversas interacciones intermoleculares pueden afectar a la operación puntual realizada por el sistema. Sin embargo, resulta fundamental considerar la reutilización o eliminación de los distintos subproductos que puedan generarse durante el funcionamiento de

8 “¿Qué utilidad tendrán tales máquinas? ¿Quién lo sabe? Yo no sé exactamente qué ocurrirá, pero no me cabe la menor duda de que cuando tengamos algún tipo de control sobre estas máquinas a escala molecular nos encontraremos, entonces, con un amplio rango de posibles propiedades que permitirán realizar multitud de cosas”. Feynman, R. Eng. Sci. 1960, 23, 22. 9 Ballardini, R.; Balzani, V.; Credi, A.; Gandolfi, M. T.; Venturi, M. Acc. Chem. Res. 2001, 34, 445. 10 Astumian, R. D. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 1843. 11 Chia, S.; Cao, J.; Stoddart, J. F.; Zink, J. I. Angew. Chem., Int. Ed. 2001, 40, 2447.

2. Antecedentes

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la máquina. Este hecho supone una clara limitación a nivel práctico en la función y el diseño de máquinas moleculares de este tipo. En la Figura 2.1 se expone una máquina molecular biestable cuya cadena principal presenta dos zonas de reconocimiento diferentes para el anillo. Mediante un estímulo químico como el cambio de pH puede diferenciarse el poder de atracción ejercido por cada una de las zonas logrando así un movimiento controlando del sistema.

Figura 2.1. Máquina molecular controlada por un estímulo químico.12

En cuanto a la energía térmica, la temperatura es el estímulo más simple a través del cual una máquina puede ser activada. Por ejemplo, la actividad de una enzima se ve afectada significativamente cuando la temperatura asciende dado que esto causa en la misma un cambio conformacional. Por contra, el uso de calor como suministro energético conlleva serios problemas prácticos como su dificultad para ser controlado, tanto en términos de tiempo como de localización, o su rápida disipación.

Por otro lado, la capacidad de los impulsos electroquímicos para producir reacciones endergónicas y reversibles se ha empleado en multitud de ocasiones con la finalidad de producir dispositivos activados mediante este tipo de estímulos. El empleo de transferencias heterogéneas de electrones presenta una serie de ventajas importantes respecto a las fuentes energéticas explicadas con anterioridad. En este sentido, cabe destacar la ausencia de productos de desecho y la capacidad de los electrodos para actuar a modo de interconexión entre el nivel molecular del dispositivo y el mundo macroscópico. A modo de ejemplo ilustrativo, en la Figura 2.2 se observa una máquina molecular controlada por un estímulo electroquímico externo. Este sistema consiste en dos anillos que pueden deslizarse a lo largo de una cadena lineal. Además, este sistema diseñado por J. Fraser Stoddart en 2005 demuestra que mediante la incorporación de nanomáquinas a sistemas de mayor tamaño los movimientos acumulativos en la nanoescala pueden ser aprovechados para realizar trabajo mecánico a una escala superior. Concretamente, el cambio producido en la distancia entre anillos, de 4,2 a 1,4 nm, imita la contracción y extensión de los músculos esqueléticos. Por tanto, su anclaje a una superficie áurica permite transmitir a este substrato un movimiento de flexión controlado y reversible que imita el movimiento muscular. De esta manera es posible sintetizar músculos moleculares artificiales a partir de máquinas moleculares.

12 Badjic, J. D.; Balzani, V.; Credi, A.; Silvi, S.; Stoddart, J. F. Science 2004, 303, 1845.

2. Antecedentes

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Figura 2.2. Máquina molecular controlada por un estímulo electroquímico.13

Por último, la luz es probablemente la fuente de energía más ventajosa dado que evita prácticamente todas las desventajas mencionadas en el caso de las otras fuentes de energía. A continuación se indican algunas de las ventajas que ofrece la energía fotoquímica.

No se generan residuos.

La luz puede controlarse fácilmente gracias a la instrumentación óptica actual que permite una gran resolución temporal y espacial. Además, una selección precisa de la longitud de onda de trabajo permite realizar operaciones selectivas en el dispositivo con independencia de la complejidad del entorno.

Los impulsos iniciales de carácter fotoquímico pueden usarse simultáneamente tanto para generar el funcionamiento de la máquina como para controlar el movimiento de la misma. Esta característica facilita el diseño y la función en sí del dispositivo.

Los fotones pueden ser útiles para leer el estado del sistema, permitiendo así el control y la monitorización del funcionamiento de la máquina.

La luz solar supone una fuente de energía limpia y renovable.

Esta energía lumínica es capaz de producir la fotoisomerización de dobles enlaces (–C=C–, –C=N– y –N=N–). Por lo tanto esta reacción es usada comúnmente el diseño de máquinas y dispositivos moleculares.

13 (a) Liu, Y.; Flood, A. H.; Bonvallet, P. A.; Vignon, S. A.; Northrop, B. H.; Tseng, H.-R.; Jeppesen, J. O.; Huang, T. J.; Brough, B.; Baller, M.; Magonov, S.; Solares, S. D.; Goddard, W. A.; Ho, C.-M.; Stoddart, J. F. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 9745, (b) Niess, F.; Duplan, V.; Sauvage, J.-P. Chem. Lett. 2014, 43, 964.

2. Antecedentes

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2.2. TIPOS DE MÁQUINAS MOLECULARES Y EJEMPLOS NATURALES

En función del tipo de movimiento realizado por el dispositivo, las máquinas moleculares pueden clasificarse en interruptores, rotores y motores moleculares.

2.3.1 Interruptores moleculares

Un interruptor molecular es un sistema biestable cuyas dos posiciones, “on” y “off”, pueden ser intercambiados reversiblemente en respuesta a la aplicación de un estímulo externo.14 En la Figura 2.3 se presenta un dispositivo de este tipo en el que los dos diferentes estados pueden revertirse mediante la aplicación del correspondiente estímulo (E1 o E2).

Figura 2.3. Esquema del funcionamiento de un interruptor molecular.

Concretamente, los interruptores moleculares basados en estímulos fotoquímicos son los dispositivos más útiles y su funcionamiento está extensamente estudiado. Principalmente se han estudiado sistemas basados en dos tipos de reacciones: la fotoisomerización E/Z y la fotociclación.

Estos dispositivos presentan multitud de aplicaciones y ya han sido utilizados en varios contextos para convertir la energía luminosa en movimiento mecánico a nivel molecular. Por ejemplo se ha estudiado la modulación de la conformación y función de biomoléculas, 15 el plegamiento de proteínas,16 y el marcaje de células con este tipo de interruptores.17

Finalmente cabe destacar que en la naturaleza existe un gran número de máquinas moleculares especializadas en realizar una determinada función. Uno de los ejemplos más importantes es el proceso de isomerización E/Z que sufre el cromóforo de la rodopsina durante el proceso de la visión.18 Este proceso se inicia en los fotorreceptores de bastones y conos del ojo. Las entidades fotosensibles de estas células consisten en una apoproteína, la opsina, y un cromóforo que se encuentra embebido en ella, el 11-cis-retinal. Tal y como puede observarse en la Figura 2.4, el retinal se encuentra unido a un residuo de lisina a través de su grupo carbonilo dando lugar a una base de Schiff que se encuentra protonada (PSB-retinal). El grupo imínico protonado se encuentra estabilizado por un carboxilato de la proteína cargado negativamente (Figura 2.4 (b)).19

14 Garcia-Iriepa, C.; Marazzi, M.; Frutos, L. M.; Sampedro, D. RSC Adv. 2013, 3, 6241. 15 Silverman, S. K. Org. Biomol. Chem. 2004, 2, 2701. 16 Fierz, B.; Satzger, H.; Root, C.; Gilch, P.; Zinth, W.; Kiefhaber, T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007, 104, 2163. 17 Schrader, T. E.; Cordes, T.; Schreier, W. J.; Koller, F. O.; Dong, S.-L.; Moroder, L.; Zinth, W. J. Phys. Chem. B 2011, 115, 5219. 18 Kandori, H.; Shichida, Y.; Yoshizawa, T. Biochemistry (Moscow) 2001, 66, 1197. 19 Migani, A.; Sinicropi, A.; Ferre, N.; Cembran, A.; Garavelli, M.; Olivucci, M. Faraday Discuss. 2004, 127, 179.

E1

E2

2. Antecedentes

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Figura 2.4. Rodopsina (a), y su cromóforo PSB-retinal (b).

En ausencia de luz visible, la PSB-retinal presenta una conformación cis entre sus carbonos 11 y 12. Sin embargo, la absorción de luz visible provoca la fotoisomerización de este doble enlace dando lugar a la conformación trans. Esta transformación genera una serie de cambios estructurales en la rodopsina que permiten la visión en los vertebrados.

El proceso de isomerización cis-trans del retinal en la rodopsina es muy eficiente, presentando un rendimiento cuántico in vivo de 0,67.20 Debido a esta elevada eficiencia, el retinal ha sido ampliamente estudiado y utilizado para el diseño de interruptores moleculares activados por luz. Con esta idea en mente, en 2004 fue diseñada y sintetizada una nueva familia de interruptores biomiméticos en los cuales la subestructura –C=C–C=C–C=N– se modifica bloqueando los dobles enlaces de ambos extremos con el objetivo de eliminar procesos de fotoisomerización competitivos.21 Este tipo de compuestos tienen como estructura general la base de Schiff de una benciliden-pirrolina (BPs) que trata de replicar en disolución las excelentes propiedades fotoquímicas que presenta el cromóforo de la rodopsina. La ruta sintética general para la preparación de este tipo de interruptores moleculares se presenta en la Figura 2.5.

20 Dartnall, H. J. A. Vision Res. 1968, 8, 339. 21 Sampedro, D.; Migani, A.; Pepi, A.; Busi, E.; Basosi, R.; Latterini, L.; Elisei, F.; Fusi, S.; Ponticelli, F.; Zanirato, V.; Olivucci, M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 9349.

a)

11-cis-retinal

b)

2. Antecedentes

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Figura 2.5. Ruta sintética para la obtención de interruptores BPs.

Siguiendo esta línea de investigación, nuestro grupo de trabajo ha sido capaz de diseñar y sintetizar con éxito un eficiente interruptor molecular basado en la PSB-retinal (1).

Figura 2.6. Interruptor molecular basado en el cromóforo de la rodopsina.

Interesantemente, la isomerización E/Z de este interruptor puede llevarse a cabo mediante luz visible y a través de este proceso la distancia entre los dos extremos de la molécula sufre un importante cambio (≈10 Å). Estas características lo convierten en un gran candidato para el fotocontrol reversible de biomoléculas. En concreto, su incorporación en péptidos resulta especialmente relevante ya que la función de estas moléculas está íntimamente relacionada con su estructura. Esta hipótesis de partida ya ha sido comprobada a través de su anclaje a un péptido modelo de carácter puramente sintético y sin una función biológica concreta.22

22 Blanco-Lomas, M.; Samanta, S.; Campos, P. J.; Woolley, G. A.; Sampedro, D. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 6960.

2. Antecedentes

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Figura 2.7. Fotocontrol de la estructura de un péptido.

De esta manera resulta posible la fotomodulación de la estructura y función de un péptido de manera eficaz utilizando luz visible. Dado que esta luz es de muy baja energía, este procedimiento podría llevarse a cabo incluso in vivo sin ningún tipo de problema.

En este Trabajo Fin de Grado se pretende dar continuidad a esta línea de investigación a través de la incorporación de este interruptor molecular a un fragmento peptídico funcional con el fin de modular su actividad.

2.3.2. Rotores y motores moleculares

Un rotor molecular se define como un dispositivo capaz de girar en distintas direcciones a través de un movimiento continuo.

En el caso de que este movimiento rotatorio sea controlado de manera que únicamente gire en una dirección, la máquina se denomina motor molecular rotativo. Además de estos dos tipos de dispositivos, existen los denominados motores moleculares lineales que son capaces de desarrollar un movimiento lineal.

En cuanto a los motores moleculares rotativos, estos sistemas están involucrados en procesos tan importantes como la síntesis de adenosín trifosfato (ATP),23 o la propulsión de bacterias como la Escherichia coli.24

Los motores moleculares lineales, por su parte, están involucrados en la división celular,25 en los movimientos de cilios y flagelos, en la detección del sonido, en la contracción muscular,26 o en el transporte intracelular. Dado que uno de los objetivos de este proyecto de investigación

23 Yasuda, R.; Noji, H.; Kinosita, K., Jr.; Yoshida, M. Cell 1998, 93, 1117. 24 Lowder, B. J.; Duyvesteyn, M. D.; Blair, D. F. J. Bacteriol. 2005, 187, 5640. 25 Gelles, J.; Landick, R. Cell 1998, 93, 13. 26 Frey, E. ChemPhysChem 2002, 3, 270.

2. Antecedentes

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reside en modular la velocidad del transporte intracelular, a continuación se explica brevemente cómo se lleva a cabo este proceso.

En las células eucariotas se necesitan sistemas eficientes que se encarguen del transporte intracelular con la finalidad de abastecer a los diferentes orgánulos. Entre estos sistemas destacan motores proteicos microtubulares como la kinesina (ver Figura 2.8).

Figura 2.8. Un motor natural: la kinesina.

La kinesina convencional es un dímero de dos cadenas pesadas, cada una de las cuales está asociada a una cadena liviana. Consta de dos dominios cabeza globulares, un tallo central y un par de dominios cola, también globulares pero de menor tamaño.

Las dos cadenas pesadas están involucradas en la unión y movilidad de los microtúbulos, la hidrólisis del ATP necesaria para realizar el movimiento y la dimerización de proteínas. En cuanto a las cadenas más ligeras, éstas regulan la actividad de las cadenas pesadas y la unión a diferentes vesículas de transporte.

Los microtúbulos que son recorridos por la kinesina durante su movimiento lineal están formados por un conjunto de proteínas tubulares que se agrupan formando una especie de cilindro. Por cada molécula de ATP hidrolizada durante este movimiento, la kinesina realiza un paso de 8 nm sobre la superficie del microtúbulo. Además, la kinesina se mueve con una velocidad de aproximadamente 1,8 μm/s y puede aguantar cargas de 6 pN.

A pesar del amplio conocimiento que se tiene sobre este proceso existe un gran desconocimiento acerca de los factores intracelulares que regulan la velocidad de este motor molecular. Sin embargo, un estudio reciente llevado a cabo por la Unidad de Angiogénesis del Centro de Investigación Biomédica de La Rioja (CIBIR) revela que el péptido de 20 aminoácidos N-terminal de la proarenomedulina, PAMP, influye en la velocidad del consumo de ATP y por tanto en la velocidad de la kinesina.27 En el mismo estudio se describe otra de sus funciones, enlazarse a la tubulina desestabilizando su polimerización (ver Figura 2.9).

27 (a) Larrayoz, I. M.; Martinez, A. Endocrinology 2012, 153, 1734. (b) Sackett, D. L.; Ozbun, L.; Zudaire, E.; Wessner, L.; Chirgwin, J. M.; Cuttitta, F.; Martinez, A. Ibid.2008, 149, 2888.

Cola

Tallo

Cabeza

a) Estructura de la kinesina b) Movimiento de la kinesina a lo largo del microtúbulo

Microtúbulo

Kinesina

Vesícula

Extremo - Extremo +

2. Antecedentes

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Figura 2.9. Polimerización de tubulina.

Investigaciones adicionales acerca de la estructura activa de la PAMP determinan que la amidación del grupo carboxilo terminal es indispensable para el correcto desarrollo de ambas funciones. Además, revelan que estas dos funciones dependen de diferentes regiones de la molécula. Así, el péptido PAMP12-20 es el fragmento más pequeño que mantiene intacta su actividad sobre la kinesina mientras que la PAMP18-20 conserva su capacidad de retrasar la polimerización de la tubulina.

Figura 2.7. Estructura del péptido de 20 aminoácidos N-terminal de la proadrenomedulina.

Debido al pequeño tamaño de estos fragmentos parece factible controlar su función mediante la incorporación en su estructura del interruptor 1. Además, el conocimiento de la actividad de la PAMP frente a la tubulina y la kinesina y el hecho de que ésta pueda ser cuantificada experimentalmente posibilita comprobar la eficiencia de su modulación.28 Por estas razones se ha seleccionado a la PAMP como péptido susceptible de fotocontrol para el desarrollo de este proyecto.

Para concluir, conviene resaltar que esta proteína está involucrada en multitud de procesos fisiológicos. Entre ellos destacan la vasodilatación, la regulación de la secreción hormonal, la actividad antimicrobiana, la modulación del crecimiento celular, la apoptosis y la angiogénesis. 29 Debido a esta capacidad para intensificar la angiogénesis, este péptido desempeña un papel fundamental en la diseminación o metástasis de un cáncer. Por esta razón, la PAMP supone una potencial diana molecular para futuros tratamientos quimioterapeúticos.

28 Ver referencia 27 (a). 29 Martinez, A.; Zudaire, E.; Portal-Nunez, S.; Guedez, L.; Libutti, S. K.; Stetler-Stevenson, W. G.; Cuttitta, F. Cancer Res. 2004, 64, 6489.

Heterodímeros de α y β-tubulina

Núcleo del microtúbulo

Microtúbulo

Extremo +

Extremo -

CAPÍTULO 3

Objetivos

3. Objetivos

- 16 -

El objetivo general de este Trabajo Fin de Grado consiste en preparar un péptido fotomodulable con potenciales aplicaciones biológicas y estudiar su fotoquímica. Para lograrlo se pretenden cumplir los siguientes objetivos específicos.

Sintetizar un interruptor molecular biomimético basado en la estructura de la PSB-retinal optimizando la ruta sintética establecida.

Sintetizar dos fragmentos peptídicos funcionales de la PAMP.

Incorporar el interruptor molecular en la estructura de ambos péptidos y evaluar su comportamiento fotoquímico.

CAPÍTULO 4

Estudio fotoquímico

4. Estudio fotoquímico

- 18 -

4.1. SÍNTESIS DE UN INTERRUPTOR MOLECULAR BASADO EN LA PSB-RETINAL

El interruptor molecular seleccionado para el desarrollo de este proyecto de investigación es el compuesto 1. Los grupos cloroacetamida presentes en los extremos de su estructura tienen la capacidad de acoplarse a las funciones tiol de aminoácidos cisteína. Por tanto es posible anclar el interruptor de manera específica en un péptido a través de estas posiciones sulfuradas. Además, sus excelentes propiedades fotoquímicas, expuestas en la Sección 2.3.1, lo convierten en el candidato idóneo justificando su elección.

En base a la ruta sintética establecida para la síntesis de este tipo de compuestos (Figura 2.5), puede plantearse el siguiente esquema general para llevar a cabo su preparación.

Figura 4.1. Esquema sintético general del interruptor molecular 1.

Una vez planteada de manera global la síntesis de 1, en el Capítulo 6 se detalla el procedimiento experimental a seguir en cada una de las etapas de su preparación.

4.2. SÍNTESIS DE FRAGMENTOS PEPTÍDICOS DE LA PAMP

El razonamiento expuesto en la Sección 2.3.2 justifica la elección de la PAMP como péptido funcional susceptible de ser modulado fotoquímicamente. Tal y como se ha indicado, el fragmento PAMP12-20 mantiene intacta su actividad biológica tanto frente a la tubulina como a la kinesina. Además, la subestructura PAMP18-20 es activa frente a la primera de ellas. Esto supone una gran ventaja a nivel práctico, ya que es posible trabajar con fragmentos peptídicos menores que la PAMP siempre que contengan la secuencia de aminoácidos presentes en la región activa. Por contra, ya que el interruptor molecular es parcialmente hidrófobo, el fragmento peptídico debe tener el tamaño suficiente para conferir solubilidad acuosa al sistema péptido-interruptor.


- 19 -

Como el anclaje del interruptor en el péptido se lleva a cabo a través de posiciones cisteína, resulta necesario incorporar dos de estos aminoácidos en la estructura de los fragmentos de la PAMP que de deseen modular. Conviene advertir que la posición de estos grupos en la secuencia de aminoácidos no es trivial, sino que la distancia cisteína-cisteína debe adecuarse a la distancia entre los extremos del interruptor molecular. En este sentido, mediante una simulación de dinámica molecular complementaria a esta investigación se ha estimado que la distancia extremo-extremo presente en el isómero E es de 17 Å, mientras que en el isómero Z es de 6 Å.30 Estos valores determinan que la distancia entre extremos del isómero E se ajusta de manera aproximada a la correspondiente a una separación i, i + 11 en la secuencia de aminoácidos de un péptido con estructura de α-hélice como la PAMP.

En base a estos condicionantes se han diseñado dos fragmentos peptídicos basados en la región activa de la PAMP con la intención de que mantengan su actividad biológica y poder lograr así su modulación fotoquímica (Figura 4.2).

Figura 4.2. Secuencia de aminoácidos de la PAMP y de los fragmentos de estudio F1 y F2.

En cuanto al fragmento peptídico F1, únicamente se modifica la región PAMP12-20 colocando una cisteína en lugar de una serina. La gran similitud en la estructura de estos dos aminoácidos justifica su intercambio (Figura 4.3). En el péptido F2 la secuencia 18-20 se mantiene inalterada y la subestructura 12-20 sólo se altera intercambiando una alanina por una cisteína.

Figura 4.3. Estructura de la cisteína (C) y de la serina (S).

La preparación de F1 y F2 se ha realizado mediante la metodología de síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS). Su posterior purificación se ha llevado a cabo por HPLC de tipo semipreparativo (ver Capítulo 6).

4.3. ACOPLAMIENTOS PÉPTIDO-INTERRUPTOR

Para llevar a cabo la incorporación del interruptor molecular 1 a los péptidos F1 y F2 se utiliza la metodología seguida por Andrew Woolley en la Universidad de Toronto.31 En el Capítulo 6 se detalla el procedimiento experimental a seguir para realizar estos acoplamientos 1-F1 y 1-F2 y su posterior purificación mediante HPLC de tipo semipreparativo.

30 Ver referencia 22. 31 (a) Burns, D. C.; Zhang, F.; Woolley, G. A. Nat. Protoc. 2007, 2, 251. (b) Samanta, S.; Woolley, G. A. ChemBioChem 2011, 12, 1712. (c) Woolley, G. A. Acc. Chem. Res. 2005, 38, 486.


- 20 -

A pesar de que el isómero Z está presente en pequeña proporción, en condiciones de temperatura y luz ambiental el sistema péptido-interruptor se encuentra mayoritariamente en su forma E. Por otro lado debe tenerse en cuenta que el compuesto 1 no es una molécula simétrica. Por tanto las cisteínas del péptido pueden enlazarse a cualquiera de los grupos cloroacetamida del interruptor dando lugar a dos regioisómeros diferentes (E1 y E2 o Z1 y Z2). Por estos motivos en cada sistema pueden estar presentes cuatro especies en diferente proporción (Figuras 4.4 y 4.5).

Figura 4.4. Especies 1-F1.

Figura 4.5. Especies 1-F2.

En un primer intento de aislar las diferentes especies mediante HPLC no se ha tenido éxito al no lograrse una adecuada resolución de los distintos picos cromatográficos. Por tanto se plantea como objetivo a medio plazo conseguir su separación optimizando el método de elución.


- 21 -

Sin embargo, no es necesario aislar cada una de las especies para realizar el estudio preliminar del sistema que supone este Trabajo Fin de Grado. La primera razón se basa en que el cambio en la distancia extremo-extremo tras la isomerización es idéntico para los dos regioisómeros, por lo que se espera que ambos provoquen el mismo cambio conformacional sobre la cadena peptídica. El segundo motivo reside en que por el momento no se desea cuantificar la actividad biológica del compuesto Z y del compuesto E por separado, sino que basta con comprobar si cada uno de ellos se comporta de manera diferente. Para lograrlo es suficiente con comparar la actividad del sistema sin irradiar con la correspondiente al estado fotoestacionario, que presentará un mayor porcentaje de isómero Z.

4.4. ESTUDIO FOTOQUÍMICO DE PÉPTIDOS FOTOMODULABLES

A continuación se explica el estudio fotoquímico realizado sobre los derivados péptido-interruptor preparados anteriormente y se discuten los resultados obtenidos. Para lograr una mayor claridad esta sección se divide en dos bloques: el primero se centra en el estudio de 1-F1 y el segundo en 1-F2.

Estudio fotoquímico del sistema 1-F1.

En primer lugar se registra el espectro UV-vis de una disolución acuosa 5 mM del sistema 1-F1 (Figura 4.6).

Figura 4.6. Espectro UV-vis de 1-F1 5 mM a pH = 7 y temperatura ambiente.

Mediante una predicción del pKa del interruptor se determina que tanto el isómero Z como el E presentan un valor de 7,4 ± 0,2 (ACD/iLabs, ver Sección 6.2). Este valor es significativamente inferior al correspondiente al cromóforo de la rodopsina, pKa = 9. A partir de estos datos se puede concluir que a pH neutro el nitrógeno imínico del cromóforo natural se encuentra protonado prácticamente en su totalidad mientras que en este compuesto sólo se encuentra parcialmente protonado.

250 300 350 400 450 500 550

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

282,54

283

Ab

so

rban

cia

(u

.a)

(nm)


- 22 -

Por este motivo se registra de nuevo el espectro UV-vis del sistema a pH 5 (Figura 4.7).

Figura 4.7. Espectro UV-vis de 1-F1 5 mM a pH 5 y 7.

En la Figura 4.7 se aprecia que la disminución del pH provoca un desplazamiento batocrómico del espectro debido a la protonación de la base de Schiff. De este modo se desarrolla una banda centrada en 370,53 nm que se extiende hasta los 500 nm permitiendo que el sistema pueda ser irradiado incluso con luz visible para conseguir su fotoisomerización. Sin embargo, debido a que este nivel tan bajo de pH no es compatible con un medio biológico deben plantearse otras alternativas que permitan el desarrollo de esta banda. Una alternativa consiste en introducir sustituyentes electro-dadores que provoquen un aumento del pKa del cromóforo permitiendo así su protonación a pH fisiológico. Otra opción es incorporar un sustituyente en el átomo de nitrógeno de manera que su carga positiva se mantenga permanentemente.

El siguiente estudio consiste en irradiar (λ = 370 nm) esta disolución ácida de 1-F1 provocando así la fotoisomerización E → Z hasta alcanzar el estado fotoestacionario. En la Figura 4.8 se presentan los cromatogramas obtenidos mediante HPLC de tipo analítico tanto antes de irradiar como una vez alcanzado el estado estacionario. Los picos cromatográficos se asignan en función de su comportamiento tras la isomerización ya que a través de esta reacción la cantidad de isómero Z aumenta en detrimento de la correspondiente al isómero E. Conviene aclarar que la diferenciación entre regioisómeros no es posible mediante esta técnica por lo que se han asignado arbitrariamente.

250 300 350 400 450 500 550

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

259,35

370,53

37111

37111371

259

(nm) (M-1·cm

-1))

------------------------------------------------------------------------ 259 18860

283 17080

371 13360

283A

bso

rban

cia

(u

.a)

(nm)

pH = 7

pH = 5


- 23 -

Figura 4. 8. Cromatograma de 1-F1 sin irradiar (abajo) y en el estado fotoestacioario.

En base a los anteriores cromatogramas se confirma que la irradiación provoca la fotoisomerización del sistema produciéndose la transformación E → Z. Además se observa que bajo estas condiciones cromatográficas los picos correspondientes a las especies E1-F1 y E2-F1 aparecen solapados mientras que los correspondientes a los regioisómeros Z se separan, apareciendo uno de ellos bien resuelto y el otro solapado con los picos E. Mediante la integración de las señales se concluye que el estado fotoestacionario presenta la siguiente composición: 52 % E / 48 % Z. Además, a temperatura ambiente esta composición se mantiene con el tiempo. Sin embargo, mediante una subida de la temperatura hasta los 50 ºC se consigue la reversión completa del isómero Z al isómero termodinámicamente más estable E en 10 horas. Esto permite establecer un control sobre la conformación estructural del péptido anclado, pero las condiciones necesarias no son compatibles con sistemas vivos. Por tanto se plantea continuar con este proyecto de investigación en un futuro con el fin de conseguir la reversión Z → E mediante la irradiación del estado estacionario a otra longitud de onda de baja energía. Para ello se propone aislar el isómero Z y registrar su espectro UV-vis con el fin de encontrar una región de absorción específica que no esté presente, o de manera reducida, en la forma E. El hecho de

Tras irradiar a 375 nm

Luz ambiental

Z1-F1

E1-F1 y E2-F1

Z2-F2


- 24 -

que en sistemas similares la banda de absorción del isómero Z presente una cola que se extiende a mayores longitudes de onda que en E, permite valorar con optimismo esta hipótesis de partida. De esta manera podría irradiarse el sistema en su estado fotoestacionario con una longitud de onda mayor consiguiendo la reversión en unas condiciones suaves compatibles con un medio biológico.

Por tanto es posible tener el sistema péptido-interruptor tanto mayoritariamente en su forma E como en el estado fotoestacionario, en el que casi la mitad de 1-F1 se encuentra en forma Z. Mediante una representación de las correspondientes estructuras puede comprobarse que la isomerización del interruptor provoca una disrupción en la estructura helicoidal de la cadena peptídica (Figura 4.9). En concreto se observa que la distancia extremo-extremo del isómero E se ajusta a la separación i, i + 10 que presentan las cisteínas en la secuencia del péptido. Sin embargo, la distancia entre extremos del isómero Z es demasiado corta para permitir esta estructuración regular de α-hélice.

Figura 4.9. Ilustración de la isomerización del sistema 1-F1.

Por último es necesario realizar un estudio in vitro introduciendo el sistema en un entorno controlado que imite el medio celular. El primer análisis consiste en comprobar si el fragmento F1 sintetizado, con pequeñas modificaciones con respecto a la PAMP, mantiene sus funciones biológicas. En caso de que conserve su función, después debe analizarse cómo interfiere la incorporación del interruptor molecular, tanto en su forma Z como E, en la actividad biológica del péptido frente la tubulina y la kinesina. Este estudio se está realizando en colaboración con la Unidad de Angiogénesis del CIBIR. A fecha de hoy el proyecto se encuentra a en este punto temporal, permaneciendo tanto el sistema 1-F1 como 1-F2 depositados en el CIBIR pendientes de ensayo.

hν, 370 nm

Δ, 50 ºC


- 25 -

Estudio fotoquímico del sistema 1-F2.

Primeramente se registra el espectro UV-vis de una disolución acuosa 5 mM de 1-F2 tanto a pH 7 como a pH 5 (Figura 4.10).

Figura 4.10. Espectro UV-vis de 1-F2 5 mM a pH 5 y 7.

Al igual que en el sistema 1-F1, a pH 5 se desarrolla una banda en la región visible del espectro centrada en 374,1 nm que en este caso se extiende hasta casi los 450 nm.

La exposición de esta disolución ácida de 1-F2 a una radiación de 370 nm provoca la isomerización E → Z. En la Figura 4.11 se presentan los cromatogramas obtenidos mediante HPLC de tipo analítico tanto antes de irradiar como una vez alcanzado el estado estacionario. Posteriormente se interpretan las distintas señales que aparecen.

Figura 4.11. Cromatograma de 1-F1 sin irradiar (abajo) y en el estado fotoestacionario.

250 300 350 400 450 500

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

226,81

281,9

225,1

00000282

(nm) (M-1·cm

-1))

-------------------------------------------------------------------- 260 10120

282 14406

319 9966

374 8183260

374

319

Ab

so

rban

cia

(u

.a)

(nm)

pH = 7

pH = 5


- 26 -

A partir de la forma del cromatograma previo a la irradiación se plantea como hipótesis inicial que los picos a y c corresponden a los regioisómeros Z, mientras que las señales b y d corresponden a los regiosiómeros E. Tras la irradiación se comprueba que efectivamente el pico a disminuye en detrimento del pico b, confirmándose así la fotoisomerización E → Z. Sin embargo los picos c y d no presentan el comportamiento esperado y se mantienen inalterados. En base a ello se proponen dos nuevas hipótesis que deberán ser discutidas en el futuro. La primera plantea que la hipótesis inicial es correcta, y que por tanto la pareja regioisómera c/d presenta un comportamiento fotoquímico significativamente diferente a la pareja a/b. La segunda sugiere que las señales c y d son impurezas, por lo que el pico a corresponde a Z1+Z2 y el pico b a E1+E2.

En la Figura 4.12 se presenta una ilustración del proceso de isomerización de 1-F2. En este caso se observa que la distancia entre extremos del isómero E permite la correcta estructuración en forma de α-hélice regular del péptido. Por el contrario, el isómero Z no se ajusta a la separación i, i + 11 que presentas las cisteínas en la secuencia de aminoácidos del péptido provocando una disrupción en su estructura helicoidal.

Figura 4.12. Ilustración de la isomerización del sistema 1-F1.

Finalmente debe realizase en el CIBIR el mismo estudio biológico in vitro explicado anteriormente para el sistema 1-F1. En función de los resultados obtenidos en este estudio biológico se podrá continuar el proyecto a medio plazo a través de diferentes vías. Por ejemplo, en caso de que los fragmentos F1 y F2 no presenten actividad biológica, puede ampliarse el estudio mediante la preparación de otros fragmentos distintos de la PAMP. Por el contrario, si los resultados son exitosos sería interesante estudiar computacionalmente el sistema que ofrece los mejores resultados con el fin de proponer mejoras racionales en busca de su optimización.

hν, 370 nm

Δ, 50 ºC

CAPÍTULO 5

Conclusiones

5. Conclusiones

- 28 -

A partir del estudio realizado durante este Trabajo Fin de Grado pueden extraerse las siguientes conclusiones:

En primer lugar se ha logrado sintetizar un interruptor molecular eficiente basado en la estructura de un cromóforo natural, la base de Schiff protonada del retinal.

Una vez sintetizado, este interruptor ha sido anclado con éxito en distintos fragmentos de

una proteína con actividad biológica conocida, la PAMP. Mediante un estudio fotoquímico se ha comprobado que el interruptor molecular mantiene

su comportamiento inicial una vez incorporado al péptido. Además, es posible controlar la isomerización reversible de estos sistemas péptido-interruptor mediante su exposición alternativa a radiación electromagnética (370 nm), y a una temperatura de 50 ºC.

Por último, se ha observado que el cambio estructural sufrido por el interruptor tras la

isomerización induce un cambio en la estructura secundaria de la proteína. De esta manera es posible tener un cierto control sobre la estructura de los fragmentos estudiados de la PAMP, y por tanto sobre su actividad biológica.

CAPÍTULO 6

Parte experimental

6. Parte experimental

- 30 -

6.1. CONSIDERACIONES GENERALES

Resonancia magnética nuclear.

Los espectros de resonancia magnética nuclear han sido obtenidos en un equipo Bruker Avance 400. Como disolvente se ha utilizado DMSO-d6 utilizando las señales de los grupos metilo no deuterados como referencia. Los valores de desplazamiento químico (δ) se expresan en ppm. Las multiplicidades de las señales se indican de la siguiente forma: (s) = singlete, (d) = doblete y (t) = triplete.

Espectroscopia de absorción molecular UV-vis.

Los espectros de absorción molecular se han obtenido en un espectrofotómetro USB4000 de Oceano Optics, provisto de un detector CCD de 3648 pixels, y acoplado a una lámpara DT-MINI-2-GS del mismo fabricante. En todos los casos se han empleado disoluciones de concentración 5·10-5 M en cubetas de cuarzo de 1 cm de paso óptico.

Electrospray-Espectrometría de masas (ESI-MS).

Los análisis de espectrometría de masas se han realizado en un equipo HP Bruker MicrOTOF-Q provisto de una fuente de ionización por electrospray y se han registrado en modo ión positivo.

Cromatografía.

Las cromatografías de capa fina se han llevado a cabo utilizando cromatofolios ALUGRAM Xtra SIL G/UV254 de gel de sílice de 0,2 mm de espesor provistos de indicador de fluorescencia UV254.

Las cromatografías de columna se han realizado utilizando como fase estacionaria gel de sílice 60 (0,04 - 0,06 mm) y como fase móvil los eluyentes indicados en cada caso.

HPLC de tipo analítico.

Para llevar a cabo los análisis de identificación y cuantificación de las especies presentes en los sistemas péptido-interruptor se ha empleado un equipo Waters 1525 provisto de una columna Phenomenex Luna de C18 con un tamaño de partícula de 5 μm cuyas dimensiones son: 250 x 4.60 mm. En todos los casos se ha empleado un método de elución isocrático H2O/CH3CN 75:25.


- 31 -

HPLC de tipo semipreparativo.

La purificación de los sistemas peptídicos se ha realizado mediante HPLC de fase reversa utilizando un equipo Waters Delta Prep 400 proviso de una columna Phenomenex Luna de C18 con un tamaño de partícula de 10 μm. Las dimensiones de esta columna son 250 x 21,20 mm.

Sintetizador automático de péptidos.

Para la síntesis de los dos péptidos se ha utilizado un sintetizador de péptidos automático Applied Biosystems ABI 433A.

Monocromador.

Para llevar a cabo la irradiación de los sistemas 1-F1 y 1-F2 se ha utilizado un monocromador de red de difracción Oriel Cornestone 130 1/8 m provisto de una lámpara de Hg(Xe) de 500 W. Las correspondientes muestras de estos sistemas se han irradiado en cubetas de cuarzo de 1 cm de paso óptico utilizando disoluciones de concentración 5·10-5 M.

6.2. SÍNTESIS DE UN INTERRUPTOR MOLECULAR BASADO EN LA PSB-RETINAL

El esquema sintético seguido para la obtención del interruptor molecular 1 se presenta en la Figura 6.1. Debido a que la caracterización de los distintos intermedios de la ruta ha sido publicada anteriormente,32 en este trabajo únicamente se recoge la caracterización por 1H RMN del producto final

Figura 6.1

32 Ver referencia 22.


- 32 -

Síntesis de t-butil (4-acetilfenil)carbamato (3).

El primer paso de la ruta sintética consiste en proteger el grupo amino de la 4-aminoacetofenona (2), que es un reactivo comercialmente accesible. Para ello se emplea dicarbonato de di-tert-butilo (1,5 equiv.) en presencia de carbonato de sodio (2 equiv.) en THF/H2O (5:1).33 La mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante tres días y tras esto se adicionan 50 mL de una disolución acuosa de hidróxido sódico 2 M. A continuación se lleva a cabo una extracción con diclorometano (3 x 50 mL) eliminando después esta fase orgánica a presión reducida en el rotavapor. El residuo resultante se purifica mediante una cromatografía de columna empleando como eluyente (1:1 hexano/AcOEt) obteniéndose así el compuesto 3, un sólido blanco, con un 95 % de rendimiento.

Síntesis de t-butil (4-(2-bromoacetil)fenil)carbamato (4).

Una vez obtenida la acetofenona 3 se lleva a cabo su bromación utilizando Br2. Para ello es necesario disolver previamente el bromo (2 equiv) en THF seco y adicionar esta mezcla lentamente sobre el compuesto 7 (1 equiv.) durante 30 minutos manteniendo la temperatura en 0 ºC. La reacción se mantiene a temperatura ambiente otros 10 minutos y seguidamente se evapora el THF bajo presión reducida obteniéndose así un aceite de color anaranjado. Este aceite se disuelve en cloroformo y se coloca una temperatura de -20 ºC precipitando así la bromoacetofenona 4 (sólido amarillo) que debe separarse a través de una filtración. El rendimiento de esta etapa es de un 65 %.

Síntesis de t-butil (4-(2-(dietoxifosforil)acetil)fenil)carbamato (5).

Se adiciona fosfito de trietilo (5 equiv.) sobre el compuesto 4 (1 equiv.) y la mezcla resultante se mantiene a 160 ºC durante 3 horas. El producto obtenido se purifica mediante una cromatografía de columna empleando (2:1 hexano/AcOEt) para dar el fosfonato 5, de aspecto aceitoso e incoloro, con un 85 % de rendimiento.

Síntesis de 2-yodoetilazida (13).

Dado que la 2-yodoetilazida empleada en la síntesis de 6 no es accesible comercialmente, resulta necesaria su preparación previa partiendo de 2-cloroetanol (Figura 6.2).

Figura 6.2

33 Tarbell, D. S.; Yamamoto, Y.; Pope, B. M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1972, 69, 730.


- 33 -

En primer lugar se añade una disolución acuosa de azida de sodio (1,5 equiv.) sobre 2-cloroetanol (1 equiv.) calentando la mezcla a 30 ºC durante 1 hora y seguidamente a 80 ºC por un día. Una vez que la reacción ha concluido se lleva a cabo una extracción con diclorometano (4 x 30 mL) y a continuación se elimina este disolvente a presión reducida. De este modo se obtiene con un 80 % de rendimiento el 2-azidoetanol (11) que es un aceite incoloro.

Para llevar a cabo la segunda etapa de la síntesis se disuelve 1 equivalente de 11 en piridina y se añaden con cuidado 1,2 equivalentes de cloruro de 4-toluensulfonilo manteniendo la temperatura a 0 ºC. La mezcla resultante se mantiene a esta temperatura otras 48 horas y después se lleva a cabo la desactivación de la piridina mediante la adición de ácido clorhídrico. Posteriormente se realiza una extracción con diclorometano (3 x 50 mL) lavando la fase orgánica obtenida con una disolución saturada de cloruro de sodio. Finalmente se elimina el diclorometano en el rotavapor y se obtiene de nuevo un aceite incoloro que corresponde a 12. El rendimiento de esta etapa es del 60 %.

En el último paso sintético se lleva a cabo la adición azida de sodio (2 equiv.) sobre 12 (1 equiv.) en acetona. La mezcla así obtenida se mantiene bajo agitación magnética y a temperatura ambiente durante un día y tras esto se elimina el disolvente y se lleva a cabo una extracción con diclorometano (3 x 50 mL). De este modo se obtiene con un rendimiento del 60 % el producto 13 que presenta un color rojizo y una apariencia aceitosa.

Síntesis de t-butil (4-(4-azido-2-(dietoxifosfino)butanoil)fenil)carbamato (6).

Esta etapa de la síntesis consiste en un proceso de transferencia de fase mediante el cual se incorpora una cadena lateral de etilazida en la estructura del compuesto 5.34 Para comenzar se prepara una mezcla de 5 (1 equiv.) y 13 (2,5 equiv.) en CH2Cl2 (5 mL) y a continuación se añade una disolución de hidrogenosulfato de tetrabutilamonio (1 equiv.) en hidróxido de sodio 2 M (2 equiv.). Esta mezcla se mantiene a reflujo durante 36 horas. Una vez que la reacción ha finalizado se adiciona agua (50 mL) y diclorometano (50 mL) y se lleva a cabo la separación de la fase orgánica concentrándola posteriormente a presión reducida. El residuo resultante se disuelve en 100 mL de dietiléter lográndose de esta manera la precipitación de yoduro de tetrabutilamonio. Seguidamente se separa esta sal por filtración y la fase líquida obtenida se seca con sulfato de sodio y se concentra a presión reducida en el rotavapor dando lugar a un aceite incoloro. Por último, se purifica este aceite mediante una cromatografía flash (1:2 hexano/AcOEt) obteniéndose así el compuesto 6. Este producto es un líquido incoloro y el rendimiento de su síntesis es del 60 %.

34 Snider, B. B.; Zhou, J. J. Org. Chem. 2005, 70, 1087.


- 34 -

Síntesis de t-butil (4-formilfenil)carbamato (7).

En cuanto al compuesto 7, este aldehído no es accesible comercialmente por lo que es necesario llevar a cabo su preparación partiendo de un compuesto común como el ácido 4-aminobenzoico (Figura 6.3).

Figura 6.3

Primeramente se disuelve el ácido 4-aminobenzoico (1 equiv.) en diclorometano (10 mL) y sobre esta disolución se adicionan 6 equivalentes de cloruro de tionilo. Tras esto se añaden gota a gota 1,25 equivalentes de metanol y la mezcla se mantiene a reflujo durante una hora. Una vez pasado este tiempo se lleva a cabo la evaporación del disolvente obteniéndose el derivado 16 con un 80 % de rendimiento.

Posteriormente se trata el éster 16 (1 equiv.) con dicarbonato de di-tert-butilo (1,5 equiv.) y carbonato de sodio (2 equiv.) en THF/H2O (5:1). Esta mezcla se mantiene bajo agitación y a temperatura ambiente durante tres días. Una vez que la reacción ha finalizado se adicionan 50 mL de una disolución acuosa de hidróxido sódico 2 M, se lleva a cabo una extracción con diclorometano (3 x 50 mL) y se elimina este disolvente en el rotavapor obteniéndose el compuesto 17 con un 90 % de rendimiento.

En la siguiente etapa se disuelve el derivado 17 (1 equiv.) en 60 mL de THF seco y a continuación se añaden lentamente 2 equivalentes de LiBH4 4 M manteniendo el medio de reacción a 0 ºC. Esta reacción se mantiene a temperatura ambiente y bajo atmósfera inerte una semana. Una vez que la reducción ha concluido se añade una disolución saturada de cloruro amónico (20 mL) y se realiza una extracción con acetato de etilo (3 x 15 mL). La fase orgánica obtenida se concentra a presión reducida y el residuo resultante se purifica mediante una cromatografía de columna (2:1 hexano/AcOEt) dando lugar al alcohol 18 con un rendimiento del 70 %.

El último paso consiste en oxidar de manera controlada el alcohol 18 empleando el peryodinano de Dess Martin (DMP) para dar lugar al aldehído 7. Para ello se adiciona una disolución de DMP en diclorometano (1,5 equiv.) sobre el compuesto 18 (1 equiv.). La mezcla resultante se deja a temperatura ambiente unas dos horas y una vez que la oxidación ha finalizado se adicionan 10 mL de bicarbonato de sodio y 10 mL de tiosulfato de sodio.


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Posteriormente se separa la fase orgánica, se lava con una disolución saturada de cloruro de sodio y se elimina el disolvente dando lugar al compuesto 7 con un 70 % de rendimiento. Este aldehído es sólido y presenta un color marrón pálido.

Síntesis de t-butil (E)-(4-(4-azido-2-(4-((tert-butoxicarbonil)amino)benzoil)but-1-en-1-il)fenil)carbamato (8).

Este paso sintético consiste en una reacción de Wittig-Horner entre el azido-fosfonato 6 y el aldehído 7 utilizando de nuevo hidrogenosulfato de tetrabutilamonio como agente de transferencia de fase. En primer lugar se prepara una mezcla de 3 (1 equiv.) y 4 (1,5 equiv.) en THF y se añade una disolución de hidrogenosulfato de tetrabutilamonio (0,15 equiv.) en hidróxido de sodio 2 M (1 equiv.). La mezcla resultante se mantiene a reflujo durante unas 3 semanas siguiendo el progreso de la reacción mediante cromatografía de capa fina (3:1 hexano/AcOEt). Una vez que todo el fosfonato de partida ha sido consumido se elimina el THF y se adicionan 50 mL de agua antes de realizar una extracción con diclorometano (3 x 50 mL). Las fases orgánicas obtenidas se secan con sulfato de sodio, se concentran a presión reducida y el residuo obtenido se purifica mediante una cromatografía de columna (3:1 hexano/AcOEt) para dar 8 con un rendimiento del 30 %. Este compuesto es un líquido amarillento de apariencia aceitosa. Aunque la reacción da como resultado una mezcla 9:1 de los isómeros E y Z, no es necesario llevar a cabo su separación ya que ambos conducen al mismo producto (9) en la siguiente etapa de la ruta sintética.

Síntesis de t-butil (E)-(4-((2-(4-((t-butoxicarbonil)amino)fenil)-4,5-dihidro-3H-pirrol-3-iliden)metil)fenil)carbamato (9).

Mediante una reacción de aza-Wittig intramolecular sobre el compuesto 8 se obtiene el isómero E del interruptor molecular 9. Una vez preparada una disolución de 8 en dietiléter seco (1 equiv.), se adiciona trifenilfosfina (3 equiv.) y la mezcla resultante se agita a temperatura ambiente y bajo atmósfera inerte durante 1 día. Tras esto se elimina el dietiléter en el rotavapor y el producto resultante se purifica mediante una cromatografía de columna empleando como eluyente hexano/AcOEt (1:4). De esta manera se obtiene un sólido amarillo correspondiente al compuesto 9 con un 60 % de rendimiento.

Síntesis de (E)-2-cloro-N-(4-(4-(4-(2-cloroacetamido)benciliden)-3,4-dihidro-2H-pirrol-5-il)fenil)acetamida (1).

Primero se prepara una disolución de 9 en la mínima cantidad posible de diclorometano (1 equiv.) y tras esto se adiciona ácido trifluoroacético en exceso (300 equiv.) produciéndose así la desprotección de los dos grupos amino de manera cuantitativa. Sin necesidad de purificación, el crudo de reacción se disuelve en una disolución acuosa de carbonato de sodio (pH = 8) y se mantiene a una temperatura de 0 ºC. Seguidamente se adiciona cloruro de cloroacetilo (1 equiv.) y la mezcla se agita vigorosamente manteniendo la temperatura a 0 ºC


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Fórmula molecular: C32H19Cl2N3O2

Peso molecular (g/mol): 415,09

Observaciones: sólido marrón

durante 30 minutos y después a temperatura ambiente otras dos horas. El precipitado así obtenido se filtra, se lava con agua y se seca en la bomba de vacío para dar el interruptor molecular 1 con un 40 % de rendimiento. Este producto es un sólido de color marrón.

1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 11,04 (s, 1H); 10,82 (s, 1H), 7,93 (d, 2H, J= 8,4 Hz); 7,82 (d, 2H, J= 8,4 Hz); 7,78 (d, 2H, J= 8,4 Hz); 7,70 (d, 2H, J= 8,4 Hz); 7,39 (s, 1H); 4,38 (s, 2H); 4,33 (s, 2H); 4,22 (t, 2H, J= 5,6 Hz); 3,39 (t, 2H, J= 5,6 Hz).

ESI-MS (+) (m/z) [C32H19Cl2N3O2 + H]+: 416,0923; calculado 416,0933.

Predicción pKa (ACD/ilabs):


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6.3. SÍNTESIS DE FRAGMENTOS PEPTÍDICOS DE LA PAMP

La preparación de F1 y F2 se realiza en el sintetizador automático de péptidos mediante la metodología SPPS y siguiendo la estrategia Fmoc/tBu. Se ha optado por trabajar con la resina de amida de Rink ya que permite obtener el carboxilo terminal amidado. En la Figura 6.4 se presenta a modo de ejemplo ilustrativo el esquema sintético de F1. Posteriormente se describe el procedimiento experimental seguido en la síntesis de ambos péptidos.

Figura 6.4. Esquema sintético de F1.


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En primer lugar se introduce la resina (0,1 mmol) y los aminoácidos convenientemente protegidos (1 mmol) en los correspondientes recipientes del equipo. A continuación se lleva a cabo la desprotección de la resina mediante un tratamiento de 10 minutos con una disolución de piperidina (1 mL) en DMF (3 mL).

Seguidamente se expulsa el cartucho de iniciación, se disuelve el primer aminoácido en DIEA (1 mL), HBTU (3,4 g) y DMF (2 mL) y se añade al reactor por 10 minutos. Después se lleva a cabo la desprotección del grupo protector Fmoc realizando lavados sucesivos durante 30 minutos con piperidina (1 mL) en DMF (3 mL). Estos dos pasos deben repetirse cíclicamente tantas veces como aminoácidos haya que acoplar.

Posteriormente, se retira la resina del equipo y se acetila el grupo amino terminal del péptido. Para lograrlo se realiza un tratamiento con anhídrido acético (1 mL) y piridina (2 mL) durante 2,5 horas.

Finalmente se procede a liberar la resina y a desproteger las cadenas laterales del péptido. Para ello se añade TFA (1,9 mL), TIS (50 µL), EDT (50 µL) y H2O (50 µL) y la mezcla resultante se agita durante dos horas. Transcurrido este tiempo, se añade dietiléter frío (10 mL) manteniendo la temperatura a 0 ºC para provocar la precipitación del péptido. Se separa el sólido por filtración, se lava con más dietiléter para eliminar impurezas y por último se redisuelve en agua.

La purificación del producto obtenido se lleva a cabo mediante HPLC de tipo semipreparativo utilizando como método de elución un gradiente lineal de H2O/CH3CN. El agua empleada contiene un 0,1 % (v/v) de ácido trifluoroacético.

Método de elución: gradiente lineal de H2O/CH3CN desde 95:5 hasta 65:35 en 25 min.

Tiempo de retención: 19,01 min.




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6.4. ACOPLAMIENTOS PÉPTIDO-INTERRUPTOR

El procedimiento seguido para el anclaje péptido-interruptor es el mismo tanto para F1 como para F2. Este acoplamiento se lleva a cabo es un disolución tampón de trisaminometano 60 mM a pH 8 que contiene TCEP en una concentración 2 mM. Sobre esta mezcla se adiciona otra disolución con el correspondiente péptido (0,5 mM) y el interruptor (2 mM) en H2O/DMSO 80:20. La reacción se mantiene bajo agitación durante 12 horas, se elimina el DMSO con ayuda de la bomba de alto vacío y el producto obtenido se purifica con HPLC semipreparativo. Su posterior caracterización se realiza mediante ESI-MS en modo de ión positivo.



ESI-MS (+) (m/z) [C94H134N28O16S2 + 2H]2+: 988,5060; calculado 988,5066.



ESI-MS (+) (m/z) [C111H155N31O23S2 + 4H]4+: 589,5411; calculado 589,7936.

ANEXO

Espectros de RMN

Anexo. Espectros de RMN

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Caracterización del interruptor molecular 1. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)

1H-1H COSY (400 MHz, DMSO-d6)

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