PRCTICA N10

PRACTICA N 10

INVESTIGACIN DE Listeria monocytogenes

I. INTRODUCCINListeria monocytogenes, es un bacilo Gram positivo, no esporulado de 1,0 - 2,0 de largo x 0,5 u de dimetro, son muy mviles, tienen de 1 a 5 flagelo peritricos lo cual les confiere una movilidad caracterstica en tumbos y un desarrollo en paraguas cuando se cultiva a 25C. El gnero se puede diferenciarse fcilmente a base de su B hemolisis y la fermentacin de manitol, ramnosa y xilosa; desarrollan a 37C, pero pueden sobrevivir a temperaturas extremas de -4C y 50C. Es sensible a la desecacin y a pH bajo, es sensible a la cloracin del agua y a la pasteurizacin. Requiere un AW mnimo de 0.93.Muchas de las caractersticas exclusivas de Listeria hacen que sea un microorganismo difcil de controlar en los alimentos; puede desarrollar en un amplio rango de temperaturas y pH, sobrevive a la congelacin y es relativamente resistente a la temperatura. Listeria es comensal en el tracto gastrointestinal de bovinos, caprinos y equinos. Se ha comprobado que personas infectadas pueden eliminar Listeria durante su enfermedad y periodo de convalecencia.En leches con alto grado de contaminacin algunas clulas pueden permanecer viables. Desarrolla en alimentos mantenidos a temperatura ambiente y en condiciones de refrigeracin. El modo de transmisin es por contacto directo con animales portadores o sus carcasas contaminadas, por ingestin de alimentos y aguas contaminadas y por contacto directo con tejidos de animales infectados. El gnero y en especial Listeria monocytogenes tiene una gran importancia en la salud pblica y es necesario su deteccin e identificacin en los alimentos con fines de vigilancia, monitoreo y diagnstico.II. OBJETIVOS Determinar e identificar gnero Listeria a partir de leche. Realizar una evaluacin de cuanto es el riesgo de infeccin en la muestra por la bacteria. El riesgo que se corre al consumir leche contaminada con Listeria.

III. MATERIALES Muestra biolgica: Leche frescoMateriales de laboratorioMedios de cultivo Agar listeria Cado de enriquecimiento para Listeria Frasco pequeo esterilizado Tubos de ensayo de dilucin. Placas Petri Pipetas estriles de 10mL y 1mL Asa bacteriolgica Gradillas Estufa. Mecheros, algodn, alcohol

Medio LEB sea medio de pre-enriquecimientoIV. PROCEDIMIENTOPASO 1: pre-enriquecimiento

En un frasco estril colocar 25ml de leche fresca.

Agregar 225ml caldo de enriquecimiento para Listeria. Llevar a incubar por 4h a 37C.

Luego se le agrega al medio suplemento selectivo para caldo LEB y se incuba a 37C por 24h

PASO 2: SIEMBRA EN PLACA (medio selectivo, agar listeria) Luego del enriquecimiento, se lleva a sembrar en placa, mtodo en superficie por estra.

Lectura: En iluminacin oblicua, colonias pequeas, borde ntido, ligeramente abombadas, con superficie lisa (brillante), tornasoladas, azul verdosas, centro poco transparente o verde amarillento (se puede confundir con Enterococcus). Realizar prueba de CAMP, positivo para listeria.

V. RESULTADOSDe las observaciones:ENRIQUECIMIENTO:Se observ turbidez del frasco de enriquecimiento.

SIEMBRA EN PLACA:Se obtuvo el siguiente resultado:

Se encontraron colonias caractersticas del Gnero Listeria. Se le realizo tincin Gram y se pudo observar bacterias de Listeria

VI. CONCLUSIONES De la muestra analizada se concluye que la muestra presentaba listeria por tanto no es apto para el consumo humano. Se determina que la muestra analizada est contaminada con Listeria

VII. CUESTIONARIO

Prueba de Cristie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP)

Para la prueba de CAMP se emplean las siguientes cepas de coleccin de S. aureus y R. equi:Staphylococcus aureus Rhodococcus equiATCC 49444 ATCC 6339NCTC 7428 NCTC 1621ATCC 25923CIP 5710Las cepas empleadas en la prueba de CAMP pueden obtenerse de diversas colecciones nacionales e internacionales.En una placa de agar sangre de carnero sembrar una estra de la cepa de S. aureus y, paralelamente una de R. equi, separadas lo suficiente para que entre stas se puedan estriar perpendicularmente las cepas sospechosas de Listeria, sin que lleguen a tocarse (aproximadamente 5 mm de separacin). Despus de 24 y 48 h de incubacin a 35C observar el sinergismo entre las hemolisinas de S. aureus, R. equi y Listeria que se manifiesta como una zona hemoltica ms intensa.

La figura, muestra la disposicin de las estras de los cultivos en una placa para la prueba de CAMP. La hemlisis de L. monocytogenes y L. seeligeri se incrementa cerca de la estra de S. aureus, y la hemlisis de L. ivanovii se aumenta cerca de la estra de R. equi. Las especies restantes no son hemolticas en esta prueba.Diseo de la inoculacin en placas de agar sangre de carnero. Las lneas horizontales representan las estras de la inoculacin de cinco cepas. Las lneas verticales representan las estras de inoculacin de S. aureus (S) y R. equi (R). Las lneas sombreadas indican el incremento de hemlisis en esas regiones.

Cmo se observan las colonias en Medio Oxford?

Despus de la incubacin, se registran el crecimiento de microorganismos. La mayora de las cepas de L. monocytogenes y otras Listeria spp. forman colonias blancas de aproximadamente 1mm de dimetro que est rodeado de un halo negro tras pasar 24 horas. Despus de 48 horas, estas colonias tpicamente tienen un dimetro de 2-3mm, permaneciendo negras con un halo negro, pero desarrollando un centro hundido. La caracterstica de ennegrecimiento es causada por la reaccin positiva a la asculina exhibida por Listeria spp.

Mtodos normalizados para Listeria.

Un mtodo basado en las Normas ISO correspondientes para Salmonella (EN/ISO 6579) y Listeria monocytogenes (EN/ISO 11290-2), u otros mtodos, siempre que estn validados con respecto al mtodo de referencia establecido, debiendo estar registrados, certificados por terceros conforme al protocolo de la norma EN/ISO 16140 u otros protocolos similares internacionalmente aceptados.

Listeria ISO 11290 Listeria ISO 11290-1/2 (Deteccin y recuento de L. monocytogenes).

VIII. BIBLIOGRAFIA Pascual M. y V. Caldern. 2000. Microbiologa Alimentaria: metodologa analtica para alimentos y bebidas. Editorial Daz de Santos. Segunda edicin. Madrid-Espaa. James M. Jay. 2002. Microbiologa moderna de los alimentos. Editorial Acribia S.A. Cuarta edicin. Zaragoza-Espaa. Direccin general de Salud Ambiental (DIGESA). Manual de Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2001. Lima-Per.