PRUEBA COLORIMÉTRICA DE PH DEL EXUDADO DE SEMILLAS PARA LA EVALUACIÓN DE VIGOR EN SIMIENTES DE ARVEJA ( PISUM SATIVUM L.)

Gallo, C.; Arango, M.; Craviotto, R.

Tecnología de Semillas. Estación Experimental Agropecuaria Oliveros, INTA

Ruta 11, Km 353, C.P 2206, Oliveros, Santa Fe, Argentina. cgallo@correo.inta.gov.ar

Palabras clave: pH, exudados, semillas, Pisum sativum L.

RESUMEN

INTRODUCCIÓN

Son varias las investigaciones realizadas en el mundo referidas al desarrollo y/o adaptación de

nuevas técnicas rápidas para la evaluación de la calidad fisiológica de semillas de diversas

especies. Las investigaciones más importantes han avanzado en técnicas basadas en la coloración

de los tejidos vivos de las semillas como es el caso de la Prueba Topográfica por Tetrazolio

(Lakon, 1942; Moore & Goodsell, 1965; França Neto et al., 1986; Craviotto et al., 2008). Otra

técnica extensamente estudiada es la Prueba de Conductividad Eléctrica donde se evalúa

indirectamente la condición fisiológica de semillas de diferentes especies. En esta prueba se mide

la concentración de electrolitos liberados por las simientes durante un período de imbibición

(Carvalho et al, 2000; Ayala Aguilera & Menezes; 2000; Gallo et al, 2008). La liberación de los

electrolitos desde las células hacia el medio de imbibición depende del grado de permeabilidad

selectiva de las membranas plasmáticas. Según Rech, et al (1999) y Peske & Amaral (1986); las

semillas poco deterioradas poseen membranas celulares con buena permeabilidad selectiva y la

liberación de sustancias desde el interior de las mismas es menor respecto a semillas deterioradas

cuyas membranas se encuentran alteradas y consecuentemente la liberación de sustancias al

medio es mayor.

Entre las sustancias liberadas desde el interior de las semillas se encuentran azúcares, ácidos

orgánicos e iones H+ principalmente. Estas sustancias provocan la acidificación del medio donde

se encuentran embebidas las simientes (Cabrera & Peske, 2002). El cambio en el pH del medio de

imbibición de las semillas, provocado por el proceso de liberación de sustancias desde el interior

de las simientes, puede determinarse a través de la Prueba Colorimétrica de pH del exudado de

semillas. Esta prueba estima la integridad citológica y fisiológica de las células a través del pH del

exudado de las simientes. La valoración del pH del exudado puede realizarse mediante el empleo

de sustancias indicadoras que facilitan la coloración del medio de imbibición de las semillas. De

este modo, la observación del color permite inferir la condición de permeabilidad de las membranas

celulares y por lo tanto, estimar indirectamente el grado de deterioro de las semillas (Amaral &

Peske, 1984). La Prueba Colorimétrica del pH del exudado fue desarrollada inicialmente para

evaluar la viabilidad en semillas de soja (Peske & Amaral, 1986; Amaral & Peske, 1984), en

semillas de maíz (Mondragón, 1987; Montenegro, 1991; Santana et al, 1998; Cabrera & Peske,

2002) y en semillas de poroto (Fernandes et al., 1987). Sin embargo, esta técnica podría ser

empleada para la determinación de la condición de vigor de las semillas tal como lo es la Prueba

de Conductividad Eléctrica debido a ambas pruebas comparten el mismo principio fisiológico. Por

lo tanto, el presente trabajo tuvo como objetivo determinar la eficiencia de la Prueba Colorimétrica

del pH del exudado de semillas como una técnica rápida de evaluación de vigor de semillas de

arveja.

MATERIALES Y MÉTODOS

El trabajo fue desarrollado en el Laboratorio de Semillas de INTA Oliveros en octubre y noviembre

2011. Se emplearon ocho lotes de semillas de arveja (Pisum sativum L.) del cultivar Facón

cosechados en diciembre de 2010. A fin de evitar el deterioro fisiológico de las semillas, éstas se

conservaron en bolsas de polietileno en cámara fría a 10ºC durante los meses previos al inicio del

trabajo.

Para caracterizar los lotes de semillas de arveja según la calidad fisiológica se realizaron las

siguientes pruebas: Prueba de Germinación Estándar; Prueba Colorimétrica del pH del exudado y

Emergencia a Campo.

Prueba de Germinación Estándar : Se emplearon 4 repeticiones de 50 semillas para cada lote de

simiente. Para la siembra se empleó arena como medio de crecimiento, previamente esterilizada y

tamizada. Los recipientes utilizados fueron cajas plásticas en cuyo interior se colocó una capa de

arena humedecida de 20 mm de espesor. Finalizada la siembra de las 50 semillas por caja, éstas

se cubrieron con 20 mm de arena húmeda. Las cajas se introdujeron en bolsas de polietileno de

100 micrones para evitar la pérdida de humedad desde el medio de crecimiento y luego se llevaron

los recipientes a una cámara de germinación con temperatura constante de 20ºC. Las

evaluaciones de las plántulas fueron realizadas al 8vo día después de la siembra según establecen

las Reglas ISTA (2009). La clasificación de plántulas se realizó según criterio del Manual de

Evaluación de Plántulas de ISTA, 3era edición (ISTA, 1995). El resultado se expresó como

Porcentaje de Plántulas Normales. Para corroborar la precisión de los resultados, se empleó la

tabla de Tolerancia 14.3 del capítulo 14 del Handbook of Seed Technology for Genebanks (Ellis et

al., 1985).

Prueba Colorimétrica del pH del exudado: Se emplearon 100 semillas para cada lote de

simientes, distribuidas en bandejas con 100 celdas individuales. En cada celda se colocaron 3 ml

de agua deionizada a fin de asegurar la correcta inmersión de cada una de las semillas colocadas

de forma individual en cada celda. Luego de sumergir las semillas en las celdas, las bandejas se

cubrieron con bolsas de polietileno para evitar la contaminación del agua deionizada, y se llevaron

a cámara a 20ºC durante un período de 30 minutos (Amaral & Peske, 1984; Bewley & Black, 1985).

Finalizado el período de lixiviación de electrolitos desde las semillas hacia el medio de inmersión,

se retiraron las bandejas de la cámara y se colocaron 2 gotas (0.03 mg/gota) de la solución

indicadora formada por una relación 1:1 de solución de fenolftaleína al 0.5% y solución de

carbonato de sodio (Na2Co3) al 0.25% respectivamente (Peske & Amaral, 1986; Peretti, 1994). La

solución de fenolftaleína se preparó disolviendo 0.5 gr de fenolftaleína en 50 ml de alcohol 96º y

luego agregando 50 ml de agua deionizada. Por otra parte, la solución de carbonato de sodio al

0.25% se obtuvo disolviendo 0.25 gr de sal Na2Co3 en 100 ml de agua deionizada (Peretti, 1994).

Inmediatamente después del contacto con las gotas de solución indicadora, se produjo el viraje de

color en el agua de inmersión de las semillas. La coloración que adquirió la solución de inmersión

en cada celda difirió en función de la calidad fisiológica de cada semilla. Las coloraciones

observadas fueron: rosa intenso, rosa pálido e incoloro (Fig. 1).

La relación existente entre la calidad fisiológica de las semillas y el color del medio de inmersión se

comprobó a través de la capacidad de germinación de las simientes previamente sometidas a la

lixiviación. Debido a que la solución indicadora no produce alteraciones en las semillas (Peretti,

1994), las semillas contenidas en las celdas se sembraron en recipientes individuales de 16 cc con

arena para conocer la calidad fisiológica. Cada recipiente fue identificado con el número de celda

correspondiente a cada semilla. Previamente a la siembra se registró el color del agua de

inmersión luego del agregado de la solución indicadora de todas las celdas. Posteriormente se

cuantificó la cantidad de celdas con color rosa oscuro, expresando dicho resultado como

Porcentaje de Exudado Rosa Intenso.

a

b

c

Fig.1. Coloraciones de la solución de inmersión de semillas de arveja luego del agregado de la

solución indicadora. a) Incolora (semilla no viable); b) rosa pálido (semilla no viable); c) rosa

intenso (semilla viable).

Los recipientes sembrados se llevaron a cámara de germinación a 20ºC constantes durante 8 días.

Finalizado el período de germinación, se evaluaron las plántulas de cada recipiente y se

clasificaron como plántulas normales, plántulas anormales o semillas muertas según criterio del

Manual de Evaluación de Plántulas de ISTA, 3era edición (ISTA, 1995).

Se observó que las semillas provenientes de celdas con solución de coloración rosa intenso

produjeron plántulas normales, mientras que las semillas sumergidas en solución de color rosado

pálido o solución incolora produjeron plántulas anormales o no germinaron.

Emergencia a campo: Se sembraron aleatoriamente 2 surcos de 100 semillas para cada lote de

simientes. La siembra se realizó el día 5 de agosto de 2011 en una parcela con rastrojo de soja,

sobre suelo con 64% de la capacidad de retención de agua y con temperatura de suelo promedio a

los 0.05 m de profundidad de 11.5ºC. La profundidad de siembra fue de 0.03 m y el recuento de

plántulas emergidas se realizó a los 25 días luego de la siembra. Los resultados se expresaron

como Porcentaje de Plántulas Emergidas.

Los datos expresados en porcentajes fueron transformados usando el arco seno de la raíz

cuadrada de la proporción (arc sen √x/100). Se realizó la prueba de comparaciones múltiples,

utilizando un nivel de significación del 0,05. Para los cálculos estadísticos se empleó el software

estadístico InfoStat (InfoStat, Grupo InfoStat/FCA. Universidad Nacional de Córdoba, 2007).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados de la Prueba de Germinación Estándar difirieron estadísticamente entre sí pero los

porcentajes de plántulas normales revelaron que todos los lotes de semillas de arveja analizados

presentaron muy buena calidad fisiológica, encontrándose los valores de Porcentaje de Plántulas

Normales entre 86% y 99%, siendo el lote D aquel que manifestó la mejor calidad y el lote A el que

presentó la menor germinación (Fig. 2).

Con respecto a la condición de vigor, la figura 3 muestra los resultados obtenidos durante la

Prueba de pH del exudado de semillas en los 8 lotes de simientes de arveja. Los datos,

expresados como Porcentaje de Exudados Rosa Intenso, se diferenciaron estadísticamente

permitiendo agrupar a los lotes de semillas en grupos de calidad fisiológica diferente. Los lotes E y

F presentaron los menores porcentajes de celdas con exudados rosa intenso, lo que permite inferir

que las semillas de arveja de estos lotes presentaban un mayor deterioro en sus membranas

celulares ocurriendo una alta liberación de electrolitos y una mayor acidificación del medio de

inmersión. Por el contrario, los lotes B y D presentaron altos Porcentajes de Exudados Rosa

Intenso, indicando un alto Porcentaje de Semillas Viables y por ende una mejor calidad fisiológica

respecto a los lotes E y F. Coincidiendo con Rech et al.(1999), quiénes demostraron que la Prueba

de pH del exudado de semillas está relacionada con el vigor de las semillas de arveja, los

resultados del presente ensayo muestran que la alteración del pH provocada por los exudados

liberados desde las semillas deterioradas permitió identificar a los lotes de simientes con diferentes

niveles de vigor. Resultados similares obtuvieron Santana et al. (1998) quiénes separaron

a ab

cd d b b

c cd

Fig.2. Porcentaje de Plántulas Normales de ocho lotes de semillas de arveja, obtenidos en la

Prueba de Germinación Estándar. Valores seguidos de igual letra no difieren estadísticamente entre sí

según el Test de Duncan a un nivel de P= 0,05.

eficientemente lotes de semillas de maíz con diferentes calidades fisiológicas a través del uso de la

Prueba de pH del exudado de semillas.

Los datos referidos a la emergencia de plántulas en el campo (Fig. 4), muestran un ordenamiento

de los lotes según su calidad fisiológica similar al obtenido con los resultados de la Prueba de pH

del exudado de las semillas. En función a los resultados del conteo de plántulas emergidas en el

campo, el lote E manifestó la menor emergencia en el campo, coincidiendo con la menor calidad

fisiológica expresada en la Prueba de pH del exudado. Los lotes B y D fueron los que presentaron

el mayor porcentaje de plántulas emergidas en el campo, mientras que el resto de los lotes

manifestaron porcentajes de emergencia de plántulas comprendidos entre 80% y 89%. El lote F fue

el único lote de semillas que presentó resultados disímiles entre la prueba de laboratorio del pH del

exudado de semillas y la emergencia en el campo, ya que en el conteo de plántulas en el campo

presentó 89% de plántulas emergidas indicando un buen comportamiento en la germinación bajo

las condiciones ambientales presentes en el ensayo.

Fig.3. Porcentaje de celdas con solución de color rosa intenso, de ocho lotes de semillas de

arveja, obtenidos en la Prueba de pH del exudado de semillas. Valores seguidos de igual letra no

difieren estadísticamente entre sí según el Test de Duncan a un nivel de P= 0,05.

bc d

b

e

a a b c

CONCLUSIONES

El análisis y la interpretación de los resultados permiten concluir que la Prueba de pH del exudado

de semillas podría ser una prueba rápida para determinar el vigor de simientes de arveja debido a

la similitud del comportamiento de los lotes en el laboratorio y en el campo. Sin embargo, es

necesario continuar con líneas de investigación tendientes a evaluar la correlación entre la Prueba

de pH del exudado con un amplio rango de condiciones ambientales en el campo.

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ab

d

abc

d

a

cd bcd

abc

Fig.4. Porcentaje de Plántulas Emergidas, de ocho lotes de semillas de arveja, obtenidos en la

Prueba de Emergencia en el campo. Valores seguidos de igual letra no difieren estadísticamente entre sí

según el Test de Duncan a un nivel de P= 0,05.

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