Reacción en cadena de la Polimerasa, sus aplicaciones y algunos … · 2016. 7. 8. · ¿PCR?...
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Reacción en cadena de la Polimerasa, sus aplicaciones y algunos elementos de ecología
molecular
Polymerase Chain Reaction (PCR)
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¿PCR?
1983, Dr. Kary Mullis, Premio novel (1993)
PCR = síntesis en progresión exponencial de secuencias “objetivos” (locus) de DNA (in vitro).
“Polimerasa” = la enzima
“en cadena” = los productos de una reacción se usan en la siguiente
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La reacción
Termo-ciclador
PCR-multiplex
(Práctica 2)
Tubo PCR
(DNA extraído, pre-PCR)
(Práctica 1)
Post PCR
(Práctica 3)
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Componentes
1) DNA objetivo (secuencia a amplificar; ciertos locus)
2) “Primers” (“cebadores”; oligonucleótidos q definen la secuencia a
amplificar
3) dNTPs - nucleótidos (bloques q constituyen el DNA)
4) DNA Polimerasa - enzima
5) Mg++ ions – cofactor de la enzima
6) Solución buffer – mantiene el pH en el rango de trabajo de la
polimerasa
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“Primers” (por donde empieza a
trabajar la Polimerasa)
• Universales – amplifica DNA de cualquier
organismo (ancestro común)
• Específicos – amplifican locus para grupos
animales y vegetales concretos
• PCR Multiplex – múltiples PCR con múltiples
Primers para secuenciar distintos DNA objetivo
(distintos locus) – técnica actual
• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
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Desnaturalización (95oC)
Enfriamiento (56oC) – unión de
“Primers” (cebadores)
Calentamiento (72oC) DNA
polimerasa + dNTPs
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0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
DN
A c
op
ies
Cycle number
DNA copies vs Cycle number
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https://www.youtube.com/watch?v=8DodRwl8pxM
https://www.youtube.com/watch?v=V9PtQlp-e7g
Videos de PCR
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Post procesamiento de productos PCR
(post PCR…algunos ejemplos)
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Los productos de
la PCR se cortan
con enzimas de
restricción
Separación de los
productos por su
peso en gel de
agarosa (práctica 2)
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Electroforesis
• Separación de los productos
post PCR según su longitud
(peso molecular) al aplicar un
campo eléctrico (la carga
eléctrica cambia con el peso,
pares de bases, fragmentos
más pequeños, viajan más
lejos en el gel), generalmente
sobre un gel de agarosa o por
capilaridad
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Individuos es homocigoto
(respecto a un locus
concentro), si ambos alelos
son iguales; heterocigótico
si son distintos
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• Frecuencias fenotípicas y genotípicas (de alelos) de
una población: proporciones de fenotipos y alelos
• En co-dominancia: frecuencias fenotípicas =
frecuencias genotípicas
• En dominancia: (alelos dominantes y recesivos)
frecuencias fenotípicas =/= frecuencias genotípicas
Genotipos Nº de individuos Frecuencias genotípicas
D= A1A1 15 15/50 = 0,3 => 30%
H= A1A2 30 30/50 = 0,6 => 60 %
R= A2A2 5 5/50 = 0,1 => 10 %
Total 50 1 100%
Genotipos Nº de
individuos
Nº de genes
A1 A2
A1A1 30 30 0
A1A2 60 60 60
A2A2 10 0 10
Total 100 90 70
Frecuencias del alelo A1 => 90/100 = 0,9
Frecuencias del alelo A2 => 70/100 = 0,7
D + H + R = 1
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• La variación genética (ej. intra e inter-poblacional)
puede medirse por: Polimorfismo y Heterocigosidad
• Polimorfismo fenotípico: referente a variaciones
morfológicas. Ej: guisantes lisos/rugoso;
verdes/amarillos.
• Polimorfismo genotípico (alélico, nº alelos para una
población= riqueza alélica; alelos privados = alelos
propios de cada población)
Polimorfismo= nº total de loci polimórficos
nº total de loci
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Heterocigosidad
A partir de frecuencias alélicas para
una población puedo calcular
índices de heterocigosidad
Heterocigosidad: frecuencia media de individuos heterocigóticos;
se estima calculando la frecuencia de heterocigóticos para cada
locus y dividiendo por el total de loci (Ho = Heterocigosidad
observada)
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Ley de Hardy-Weinberg, equilibrio de
poblaciones.• Población grande con apareamiento al azar; es decir, no
sometida a migración, mutación, deriva génica o
selección, las frecuencias genotípicas se mantienen
constantes de generación en generación. Cuando se
cumplen estas condiciones, población en equilibrio
Hardy-Weinberg
• Panmixia = apareamiento aleatorio, al azar, entre los
individuos de una población o varias poblaciones = falta
de estructura genética.
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Frecuencias
alélicas para
una serie de
locus
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Heterocigosidad esperada: frecuencia de heterocigóticos si la
población se encontrara en equilibrio HW.
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Aplicaciones de la PCR
Basic Research Applied Research
• Genetic matching
• Detection of pathogens
• Pre-natal diagnosis
• DNA fingerprinting
• Gene therapy
• Mutation screening
• Drug discovery
• Classification of organisms
• Genotyping
• Molecular Archaeology
• Molecular Epidemiology
• Molecular Ecology (la BOMBA¡¡)
• Bioinformatics
• Genomic cloning
• Site-directed mutagenesis
• Gene expression studies
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Clasificación de Organismos
1) Relating to each other
2) Similarities
3) Differences
* Fossils
* Trace amounts
* Small organisms
Morfología + DNA ¡¡¡¡¡¡
Ha cambiado nuestra forma de definir especies
Insufficient data
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Árboles filogenéticos
basados en caracteres
morfológicos/anatómicos,
pero tb en similitudes
genéticas
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Detección de patógenos
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Aplicaciones PCR (marcadores moleculares
en ecología)
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Estructura (variabilidad) genética de poblaciones
Selección natural (proceso evolutivo)
Mutaciones (aleatorias, replicación del DNA, cambios lentos en la
estructura genética)
Deriva genética (aislamiento, fijación de alelos, consanguinidad)
Recombinación (durante la meiosis)
Flujo genético (movimiento de genes entre poblaciones,
Conectividad, inmigración, cambio brusco en frecuencias alélicas)
Migraciones (aleatorias, replicación del DNA)
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La variabilidad génica existe en todas las
poblaciones: seleccionista y neutralista
(debido al azar)
Sólo importante cuando
poblaciones son reducidas
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Estudios de ecología molecular
- Flujo genético (conectividad entre poblaciones):
¿Poblaciones abiertas o cerradas?
- Efecto de barreras geográficas
- Especies exóticas
- Trazabilidad de especies “escapadas”
- Gestión de reservas marinas
…..y…clave para unos seres muy especiales….
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31
Cymodocea nodosa
Ejemplo de necesidad de estudios con marcadores
moleculares
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• Funcionamiento: productividad primaria y
secundaria, reciclaje de nutrientes, biomasa,
diversidad, etc.
• Resiliencia: resistencia y recuperación frente a
perturbaciones
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34
Muestreo la misma planta?
Herramientas moleculares; incluyo “genes”
(identidad genética)
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35
Fanerógamas son plantas clonales
Conexión entre la distribución de parches y la
distribución de genotipos?
P1 P2 P3
P1 P2 P3
G1 G2 G3“where landscape genetics meets landscape ecology”
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36
Diferentes clones funcionan de manera
distinta?
Variación demográfica entre clones?
Diferentes genotipos generan
diferentes fenotipos?
Varía la resiliencia entre clones?
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+NiPi
‛Placebo’
37
Auto-crítica: diferentes genotipos?
Necesitamos incluir diferentes niveles de variación genética
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38
Gi,j… Gi,j,k G3,k,l
Funcionamiento y resiliencia de praderas marinas
He1 He2 He3
Favorece la diversidad genética la mayor resiliencia?