RESUMEN

La enfermedad de Parkinson es un trastorno neurodege-nerativo caracterizado por la pérdida progresiva de las neu-ronas dopaminérgicas de la Sustancia Negra. Recientes traba-jos relacionan al estrés oxidativo, implicado en la etiología deesta patología, con una sobreexpresión en las neuronas de pro-teínas reguladoras del ciclo celular. Las células postmitóticas,en respuesta a esta sobreexpresión, mueren por apoptosis enlugar de progresar a través de un ciclo celular descoordinadoy por ello fatal. En este trabajo hemos comprobado el efectoneuroprotector de la melatonina frente a la muerte inducidapor las neurotoxinas catecolinérgicas, MPP+ y 6-OHDA, endos líneas celulares dopaminérgicas diferenciadas (UR61 yPC12), observando una prevención de entre el 10-20%(p<0.05). Un efecto similar fue observado con el empleo de an-tioxidantes y de inhibidores del ciclo celular, por lo que la neu-roprotección mostrada por la melatonina podría estar media-da tanto por su actividad antioxidante, como su capacidadpara impedir la reentrada en el ciclo celular.

ABSTRACT

Parkinson´s disease is a neurodegenerative disorder thatleads to a progressive death of dopaminergic neurons in theSubstantia Nigra. The generation of reactive oxygen species isconsidered to be implicated in its etiology. Recent works con-nect oxidative stress with the overexpresion of cell cycle pro-teins in neurons. Postmitotic neurons, because of said overex-presion, undergo apoptosis instead of going through aderegulated, therefore fatal, cell cycle. Our work shows theneuroprotector effect of melatonin against neuronal death in-duced by the catecolinergic toxins MPP+ and 6-OHDA on twodifferentiated dopaminergic cell lines (UR61 and PC12). Me-latonin was able to reduce cell death over a 10-20% (p<0.05).Other antioxidants, as well as other cell cycle inhibitors tested,produced a similar effect. Thus, it appears that either melato-nin antioxidant properties or cell cycle reentry inhibiting pro-perties may mediate its neuroprotector effect.

Relación entre estrés oxidativo y ciclo celular en la etiología de la muerte neuronal en la enfermedad de Parkinson. Efectos de los antioxidantes

Oxidative stress and cell cycle in the ethiology of neuronal cell death in Parkinson disease.Antioxidant effects

Rodríguez Blanco J, Rodríguez Sánchez CRelación entre estrés oxidativo y ciclo celular en la etiologíade la muerte neuronal en la enfermedad de Parkinson. Efectosde los antioxidantesMAPFRE MEDICINA, 2006; 17: 47-61

Rodríguez Blanco J, Rodríguez Sánchez COxidative stress and cell cycle in the ethiology of neuronal celldeath in Parkinson disease. Antioxidant effects

MAPFRE MEDICINA, 2006; 17: 47-61

O

Correspondencia:

Carmen Rodríguez Sánchez. Departamento de Morfología y Biología Celular,Universidad de OviedoC/ Julián Clavería s/n33006 (OVIEDO)Correo electrónico: carro@uniovi.es

Fecha de recepción: 14 de abril de 2005

FINANCIACIÓN: Beca FUNDACIÓN MAPFREMEDICINA-Universidad de Oviedo. Ministeriode Ciencia y Tecnología (proyectoSAF2003-03303).

Palabras clave: Ciclo celular, enfermedad de Parkinson, es-trés oxidativo, melatonina.

Key words: Cell cycle, Parkinson´s disease, oxidative stress,melatonin.

Departamento de Morfología y Biología Celular.Facultad de Medicina. Universidad de Oviedo.

Rodríguez Blanco J.

Rodríguez Sánchez C.

INTRODUCCIÓN

La enfermedad de Parkinson (EP) es un tras-torno neurodegenerativo caracterizado principal-mente por una disfunción motora. Su sintomato-logía comprende temblores, rigidez, bradikinesiae inestabilidad postural. La patofisiología de laenfermedad de Parkinson incluye una pérdidaprogresiva de las neuronas dopaminérgicas ubi-cadas en la Sustancia Negra pars compacta,acompañada de la acumulación de inclusionesintracelulares denominadas cuerpos de Lewy. Suetiología es aún incierta, si bien se postula la po-sible implicación tanto de los radicales libres (1,2), como de alteraciones en el ciclo celular (3, 4).

Existen muchos modelos que imitan la muer-te selectiva de las neuronas dopaminérgicas quetiene lugar en esta enfermedad. Entre las neuro-toxinas más empleadas en estos modelos deparkinsonismo están tanto el 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridine (MPTP) que es captadopor los astrocitos y metabolizado por la Monoa-mino Oxidasa B (MAO-B) a su forma activa: 1-metil-4-fenilpiridinium (MPP+); como la 6-hidro-xidopamina (6-OHDA), derivado hidroxilado dela dopamina. Tanto el MPP+, como la 6-OHDA,son captados selectivamente por las neuronascatecolinérgicas a través del transportador dedopamina y una vez en el interior de la célula,dan lugar a la aparición de radicales libres. El in-cremento de las especies reactivas del oxígeno(EROs) es originado por una disfunción metabó-lica mediada por la inhibición irreversible delcomplejo I de la cadena de transporte de elec-trones mitocondrial (NADH-Coenzima Q oxido-rreductasa) que conduce a una caída en los ni-veles de ATP, pérdida del potencial mitocondrial,alteración de la homeostasis del Calcio y forma-ción de EROs, lo que trae como desenlace lamuerte celular (5,6).

El tipo de muerte que induce el estrés oxida-tivo generado por estas neurotoxinas, se corres-ponde en la mayoría de los casos con un mode-lo apoptótico. Así, en ensayos in vitro realizadosen cultivos neuronales, se propone la apoptosiscomo la vía que, en la mayoría de los casos, esseguida durante la desaparición de la poblacióndopaminérgica (7,8). Esto concuerda con investi-gaciones clínicas que confieren evidencias deque la muerte celular programada (PCD) es laresponsable de la perdida de la población neu-ronal propia de las enfermedades neurodegene-rativas (9,10).

En estudios previos de nuestro grupo se ob-servó un efecto protector de la melatonina sobrecélulas dopaminérgicas, concretamente sobre lalínea celular PC12, cuando éstas eran tratadascon una neurotoxina inductora de estrés oxidati-vo, la 6-OHDA (11, 12, 13). Este efecto protectorse atribuye a la reconocida capacidad antioxi-dante de la melatonina, ya sea gracias a su acti-vidad antioxidante directa, por medio de la de-puración de radicales libres, o a través de sucapacidad para estimular la síntesis de enzimasantioxidantes, como la glutation peroxidasa ylas superóxido dismutasa (11, 14).

Por otro lado, en este mismo diseño experi-mental, se observó que la melatonina es capazde inhibir la proliferación de esta línea celular in-diferenciada (13). En trabajos recientes se de-muestra que el estrés oxidativo es capaz de con-ducir a células postmitóticas a la reentrada en unciclo celular para el que no están preparadas, lle-vándolas así a una muerte celular programada(15, 16). Si esto fuera así en la enfermedad deParkinson y en los modelos experimentales quenos ocupan, podemos intuir que el efecto neu-roprotector que presenta la melatonina podríaser debido a que evita la entrada en este cicloabortivo. Se ha visto que ante situaciones de es-trés oxidativo las células postmitóticas sufrenuna alteración de las proteínas del ciclo, díganselas ciclinas, quinasas dependientes de ciclina(CDKs) y otras proteínas relacionadas como laproteína de retinoblastoma (pRb) (16, 17, 18).Puede que el efecto neuroprotector de la mela-tonina sea debido en parte a la regulación de ta-les proteínas. Esto es, la melatonina, posible-mente gracias a su efecto antioxidante, evitaríala entrada en un ciclo aberrante, regulando a labaja o impidiendo la estimulación de las proteí-nas que promueven el paso a través del ciclo, esdecir, estaría evitando su activación por parte delos radicales libres.

Con el fin de concretar si el efecto de la me-latonina es mediado gracias a que previene lareentrada en el ciclo descrita anteriormente, enel presente trabajo se emplearon dos tipos deneuronas dopaminérgicas, PC12 y UR61, pos-tmitóticas, esto es, diferenciadas. Hemos utiliza-do las dos neurotoxinas anteriormente men-cionadas, MPP+ y 6-OHDA, sobre células de feo-cromacitoma de rata PC12, diferenciadas pormedio de la adicción al medio, durante seis días,de Factor de Crecimiento Neuronal (NGF) (19).Así mismo también hemos realizado todos losexperimentos sobre una sublínea derivada de la

anterior, denominada UR61. Esta segunda líneadifiere de aquella en que es capaz de diferen-ciarse en presencia de Dexametasona, en el pla-zo de 48 horas, gracias a la inducción directa deRas. La expresión de este gen, involucrado en lacascada de diferenciación, es debida a la trans-fección previa de las células con una construc-ción que contiene el oncogen N-ras situado de-trás de un promotor inducible por el citadoglucocorticoide (20). En ambos casos nos en-contramos ante líneas celulares diferenciadas ypor tanto postmitóticas, capaces de sintetizardopamina y por tanto empleadas como mode-los experimentales de enfermedad de Parkin-son. Tal y como hemos comentado previamente,el MPP+ y la 6-OHDA son capaces de producirmuerte celular y degeneración de las neuronascatecolinérgicas tanto en cultivo como en mode-los animales. La eficacia de estas neurotoxinassobre cultivos celulares proporciona una herra-mienta muy valiosa para el estudio de los meca-nismos a través de los cuales median su toxici-dad, así como en la búsqueda de posiblesdrogas útiles en la prevención y tratamiento deldesorden neurodegenerativo con el que se lasrelaciona.

En primer lugar, en este trabajo pasamos aconfirmar el efecto neuroprotector de la melato-nina frente al daño producido por el MPP+ y la 6-OHDA en ambas líneas celulares diferenciadas.Seguidamente, con el fin de esclarecer las víaspor las que media su acción la melatonina, pa-samos a emplear, sobre el mismo modelo expe-rimental, otros antioxidantes y sustancias capa-ces de inducir paradas en diferentes fases delciclo celular, tratando así de mimetizar los efec-tos observados con la melatonina para poder di-lucidar qué vía o vías intervienen en su capaci-dad neuroprotectora.

MATERIAL Y MÉTODOS

Materiales

Los reactivos y drogas empleados fueron ad-quiridos a SIGMA (Sigma Aldrich, Spain) con laexcepción de los sueros y la tripsina que fueronproveídos por GIBCO Invitrogene Life Technolo-gies y el Factor de Crecimiento Neuronal (NGF)proveniente de ALOMONE. Las placas y frascosde cultivo se adquirieron a FALCON (Becton Dic-kinson BioScience, Le Pont de Claix, France).

Cultivos celulares

La línea celular de feocromacitoma de rata,PC12, procede del laboratorio del Dr. A. Cuadra-do. Las células se mantuvieron en medio Dul-becco´s modified Eagle´s medium alto en gluco-sa (DMEM-High Glucose), conteniendo 4.500mg/l D-Glucosa y L-Glutamina; suplementadocon un 8% de suero fetal bovino (FBS), 8% desuero de caballo (HS) y 1% de mezcla antibióti-ca-antimicótica (100 μg/ml de penicilina, 100μg/ml de estreptomicina y 25 μg/ml de anfoteri-cina). Las células se mantuvieron en un frascode cultivo T75, tratado previamente con coláge-no tipo-I. Tanto los frascos de cultivo como lasplacas fueron colagenizadas hasta llegar a unaconcentración de 10 μg/cm2. Las células se incu-baron a 37 º C en una atmósfera con un 5% deCO2; fueron subcultivadas una vez por semana,realizando una dilución de 1:10 aproximada-mente y el medio fue sustituido cada dos o tresdías por medio fresco.

Los experimentos se llevaron a cabo a partirdel subcultivo 5 y las células fueron sembradas auna densidad de 6.250 células/cm2. Se dejaron 24h en medio completo y tras este tiempo, el mediofue sustituido por medio con NGF 7S a 50 ng/mldiluido en DMEM-alto en Glucosa, suplementadocon un 1% de FBS y un 1% de HS. Las células sedejaron 6 días diferenciándose en este medio,sustituyéndolo por medio fresco cada 48 o 72h.

La línea celular UR61 es una sublínea deri-vada de la anterior que fue proporcionada por ellaboratorio del Dr. J. León. Se mantuvieron enmedio Dulbecco´s modified Eagle´s medium(DMEM) suplementado con un 10% de FBS, 1%de mezcla antibiótica-antimicótica, además de250 μg/ml de Geneticina (G418) que seleccionaaquellas células transfectadas correctamentecon la construcción. Las células se incubaron enlas mismas condiciones descritas para las PC12.

Las células se emplearon en los experimen-tos una vez hubieran alcanzado el subcultivo 5 yfueron sembradas en placas a una densidad de62.500 células/cm2. Permanecieron, al igual quelas PC12, en medio completo 24h y tras estetiempo el medio fue sustituido por medio frescoconteniendo 200 ng/ml de Dexametasona y sedejaron diferenciándose 48 h, el medio fue sus-tituido antes de llevar a cabo los distintos trata-mientos.

Tanto en el caso de las PC12 como de lasUR61, las células empleadas en los experimen-tos poseen neuritas de un tamaño que supera 2

veces su diámetro inicial, siendo consideradaspues diferenciadas (19).

Estudios de viabilidad celular

El ensayo MTT se basa en la reducción delbromuro de 3-[4,5-dimetil-2-thiazol-il] 2,5-difeniltetrazolio (MTT) en el interior de las mitocon-drias a formazán, el cual puede ser cuantificadoespectrofotométricamente a la longitud de ondade 570nm. La cantidad de formazan producidoes proporcional al número de células metabóli-camente activas presentes (21).

Las células se sembraron en placas de 96 po-cillos, donde se diferenciaron tal y como se ex-puso anteriormente. Una vez trascurrido el tiem-po de diferenciación propuesto para cada líneacelular, se procedió a llevar a cabo los trata-mientos con las diferentes drogas. Finalmentese añadió un 10% de una solución de MTT (5mg/ml en PBS) por pocillo, incubándose las cé-lulas 2 h a 37 º C, en oscuridad y en una atmós-fera al 5% CO2. A continuación se añadió un vo-lumen de solución de lisis (SDS: sodium dodecilsulfato 20% y dimetilformamida 50% pH 4,7). Lamezcla fue incubada toda la noche a 37 ºC y lasmuestras se midieron en un espectrofotómetrode placa μQuant (Bio-Tek Istruments, Inc., Wino-oski, VT, USA).

Análisis estadístico

Todos los experimentos fueron realizados almenos por triplicado. Las gráficas muestran losresultados de un experimento representativo.Las barras de error representan el error mediostandard de 7 réplicas por grupo experimental.Los datos se analizaron por medio de un ANOVAseguido de un test de Student-Newman-Keulsempleando el programa estadístico SigmaStat2.0 (Sigma). La representación gráfica de los da-tos se llevó a cabo con el programa Sigmaplot7.101 (Sigma).

RESULTADOS

La melatonina protege a las células

dopaminérgicas diferenciadas frente a

la muerte inducida por MPP+

Con el fin de seleccionar la dosis de neuroto-xina adecuada para estudios posteriores, se rea-

lizaron estudios de citotoxicidad inducida por laneurotoxina MPP+ sobre células UR61, diferen-ciadas 48 h en presencia de Dexametasona 200ng/ml (FIG. 1.A) y sobre las PC12 diferenciadas 6días en presencia de NGF 7S 50 ng/ml al 1% desueros (FIG. 1.C), llevando a cabo una curva do-sis-respuesta. Para ello se determinó la viabili-dad celular incubando la neurotoxina 24h y mi-diendo la reducción del MTT a formazán. Seseleccionó aquella concentración para la que lacaída de la viabilidad oscilaba entre el 20-40%siendo esta de 250 μM en UR61 (FIG.2.A) y 300μM para el caso de las PC12 (FIG.3.A).

A continuación, empleando las concentracio-nes seleccionadas, se estudio el efecto neuro-protector de la melatonina en ambas líneas ce-lulares. Las células se preincubaron durante 4 y24 h con la neurohormona a concentracionesdesde 1 nM a 1 mM. Sin retirar la melatonina delmedio, se añadió la neurotoxina y las células seincubaron 24 h más. Tras este tiempo se analizóla viabilidad midiendo la reducción de MTT. Aun-que no se apreciaron diferencias significativas

Figura 1. Micrografía de contraste de fases de células dela línea UR61 diferenciadas 48h con 200 ng/ml de Dexa-metasona en medio completo (A, B) y de las células PC12diferenciadas durante 6 días con 50ng/ml NGF (C).

entre las diferentes concentraciones de neuro-hormona empleadas y el grupo control (datosno presentados), la representación de los resul-tados y el análisis estadístico de los mismos sellevó a cabo dándole un 100% de viabilidad a losgrupos tanto control, como con Melatonina, pe-ro sin neurotoxina.

El efecto neuroprotector de la melatoninafrente a la toxicidad inducida por MPP+, apenasvaría entre ambas líneas celulares. Los resulta-dos se muestran en las figuras 2 (células UR61)y 3 (células PC12). Tampoco se aprecia alteraciónde su efecto en función del tiempo de preincu-bación aplicado (4 h, FIGs 2.B y 3.B o 24 h, FIGs2.C y 3.C). Respecto a las diferencias que seaprecian en la efectividad de unas dosis y otrasestas no son significativas. El efecto neuropro-tector de la melatonina sobre la citotoxicidadinducida por MPP+ oscila entorno al 10-20%;exceptuando el caso de la melatonina 1nMpreincubada 24 h para el que no se aprecian di-ferencias significativas respecto al grupo sin me-latonina en ninguna de las dos líneas celulares.Así mismo, cuando se preincubó la melatonina4h en células UR61, ni la concentración 1 mM nila 10 μM ejercieron neuroprotección.

La melatonina protege a las células

dopaminérgicas diferenciadas frente a

la muerte inducida por 6-OHDA

Al igual que para el caso del MPP+ antes ex-puesto, se realizó un estudio de viabilidad tras eltratamiento durante 24 h con diferentes concen-traciones de 6-OHDA en ambas líneas celulares.

Se seleccionó, para estudios posteriores, aquellaconcentración de 6-OHDA que inducía una caídaen la viabilidad que rondaba el 40%; siendo éstade 400 μM para la línea celular UR61 (FIG. 4.A) yde 100 μM para las células PC12 (FIG. 5.A). Seutilizaron células diferenciadas, al igual que en elcaso anterior.

Seguidamente se preincubaron las célulascon melatonina 4 y 24 h; a continuación se trata-ron, sin retirar la melatonina, con la concentra-ción seleccionada en cada caso de 6-OHDA. Seanalizó la viabilidad celular por medio de lacuantificación espectrofotométrica de la reduc-ción de MTT y al igual que para el caso del MPP+,tanto los resultados obtenidos, como el análisisestadístico de los mismos, se llevo a cabo dán-doles un 100% de viabilidad a los grupos controly con melatonina, pero sin neurotoxina.

Observamos neuroprotección con todas lasconcentraciones de melatonina probadas, enambas líneas celulares (FIG. 4 para UR61 y FIG.5 para PC12). Al igual que en el caso de MPP+ di-cha neuroprotección ronda entre el 10 y el 20%,y fue significativa con respecto al grupo con só-lo la neurotoxina con todas las concentracionesde melatonina empleadas, tanto tras 4 h (FIG.4.B y FIG. 5.B), como tras 24 h (FIG. 4.C y FIG.5.C) de preincubación.

Otros antioxidantes también presentan efecto

neuroprotector en células dopaminérgicas

diferenciadas

Dado que la vía por la que inducen muertecelular el MPP+ y la 6-OHDA incluye la genera-

Figura 2. Medida de la viabilidad de células UR61 tratadas con MPP+ determinada mediante la reducción de MTT. Las cé-lulas fueron tratadas durante 24 h con diferentes concentraciones de la toxina (A) * p<0.05 vs. CON. Efecto neuroprotectorde diferentes concentraciones de melatonina preincubadas 4 h (B) y 24 h (C) frente al daño inducido por 250 μM de MPP+24 h. # p<0.05 vs. grupo sin aditivos, * p<0.05 vs. grupo tratado sólo con la neurotoxina.

% R

ED

UC

CIO

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TT

w/o

MPP+

# * *B

0102030405060708090

100110120130

[ MELATONINA ]

0 1nM 100nM 10μM 1mM

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ED

UC

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20

40

60

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100

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140

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MPP+C

#** *

[ MELATONINA ]

0 1nM 100nM 10μM 1mM

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0 250 500 750 10001500

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ED

UC

CIO

N D

E M

TT

vs

CO

N

**

*

A

*

50

60

70

80

90

100

110

[μM MPP+]

ción de radicales libres, llevamos a cabo unapreincubación de 24 h con varios antioxidantescon el fin de comprobar que el efecto antioxi-dante de la melatonina puede ser realmente res-ponsable de su capacidad neuroprotectora. Losantioxidantes utilizados fueron la vitamina-C(200 μM), el estradiol (10 μM) y trolox (100 μM).

El ácido ascórbico o vitamina-C protegió aambos tipos de neuronas dopaminérgicas, entreun 10-20% frente al daño oxidativo ejercido porambas neurotoxinas (FIG. 6). El estradiol y el tro-lox sólo mostraron algún efecto sobre la líneaUR61; concretamente el estradiol resultó efecti-vo previniendo en casi un 10% la muerte induci-da por 6-OHDA (FIG. 6.C) y el trolox, por su par-te, previno en el mismo porcentaje aquellainducida por MPP+ (FIG. 6.A)

Los inhibidores del ciclo celular protegen a

las células dopaminérgicas frente al daño

inducido por neurotoxinas

Con el fin de esclarecer si en nuestro modeloexperimental de enfermedad de Parkinson, (enel que empleamos células dopaminérgicas pos-tmitóticas) la hipótesis de la reentrada en el ciclocelular forzada por estrés oxidativo es válida, serealizaron estudios de viabilidad tratando a estascélulas con las neurotoxinas, previa incubacióncon diferentes inhibidores del ciclo celular. Losinhibidores del ciclo y por tanto de la prolifera-ción celular impiden el paso de una fase a otradel ciclo o el progreso a través de las mismas,dando lugar a una parada en aquella a la queafectan o en la inmediatamente anterior a ella.

Figura 3. Medida de la viabilidad de células PC12 tratadas con MPP+ determinada mediante la reducción de MTT. Las célu-las fueron tratadas durante 24 h con diferentes concentraciones de la toxina (A) * p<0.05 vs. CON. Efecto neuroprotector dediferentes concentraciones de melatonina preincubadas 4 h (B) y 24 h (C) frente al daño inducido por 300 μM de MPP+ 24h. # p<0.05 vs. grupo sin aditivos, * p<0.05 vs. grupo tratado sólo con la neurotoxina.

0 100 200 300 500 700 1000

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# ** *

C

0102030405060708090

100110120130

MPP+

Figura 4. Medida de la viabilidad de células UR61 tratadas con 6-OHDA determinada mediante la reducción de MTT. Las cé-lulas fueron tratadas durante 24 h con diferentes concentraciones de la toxina (A) * p<0.05 vs. CON. Efecto neuroprotectorde diferentes concentraciones de melatonina preincubadas 4 h (B) y 24 h (C) frente al daño inducido por 400 μM de 6-OH-DA 24 h. # p<0.05 vs. grupo sin aditivos, * p<0.05 vs. grupo tratado sólo con la neurotoxina.

[ μM 6-OHDA]

0 100 200 300 400 500

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UC

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*

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0102030405060708090

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0102030405060708090

100110120130

[ MELATONINA ]

0 1nM 100nM 10μM 1mM

#

* * **

Se emplearon los siguientes inhibidores del ci-clo celular y a aquellas concentraciones descri-tas en PC12 indiferenciadas como con efecto an-tiproliferativo: CTP-AMPc 100 μM, el cual poseela capacidad de inhibir las fases S y G2/M del ci-clo celular; la olomoucina 200 μM, que inhibe lasCDKs 1, 2, 5, 7 y 9, inhibiendo por tanto el pasoa través de todas las fases del ciclo celular; la mi-mosina 400μM, que impide la síntesis de nucle-ótidos trifosfato, inhibiendo el paso a través dela fase S; la afidicolina 10 μM, que inhibe la ADN-polimerasa-α, y por tanto también la fase S; ypor último también empleamos la colchicina 150μM, siendo éste un inhibidor de la formación delhuso mitótico y por tanto capaz de parar las cé-lulas en fase M; si bien esté sólo lo pudimos em-plear sobre la línea UR61, ya que su efecto sobrelas PC12 resultó muy llamativo, reduciendo elnúmero de células viables en un 90%.

Antes de comprobar si los inhibidores del ci-clo celular mostraban algún efecto neuroprotec-tor sobre la muerte inducida por MPP+ y 6-OH-DA, examinamos si mostraban algún efectodirecto sobre las células de ambas líneas (FIG.7). Salvo con la excepción de la colchicina sobrePC12, en todos los casos observamos que exis-tía una pequeña disminución de la reducción deMTT, de entre un 10 y un 20%, probablementedebida en parte a su posible toxicidad sobre elcultivo y a la inhibición del crecimiento celularque ejercen, ya que pese a ser células diferen-ciadas, y por tanto postmitóticas, muestran unaresidual fase de síntesis de entorno al 2% (22). Lalínea celular PC12 se veía seriamente afectadapor la colchicina, a las dosis probadas para ésta,

que iban desde 50 μM hasta 150 μM (datos nomostrados).

En las representaciones gráficas se concedeun 100% de viabilidad al grupo con inhibidor delciclo celular pero sin neurotoxina, para que elefecto directo de aquellos sobre el número decélulas no enmascare sus posibles cualidadesneuroprotectoras.

La olomoucina resultó neuroprotectora paraambas líneas celulares y sendas neurotoxinas(FIGs. 8.A-D). Sobre la línea UR61 (FIGs. 8.A y C),ni el AMPc, ni la afidicolina presentaron efectoneuroprotector, mientras que la colchicina prote-gió eficazmente frente a la muerte inducida porambas neurotoxinas (FIGs. 8.A y C). Finalmente,sobre esta línea celular la mimosina sólo mostrócualidades neuroprotectoras frente al daño in-ducido por 6-OHDA (FIG. 8.C). En el caso de la lí-nea PC12 (FIGs. 8.B y D), todos los inhibidoresdel ciclo probados se mostraron efectivos frenteal daño inducido por ambas toxinas caticolinér-gicas, a excepción de la mimosina que no mos-tró tal efecto frente al daño inducido por MPP+

(FIG. 8.B).

DISCUSIÓN

En este trabajo se ha descrito la capacidadque posee la melatonina para prevenir la muer-te inducida por las neurotoxinas MPP+ y 6-OHDAen células dopaminérgicas diferenciadas. Asímismo se ha comprobado que ciertos antioxi-dantes e inhibidores de la proliferación celularposeen cualidades neuroprotectoras similares.

Figura 5. Medida de la viabilidad de células PC12 tratadas con 6-OHDA determinada mediante la reducción de MTT. Las cé-lulas fueron tratadas durante 24h con diferentes concentraciones de la toxina (A) * p<0.05 vs CON. Efecto neuroprotectorde diferentes concentraciones de melatonina preincubadas 4h (B) y 24h (C) frente al daño inducido por 100μM de 6-OHDA24h. # p<0.05 vs. grupo sin aditivos, * p<0.05 vs. grupo tratado sólo con la neurotoxina.

[μM 6-OHDA]

0 25 50 100 200 300

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[ MELATONINA ]

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Las neurotoxinas MPP+ y 6-OHDA administra-das a células dopaminérgicas indiferenciadasconstituyen el modelo más habitual de parkinso-nismo en cultivos celulares, siendo igualmenteútiles en modelos animales. En trabajos previosde este grupo se demostró el efecto neuropro-tector de la melatonina sobre la apoptosis indu-cida por el derivado hidroxilado de la dopamina,6-OHDA en células dopaminérgicas indiferen-ciadas y diferenciadas, si bien, sobre células postmitóticas apenas figuran resultados en la bi-bliografía (11, 12). Dado que las enfermedadesneurodegenerativas tienen lugar sobre neuronasdiferenciadas, y que los trabajos en los que sedescribe el efecto neuroprotector de la melatoni-na, y en general de otros neuroprotectores, sobre

estas células postmitóticas son más bien esca-sos, el primer objetivo del presente trabajo fueverificar las cualidades neuroprotectoras de estaneurohormona frente a dos agentes inductoresde estrés oxidativo, como son el MPP+ y la 6-OH-DA, en dos tipos de células postmitóticas.

Las neurotoxinas empleadas en este trabajohan sido descritas previamente como capacesde inducir apoptosis en células dopaminérgi-cas. La 6-OHDA induce apoptosis a bajas dosisen células PC12 tanto diferenciadas, como indi-ferenciadas. Así trabajos previos de este grupomostraban fragmentación del ADN a concentra-ciones de 6-OHDA de entre 50 y 100 μM (11).

Los trabajos llevados a cabo con anterioridaden nuestro grupo empleando MPP+ sobre célu-

Figura 6. Efecto de diversos antioxidantes sobre la reducción de viabilidad inducida por el trata-miento con MPP+ y 6-OHDA. Medida de la reducción de MTT en células UR61 tras una preincuba-ción de 24h con los antioxidantes, seguida de un tratamiento de 24 h con 250 μM de MPP+ (A). Efec-to de la preincubación durante 24 h con los antioxidantes sobre la muerte inducida por 300 μM 24 hde MPP+ en células PC12 (B). Medida de este mismo efecto sobre UR61 tratadas con 400 μM 24 h de6-OHDA (C). Medida de este efecto sobre PC12 tratadas 24 h 100 μM de 6-OHDA. # p<0.05 vs. gruposin aditivos, * p<0.05 vs. grupo tratado sólo con la neurotoxina.

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las PC12, se limitaron a su efecto sobre célulasindiferenciadas y mostraban un descenso en laviabilidad de un 5-10% a las concentraciones uti-lizadas en este trabajo, no estando acompañadaesta caída por fragmentación del DNA, por tantode apoptosis tardía (datos no publicados). En elpresente trabajo, usando células diferenciadas, alas mismas concentraciones de MPP+, vemosuna caída en la viabilidad celular de entre el 20 yel 40%. El diferente efecto que muestra esta neu-rotoxina según se trate de células diferenciadaso indiferenciadas, se puede explicar por su in-fluencia sobre el mecanismo de autorregulaciónde la síntesis de tubulina. Así, se demostró queel tratamiento con concentraciones de MPP+

dentro del rango μM inducía un incremento enla expresión de α-tubulina y un descenso en losde β-tubulina. Se propone que el efecto sobre losmicrotúbulos puede estar relacionado con la in-hibición de la cadena de transporte mitocondrialo la alteración de la homeostasis del calcio queproduce el MPP+, lo cual desencadenaría cam-bios en la organización del citoesqueleto que se-rían los responsables de la ruptura de las neuri-tas y con ello de la muerte celular observada encélulas diferenciadas, pero no así en indiferen-ciadas (23, 24). Concentraciones de MPP+ porencima de la empleada en nuestro caso (250μmen células UR61 y 300 μM para células PC12) encélulas dopaminérgicas diferenciadas han sidodescritas con anterioridad como inductoras deapoptosis (25, 26).

Actualmente se están llevando a cabo medi-ciones de presencia del fosfolípido fosfatidil-se-rina en la membrana celular externa (marcadorpara apoptosis temprana), actividad caspasa-3(efector final de la apoptosis) y de fragmentaciónde ADN (marcador de apoptosis tardía), con elfin de corroborar que el descenso de viabilidadobservado a las dosis empleadas en este traba-jo, tanto de la 6-OHDA, como del MPP+ para lasdos líneas celulares se debe a la inducción deapoptosis. Nuestros resultados preliminaresmuestran un incremento de la actividad caspa-sa-3 tanto en UR61, como en PC12 diferencia-das, tras su tratamiento 24 h con 6-OHDA 400μM y 100 μM respectivamente; lo que nos hacepensar que estas neurotoxinas podrían estar in-duciendo apoptosis en nuestro modelo. Estoviene a confirmar la validez del diseño experi-mental propuesto sobre células diferenciadas,en lugar de indiferenciadas; el cual se aproxima-ría más a lo que sucede in vivo durante el des-arrollo de una enfermedad neurodegenerativa.

La preincubación de la melatonina 4 y 24 hresultó efectiva previniendo el daño inducidopor las neurotoxinas empleadas a prácticamen-te todas las concentraciones probadas, yendoéstas desde 1 nM hasta 1 mM. La protección secifró en todos los casos en torno a valores del 10-20%. Cabe mencionar que los efectos observa-dos con la 6-OHDA, resultaron mucho más regu-lares que para el caso del MPP+, para el cual laconcentración más baja empleada de melatoni-

Figura 7. Efecto de diversos inhibidores del ciclo celular sobre la viabilidad de las líneas celulares UR61 (A) y PC12(B). * p<0.05 vs. control.

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na, 1nM, preincubada 24 h resultó ineficaz en laprevención del daño tanto en células UR61, co-mo en PC12. Del mismo modo, la preincubaciónde células UR61 durante 4 h con melatonina, nofue capaz de prevenir este daño a concentracio-nes por encima de 100 nM. Las diferencias quese observan en la eficacia de la melatonina fren-te al daño inducido por MPP+, pueden ser expli-cadas por el efecto irregular que muestra la neu-rotoxina sobre las células, pudiendo afectar aéstas en mayor o menor medida debido a laexistencia de factores exógenos al experimento

y difíciles de controlar, como es el tiempo em-pleado en la preparación de la droga. Mínimasdiferencias en este tiempo generan variacionesimportantes en la efectividad de la toxina.

El mecanismo por el que ambas neurotoxi-nas provocan una caída en la viabilidad celulardifiere levemente en la vía, si bien, ambas com-parten la generación de especies reactivas deloxígeno como el efector final del daño (26). Elestrés oxidativo y daño derivado de éste, se hademostrado que están implicados en un grannúmero de enfermedades, entre ellas ateroes-

Figura 8. Efecto de diversos inhibidores del ciclo celular sobre la reducción de viabilidad inducida porel tratamiento con MPP+ y 6-OHDA. Medida de la reducción de MTT en células UR61 tras una prein-cubación de 24h con los inhibidores del ciclo, seguida de un tratamiento de 24 h con 250 μM de MPP+(A). Efecto de la preincubación de 24 h con los inhibidores del ciclo sobre la muerte inducida por 300μM 24 h de MPP+ en PC12 (B). Medida de este mismo efecto sobre UR61 tratadas con 400 μM 24 hde 6-OHDA (C). Medida de este efecto sobre PC12 tratadas 24 h 100 μM de 6-OHDA. # p<0.05 vs. gru-po sin aditivos, * p<0.05 vs. grupo tratado sólo con la neurotoxina.

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clerosis, enfermedades autoinmunes, cáncer yenfermedades neurodegenerativas, incluida laenfermedad de Parkinson (1, 2, 9). Las especiesreactivas del oxígeno tienen la capacidad de da-ñar las células rompiendo la bicapa lipídica delas membranas celulares, dañando el ADN y lasproteínas, dando así lugar a, entre otros efectos,la generación de grupos carbonilo, formación ni-trotirosina y bloqueo de la cadena respiratoriamitocondrial (27).

La melatonina ha sido descrita como un im-portante antioxidante endógeno (28), así comoun inhibidor directo de la proliferación celular enciertos tipos tumorales (29, 30, 31), entre ellos desistema nervioso central, véase su efecto oncos-tático sobre células de neuroblastoma humano(32). Con el fin de esclarecer si el efecto antioxi-dante de la melatonina puede estar implicado ensu capacidad neuroprotectora sobre células pos-tmitóticas tratadas con toxinas inductoras de es-trés oxidativo, se emplearon antioxidantes co-munes, como la vitamina-C, el estradiol y eltrolox, a las dosis descritas con anterioridad (11).Se vio que tan sólo la vitamina-C resultó efectivafrente al daño inducido por ambas neurotoxinasy en ambas líneas celulares, mientras el estra-diol y el trolox fueron efectivos en UR61 tratadascon 6-OHDA y MPP+ respectivamente. El efectoirregular que mostraron los antioxidantes podríadeberse a su distinto mecanismo de acción,siendo capaz la vitamina-C, tras atravesar lamembrana celular, de depurar radicales libresen el citoplasma; mientras que el estradiol y eltrolox, sólo poseen efectividad sobre la oxida-ción en las membranas celulares; y por esta ra-zón sólo se muestran efectivos en aquellos mo-delos en los que las membranas celulares estánafectadas. Los datos obtenidos de este experi-mento indican que, efectivamente, la capacidadantioxidante de una molécula es capaz de pre-venir la muerte celular inducida por las neuroto-xinas aquí estudiadas; confirmando que las pro-piedades antioxidantes de la melatonina puedenser las responsables del efecto neuroprotectorobservado sobre células postmitóticas.

El ciclo celular es un proceso finamente re-gulado. La regulación del avance a través del ci-clo es llevada a cabo, en parte, por complejosproteicos que constan de una subunidad catalíti-ca, denominada quinasa dependiente de ciclina(CDK), para cuya activación precisa la unión desu correspondiente subunidad reguladora o ci-clina. Se han descrito un gran número de com-plejos ciclina-CDK que actúan en diversos pun-

tos del ciclo celular permitiendo así la progre-sión de las células a lo largo del mismo (33).Aunque son muchas las posibles rutas relacio-nadas con la muerte neuronal que tiene lugardurante el desarrollo de una patología neurode-generativa, existen recientes evidencias que su-gieren la implicación de una desregulación en elcontrol del ciclo celular (15, 34, 35). Trabajos in vi-vo (36-38) e in vitro (39-45) muestran que ciertasCDKs están reguladas a la alza durante la muer-te neuronal que acompaña a las enfermedadesneurodegenerativas. En respuesta a este incre-mento en la expresión o en la actividad enzimá-tica de las CDKs y proteínas relacionadas, lasneuronas, células diferenciadas y por tanto pos-tmitóticas, mueren en lugar de progresar a tra-vés de las fases de un ciclo celular descoordina-do y en consecuencia fatal. Así pues, por mediode la inhibición de estas proteínas del ciclo sepodría proteger a las neuronas de la muerte ce-lular programada que acompaña a los procesosneurodegenerativos. Por otra parte, el estrésoxidativo ha sido descrito como capaz de provo-car esta regulación a la alza de las proteínas delciclo y por tanto, como el posible responsable deesta reentrada en el ciclo celular (15, 35).

Dado, 1] que cada vez son más las publica-ciones en las que se apoya la posible implicaciónde las proteínas reguladoras del ciclo celular enla inducción de apoptosis mediada por estrésoxidativo (18, 46, 47); y 2] los resultados de estegrupo en los que se demostraba que la melato-nina no sólo posee un efecto antioxidante sobrelas células PC12 tratadas con 6-OHDA (11), si noque además, en células indiferenciadas es capazde inhibir la proliferación celular (13); pasamos averificar si las propiedades antiproliferativas dela melatonina podrían estar implicadas en suefecto neuroprotector. Como aproximación paraestudiar el posible mecanismo de acción de lamelatonina, se emplearon diversos inhibidoresdel ciclo celular a aquellas dosis que fueron des-critas en trabajos anteriores como capaces de in-hibir la proliferación celular en PC12 indiferen-ciadas, véase resumen en FIG. 9.

La olomoucina es el único inhibidor del ciclocelular que es capaz de proteger ambas líneascelulares diferenciadas de la muerte inducidapor una y otra neurotoxina. Se trata de un inhi-bidor de las CDKs 1, 2, 5, y en menor medida deCDK-7 y CDK-9 (48). La CDK-1 se une a la ciclina-A y ciclina-B, regulando el paso de la profase ala metafase en la mitosis (fase M), la actividad dela topoisomerasa-2 (fase S) y el paso a través de

la fase G2. La CDK-2 se une a la ciclina-E y cicli-na-A, y regula el paso de G-1 a S y de S a G-2. LaCDK-5 se expresa principalmente en neuronas ysobretodo tras finalizar la mitosis. Esta CDK noprecisa su unión a una ciclina, si no que es acti-vada por proteínas específicas del cerebro, p35 yp39 y sus respectivos productos de degradaciónproteolítica p25 y 29. Estos complejos activadosse relacionan con la promoción de neuritas, lamigración neuronal, y las vías de señalización delos receptores metabotrópicos de glutamato ydopamina. Recientemente se han publicado tra-bajos in vivo en los que se demuestra que la ad-ministración de las neurotoxinas empleadas eneste trabajo: 6-OHDA y MPTP, precursor delMPP+, inducen un incremento en la expresióndel complejo CDK5/p25 (49, 50), pudiendo ser laexpresión constitutiva a la alza de este complejola responsable de la degeneración de la sustan-cia negra en los modelos de parkinsonismo em-pleados en estos trabajos.

El CTP-AMPc es un análogo soluble del AMP-cíclico, que posee un efecto inhibidor sobre laCDK-1 y por tanto interviene en la modulaciónde las fases S y G2/M (51). Vemos que sólo re-sulta efectivo en la protección de las célulasPC12, lo que indicaría que éstas progresan en elciclo celular por lo menos hasta la fase S; y ade-más que en ésta línea entre las ciclinas activadaspor efecto del MPP+ y la 6-OHDA, además de laCDK-5, estaría la CDK-1. Sin embargo, no suce-dería así en la línea celular UR61 para la cual noapreciamos neuroprotección mediada por la in-

hibición de la CDK-1, lo que hace pensar que es-tas células pueden estar entrando en apoptosisantes de llegar a la activación de la CDK-1 en lafase S.

La afidicolina es un inhibidor de la ADN poli-merasa-α, por lo que induce una parada del cicloen fase S (52). Ésta, al igual que lo que ocurríacon el CTP-AMPc, sólo posee efecto neuropro-tector sobre células PC12, confirmando que pro-bablemente la inducción de apoptosis en las cé-lulas UR61 se produzca antes del comienzo de lareplicación del ADN en la fase S.

La mimosina es un aminoácido vegetal que-lante de hierro y cobre, capaz de inhibir rever-siblemente a la metalo-enzima deoxihipusil hi-droxilasa, interrumpiendo la formación de lahipusina relacionada con el paso de G-1 a S delciclo celular (53). Este inhibidor del ciclo celularsólo mostró efecto neuroprotector frente al dañoinducido por 6-OHDA en ambas líneas celulares.Lo que deja entrever que a partir de la entrada enfase S la ruta que sigue una y otra neurotoxinadiverge, pudiendo desencadenarse la muerteapoptótica antes de la entrada en fase S con elMPP+.

Finalmente un inhibidor de la síntesis de mi-crotúbulos y por lo tanto de la formación del hu-so acromático durante la mitosis, como es la col-chicina (54), resulto útil en la prevención de lamuerte inducida por estrés oxidativo en célulasUR61, si bien su empleo sobre PC12 fue impo-sible ya que reducía de manera drástica el nú-mero de células. Esta neuroprotección no con-cuerda con lo anteriormente postulado, ya quesignificaría que la inducción de apoptosis se es-taría produciendo en UR61 una vez las células yahan entrado en fase M, por lo que carecería desentido que en esta línea celular no fuesen útileslo inductores de parada en fase S (caso de la afi-dicolina). Si bien, podría ser que el efecto neuro-protector observado por la colchicina sobre la lí-nea celular UR61 fuese mediado por un efectodirecto sobre las proteínas del citoesqueleto, evi-tando, de alguna manera, el daño que sobre és-tas generan las especies reactivas del oxígeno(55).

Gracias a la neuroprotección observada conlos diferentes inhibidores del ciclo se deduceque el efecto antiproliferativo de la melatonina,mediado posiblemente gracias a su capacidadantioxidante, podría intervenir en la neuropro-tección; ya que la mayoría de los inhibidores delciclo celular mimetizan los efectos de la neuro-hormona. Además trabajos recientes (49, 50, 56),

Figura 9. Representación esquemática de las posibles ví-as de actuación de los inhibidores del ciclo celular olo-moucina, AMPc, afidicolina y mimosina, sobre neuronaspostmitóticas que han sufrido una reentrada en el ciclocelular mediada por estrés oxidativo.

indican que la CDK-5 unida a la proteína p25,fragmento proteolítico de p35, podría estar im-plicada en la reentrada en el ciclo celular media-da por el estrés oxidativo generado por las neu-rotoxinas catecolinérgicas MPP+ y 6-OHDA. Elestrés oxidativo puede ser el responsable de ladigestión del extremo N– terminal de la proteínaactivadora de CDK-5, p35, por parte de una pro-teasa de la familia de las calpainas, dando lugara p25 el cual es responsable de la activaciónconstitutiva de CDK-5 (FIG. 10). La sobreactiva-ción de este complejo daría lugar a cambios enel citoesqueleto que desencadenarían la activa-ción de p53, Bax y finalmente de las caspasas,siendo estos los efectores finales de la apoptosis(47, 56). Los resultados expuestos hasta ahorapueden encajar en esta ruta apoptótica, si bien,se hace necesario precisar la implicación delcomplejo CDK-5/p25, así como de las posiblesmoléculas que estarían por debajo de éste en laruta apoptótica, como podrían ser Bax, p53 ocaspasa-3.

En este trabajo se ha confirmado el efectoneuroprotector de la melatonina sobre la muer-te inducida por estrés oxidativo en 4 modelos di-ferentes de parkinsonismo en los que se emple-aron células postmitóticas. Así mismo, se hademostrado que tanto su capacidad antioxidan-

te, como la antiproliferativa podrían interveniren la neuroprotección; pudiendo ser la capaci-dad antiproliferativa una consecuencia de suefecto antioxidante (57).

Nuestros actuales esfuerzos se centran enconfirmar definitivamente que la reentrada en elciclo celular es la responsable de la inducción deapoptosis en estos modelos, empleando paraello marcadores del ciclo celular como la bromo-deoxiuridina (BrdU) y el PCNA (del ingles: proli-ferating cell nuclear antigen). Resultados preli-minares y pendientes de confirmación llevadosa cabo sobre células PC12 diferenciadas mues-tran un incremento significativo de la incorpora-ción de BrdU en presencia de 6-OHDA, lo queimplicaría un aumento de la síntesis de ADN, es-to es, de la fase S del ciclo celular. Una vez quese verifiquen estos resultados, habría que escla-recer la vía apoptótica, buscando aquellas CDKs,ciclinas y proteínas relacionadas con el ciclo ce-lular que pudieran estar siendo activadas. Final-mente, se tratará de ver si el estrés oxidativo esel responsable de la reentrada en el ciclo celularde las células postmitóticas. Para ello, se llevaráa cabo el marcaje inmunohistoquímico de pro-teínas relacionadas con el estrés oxidativo, juntocon de aquellas del ciclo celular que pudieranencontrarse desreguladas. Del mismo modo seestudiará el efecto de la melatonina sobre estasproteínas.

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Figura 10. Modelo de la posible cascada apoptótica in-ducida por estrés oxidativo con la implicación del com-plejo CDK-5/p25 como impulsor de la reentrada en el ciclo celular. Este esquema muestra cómo el estrés oxi-dativo inducido por las neurotoxinas MPP+ y 6-OHDA se-ría capaz de provocar la digestión del extremo N-terminalde la proteína activadora de CDK5, p35, por parte de pro-teasas del tipo calpaina. La acumulación del complejoCDK-5/p25 en las neuronas daría lugar a la fosforilaciónanormal de proteínas del citoesqueleto, degeneraciónmorfológica de las neuronas y el disparo de una cascadaapoptótica.

p35

p10

Calpaina

p25

Daño al citoesqueleto

p53 BAX Citocromo-C

Caspasa-9Procaspasa-9

Caspasa-3Apoptosis

MitocondriaCDK-5

EROs

MPP+

6-OHDA

Procaspasa-3

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