Siembras y Cultivos Bacterianos

DANNY ARMANDO PISCIOTTI ORTEGA 1

Microbiólogo con énfasis en alimentos

2012

INTRODUCCIÓN Un método fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio de cultivo ya sea líquido o

en la superficie de un medio sólido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van,

desde azúcares simples hasta sustancias complejas que se adicionan para satisfacer las necesidades de

algunos grupos microbianos.

Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de

bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican no cambian de

localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisión binaria una

estructura macroscópica fácilmente visible denominada “colonia” compuesta por decenas de millones de

células similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecerá como

cultivo puro de un solo tipo de bacteria.

Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente que es imposible diferenciarlas sólo con

el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus características

bioquímicas sembrándolas en medios de cultivo especiales. Así, algunos medios contienen un producto que

inhibe el crecimiento de la mayoría de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que deseamos

averiguar si está presente. Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azúcares especiales que

sólo pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios se añaden indicadores de pH que cambian de

color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos ácidos. Si las

bacterias son capaces de producir fermentación, generan gases que pueden ser apreciados cuando el

cultivo se realiza en un tubo cerrado.

Con otros medios de cultivo se identifica si las bacterias producen determinadas enzimas que digieren los

nutrientes: así, algunas bacterias con enzimas hemolíticas (capaces de romper los glóbulos rojos) producen

hemólisis y cambios apreciables macroscópicamente en las placas de agar-sangre. Los diferentes medios y

técnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de microbiología de un hospital, pues sirven para

identificar las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas y los antibióticos a los que son sensibles

esas bacterias.

MEDIOS DE CULTIVO. El tipo de medio que utiliza un microbiólogo depende del microorganismo que está cultivando y el porqué

de dicho cultivo. Los microorganismos presentan una enorme variedad de requerimientos nutricionales. Se

utiliza un medio mínimo para determinar los requerimientos nutricionales de un organismo y un medio rico

si se desea obtener masa celular de una forma rápida. Los medios se pueden formular para el desarrollo de

una especie o para distinguir entre especies o cepas. Por tanto, los medios se clasifican en definidos,

complejos o indefinidos, selectivos, diferenciales, selectivos-diferenciales y de enriquecimiento,

dependiendo de su composición y uso.

Medios definidos

Un medio definido es aquel en el cual se conoce composición química exacta, porque ha sido preparado a

partir de compuestos químicos puros. Es fácilmente reproducible y cada uno de sus componentes cumple

una función nutricional específica.

Existen grupos bacterianos que pueden crecer en medios con composiciones simples basadas en una

fuente de carbono orgánico (glucosa) y pueden obtener el resto de los nutrientes esenciales a partir de

PRACTICA 5 SIEMBRAS Y CULTIVOS BACTERIANOS.

CITOLOGIA MICROBIANA

UNIVERSIDAD DE PAMPLONA

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA



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sales minerales. En cambio, otros organismos, denominados exigentes, requieren medios químicamente

complejos ya que requiere un medio con muchos ingredientes.

Los medios definidos se usan generalmente para realizar estudios genéticos, pero sus inconvenientes a

menudo sobre pasan sus ventajas. Así, se requiere un tiempo considerable para preparar un medio definido

y las bacterias crecen más despacio en ellos. Además, no conocemos los requerimientos nutricionales de

todas las bacterias y por tanto, no siempre pueden utilizarse.

Medios complejos

En los medios complejos se desconoce la composición química exacta de un medio complejo, ya que estos

medios son preparados a partir de extractos de productos naturales tales como carne, sangre, caseína (la

proteína de la leche), levaduras o soja.

La adición de compuestos cumplen necesidades nutricionales mas completas que los medios definidos, por

ejemplo, la caseína u otras proteínas que se añaden a los medios son usualmente hidrolizadas con enzimas

o en medio ácido, para hacerlas más solubles y, por tanto, más fáciles de utilizar nutricionalmente. Una

hidrólisis parcial rompe las proteínas en péptidos. Una hidrólisis total las degrada hasta aminoácidos. A las

proteínas parcialmente hidrolizadas se les denomina peptonas, quienes son los principales compuestos que

poseen hoy en día todos los medios de cultivo. Entre las peptonas comerciales se encuentra la proteosa-

peptona, la triptona y la triptosa. A la caseína totalmente hidrolizada se le denomina hidrolizado de

caseína. Los diversos componentes de un medio complejo se venden como polvos deshidratados. También

existen ya cientos de mezclas complejas que se comercializan como medios complejos específicos. Uno de

estos medios es el caldo nutritivo, probablemente el medio complejo que más se utiliza.

Generalmente se prefiere la utilización de los medios complejos, ya que son fáciles de preparar y permiten

un crecimiento rápido de los microorganismos.

Medios selectivos

Un medio selectivo favorece el crecimiento de ciertos microorganismos, mientras suprime el crecimiento

de otros. Los medios selectivos se utilizan para aislar especies particulares a partir de una mezcla compleja

vinculan o contienen un producto químico, como la azida sódíca, antibióticos como la polimixina, la

tetraciclina, la sulfadiacina, componentes reductores como el telurito potásico, aminoácidos toxicos,

sustancias que influyen en los procesos de osmodifusion y actividad acuosa como sales o colorantes como

el cristal violeta, finalmente la selectividad también se puede lograr en otros medios de cultivo cuando se

utilizan un valor extremo de pH, limitando el rango de crecimiento de algunos grupos microbianos.

Medios diferenciales

Se utiliza un medio diferencial para identificar las colonias de un determinado microorganismo.

Y las bacterias relacionadas con ella se identifican en medios con un indicador de pH porque originan

productos metabólicos ácidos, que cambian el color del indicador y por tanto de sus colonias.

Medios selectivos-diferenciales

Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo, quiere decir que poseen varios

componentes que cumplen funciones tanto como de separación, eliminación e identificación de grupos

microbianos.

VARIABLES DE CULTIVO EN LABORATORIO Un medio se formula para suministrar todos los nutrientes que un microorganismo necesita para crecer,

pero esto no es suficiente para llevar a buen término el desarrollo de un cultivo microbiano, existen

variables que puede ser modificadas o controladas e influir en el éxito para el aislamiento, estas variables

son: La temperatura, el pH y la concentración de oxigeno.



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Temperatura.

Cada especie bacteriana se caracteriza por un intervalo de temperatura en el cual presenta su crecimiento

óptimo. Por lo general, los microorganismos crecen más rápidamente cuando se aumenta la temperatura,

pero esta actividad y velocidad cesa o llega a cero cuando la temperatura alcanza una valor alto que impide

los procesos celulares y desnaturaliza las proteínas propias funcionales y estructurales, pero, también

temperaturas bajas pueden influir en el crecimiento celular generalmente sin efecto letal pero si que

retrasa y ralentiza la velocidad de crecimiento.

Las temperaturas de laboratorio sulen dividirse en tres grandes grupos, para bacterias ambientales se

emplea una temperatura de incubación de 25º C +/-2ºC; para bacterias patógenas parasitas o comensales

de animales y del hombre la temperatura de incubación de 37º C +/-2ºC; y para bacterias que crecen en

ambientes calidos se emplea una temperatura de incubación de 44º C +/-2ºC.

pH.

El pH óptimo depende de la especie bacteriana, pero cada una de ellas crece en un intervalo de pH

relativamente similar. Casi todas las bacterias crecen mejor a valores de pH próximos a la neutralidad, en el

intervalo de 6,5 a7,5. Sin embargo, los hongos crecen mejor entre 4,5 y 6,0.Aunque el pH de un medio sea

el adecuado cuando se inicia el cultivo, a menudo el crecimiento microbiano como resultado de la

producción de metabolitos tiende a modificarlo. Para disminuir los cambios de pH en los medios definidos

se suelen utilizar tampones. En los medios complejos no suele ser esencial, porque sus materiales

naturales actúan como tampones débiles. Los tampones más eficaces para valores neutros de pH son los

fosfatos y el carbonato cálcico. Ambos se añaden normalmente como nutrientes (fuente de fósforo y

calcio); pero si se desea que actúen como tampones se precisarán cantidades mayores.

Oxígeno.

La concentración de oxígeno del medio es un determinante crítico para el crecimiento bacteriano. Algunos

microorganismos, a los cuales se denomina aerobios estrictos no pueden vivir sin oxígeno porque lo

necesitan para obtener energía. Otros microorganismos, llamados anaerobios estrictos no pueden vivir en

presencia de oxígeno, para ellos es un agente tóxico. Otros tipos de organismos, como los anaerobios

facultativos o los anaerobios aerotolerantes, pueden crecer tanto en presencia de oxígeno como en su

ausencia. Los anaerobios facultativos utilizan el oxígeno si disponen de él, pero también pueden crecer sin

él. Los anaerobios aerotolerantes no utilizan el oxígeno, pero tampoco les afecta negativamente. Los

organismos microaerófilos requieren ambientes con bajas tensiones de oxígeno; las altas tensiones, como

las que existen en el aíre son tóxicas para ellos. Por tanto, dependiendo del microorganismo que se vaya a

cultivar, se tendrá que suministrar,restringir o eliminar el oxígeno. Suministrar oxígeno a las bacterias que

lo necesitan para crecer, o que crecen más rápidamente en su presencia,representa una dificultad técnica.

Los organismos aerobios que crecen en la superficie de las placas de agar, obtienen suficiente cantidad de

oxígeno de la atmósfera, aunque el interior de toda colonia es completamente anaerobio. Cuando los

microorganismos crecen en medios líquidos es más difícil, porque no existe demasiado oxígeno disuelto en

el agua y los microorganismos aerobios lo consumen rápidamente. Todos los cultivos líquidos con más de

uno o dos centímetros de profundidad deben oxigenarse. Esto se lleva a cabo haciendo pasar una corriente

de aire a través del cultivo o agitándolo vigorosamente de forma continua. En casi todos los laboratorios de

microbiología existen agitadores, que son plataformas en las cuales se pueden colocar los matraces

convenientemente sujetos, para ser sometidos a un movimiento de rotación o a una agitación de vaivén,

que mezclan el aire con el cultivo. El suministro de oxígeno a los cultivos de cientos de litros, como los que

se utilizan para producir antibióticos, es un desafió para la ingeniería. Estos cultivos se remueven

vigorosamente mediante grandes propulsores, mientras se fuerza a que pasen a través de ellos enormes

cantidades de aire. La exclusión del oxígeno del ambiente de los anaerobios también plantea problemas

técnicos. Muchos microorganismos anaerobios se pueden cultivar en tubos de ensayo expuestos al

oxígeno, sí el medio contiene un compuesto químico que reaccione con el mismo, como el tioglicalato que

reacciona con el oxigeno manteniendo la parte inferior del tubo libre de oxígeno. Los anaerobios también

pueden cultivarse en placas Petri, si estas se incuban dentro de unos contenedores, en los cuales se haya

eliminado totalmente el oxígeno y se haya reemplazado por un gas inerte como nitrógeno o argón.

También se puede llevar a cabo una eliminación química del oxigeno. Para ello, se comercializan paquetes



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con unas mezclas (le reactivos que producen hidrógeno cuando se les añade agua; el hidrógeno reacciona

con el oxígeno en presencia de un catalizador; la reacción consume el oxígeno produciendo agua. Un

método muy sencillo para disminuir la concentración de oxigeno (y al mismo tiempo producir anhídrido

carbónico, el cual es beneficioso para ciertos microorganismos) es encender una vela dentro de un

recipiente y cerrarlo herméticamente; la vela consumirá oxígeno hasta que se extinga. Esta técnica se

utilizaba para cultivar anaerobios aerotolerantes, como las bacterias del ácido láctico. También ha sido

utilizada para microacrófilos, especialmente cuando el dióxido de carbono les favorece. Los

microorganismos anaerobios estrictos, que mueren incluso con una breve exposición al aire, pueden

cultivarse en jarras de cristal herméticamente cerradas. Cuando se abren estos contenedores para añadir

medio o tomar muestras, se utiliza una corriente de nitrógeno para sacar el aire de la vasija. A veces, se

requieren técnicas más elaboradas. Es frecuente el uso de cámaras libres de oxígeno, en las cuales se

trabaja usando unos guantes conectados a las mismas.

MÉTODOS DE CONSERVACION. En cualquier laboratorio de microbiología es fundamental el mantenimiento y conservación de las

colecciones de microorganismos con las que se trabaja ya que facilita posteriormente otros procedimientos

analíticos. Existen una gran variedad de métodos de mantenimiento y conservación de los microorganismos

cuya utilización va a depender en parte del tiempo previsto (Mantenimiento por Cortos períodos de

tiempo, días; Conservación Largos períodos de tiempo, años) y en parte de las características de los

diferentes microorganismos (bacterias, hongos, virus, algas, protozoos).

Los objetivos de las colecciones de los microorganismos son muy simples:

1.- Mantener los cultivos viables a lo largo del tiempo.

2.- Mantener los cultivos puros, sin contaminaciones.

3.- Mantener los cultivos sin cambios en sus características, es decir estables.

TECNICAS DE MANTENIMIENTO Y CONSERVACION DE LOS MICROORGANISMOS

Subcultivo seriado Consiste en resembrar el microorganismo cada cierto tiempo en un medio adecuado; generalmente se

utiliza agar inclinado ya que en medio sólido se detectan mejor los contaminantes que en medio líquido y el

hacerlo inclinado tiene por objeto el evitar la desecación rápida del medio.

Este método es válido para cortos períodos de tiempo (semana - 15 días) por lo que deben ser resembrados

con frecuencia lo que incrementa el riesgo de contaminación. Además, al mantenerlos a temperatura

ambiente, pueden crecer y espontáneamente cambiar sus características genéticas (mutación, pérdida de

plásmidos, etc.) que pueden afectar al carácter por el que fueron seleccionados. Estos dos inconvenientes

pueden subsanarse en parte enlenteciendo el metabolismo de los microorganismos al mantenerlos a 4°C

con lo que su crecimiento es inferior y la necesidad de hacer subcultivos se prolonga a 1 - 3 meses. En

microbiología industrial hay que pensar en mantener las colecciones durante períodos de años y no de

meses, por lo tanto se utilizan otras técnicas que nos ahorran trabajo y disminuyen los riesgos.

Desecación La eliminación del agua (deshidratación) es un método de conservación que reduce drásticamente el

metabolismo. Sin embargo, no todos los microorganismos sobreviven a estos métodos de secado, por lo

que se hace necesario añadir agentes protectores (leche descremada, glutamato sódico al 10%). Una vez

secos es importante mantener el producto sellado (tapón de rosca, ampolla) para evitar el contacto con el

aire ya que son higroscópicos.



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Los soportes que se suelen utilizar son arena, suelo, sílica gel previamente secados y esterilizados por

calentamiento con aire caliente (no utilizar autoclave y sí calor seco). Sobre estos soportes se añade la

suspensión de los microorganismos y se deja secar a temperatura ambiente. También se pueden utilizar

como soportes discos o tiras de papel, agar , discos de gelatina donde se añade la suspensión de

microorganismos y posteriormente se seca al vacío evitando la congelación, lo que se denomina L-secado

(L-drying).

Estos métodos de secado son particularmente útiles para conservar microorganismos productores de

esporas, p.j. actinomicetos.

Congelación Al bajar la temperatura hasta el punto de congelación o por debajo de éste se reduce el metabolismo

drásticamente hasta el caso de prácticamente anularlo con nitrógeno líquido (-196°C).

Sin embargo, existen una serie de problemas que debemos tener en cuenta. La formación de cristales de

hielo pueden romper las células, además al eliminar el agua líquida por convertirse en hielo existe una

concentración de sales que puede ser perjudicial. Para evitar estos problemas se deben utilizar

suspensiones que contengan el mínimo de sales posibles así como utilizar agentes protectores como el

glicerol (25%) o dimetilsulfóxido (DMSO c.a. 10%) que neutralizan el efecto de las sales. El realizar el

proceso de congelación de una forma rápida o gradualmente no está claro. Algunos recomiendan una

bajada gradual (1°C/min) hasta -20°C para posteriormente enfriar rápidamente. Sin embargo, la

descongelación debe ser rápida.

Las distintas temperaturas que se utilizan para la conservación de los microorganismos por congelación

son:

-30°C: congelador de frigorífico. No se recomienda debido a la formación de eutécticos (suspensión con

distintos puntos de congelación debido a los solutos que pueden dañar a las células).

-70°C: nieve carbónica (CO2 sólido) o ultracongeladores. Es el método más utilizado en los laboratorios de

microbiología.

-196°C: nitrógeno líquido. Se utiliza para la conservación de bacterias, virus y líneas celulares. Existen varios

problemas prácticos: el nitrógeno se evapora continuamente por lo que se debe rellenar regularmente; se

deben utilizar recipientes que resistan bien estas temperaturas y que estén bien cerrados para evitar la

entrada de nitrógeno líquido.

Liofilización Es el método más utilizado por las colecciones internacionales de cultivos tipo para la conservación de los

microorganismos. Básicamente consiste en congelar rápidamente una suspensión de microorganismos y

eliminar el agua como vapor de agua directamente del hielo sin pasar por el estado intermedio líquido. Por

lo tanto, combina las dos técnicas anteriormente citadas ya que es una desecación por sublimación. El

sistema requiere tres componentes: mecanismo de congelación, bomba de vacío y una trampa de agua.

Los liófilos se conservan entre 0 y 5°C durante muchos años. Para su recuperación se resuspende el liófilo

en el medio de cultivo adecuado y se incuban a la temperatura adecuada. No obstante, hay que estudiar,

como en los casos anteriores (desecación y congelación), las condiciones óptimas de supervivencia de

nuestro microorganismo.



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PROCEDIMIENTO.

PREPARACION DEL INOCULO. A partir de un cultivo bacteriano en medio solido prepare una suspensión transfiriendo una asada (asa

redonda) a un tubo con 10 ml de agua destilada estéril, compare la turbidez generada por su

microorganismo con la de otras preparaciones, de este primer inoculo transfiera 1 ml a otro tubo de ensayo

con 9 ml de agua destilada estéril (dilución 1/100) (Realice el procedimiento de forma aséptica, no se

olvide de flamear el tubo antes y después de inocularlo)

SIEMBRAS EN SUPERFICIE EN MEDIOS BASICOS. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de crecimiento A partir del patrón de la segunda dilución (1/100) del inoculo en suspensión tome 0,1 ml y deposítelo en la

superficie del medio de cultivo, distribuya la muestra con la ayuda del asa de digralsky (asa de hockey)

realice el procedimiento sembrando en cinco cajas de agar nutritivo e incube cada una a diferentes

temperaturas. (5ºC, 25ºC, 37ºC, 42ºC y 55ºC), observe como se desarrolla el crecimiento a las 3 horas, a las

6 horas, 12 horas, 24 y 48 horas respectivamente; realice las anotaciones y comparaciones pertinentes.

Efecto de tensión de oxigeno sobre el crecimiento celular A partir del patrón de la segunda dilución (1/100) del inoculo en suspensión tome 0,1 ml y deposítelo en la

superficie del medio de cultivo, distribuya la muestra con la ayuda del asa de digralsky (asa de hockey)

realice el procedimiento sembrando en cinco cajas de agar nutritivo realice este procedimiento por

duplicado, un juego de cajas se incuban en aerobiosis y otro juego de cajas se disponen en jarras de

anaerobiosis y se llevan a incubación a diferentes temperaturas. (5ºC, 25ºC, 37ºC, 42ºC y 55ºC), observe

como se desarrolla el crecimiento a las 6 horas, 12 horas, 24 y 48 horas respectivamente; realice las

anotaciones y comparaciones pertinentes.

SIEMBRAS EN SUPERFICIE EN MEDIOS SELECTIVOS DIFERENCIALES. Efecto de los nutrientes y aditivos sobre el crecimiento A partir del patrón de la primera dilución (1/10) del inoculo en suspensión tome una asada con un asa

redonda calibrada (0,1 ml) y realice siembras por agotamiento en la superficie de los medios de cultivo

MYP, SALADO MANITOL, HEKTOEN, VRB, PALCAM, PDA y MULLER HINTON, realice las siembras por

triplicado e incube cada una de las cajas sembradas por cada medio de cultivo a 5ºC, 37ºC y 55ºC por 48

horas; una vez pasado el periodo de Incubación, observe las cajas y determine la respuesta celular en cada

una de ellas en función de la sensibilidad (No hay crecimiento) , resistencia (crecimiento abundante) o

tolerancia (crecimiento mínimo) de acuerdo a la composición de cada uno de los medios, o actividad

enzimática diferencia ( si hay crecimiento y este se caracteriza por tener alguna reacción diferente al de los

demás grupos).

Efecto de la presencia de aditivos en etapas de enriquecimiento sobre el crecimiento A partir del patrón de la segunda dilución (1/100) del inoculo en suspensión tome 0,1 ml y deposítelo en los

siguientes tubos de ensayo con medios líquidos: AGUA DESTILADA ESTERIL, CALDO BHI, CALDO PEPTONA,

CALDO TETRATIONATE, CALDO PEPTONA+10% CLORURO DE SODIO, CALDO BHI+10% ETANOL AL 70%,

CALDO RAPAPPORT VASILIADIS, CALDO SELENITO CISTEINA Y CALDO PEPTONA + 5% GLUCOSA. Realice el

procedimiento por triplicado y cada uno de los tubos incúbelos a diferentes temperaturas: a 25ªC, 37ºC y

45ºC/24 horas, pasado el tiempo de incubación, observe como se desarrolla el crecimiento y determine el

crecimiento como positivo cuando se presente Turbidez óptica considerable, el crecimiento mínimo

cuando haya un ligera turbidez y el crecimiento negativo cuando el tubo se encuentra translucido y sin

ningún cambio.

En una hoja de cálculo asigne valores numéricos a cada uno de los resultados obtenidos (crecimiento

positivo = 1, crecimiento mínimo = 0,5 y crecimiento negativo = 0) grafique dichos resultados y comente sus



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observaciones y concluya, como influye la presencia de aditivos en el crecimiento y estos cómo interactúan

con la temperatura de incubación.

METODOS DE CONSERVACION.

Siembra en tubo inclinado A partir de un cultivo en medio solido, tomo una asada del microorganismos (asa recta) y transfiera al

inoculo a un tubo con agar nutritivo inclinado, realice una punción hasta el fondo del medio. (Realice el

procedimiento de forma aséptica, no se olvide de flamear el tubo antes y después de inocularlo) a 25ºC, 24

horas y después restire y conserve a 5ºC/15 días, pasado este tiempo repita el procedimiento, mantenga el

microorganismo viable durante mes y medio. (45 días)

Siembra en caldo y centrifugación. A partir de un cultivo en medio solido prepare una suspensión transfiriendo una asada a dos tubos con 10

ml de caldo (uno con BHI, otro con Caldo peptona y otro con agua destilada estéril) realice este

procedimiento por duplicado, Incube a 37ºC/24 horas, transcurrido ese tiempo, centrifugue los tubos a

2500 rpm por 10 minutos, retire el sobrenadante, realice el procedimiento por duplicado a un grupo de

tubos, llévelos a congelación directa a -40ºC/30 días; al otro grupo de tubos adiciónele entre 2 y 5 ml de

glicerol estéril y llévelo a congelación a -40ºC/30 días; pasado este tiempo, descongele lentamente los

tubos (deje los tubos a temperatura ambiente durante 4 horas) rehidrate cada uno de ellos adicionando 10

ml de agua destilada estéril y siembre 0,1 ml de cada uno de los tubos en la superficie de agar nutritivo en

cajas de petri, distribuya la muestra con la ayuda del asa de digralsky (asa de hockey)e incube a 37ºC/24,

pasado el tiempo cuente el crecimiento y compárelo con los datos de crecimiento del inoculo bajo

condiciones normales.

Siembra en caldo crio protector y congelación A partir de un cultivo en medio solido prepare una suspensión transfiriendo una asada a dos tubos con 10

ml de caldo BHI con crioprotectores (sacarosa, glicerol) y SKIM MILK, Incube a 37ºC/24 horas transcurrido

ese tiempo distribuya de 1 ml de cada caldo en viales (tubos eppendorf), séllelos y márquelos

adecuadamente y dispóngalos en una bandeja para ser ultrcongelados a -80ºC/30 días. Pasado este tiempo,

descongele lentamente los tubos (deje los tubos a temperatura ambiente durante 4 horas) tome una asada

y realice una siembra por agotamiento en la superficie de agar nutritivo, incube a 37ºC/24, pasado el

tiempo observe el crecimiento y compárelo con los datos de crecimiento del inoculo de cada uno de los

caldos con crioprotector.

CONSULTA.

• ¿Qué es congelación rápida y congelación lenta?

• ¿Cómo influye la formación de cristales en el proceso de congelamiento y descongelamiento

celular?

• ¿Qué es un crioprotector, cuales son los más comúnmente usados y en que concentraciones suelen

emplearse?

BIBLIOGRAFIA.

• Mateos, G. Pedro. TEMA 4: MANTENIMIENTO Y CONSERVACION DE MICROORGANISMOS

INDUSTRIALES. http://darwin.usal.es/profesores/pfmg/sefin/MI/tema04MI.html

• Romero Cabello, R. Microbiología y Parasitologìa Humana: Bases etiológicas de las enfermedades

infecciosas.Editorial Panamericana, México 2001. 2ºed. Pp.257-429

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