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Tesina de Grado Licenciatura en Bioqumica

Sirtuinas, enzimas moduladoras del metabolismo energtico

Leonardo Santos

Tutora: Dra. Ana Denicola

Laboratorio de Fisicoqumica Biolgica Facultad de Ciencias, UdelaR

Diciembre 2011

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INDICE RESUMEN

INTRODUCCIN

1. Sndrome metablico vs restriccin calrica

2. Sirtuinas

2.1 Descubrimiento de la familia

2.2 Isotipos en mamferos

2.3 Mecanismo cataltico de las sirtuinas como desacetilasas

2.4 Estructura

3. SIRT1

3.1 Regulacin

3.2 Funciones

4. Molculas moduladoras de SIRT1

OBJETIVOS

MATERIALES Y METODOS

1. Reactivos

2. Expresin y purificacin de hSIRT1

2.1 Expresin

2.2 Preparacin de extracto libre de clulas

2.3 Purificacin por cromatografa de afinidad

2.4 Purificacin por gel filtracin

3. Control de calidad y rendimiento de la produccin de la hSIRT1-r

3.1 Electroforesis en geles de poliacrilamida

3.2 Anlisis por espectrometra de masa

3.3 Espectro UV-Vis y espectro de fluorescencia

3.4 Cuantificacin de protenas

4. Medidas de Actividad

Pg.

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4.1 Mtodo con pptido fluorescente

4.2 Medida de actividad por HPLC

RESULTADOS Y DISCUSIN

1. Purificacin de hSIRT1 recombinante

2. Anlisis fisicoqumico de la protena purificada

3. Ensayo de actividad de la protena obtenida

4. Mtodo cromatogrfico de medida de actividad

5. Ensayo de compuestos polifenlicos como potenciales moduladores de la actividad de SIRT1

CONCLUSIONES

PERSPECTIVAS

REFERENCIAS

AGRADECIMIENTOS

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ndice de abreviaturas AADPR - Adenosil difosfato acetil ribosa

ADPR - Adenosil difosfato ribosa

AMC - 7-amino-4-metilcumarina

ME - mercaptoetanol

BSA - Albumina srica bovina

FdlP - Pptido sustrato acetilado fluorescente (RHKK(Ac)-AMC)

HPLC - Cromatografa liquida de alta performance

hSIRT1- Sirtuina de tipo 1 humana

hSIRT1-r - Sirtuina de tipo 1 humana recombinante

IMAC - Cromatografa de afinidad por iones metlicos

NAD+ - Dinucletido de nicotinamida y adenina

NAM - Nicotinamida

p53mer - Pptido sustrato acetilado (RHKK(Ac)-NH2)

PMSF - Fluoruro de fenilmetilsulfonilo

RC - Restriccin Calrica

RSV - Resveratrol

SDS - Dodecilsulfato sdico

SEC - Cromatografa de exclusin molecular

SM - Sndrome Metablico

STACs - Compuestos activadores de SIRT1

Tris - Tris(hidroximetil)aminometano

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Resumen

Las sirtuinas conforman una familia de enzimas evolutivamente conservadas, presentes en un

amplio rango de organismos, desde bacterias hasta mamferos. Estas enzimas cumplen

funciones como el silenciamiento gnico y la regulacin metablica, las cuales son claves en la

promocin de la salud y sobrevida de dichos organismos. Las sirtuinas catalizan la

desacetilacin de protenas acetiladas en residuos de lisina utilizando como segundo sustrato

dinucletido de nicotinamida y adenina (NAD+), dando como productos a la protena

desacetilada, nicotinamida y ADP-Ribosa acetilada. En mamferos se expresan siete isotipos de

sirtuinas (SIRT1-SIRT7) con diferentes localizaciones a nivel celular y distintos sustratos

proteicos.

Dentro del grupo, la ms estudiada es la SIRT1, y aunque el alcance y detalle de las funciones

de SIRT1 an no estn completamente esclarecidos, existe evidencia abrumadora que sugiere

que esta enzima censa la disponibilidad de nutrientes y transmite esta informacin a las

protenas que regulan la utilizacin del combustible celular y el mantenimiento de la

homeostasis energtica.

Se han reportado resultados sorprendentes en modelos animales de ratones transgnicos

obesos, o animales a los cuales se les induce trastornos metablicos con dietas ricas en grasas,

en donde una induccin de la expresin o un aumento de la actividad de SIRT1, corrige en parte

los desbalances metablicos asociados con la obesidad. Estos resultados posicionan a la SIRT1

como un excelente blanco teraputico para el tratamiento de sndrome metablico, de alta

incidencia en nuestros das.

En el presente trabajo se expres y purific hSIRT1 recombinante. Se pusieron a punto dos

tcnicas de medida de actividad enzimtica de SIRT1. Una de ellas fue una adaptacin del

mtodo ms utilizado en la bibliografa el cual utiliza un pptido sinttico fluorescente como

sustrato acetilado. El otro mtodo se bas en la cuantificacin de la nicotinamida producida en

la reaccin enzimtica, utilizando cromatografa de fase reversa (HPLC-DAD). Se ensayaron

diferentes compuestos polifenlicos y derivados, sintetizados en el Lab. Qumica Orgnica,

Facultad de Qumica, como potenciales moduladores de actividad SIRT1. Con ninguno de los

compuestos ensayados se logr una activacin de la enzima, presentado algunos de ellos

incluso una leve inhibicin de la actividad enzimtica in vitro de SIRT1.

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Introduccin

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1. Sndrome metablico vs restriccin calrica

Se define como sndrome metablico (SM) a una combinacin de parmetros fisiopatolgicos

que incluyen a la hipertensin, obesidad abdominal, resistencia a la insulina, dislipidemia (altos

niveles de triglicridos y LDL y bajos de HDL circulando en sangre) y estados pro-trombtico y

pro-inflamatorio [1]. Las causas principales que llevan al desarrollo de SM son una dieta

desbalanceada (rica en carbohidratos y lpidos) y la falta de actividad fsica. En la actualidad

existe una gran preocupacin a nivel mundial a causa del aumento alarmante de la poblacin

obesa y por tanto un aumento de las patologas asociadas a la obesidad [2]. En la primer

encuesta de factores de riesgo de enfermedades crnicas no transmisibles, realizada en

Uruguay en el 2006, se determin que casi un 57% de la poblacin adulta sufre de sobrepeso

y/u obesidad, en tanto un 30% sufre de hipertensin arterial. Estos nmeros no hacen ms que

confirmar la alta prevalencia de SM en los tiempos que corren [3].

Se sabe que la esperanza de vida de muchos organismos aumenta al ser sometidos a dietas

restringidas en caloras, pero dentro de los parmetros saludables [4]. En

1935, McCay et al. publican el primer trabajo donde someten ratas a una restriccin

calrica (RC) y observan que se extiende su esperanza media de vida [5].

Estudios posteriores demostraron que la RC no slo extiende la esperanza de vida mxima de

otros organismos (levadura, moscas, gusanos y peces) sino tambin retarda su envejecimiento

[4]. Se ha demostrado adems que la RC impide o atena la gravedad de algunas

enfermedades crnicas como diabetes, obesidad y enfermedades cardiovasculares [6].

El efecto de la RC en la longevidad de los seres humanos es difcil de determinar

debido a que, entre otras cosas, no es prctico llevar a cabo estudios a largo plazo.

Sin embargo, hay datos epidemiolgicos que sugieren que la RC tambin tiene efectos

beneficiosos en los seres humanos con respecto a enfermedades asociadas con la vejez as

como en la prolongacin de la esperanza de vida [6].

Si bien el SM y la RC se relacionan con enfermedad y salud, respectivamente, parecen

compartir varios de los mecanismos moleculares implicados en la manutencin de la

homeostasis del metabolismo energtico.

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Entender cules son los mecanismos moleculares que vinculan a la RC con el aumento de la

esperanza de vida y la salud de organismos de distintas especies despierta gran inters. De un

tiempo a esta parte se ha acumulado evidencia experimental que sugiere que las sirtuinas

juegan un papel importante en la respuesta fisiolgica a situaciones de estrs nutricional,

mediando respuestas que favorecen la salud en varias clases de organismos incluyendo

mamferos [7, 8].

2. Sirtuinas Las sirtuinas constituyen una familia de enzimas altamente conservadas en la evolucin,

presentes en todos los filos, desde arqueas a eucariotas superiores e incluso virus [9, 10]. Las

sirtuinas o desacetilasas de histonas de clase III (HDAC III) catalizan la desacetilacin de

protenas con lisinas -amino-acetiladas, utilizando como cosustrato dinucletido de adenina y

nicotinamida oxidado (NAD+). Esto ltimo las diferencia de las HDAC de clase I ,II y IV, las cuales

cuentan con un mecanismo cataltico dependientes de Zn2+ e independiente de NAD+[11].

2.1 Descubrimiento de la familia

Dentro de la familia de las sirtuinas se incluyen todas las enzimas homlogas a la Sir2 (Silence

information regulator 2) de Saccharomyces cerevisae, la primer enzima descripta de esta

familia. La Sir2, formando complejos con otras protenas, cumple funciones de silenciamiento

gnico, por ejemplo los loci HM (maiting-type loci) y las regiones telomricas son blancos de

esta protena [12]. Otra regin del genoma de levadura bajo la regulacin de Sir2 son los loci de

ADNr, donde se encuentran los genes que codifican para los componentes del ribosoma. Estas

regiones cuentan con secuencias repetidas donde pueden darse eventos de recombinacin

homloga y la recombinacin excesiva en genes esenciales como los que all se encuentran

puede ser deletrea. Adems, la recombinacin homloga en los loci de ADNr da lugar a la

generacin de crculos extracromosmicos de ADNr (ERC sigla en ingls). La acumulacin de

mltiples copias de estos ERC se asocia con el envejecimiento en levaduras [13], por lo tanto

Sir2 es responsable de silenciar las regiones de ADNr disminuyendo la formacin de ADNr

circular extracromosmico [14].

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Adems se ha observado que la introduccin de otra copia del gen SIR2 en la levadura aumenta

un 30% la esperanza de vida de las mismas [14] y estudios posteriores demostraron que la

sobreexpresin de la enzima en eucariotas superiores como D. melanogaster y C. elegans

tambin aumenta su sobrevida [15, 16]. En este sentido se ha asociado la activacin de

sirtuinas con la prolongacin de la vida media del organismo. Sin embargo, un trabajo publicado

recientemente desat controversia en este aspecto, ya que en el mismo no se observa el

aumento de la sobrevida esperado al aumentar la expresin de la enzima en eucariotas

inferiores, y aducen artefactos experimentales en las observaciones anteriores [17].

2.2 Isotipos en mamferos

En mamferos se han reportados siete isotipos de sirtuinas SIRT1-7. Todas las isoformas

presentan un ncleo cataltico conservado, denominado dominio sirtuina, de entre 240-276 aa

y regiones N-C-terminales muy variables en longitud y secuencia aminoacidicas. El anlisis

filogentico de los ncleos catalticos de 60 sirtuinas procariotas y eucariotas, dio lugar a una

nueva clasificacin de las sirtuinas en distintas clases y subclases (Fig.1) [18].

Los isotipos SIRT1-3 pertenecen a la clase I; adems SIRT1 se subclasifica en Ia, siendo el isotipo

que guarda mayor homologa con respecto a Sir2, la cual tambin pertence a la subclase Ia

(Fig.1). Por otro lado, los isotipos SIRT4 y SIRT5 pertenecen a la clase II y III, respectivamente y

SIRT6-7 a la clase IV [18].

Los diferentes isotipos tienen distintas ubicaciones subcelulares [19]. Las SIRT1, 6 y 7 fueron

identificadas como protenas nucleares, aunque se sabe que SIRT1 puede translocarse al citosol

celular dependiendo del tejido [19, 20]. As, dentro del ncleo, SIRT6 se localiza

predominantemente en las regiones ricas en heterocromatina mientras que SIRT7 se encuentra

en el nuclolo [19].

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SIRT2 se encuentra principalmente en el citosol, siendo uno de sus sustratos la -tubulina [22],

en tanto SIRT3-5 son sirtuinas mitocondriales [19, 23]. Tambin es sabido que algunas sirtuinas

catalizan otro tipo de reacciones adems de la desacetilacin. SIRT1 es una desacetilasa NAD-

dependiente, en tanto SIRT4 cuenta con actividad ADP-ribosiltransferasa (Fig. 2) [24, 25]. Se ha

reportado que SIRT2, SIRT3 y SIRT6 cuentan tanto con actividad desacetilasa como ADP-

ribosiltransferasa [22, 26, 27]. SIRT5 cuenta con una baja eficiencia como desacetilasa pero en

trabajos recientes se seala que este isotipo tiene actividad desmalonilasa y desuccinilasa NAD-

dependiente [28].

Figura 1. Subclasificacin de sirtuinas de mamferos. A) Diagrama filogentico del anlisis de secuencia de dominios conservados de 60 sirtuinas. Se observa que la Sir2 de levadura y SIRT1 se encuentran muy prximas en la filogenia. B) Se representa en forma esquemtica a las siete isoformas de sirtuinas de mamferos. El dominio cataltico de la enzima se encuentra coloreado segn el subgrupo al que pertenecen. En negro se ven los dominios amino y carboxilo terminal no conservados entre los distintos isotipos y como se ve con distintas extensiones. Figura extrada de [21].

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2.3 Mecanismo cataltico de las sirtuinas como desacetilasas

Una de las caractersticas de las sirtuinas que llama la atencin es la participacin de NAD+ en el

proceso de desacetilacin de lisinas proteicas -amino-acetiladas.

La mayora de las sirtuinas catalizan la hidrlisis de un enlace amida transfiriendo el grupo

acetilo a la ribosa del NAD+ a expensas de la hidrlisis de un enlace N-glicosidico. Los productos

de esta reaccin son nicotinamida (NAM), O-acetil-ADP-ribosa (AADPr) y la lisina con su -

amino libre (Fig. 3) [30].

Figura 2. Esquema de las reacciones tpicas catalizadas por sirtuinas. Las sirtuinas segn su isotipo pueden catalizar la desacetlacin de protenas acetiladas y/o catalizar la ADP-Ribosilacin de

protenas. Esquema adaptado de [29].

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Figura 3. Reaccin de desacetilacin catalizada por las sirtuinas. Esquema adaptado de [31].

El consumo de NAD+ en la reaccin de desacetilacin es termodinmica y cinticamente

innecesario. Entonces, cul es la razn de la qumica tan peculiar de este tipo de enzimas? Una

de las hiptesis que se manejan, es que el producto AADPr podra estar cumpliendo un rol de

segundo mensajero y/o participando en la regulacin metablica junto a la desacetilacin de

las protenas blanco de sirtuinas.

Por otra parte, el requerimiento de NAD+ en la catlisis, aleja a las sirtuinas del resto de las

desacetilasas pero las asemeja a las ribosil transferasas, enzimas que catalizan la ribosilacin de

protenas modificando su actividad biolgica (Fig. 2). De hecho, los isotipos de mamferos

SIRT4/6 , cuentan con actividad ADP-ribosiltransferasa [25, 32] .

Por ltimo cabe destacar que el uso de NAD+ por las sirtuinas podra estar estableciendo un

puente entre la modulacin de sus protenas blanco y el estado metablico de la clula,

censando la relacin NAD+/NADH [33].

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Figura 4. Mecanismo de reaccin de las sirtuinas. (I) Una vez unido el sustrato acetilado y al NAD

+, el anillo de la

nicotinamida se ubica en un bolsillo hidrofbico C y quedan enfrentadas la cara de la N-ribosa al carbonilo de la acetil lisina. La carga positiva sobre el anillo nicotinamidico dentro del bolsillo hidrofbico se relocaliza sobre la ribosa debilitando el enlace N-ribosilico. En simultneo el oxigeno carbonilico se aproxima a C1 electrodeficiente para formar el intermediario O-alquilimidato (II) Los electrones del fenilo de una Phe dentro del sitio activo estabiliza la carga positiva que se relocaliza en la ribosa y provee un escudo hidrofobico evitando el ataque de una molcula de agua al C1. Una vez hidrolizado el enlace glicosidico, el fenilo de la Phe rota previniendo la reformacin de NAD+ retrasando la reaccin de intercambio de base. (III) Una His conservada dentro del sitio activo atrae al protn de hidroxilo 2 o 3 activando el ataque del 2 oxigeno al enlace imidato para formar el intermediario amino-acetal cclico. (IV) Ahora la His acta como un cido, protona el intermediario amino acetal. (V) El enlace amida se rompe dando un in acil-oxonio. (VI) Una molcula de agua media el ataque al intemediario cclico. (VII) Subsecuentemente se da la substraccin de un protn por el grupo amina de la Lys del sustrato. (VIII) El O 1 resuelve el acil-oxonio formando (IX) 2-O-acetil-ADP-ribosa. No se muestra en este esquema pero en solucin el 2-O-acetil-ADP-ribosa entra en equilibrio con el 3-O-acetil-ADP-ribosa. Esquema extrado de [34].

Estudios cinticos revelaron que la lisina acetilada se une primero al sitio activo de la enzima y

que el NAD+ lo hace en segundo lugar [35].

El primer paso de reaccin implica el ataque nucleofilico del oxigeno del grupo acetilo sobre el

C1 de la ribosa del NAD+ para formar el intermediario de reaccin C1-O-alquilimidato (Fig. 4,

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I,II). Aunque todava no est claro si se trata de un ataque nucleofilico del tipo SN1 o SN2, la

formacin del intermediario fue comprobada en varios estudios qumicos y estructurales.

Por un lado se realizaron experimentos utilizando pptidos con tioacetil lisina como sustrato,

en donde se observ que el ciclo cataltico de la enzima queda detenido tras la formacin de un

intermediario C1-S-alkilamidato interrumpiendo la funcin de la misma [36]. En trabajos donde

utilizan pptidos marcados con 18O en el carbonilo de la lisina acetilada, como sustrato de Hst2,

una de las sirtuinas de levaduras, queda demostrado que se da la transferencia directa del

grupo acetilo marcado al 1-hidroxilo de AADPr [37]. Suve et al. [38] sugieren que este

intermediario puede formarse reversiblemente explicando tanto la capacidad de las sirtuinas

para catalizar la ruptura y reformacin del enlace N1- ribosilico como el requerimiento de

pptidos acetilados para que se de esta segunda reaccin de intercambio de base [39].

Luego de la formacin del intermediario C1-O-alquilimidato, el grupo 2-hidroxilo del NAD+

ribosa es activado por un residuo de histidina en el sitio activo de la enzima. El hidroxilo activo

ataca el C1-O-alquilimidato para formar el intermediario 1,2-cclico (Fig. 4, III-V) [39].

Por ltimo, una molcula de agua ataca al intermediario cclico para dar la lisina desacetilada y

el OAADPr (Fig. 4, VI-IX). Esto se constata en experimentos donde se utiliza como solvente agua

marcada con 18O en donde se puede encontrar una mezcla de 2AADPr y 3AADPr con 18O en el

grupo acetilo [39].

Con respecto a los parmetros cinticos de la enzima, en trabajos donde se realizaron estudios

cinticos de SIRT1 se obtuvieron valores de KMNAD

en el rango de 90-600 M [40-42]. La KM para

el pptido derivado de p53 conjugado con el fluorforo: 64 M y 87 M, pero para el pptido

sin fluorforo el valor de KM es de 10 M [41, 42].

Las sirtuinas son inhibidas no-competitivamente, con respecto a sus dos sustratos, por

nicotinamida (NAM), uno de los productos de reaccin. Los valores de la constante de

inhibicin (Ki) para NAM reportados estn en el rango de 50-150 M [38, 43-45]. La inhibicin

de la actividad desacetilasa sucede porque se da la reaccin reversa entre el intermediario

ADPr-peptidil-imidato y la nicotinamida. Esta reaccin de intercambio de base da lugar a la

reformacin de NAD+. De esta manera, la reaccin de intercambio de nicotinamida compite por

el intermediario peptidil imidato con la reaccin de desacetilacin, consumiendo al

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intermediario e inhibiendo as la desacetilacin [38, 45]. Adems, los valores de la KM para la

reaccin de intercambio de NAM y de Ki para la inhibicin por NAM son muy similares, lo que

sustenta el mecanismo de inhibicin postulado [45].

2.4 Estructura

La informacin estructural disponible sobre las sirtuinas proviene principalmente de datos

cristalogrficos de sirtuinas de organismos inferiores.

Si bien SIRT1 es la isoforma de mamferos ms estudiada, no se ha podido cristalizar aunque se

cuenta con un modelo construido computacionalmente [46]. De mamferos, la nica estructura

cristalogrfica reportada al momento es de SIRT2, la isoforma citosolica (Fig.5) [47]. La

informacin estructural que se tiene sobre las sirtuinas proviene de las estructuras

cristalogrficas ya publicadas de: Sir2Af1 y Sir2Af2 de Archea, Hst2 de levadura, CobB bacterial,

Sir2Tm de Termofilus y SIRT2 humana [47-52].

Figura 5. Estructura de dos sirtuinas. A la izquierda se puede observar la estructura cristalogrfica de la hSIRT2 unido a sus dos sustratos (pptido acetilado en rojo y NAD+ en verde). En amarillo est coloreado el domino grande con plegamiento de Rossman. El dominio pequeo bilobular con el sitio de unin al Zn

+2 en celeste claro y el dominio globular en azul oscuro. A la derecha se muestra el

modelo computacional de hSIRT1 obtenido por Autiero et al. [46]. En verde se indica la regin cataltica conservada con plegamiento Rossman y sitio de unin a sustratos (zoom del sitio de unin al Zn

+2 no cataltico). En turquesa se marca el sitio de unin a AROS, protena activadora de SIRT1. Se

indican adems las regiones N- y C-terminal.

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Se sabe que el ncleo cataltico de la enzima es la regin ms conservada en virtualmente todos

los organismos. Esta regin comprende aproximadamente 250 aminocidos y est conformada

por dos dominios globulares: un dominio pequeo conformado a su vez por dos mdulos y un

domino grande.

El domino grande adopta un plegamiento clsico de unin a dinucletidos de piridina, llamado

plegamiento de Rossman, caracterstico de protenas con sitios de unin a NAD y NADP en su

forma oxidada y reducida [53]. Este dominio consiste en una hoja beta central formada por seis

cadenas beta paralelas y varias alfa hlices (el nmero depende de la sirtuina), que se

empaquetan enfrentadas a la hoja beta.

El dominio pequeo del centro cataltico se conforma por dos mdulos estructurales. Uno de

estos mdulos tiene un plegamiento helicoidal formado por tres alfa hlices. En las sirtuinas de

clase I (grupo en el que se encuentra SIRT1 de mamferos) estas tres alfa hlices forman un

bolsillo hidrofbico que se propone estara mediando el reconocimiento de residuos especficos

en las protenas sustrato. Informacin estructural proveniente de Sir2-Af1 unida a NAD+, Sir2-

Af2 unida a p53, y SIRT2 humana sugieren que el mdulo helicoidal sufre un cambio

conformacional al unirse NAD+ permitiendo la interaccin del mismo con la lisina acetilada del

sustrato [47]. El segundo mdulo contiene un sitio de unin al zinc (Zn2+), conformado por dos

cadenas beta antiparalelas que contienen dos motivos Cys-X-X-Cys separados por entre 15 y 20

aminocidos encargados de coordinar al tomo de Zn2+ [48]. El zinc no participa en el

mecanismo cataltico de las sirtuinas pero su presencia es requerida para que la enzima

funcione correctamente. En trabajos donde se remplazan las cuatro Cys que coordinan al zinc

por alaninas o donde se utiliza o-fenantrolina como quelante de zinc, la actividad enzimtica

disminuye notoriamente [47], por lo tanto el zinc estara cumpliendo un rol estructural en estas

enzimas.

No se cuenta todava con una estructura cristalogrfica de SIRT1, pero se sabe que el ncleo

cataltico guarda una gran homologa de secuencia con la Sir2. En el trabajo de Auterio et. al. se

propone un modelo de SIRT1 construido mediante herramientas bioinformticas [46]. En dicho

trabajo se predice, utilizando un programa para el modelado de regiones desordenadas

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DISOPRED, que tanto el dominio C- como el N-terminal se encuentran muy desestructurados,

siendo el C-terminal el que cuenta con una mayor cantidad de segmentos estructurados [46].

Estas regiones contienen dos secuencias de localizacin nuclear en el extremo N y dos

secuencias de exportacin nuclear, una N-terminal y otra C-terminal [20].

Tanto la regin carboxilo como amino terminal sufren modificaciones que modulan la actividad

enzimtica. En un trabajo recientemente publicado se caracteriza una secuencia aminocidica

especifica dentro del extremo N-terminal de la SIRT1 que se une al ncleo cataltico y es

indispensable para que la enzima sea activa [54]. Cuando se trabaja con la protena

recombinante con dicha regin eliminada, se observa que la enzima pierde actividad

desacetilasa y disminuye la afinidad por los sustratos acetilados tanto in vivo como in vitro [54].

En la sirtuina de levadura Hst2 se ha demostrado que las regiones N- y C-terminal interaccionan

intermolecularmente para dar lugar a la formacin de trmeros de Hst2, lo cual fue constatado

tanto en la protena cristalizada como en solucin [49]. La oligomerizacin de la enzima podra

cumplir un rol en la regulacin de la unin al sustrato acetilado y/o en la catlisis de la reaccin

de desacetilacin [49].

3. SIRT1

De los siete isotipos de sirtuinas en mamferos es SIRT1 la protena ms estudiada de la familia.

Est demostrado que esta enzima participa en varios procesos fisiolgicos como son: el control

del ciclo celular, la resistencia al estrs, la apoptosis, la diferenciacin celular y el metabolismo

energtico, entre otros.

En humanos se la postula como un blanco teraputico claro para el tratamiento del sndrome

metablico. Esto se debe a resultados como el que arroja un estudio en la poblacin holandesa

donde se observa que las variantes en los alotipos de SIRT1 se correlacionan con el desarrollo

de obesidad y diabetes tipo 2 [55, 56].

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3.1 Regulacin

SIRT1 es una enzima muy verstil en el sentido de que participa en la regulacin de varios

mecanismos fisiolgicos por lo que no resulta para nada extrao que su regulacin se d a

todos los niveles: transcripcional, postranscripcional, postraduccional, y mediante la interaccin

con protenas regulatorias.

Por ejemplo, la transcripcin basal del gen de Sirt1 en mamferos es regulada por E2F1, un

regulador del ciclo celular y de la apoptosis. E2F1 se une a un sitio consenso que se encuentra a

65 pb corriente arriba del gen que codifica para Sirt1, induciendo la transcripcin del mismo. A

su vez SIRT1 se une a E2F1 e inhibe su actividad, estableciendo un bucle en el cual la expresin

de la protena es en parte regulada por si misma [57]. Por otra parte SIRT1 tambin regula su

transcripcin formando complejos con el factor de transcripcin HIC1 [58].

La expresin es regulada a nivel traduccional mediante la unin de la protena HUR que se une

al extremo 3UTR del ARNm de Sirt1 estabilizando a la molcula y por consiguiente aumentando

el nivel de traduccin de la protena [59].

La actividad de la enzima esta tambin regulada por modificaciones postraduccionales como

son la sumoilacin y fosforilacin. Est reportado que la sumoilacin en la lisina 743 aumenta la

actividad in vitro de la enzima con respecto a la actividad de la enzima mutada en el residuo

743 o a la enzima desumoilada por SENP1, una desumoilasa nuclear [60].

Con respecto a la fosforilacin, tres trabajos diferentes reportaron la fosforilacin de la

protena en distintos sitios ubicados en las regiones C- y N-terminal [61-63] y se muestra que

varias protena-quinasas tienen como blanco a SIRT1. La quinasa DIRK fosforila la Thr522 en el

extremo C-terminal activando a la enzima, promoviendo la liberacin del producto y en

consecuencia aumentando la tasa de recambio de la misma [63]. JNK1 fosforila los residuos de

Ser27, Ser47 y Thr530 aumentando la actividad desacetilasa y la localizacin en el ncleo de la

SIRT1 [62]. Se sabe que CiclinaB/Cdk1 fosforila a la SIRT1 en los residuos Thr530 y Ser540

tambin activando a la enzima [63].

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Figura 5. Efecto de la actividad de SIRT1 en distintos tejidos. Accin de SIRT1 a nivel de distintos tejidos y rganos. Se muestran los diferentes tipos de reguladores de la actividad de SIRT1. Tambin se muestra los efectos a nivel metablico y fisiolgico que tiene el aumento o disminucin de la actividad de la enzima en distintos tipos de tejidos. Figura tomada y modificada de [64].

Se ha constatado tambin la modulacin de la enzima va la interaccin con otras protenas. Se

han identificado al menos dos protenas que regulan la actividad enzimtica de SIRT1 formando

complejos con la misma. La primera protena reguladora identificada fue AROS (Active

Regulator of SIRT1). AROS fue identificada en ensayos de doble hbrido en levaduras y

confirmado utilizando ensayos de co-inmunoprecipitacin y GST-pulldown [65]. Kim et al.

determinaron que AROS puede estimular la desacetilacin de p53 in vivo y aumenta al doble la

actividad de la enzima in vitro [65]. Otra protena descripta como moduladora de la actividad de

SIRT1 es la DBC-1 (Deleted in Breast Cancer 1). Zhao et. al. y Kim et al. demostraron que DBC-1

reprime la desacetilacin de p53 y FOXO3 in vivo e in vitro [65, 66]. Por el contrario, el

silenciamiento de la expresin de DBC-1 utilizando ARNi estimula la desacetilacin de p53 de

forma SIRT1 dependiente [66]. DBC-1 interacciona con SIRT1 pero no con los otros isotipos. La

protena inhibidora cuenta en su estructura terciaria con un motivo cierre de leucinas (leu

zipper) que media la unin con el ncleo cataltico de SIRT1. No est todava claro cul es el

21

mecanismo de accin de DBC-1, aunque en un trabajo reciente se propone que DBC1 podra

competir por el mismo sitio de unin en el centro cataltico, con una regin del extremo

carboxiterminal de SIRT1, esencial para la actividad cataltica de la enzima [54].

Ms recientemente se ha planteado (tmidamente) que podria haber una regulacin redox de

SIRT1 [67, 68]. Se sabe que SIRT1 reduce el estado de estrs oxidativo asociado con varias

condiciones de inflamacin, a travs de la desacetilacin de factores de transcripcin como NF-

kB, p53, FOXO que inducen la expresin de enzimas antioxidantes como SOD, catalasa. Se ha

demostrado que SIRT1 es una enzima redox-sensible que se modifica postraduccionalmente

por oxidantes, con reduccin significativa de su actividad desacetilasa [67].

3.2 Funciones

La SIRT1 participa de manera central en vas que mantienen la homeostasis del metabolismo

energtico tanto a nivel celular como sistmico. Entre algunos de los procesos que modula la

protena se encuentran el metabolismo heptico de lpidos, la glicolisis, la gluoconeognesis, la

secrecin de insulina y la acumulacin de grasa en tejido adiposo (Fig. 5).

Algunos miembros de la familia de factores de transcripcin FOXO (Forkhead-O-box),

reguladores clave del metabolismo de lpidos, resistencia al estrs y apoptosis, son sustrato de

SIRT1. SIRT1 aumenta la gluconeognesis va la desacetilacin del factor de transcripcin Foxo1

(Forkhead box protein O1) [69].

La SIRT1 modula la actividad de la fosfoglicerato mutasa 1 (PGAM1), una de las enzimas que

participa en una de las vas metablicas ms conservadas como es la glicolisis. La sirtuina

desacetila a la enzima de la PGAM1 disminuyendo su actividad y por lo tanto disminuyendo la

tasa de gluclisis[70].

En modelos animales donde se somete a ratones a periodos cortos de ayuno, se observa que

SIRT1 inhibe la fase temprana de la gluconeognesis va TORC2 [71]. En periodos de ayuno

prolongado se observa una mayor desacetilacin de PGC-1, un coactivador de un gran nmero

de factores de transcripcin que inducen la expresin de genes que median el aumento de la

22

oxidacin de cidos grasos y modulan la homeostasis de la glucosa [72]. En tanto, en trabajos

donde la expresin de SIRT1 es silenciada utilizando shRNA (small hairpin RNA), se observa una

disminucin en la expresin de los genes participantes en la -oxidacin de cidos grasos en

hgado de ratones sometidos a ayuno [73]. La disminucin de de la -oxidacin tambin fue

constatada en ratones KO para la enzima en hgado [74]. Si se somete a estos animales a una

dieta rica en grasas (HFD), los mismos desarrollan esteatosis heptica, dislipidemia e

inflamacin del hgado [74]. En cambio, en ratones KO para DBC-1 (una de las protenas

inhibidoras de la SIRT1), se observa una menor susceptibilidad de estos animales a desarrollar

esteatosis heptica inducida por HFD [75]. Tambin se ha visto, que la sobreexpresin heptica

de SIRT1, atena la esteatosis heptica y restituye la homeostasis de la glucosa [76].

SIRT1 regula el metabolismo del colesterol mediante la desacetilacin de SREBPs, reguladores

crticos en el metabolismo lipdico que promueven la expresin de genes colesteronignicos y

lipognicos y de genes implicados en el almacenamiento de lpidos [77]. A nivel del tejido

adiposo blanco participa en el almacenaje de cidos grasos y el metabolismo de la glucosa

reprimiendo la actividad de PPAR [78].

SIRT1 tambin participa en la secrecin de insulina por las clulas del pncreas. Ha sido

reportado que en ratones transgnicos a los cuales se les aumenta la dosis gentica para SIRT1

en clulas pancreticas, se mejora la tolerancia a la glucosa y se potencia la secrecin de

insulina en respuesta a la glucosa [79]. En tanto en lneas celulares de pncreas donde se

disminuye la expresin de SIRT1 mediante siARN (pequeos ARNi), se observa que disminuye el

efecto de la glucosa en la estimulacin de secrecin de insulina [80]. En ambos trabajos se

concluye que SIRT1 promueve la secrecin de insulina reprimiendo la transcripcin de UCP2.

23

4. Molculas moduladoras de SIRT1

Hace algunos aos Howitz et al. publicaron un trabajo donde se reportan algunos estilbenos,

chalconas y flavonas con capacidad de incrementar varias veces la actividad de SIRT1 in vitro

[41]. Estos compuestos polifenlicos son producidos en el metabolsimo secundario de algunas

plantas y presentan estructuras qumicas similares (Fig. 6).

Ensayos in vivo en levaduras determinaron que la buteina (3,4,2,4-tetrahidroxichalcona) y la

fisteina (3,7,3,4-tetrahidroxiflavona) eran capaces de aumentar la sobrevida de las clulas

hasta un 31% y 55%, respectivamente, y de aumentar varias veces la actividad enzimtica de

hSIRT1 in vitro [41].

De los compuestos naturales ensayados en la literatura el 3,5,4 trihidroxiestilbeno o resveratrol

(RSV) fue el que present mayor potencia como activador, aumentando la vida media de las

clulas de levadura hasta en un 70% y multiplicando por trece la actividad de la hSIRT1 in vitro

[41].

Sorprendentemente se ha observado que el RSV tiene la capacidad de emular en levaduras el

estado de restriccin calrica, an cuando la ingesta calrica no disminuye [41]. En otros

estudios donde se trabaja con modelos animales se reporta que el RSV, como activador de

SIRT1, prolonga la vida de ratones obesos disminuyendo los niveles de glucosa e insulina y

elevando la capacidad mitocondrial [81, 82]. Por otro lado, estudios de expresin gnica

revelaron que la mitad de las vas alteradas por la RC tambin se encuentran afectadas por RSV

en hgado de ratones, por ejemplo disminuyendo el flujo de la gliclisis [81]. En otros trabajos

donde estudian la expresin gnica en msculo esqueltico cardaco y cerebro, tambin se

observan alteraciones a nivel de la transcripcin gnica similares a las observadas en ratones

suministrados con RSV o sometidos a una RC [83].

24

Figura 6. Algunos compuestos activadores. Aqu se muestran las estructuras de varios activadores de SIRT1 (STACs, sirtuin activating compound).

Basados en los resultados obtenidos por Howitz et al. en donde se demostr que el RSV activa

a la enzima in vitro utilizando como sustrato acetilado un pptido conjugado a un fluorforo, se

asumi que el mecanismo de accin del RSV era mediante la interaccin directa del polifenol

con la enzima [41]. Recientemente se ha cuestionado esta activacin directa por RSV,

aduciendo un resultado artefactual relacionado con este ensayo fluorescente de medida de

actividad, lo que ha convertido al mecanismo de activacin por RSV en un tema controversial

[40, 42, 84].

El mtodo de medida de actividad utilizado por Howitz et al. y que es utilizado ampliamente

para constatar la actividad de las sirtuinas en varios trabajos y para el testeo de compuestos

potencialmente moduladores de su actividad, es el mtodo conocido con el nombre de Fluor

de Lys assay (BIOMOL Inc., Pennsylvania, EEUU, Fig. 7). El ensayo se basa en la utilizacin de

un tetratapptido derivado de la secuencia primaria de p53 que contiene la Lys382 acetilada y

al fluroforo 7-amino-4-metilcumarina (AMC) unido covalentemente a su extremo C-terminal.

Es un ensayo de actividad enzimtica a tiempo final de dos pasos, en primer lugar la enzima

25

cataliza la desacetilacin del pptido sinttico y en un segundo paso el fluorforo se libera por

digestin con tripsina [85, 86].

Figura 7. Esquema del ensayo de actividad tipo Fluor de Lys (BIOMOL).

La polmica entorno al efecto directo del RSV sobre la actividad de la enzima surge de algunos

trabajos como el de Borra et al., donde se mide la actividad enzimtica utilizando molculas

etiquetadas con istopos radiactivos, donde se cuantifican los productos por HPLC o ensayos de

unin a carbono activado (todos ensayos a tiempo final)[84]. Como sustrato se utilizaron dos

pptidos acetilados con diferente secuencia y unidos o no a molculas fluorescentes. All se vio

que la activacin por RSV es independiente de la secuencia peptdica pero dependiente de que

el sustrato acetilado est unido a un fluorforo [84]. En ese mismo trabajo se hacen tambin

estudios de competicin y se concluye que el pptido fluorescente tiene menor afinidad por la

enzima que el mismo pptido sin fluorforo, y que el RSV acta entonces favoreciendo la unin

del pptido fluorescente a la enzima. Esto sugiere que la unin del RSV a la enzima provoca un

cambio conformacional que le permite unirse con mayor afinidad al fluorforo [84]. En

trminos cinticos se determin que el KM del pptido derivado de p53 utilizado en el ensayo

de BIOMOL conjugado al fluorforo es casi nueve veces mayor que para el pptido no

conjugado [42]. Tambin se observ la misma activacin dependiente de un fluorforo

26

conjugado al pptido sustrato, en otro trabajo donde las medidas de actividad fueron realizadas

mediante la cuantificacin de las especies acetiladas y desacetiladas del pptido mediante HPLC

[40].

Se han descrito ms recientemente una serie de compuestos sintticos no polifenlicos (serie

SRT), que no guardan similitud estructural con el RSV y que son 1000 veces ms potentes que el

mismo [87]. Se trata de compuestos que contienen un anillo bicclico imidazotiazol (Fig. 6).

Estos compuestos disminuyen el KM de la enzima por el sustrato acetilado pero no afectan los

parmetros cinticos para el NAD+ [87]. Utilizando varios mutantes de SIRT1 se logr identificar

el sitio de unin para los mismos y se concluy que la unin del pptido acetilado a la enzima

expondra el sitio de unin a la molcula activadora en la regin amino terminal [87].

Utilizando tambin un ensayo de actividad a tiempo final en dos pasos, Milne et al. realizaron el

screening de 290.000 compuestos, 127 de los cuales presentaron una buena actividad

activadora y de los cuales se han reportado los resultados de tres de los mismos (Fig 6). En este

ensayo se utiliza un pptido de 20 aminocidos tambin derivado de p53 pero conjugado al

fluorforo TAMRA (5carboxil-tetrametil-rodamina). El primer paso de la tcnica implica la

desacetilacin del pptido por la enzima y el segundo la hidrlisis del pptido catalizada por

tripsina, determinando finalmente la polarizacin de fluorescencia [87]. A su vez se observ que

en ratones alimentados con dietas ricas en grasas, con resistencia a la insulina, el tratamiento

con el compuesto SRT1720 (Fig. 6) mejor la sensibilidad a la insulina y en consecuencia la

homeostasis de la glucosa [88].

De todos modos, posteriormente se ha planteado que estos compuestos, al igual que el RSV, no

activan directamente a la SIRT1 en condiciones in vitro y con sustratos nativos, ya que no se

observa un cambio en la actividad en presencia o ausencia de los compuestos activadores [40].

La activacin de SIRT1 in vitro por esta familia de compuestos tambin dependera de la

presencia de un grupo fluorforo en los pptidos sustrato utilizados en el ensayo de actividad

de la enzima [40].

Basados en el hecho de que tanto la nicotinamida (producto de la reaccin) como la

isonicotinamida pueden modular la actividad de sirtuinas, Mai et al. prepararon una serie de

1,4-dihidropiridinas, algunas de las cuales resultaron activadoras (Fig. 6) con EC150 ~ 1 M [89].

27

En general, SIRT1 regula varios procesos metablicos que permiten a la clula adaptarse al

estrs de falta de nutrientes y desempea un papel fundamental en las enfermedades

metablicas relacionadas con el envejecimiento. No cabe duda de que SIRT1 juega un papel

importante en enfermedades metablicas asociadas con la obesidad como diabetes tipo 2 y

esteatosis heptica. Los resultados obtenidos con suplementacin de RSV en modelos animales

son sorprendentes y abrieron paso a ensayos clnicos que estn en marcha. La evidencia

experimental acumulada hasta hoy sostiene que controlar la actividad de SIRT1 con nutrientes

o la suplementacin con molculas pequeas activadoras de dicha actividad, podra ser una

estrategia de tratamiento muy valiosa.

28

Objetivos

1- Obtencin de sirtuina 1 humana recombinante

2- Puesta a punto de ensayos de actividad enzimtica

3- Ensayo de compuestos polifenlicos como potenciales moduladores de la actividad

enzimtica de SIRT1

29

Materiales y Mtodos

30

1. Reactivos

Los reactivos generales fueron de calidad analtica y adquiridos en Sigma-Aldrich (EEUU).

Los pptidos utilizados como sustrato para las medidas de actividad p53mer (RHKK(Ac)-NH2) y

el FdLP (RHKK(Ac)-AMC) fueron adquiridos en PEPTIDE 2.0 (EEUU).

Los compuestos polifenlicos y derivados ensayados fueron provistos por la ctedra de Qumica

Orgnica de la Facultad de Qumica de la Universidad de la Repblica, y se presentan en la Tabla

1 a continuacin.

Tabla 1. 1

8

15

2

9

16

3

10

17

4

11

18

5

12

19

6

13

20

7

14

21

31

Se prepararon soluciones stock, 10 mM en DMSO de cada uno de los compuestos, que luego

fueron diluidas en amortiguador Tris 50 mM pH 7.5, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, MgCl2 1 mM,

BSA 0,5 %, previo al ensayo. Los compuestos que presentaron problemas de solubilidad en fase

acuosa, se indican ms adelante en Resultados.

2. Expresin y purificacin de hSIRT1

2.1 Expresin

Contamos con la secuencia de hSIRT1 con cola de histidinas clonada en el vector pHEX, una

versin modificada del pGEX-2T (GE) en el que la secuencia codificante para GST fue

remplazada por una secuencia codificante para 6 histidinas en tandem. El vector con el inserto

fue cedido gentilmente por el Dr. Z. Lou, Mayo Clinic Research Foundation, MN, USA.

Se transformaron por shock trmico clulas quimiocompetentes de E. coli BL21 Star(DE3)

(Invitrogen). Con las clulas transformadas, se procedi a plaquear en LB con 0,1 mg/ml de

ampicilina y a incubar la placa toda la noche a 37 C.

A partir de una colonia aislada crecida en placa se inoculan matraces de 20 ml de LB con

ampicilina 0,1 mg/ml. Se incuba toda la noche a 37 C a 200 rpm. A partir de este cultivo se

procede a realizar un cambio de escala inoculando matraces de 1 L de LB, ampicilina 0,1 mg/ml

con el volumen necesario para que el valor de absorbancia a 600 nm (DO600nm) sea de 0,04. Se

incuba a 37 C a 220 rpm hasta que el cultivo alcance una DO600nm de entre 0,6-0,8 para luego

inducir la expresin de la protena agregando isopropilo- -D-tiogalactopiranosa (IPTG) 1 mM.

Se incuba a 16 C a 220 rpm 16-20 h. Las clulas se cosechan centrifugando a 7.000 g durante

20 min. El pellet obtenido se resuspende en amortiguador fosfato salino (PBS) y se vuelven a

precipitar las clulas centrifugando a 10.000 g durante 15 min. Se descarta el sobrenadante y el

pellet se puede guardar a -20 C hasta su utilizacin.

32

2.2 Preparacin de extracto libre de clulas

Para el lisado de las clulas se resuspenden las mismas en amortiguador de lisis Tris/HCl 50

mM pH 8, NaCl 500 mM, imidazol 20 mM, 1% tritn X-100, -mercaptoetanol (ME) 3 mM,

lisozima 1 mg/ml, PMSF 0,1 mM, leupeptina 10 g/ml y aprotinina 5 g/ml, durante 30 min en

bao de hielo. Se utilizan 5 ml de amortiguador de lisis por gramo de pellet para resuspender a

las clulas. Se agregan 2 g/ml ADNasa I inmediatamente antes de sonicar con un macrotip (10

s on-15 s off), amplitud 30%, durante 2 min. Se sedimentan los restos celulares centrifugando a

20.000 g durante 30 min. El sobrenadante es filtrado por filtros de 0,45 m.

2.3 Purificacin por cromatografa de afinidad

El clarificado se carga en una columna de IMAC (cromatografa de afinidad por iones

inmovilizados) HisTrap FF 1ml (GE), a un flujo 1 ml/min. La cromatografa se realiza conectando

la columna a un sistema de cromatografa lquida de protenas KTA Prime Plus (GE). Los

amortiguadores utilizados para la corrida son: A (Tris 50 mM pH 8.0, NaCl 500 mM, Imidazol 20

mM, ME 3 mM); B (Tris/Cl 50 mM pH 8.0, NaCl 500 mM, Imidazol 500 mM, ME 3 mM).

2.4 Purificacin por gel filtracin

Para este paso se utiliza una columna de exclusin molecular Superdex 16/60 200 pg (GE). La

fase mvil es amortiguador C (Tris/Cl 50 mM pH 7.5, NaCl 150 mM, ME 5mM). En esta ocasin

tambin fue utilizado el equipo KTA Prime Plus.

3. Control de calidad y rendimiento de la produccin de la hSIRT1 recombinante

3.1 Electroforesis en geles de poliacrilamida

Las fracciones de los pasos de purificacin se analizan por electroforesis desnaturalizante en gel

de poliacrilamida discontinuo (SDS-PAGE) con entrecruzamiento del 10% para el gel resolutivo y

33

de 5% para el gel concentrador. Las muestras se preparan en amortiguador de carga: Tris 62,5

mM pH 6.8, 2% dodecil sulfato de sodio (SDS), 10% glicerol, 10% -ME, 0,01% azul de

bromofenol. Las muestras son calentadas a 100 C durante 5 minutos.

Para el revelado de las bandas proteicas en los geles, stos se tien con solucin coloidal Azul

de Coomassie [90].

3.2 Anlisis por espectrometra de masa

La fraccin purificada de la enzima fue analizada por espectrometra de masa MALDI-TOF

(Instituto Pasteur de Montevideo).

3.3 Espectro UV-Vis y espectro de fluorescencia

Los espectros de absorcin y emisin de la enzima purificada fueron realizados en

espectrofotmetro Cary 50 y espectrofluormetro Aminco Bowman a una concentracin de

0,5 mg/ml y 0,25 mg/ml, respectivamente.

3.4 Cuantificacin de protenas

La concentracin de protenas se determina por el mtodo de Bradford, utilizando BSA como

estndar [91].

En algunas ocasiones se calcula concentracin de protenas (como hSIRT1) midiendo

absorbancia a 280 nm utilizando un coeficiente de absortividad molar calculado tericamente

segn la ecuacin que se presenta a continuacin:

280 [M-1cm-1] = 5500 x nTrp + 1490 x nTyr + 125 x nss

Para hSIRT1 que contienen 4 residuos de triptofano, 16 de tirosina y despreciando el aporte de

los enlaces disulfuros, el coeficiente de absortividad molar a 280 nm terico es: 280= 45.840

M-1 cm-1 [92]. Las medidas de absorbancia se realizaron en espectrofotmetro Cary 50 (Varian).

34

4. Medidas de Actividad

4.1 Mtodo con pptido fluorescente

Las medidas de actividad se realizan mediante un mtodo discontinuo de dos pasos que se

esquematiza en la Figura 7. El mtodo es ampliamente utilizado en la literatura y se basa en la

utilizacin del pptido FdLP como sustrato de la enzima [86]. El ensayo se lleva a cabo en

amortiguador Tris 50 mM pH 7.5, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, MgCl2 1 mM, 0,5 % BSA. Las

medidas se realizaron utilizando distintas concentraciones de la hSIRT1r y concentraciones casi

saturantes de los sustratos: 500 M de NAD+ y 25 M de pptido. Las reacciones de

desacetilacin se llevan a cabo a 25 C.

Las reacciones se inician con el agregado de NAD+ al resto de los componentes de la mezcla de

reaccin. Se toman alcuotas a distintos tiempos deteniendo la reaccin con el agregado de

NAM a una concentracin final de 5 mM. Una vez hechas todas las tomas, se les agrega una

solucin de tripsina disuelta en amortiguador de ensayo para alcanzar una concentracin final

de 1 mg/ml de tripsina. Esta mezcla se deja incubando durante 30 min a 37 C y al trmino se

mide la intensidad de fluorescencia a ex= 360 nm, em= 440 nm en lector de placas Varioskan

Flash (Thermo Fisher Scientific Inc.).

4.2 Medida de actividad por HPLC

Se trata tambin de un mtodo discontinuo de medida de actividad. Las reacciones se llevan a

cabo a 37 C utilizando amortiguador de ensayo sin BSA (Tris 50 mM pH 7.5, NaCl 137 mM, KCl

2,7 mM, MgCl2 1 mM). El sustrato acetilado en este caso es el p53mer (sin la sonda

fluorescente conjugada). La reaccin se inicia con el agregado del NAD+ a la mezcla de reaccin.

Se toman alcuotas en el tiempo deteniendo la reaccin con cido trifluoroactico (TFA) para

alcanzar una concentracin final 1%. Las distintas alcuotas son filtradas e inyectadas en un

columna de fase reversa C18 ZORBAX Eclipse Plus C18 ( Agilent, EEUU) para separar la

nicotinamida del resto de los componentes de la muestra [93]. Se utiliz equipo Agilent 1200

con detector de arreglo de diodos.

35

Resultados y Discusin

36

1. Purificacin de hSIRT1 recombinante Para la evaluacin de la capacidad moduladora de la actividad de SIRT1 de los distintos

compuestos, fue necesaria la produccin de la protena recombinante en el laboratorio, la cual

se utilizara para realizar las medidas de actividad ya sea por el mtodo fluorescente

(ampliamente utilizado en la literatura) o por el mtodo cromatogrfico, cuantificando la

nicotinamida producida en la reaccin por HPLC (ambos mtodos discontinuos).

La produccin de hSIRT1 se realiz segn se describe en Materiales y mtodos, purificando la

enzima en dos pasos cromatogrficos. El resultado de una de las purificaciones se muestra a

continuacin.

En la Fig. 8 se muestra el perfil cromatogrfico del primer paso de purificacin de la SIRT1

recombinante. Para este paso se conectaron dos columnas His-Trap de un 1ml en serie y se

carg con 75 ml de un clarificado del lisado de bacterias transformadas con el vector de

expresin que contiene a la protena. Los detalles de la expresin se detallan en Materiales y

mtodos. El primer pico corresponde a la fraccin no unida a la resina de la columna. Las

protenas unidas son eludas cambiando la fase mvil, aumentando de imidazol 20mM a 500

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Abso

rban

cia

a 28

0 nm

(m

UA

)

Volumen de elucion(ml)

0

20

40

60

80

100

Am

ort

iguad

or B

(%

)

Figura 8. Cromatograma de elucin de la IMAC. Se sigue la elucin por absorbancia a 280 nm. El pico entre 16 y 20 ml del volumen de elucin se corresponde con las fracciones donde eluye la enzima recombinante.

37

mM en un solo paso. Aproximadamente entre los 16 y 20 ml, inmediatamente despus del

cambio de fase mvil, se observa un pico donde se espera eluya la protena recombinante (Fig.

8). Se tomaron alcuotas a los distintos volmenes de elucin y se prepararon las mismas para

electroforesis (Fig. 9).

Figura 9. Electroforesis SDS-PAGE 10% de la primera etapa de purificacin por IMAC. Carriles 1: Marcador de peso molecular; 2: Lisado de bacterias antes de la induccin con IPTG; 3: Lisado de bacterias luego de la induccin; 4: Fraccin soluble del lisado bacteriano; 5: Fraccin no unida a la columna; 6: Fraccin del pico de elucin al cambiar la fase mvil a 500 mM imidazol. La flecha indica la banda correspondiente a SIRT1.

La banda mayoritaria en el carril 6 (Fig. 9) correspondera a la SIRT1 recombinante. Esto fue

corroborado por espectrometra de masa MALDI-TOF de la banda proteica mayoritaria. La

banda correspondiente a la SIRT1 presenta una movilidad electrofortica algo inferior a la

esperada para una protena de 81,68 kDa, o sea corre por encima de los 100 kDa.

La SIRT1 co-eluye de la IMAC junto a otras protenas de menor peso molecular (Fig. 9) que se

estaran uniendo inespecficamente a la resina de Ni+2 o mismo podran estar interaccionando

con la propia SIRT1 recombinante.

Para aumentar la pureza de la muestra se procedi a juntar las alcuotas correspondientes al

pico que eluy de la IMAC, aproximadamente 5 ml, y cargar en una columna de gel filtracin

Superdex 16/60 previamente equilibrada con amortiguador C. El perfil cromatogrfico de esta

corrida de exclusin molecular se presenta en la Figura 10. En el transcurso de la gel filtracin

se tomaron alcuotas a los distintos tiempos de retencin y se prepararon para electroforesis,

38

para de esta forma monitorear la composicin de los distintos picos observados en el

cromatograma (Fig. 11).

Figura 10. Perfil de elucin de la cromatografa de exclusin molecular. Se sembraron los 5 ml correspondientes al pico que eluy de la IMAC, en una columna Superdex 16/60 200 pg (GE). Flujo 1 ml/min y deteccin en lnea a 280nm (-). En azul se marcan algunas de las alcuotas recogidas durante la corrida como referencia.

Figura 11. Electroforesis SDS-PAGE.10% del segundo paso de purificacin (exclusin molecular). En los distintos carriles se sembraron muestras de las distintas fracciones (F#) colectadas durante la gel filtracin.

El primer pico que se aprecia en el cromatograma de la Figura 10 (45 ml) eluye en el volumen

muerto de la columna y no se observaron bandas de protena en el SDS-PAGE en el carril donde

40 50 60 70 80 90 1000

20

40

60

80

100

120

140

160

7 12 17 22 27 31 41

600 kDa

189 kDa

Abs

orba

ncia a

280

nm

(mAU)

Volumen de retencion (ml)

39

se sembr una fraccin de este pico (Fig. 10,11). Podemos afirmar que lo que estamos

detectando son molculas de alto peso molecular, que absorben a longitudes de onda cercanas

a 280 nm, pero que no son protenas. Esto nos sugiere que se trata de cidos nucleicos,

presentes en la muestra inyectada en la columna.

A los 50 ml se empieza a constatar la presencia de SIRT1 recombinante como una banda que

migra por encima de los 102 kDa (Fig. 11). Segn la calibracin de la columna Superdex 16/60

(Fig. 12) a este volumen de retencin eluyen protenas de aproximadamente 600 kDa. El

siguiente pico definido (65 ml) y el ms intenso, se corresponde con especies de 189 kDa segn

la calibracin de la columna. En gel se constata la presencia de la hSIRT1 entre los 50 y los 65 ml

de elucin (Fig. 11) lo que est indicando que la protena se comporta como un oligmero en

solucin. Segn el resultado de la gel filtracin, teniendo en cuenta la calibracin realizada para

la columna (Fig. 12) la protena eluye en forma de tetrmero y dmero. La oligomerizacin de

una sirtuina ya se haba reportado para la enzima Hst2 de levadura [49]. En el gel, este pico se

corresponde con las fracciones F27-30 y es donde se observa mayor intensidad de las bandas

que corresponden con la SIRT1 (Fig. 11). Tambin se constata en el gel que es en este pico

donde la protena se presenta con mayor pureza. Luego de los 70 ml, lo que eluyen son

especies de menor peso molecular, como se puede ver en el carril F41 de la SDS-PAGE (Fig. 11).

Figura 12. Curva de calibracin de columna de gel filtracin Superdex 16/60 200 pg. Se realiz una corrida donde se separ una mezcla de estndares de peso molecular (protenas globulares) con ferritina (440 kDa), aldolasa (158 kDa) y conalbmina (75 kDa). A partir de la ecuacin de la recta se pueden estimar los pesos moleculares de las especies que eluyen de la columna.

1000 10000 100000 1000000

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Kav = -0,326(log Mr) + 2,029

Ka

v

log Mr

40

La concentracin proteica de cada alcuota fue medida por Bradford, y el rendimiento

aproximado de la purificacin (con estos dos pasos cromatogrficos) es de entre 1-2 mg de

protena por litro de cultivo.

A las distintas fracciones colectadas se les agrega glicerol hasta alcanzar una concentracin final

del 10% y son almacenadas a -80 oC.

Se realizaron ensayos de actividad enzimtica y concentracin total de protenas para las

distintas alcuotas obteniendo una mayor actividad especfica para el segundo pico (F27-F31,

Fig. 11) y stas fueron las alcuotas empleadas para los ensayos de activadores de la enzima.

2. Anlisis fisicoqumico de la protena purificada

La banda proteica mayoritaria en el gel de poliacrilamida (luego de los dos pasos de

purificacin), que se supone corresponde a la hSIRT1r, fue preparada para analizar por

espectrometra de masa y enviada al Instituto Pasteur para su identificacin por mapeo

peptdico. La Figura 13 A muestra el espectro de masa obtenido en modo reflector positivo

luego de la digestin con tripsina. Utilizando el motor de bsqueda Mascot con la base de

datos local (www.matrixscience.com) se identificaron 21 pptidos de 74, con un score de 145 (>

34 son significativos con p

41

que indica una contribucin de los residuos de tirosina al espectro de fluorescencia de la

protena nativa.

Figura 13. Espectrometra de masa de la protena purificada. A. Se registran los tiempos de vuelo de los pptidos producto de la digestin triptica de la banda que corre en el SDS-PAGE entre 150 y 102 kDa. B.Esquema de la secuencia aminoacidica de SIRT1 donde en rojo se marcan los pptidos producidos en la digestin triptica, segn el anlisis del espectro.

B

A

42

3. Ensayo de actividad de la protena obtenida

Para constatar la funcionalidad de la enzima se realizaron medidas de actividad utilizando el

mtodo fluorescente descripto en Materiales y mtodos. Brevemente el mtodo consta en un

primer paso donde se prepara una mezcla de reaccin incubando a la enzima con el pptido

fluorescente y NAD+, y a medida que se va dando la reaccin se toman alcuotas en el tiempo

en las cuales se detiene la reaccin con el agregado de NAM. El segundo paso consta de la

hidrlisis del pptido desacetilado en la reaccin catalizada por SIRT1, por tripsina, liberndose

AMC cuya fluorescencia es medida en un lector de placas.

En la Figura 15 se muestra el cambio de actividad enzimtica en funcin de la concentracin de

la enzima SIRT1 observndose un aumento lineal de la actividad (Vmax proporcional a la

concentracin de enzima).

Se decide fijar las condiciones del ensayo de actividad para el screening de potenciales

activadores/inhibidores, de la siguiente manera:

Amortiguador Tris 50 mM pH 7.5, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, MgCl2 1 mM, 0,5 % BSA, NAD 500

M, pptido 25 M. Las reacciones se llevan a cabo a 25 C, las alcuotas son tomadas a

distintos tiempos y llevadas a una concentracin final de NAM 5 mM. Luego de tripsinizar por

30 min a 37 C, se procede a medir la fluorescencia del AMC ( ex 360 nm , em 460 nm).

250 260 270 280 290 3000.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

Ab

sorb

anci

a a

28

0 n

m (

UA

)

Longitud de onda (nm)

A

Figura 14. Espectros desorcin y emisin de la protena purificada. A. Espectro de absorcin UV con mximo a = 280 nm. B. Espectros de emisin usando excitacin 280 nm (negro) o 295nm (azul). Los mximos de emisin se dan a = 337nm y = 345 nm, respectivamente.

300 320 340 360 380 400 420

0

1

2

3

4

5

6

Inte

sid

ad d

e fl

uo

resc

enci

a (u

rf)

Longitud de onda de emisin (nm)

ex

280 nm

ex

295 nm

B

43

4. Mtodo cromatogrfico de medida de actividad

Se realizan las medidas de actividad SIRT1 siguiendo la aparicin de producto NAM por HPLC.

Primeramente se puso a punto la separacin de mezclas conteniendo NAD+ y NAM en el menor

tiempo posible para poder disminuir el tiempo de duracin del ensayo. En la Figura 16 se

muestra un cromatograma con el perfil caracterstico de la separacin de una mezcla de NAD+ y

NAM que eluyen a los 3,5 min y los 4,3 min, respectivamente.

Una vez puesto a punto el mtodo de separacin de los nucletidos se procedi a realizar

medidas de actividad con y sin resveratrol. El ensayo de actividad consiste en una mezcla de

reaccin que contiene SIRT1 3 M, NAD+ 500 M, p53mer 130 M. La reaccin se inicia con el

agregado de NAD+ y es llevada a cabo a 37oC. A medida que transcurre la reaccin, se toman

alcuotas y la reaccin es detenida con el agregado de cido trifluoroactico, que adems

acidifica las muestras para la corrida HPLC, neutralizando en parte las cargas negativas del

NAD+. Las alcuotas se filtran (0,22 m) previo a la inyeccin en la columna de fase reversa C18.

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

Activid

ad

(u

rf/m

in)

[SIRT1 ] ( M)

Figura 15. Actividad enzimtica en funcin de la concentracin de SIRT1. Las medidas de actividad fueron realizadas con 500 M NAD

+, 25 M FdLP , amortiguador 50 mM Tris pH 7.5, 137 mM NaCl,

2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,5 % BSA a 25 oC

44

En la Figura 17 se presenta una curva de calibracin realizada para poder cuantificar el NAM

producido en la reaccin de desacetilacin. Se realizaron varias corridas con concentraciones

conocidas de NAM estndar y se integran las reas de los picos donde sta eluye. Con estos

valores se construye la curva de calibracin (Fig. 17 B).

En la Figura 18 se muestran en un mismo par de ejes dos medidas de actividad obtenidas por

HPLC, en presencia y ausencia de RSV 100 M. En la figura se puede ver que las pendientes de

las rectas son muy similares. Utilizando este mtodo de medida de actividad, el RSV no parece

afectar la actividad de la enzima.

0 1 2 3 4 5 6

0

200

400

600

Ab

so

rba

nc

ia 2

20

nm

(m

UA

)

Tiempo (min)

NAD+

NAM

Figura 16. Cromatograma de HPLC para separar y cuantificar NAM. Se utiliz una columna de fase reversa C18, fase mvil amortiguador 20 mM AcNH4, 0-20% MeOH en 5 min, flujo 1 ml/min. Se inyecta una mezcla de NAD

+ y NAM disueltos en el amortiguador de ensayo. [NAD

+]=[NAM]=250 M.

240 245 250 255 260 265

0

40

80

120

160

Ab

so

rba

nc

ia a

22

0 n

m

Tiempo (s)

10 M

20 M

30 M

40 M

50 M

60 M

70 M

80 M

90 M

100 M

Stds. de NAMA

Figura 17. Cuantificacin de nicotinamida (NAM) por HPLC.. A) Se muestran los cromatogramas de las corridas HPLC para varias concentraciones de nicotinamida estndar. A partir de las integrales de estos picos se construye la curva de calibracin (B) A partir de la ecuacin de la recta a la que ajusta la curva es que se calcula el producto.

B

0 20 40 60 80 1000

150

300

450

600

750

Are

a d

el

pic

o (

mU

A*s

)

[NAM] ( M)

y = 6.78 x - 14.2

45

5. Ensayo de compuestos polifenlicos como potenciales moduladores de actividad SIRT1

Para realizar las medidas se utilizaron mezclas de reaccin NAD+ 500 M, FdLP 25 M y SIRT1

750 nM en presencia o ausencia de 100 M de compuesto a ensayar. Se disolvieron los

componentes en Tris 50 mM pH 7.5, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, MgCl2 1 mM, 0,5 % BSA. Las

reacciones se inician con el agregado de NAD+ y se llevaron a cabo a 25oC. Una vez iniciada la

reaccin se toman alcuotas en el tiempo a las que se le mide la intensidad de fluorescencia

luego de detener y la reaccin de desacetilacin con NAM y digerir con tripsina las muestras.

Los valores de intensidad de fluorescencia se grafican en funcin del tiempo y as se construyen

los cursos temporales que se muestran como ejemplo en la Figura 18.

Los compuestos a ensayar fueron todos disueltos primeramente en DMSO a una concentracin

final de 10 mM. Varios de los compuestos no pudieron ser solubilizados en el amortiguador de

ensayo a la concentracin de trabajo utilizada (100 M).

En la Tabla 2 se presentan los resultados de las medidas de actividad para los distintos

compuestos solubles en el amortiguador de ensayo (compuestos 4, 6, 7, 9-13, 15, 17, 18, 21).

Como se aprecia en la Tabla 2, ninguno de los compuestos solubles tuvo capacidad activadora

de la actividad de SIRT1. La mayora de los compuestos no afectaron significativamente la

actividad, o fueron ligeramente inhibidores de la actividad de la enzima. El compuesto 21 y el 7

fueron los que presentaron mayor capacidad inhibitoria. En un trabajo recientemente

publicado donde se testean tambin algunas chalconas y flavanonas, se observa tambin una

actividad inhibitoria [94].

Figura 18. Grficos de velocidad reaccin catalizada por SIRT1 en presencia y ausencia de RSV. Las condiciones de reaccin fueron 3 M SIRT1, 500 M NAD

+, 130 M p53mer, y la reaccin fue llevada a cabo a 37

oC.

100 200 300 400 500 600 700 800

35

40

45

50

55

60

65

70

Ctrol.

+ RSV

[NA

M]

(M

)

Tiempo (s)

46

0 50 100 150 200 250 300

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Inte

ns

ida

d d

e F

luo

res

ce

nc

ia (

urf

)

Tiempo (s)

A

0 50 100 150 200 250 300

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

Inte

ns

ida

d d

e F

luo

res

ce

nc

ia (

urf

)

Tiempo (s)

B

0 50 100 150 200 250 300

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Inte

nsid

ad

de F

luo

rescen

cia

(u

rf)

Tiempo (s)

C Figura 18. Se presentan como ejemplo tres medidas de actividad realizadas con el mtodo fluorescente. Se grafica la corrida control, o sea sin compuesto (rojo), y la corrida en presencia de 100 M del compuesto (negro). A) Resveratrol. B) Compuesto 21. C) Compuesto 10. Las medidas fueron realizadas utilizando pptido sustrato 25 M, SIRT1 750 nM y NAD

+ 500 M, excepto para B donde se

utiliz NAD+ 1 mM.

47

Tabla 2.

1

Insoluble 12

0,65

2

Insoluble 13

0,8

3

Insoluble 14

Insoluble

4

0,84 15

0,84

5

Insoluble 16

Insoluble

6

0,70 17

0,70

7

0,65 18

0,80

8

Insoluble 19

Insoluble

9

0,87 20

Insoluble

10

1,0 21

0,50

11

0,87

48

Conclusiones

49

Se obtuvo a la hSIRT1r en dos pasos cromatogrficos con una alta pureza y buena

actividad enzimtica. El rendimiento de la purificacin no es alto pero se logr obtener

enzima suficiente como para poder realizar las medidas de actividad enzimtica.

La protena se comporta en solucin como un oligomero (dmeros y tetrmeros en

equilibrio).

Se puso a punto una tcnica para la cuantificacin de la nicotinamida producida en la

reaccin de desacetilacin por la SIRT1 mediante HPLC.

A pesar de tratarse tambin de un mtodo de medida de actividad discontinuo se pudo

constatar que la activacin por resveratrol observada con el mtodo fluorescente no se

observa utilizando un sustrato sin la molcula fluorognica unida.

Se ensay la capacidad moduladora de la actividad de hSIRT1 de 12 compuestos, la

mayora flavonoides (chalconas y flavanonas). En general los compuestos testeados no

afectaron sustancialmente la actividad de la enzima, presentando una leve capacidad

inhibitoria.

De los compuestos ensayados el que present mayor capacidad inhibitoria fue la

flavanona 21.

50

Perspectivas

La sobreexpresin de SIRT1 as como su knockdown en distintos sistemas celulares y modelos

animales han sostenido la idea de que SIRT1 no slo participa activamente en la regulacin del

metabolismo de carbohidratos y lpidos sino en la reparacin del ADN, senescencia, muerte y

diferenciacin celular. Se ha focalizado en la regulacin de su actividad como blanco

teraputico de varias patologas, no slo sndrome metablico, diabetes, hgado graso, sino

enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas y cncer. La regulacin bioqumica de

SIRT1 es compleja; se han identificado distintos mecanismos de regulacin pero hay muchos

otros poco explorados. Nos interesa profundizar en las modificaciones oxidativas que puede

sufrir esta enzima, capaces de modular su actividad y su interaccin con otras protenas.

Por otro lado, tenemos una serie de compuestos polifenlicos sintticos (estilbenos y

derivados) cuya capacidad de modular la actividad SIRT1 queremos ensayar y en los casos ms

prometedores, profundizar en el estudio de la interaccin del activador/inhibidor con la enzima

o complejos enzima-protena.

Nos interesa tambin seguir explorando un ensayo de actividad desacetilasa continuo y

sensible, adems del uso de diferentes sustratos peptdicos/proteicos acetilados, en particular,

utilizar histonas acetiladas ya que representan un sustrato ms fisiolgico. En ese sentido, cabe

destacar la importancia de la estructura del sustrato utilizado en el ensayo de actividad para

observar activacin de STACs. Todava no se tiene un mecanismo claro de activacin por estas

molculas pequeas que explique la activacin de SIRT1 in vitro y correlacione con el efecto

indudable observado en clulas e in vivo.

51

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