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Tecnología de Proteínas

Universidad Nacional de Quilmes

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Extracciones proteicas•Ruptura mecánica directa.•Alta presión•Sonicación•Bolitas de vidrio•Soluciones hipotónicas•Detergentes



Centrifugación diferencial



Centrifugación en gradiente



Los aminoácidos y su carga



Isoelectroenfoque



Electroforesis de proteínas – “SDS-PAGE”



Electroforesis de proteínas



Poliacrilamida



SDS-PAGE

¿Porqué vemos las bandas proteicas en el gel?



Geles Bidimensionales



Técnicas que involucran el uso de anticuerpos



Western-Blot



ELISA - Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assays

El objetivo es identificar y cuantificar proteína omoléculas que interaccionen con anticuerpos



ELISA - Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assays



Inmunohistoquímica y citoquímica

Lo dejamos para la clase de MO



Array de proteínas



Inmunoprecipitaciones



Doble híbrido



Cristalografía de rayos X



Cromatografía



Cromatografía de tamiz molecular



Cromatografía de intercambio iónico



Columnas catiónicas: suelenusar residuos sulfonados

Columnas aniónicas: suelenbasarse en residuos de Amonio cuaternario.

Cromatografía de intercambio iónico



Cromatografía de afinidad



Hidrofóbica: pega a través de interacciones hidrofóbicas(CH2S CH2S CH2S CH2S CH2S CH2S)

Con metales: para proteínas que exponen histidinas, cisteínas o grupos carboxilos.(Mercurio para SH2, Hierro para fosfoproteínas)

Cromatografías



• aa• carbohidratos• Peptidos chicos

HPLC



HPLC



Cromatografías



…used for detection and characterization of biomolecules, such as proteins, peptides, oligosaccharides and oligonucleotides, with molecular masses between

400 and 350,000 Da. It is a very sensitive method, which allows the detection of low (10-15 to 10-18 mole) quantities of sample.

MALDI-TOF



Identificación de una proteína por digestión enzimática



1000 2000 3000 4000 5000

1000 2000 3000 4000 5000

1011.chip2.08. 16% gel, tryp control

1012.chip2.09. 16% gel, sample 1+STD

1011.chip2.09. 16% gel, sample 1

0

10

20

30

0

25

50

75

1000 2000 3000 4000 5000

894.

9+H

946.

105

1082

.98

1311

.5+H

1439

.59 15

80.9

3 1709

.08

1815

.45

1886

.2

2847

.5+H

2991

.8+H

3022

.83

3317

.97

3365

.38

3462

.32

3833

.65

3930

.64

Calibrated Internally on 10/12/01 11:59 using 824.4+1H, 1296.49+1H, 2163.3+1H, 2933.5+1H

0

20

40

60

1000 2000 3000 4000 5000Calibrated Internally on 10/18/01 22:31 using 946.1+1H, 1590.8+1H, 2163.3+1H, 3462.32+1H




Secuenciación de Proteínas



HPLC sobre degradación de EDMAN



Intro a los Trabajos Prácticos 3, 4 y 5

TP 3: extracción de proteínas y cuantificación

TP 4: SDS-PAGE

TP 5: western blot



Métodos de cuantificaciónDETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE PROTEINAS:

Absorbancia medida a 280 nm: este es un método rápido y sencillo que puede ser utilizado cuando la concentración es de más de 4 mg/ml, la dificultad es que a esta longitud absorben otras moléculas no-proteicas, como el DNA. Además este método, comparado con los colorimétricos, es menos sensible y requiere mayores concentraciones y debe ser usado con soluciones proteicas puras.

Determinación colorimétrica: las muestras proteicas por lo general consisten de una mezcla de diferentes proteínas, entonces el contenido relativo se basa en la utilización de reactivos que reaccionan con grupos funcionales de las proteínas para dar el reactivo coloreado, donde la intensidad del colorante correlaciona directamente con la concentración de los grupos reactivos y puede ser medida mediante espectrofotometría.

Ensayo de Lowry (750 nm): principalmente se trata de una reacción de rédox con los enlaces peptídicos y con los aminoácidos Tyr, Trp y Cys. Desventajas: es afectado por un amplio rango de compuestos no proteicos como EDTA, sulfato de amonio, Tritón X-100.Bicinchoninine acid assay 562nm (BCA): más sensible, puede ser usado a varias temperaturas, los complejos coloreados son muy estables, pero es altamente susceptible a interferencias entre los que no se encuentran los detergentes lo que lo hace muy conveniente.Ensayo de Bradford (595nm): es el doble de sensible que los dos anteriores con lo cual reacciona a menor concentración de proteínas, es un método rápido y además no presenta interferencia con sustancias reductoras como el DTT y el β-mercaptoetanol, que interfiere con los otros. La desventaja es que es altamente sensible a detergentes, por lo cual se han realizado tablas con coeficientes de corrección con distintas concentraciones de detergentes

TP 3



BSA 1ug/ul (ul) 10 15 20 25 30 35 40 45 50

H2O (ul) 90 85 80 75 70 65 60 55 50

volumen final ul 100 100 100 100 100 100 100 100 100

BSA [ug/ul] 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5

Curva de calibración con BSA

BSA vs A595

y = 1.1967x + 0.1363R2 = 0.9879

00.10.20.30.40.50.60.70.8

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

[BSA] en ug/ul

A59

5 Nm

TP 3



Por cada banda graficar

Log (PM) vs Rf

Rf = Dc/Dt

Dt

Dc

TP 4



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