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Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer

INTRODUCCIÓNLos avances en el campo de la genética molecular están teniendo una

importante repercusión en nuestra capacidad para comprender, diagnosticar

y tratar una varie-

dad de enferme-

dades congénitas

y adquiridas. Así,

la posibilidad de

introducir genes

en células euca-

riotas ha permiti-

do dar comienzo a nuevos protocolos de marcado y de terapia gé-

nica humana (TG), que no resultaban abordables hace unos pocos

años y que en esencia se fundamentan en dos estrategias que se re-

cogen en la Figura 1.

TERAPIA GÉNICA EN ENFERMEDADESMONOGÉNICAS Y CÁNCERJuan A. Bueren1 y Antonio Bernad2

1División de Hematopoyesis y Terapia Génica, CIEMAT2Departamento de Inmunología y Oncología, Centro Nacional de Biotecnología, CSIC

Figura 1: Modalidadesbásicas en las que se

fundamentan losprotocolos de terapia

génica

Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncerBIOTECNOLOGÍA APLICADA6º Curso de

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En términos teóricos existen dos posibilidades técnicas para realizar TG.

En primer lugar podríamos plantear una "terapia de sustitución" en la que el

gen afectado (mutado) fuese sustituido por una versión correcta. Esta aproxi-

mación sería perfecta puesto que el gen introducido se encontraría en su entor-

no natural y bajo los sistemas de control/regulación de la expresión fisiológica.

Sin embargo, debido fundamentalmente al bajo índice de recombinación homó-

loga demostrada en las células eucarióticas (incluidas las de mamífero), esta

aproximación no se plantea en términos prácticos, aunque muchos grupos de

investigación trabajan activamente en el desarrollo de procedimientos para au-

mentar dicho fenómeno (Li J. y Baker M.D., 2000), y se han comunicado algu-

nos intentos con éxito (Hatada et al. 2000). En segundo lugar nos encontramos

con la denominada "terapia de adición", que pretende introducir una construc-

ción de diseño que permita aportar la función génica afectada, generar un cir-

cuito secundario que incida sobre las vías afectadas o promueva una respuesta

fisiológica que elimine las células malignas o defectivas. La mayoría de los

protocolos en desarrollo actualmente utiliza esta alternativa, combinando un

sinfín de posibilidades técnicas que viene principalmente determinado por el ti-

po de afección con la que se enfrenta el equipo de investigación. El resumen

de la experiencia acumulada hasta el momento indica que no existe una fórmu-

la universal de TG. Cada patología, y por ende cada tipo celular afectado, e in-

cluso cada paciente, tiene más posibilidades de éxito con un determinado pro-

cedimiento que con otro, y esto es necesario probarlo en la arena clínica.

En esencia, el proceso de TG puede realizarse tanto in vivo (inoculando el

vector de transferencia en el paciente), como in vitro. En este caso, la transfe-

rencia génica se realiza sobre células extraídas del paciente; las cuales, una vez

modificadas genéticamente, serán reinoculadas en el mismo. En general, los

vectores de transferencia actuales presentan una eficacia de transducción nota-

blemente superior cuando éstos se utilizan in vitro sobre las células diana a

transducir, frente a cuando éstos se inoculan in vivo. Por ello, una gran parte de

los protocolos actuales de TG tienen su fundamento en la obtención, transduc-

ción y reinfusión de las células transducidas. A pesar de ello, los vectores ade-

novirales, y en menor medida los retrovirales, se han comenzado a utilizar in

vivo en protocolos de terapia génica antitumoral, mediante inoculaciones direc-

tas en la masa tumoral del paciente

La revista Journal of Gene Medicine ha reportado que a finales del año

2005 estaban en marcha un total de 678 ensayos clínicos de terapia génica en

fase I; 219 en fases I/II, 147 en fase II y tan sólo 32 en fases II/II ó III. Los

vectores retrovirales y los adenovirales son los vectores de uso más frecuente

en estos ensayos, pues cada uno de estos vectores se está utilizando en un

25% de los protocolos. Le siguen los ensayos en los que se utiliza DNA des-

nudo (16%), lipofección (8%), y el resto está muy repartido entre ensayos

que utilizan vectores adenoasociados, virus vaccinia, y hasta 20 tipos diferen-

tes de vectores.

TERAPIA GÉNICA DE ENFERMEDADES MONOGÉNICAS

Criterios para definir el vector de transferencia a utilizar

El éxito terapéutico de los tratamientos de TG depende fundamentalmente

de dos variables. En primer lugar, resulta necesario insertar eficazmente el trans-

gén en las células diana deseadas. Por otra parte, es también necesario que el

gen se exprese adecuadamente produciendo niveles suficientes de la proteína te-

rapéutica. En el caso de enfermedades metabólicas asociadas a defectos genéti-

cos hereditarios, resulta evidente que la curación de la enfermedad sólo se ob-

tendrá cuando a las células de los tejidos afectados les llegue de manera estable

en el tiempo niveles umbrales de la proteína deficitaria. Una de las aproxima-

ciones más directas para lograr este objetivo es la de transducir la población ce-

lular afectada y/o sus células progenitoras con vectores que permitan la integra-

ción estable del transgén en el genoma celular. En los protocolos clínicos

diseñados al efecto, se han utilizado fundamentalmente vectores retrovirales, en

particular los derivados del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV).

En un grupo significativo de aplicaciones clínicas –por ejemplo las relacionadas

con la terapia de la hemofilia– se ha comenzado a hacer uso de vectores adeno-

asociados (AAV). Tal como ocurre con los vectores retrovirales, estos vectores

permiten la inserción estable del transgén, si bien en este caso suelen ser varias

las copias integradas, con lo que parece que se consiguen mayores niveles de

expresión del transgén en las células diana. Los vectores lentivirales constituyen

también una herramienta ya considerada para su uso en protocolos clínicos de

TG humana, ya que mediante estos vectores se facilita la integración del trans-

gén en células poco o nada proliferativas, con lo que se confía poder transducir

de manera muy eficaz las células madre de los diferentes tejidos.

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El esquema básico seguido en

estos ensayos clínicos es el que se

muestra en la Figura 2. Las células

de la médula ósea del paciente se

extraen de la médula ósea, se purifi-

can y se translucen con los vectores

terapéuticos. Finalmente, la pobla-

ción conteniendo células madre co-

rregidas genéticamente son infundi-

das en el paciente, el cual en

ocasiones puede haber recibido un

tratamiento submieloablativo para

facilitar el prendimiento del inóculo.

Principales enfermedades monogénicas que son objetode terapia genética

Hasta que los laboratorios de genética molecular ofrezcan alternati-

vas eficaces para el tratamiento de mutaciones dominantes, el tratamiento

genético de las enfermedades metabólicas se está centrando en la terapia de muta-

ciones monogénicas recesivas, en las cuales la expresión de una copia funcional del

correspondiente transgén pueda ser suficiente para la curación de la enfermedad.

En aquellas patologías metabólicas en las que no resulta posible, o no es

del todo eficaz la administración exógena de la proteína deficitaria, se han plan-

teado alternativas de terapia celular o génica sobre estos pacientes. En relación a

los protocolos clínicos de terapia celular, del orden de treinta enfermedades me-

tabólicas pueden ser tratadas mediante trasplante de progenitores hematopoyéti-

cos procedentes de donantes histocompatibles sanos. No obstante, debido a las

limitaciones de donantes histocompatibles y a los riesgos asociados al trasplante

alogénico, una larga serie de enfermedades metabólicas monogénicas han sido

consideradas para su tratamiento mediante la transferencia del gen deficitario en

las células que manifiestan la patología.

De todos los protocolos de TG de enfermedades asociadas a defectos mono-

génicos, a continuación se muestra el fundamento de algunos de los que han sido

más relevantes, bien por su relevancia histórica, por su eficacia terapéutica o por

las expectativas generadas.

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Figura 2: Esquema básicodel protocolo utilizadopara la terapia génicade enfermedadeshematopoyéticashereditarias

Inmunodeficiencias genéticas

Entre las inmunodeficiencias

consideradas para su tratamiento

genético son de destacar las inmu-

nodeficiencias severas combinadas

asociadas a mutaciones en los genes

de la Adenosina Deaminasa (ADA)

y la inmunodeficiencia SCID-X1.

La ausencia de la ADA implica

una acumulación del sustrato desoxiadenosina trifosfato en las células,

resultando particularmente tóxico para los linfocitos T (Figura 3). Ésta

fue una de las primeras patologías en ser tratadas mediante protocolos

de TG con vectores retrovirales, primero en el NIH de Estados Unidos

(Blaese et al., 1995; Khon et al., 1998), y luego en el Hospital S. Raf-

faelle de Milán (Bordignon et al., 1993; 1995; Ferrari et al., 1992; Aiu-

ti et al 2002). Las dos alternativas que se han considerado para el tratamiento ge-

nético de esta enfermedad estuvieron basadas en la transferencia del gen ADA en

las células T de pacientes y también en células madre hematopoyéticas (CMH).

En todos los casos se comprobó la pre-

sencia de células transducidas en los pa-

cientes y evidencias de mejora en su in-

munocompetencia. Muy recientemente

se ha comunicado que pacientes con de-

ficiencia de ADA que fueron acondicio-

nados con protocolos poco agresivos y

trasplantados con células de médula

ósea corregida genéticamente han podi-

do hacerse independientes de la admi-

nistración exógena del ADA bovino y

recuperado su función inmune (Aiuti et

al 2002).

La inmunodeficiencia SCID-X1 representa aproximadamente la

mitad de todas las inmunodeficiencias severas y está asociada a un

defecto en la cadena γc, una proteína que forma parte de numerosos

receptores de interleuquinas (Figura 4). La TG de estos pacientes se

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Figura 3:Inmunodeficiencia

severa combinada ADA

Figura 4: Defectivaseñalización por

receptores de citoquinasen la inmunodeficiencia

X1-SCID

ha realizado mediante la

transferencia de la ver-

sión funcional del trans-

gén a CMHs, utilizando

para ello técnicas opti-

mizadas de transferen-

cia retroviral. Las

CMHs se han trasplan-

tado a once pacientes

no acondicionados, ha-

biéndose observado en

diez de ellos la apari-

ción de células del sis-

tema inmune contenien-

do el transgén y una

evidente mejoría clínica

de los pacientes, que les

permitió abandonar las unidades de aislamiento a las pocas semanas

del tratamiento (Cavazzana-Calvo et al., 2000).

Se considera que este protocolo, desarrollado en Francia por el

grupo de A. Fischer, es el primer protocolo de TG de una enfermedad metabó-

lica que ha demostrado una eficacia terapéutica incuestionable. Desgraciada-

mente, dos de los once pacientes actualmente tratados han desarrollado una

leucemia linfocítica como consecuencia de la activación del oncogén LMO2 en

las células que habían incorporado el gen terapéutico. Esta observación supone,

por tanto, también el primer efecto patogénico asociado a una inserción retrovi-

ral en un paciente, y pone de manifiesto la necesidad de evaluar el delicado

equilibrio beneficio/riesgo asociado a la práctica de la TG insercional (Hacein-

Bey-Abina et al 2003) en cada indicación clínica.

La granulomatosis crónica constituye otra inmunodeficiencia que ha recibido

atención particular para su tratamiento genético. Esta enfermedad se caracteriza por

un fallo por parte de las células fagocíticas para generar el anión superóxido, por lo

que se manifiesta mediante un síndrome recurrente de infecciones y formación de

granulomas (Figura 5). Estudios experimentales sugieren que la corrección genética

de aproximadamente un 5% de los granulocitos circulantes será suficiente para re-

portar un beneficio terapéutico (Malech et al., 1999). Los estudios clínicos basados

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Figura 5: Granulomatosiscrónica

en el trasplante de células

CD34+ transducidas sobre pa-

cientes no acondicionados no

han mostrado beneficio tera-

péutico. No obstante, un ensa-

yo clínico comenzado en Ale-

mania con pacientes sometidos

un acondicionamiento modes-

to con busulfán ha evidencia-

do mejoría clínica en los dos

pacientes tratados.

Como conclusión a los

estudios realizados para tratar

genéticamente pacientes con

enfermedades monogénicas, la Figura 6 muestra el número de pacien-

tes con inmunodeficiencias severas, así como los que han mostrado

evidencias de mejoría clínica. De estos estudios se pone de manifiesto

que existe un número de enfermedades monogénicas, para las cuales la

terapia génica comienza a ser una realidad terapéutica. En este mo-

mento son las cuestiones de seguridad las que limitan el mayor desarrollo de es-

tos ensayos en la clínica (Ver apartado “Seguridad en terapia génica”).

Enfermedades de acumulación de sustratos tóxicos

Un número relativamente elevado de genes se ha asociado a este tipo de en-

fermedades. De entre todas ellas, la enfermedad de Gaucher es la más frecuente,

por lo que ésta es la enfermedad de acumulación lisosomal que ha sido objeto de

más estudios de TG. La enfermedad de Gaucher está asociada a una deficiencia

en glucocerebrosidasa (GC), por lo que se presentan importantes acumulaciones

de glucocerebrósido en macrófagos y en células derivadas de los mismos, produ-

ciéndose patologías de la médula ósea, hígado, bazo y cerebro. Para que la TG de

esta patología sea eficaz se requerirá, por tanto, que las células corregidas alcan-

cen órganos hematopoyéticos y no hematopoyéticos. En particular, para el trata-

miento de la patología que afecta a la microglía del sistema nervioso central, será

necesario que las células modificadas genéticamente migren al SNC y confieran

allí el efecto necesario sobre la manifestación neurológica. Hasta el momento se

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Figura 6: Beneficio clínicode pacientes con

inmunodeficienciascongénitas tratados con

terapia génica

han realizado pocos estudios piloto, aunque los mismos se encuentran todavía en

fases tempranas de estudio clínico. Otras enfermedades de acumulación de sustra-

tos, tales como la mucopolisacaridosis de tipo II (síndrome de Hunter), han recibi-

do atención para su tratamiento genético, aunque su desarrollo no se encuentra tan

avanzado como en el caso de la enfermedad de Gaucher.

Hemofilia

Tanto la hemofilia A, producida como consecuencia de un defecto en la pro-

ducción del Factor VIII de coagulación, como la hemofilia B, asociada al defecto

en el factor IX, han sido consideradas para su tratamiento por TG. Un estudio clí-

nico reciente (Kay et al., 2000) ha mostrado las primeras evidencias de eficacia clí-

nica asociada al tratamiento con vectores AAV que codifican el factor IX. En este

estudio, los vectores AAV se inocularon en el músculo de pacientes de hemofilia

B, obteniéndose resultados que sugieren que la hemofilia B podría transformarse

en una enfermedad más leve mediante la aproximación genética propuesta.

Enfermedades asociadas a defectos en la hemoglobina

La talasemia β y la anemia falciforme constituyen las dos patologías de

este grupo más estudiadas para su tratamiento mediante TG. Constituyen las

dos enfermedades monogénicas más frecuentes, y su patología molecular ha si-

do ampliamente investigada. El remplazamiento de la globina β , defectiva o

ausente en pacientes con talasemia β, puede ser curativa. Los altos niveles de

expresión del gen que codifica la globina γ normal en las células eritroides de

pacientes con anemia falciforme, se confía que sea beneficiosa, debido al en-

samblaje preferente de los tetrámeros α y γ, y la relativa inestabilidad de las

cadenas βs. La TG de esta enfermedad requerirá, sin embargo, muy altos nive-

les de expresión del transgén, lo cual supone una tarea todavía pendiente.

Anemia de Fanconi

La anemia de Fanconi (AF) es una enfermedad autosómica recesiva poco

frecuente entre la población, pero de muy mal pronóstico. Los pacientes suelen

desarrollar anomalías congénitas múltiples (en un 65% de los casos), fallo de

médula ósea y predisposición a cáncer. De promedio, la manifestación de la apla-

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sia se observa alrededor de los 8 años de edad, siendo la supervivencia media de

estos pacientes de 16 años. Una de las características de esta enfermedad que la

hacen particularmente apropiada para su tratamiento por TG radica en la ventaja

selectiva que parecen tener las células corregidas, respecto a las células defecti-

vas en los genes de Fanconi. La AF es consecuencia de mutaciones o deleciones

en cualquiera de los ocho genes que en la actualidad se sabe están implicados en

una función celular relacionada con la estabilidad del genoma de estas células.

Los resultados publicados sobre los ensayos realizados en fase I no manifiestan

beneficios terapéuticos evidentes (Liu et al., 1999). No obstante, nuevos ensayos

con protocolos optimizados de transducción están actualmente en marcha.

Fibrosis quística

El gen de la fibrosis quística (FQ) está localizado en el cromosoma 7 y posee

un tamaño de 6,7 kB. En un 75% de los pacientes enfermos de FQ, la enfermedad

se produce por un defecto en la posición 508. Como consecuencia de las deficien-

cias de este gen se produce una alteración física y química de las secreciones de

las vías respiratorias y de las enzimas pancreáticas. Como consecuencia del defec-

to en el transporte del cloro entre las células, las mucosidades se hacen muy den-

sas, dificultando la expulsión del moco bronquial y facilitando su infección con

patógenos difíciles de eliminar. La TG prioritaria de esta enfermedad radica en la

inserción del gen de la FQ en las células respiratorias. Hasta la actualidad se han

desarrollado diversos ensayos clínicos en fase I utilizando vectores adenovirales,

adenoasociados y liposomas (Alton et al., 1998). Los protocolos con vectores ade-

novirales han mostrado ventajas respecto a su eficacia de transducción de las célu-

las diana; sin embargo, también han puesto de manifiesto su inmunogenicidad, al

haberse generado anticuerpos que neutralizaron la eficacia de los vectores adeno-

virales. Es de esperar que los protocolos actuales, con vectores menos inmunogé-

nicos y más eficaces, faciliten la mejoría clínica de estos pacientes.

TERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER (TGC)

En los años 60 y 70 se sucedieron las primeras propuestas teóricas para el

tratamiento de enfemedades humanas mediante la introducción de material gené-

tico en los órganos o células afectados. En 1968 se reportó el primer experimento

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en el que se utilizó un virus oncogénico modificado como transportador de mate-

rial genético potencialmente terapeútico (Rogers S. y Pfuderer P. 1968). Hubo

que esperar al año 1979 hasta que apareciera el primer modelo animal (Andreson

W.F. y Fletcher J.C. 1979), lo que catapultó la investigación general en el área.

Sin embargo, la aplicación al campo de la terapia en cáncer se retrasó hasta el

año 1987, cuando se abordó el tratamiento de leucemias (Howell et al. 1987;

Merz, B. 1987; Bank et al. 1987).

Biología molecular del cáncer

El principal problema al que se enfrenta la TGC es que, en sus formas

más habituales, no se trata de una enfermedad monogénica y las células cance-

rígenas presentan un gran número de anomalías genéticas y cromosómicas. Por

tanto, las filosofías y formas de trabajo habituales en el campo, más centradas

en conseguir una mayor eficiencia de transducción en los órganos diana, es só-

lo una parte del problema en la TGC.

En base a esta premisa general, ha si-

do necesario avanzar en el conocimiento

molecular y fisiológico del enemigo a ba-

tir, antes de contar con herramientas sufi-

cientemente eficaces para afrontar el reto

que supone conceptualmente. Actualmen-

te, y contando con que en cada tipo de tu-

mor humano los circuitos implicados prin-

cipales pueden ser distintos, conocemos

varios principios de la fisiología tumoral

sobre los que poder incidir con garantías

razonables de éxito. Las principales vías

afectadas (en solitario o en combinación)

en los tumores humanos (Hanahan, D. y

Weinberg, R.A., 2000), y en las que se

conocen genes importantes, son las si-

guientes (ver Figura 7).

1) Bloqueo de los programas de muerte celular programada.

2) Insensibilidad a señales antiproliferativas.

3) Generación de circuitos de supervivencia alternativos.

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Figura 7: Basesmoleculares del cáncer.Adaptada de Hanahan(2000)

4) Proliferación descontrolada.

5) Invasividad y metástasis.

6) Inducción de angiogénesis asociada al desarrollo de tumores sólidos.

Todas estas vías pueden cooperar sin solución de continuidad y dependien-

do del tumor humano concreto, de forma casi aleatoria (al menos poco predeci-

ble), por lo que ha sido necesario acumular esta información, antes de poder

realizar un diseño terapéutico racional. Esta situación se resume en varias si-

nergias bien caracterizadas en tumores humanos.

Este desarrollo ha llevado a un cambio conceptual del "tumor", asumiéndo-

se actualmente que se trata de un nuevo "tejido", con necesidades fisiológicas

específicas. Frente a la visión "reduccionista" del tumor, asumiendo que es un

conjunto de células, relacionadas clonalmente pero heterogéneas por su inestabi-

lidad génica intrínse-

ca, la nueva visión

emergente entiende el

tumor como un "neo-

tejido" en constante

evolución, con unas

necesidades cambian-

tes, tanto en términos

metabólicos como

protectores. El tumor

genera señales y sus-

tancias que "manipu-

lan" su entorno fisio-

lógico en su propio

beneficio; se está ju-

gando su propia supervivencia. Los tumores primarios crecen autóno-

mamente hasta que sus necesidades nutricionales les obliga a reclutar

más recursos. Este es un momento crítico (denominado angiogenic

switch) en el que el tumor se estructura atrayendo células de soporte,

promueve la neovascularización de su entorno (angiogénesis) y atrae

células inmunes circulantes y las estimula para que secreten metaloproteasas

(p.e.) para favorecer su expansión y extravasación (Figura 8).

En cada una de las vías anteriormente descritas se conocen algunos de los

mediadores o reguladores moleculares principales (master genes) sobre los que

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Figura 8: El tumor comoun tejido complejo.

Adaptada de Hanahany Weinberg (2000)

se plantean las distintas aproximaciones terapéuticas. Dependiendo de cuál sea

la vía principal y cuál el mecanismo molecular afectado, los argumentos y es-

trategias terapéuticas son diferentes. A modo de ejemplo, ya que es imposible

ser exhaustivo en el marco de este capítulo, mencionaremos las principales es-

trategias desarrolladas y los protocolos técnicos asociados.

Terapia génica del cáncer

Lo primero a tener en cuenta es que los tratamientos clínicos contra el cáncer

son tremendamente eficaces, eliminando un altísimo porcentaje de las células ma-

lignizadas. Los problemas fundamentales derivan bien de la agresividad de los tra-

tamientos, de la aparición de quimiorresistencias cruzadas, o bien de la existencia

de pequeños focos que no se eliminan y que pueden dar lugar a la reaparición de

los procesos neoplásicos. En la actualidad, la mayoría de los procedimientos desa-

rrollados en base a la utilización de TGC distan mucho de ser capaces de sustituir

a los tratamientos clí-

nicos actuales, aunque

pueden aspirar a com-

binarse con ellos.

La Figura 9 pre-

senta de forma muy

esquemática las prin-

cipales estrategias,

agrupadas de acuerdo

con las distintas vías

implicadas en la trans-

formación tumoral.

En términos ge-

nerales, si el princi-

pal proceso afectado

es la eliminación de

los mecanismos de

control negativo de la proliferación, se intentan introducir versiones

correctas de estos genes (p.e. los genes p53 o p16; Chen y col, 2000;

Swisher S.G. y Roth, J.A., 2000; Cowen et al., 2000; Kawacabe et

al., 2000). Si el defecto consiste en la resistencia a los mecanismos

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Figura 9: Definiciónde dianas en terapiagénica antitumoral.Adaptada de hanahany Winberg (2000)

naturales de inducción de muerte celular programada, se intentan expresar ge-

nes que la pueden promover o hacerla más efectiva (caspasas, FasL, etc). Un

buen ejemplo es el tratamiento de gliomas mediante la expresión de caspasa-8

con vectores adenovirales (Shinoura et al., 2000) Si el tumor es muy depen-

diente de la inducción de neovascularización o es muy propenso a metastatizar,

se introducen genes que puedan bloquear o disminuir dichos procesos (VEGF-

R, análogos de angiostatina, moduladores de integrinas o metaloproteasas, etc;

Chen et al., 2000; Carmeliet, 2000; Abruzzese et al., 2000).

Los procedimientos empleados para realizar la transferencia génica son

muy variados y dependen fundamentalmente de la biología y fisiología del tu-

mor, pero esta etapa es crítica para el resultado final del tratamiento. Se emple-

an vectores virales (adenovirus, adeno-asociados, virus herpes, retrovirus, y

vectores derivados de lentivirus), vectores no-virales (liposomas, dendrímeros,

péptidos, bombardeo con micropartículas de oro que transportan las construc-

ciones génicas, etc), y el procedimiento puede ser in vivo o ex vivo.

Como es imposible en esta presentación hacer una revisión exhaustiva de

todo el panorama en desarrollo del área, nos restringiremos a aquellas aproxi-

maciones más específicas del campo o aquéllas que más se han desarrollado.

Una rama especialmente desarrollada en la TGC es la introducción de ge-

nes pro-citotóxicos en las células tumorales (fundamentalmente la timidina ki-

nasa del virus herpes-HSV-TK-, y la proteína citidin-deaminasa -CDA-) lo que

las susceptibiliza a distintos compuestos (el más empleado es el ganciclovir,

GCV) de forma diferencial con respecto a las células sanas. La administración

de estas sustancias al modelo animal o al paciente, elimina las células tumora-

les transducidas y aquellas que se encuentran en sus cercanías por un fenóme-

no conocido como "bystander", que está mediado por la transferencia de la

droga metabolizada a las células circundantes.

Dos son los modelos tumorales que más atención han recabado de las ex-

pectativas de la TGC, y lógicamente, son los tumores que peor pronóstico pre-

sentan con los tratamientos clínicos actuales: glioma maligno y melanoma

avanzados. El tratamiento de gliomas ha sido evaluado por numerosos autores

(revisado por Klatzman et al., 1998), obteniendo resultados variables. Sandmair

y col, han comparado la eficiencia del tratamiento, bien utilizando vectores re-

trovirales, bien con adenovirus (Sandmair y col, 2000). Sus resultados demues-

tran claramente que los efectos secundarios del tratamiento son aceptables, y

que los pacientes tratados con vectores adenovirales han mostrado una duplica-

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ción del tiempo de supervivencia (MRI), 15.0 meses, en comparación con los

pacientes tratados con vectores retrovirales, 7.4 meses y el grupo control, 8.3

meses.

De 1998 a febrero de 2000 se han hecho públicos varios estudios clínicos

(Fase I/II) para el tratamiento de pacientes con melanoma cutáneo maligno y

metastático, mediante la administración intra-lesión de vectores adeno expre-

sando HSV-TK en combinación con dosis escaladas de ganciclovir (Klantzman

et al., 1998; Morris et al., 2000). En estos estudios se pretende determinar la

dosis máxima de GCV que puede ser administrada en combinación con la ad-

ministración autorizada del vector, evaluar la tasa terapéutica objetiva del ensa-

yo y determinar si existe efecto "bystander" en otras localizaciones lejanas al

punto de tratamiento.

Esta estrategia es bastante efectiva, aunque todavía presenta algunos in-

convenientes como los derivados de: 1) aparición de células tumorales resisten-

tes al tratamiento, 2) eficiencia del proceso de transferencia y 3) generación de

inmunogenicidad por la expresión de una proteína de origen bacteriano (TK).

De forma adicional existe una rama casi exclusiva de la TGC que lidia

con mejorar la respuesta inmune del organismo frente a los tumores (inmunote-

rapia bioquímica y/o celular). En esta aproximación se utilizan también distin-

tas aproximaciones, que se pueden resumir en las siguientes:

1) Aislamiento, amplificación ex vivo, modificación génica (en algunos

casos) y retrasplante en el paciente de linfocitos autólogos del paciente (TILs,

LAKs, ALTs) que presentan afinidad por el tumor (Weijtens et al., 1998; Bol-

huis R.L. y Gratama J.W., 1998).

2) Inmunización con DNA de oncogenes tumor-específicos (p.e - neu en

el caso de cáncer de mama-; Reilly et al., 2000; Amici et al., 2000).

3) Generación de vacunas autólogas, utilizando células tumorales inactiva-

das, primando células dendríticas (revisado por Kirk C. y Mule J., 2000), o po-

tenciando la inmunogenicidad de las células tumorales mediante la introduc-

ción de genes que favorecen el proceso (HGFs, ILs, moléculas accesorias, etc).

Ésta es una de las aproximaciones más evaluadas, con distintas filosofías. Mi-

ller y col ha demostrado que la administración intratumoral de células dendríti-

cas modificadas con adenovirus que expresan IL-7, aumenta la respuesta inmu-

ne antitumoral (cáncer de pulmón) hasta conseguir su erradicación (Miller et

al., 2000). El tratamiento del melanoma también se ha intentado mediante téc-

nicas de vacunación. Osanto y col. han publicado el tratamiento con éxito de

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33 pacientes afectados por melanoma matastático, mediante su vacunación con

una línea celular de melanoma alogénica, manipulada para producir IL-2

(Osanto et al., 2000). Otros autores han tratado cinco pacientes con células tu-

morales autólogas transducidas para que secreten GM-CSF (Chang et al.,

2000), demostrando una remisión total en uno de los pacientes.

Cualquiera de estas aproximaciones presenta la gran ventaja respecto a los

tratamientos más convencionales de que, al menos teóricamente, sería capaz de

alcanzar los reservorios residuales del tumor (santuarios), que no son elimina-

bles por las terapias convencionales (cirugía, quimio y radioterapia), por lo que

los tratamientos más prometedores podrían ser utilizados en combinación con

los que actualmente se utilizan en clínica. Desde mi modesta opinión, estas

aproximaciones parecen las más realistas y prometedoras para aumentar el ar-

senal terapéutico en la lucha contra el cáncer.

Finalmente se han introducidos nuevos vectores virales citotóxicos con

una particularidad esencial: se replican y amplifican preferentemente en las cé-

lulas tumorales (conditional replication-competent vectors). Actualmente exis-

ten varios modelos preliminares (Alemany et al., 2000; Rancourt et al., 1999)

que necesitarán una posterior etapa de refinamiento y de bioseguridad, pero

que son muy interesantes. En este último estudio se ha desarrollado un modelo

para controlar la producción de partículas infecciosas tras la infección con un

vector adenoviral (Ad5dl312) al que se le había delecionado la función E1A, y

sustituido por una función de síntesis activada por IL-6. La generación de par-

tículas infecciosas depende de la producción celular de IL-6, por lo que el mo-

delo terapéutico tiene un gran interés en tumores que poseen un ciclo autocrino

de IL-6, como el cáncer de ovario.

Una variante de esta última aproximación, que todavía se encuentra en fa-

se de desarrollo, es la utilización de vectores retrovirales replicativos (RRV).

Solly y col. han publicado recientemente un primer estudio en el que comparan

la eficacia de transducción in vivo de los RRV (>85%) en comparación con los

vectores convencionales (<1%), para modificar masas tumorales desarrolladas

en modelos animales inmunocompetentes; los autores proponen el uso de estos

modelos para el tratamiento de tumores cerebrales en los que han demostrado

una eficiencia 1000 veces mayor que los adenovirus deficientes en replicación

(Solly et al., 2003). Si se consiguen derivar vectores RRV condicionales se ob-

tendrá una nueva valiosa herramienta para la lucha contra el cáncer mediante

técnicas de manipulación genética.

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LA SEGURIDAD EN TERAPIA GÉNICA

Problemas ocurridos en el tratamiento de la deficiencia de laOrnitín Transcarbamilasa

Esta es una enfermedad en la que los pacientes carecen de una enzima cla-

ve del metabolismo de aminoácidos –la Ornitín Transcarbamilasa (OTC)–, lo

que da lugar a una acumulación potencialmente fatal de amoniaco en la sangre.

Puesto que la actividad OTC está normalmente presente en el hígado, se consi-

dera que éste es el tejido diana de vectores que expresen la versión correcta del

gen OTC. En virtud de la eficacia de los adenovirus para infectar células hepá-

ticas, se propuso utilizar tales vectores para transducir las células hepáticas de

estos pacientes con el gen OTC. Estudios in vitro, y también en animales de

experimentación, mostraron la eficacia del protocolo propuesto. El tratamiento

de 17 pacientes con dosis progresivamente crecientes del vector no manifestó

efectos tóxicos severos. No obstante, en uno de los pacientes tratados con la

dosis más alta se manifestó un proceso febril seguido de inflamación hepática

y aumento descontrolado de los niveles de amonio, dando lugar a la entrada en

coma del paciente. Lamentablemente, el paciente falleció poco después, estan-

do todavía en investigación la causa primaria de su muerte. El fallecimiento de

este paciente como consecuencia de la inoculación del vector viral disparó las

alarmas de los organismos reguladores, principalmente en lo que se refiere a la

inoculación in vivo de vectores de la familia de los adenovirus. En la actuali-

dad se han generado nuevos vectores adenovirales desprovistos de la mayor

parte del esqueleto viral implicado en la inmunogenicidad de los mismos, por

lo que se confía que su uso prevenga de la generación de respuestas inmunogé-

nicas no previstas.

Incidencia de leucemias en pacientes X1-SCID tratadosmediante terapia génica

Desgraciadamente, tres de los diez pacientes X1-SCID que han sido trata-

dos en el Hospital Necker mediante terapia génica han desarrollado leucemias

asociadas a la inserción del gen terapéutico en la proximidad de oncogenes

(Hacein-Bey-Abina et al 2003). De particular significado ha sido la observa-

116


ción que en dos de estos pa-

cientes la inserción se ha ob-

servado próxima al oncogén

LMO2, implicado en leuce-

mias linfocíticas. Como se

recoge en la Figura 10, en

ninguno de los otros proto-

colos en marcha, ni tampoco

en los pacientes X1-SCID

tratados en Londres, se han

observado efectos adversos

severos similares.

El conocimiento de las

bases moleculares por los

cuales se han producido las leucemias en estos pacientes aún está por

resolver. No obstante, estas evidencias sugieren la conveniencia de

proseguir los trabajos que tienen por objeto mejorar la seguridad de

los vectores dirigidos a tratar pacientes con esta nueva aproximación

terapéutica.

Como también sucedió con la quimioterapia o la radioterapia,

los primeros efectos severos adversos asociados a la terapia génica

también han quedado ya de manifiesto. En los próximos años los investigado-

res habrán de ser capaces de demostrar que la relación entre el beneficio clíni-

co y el riesgo asociado a la terapia génica es positiva para el paciente. Este he-

cho repercutirá en la expansión de una nueva herramienta terapéutica para

pacientes que no tienen otra opción terapéutica eficaz.

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