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TRABAJO FIN DE GRADO
Tıtulo: Determinacion de polifenoles en infusiones mediante analisis
por inyeccion en flujo.
Autor: Maria Sandra Reyes Ballesteros
Tutor: Adolfo Narros Sierra, Maria Isabel del Peso
Departamento: Departamento de Ingenierıa Quımica Industrial y del Medio
Ambiente
UNIVERSIDAD POLITECNICA DE MADRID
ESCUELA TECNICA SUPERIOR DEINGENIEROS INDUSTRIALES
TRABAJO FIN DE GRADO
Maria Sandra Reyes Ballesteros
Julio de 2017
Resumen
El presente TFG ha tenido como objetivo principal el montaje de un sistema de analisis
por inyeccion en flujo y el analisis mediante el mismo del contenido de polifenoles en te verde,
te blanco y Rooibos.
Los polifenoles encontrados en estos tes son considerados como beneficiosos para la salud, de ma-
nera que la cuantificacion de los mismos es objeto de numerosos estudios. Para la determinacion
de la cantidad de polifenoles totales se empleo el metodo de Folin Ciocalteu.
El montaje del sistema ha consistido en un montaje sencillo con dos canales por lo que se
circulan el portador (Reactivo de Folin Ciocalteu) y el reactivo (NaOH), la muestra se inyecta
en el canal 1(por el que circula el portador) y posteriormente este confluye con el canal 2 (por
el que circula el reactivo) la mezcla de ambos pasa al reactor y el producto de la reaccion llega
al analizador.
Tras la fase de montaje se llevaron a cabo vayos ensayos previos utilizando agua como
portador y reactivo y tinte azul como muestra, de esta forma se comprobo que no existıa ninguna
fuga o mal sellado que permitiera la entrada de aire al sistema, ası como la velocidad a la que
habıa de operarse la bomba para trabajar con un caudal optimo.
Finalmente se realizaron los analisis de los tes mencionados, obteniendose que la mayor
cantidad de polifenoles aparece en el te verde seguido del te blanco y por ultimo el Rooibos.
Se comprobo la utilidad y la fiabilidad del analisis por inyeccion en flujo.
Palabras clave: Analisis Por inyeccion en flujo, Polifenoles , Folin Ciocalteu
Codigos UNESCO: 2301 Quımica Analıtica 230691; Quımica Organica. Analisis Instrumental;
330903 Antioxidantes en Los Alimentos
V
Acronimos
FIA: Analisis por inyeccion en flujo
SFA: Analisis por flujo segmentado
PT: Polifenoles totales
EGCG: Epigalocatequin galato
VII
Glosario
flavonoides: Pigmentos naturales que se encuentran en las plantas y poseen actividad
antioxidante.
catequinas: Nombre que se le da a cierto subgrupo de la familia de los flavonoides con
una estructura determinada.
polifenoles: son sustancias que se encuentran en plantas y poseen mas de un grupo fenol,
son polifenoles tanto los flavonoides como las catequinas.
fitoquımicos: sustancias que se encuentran en las plantas y se consideran positivas para
la salud aun sin ser esenciales, en este trabajo se refiere a polifenoles.
especies de oxıgeno reactivo: iones de oxıgeno, radicales libres y peroxidos tanto
inorganicos como organicos.
IX
Indice general
Resumen V
Acronimos VII
Glosario IX
Contenidos XI
Indice de figuras XV
Indice de tablas XVII
1. Introduccion 3
2. Estado del arte 5
2.1. Analisis por inyeccion en flujo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2.2. Consumo de Te . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.2.1. Te verde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.2.1.1. Efectos antioxidantes del te verde . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.2.2. Te blanco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.2.3. Rooibos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.3. Determinacion del contenido de Polifenoles totales. Metodo de Folin-Ciocalteu . . 12
3. Objetivos 15
4. Metodologıa Experimental 17
XI
4.1. Montaje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
4.2. Puesta en marcha y funcionamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
4.2.1. Obtencion de rectas de Calibrado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
4.3. Montaje FIA con un canal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
5. Resultados y discusion 31
5.1. Introduccion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
5.2. Te verde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
5.2.1. Estudio de la temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
5.2.2. Estudio del tiempo de extraccion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
5.2.3. tiempo de reposo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
5.3. te blanco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
5.3.1. segundo calibrado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
5.3.2. Estudio de la temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
5.3.3. Estudio del tiempo de extraccion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
5.3.4. Estudio del tiempo de reposo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
5.4. Rooibos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
5.4.1. tercer calibrado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
5.4.2. Estudio de la temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
5.4.3. Estudio del tiempo de extraccion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
5.4.4. Estudio del tiempo de reposo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
5.5. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
6. Conclusiones 57
6.1. Estudio de las condiciones de extraccion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
6.2. Contenido de Polifenoles Totales (ındice PT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
7. Lıneas futuras 61
8. Planificacion temporal y presupuesto 63
Bibliografıa 68
Indice de figuras
2.1. Configuraciones SFA y FIA Fuente: Analisis por inyeccion en flujo: herramienta
clave para la automatizacion analıtica, Marıa del Pilar Canizares Macıas . . . . . 6
2.2. Senal obtenida en una configuracion FIA. En la parte superior aparece la dis-
persion de la muestra Fuente: Analisis por inyeccion en flujo: herramienta clave
para la automatizacion analıtica, Marıa del Pilar Canizares Macıas . . . . . . . . 7
2.3. montaje FIA de dos canales Fuente: Flow Injection Analysis [1] . . . . . . . . . 8
2.4. Mecanismo de accion del reactivo de Folin-Ciocaltu Fuente: Determinacion de
polifenoles totales por el metodo de Folin-Ciocalteu, Martınez et al. , UPV . . . 13
4.1. Bomba peristaltica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
4.2. Montaje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
4.3. Ensayo a con azul de metileno a 5 rpm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
4.4. Repeticion de ensayo con tinte, velocidad de la bomba: 5 rpm . . . . . . . . . . 22
4.5. Ensayo 2 con tinte, velocidad de la bomba: 10rpm . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
4.6. Ensayo 2 con tinte, velocidad de la bomba :20 rpm . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
4.7. Ensayo 2 con tinte, velocidad de la bomba:30 rpm . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
4.8. Ensayo 2 con tinte, velocidad de la bomba :40 rpm . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
4.9. Ensayo 3 con tinte, velocidad de la bomba: 30 rpm . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
4.10. montaje final . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
4.11. Espectros de muestras 3 a 6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
4.12. Recta de calibrado acido Galico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4.13. Recta de calibrado acido Tanico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
4.14. Montaje FIA un canal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
XV
5.1. Absorbancia a diferentes temperaturas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
5.2. Concentracion de polifenoles vs Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
5.3. Absorbancia a diferentes tiempos de extraccion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
5.4. Tiempo vs PT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
5.5. Absorbancia a distintos tiempos de reposo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
5.6. Rectas de calibrado Tanico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
5.7. Rectas de calibrado Galico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
5.8. Comparacion de las terceras rectas de calibrado obtenidas . . . . . . . . . . . . . 39
5.9. Absorbancia a diferentes temperaturas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
5.10. Temperatura vs PT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
5.11. Absorbancias para distintos tiempos de extraccion . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
5.12. Tiempo de extraccion vs. PT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
5.13. Absorbancia para 3 minutos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
5.14. Muestra recien preparada vs muestra con dos dıas de reposo . . . . . . . . . . . . 45
5.15. Absorbancias para distintos tiempos de reposo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
5.16. Recta de calibrado acido Tanico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
5.17. calibrado acido Galico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
5.18. comparacion curvas de calibrado de acido Tanico . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
5.19. comparacion curvas calibrado acido Galico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
5.20. Absorbancia para diferentes temperaturas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
5.21. PT(ppm) vs Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
5.22. Absorbancia para distintos tiempos de extraccion . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
5.23. Tiempo de extraccion vs PT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
5.24. Asorbancias para distintos tiempos de reposo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
8.1. EDP del proyecto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
8.2. Diagrama de Gantt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
Indice de tablas
2.1. Clasificacion de los polifenoles y ejemplos de ellos Fuente: Determinacion de
polifenoles totales por el metodo de Folin-Ciocalteu, Garcıa Martınez et al. , UPV 12
4.1. Calibrado de la bomba . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
4.2. Resultados a 10 y 20 rpm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
4.3. masas pesadas de acido Galico y acido Tanico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
4.4. Muestras acido galico y acido tanico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
4.5. longitudes de onda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
5.1. absorbancias medias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
5.2. Concentracion de polifenoles totales en funcion de la temperatura . . . . . . . . . 33
5.3. Absorbancias medias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
5.4. Tiempo (min) vs PT (ppm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
5.5. PT para distintos tiempos de reposo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
5.6. absorbancias medias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
5.7. Temperatura(oC) vs PT (ppm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
5.8. Absorbancias medias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
5.9. Tiempo de extraccion (min) vs contenido de PT (ppm) . . . . . . . . . . . . . . . 43
5.10. PT (ppm) vs. tiempo de reposo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
5.11. absorbancias medias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
5.12. Temperatura (oC) vs PT(ppm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
5.13. Absorbancias medias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
5.14. Tiempo de extraccion (min) vs PT (ppm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
XVII
5.15. Tiempo de reposo vs PT (ppm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
5.16. Contenido de polifenoles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
8.1. Costes de instrumentacion y equipos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
8.2. Costes de Materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
8.3. Costes de los reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
8.4. Costes de personal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
8.5. Presupuesto total . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
1
2
CAPITULO 1Introduccion
Los antioxidantes naturales estan siendo cada vez mas apreciados por los consumidores de-
bido a sus efectos positivos [2] y a la posibilidad de emplearlos como aditivos naturales que
reemplacen a los sinteticos [3] El te es una fuente natural de antioxidantes ademas de ser una
de las bebidas mas consumidas a nivel mundial.
Sus propiedades medicinales han sido exploradas y conocidas desde los primeros periodos de
la civilizacion China, casi 5000 anos atras. Las propiedades de los tes varıan dependiendo de
su origen, condiciones climatologicas y metodos de procesamiento, pero en general se distingue
entre tes no fermentados (te verde y te blanco) y fermentados (Rooibos) siendo el te blanco el
menos procesado ya que se recoge antes de la maduracion de las hojas y se seca al aire. En este
trabajo se llevara a cabo la cuantificacion de los antioxidantes presentes en muestras de te verde,
te blanco y Rooibos mediante el metodo de Folin-Ciocalteu y analisis por inyeccion en flujo.
El analisis por inyeccion en flujo es una herramienta para la automatizacion del analisis
quımico, esto lo convierte en una herramienta de valor puesto que permite eliminar el error
craso que introduce la manipulacion humana y conlleva un ahorro notable de reactivos ası como
un gran aumento de la frecuencia de muestreo.
Tambien presenta la ventaja de ser mas barato que otras alternativas de automatizacion, esto lo
hace muy atractivo para su uso en aplicaciones en las que no se requiere un grado de precision
muy alto.
3
CAPITULO 1. INTRODUCCION
Respecto al metodo de Folin-Ciocalteu; se emplea por ser el metodo estandar para la cuan-
tificacion de polifenoles y otras especies antioxidantes segun la norma ISO 14502-1:2005 en la
que se detalla su uso para la cuantificacion de polifenoles en tes verde y negro. Consiste en
un determinacion colorimetrica empleando el reactivo de Folin Ciocalteu, este contiene acido
fosfotungstico (H3PW12O40) y acido fosfomolıbdico (H3PMo12O40) que son oxidantes que al
reducirse, oxidando los fenoles, producen un color azul con absorcian maxima a
765 nm, esto ocurre debido a la formacion de los llamados azules de tungsteno y molibdeno
(oxido de tungsteno y oxido de molibdeno).
El reactivo de Folin Ciocalteu reacciona con un amplio rango de polifenoles y, aunque las res-
puestas variaran con los distintos componentes la seleccion de acido galico como patron de
calibracion permite la obtencion de datos utiles sobre el contenido de polifenoles totales.
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CAPITULO 2Estado del arte
2.1. Analisis por inyeccion en flujo
El analisis por inyeccion en flujo o FIA (flow injection analysis) aparecio por primera vez
en descrito por Ruzicka y Hansen en una patente en 1974. Se crea como respuesta al analisis
automatizado que existıa aquel momento, el analisis por flujo segmentado SFA (Segmented flow
analysis) [1]
En la siguiente figura se muestran las configuraciones tıpicas para SFA y FIA
5
CAPITULO 2. ESTADO DEL ARTE
Figura 2.1: Configuraciones SFA y FIA
Fuente: Analisis por inyeccion en flujo: herramienta clave para la automatizacion analıtica,
Marıa del Pilar Canizares Macıas
Al principio, en los primeros trabajos de FIA se presuponıa la existencia de un flujo turbu-
lento, de esta manera se explicarıa el que no hubiera contaminacion mutua entre las muestras
[1].En trabajos publicados posteriormente White y sus colaboradores [4], Stewart [5] y Ruzicka
y su grupo[6] demostraron que para sistemas de flujo continuo el numero de Reynolds era en
la mayorıa de los casos menor que 2000, asegurando que el regimen existente es laminar en el
transporte de materia a traves de los tubos, mientras que para el SFA el numero de Reynolds
es mayor o igual a 3000, debido al regimen turbulento existente.
El que el flujo sea laminar otorga grandes ventajas al FIA :
Zona de muestra bien definida
Caudales pequenos
6
2.1. ANALISIS POR INYECCION EN FLUJO
Alta frecuencia de muestreo
Esto simplica el montaje, ya que no es necesaria una presion alta ni la existencia de burbujas
de aire que separen las muestras para evitar su contaminacion mutua al ser inyectadas sucesi-
vamente.
La base por tanto de este tipo de analisis se encuentra en el fenomeno de dispersion.
Las condiciones de trabajo habituales del FIA provocan que el bolo de muestra se disperse
en la solucion portadora o en el reactivo. A causa del regimen laminar la muestra aparece en
una zona definida, produciendose un gradiente de concentracion en esta zona que se relaciona
con el perfil de velocidad correspondiente al regimen laminar. Esto provoca la forma de los picos
que se forman en el analizador como se refleja en la siguiente figura.
Figura 2.2: Senal obtenida en una configuracion FIA. En la parte superior aparece la dispersion
de la muestra
Fuente: Analisis por inyeccion en flujo: herramienta clave para la automatizacion analıtica,
Marıa del Pilar Canizares Macıas
La dispersion de la muestra ocurre por medio de dos mecanismos:
Transporte por conveccion, que genera un flujo parabolico con velocidad nula en las paredes
y velocidad maxima igual al doble de la velocidad media.
Transporte por difusion causado por gradientes de concentracion tanto verticales como
horizontales.
7
CAPITULO 2. ESTADO DEL ARTE
Ası que, las senales FIA toman diferentes formas en funcion del tiempo que pasa en el sistema.
Si el tiempo es demasiado corto la dispersion no afecta; pero, si el tiempo de residencia fuera
demasiado largo ocasionan que el efecto de la difusion sea muy acusado, originando picos muy
anchos.
Por tanto, se ve que el tiempo de residencia es un parametro fundamental, y que tiene
que responder a un compromiso de manera que el transporte por conveccion tenga la misma
importancia que el transporte por difusion.
Las caracterısticas del pico (tiempos de arranque, residencia y ancho de banda y altura o
area de pico) dependen de las caracterısticas hidrodinamicas del sistema FIA que son caudal,
volumen de inyeccion, longitud del reactor, etc. Por ello, resulta difıcil modelar el modelo de
dispersion que pueda predecir el comportamiento de una muestra inyectada en un sistema FIA.
Para probar la validez del metodo se llevaron a cabo valoraciones acido base con naranja
de metilo, para este ensayo se utilizo el montaje FIA mas sencillo posible, en el que la solucion
portadora (acido) se hace circular por un canal en el que se inyecta la muestra (indicador) que
tras reaccionar pasa al elemento analizador. Pero despues de comprobar que efectivamente, este
montaje resultaba efectivo se paso a utilizar el siguiente mas sencillo, que aparece representado
en la siguiente figura,
Figura 2.3: montaje FIA de dos canales
Fuente: Flow Injection Analysis [1]
Este montaje de dos canales permite mas aplicaciones, y por lo general, los montajes FIA que
se utilizan tienen dos o mas canales. Aparecen entonces nuevos parametros a tener en cuenta,
como son las uniones entre canales, la geometrıa de la celda de flujo etc.
Conocido esto, diversos modelos teoricos han sido discutidos [7] [8] [9] [10] resolviendose que
el parametro mas adecuado para caracterizar la dispersion en un sistema FIA es el coeficiente
de dispersion de Ruzicka, propuesto por este y sus colaboradores [1]. Este parametro cuantifica
la dilucion que sufre el bolo de muestra cuando pasa por el detector y se define como la relacion
entre las concentraciones del analito antes (Co) y despues del analisis (C), es decir el inverso del
factor D de dispersion (D= Co/C).
Por tanto, para el maximo de la curva el valor D = Co / Cmax.
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2.1. ANALISIS POR INYECCION EN FLUJO
Puesto que siempre se puede encontrar una relacion entre la senal analıtica detectada (
absorbancia, ,mV, etc.) el registro de la misma (altura o ancho de pico ) y la concentracion de
la muestra o su producto de reaccion (C), el coeficiente D puede calcularse en funcion de la
senal detectada expresandose como D = Koho / k1hmax. Donde Ko y k1 son las constantes de
proporcionalidad que normalmente tendran el mismo valor puesto que no varıa la relacion entre
concentracion y altura entre ambas concentraciones.
Por otra parte, tambien hay que tener las condiciones hidrodinamicas del sistema. La dis-
persion global del sistema se puede considerar igual a la suma de las dispersiones originadas en
las tres partes del sistema FIA:
La dispersion originada tanto por el volumen de muestra como por los aspectos geometricos
del sistema de inyeccion
la dispersion originada por la geometrıa del reactor y el caudal circulado
la dispersion originada por la dilucion provocada por la geometrıa de la celda de flujo.
Que dependen principalmente del tiempo de residencia del bolo de muestra en cada una de
estas partes, por lo que se puede establecer que la altura de la senal dependera principalmente del
tiempo de residencia. Por lo que caudales bajos o reactores largos provocan alturas mayores de
la senal mientras que volumenes pequenos, que incrementan la dilucion, provocan la disminucion
de la altura del pico.
A todo lo expuesto hasta ahora se debe anadir el efecto de las reacciones quımicas ya que
cuando ocurren resultarıa erroneo considerar la dispersion como un fenomeno puramente fısico.
Se considera ademas el efecto de la cinetica de la reaccion ya que no se llega al equilibrio en
contra de lo que ocurre en el caso del SFA. Las principales variaciones que las reacciones quımicas
introducen en el sistema FIA son:
La posibilidad de que la medida que se realice sea del producto de la reaccion por lo que
el grado de conversion afecta a la altura del pico, respecto a la dispersion cuanto mayor
sea la velocidad de reaccion menor sera la dispersion
Cuando la propiedad que se mide tiene relacion con uno de los reactivos que desaparece
del flujo, que serıa el escenario opuesto al anterior, por lo que, un aumento de la velocidad
de reaccion provoca un aumento de la dispersion
Como se ha visto el analisis por inyeccion en flujo aparecio en 1975 de mano de Ruzicka
y Hansen pero desde entonces muchos estudios se han publicado al respecto, confirmando la
9
CAPITULO 2. ESTADO DEL ARTE
robustez y fiabilidad del metodo y adaptandolo cada vez a mas tipos de analisis mediante confi-
guraciones cada vez mas complejas, como por ejemplo su utilizacion combinada con biosensores
para la determinacion de ciertos metabolitos.
En conclusion, el analisis por inyeccion en flujo es una de las tecnicas que, al permitir
altas frecuencias de muestreo y mınima intervencion humana permite mejorar la calidad de
los resultados analıticos siendo una de las tecnicas mas sencillas para la automatizacion del
analisis quımico. Otras tecnicas de automatizacion han ido surgiendo durante los anos, pero
la flexibilidad, versatilidad y bajo coste del analisis por inyeccion en flujo han llevado a la
consolidacion de su uso.
2.2. Consumo de Te
En los ultimos anos el consumo de te en Espana ha aumentado, segun la consultora IRI entre
el 2014 y 2015, las ventas de tes e infusiones crecieron un 3.5 % en volumen en el interanual a 30
de octubre, superando de esta forma las 4.905 t, por valor de 145,9 millones de euros, un 4,5 %
mas. Por categorıas, las infusiones siguen siendo las mas demandadas, tras haber crecido un 2,9 %
tanto en volumen como en valor, lo que le da una cuota cercana al 65 % en ambas dimensiones.
Pese a ello, los tes comienzan a ganar terreno al anotarse un 4,8 % en volumen y mas del 7,5 % en
valor, con las variedades naturales evolucionando por encima del 17 % en toneladas y del 58 % en
terminos economicos; si bien este crecimiento es menor que en otros lugares del mundo, el te se
esta convirtiendo en la opcion preferida para sustituir al cafe principalmente por los beneficios
que reporta a la salud. A continuacion se discuten los beneficios que reporta el consumo del
te verde, te blanco y Rooibos.
2.2.1. Te verde
El consumo de te verde se ha asociado a la reduccion de la posibilidad de padecer cancer y al
control de enfermedades cardiovasculares. Dichos efectos positivos se asocian principalmente a su
contenido de flavonoides polifenolicos,conocidos como catequinas. Principalmente a la catequina
EGCG (Epigalocatequin galato). Los polifenoles del te verde son antioxidantes conocidos y ha
sido propuesto que estos fitoquımicos modulan los procesos bioquımicos y fisiologicos que llevan
a la iniciacion y propagacion de carcinogenesis y enfermedades cardiovasculares o sus factores
de riesgo, retrasandolos o reduciendo su alcance.
10
2.2. CONSUMO DE TE
2.2.1.1. Efectos antioxidantes del te verde
Cuando se acumulan especies de oxıgeno reactivo (EOR) se marca el inicio de estres oxida-
tivo , que a su vez se han asociado con acontecimientos intracelulares. Estos acontecimientos
intracelulares han mostrado una correlacion fuerte con el desarrollo de enfermedades como el
cancer, cardiovasculares y neurodegenrativas. De esta manera, por el contenido de polifenoles
del te verde, se asocia su consumo con la disminucion del riesgo de padecer dichas enfermeda-
des. Diversos estudios respaldan esta hipotesis exponiendo el aumento del nivel de antioxidantes
causado por el consumo de te verde. [11] [12]
2.2.2. Te blanco
El te blanco es originario de la costa sudeste de China donde se produce y es conocido
por su procesamiento mınimo y caracterısticas naturales. Por ello su demanda y su consumo ha
aumentado sistematicamente durante los ultimos anos. Comparte con la composicion del te verde
diferentes catequinas y en concreto la EGCG por lo que tambien tiene actividad antioxidante [13]
pero tambien cuenta con otros efectos beneficiosos en el rango de los ya descritos para otros tipos
de tes como el verde o oolong. La principal diferencia es que carece de etapas de fermentacion
como el Rooibos o de descativacion de encimas como el te verde. Ya que las condiciones de
manufactura afectan al contenido de catequinas hay mucho que se desconoce respecto a este
tipo de te.
2.2.3. Rooibos
El Rooibos es un te de hierbas, que se comercializa como una bebida buena para la salud
debido a su alto contenido de antioxidantes, procedente de Sudafrica no contiene cafeına y
tiene un contenido significativo de polifenoles. Como en los anteriores casos se relaciona con la
proteccion frente al cancer y las enfermedades cardiovasculares.
En este caso no existen las catequinas que encontramos en los tes anteriores, sin embargo
es la unica fuente natural de aspalatina y la principal de notofagina. Antioxidantes con efectos
antiinflamatorios [14] ademas de otros flavonoides.
11
CAPITULO 2. ESTADO DEL ARTE
2.3. Determinacion del contenido de Polifenoles totales. Metodo de
Folin-Ciocalteu
A causa de todos los beneficios mencionados anteriormente de la actividad antioxidante
derivada del contenido de polifenoles resulta de interes su cuantificacion en distintos productos
de consumo humano. El metodo mas comunmente utilizado para hacerlo es el de Folin Ciocalteu.
Los compuestos polifenolicos presentan en su estructura quımica uno o mas anillos de ben-
ceno y uno o mas grupos hidroxilados con algun elemento comun, como los grupos funcionales
esteres de metilo, glicosidos, etc. Se trata de moleculas muy reactivas que normalmente se en-
cuentran combinados con azucares pero tambien pueden unirse con acidos carboxılicos, acidos
organicos, aminoacidos y lıpidos. Clasificando los polifenoles segun su complejidad quımica pue-
den agruparse como se refleja en la siguiente tabla:
Estructura quımica Tipo Ejemplo de polifenol
C6 - C1 Acido Fenolico / Acido benzoico Acido Galico / Acido elagico
(C6 − C1)n Taninos hidrolizables
C6 - C2 Acido fenil acetico
C6 - C3 Acido hidroxicinamico / Cumarinas Acido cafeico/Acido ferulico
(C6 − C3)2 Linganos
C6 - C1 -C6 Benzofenonas / Xantonas
C6 -C2 -C6 Estilbenos Reveratrol
C6 -C3 -C6 Flavonoides / Chalconas Antocianinas, Flavonoles, Flavonas, Flavanonas, Isoflavonas, Flavanoles
(C6 − C3 − C6)n Proantoancinas / Taninos(4 ≤n≤11)
Tabla 2.1: Clasificacion de los polifenoles y ejemplos de ellos
Fuente: Determinacion de polifenoles totales por el metodo de Folin-Ciocalteu, Garcıa Martınez
et al. , UPV
El metodo de Folin-Ciocalteu se basa en la reaccion de estos compuestos con el reactivo
de Folin-Ciocalteu, a pH basico para dar lugar a una coloracion azul que es susceptible de ser
determinada espectofotometricamente a 765 nm. Este reactivo contiene una mezcla de wolfra-
mato sodico y molibdato sodico en acido fosforico, las sales en medio acido dan el color amarillo
caracterıstico del reactivo, y al ser reducida por los grupos fenolicos da lugar al mencionado azul
intenso, cuya intensidad se medira para determinar el contenido de polifenoles.
12
2.3. DETERMINACION DEL CONTENIDO DE POLIFENOLES TOTALES. METODO DEFOLIN-CIOCALTEU
Figura 2.4: Mecanismo de accion del reactivo de Folin-Ciocaltu
Fuente: Determinacion de polifenoles totales por el metodo de Folin-Ciocalteu, Martınez et al.
, UPV
Al ser el mecanismo de la reaccion redox el grado en el que se completa se puede conside-
rar tambien como indicador de la actividad antioxidante total. Para cuantificar la cantidad de
polifenoles se recomienda utilizar como patron de calibracion el acido galico.
13
CAPITULO 2. ESTADO DEL ARTE
14
CAPITULO 3Objetivos
Tras el desarrollo del estado del arte del campo a estudiar, es preciso establecer un sarie de
objetivos a cumplir durante el desarrollo del presente trabajo, estos son:
Disenar un sistema FIA que permita analizar el contenido de polifenoles totales en muestras
de te de manera rapida y efectiva.
Realizar el montaje y la puesta a punto
Comprobar la validez de los datos de diseno del montaje FIA de la bibliografıa en los que
se basa el proyecto.
Estudiar el efecto de diferentes condiciones de extraccion.
Comparar la actividad antioxidante encontrada para diferentes tipos de te.
En general, este Trabajo de Fin de Grado busca realizar un montaje FIA sencillo y comprobar
su utilidad. Como aplicacion se toma el analisis del contenido de polifenoles totales en muestras
de te verde te blanco y Rooibos.
Esta aplicacion resulta interesante ya que el consumo de te es bueno para la salud por su
contenido en polifenoles.
15
CAPITULO 3. OBJETIVOS
16
CAPITULO 4Metodologıa Experimental
4.1. Montaje
Se realizo un montaje basico de analisis por inyeccion en flujo con dos canales como el
mostrado en la figura 2.3 Los equipos y materiales utilizados fueron los siguientes:
Materiales
Tubos de Teflon de diversos diametros internos
Inyector de jeringa
Union en T
Tubo de cristal hueco
Valvula de seis vıas (Cheminert C22)
Instrumentacion
Bomba persitaltica (Heidoplh, DP5201)
17
CAPITULO 4. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
Figura 4.1: Bomba peristaltica
En primer lugar, se llevo a cabo el calibrado de la bomba peristaltica. Para ello se utilizaron
dos probetas de cinco mililitros, siendo sus masas vacıas: 11,3 g y 11,4 g para las probetas 1 y 2
respectivamente y un cronometro. La bomba se puso en funcionamiento durante cinco minutos
a diferentes velocidades tras los cuales se peso la cantidad de lıquido desplazado por ella. Los
resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla.
Velocidad de la
bomba (rpm)Masa 1 (g) Masa 2 (g) Caudal Q1 (ml/min) Caudal Q2 (ml/min)
5 2,4 2,8 0,48 0,56
10 4,9 6 0,98 1,2
20 9,6 11,8 1,92 2,36
30 13,7 16,7 2,74 3,34
40 18,4 22,3 3,68 4,46
Tabla 4.1: Calibrado de la bomba
La diferencia obtenida entre ambos caudales no se considero importante por ser lineal y
pequena. A partir de estos resultados se elaboraron rectas de calibrado a partir de las cuales se
hallara el caudal de la bomba a la velocidad de trabajo en cada experimento, ya que el caudal
es el parametro importante para el diseno pero no se puede fijar directamente en la bomba.
Una vez calibrado el sistema del bombeo se procedio al montaje de la hidraulica. En primer
lugar se eligieron los tubos para la bomba peristaltica de manera que los seleccionados para
18
4.2. PUESTA EN MARCHA Y FUNCIONAMIENTO
el resto del montaje ( D.I 0,8 mm) encajaran en ellos. Despues se introdujo la valvula de la
inyeccion en el primer canal y se sujeto mediante un pie y una pinza, Se unieron ambos canales
mediante una union en T y por ultimo se cortaron 0,5 metros de tubo para que constituyeran el
reactor que se enrollaron alrededor del tubo hueco con el fin de ocupar el menor espacio posible.
Figura 4.2: Montaje
Se bombeo agua destilada a velocidades altas para comprobar que no existıan fugas. Al
comprobar que efectivamente no habıa fugas se conecto el final del reactor a la cubeta de flujo
terminando ası la fase de montaje.
4.2. Puesta en marcha y funcionamiento
Los equipos y materiales que se emplean para la puesta en marcha y durante el funciona-
miento del sistema son:
Equipos
Espectofotometro UV (Perkin Elmer, Lambda 35)
19
CAPITULO 4. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
Reactivos
Acido Galico (Sigma Aldrich)
Acido Tanico (Sigma Aldrich)
Azul de metileno (preparado en el laboratorio)
Reactivo de Folin-Ciocalteu (Sigma Aldrich)
Na(OH) (Sigma Aldrich)
Te verde (DIA)
Te blanco (Argen Bio)
Rooibos (Argen Bio)
Agua destilada
Todos los reactivos son de grado analıtico.
Para la puesta en marcha se hizo circular agua por los dos canales y se utilizo azul de metileno
como muestra. Se realizaron experimentos con la bomba operando a diferentes velocidades para
volumenes de muestra de 25 microlitros.
Se utiliza azul de metileno ya que absorbe en la misma region que el reactivo de Folin
Ciocalteu reducido. [15] Estudiando el espectro de absorcion del azul de metileno se fija la
absorbancia para estos ensayos en 660 nm.
De esta manera al observar la forma de los picos de absorbancia se puede comprobar el fenomeno
de transporte predominante como se explico en el capıtulo 2.
Otro cometido de estos ensayos previos es la comprobacion de que el sistema no tiene fugas que
no se hayan detectado con anterioridad [1].
Se fijo la duracion de todos los ensayos en una hora, intentando inyectar una muestra cada vez
que la absorbancia volviera a cero. Esto resultaba ineficiente ya que se creaban tiempos muertos
muy largos entre muestras. Por eso se decide fijar en la medida de lo posible la frecuencia de
muestreo en una inyeccion por minuto.
En primer lugar se llevo a cabo un ensayo a 5 rpm, los resultados obtenidos se pueden
observar en la figura 4.3
20
4.2. PUESTA EN MARCHA Y FUNCIONAMIENTO
Figura 4.3: Ensayo a con azul de metileno a 5 rpm
Se quieren destacar dos aspectos de la figura; En primer lugar las perturbaciones que se aprecian
tras la aparicion del tercer pico. Este tipo de perturbaciones aparecen cuando entra aire de alguna
manera en el sistema, formandose burbujas que al pasar por el instrumento de medida reflejan
grandes alteraciones en las absorbancias medidas.
El otro aspecto a tener en cuenta es la diferencia que se aprecia en los picos. Esto es importante,
ya que la repetibilidad es una de las grandes ventajas de utilizar este metodo, es necesario
asegurar que los valores de absorbancia maxima son lo suficientemente parecidos como para
afirmar que el ensayo es reproducible.
A continuacion se realizaron ensayos a 10, 20, 30 y 40 rpm ya que no arrojaron resultados
aceptables, al presentar diferencias notables en las alturas de los picos y dado que se trataba del
primer ensayo realizado, se realizo un segundo ensayo para intentar encontrar la causa de dicha
diferencia.
Las figuras siguientes muestran los resultados obtenidos en las repeticiones mencionadas.
21
CAPITULO 4. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
Figura 4.4: Repeticion de ensayo con tinte, velocidad de la bomba: 5 rpm
Figura 4.5: Ensayo 2 con tinte, velocidad de la bomba: 10rpm
22
4.2. PUESTA EN MARCHA Y FUNCIONAMIENTO
Figura 4.6: Ensayo 2 con tinte, velocidad de la bomba :20 rpm
Figura 4.7: Ensayo 2 con tinte, velocidad de la bomba:30 rpm
23
CAPITULO 4. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
Figura 4.8: Ensayo 2 con tinte, velocidad de la bomba :40 rpm
Tras llevar a cabo estos ensayos se extrajeron varias conclusiones; Para empezar, se puede apre-
ciar en las graficas la aparicion de ciertos datos aislados que se deben a pequenas burbujas que
o bien entran en la aguja al tomar la muestra, o bien se introducen al inyectarla. Tambien se
observa que la repetibilidad disminuye con la velocidad, por lo que se consideran mejores las
velocidades menores.
De nuevo, se empezo una nueva repeticion del ensayo a las diferentes velocidades, las primeras
medidas ( a 30 rpm) arrojaron los siguientes resultados:
24
4.2. PUESTA EN MARCHA Y FUNCIONAMIENTO
Figura 4.9: Ensayo 3 con tinte, velocidad de la bomba: 30 rpm
Como se puede observar en la figura por la forma del ultimo pico se deduce que la muestra
esta entrando al detector mas lentamente. De manera que al revisar el montaje, se descubrio que
el motivo era una obstruccion causada por un trozo del septum de la valvula que se desprendio al
inyectar.
A la vista de los resultados obtenidos y de las dificultades que se desprenden de utilizar el
inyector de jeringa, se decide cambiarla por una nueva valvula de seis vıas. Para la utilizacion de
esta valvula fue necesario cambiar el volumen de muestra a 50 micro litros, ya que es el mınimo
posible. El montaje queda como aparece en la figura 4.10
25
CAPITULO 4. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
Figura 4.10: montaje final
A continuacion se llevaron a cabo los mismos ensayos inyectando tinte en una corriente
de agua, obteniendo resultados mucho mas alentadores que los anteriores. Se observo como en
el caso anterior, que las velocidades menores arrojaban resultados mejores. En la tabla 4.2 se
pueden observar los resultados.
Velocidad de la
bombaAbsorbancia media desviacion estandar
10 2,21 0,021
20 1,91 0,084
Tabla 4.2: Resultados a 10 y 20 rpm
Se considera que las diferencias entre ambas no resultan tan favorables como para justificar
26
4.2. PUESTA EN MARCHA Y FUNCIONAMIENTO
el uso de mas reactivo. Por lo que se elige trabajar a 10 rpm.
Con esto termina la puesta a punto, quedando los parametros FIA fijados en:
longitud del reactor: 50 cm
volumen de muestra: 50 micro litros
velocidad de la bomba: 10 rpm
4.2.1. Obtencion de rectas de Calibrado
Para realizar las rectas de calibrado se utilizaron acido Tanico y acido Galico. Primero se
prepararon las disoluciones madre de 1g/l, para ello se tomaron 0,1 gramos y se disolvieron en
100 ml de agua.
masa acido
Galicomasa acido Tanico
0.1016 0.112
Tabla 4.3: masas pesadas de acido Galico y acido Tanico
A partir de estas disoluciones se prepararon patrones para concentraciones de 5, 10, 20, 40
y 80 ppm.
Durante la etapa de calibracion de la bomba tambien se prepararon los reactivos, un litro de
Na(OH) 0,25 M y otro de reactivo FC 0,2M. [16] [17]
Para fijar la absorbancia a la que se realizaran los ensayos y utilizando las disoluciones madre
de 1g/l se tomaron las muestras recogidas en la siguiente tabla:
27
CAPITULO 4. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
no de muestra Composicion
1 1 ml FC + 4 ml agua
2 1 ml FC + 1 ml sosa + 3 ml agua
3 1 ml FC + 1 ml sosa + 1 ml tanico + 2 ml agua
4 1 ml FC + 1 ml sosa + 1 ml galico + 2 ml agua
5 1 ml FC + 1 ml tanico + 1 ml sosa + 2 ml agua
6 1 ml FC + 1 ml galico + 1 ml sosa + 2 ml agua
Tabla 4.4: Muestras acido galico y acido tanico
En la figura 4.11 se muestran los espectros de absorcion registrados de dichas muestras entre
900 y 350 nm
Figura 4.11: Espectros de muestras 3 a 6
Como se puede observar en la figura 4.11 los maximos de absorbancia para las muestras que
contienen uno de los acidos esta en el rango 700-760 nm. En la tabla 4.5 aparecen reflejadas las
longitudes de onda a la que aparecieron los picos de absorbancia para cada muestra.
28
4.2. PUESTA EN MARCHA Y FUNCIONAMIENTO
no de muestra λ (nm)
3 689
4 714
5 755
6 758
Tabla 4.5: longitudes de onda
Conocido esto, se extraen varias conclusiones. Por un lado, el orden en el que se anaden los
reactivos influye significativamente en el producto. Tambien se aprecia que en las muestras en
las que se utilizo el acido Galico la longitud de onda es mayor, aunque esta diferencia es menos
importante en el caso de las muestras 5 y 6.
Puesto que el orden en el montaje FIA es el mismo que para las muestras 5 y 6 se escoge la
longitud de onda de 758 nm para los experimentos posteriores.
Tras conocer la longitud de onda que se habıa de fijar, y teniendo los reactivos preparados
se procedio a la obtencion de las rectas de calibrado. Para ello, se hicieron 5 inyecciones de cada
dilucion de las disoluciones madre de los acidos (80 ppm, 40 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm) a
partir de las absorbancias registradas se obtuvieron las siguientes rectas de calibrado.
Figura 4.12: Recta de calibrado acido Galico
29
CAPITULO 4. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
Figura 4.13: Recta de calibrado acido Tanico
4.3. Montaje FIA con un canal
Aparentemente, nada indica que no se pudiera simplificar el montaje FIA reduciendolo a un
solo canal, para conseguir esto el reactivo que se circula por el unico canal es una mezcla 1:1 de
reactivo FC y NaOH preparados para las calibraciones dado que se emplea el mismo caudal de
ambos.
Figura 4.14: Montaje FIA un canal
Este tipo de montaje reportarıa ahorro en reactivos y materiales por lo que de ser posible
su uso este serıa deseable. Por ello, utilizando los patrones preparados para la calibracion se
llevaron a cabo pruebas de dicho montaje.
Tras varios ensayos probando diferentes caudales se concluyo que el montaje con un canal
es inviable para esta aplicacion ya que no solo los picos tienen diferentes alturas si no que no
aparece una lınea base estable.
30
CAPITULO 5Resultados y discusion
5.1. Introduccion
En este capıtulo se exponen los resultados del analisis de muestras de te verde, te blanco y
Rooibos para la determinacion de la cantidad de polifenoles totales que contienen cada uno de
ellos.
Para cada tipo de te se llevo a cabo un pequeno estudio del efecto de las condiciones de prepa-
racion sobre la extraccion de los polifenoles.
Se comprueba ası la eficacia de la extraccion cuando se siguen las instrucciones de preparacion.
5.2. Te verde
Se utilizo Te verde al limon de DIA. La masa especificada por el fabricante por cada bolsita
es de 1,5 g. Antes de empezar, se realizaron pruebas para comprobar que dilucion era necesaria
para obtener picos de absorbancia dentro del lımite de deteccion. Se eligio una dilucion 1:4.
31
CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION
5.2.1. Estudio de la temperatura
Para el estudio de la temperatura se anadieron 150 ml de agua a 100oC , 60 oC y 30 oC ,
se dejaron en reposo durante 3 minutos y se introdujeron en un bano frıo. Despues se filtraron
(Albet, DP5892125) y por ultimo se llevaron hasta 200 ml.
Tomando estas preparaciones, se realizaron las diluciones, teniendo ası preparadas las mues-
tras que se analizaron a continuacion.
Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
Figura 5.1: Absorbancia a diferentes temperaturas
Como se aprecia en la figura 5.1 no se detecta una influencia muy marcada de la temperatura
mientras esta sea alta, sin embargo sı se nota un descenso drastico en la absorbancia cuando el
agua esta a 30 oC A partir de los valores reflejados en la figure se obtuvieron las absorbancias
medias para cada caso que aparecen en la tablas 5.1
32
5.2. TE VERDE
Temperatura (oC) Absorbancia media (A)
100 0,654
60 0,593
30 0,307
Tabla 5.1: absorbancias medias
Comparando estos valores con las rectas de calibrado se obtiene el contenido de polifenoles
totales (PT) en funcion de la temperatura.
Temperatura (oC) PT (ppm) Tanico PT (ppm) Galico
100 80,7 77
60 73,1 69,7
30 37,4 35,7
Tabla 5.2: Concentracion de polifenoles totales en funcion de la temperatura
Figura 5.2: Concentracion de polifenoles vs Temperatura
Como se aprecio al registrar la absorbancia de las diferentes muestras la concentracion de po-
33
CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION
lifenoles totales disminuye con la temperatura, es decir la extraccion empeora con la disminucion
de la temperatura del agua.
5.2.2. Estudio del tiempo de extraccion
En este estudio no se midio la temperatura del agua, si no que se llevo a ebullicion y se
tomaron muestras utilizando 5 minutos , 3 minutos y 1 minuto de extraccion.
Se registraron los siguientes resultados:
Figura 5.3: Absorbancia a diferentes tiempos de extraccion
Tiempo (min) Absorbancia media (A)
5 0,746
3 0,654
1 0,516
Tabla 5.3: Absorbancias medias
34
5.2. TE VERDE
Mediante estos resultados se obtuvieron los PT.
Tiempo (min) PT (ppm) Tanico PT (ppm) Galico
5 92,2 87,9
3 80,7 77
1 63,5 60,6
Tabla 5.4: Tiempo (min) vs PT (ppm)
Figura 5.4: Tiempo vs PT
Se puede ver que en este caso la dependencia del tiempo de extraccion es mas lineal que en
el caso de la temperatura, ya que no se aprecia ningun punto de inflexion. Se deduce por tanto
que el factor crıtico para conseguir una buena extraccion es la temperatura del agua.
5.2.3. tiempo de reposo
Para comprobar el efecto del tiempo de reposo se preparo una muestra con agua a 100 o
C y 3 minutos de extraccion y se dejo reposar durante dos dıas, esta muestra se midio y se
comparo con una recien preparada en las mismas condiciones.
35
CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION
Figura 5.5: Absorbancia a distintos tiempos de reposo
Se obtuvieron tambien los polifenoles totales en cada caso.
Tiempo de reposo PT(ppm) Tanico PT (ppm) Galico
2 dıas 97,9 93,4
Recien preparada 84,4 80,5
Tabla 5.5: PT para distintos tiempos de reposo
Como se ve en la tabla 5.5 el contenido de polifenoles aumenta al aumentar el tiempo de
reposo. Tambien aumenta la turbidez de la muestra, por lo que para descartar que el aumento
de absorbancia no se deba a esto se inyecto dicha muestra pasando agua por los dos canales para
comprobar si la absorbancia que se registraba en este caso era la diferencia entre las medidas
anteriormente. Los resultados que se obtuvieron no compensaban la diferencia por lo que se
concluye que el aumento de la absorbancia no va ligado a la turbidez.
36
5.3. TE BLANCO
5.3. te blanco
En este caso al hacer pruebas para comprobar los lımites de absorbancia se encontro que
esta era muy superior a la encontrada en el te verde, por lo que la muestra habıa de diluirse
segun un ratio 1:5 en lugar de 1:4 como en el caso anterior.
5.3.1. segundo calibrado
Para comprobar que los reactivos no se han degradado, afectando a la reaccion, se realiza
un nuevo calibrado. En la primera ocasion se utilizan los mismos patrones que se prepararon
para el primer calibrado, que se habıan almacenado. En este caso se puede apreciar que la
absorbancia sube, como lo hacıa la del te que habıa reposado durante dıas. Para comprobar este
efecto se volvieron a preparar los patrones y se obtuvo otra recta de calibrado, los resultados de
la comparacion entre las diferentes rectas de calibrado se muestran a continuacion:
Figura 5.6: Rectas de calibrado Tanico
37
CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION
Figura 5.7: Rectas de calibrado Galico
En el caso del acido Tanico, la recta 3, la obtenida con patrones recien preparados se acerca
mucho a la original, sin embargo en el caso del acido galico las absorbancias reflejadas en la
recta 3 son aun mayores que las anteriores.
Esto se toma como evidencia de la descomposicion del reactivo que aun no afectando al
acido Tanico afecta al Galico. En la figura 5.8 se observa una comparacion de las rectas de
calibrado para ambos acidos cuando se realizaron con patrones recien preparados, se aprecia
una diferencia notable de absorbancia para concentraciones mayores de 20 ppm.
Esto lleva a pensar que los resultados obtenidos con una o con otra no se pareceran como en el
caso anterior; esto se discutira mas adelante.
38
5.3. TE BLANCO
Figura 5.8: Comparacion de las terceras rectas de calibrado obtenidas
Estas rectas son las que se utilizaran para calcular las concentraciones durante toda esta seccion.
39
CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION
5.3.2. Estudio de la temperatura
Se prepararon muestras utilizando agua a 100oC , 80oC , 60oC y 30oC segun el mismo
procedimiento que el utilizado para el te verde. Se midieron las siguientes absorbancias:
Figura 5.9: Absorbancia a diferentes temperaturas
Temperatura (oC) Absorbancia media (A)
100 0,769
80 0,751
60 0,604
30 0,299
Tabla 5.6: absorbancias medias
A partir de estos datos se calculan los PT resultando:
40
5.3. TE BLANCO
Temperatura (oC) PT(ppm) Tanico PT (ppm) Galico
100 102,8 59,1
80 100,5 57,7
60 81.309 46.123
30 39.946 22.423
Tabla 5.7: Temperatura(oC) vs PT (ppm)
Figura 5.10: Temperatura vs PT
Las concentraciones de PT en la muestra son bastante diferentes en funcion de la recta de
calibrado usada para hallarlas, reflejando la diferencia que se observaba en la obtencion de dichas
rectas. Aun ası se destaca que la forma de la evolucion de las concentraciones en funcion de la
temperatura es la misma. Se aprecia que el efecto de la temperatura es mayor que en el caso
anterior pues la region en la que la concentracion permanece estable pasa a ser de 100 oC a 80
oC siendo antes de 100 oC a 60 oC .
41
CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION
5.3.3. Estudio del tiempo de extraccion
Se prepararon muestras con 5 minutos, 3 minutos y 1 minuto de tiempo de extraccion, y se
analizaron resultando:
Figura 5.11: Absorbancias para distintos tiempos de extraccion
Tiempo (min) Absorbancia media (A)
5 0,77
3 0,848
1 0,625
Tabla 5.8: Absorbancias medias
Se quiere destacar que, contrariamente al caso anterior se percibe una absorbancia menor
con cinco minutos que con tres. Al calcular los PT se encuentran los siguientes resultados:
42
5.3. TE BLANCO
Tiempo de extraccion (min) PT (ppm) Tanico PT (ppm) Galico
5 101,7 60,2
3 112,3 66,67
1 82,5 48,6
Tabla 5.9: Tiempo de extraccion (min) vs contenido de PT (ppm)
Figura 5.12: Tiempo de extraccion vs. PT
Los resultados, como pasaba en el caso de la temperatura, difieren mucho en funcion de como
se obtengan, en este caso cabe destacar que la muestra con cinco minutos presenta concentracion
menor que la preparada con tres minutos.
Puesto que la diferencia no es muy acusada se piensa que se produce a causa de la temperatura
a la que estuviera el agua en cada caso, ya que para el estudio del tiempo de extraccion no se
midio la temperatura del agua sino que simplemente se empleo agua hirviendo.
Para comprobar que estos resultados no eran fruto de un error, se preparo una nueva muestra
con 3 minutos de tiempo de extraccion obteniendose los resultados siguientes:
43
CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION
Figura 5.13: Absorbancia para 3 minutos
Puesto esta repeticion se hizo tras preparar nuevos reactivos, se han de emplear las rectas
de calibrado que se hallaron en ese momento y que aparecen representadas en las figuras 5.16 y
5.17.
Con ello se encuentra una concentracion de polifenoles de 68 ppm y 67,2 ppm empleando las
rectas de acidos Tanico y Galico respectivamente.
De esta manera se comprueba que mientras la concentracion reflejada en forma de acido galico
es muy similar en ambos casos para el acido tanico hay una amplia diferencia.
Esto indica que los resultados para el te blanco expresados como equivalente de acido Tanico
no son representativos.
Por otro lado, el que la concentracion sea tan parecida parece indicar que la extraccion de
polifenoles alcanza su maximo en el minuto 3 y a partir de entonces decae. Esto esta respaldado
por el parecido entre las concentraciones con 5 minutos halladas con 100oC y 80oC.
5.3.4. Estudio del tiempo de reposo
Igual que con el te verde, se analizo una muestra preparada con agua a 100oC y 5 minutos de
extraccion para despues reservarla durante dos dıas y analizarla de nuevo. En este caso tambien
se aprecio que la muestra se enturbio con el paso del tiempo, en la figura se puede apreciar esto
al compararla con una muestra recien preparada.
44
5.3. TE BLANCO
Figura 5.14: Muestra recien preparada vs muestra con dos dıas de reposo
45
CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION
Figura 5.15: Absorbancias para distintos tiempos de reposo
En este caso, aunque existe una diferencia entre las absorbancias es menor que la observada
anteriormente, aunque la turbidez no la compensa por completo (esto se comprobo igual que en
el caso anterior, inyectando la muestra utilizando agua como portador) por lo que se concluye
que existe tambien un efecto similar al que ocurrıa con el te verde pero en menor medida.
Los contenidos en polifenoles totales para cada muestra son:
Tiempo de reposo PT (ppm) Tanico PT (ppm)Galico
recien preparado 101,7 60,2
2 dıas 108 64
Tabla 5.10: PT (ppm) vs. tiempo de reposo
Como se apreciaba segun las absorbancias las diferencias entre el contenido de polifenoles
son muy pequenas.
46
5.4. ROOIBOS
5.4. Rooibos
Por ultimo se analizo infusion Rooibos, se utilizo el mismo metodo de preparacion que con
los anteriores tes, y se diluyo segun el mismo ratio (1:5) que el te blanco.
5.4.1. tercer calibrado
Al estar los reactivos proximos a acabarse se prepararon 500 ml mas de cada uno de ellos,
tambien uno de los tubos de la bomba se rompio debido al desgaste y, al no haber disponibles
tubos con el mismo diametro interno, se tuvieron que sustituir por tubos con menor diametro
interno (0.8mm) Se calibro la bomba de nuevo hallando que para trabajar con caudales aproxi-
madamente iguales que anteriormente ( 1ml/ min ) se debıa trabajar a 20rpm. Todo esto condujo
a que se realizaran tambien nuevas rectas de calibrado. Las rectas que se obtuvieron aparecen
representadas en las figuras 5.16 y 5.17.
Figura 5.16: Recta de calibrado acido Tanico
47
CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION
Figura 5.17: calibrado acido Galico
A continuacion, en las figuras 5.18 y 5.19 se muestran las comparaciones entre todas las rectas
de calibrado que se han generado durante el desarrollo del proyecto.
En ellas se aprecia el notable parecido entre estas ultimas rectas de calibrado y las primeras
que se obtuvieron, esto se considera evidencia de la descomposicion de los reactivos que creo la
diferencia entre las rectas del tercer calibrado.
48
5.4. ROOIBOS
Figura 5.18: comparacion curvas de calibrado de acido Tanico
Figura 5.19: comparacion curvas calibrado acido Galico
Estas ultimas rectas obtenidas son las que se utilizaran para hallar el contenido de PT en esta
seccion.
49
CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION
.
5.4.2. Estudio de la temperatura
Como para el te blanco se prepararon muestras siguiendo el mismo metodo y utilizando agua
a 100oC , 80oC , 60oC y 30oC . El analisis de dichas muestras arrojo los siguientes resultados:
Figura 5.20: Absorbancia para diferentes temperaturas
Temperatura (oC) Absorbancia media (A)
100 0,224
80 0,157
60 0,08
30 0,04
Tabla 5.11: absorbancias medias
50
5.4. ROOIBOS
Temperatura (oC) PT(ppm)Tanico PT(ppm) Galico
100 26.937 22.925
80 17.98 15.26
60 7.27 2.56
30 2.49 2.56
Tabla 5.12: Temperatura (oC) vs PT(ppm)
Figura 5.21: PT(ppm) vs Temperatura
La dependecia de la temperatura de la concentracion es la mas acusada de los tres casos
estudiados.
5.4.3. Estudio del tiempo de extraccion
Como en los estudios anteriores se prepararon tres muestras con cinco, tres y un minuto de
extraccion y se analizaron. Los resultados se recogen a continuacion.
51
CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION
Figura 5.22: Absorbancia para distintos tiempos de extraccion
Tiempo (min) Absorbancia media (A)
5 0,227
3 0,224
1 0,152
Tabla 5.13: Absorbancias medias
Tiempo de extraccion (min) PT(ppm) Tanico PT(ppm) Galico
5 27.24 23.19
3 26.94 22.93
1 17.358 14.74
Tabla 5.14: Tiempo de extraccion (min) vs PT (ppm)
52
5.4. ROOIBOS
Figura 5.23: Tiempo de extraccion vs PT
En este caso los resultados percibidos segun ambas rectas de calibrado son mucho mas similares
que en el anterior, tambien cabe destacar la poca diferencia que se encuentra entre los
contenidos de polifenoles totales con 5 y 3 minutos, dada la fuerte dependecia apreciada para
la temperatura se comprobo que para ambos casos se utilizaba agua a 100oC.
53
CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION
5.4.4. Estudio del tiempo de reposo
Figura 5.24: Asorbancias para distintos tiempos de reposo
Tiempo de reposo PT (ppm) Tanico PT (ppm) Galico
Recien preparado 26,46 22,93
2 dıas 20.95 18.18
Tabla 5.15: Tiempo de reposo vs PT (ppm)
En este caso, contrariamente a lo encontrado para los anteriores, la absorbancia disminuye
con el tiempo de reposo. Puesto que los polifenoles del Rooibos no son del mismo tipo que los de
los tes analizados anteriormente se cree que no experimentan los mismos fenomenos que estos
sino que se degradan, y el te pierde capacidad antioxidante.
54
5.5. RESULTADOS
5.5. Resultados
Para poder comparar el contenido de polifenoles en la siguiente tabla se muestran los conte-
nidos hallados anteriormente normalizados.
Se presenta la concentracion de polifenoles en mg por gramo de te.
Te verde (mg/g) Te blanco(mg/g) Rooibos (mg/g)
Acido Tanico 420,5 571,2 154,2
Acido Galico 401 338,3 133,5
Tabla 5.16: Contenido de polifenoles
Estos resultados provienen de las muestras preparadas a 100 o C con 5 minutos de tiempo
de extraccion por ser estas las instrucciones de preparacion del te, es decir, de la manera en la
que se consumirıa.
Como se vio en la seccion correspondiente al te blanco, la concentracion de polifenoles ex-
presada como acido Tanico es bastante mayor que si se expresa como acido Galico. Se considera
que la valida es la expresada como acido Galico.
Respecto al te blanco cabe decir que las condiciones de preparacion de las instrucciones no
son las optimas si no que se habrıa de utilizar 3 minutos como tiempo de extraccion, de hacerse
ası el contenido de polifenoles totales en mg/g de te serıa de 374,4 mg/g.
55
CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION
56
CAPITULO 6Conclusiones
6.1. Estudio de las condiciones de extraccion
Respecto a las condiciones de extraccion, los resultados confirman en casi todos los casos lo
que se intuıa, la extraccion mejora cuanto mayor es el tiempo de extraccion y la temperatura
siendo la unica excepcion el caso del te blanco que presento una mejor extraccion para tres
minutos que para cinco. Segun la bibliografıa [18] [19] tanto para el te blanco como para el
te verde, existe un aumento del ındice de polifenoles totales con el tiempo de extraccion ası como
evidencia de que el te blanco, pese a tener mayor contenido de polifenoles, respondıa con mayor
lentitud que el te verde al tiempo de extraccion. Por lo que para cinco minutos de extraccion el
contenido de polifenoles que se reflexaba en el te verde era mayor que en el te blanco.
Esto a priori, no coincide con lo encontrado ya que el punto de inflexion respecto al tiempo de
extraccion se ecuentra para 3 minutos en el te blanco y no para el te verde.
Dicho esto, estos resultados podrıan responder a la alta capacidad de oxidacion del te blanco
[19] que al pasar mas tiempo expuesto al ambiente se oxida parcialmente y por ello se encuentra
una menor cantidad de polifenoles que la que se espera.
Diversos estudios[17] [20] [16] del contenido de polifenoles totales utilizan el acido Galico
como patron ya que es ejemplo de los polifenoles del tipo C6-C1.
57
CAPITULO 6. CONCLUSIONES
De manera que se confirma que en caso de discrepancia, los resultados que se tienen en
cuenta son los expresados como acido Galico.
Respecto al tiempo de reposo se apreciaron diferentes comportamientos para cada te. Como
se ha indicado anteriormente,para el te verde el contenido de polifenoles totales aumenta con el
tiempo de extraccion encontrandose que un aumento sostenido durante las tres primeras horas,
para luego descender en caso de ciertos tipos de polifenoles.
Sin embargo, aumenta consistentemente durante 5 horas para otros tipos. [21]
Los efectos que experimentan las catequinas durante el tiempo de reposo son principalmente
la oxidacion y epiremizacion (entre otros muchos cambios quımicos). El efecto de la oxidacion se
evita mediante el pretratamiento de las hojas de te y la epiremizacion es relevante principalmente
si se prepara el te con agua de grifo. [22] Por lo que cabrıa pensar que estas reacciones no son las
causantes del aumento de los PT observado. Sin embargo y dado que no se monitorizo el cambio
de dicho contenido durante el tiempo que estuvo almacenado se cree que alcanzo el maximo
durante la primera media hora como es habitual y se mantuvo relativamente constante durante
las siguientes 48 horas. Otra posible razon del aumento aparente del contenido de polifenoles es
la degradacion en forma de rotura de las cadenas fenolicas para dar monomeros.
Respecto al te blanco, las catequinas que contiene son mas estables que las del te verde y
tambien, como se ha mencionado anteriormente es mas sensible a la oxidacion. De esta manera
se justificarıa que el aumento de la absorbancia registrada sea menor.
En el caso del rooibos, el tiempo de reposo tuvo un efecto negativo, es decir se redujo la
concentracion de polifenoles totales, esto se achaca a la diferente composicion de ambos, ya que
el Rooibos no contiene las catequinas que contienen el te verde y el te blanco que poseen mayor
poder antioxidante que los flavonoides del Rooibos se cree que este se oxida durante el tiempo
de reposo y esto se refleja en el descenso de concentracion observado.
6.2. Contenido de Polifenoles Totales (ındice PT)
El te blanco esta siendo investigado como posible sustituto del te verde por contener ambos
catequinas que se consideran muy beneficiosas para la salud. El Rooibos sin embargo tiene otro
tipo de antioxidantes y por tanto, no se estudia como alternativa para el te verde.
Como se menciono en el apartado 2.2.2 el te blanco apenas se procesa antes de comercializarse
y por ello, los diferentes tipos tienen distintas concentraciones de catequinas. Tambien se ha de
tener en cuenta que este tipo de te esta ganando popularidad recientemente por lo que no se ha
encontrado una literatura tan extensa como la que existe para el te verde.
Los estudios consultados muestran que el te verde presenta mayor actividad antioxidante que el
58
6.2. CONTENIDO DE POLIFENOLES TOTALES (INDICE PT)
te blanco. Esto se atribuye a la mencionada oxidacion que sufre el te blanco pero no el te verde
[13] .
Al comparar distintos tipos de te blanco [23] y te verde se encuentra que los contenidos de
catequinas entre distintas clases del mismo te eran sorprendentemente diferentes que se pueden
achacar a los diferentes procesados y practicas de horticultura [24] [25] pero aun ası se reporta
mayor actividad antioxidante para el te verde que para el te blanco, lo que puede deberse a la
capacidad antioxidante de componentes que no estan presentes en el te blanco puesto que otra
caracterıstica distintiva del mismo es su cultivo en el que se recogen las hojas de te antes de que
maduren, esto causa el menor contenido en estos polifenoles adicionales[26].
Se suscriben de esta manera los resultados hallados en el presente trabajo.
Respecto al Rooibos los estudios que comparan su capacidad antioxidante con la del te verde
encuentran que esta es menor [27] lo que responde a un menor contenido de polifenoles.
Cabe destacar la influencia de la fermentacion del Rooibos en el contenido de polifenoles que
aumenta cuando no se fermenta, el analizado en este trabajo era fermentado, se ha encontrado
[28] que la actividad antioxidante Rooibos no fermentado era aproxiamdamente el doble que la
del fermentado y esta a su vez un 50 % menor que la del te verde.
En este trabajo se ha encontrado que la actividad del te verde era aproximadamente el triple que
la del Rooibos (fermentado). Se comprueba que los resultados hallados coinciden con lo hallado
en el estudio biliografico.
Por ultimo se quiere comentar la relacion entre las concentraciones de polifenoles halladas y
las que se han consumido por los individuos que percibieron los beneficios para la salud de los
mismos en los estudios consultados [29] [30] [31]. La cantidad percibida por taza coincide con la
hallada en la bibliografıa y se estima que el consumo de la gente que presentaba beneficios para
la salud como de seis a diez tazas diarias de te verde, sabiendo que este te es la mayor fuente
de polifenoles de los estudiados se estima que el consumo de Rooibos o te blanco diario tendrıa
que ser mucho mayor.
Dicho esto, se destaca que aunque los polifenoles estan despertando un gran interes por los
beneficios que reportan, el grueso de los estudios realizados al respecto han sido in vitro o en
animales.
59
CAPITULO 6. CONCLUSIONES
60
CAPITULO 7Lıneas futuras
Una vez se ha comprobado el tiempo y los recursos consumidos para elaborar un montaje
FIA sencillo, se puede ampliar o modificar el mismo para utilizarlo en otras aplicaciones. Por
otro lado, al tener en cuenta las dificultades encontradas en el montaje ( desgaste de los tubos
de la bomba, obstrucciones , etc) Se puede mejorar el mismo de cara a estas nuevas aplicaciones.
Respecto a la aplicacion tratada en este proyecto, el estudio se podrıa ampliar de las siguientes
maneras:
Estudiando la influencia de los parametros FIA, longitud de reactor y volumen de muestra
ya que el caudal sı se ha tenido en cuenta.
Anadiendo nuevos tipos de te al estudio y ampliando la comparacion de los poderes anti-
oxidantes de distintas infusiones.
Ampliando el estudio de la calidad de la extraccion empleando distintos disolventes, y
estudiando mas temperaturas y tiempos.
En conclusion, dada la flexibilidad del analisis por inyeccion en flujo, una vez realizada una
toma de contacto como se ha hecho en el presente proyecto se puede emplear como herramienta
de automatizacion de cualquier analisis que se vaya a llevar a cabo en el laboratorio.
61
CAPITULO 7. LINEAS FUTURAS
62
CAPITULO 8Planificacion temporal y presupuesto
La planificacion temporal del Trabajo se ha realizado segun la siguiente Estructura de Des-
composicion del Proyecto que aparece en la figure 8.1
63
CAPITULO 8. PLANIFICACION TEMPORAL Y PRESUPUESTO
Figura 8.1: EDP del proyecto
A partir de esta planificacion se obtiene el siguiente diagrama de Gantt:
Figura 8.2: Diagrama de Gantt
64
El presupuesto del proyecto se divide en cuatro partidas en las que se detallan los costes del
material, equipos y reactivos utilizados en el presente TFG
1. Instrumentacion y equipos
A continuacion se muestra la lista de equipos empleados durante el proyecto, se considera
una amortizacion de 10 anos, para calcular el coste total a imputar se tiene en cuenta la
amortizacion equivalente a medio ano.
Tabla 8.1: Costes de instrumentacion y equipos
2. Materiales
A lo largo del desarrollo de los experimentos se han empleado los siguientes materiales,
que se listan detallando su coste, en la tabla 8.2.
Tabla 8.2: Costes de Materiales
65
CAPITULO 8. PLANIFICACION TEMPORAL Y PRESUPUESTO
3. Reactivos
El coste asociado a todos los reactivos empleados figura en la tabla 8.3.
Tabla 8.3: Costes de los reactivos
Para los calculos se han estimado las cantidades empleadas de cada reactivo segun lo
consumido en los experimentos.
4. Personal
El coste asociado al personal implicado en la realizacion de este trabajo aparece recogido
en la tabla 8.4.
Tabla 8.4: Costes de personal
5. Costes indirectos
Dentro de la partida de costes indirectos se incluyen todos aquellos gastos cuya cuantifi-
cacion es complicada como luz, agua, etc. Se estima como un 15 % del total de las otras
partidas. Con un subtotal de 10767,38ese obtienen unos costes indirectos de 1615,11e
66
6. Presupuesto total La tabla 8.5 recoge el presupuesto total para el proyecto realizado.
Tabla 8.5: Presupuesto total
67
CAPITULO 8. PLANIFICACION TEMPORAL Y PRESUPUESTO
68
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