ESTRATEGIAS DE CLONADO MOLECULAR
BIOLOGÍA MOLECULAR BIOQUÍMICA
AÑO 2019
Dra. GABRIELA GAGO
Vectores de clonado
Son herramientas con las cuales podemos introducir ADN en las células
Derivados de plásmidos
Derivados de fagos
Plásmidos:
-Moléculas de ADN, circular y de cadena doble que tienen replicación autónoma.
-Confieren algún fenotipo (Resistencia a antibióticos, producción de antibióticos oenterotoxinas, producción de tumores en plantas: Ti, Ri)
REPASO
PLASMIDOS
Moléculas circulares de ADN de cadena doble con replicación autónoma
REPASO
Sitio de múltiple clonado(poliligador, polilinker) insertar elADN exógeno
Marcador: Confiere a la célulareceptora un fenotipo particular,por ejemplo resistencia a unantibiótico.
Replicador (pMB1, ColE1) es elsegmento de ADN que contiene elsitio donde empieza la replicaciónOri y los genes codificados por elplásmido para la replicación (algunosRNAs y proteínas)
Se pueden introducir en célulasvivas por un proceso llamadotransformación
REPASO
5
FUENTE??
BACTERIA, etc
REPASO
REPASO
REPASO
CLONAR-CLONADO-CLONACIÓN
Se refiere a los procesos (conjunto de métodos)empleados para crear copias idénticas defragmentos de ADN, copias idénticas de células ocopias idénticas de organismos
Se pueden clonar organismoscélulasmoléculas de ADN
CLONADO MOLECULAR: conjunto de métodos quepermiten identificar y purificar un fragmento deADN particular a partir de una mezcla complejade ADN, y luego reproducirlo en grandescantidades.
¿PARA QUÉ CLONAR ADN?
Aislar y determinar la secuencia de nucleótidos
de un gen específico
Identificar y analizar las secuencias reguladoras
que controlan la expresión (promotor) de un gen
Investigar la función de proteína/enzima/RNA
Identificar mutaciones (x ej. relacionadas con
alguna patología de origen genético)
CLONADO MOLECULAR
PASOS BÁSICOS DEL CLONADO MOLECULAR
Obtención del ADN a clonarElección de la fuente de ADN y de la metodología para
obtenerlo Purificación del ADNDigestión con las enzimas de restricción apropiadas
Obtención del vectorElección del vector apropiadoDigestión del vector
LigaciónIntroducción de la molécula de ADN recombinante
en la célula huésped (TRANSFORMACIÓN) Identificación de las células que contienen el ADN
recombinante (SELECCIÓN)
La estrategia depende tanto de la información de partida como del objetivo final de mi clonado
¿Con qué información cuento antes de empezar?
- Secuencia de la proteína- Ubicación en el genoma (positional cloning)- Secuencia del mRNA- Bibliotecas de cDNA o genómica- Secuencias de ADN desconocidas o conocidas- Producto de PCR
¿Cuál es la fuente del ADN?
-ADN (cromosomal, bibliotecas, etc)-ARN-PCR
Identificar y aislar un gen a partir de una biblioteca(teniendo información de la secuencia de ADN)
Identificar y aislar un gen a partir de una biblioteca(teniendo información de proteína/anticuerpos)
Amplificación de secuencias de ADN por PCR
Amplificación de secuencias de ADN por PCR introduciendo sitios de restricción
Mediante el diseñoapropiado de los oligosempleados para laamplificación por PCR, sepueden introducir lossitios de reconocimientopara las enzimas derestricción necesariospara el posterior clonado.
Amplificación de secuencias de ADN desconocidas o parcialmente desconocidas por PCR
No siempre conozco la secuencia completa quequiero amplificar como para poder diseñaroligonucleótidos específicos. Hay estrategiaspara poder hacerlo (se verán en detalle en laclase de PCR II):
- RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends):Puede ser tanto 5´como 3´.- PCR inversa- Uso de oligonucleótidos degenerados
RT-PCR: Amplificación por PCR cuando el material de
partida es ARNm.
Trascripción Reversa (RT)
seguida de PCR
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