Fluorescent in situ Hybridization
• Hibridación in situ•Desarrollada por Pardue & Gall (1969)
-Muy pocas secuencias de DNA disponibles-Radioisótopos
·Alto entrenamiento·Seguridad·Tiempo
• Hibridación in situ Fluorescente•Pinkel & Gray (1984)•Detección de secuencia blanco por fluorescencia•Método rápido•Discriminativo•Inofensivo•Relativamente fácil
HistoriaHistoria
37ºC 95ºC
FundamentosDesnaturalización
•Desnaturalización de la sonda
•Desnaturalización del DNA Cromosómico
•Hibridación Sonda-DNA Cromosómico
MetodologíaMetodología
Hibridación in situ Fluorescente
FISH (Clásico)
•Multicolor Karyotyping•Spectral Karyotyping•Multicolor banding FISH•Fiber FISH•Q-FISH•Flow-FISH•Chromosome combing•Padlock FISH•CGH•Array-CGH•etc.!!
Sondas
Fragmentos de DNA homólogos a la secuencia blanco, marcados con una molécula detectable directamente o mediante una reacción inmunoquímica
Estos fragmentos deben cubrir una región de por lo menos 70 kb para poder ser detectados al microscopio.
DefiniciónSondasSondas
Sondas:
Sondas gen-específicas:
Sondas región específicas:
Sondas de pintado cromosómico total:
Hibridación in situ Fluorescente en diagn óstico oncológico
Citogenética Molecular
Citogenética Clásica Genética Molecular
Genética Clínica
Análisis de Metafases
•Translocaciones
•Cromosomas Marcadores
•Inversiones (pericéntricas)
•Anomalías numéricas
•Microdeleciones
Análisis de Metafases
Citogenética de interfase
�Diversidad de sondas específicas (proyectogenoma)
�Simplificación de protocolos�Disminución del tiempo de análisis�Mejora notable en los métodos de
marcado de sondas�Mejora en los sistemas de tomas de
imágenes y software
Información valiosaen núcleos interfásicos
FISH en interfases
HERRAMIENTA CLHERRAMIENTA CLÍÍNICANICA
Citogenética de interfaseAlgunos usos específicos
�Estudio de mosaicismos �Células tumorales
�Muestras pequeñas�Células inactivas
FISH en interfases
Se obtiene información de una gran variedad de muestras
Permite obtener información específica en muestraspequeñas
Independiente de la presencia de células metabólicamente activas
Sujeto a variaciones técnicas importantes
Debido a:�Calidad de la sonda�Calidad de la fijación�Background�Reactivos de detección�Interpretación de las señales�Especificidad de la sonda�Temperatura de desnaturalización�Variabilidad entre reacciones
Es necesario establecer criterios propios
DiseDiseñño de sondaso de sondas
Cent.
HIRA (Tuple1) TOP3BPPM1F22qter(C+)
Cent.
HIRA (Tuple1) TOP3BPPM1F22qter(C+)
Cent.
HIRA (Tuple1) TOP3BPPM1F22qter(C+)
Para aplicación en Oncología
DiseDiseñño de sondaso de sondas
Para aplicación en Oncología
DiseDiseñño de sondaso de sondas
•Sondas Locus específicas
•Sondas Break Apart
•Sondas Doble fusión
•Sondas Tumores sólidos
Sondas OncológicasLocus Específicas
17p13.1 (TP53)
Izq, Normal. Der, P53-
Isocromosoma 17q
150Kb
17p13.1
17q25.3
SHBG
FXR2
SAT2
TP53(20Kb)
WDR79
EFNB3
DYH2
Sondas OncológicasLocus Específicas
1p36 (TP73)
1p36.32
150Kb
TP73
Control1q44
Sondas OncológicasLocus Específicas
5q15-q31 (SHGC85191/EGR1)
SHGC85191
Control5q11.2
EGR1
Her 2/neu (erb2) Es un oncogen que se encuentra en la célula normal en dos copias únicamente
Her 2/neu
Enumeración 17 (17p11.2) (C+)
CANCER DE MAMA :
Distintos mecanismos pueden llevar a la amplificación de este gen, desencadenando la enfermedad.
Sondas OncológicasTumores sólidos
MicrotomoMicrotomo
Tacos de Tacos de parafinaparafina Cortes de Cortes de 44--6 6 µµµµµµµµ
SeSeññalal al al microscopiomicroscopio
Procesado:
Sondas OncológicasTumores sólidos
Celula normal: dos copias de Her 2/neu
dos señales verdes representan dos cromosomas 17dos señales rojas representan dos copias del oncogen
Celulas con amplificaciones
Las señales verdes representan los cromosomas 17, las señales rojas representan del oncogen amplificado
Sondas OncológicasTumores sólidos
Células normales Células anormales
Sondas OncológicasTumores sólidos
Translocación BCR-ABL
DiseDiseñño de sondaso de sondas
Cromosoma Philadelphia en Leucemia Mieloide Crónica
•95 % de los pacientes tiene esta fusión
•Su presencia activa una tirosina kinasa requerida para su función transformante
•La evolución es seguida a través del porcentaje de células con cr. Phi en sangre
•El método más apropiado para esto es FISH
DiseDiseñño de sondaso de sondas
¿Porqu é FISH ?
•Los métodos moleculares (PCR) dan la respuesta: SI ó NO
•FISH: respuesta cuantitativa (%)
•Los métodos moleculares (PCR) pueden contaminarsecon falsos positivos
•FISH: no es pasible de contaminación intermuestras
Translocación BCR-ABL
DiseDiseñño de sondaso de sondas
Translocación BCR-ABL(Sonda Fusión Simple)
BCR-ABL +
BCRCrom. 22
140Kb
350Kb
ABLCrom. 9
52Kb
421Kb
BCR-ABL -
Falsos positivos5-13%
BCR-ABL +
Translocación BCR-ABL(Sonda Doble Fusión)
BCRCrom. 22
140Kb
1300Kb
ABLCrom. 9
52Kb
876Kb
BCR-ABL -
Falsos positivos0.5%
Sondas de Doble Fusión
MLL (myeloid/lymphoid or mixed leukemia)
DiseDiseñño de sondaso de sondas
MLL (myeloid/lymphoid or mixed leukemia)
(Sonda Break apart)
Crom. 11
MLL
MLL normal
MLL translocado
Sondas Break Apart
•Simple de aplicar
•Resultados obtenidos en corto tiempo
•Fácil de interpretar
•Funciona en casi cualquier célula o tejido
•Herramienta en investigación
•Herramienta diagnóstica
Conclusiones Finales
MUCHAS GRACIAS
Top Related