8/18/2019 PRACTICA 3. II Sustrato e Inhibidor Equipo 3 Yalisto
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FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS
CINÉTICA ENZIMÁTICA DE LA FOSFATASA ALCALINA.
Casas Hernández María Fernanda; Hernández Pando Daniel Alejandro; LagarQuinto Frida; López Huerta Eric
Departa!ento de "io#uí!ica E$peri!ental; %rupo &; E#uipo' &( ) de a*ril de+,-.
Resumen
En esta práctica se determinaron las
constantes cinéticas, Km y Vmax, de la
enzima fosfatasa alcalina, para la reacción de
desfosforilación, manteniendo constante laconcentración de enzima, el pH y la
temperatura previamente determinados para
tener condiciones óptimas de reacción.
También se aadió un in!ibidor "#olibdato de
$odio% y se determinaron las constantes
cinéticas aparentes para as& poder determinar el tipo de in!ibición.
1. Introdu!"n
El término cinética enzimática implica el
estudio de la velocidad de una reacción
catalizada por una enzima y los efectos 'ue
pueden tener varios factores como los
in!ibidores. (no de los principales estudios
'ue se realizan en una enzima es medir el
efecto en la velocidad de la reacción cuandose modifican las concentraciones del sustrato
de la enzima y se mantienen constantes la
concentración de enzima, el pH, la fuerza
iónica del medio, la temperatura, entre otros.
Tanto en una reacción catalizada por una
enzima como en una reacción 'u&mica, se
espera 'ue la velocidad de la reacción de
conversión de sustratos a productos, sea
directamente proporcional a la concentración
de los reactantes 'ue participan en la
reacción, es decir si se duplica la
concentración de cual'uiera de los sustratosla velocidad de la reacción también se
duplica.
) una reacción as& se denomina reacción de
se*undo orden y se representa como una
l&nea recta con pendiente positiva y diferente
de cero. +ero en una reacción 'ue es
catalizada por una enzima, sólo a
concentraciones baas del o los sustratos se
obtiene una reacción de se*undo orden. )
concentraciones altas de sustrato la
velocidad es independiente de la
concentración de sustrato, debido a 'ue no
!ay más enzima 'ue lleve a cabo la reacción.
-a reacción a concentraciones altas de
sustrato se llama reacción de orden cero ytambién se representa como una l&nea recta,
pero con pendiente casi i*ual a cero.
En resumen, en una reacción catalizada por
una enzima la variación en la concentración
del o los sustratos presenta diferentes
órdenes de reacción. +ara un *ran nmero
de enzimas la *ráfica 'ue se produce se
puede describir mediante la expresión
matemática de una !ipérbola rectan*ular.
/omo en cual'uier expresión matemática se
expresan en ella la relación entre las
variables unto a 0 o más constantes. El
trabao pionero de #ic!aelis y #enten y
1rin**s y Haldane llevó a describir la
ecuación de la !ipérbola rectan*ular, a!ora
conocida como ecuación de #ic!aelis2
#enten, con ella es posible predecir el
comportamiento de la enzima en condiciones
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experimentales diferentes. Entonces, la
ecuación se describe as&, las dos variables
de la ecuación son la velocidad "v% y la
concentración de sustrato "s%. #ientras 'ue
las dos constantes son la Km y la Vmax. -a
Km es llamada la constante de #ic!aelis2
#enten. El valor de Km de una enzima paraun sustrato espec&fico es la concentración del
sustrato a la cual la velocidad de la reacción
es la mitad de la velocidad máxima. -a Vmax
es la velocidad teórica máxima de una
reacción. ) concentraciones muy altas de
sustrato el valor de la velocidad se aproxima
al de la velocidad máxima de la reacción,
pero nunca se lle*a a ésta. -os valores de
Km y Vmax son caracter&sticos de una
enzima, aun'ue dependen de las
condiciones en las 'ue se llevó a cabo la
reacción, ya 'ue !ay 'ue recordar 'ue la
enzima es una prote&na 'ue responde
modificando su estructura y car*a eléctrica
cuando los componentes de la solución
cambian.
(na manera para obtener los valores de Km
y Vmax de una enzima también llamados
parámetros cinéticos de una enzima, es
*raficando los valores de velocidad contra la
concentración de sustrato. Este método tiene
la desventaa de 'ue se *rafica una curva y
no una l&nea recta por lo 'ue la interpolación
es dif&cil. 3tra manera, es la de utilizar al*unade las expresiones matemáticas 'ue
producen una l&nea recta como son la de
Eadie2Hosftie, la de Hanes o la más popular
la de -inea4eaver21ur5. -as formas lineales
de la ecuación de #ic!aelis2#enten son
expresiones matemáticas simples y aun'ue
cada una tiene sus problemas de
interpretación son tiles para obtener los
valores de Km y Vmax.
(na de las formas de re*ulación de la
actividad de una enzima es a través de
moléculas 'ue disminuyen su velocidad dereacción, in!ibidores. -os in!ibidores pueden
encontrarse de manera natural en las células
para controlar la velocidad de una reacción
metabólica, o bien pueden ser compuestos
sintéticos 'ue se utilizan como !erramientas
experimentales para el estudio de las
reacciones enzimáticas. #uc!os compuestos
tóxicos como antibióticos, pesticidas o
!erbicidas son in!ibidores de enzimas 'ue
son responsables de reacciones vitales para
la célula.
-a interacción de un in!ibidor y la enzima no
es siempre la misma, ya 'ue depende de la
naturaleza 'u&mica del in!ibidor, as& como de
la reacción 'u&mica 'ue cataliza la enzima.
+ara dilucidar el tipo de interacción entre
ambas moléculas se recurre a determinar el
efecto del in!ibidor en las constantes
cinéticas de la enzima.
6n!ibidores competitivos. $on moléculas 'ue
tienen una similitud estructural y 'u&mica al
sustrato de la enzima. 7ebido a lo anterior el
in!ibidor se puede unir al sitio activo de la
enzima. +ero como el in!ibidor no es idéntico
al sustrato, la enzima no es capaz de
convertir el in!ibidor a producto. El in!ibidor simplemente blo'uea el sitio activo, por re*la
no es posible 'ue tanto el in!ibidor como el
sustrato se encuentren al mismo tiempo en el
sitio activo. $i se adiciona más sustrato y el
in!ibidor es reversible, el aumento en la
concentración de sustrato reduce la
in!ibición. El in!ibidor afecta exclusivamente
el valor de la Km de la reacción catalizada
por la enzima.
6n!ibidor no competitivo. El in!ibidor no se
une al sitio activo de la enzima sino a un sitio
aleado del sitio activo y ocasiona un cambioconformacional en el sitio activo de la
enzima. (n in!ibidor no competitivo puro es
a'uel en el 'ue sólo se altera la capacidad
de unir al sustrato. -a mayor parte de los
in!ibidores son in!ibidores mixtos es decir no
sólo se afecta la unión del sustrato sino
también la conversión del sustrato a
producto. 7ebido a lo anterior, los in!ibidores
mixtos alteran tanto el valor de la Vmax como
el de la Km de la enzima.
6n!ibidor acompetitivo. Es un in!ibidor 'ue no
es capaz de unirse a la enzima libre, es decir
sólo se une al compleo Enzima2$ustrato. -o
anterior puede deberse a 'ue la unión del
sustrato expone o crea sitios de acceso o
unión para el in!ibidor, en el o fuera del sitio
activo. (na vez 'ue el in!ibidor se une la
enzima se previene la formación de producto.
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Prepararcur/a
patrón
Leer a 0-1n!
%ra2car
Prepararseg3n ta*la
Leer a 0-1n!
4*tener eltie!po ópti!o
5na /ez 2jado eltie!po( pro*ar con
distintos pHMedir a 0-1 n!
4*tener el pHópti!o en el #ueopera la enzi!a
El in!ibidor acompetitivo altera tanto la Km
como la Vmax de la enzima. $in embar*o, a
diferencia de la *ráfica 'ue se produce con
un in!ibidor de tipo no competitivo mixto, las
curvas a diferentes concentraciones de
in!ibidor son paralelas en este ltimo.
El #olibdato de $odio "8a9#o3:;9H93%. El
ión #olibdato unto con el vanadato son
potentes in!ibidores frecuentemente
utilizados en la caracterización de
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Prepara ensa6ospara encontrar la
te!peratura ópti!aleer a 0-1 n!
4*tener te!peraturaópti!a a un ti!epo
6 pH especí2cos
Con los pará!etrosópti!os de pH( tie!po6 te!peratura prepara
ensa6o para /er ele7ecto del sustrato
leer a 0-1 n!%ra2cár e7ecto del
sustrato
Por 3tli!o adicionarin8i*idor adi7erentes
concentraciones desustrato
leer a 0-1 n!4*tener constantes6 tipo de in8i*ición
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Resu%t$dos(
Determinación de t, T y pH
)r$*!$ 1A /urva patrón del producto 'ue seformará en las pruebas posteriores
, , , , , , , ,
,
,+
,0
,.
,)
79$: ; .? ; -
Cur+$ ,$tr"n de ,-n!tro*eno%
Concentración p-nitrofenol
Abssorbencia
)r$*!$ #A 7eterminación del tiempoapropiado para realizar pruebas posteriores.
, 1 -, -1 +, +1 &
,
,-
,+
,&
,0
79$: ,,-$ = ,,>? ,
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+@, +), +
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Determinación de Km y Vmax
=raficando la velocidad contra la
concentración de sustrato se obtiene una
*ráfica de tipo #ic!aeliana cuya función
se describe mediante la ecuaciónA
V =Vmax∗S
S+ Km
)r$*!$ 5A Efecto de la concentración desustrato sobre la velocidad.
, , , , , , , ,,
,
,
,
,
,
,
Bepresentacion de #ic!aelis2#enten
Sustrato (M)
Velocidad (M/min)
/on la *ráfica C es dif&cil y poco exacto
determinar tanto la Vmax como Km, por
esta razón se recurrirá a la
representación de -ine4eaver 1ur5 'ue
sirve para linealizar la ecuación de
#ic!aelis2#enten, 'uedando de la
si*uiente maneraA
1
V =
Km
Vmax∗1
S +
1
Vmax
?
+osteriormente podrán calcularse los
parámetros Vmax y Km con las
si*uientes ecuacionesA
Vmax=1
b ? Km=b∗m=
Km
Vmax∗b
La /elocidad au!enta con7or!e au!enta la
concentración de sustrato pero 8asta cierto puntocuando la /elocidad se e!pieza a !antenerconstante( indicando el lí!ite de capacidad de la
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)r$*!$ 6A Bepresentación lineal de laecuación de #ic!aelis2#enten
, +,,, 0,,, .,,,
,
+
0
.
)
-,
-+
79$: >? ,
Representación de ine!ea"er #
%/S (%/M)
%/V (min/M)
7espués de evaluar el in!ibidor se
obtuvo lo si*uienteA
)r$*!$ 7A /omparación de la velocidad cony sin in!ibidor
, , , , , , ,,
,
,
,
,
,
,
E*eto de !n8!3!dor mo%!3d$to de sod!o
S (M)
Velocidad (M/min)
+ara calcular 5m y Vmax aparentes se
usará el modelo de line4eaver bur5 y
para determinar el tipo de in!ibidor del'ue se trata.
)r$*!$ 9A Evaluación del tipo de in!ibidor utilizado
1,,, , 1,,,
,
-,,,,,
+,,,,,
&,,,,,
0,,,,,
1,,,,,
.,,,,,
@,,,,,
79$: +.-&$ = 0,@.,00@
>? ,)
79$: >? ,
E*eto de !n8!3!dor
%/S (%/M)
%/V (min/M)
e eli!inaron puntos de a!*as gra2cas #uea7ecta*an la correlación lineal de los datos asi co!o
la pendiente con la cual resulta*an /alores de-I!a$ ne ati/os
Línea naranja' sustrato sin in8i*idor Línea azul'sustrato = in8i*idor( se o!itió una !edición #ue
salía de la tendencia
e o*ser/a clara dis!inución de la /elocidad dereacción enzi!ática( sin e!*argo es di7ícildeter!inar si se trata de in8i*idor co! etiti/o o
5sando los /alores o*tenidos de la regresión se o*tu/o #ue
!a$ 2.14 x10−6
MI!in; Km=9.28 x 10−3 M
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T$3%$ 1( Evaluación y comparación de Km yVmax al a*re*ar in!ibidor
8o !ubo variación si*nificativa de la
Vmax, sin embar*o, parece 'ue Km tuvo
una mayor
modificación, lo
cual indica 'ue
podr&a tratarse
de una
in!ibición de
tipo competitiva.
+ara el cálculo
de la Ener*&a de
activación "Ea%
se utilizaron los resultadoscorrespondientes a la evaluación del
efecto de la temperatura y la ecuación de
)rr!enius, la cual se presenta a
continuaciónA
ln K =− Ea
R
1
T + ln A
7ondeA
5A constante de velocidad de la reacción.
)A factor de frecuencia o factor
preexponencial. Es un &ndice relacionado
con la frecuencia de las colisiones entre
las moléculas de reactivos y sus
unidades dependerán de las de 5.
EaA ener*&a de activación de la reacción,
normalmente dada en 5Dmol20
BA constante de los *ases ideales. $i Ea
viene dada en 5Dmol20, su valor es
F,G00@2G 5Dmol20K
TA temperatura, en 5elvin
T$3%$ ( Valores usados para la Ecuación de )rr!eTem,er$tur$:;<
+e%o!d$d:M=se/<
LN ; 1=T
9.0C F.C0:ICE20@ [email protected]:@I9 @.@@GI@F0C:
9>G.0C 9.0I9@>E2@F 20.I:>I@F @.@@G:0099G
[email protected] 9.G9>9E2@F 20.CC0CF @.@@G9>FI>
[email protected] G.@:CGFE2@F 20.G@@CC @.@@G99:9:I
G0F.0C 0.>00E2@F 20.:9@FF @.@@G0:G00
G9G.0C :.CC0IE2@> 20>.9@C9 @.@@G@>:CGF
Sustr$to>!n8!3!do
r
Sustr$tos!n
!n8!3!dor m :9G.@0 m :9,GI
3 :CC:F b :@@0IVm$?
:M=m!n<9.0>:9x0@J2
@I
Vmax ap
"#min%
9,:>CCGx0@J
2@I@m :M< @.@@@>9F0I
I
5m ap "#% @.@@@0@CG
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$e calculó primero la concentración y la
cantidad de producto por cada
temperatura evaluada, utilizando la curva
de calibraciónA
T$3%$ #( /oncentración y cantidad de
producto.
$e calculó la velocidad dividiendo la
concentración entre 9@ minutos "09@@
se*undos%, se calculó el lo*aritmo natural
de esta velocidad y se *raficó contra el
inverso de la temperatura.
, , , , , , , , , ,
+1
+,
-1
-,
1
,
79$: ? ,)1
Ecuacion de )rr!enius
-I
Ln G
)r$*!$ ( Ecuación de )rr!enius
) partir de la ecuación obtenida con el *ráfico de
las temperaturas en las 'ue es activa la enzima se
calculó la Ea, 'ue resultó ser de .F 5Dmol.
Absorbancia
Concentración (M)
Cantidad(mol)
,,-& -,[email protected],. +1100E-,
,-)@ +1
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T$3%$ 4( Besultados *rupales
&'
t(mi
n)
p
H
T(
C)
&a
(K*/mol)
Vma+
(M/min)
Km
(M)
Vma+
ap(M/min
)
$m ap
(M)
% +, -,(0
01 -11< +(&&E,&
,,,,0)
&(
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experimental o de la forma en 'ue se
calculó este parámetro. )l final de la
práctica, todos los e'uipos concluyeron
en 'ue no !ay diferencia si*nificativa
entre las Vmax y Vmax ap y si la !ay
entre Km y Km ap, por lo 'ue se trata de
una in!ibición competitiva.
CONCLUSIONES(
) pesar de pe'ueas variaciones
obtenidas por otros e'uipos, podemos
concluir 'ue el in!ibidor molibdato de
sodio es un in!ibidor de tipo competitivo.
REFERENCIAS(
• #d!ealt!.com"9@0C% Lactate
Dehydrogenase (LDH) Bevisado
el G de octubre de 9@0C M(B-A
!ttpA444.md2
!ealt!.com-7H.!tmlN• $tuart 6ra,
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