IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS DE INTERÉS MÉDICO

Natalia Peralta – BioquímicaParasitología y Micología

UNSL

TRABAJO PRÁCTICO N° 8

Levaduras más frecuentemente asociadas a las infecciones

sistémicas:

Candida albicans Candida parapsilosis Candida tropicalis Candida glabrata Candida krusei Candida guilliermondii Cryptococcus neoformans Trichosporon spp.

Cuando se observa el desarrollo de

una colonia sobre cualquiera de los

tubos del primocultivo, se procede a

identificar el aislamiento.

El primer paso en el estudio de una

levadura es la obtención de un cultivo

puro a partir del cual se puedan iniciar

los estudios sistemáticos de sus

características morfológicas,

fisiológicas y sexuales bajo

condiciones estandarizadas.

Colonia cremosa de colorblanco amarillento, lustrosa, poco elevada y de bordes bien definidos.

La identificación puede variar desde unos

pocos test simples, para identificación

presuntiva de Cándida albicans y

Cryptococcus neoformans a una gran

variedad de pruebas necesarias para

identificar a todas las levaduras

comúnmente aisladas en los laboratorios

de micología.

Pruebas para identificación de levaduras:

1- Prueba de formación de tubo germinativo por Candida albicans.

2- Prueba de formación de Clamidosporas por Candida albicans.

3- Agar semillas de girasol para diferenciación de Cryptococcus neoformans.

4- Prueba de la producción de ureasa para Cryptococcus neoformans.

5- Crecimiento a 28 º C y 37 º C.

6- Crecimiento en extracto de malta para estudio micromorfológico.

7- Cultivo en lámina en agar morfología (Difco) para estudio micromorfológico.

8- Crecimiento en agar morfología (Difco) para macromorfología.

9 - Ensayo de asimilación de Glucosa, Galactosa, L-Sorbosa, Celobiosa, Trehalosa, Sacarosa, Maltosa, Lactosa, Melibiosa, Rafinosa, Melezitosa, D-Xilosa, L-arabinosa, D-ribosa, D-manitol, ácido cítrico, eritritol y m-Inositol.

10 - Ensayo de asimilación de nitrato de potasio y peptona.

11 - Ensayo de fermentación de Glucosa, Sacarosa, Galactosa, Maltosa, Trehalosa y Lactosa.

12 - Crecimiento en medio libre de vitaminas.

13 - Producción de ascosporas.

Reactivos comerciales

Permiten arribar a la identificación presuntiva: - Chromagar Candida - Chromagar ID

Permiten la identificación confirmatoria: - ID 32C - Yeast Star - API 20C - Auxacolor - Vitek - RapID Yeast Plus

system - Fungichrom

Algoritmo de identificación presuntiva

PRUEBAS PARA

IDENTIFICACIÓN

PRESUNTIVA DE

LEVADURAS

Prueba de formación de tubo germinativo

- Prueba más confiable para identificar

presuntivamente

a Candida albicans.

- Procedimiento: Realizar suspensión ligera de un

cultivo de 24 h de la cepa en estudio en 0,5 ml de

suero bovino. - Interpretación:El tubo germinativo se ve como una proyección filamentosa delgada, que no presenta constricción en el punto de origen.

Observación de la Micromorfología

- Se debe realizar siempre, ya sea para la

identificación presuntiva como para la

identificación completa.

- Se puede realizar en EXTRACTO DE MALTA

LÍQUIDO, para observación de las principales

estructuras que caracterizan a la reproducción

vegetativa.

- Se puede realizar en AGAR HARINA DE MAÍZ, que

permite la observación de la disposición de las

estructuras y además, en el caso de C. albicans, se

puede ver la formación de clamidoconidias.

C. albicans: Clamidosconidias ydisposición de blastoconidias ypseudomicelio.

Siembra en un agar cromogénico

- Especialmente CHROMagar Candida que permite

identificar:

C. albicans (verde)

C. tropicalis (azul)

C. krusei (rosa seca)

Prueba de ureasa

(Agar urea de Christensen)

- C. neoformans y otros Cryptococcus spp. e

incluso otras levaduras producen ureasa. C.

albicans y otras especies del género Candida no la

producen.

- El medio de urea que se usa contiene rojo de

fenol, que vira al color rojo cuando se hidroliza la

urea y se libera amonio alcalinizando el medio de

cultivo.

Agar semillas de girasol

- Para identificación de C. neoformans .

- C. neoformans produce un pigmento marrón en

el agar semillas de girasol a temperatura ambiente

debido a la actividad fenoloxidasa localizada en la

pared celular de este hongo. Ninguna otra especie

de este Género, ni otras levaduras, poseen esta

propiedad.

Prueba de asimilación de trehalosa

- Para identificar presuntivamente a Candida

glabrata, debido a que fermenta y asimila la

trehalosa. Sin embargo, otras levaduras

también fermentan la trehalosa, tal es el caso

de Candida tropicalis, por tal motivo deberá

basarse en la MICROMORFOLOGÍA para la

utilización de esta prueba.

En reumen:

Algorismo

de

identificaci

ón

presuntiva

de

levaduras

PRUEBAS PARA

IDENTIFICACIÓN

DEFINITIVA DE

LEVADURAS

Los métodos que existen actualmente en

el mercado son los siguientes:

ID 32C API 20C VITEK YBC system (bioMérieux-Vitek) VITEK 2 System Fungichrom Yeast Star Auxacolor RapID Yeast Plus system

• Método más comunmente usado.

• No pudieron ser identificadas:

C.albicans, C.guilliermondii,

C.neoformans, Rhodotorula spp y

S.cerevisiae.

• Mejor identificación de cepas

atípicas.

• Tira de plástico con 32 pocillos

con diferente sustratos

deshidratados.

• Lectura a las 48 hs (T° 30°C).

• Lectura visualmente .

Crecimiento: Turbidez en el

pocillo.

• Resultados: Biocódigo numérico

de 8 dígitos que permite la

identificación a través de un

manual de códigos.

• La identificación levaduras se basa en la

presencia o ausencia de ciertas enzimas,

que se visualiza mediante reacciones

colorimétricas.

• La actividad enzimática se revela con: 1.

Hidrólisis de sustratos cromogénicos. 2.

Asimilación de sustratos naturales. 3.

Oxidación de sustratos sintéticos

(fenoloxidasa).

• Tira de plástico con 16 pocillos con los

sustratos.

• Se prepara un inóculo y se siembran dos

gotas en cada una de las celdas.

• Se incuba 24 o 48 horas a30ºC .

• Lectura: Cambio de color.

• Interpretación de resultados: a través de

un sistema de códigos y utilización de una

tabla.