964557477.Biotecnologia y Mejoramiento Vegetal II

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal IIEditores: Gabriela Levitus, Viviana Echenique, Clara Rubinstein, Esteban Hopp y Luis MroginskiConsejo Argentino para la Informacin y el Desarrollo de la Biotecnologa

Ediciones

Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

Editores:Dra. Gabriela Levitus, Dra. Viviana Echenique, Dra. Clara Rubinstein, Dr. Esteban Hopp Ing. Agr. Luis Mroginski.


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ndice

Prefacio ............................................................................................................................... Agradecimientos ................................................................................................................ Lista de Autores .................................................................................................................. Prlogo a la Primera Edicin. Dr. Francisco Garca Olmedo ............................................. Prlogo a la Segunda Edicin. Dr. Francisco Garca Olmedo ........................................... Parte I: Herramientas Bsicas ...........................................................................................Captulo 1: Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales. Luis Mroginski, Pedro Sansberro y Eduardo Flaschland . Captulo 2: Morfognesis. Silvia Radice ... Captulo 3: La citogentica molecular e inmunocitogentica en el estudio de los genomas vegetales. Guillermo Seijo, Graciela I. Lavia, Germn Robledo, Aveliano Fernndez y Viviana G. Sols Neffa. .................................................................................................................................................. Captulo 4: Herramientas bsicas de ingeniera gentica. Ingrid Garbus, Marisa Gmez y Viviana Echenique. ................................................................................................................................ Captulo 5: Marcadores moleculares. Mara Carolina Martnez, Marcelo Helguera y Alicia Carrera. Captulo 6: Construccin de mapas de ligamiento gentico, localizacin de genes y regiones cromosmicas asociadas a caracteres de inters en plantas. Gerardo D. L. Cervigni, Juan Pablo A. Ortiz y Sergio E. Feingold. ......................................................................................................... Captulo 7: Genmica. Viviana Echenique, Juan P. Selva, Mauro Meier, Pablo Roncallo y Gustavo Schrauf. .............................................................................................................................................. Captulo 8: Transcriptmica. Silvina Pessino y Silvina Felitti. .......................................................... Captulo 9: Protemica. Paula Casati y Mara F. Drincovich ............................................................. Captulo 10: Metabolmica. Fernando Carrari, Telma E. Scarpeci, Luciano A. Abriata, Alejandro J. Vila y Estela M. Valle. ......................................................................................................................... Captulo 11: Metagenmica. O. Mario Aguilar y Daniel H. Grasso. ................................................... Captulo 12: Bioinformtica aplicada a la biotecnologa vegetal. Norma Paniego, Ruth Heinz, Paula Fernndez, Vernica Lia, Corina Fusari. ...................................................................................

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Parte II: Mtodos para generar y analizar diversidadCaptulo 1: Polinizacin y fertilizacin in vitro. Susana Cardone, Gladys Prez Camargo y Aurora Picca. .................................................................................................................................................. Captulo 2: Hibridacin somtica. Pablo Polci y Pablo Friedrich. ....................................................

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Captulo 3: Epigentica y evolucin 5LFDUGR : 0DVXHOOL \ &DUORV ) 0DUO Captulo 4. Mutagnesis, TILLING y EcoTILLING. Alberto Prina, Alejandra Landau, Mara Gabriela Pacheco y Esteban Hopp ................................................................................................................... Captulo 5: Variacin somaclonal. Susana Cardone, Sofa Olmos y Viviana Echenique. ............... Captulo 6: Aplicacin de la transformacin gentica al mejoramiento vegetal. Marina L. Daz, Diego C. Zappacosta, Pascual M. Franzone y Ral D. Ros ............................................................... Captulo 7: Usos del silenciamiento gnico para el anlisis funcional de genes candidatos. Cecilia Vzquez Rovere, Ariel Bazzini, Cecilia Rodrguez, Natalia Almasia y Sebastin Asurmendi .. Captulo 8: Anlisis de experimentos biolgicos. Sofa Olmos, Miguel DiRenzo, Mercedes Ibez, Nlida Winzer .............................................................................................................................. Captulo 9: Mtodos multivariados para estimar variabilidad gentica. Nlida Winzer, Miguel DiRenzo, Sofa Olmos y Mercedes Ibez. .........................................................................................

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3DUWH ,,, 0pWRGRV SDUD DFHOHUDU SURJUDPDV GH PHMRUDPLHQWR H LGHQWLFDFLyQ YDULHWDOCaptulo 1: Obtencin de plantas doblehaploides. Pablo Polci, Vernica Conti y Rubn Miranda y Nicols Gear. .................................................................................................................................... Captulo 2: Aplicaciones de los marcadores moleculares. Alicia Carrera, Gabriela Tranquilli, Antonio Garayalde y Marcelo Helguera. .................................................................................................. Captulo 3: Marcadores moleculares y mejoramiento gentico de cultivos. Carlos Sala, Mariano Bulos, Anala Fresco y Emiliano Altieri. .......................................................................................... &DStWXOR ,GHQWLFDFLyQ \ UHJLVWUR GH YDULHGDGHV Ana Laura Vicario, Marcelo Labarta y Mara Alicia Loray .........................................................................................................................................

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Parte IV: Mtodos de propagacin y conservacin de germoplasmaCaptulo 1: Micropropagacin. Sofa Olmos, Gabriela Luciani y Ernestina Galdeano .................... Captulo 2: Semilla sinttica. Hebe Rey y Luis Mroginski ................................................................. Captulo 3: Conservacin de germoplasma in vitro. Adriana Scocchi y Hebe Rey. .......................

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Parte V: Ejemplos de aplicaciones de la biotecnologa vegetalCaptulo 1: Aportes de la citogentica al estudio de genomas vegetales. Lidia Poggio, Graciela Gonzlez, Mara Rosa Ferrari, Ana Mara Garca, Arturo Wulff, Eduardo Greizerstein, Pablo Tomas y Gustavo Schrauf. .................................................................................................................. Captulo 2: Mejoramiento de plantas forrajeras en la era genmica. Germn Spangenberg, Mauro Meier y Viviana Echenique ....................................................................................................... Captulo 3: Caracterizacin molecular de la apomixis y su aplicacin en la agricultura. Silvina C. Pessino y Juan Pablo A. Ortiz .................................................................................................... Captulo 4: Avances de la biotecnologa en cultivos ornamentales. Alejandro S. Escandn, Pablo A. Marinangeli y Mariana Prez de la Torre. ..................................................................................

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Captulo 5: Aplicacin de la biotecnologa en la mejora y conservacin de especies forestales. Susana Marcucci Poltri, Leonardo Gallo, Noga Zelener, Susana Torales, Sandra Sharry .................... Captulo 6: Tcnicas de ingeniera gentica para conferir resistencia a virus en plantas. Mariana del Vas, Ana Julia Distfano, Cecilia Vzquez-Rovere, Esteban H. Hopp. ..................................... Captulo 7: Obtencin de plantas resistentes a enfermedades bacterianas. Adrin Vojnov, Mercedes Rivero y Diego Zappacosta ....................................................................................................... Captulo 8: Aproximaciones biotecnolgicas para un manejo sustentable del estrs fngico en la agricultura. Juan Carlos Daz Ricci; Ursula Tonello; Gustavo Martnez-Zamora; Sergio Salazar; Nadia Chalfoun; Gabriel Vellicce; Carlos Grellet; Paula Filippone; Alicia Mamani; Marta Ontivero y Atilio Pedro Castagnaro. ................................................................................................................... Captulo 9: Utilizacin de cultivos de tejidos para la obtencin y conservacin de plantas libres de enfermedades. Vilma Conci. ................................................................................................ Captulo 10: Obtencin de plantas resistentes a insectos. Dalia Lewi y Clara Rubinstein ............... Captulo 11: Aplicaciones biotecnolgicas al manejo de malezas. Germn Ferrari y Julio E. Delucchi. .................................................................................................................................................. Captulo 12: Obtencin de plantas tolerantes a distintos tipos de estreses abiticos. Florencia del Viso, Andrea F. Puebla, Nstor Carrillo y Raquel L. Chan ............................................................. Captulo 13: Manipulacin gentica del metabolismo secundario en plantas. Alicia Zelada, Mara Binaghi ........................................................................................................................................... Captulo 14: Mejoras de calidad en alimentos. Clara Rubinstein, Gabriela Levitus ............................. Captulo 15: Fitorremediacin. Mara Eugenia Segretn, Paula Bey y Alejandro Mentaberry ............. Captulo 16: Plantas como biorreactores. Fernando Bravo Almonacid, Sonia Wirth, Mara Eugenia Segretin, Mauro Morgenfeld, Ezequiel Matas Lentz. .........................................................................

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Parte VI: Manejo responsable de la tecnologa

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&DStWXOR &ULWHULRV FLHQWtFRV SDUD OD HYDOXDFLyQ GH OD ELRVHJXULGDG GH 2UJDQLVPRV *HQpWLFDPHQWH 0RGLFDGRV Clara Rubinstein ........................................................................................... &DStWXOR %LRVHJXULGDG GH 2UJDQLVPRV *HQpWLFDPHQWH 0RGLFDGRV 0DUFRV 5HJXODWRULRV Moiss Burachik .................................................................................................................................. Captulo 3: Flujo gnico y su posible impacto ambiental. Mnica Poverene, Soledad Ureta y Agustina Gutirrez. ............................................................................................................................. Captulo 4: Deteccin de OGM en la cadena agroalimentaria. Florencia Longo y Ana Vicario. ....... Captulo 5: Manejo integrado de plagas Programa de Refugios. Viviana Confalonieri y Cecilia Roca. ................................................................................................................................................... Captulo 6: Resistencia de malezas a herbicidas: evolucin y estrategias de manejo. Daniel Tuesca, Luisa Nisensohn, Mario R. Sabbatini, Guillermo Chantre. .....................................................

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Parte VII: Biotecnologa y sociedadCaptulo 1: La transformacin tecnolgica y los nuevos desafos. Carmen Vicin. ..........................

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&DStWXOR $GRSFLyQ GH ORV FXOWLYRV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV HQ $UJHQWLQD \ HQ HO PXQdo. Gabriela Levitus ......................................................................................................................... Captulo 3: Biotecnologa en la mira: el problema de la percepcin. Valeria Durand ...............

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PREFACIO En oportunidad de la Primera Edicin de Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal, nos habamos propuesto responder a la necesidad de un texto en idioma espaol, dirigido a docentes y estudiantes de los cursos de Agronoma y de otras formaciones relacionadas con las tecnologas aplicadas al mejoramiento vegetal, as como brindar un recurso de informacin general y consulta para no especialistas. Esta Segunda Edicin, intenta actualizar, profundizar y extender estas temticas, atendiendo a la rpida evolucin en este campo del conocimiento. En el contexto de los principios bsicos del mejoramiento, es decir, generar variabilidad gentica y seleccionar caractersticas deseables, las tecnologas evolucionan rpidamente y, del mismo modo, se acelera la transferencia del conocimiento bsico a las aplicaciones. Esta edicin intenta UHHMDU HVWH SURFHVR GLQiPLFR \ DSRUWDU LQIRUPDFLyQ DFWXDOL]DGD FRQ HMHPSORV GH DSOLFDFLRQHV DO mejoramiento de diferentes especies vegetales. En este trabajo se han reunido las contribuciones de investigadores y especialistas en diferentes campos relacionados con el mejoramiento. En las secciones dedicadas a las herramientas bsicas, se ha hecho foco en las tcnicas de cultivo de tejidos y micropropagacin que se utilizan en s mismas para generar variabilidad, conservar germoplasma, producir clones libres de enfermedades o como paso obligado en la construccin de plantas transgnicas. En la seccin que se ocupa de las DSOLFDFLRQHV GH HVWDV WpFQLFDV D FDVRV HVSHFtFRV VH EULQGDQ HMHPSORV GH PHMRUDPLHQWR ORJUDGR en diferentes especies. La tecnologas omicas (genmica, transcriptmica, metabolmica) constituyen una de las herramientas ms importantes en el mejoramiento, por la potencialidad que presentan, tanto en el campo GH OD LQYHVWLJDFLyQ EiVLFD HQ HO PDSHR GH JHQHV \ OD LGHQWLFDFLyQ GH PDUFDGRUHV PROHFXODUHV FRPR HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH IXQFLRQHV \ UHGHV UHJXODWRULDV TXH LQX\HQ HQ ODV FDUDFWHUtVWLFDV TXH VH desean mejorar: resistencia a enfermedades y plagas, rendimiento, calidad nutricional y respuestas a diferentes tipos de estrs ambiental, entre otras. Es claro que dentro de las tecnologas de mejoramiento, la transgnesis o transformacin gentica es una de las herramientas ms verstiles y poderosas, ya que permite resolver problemas que por va del mejoramiento convencional no sera posible enfrentar. En esta edicin se presentan numerosos ejemplos de transgnesis para la obtencin de cultivos tolerantes a estrs bitico y abitico, a plagas y enfermedades o con mejoras en su calidad nutricional. 'HVGH FXDQGR VH FXOWLYDURQ SRU SULPHUD YH] OD VXSHUFLH PXQGLDO GH FXOWLYRV WUDQVJpQLFRV aument 80 veces, alcanzando las 134 millones de hectreas en 2009. Segn el ltimo informe del ISAAA (Servicio Internacional para las Adquisiciones Agrobiotecnolgicas) estas hectreas fueron cultivadas por 14 millones de agricultores de 25 pases, siendo Argentina uno de los lderes en adopcin, con el 16% del rea global. Por otro lado, es importante notar que se han establecido sistemas de control a nivel internacional para regular el desarrollo y la aplicacin de la ingeniera gentica al mejoramiento de organismos YLYRV FRQRFLGRV FRPR RUJDQLVPRV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV X 2*0V 6L ELHQ pVWRV QR VH OLPLWDQ a plantas, en este trabajo se presentan slo los aspectos regulatorios y de bioseguridad relacionados con los cultivos transgnicos. Esperamos que esta nueva edicin constituya una herramienta til y accesible para docentes, estudiantes y profesionales que se dedican y se dedicarn a la noble tarea de mejorar la agricultura.

Los Editores


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AGRADECIMIENTOS A todos y cada uno de los 141 autores, en su mayora investigadores y profesionales de instituciones argentinas, que han contribuido con sus aportes. Al Dr. Francisco Garca Olmedo, reconocido investigador y catedrtico espaol, por regalarnos tambin el prlogo de esta segunda edicin. Al Consejo Argentino para la Informacin y el Desarrollo de la Biotecnologa (ArgenBio), por auspiciar la publicacin del libro. A los revisores, colegas y personal de apoyo, por sus valiosas contribuciones para concretar este proyecto. Los Editores

(O XVR GH IXHQWHV \ QRPEUHV FRPHUFLDOHV HQ HVWH GRFXPHQWR HV VyOR SDUD QHV GH LGHQWLFDFLyQ y no implica ningn aval ni recomendacin. Adems, los contenidos u opiniones expresadas en esta publicacin son de exclusiva responsabilidad de los autores.

LISTAS DE AUTORES (por orden alfabtico)Abriata Aguilar Almasia Altieri Asurmendi Bazzini Bey Binaghi Bravo Almonacid Bulos Burachik Cardone Carrari Carrera Carrillo Casati Castagnaro Cervigni Chalfoun Chan Chantre Conci Confalonieri Conti del Vas del Viso Delucchi Luciano A. O. Mario Natalia Emiliano Sebastin Ariel Paula Mara Fernando Mariano Moiss Susana Fernando Alicia Nstor Paula Atilio Pedro Gerardo D. Nadia Raquel L. Guillermo Vilma Viviana Vernica Mariana Florencia Julio E. Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar IBBM, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Nidera Semillas Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar INGEBI, CONICET Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA INGEBI, CONICET Nidera Semillas Dir. de Biotecnologa, Min. de Agricultura, Ganadera y Pesca Facultad de Agronoma, UBA Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur IBR - Facultad de Cs Bioquimicas y Farmaceuticas, UNR CEFOBI, Universidad Nacional de Rosario EEAOC, Tucumn CEFOBI, Universidad Nacional de Rosario INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Universidad Nacional del Litoral CERZOS, CONICET, Universidad del Sur INTA IFFIVE Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) INTA-EEA Bordenave Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Monsanto Argentina

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Daz Daz Ricci DiRienzo Distfano Drincovich Durand Echenique Escandn Feingold Felitti Fernndez Fernndez Ferrari Ferrari Filippone Flaschland Franzone Fresco Friedrich Fusari Galdeano Gallo Garayalde Garbus Garca Garca Olmedo Gear Gmez Gonzlez Grasso Greizerstein Grellet Gutirrez Heinz Helguera Hopp Ibez Labarta Landau Lavia Lentz Levitus Lewi Lia Longo Loray Luciani Mamani Marcucci Poltri 0DUO Marinangeli Martnez

Marina L. Juan Carlos Miguel Ana Julia Mara F. Valeria Viviana Alejandro S. Sergio E. Silvina Aveliano Paula Germn Mara Rosa Paula Eduardo Pascual M. Anala Pablo Corina Ernestina Leonardo Antonio Ingrid Ana Mara Francisco Nicols Marisa Graciela Daniel H. Eduardo Carlos Agustina Ruth Marcelo Esteban Mercedes Marcelo Alejandra Graciela I. Ezequiel M. Gabriela Dalia Vernica Florencia Mara Alicia Gabriela Alicia Susana Carlos F. Pablo A. Ma. Carolina

CERZOS, CONICET, Universidad del Sur INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Facultad de Agronoma, Universidad Nacional de Crdoba Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar CEFOBI, Universidad Nacional de Rosario Ketchum Argentina - ArgenBio Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur Instituto de Floricultura, INTA Castelar INTA - EEA Balcarce Universidad Nacional de Rosario Fac. Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE IBONE Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Monsanto Argentina Universidad Nacional de Buenos Aires EEAOC, Tucumn Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) IBONE IGEAF INTA Castelar Nidera Semillas Universidad Nacional del Sur Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) IBONE INTA - EEA Bariloche CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur Facultad de Agronoma, UBA Universidad Politcnica de Madrid Syngenta CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA Instituto de Suelos, INTA Castelar Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Universidad Nacional del Sur Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar INTA EEA Marcos Jurez Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Universidad Nacional de Ro Cuarto Instituto Nacional de Semillas INASE Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONE INGEBI, CONICET ArgenBio IGEAF INTA Castelar Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Direccin de Calidad - INASE CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar INTA - EEA Mendoza CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar


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Martnez-Zamora Masuelli Meier Mentaberry Miranda Morgenfeld Mroginski Nisensohn Olmos Ontivero Ortiz Pacheco Paniego Prez Camargo Prez de la Torre Pessino Picca Poggio Polci Poverene Prina Puebla Radice Rey Ros Rivero Robledo Roca Rodrguez Roncallo Rubinstein Sabbatini Sala Salazar Sansberro Scarpeci Schrauf Scocchi Segretin Seijo Selva Sharry Sols Neffa Spangenberg Tomas Tonello Torales Tranquilli Tuesca Ureta Valle Vzquez Rovere

Gustavo Ricardo W. Mauro Alejandro Rubn Mauro Luis Luisa Sofa Marta Juan Pablo Ma. Gabriela Norma Gladys Mariana Silvina C. Aurora Lidia Pablo Mnica Alberto Andrea F. Silvia Hebe Ral D. Mercedes Germn Cecilia Cecilia Pablo Clara Mario R. Carlos Sergio Pedro Telma E. Gustavo Adriana Ma. Eugenia Guillermo Juan P. Sandra Viviana G. Germn Pablo Ursula Susana Gabriela Daniel Soledad Estela M. Cecilia

INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn INTA - EEA Mendoza CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA Asociacin Cooperativas Argentinas (ACA), Univ. del Sur INGEBI, CONICET Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) IBONE Universidad Nacional de Rosario Laboratorio de Biotecnologa, INTA Pergamino INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Facultad de Ciencias Agrarias, UNR IGEAF INTA Castelar Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Facultad de Agronoma, UBA Instituto de Floricultura, INTA Castelar Facultad de Ciencias Agrarias, UNR Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur IGEAF INTA Castelar Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar INTA Castelar Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONE IGEAF INTA Castelar Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONE Dow Agrosciences Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar CERZOS, CONICET Monsanto Argentina ILSI CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur Nidera Semillas INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONE IBR - Facultad de Cs Bioquimicas y Farmaceuticas, UNR Facultad de Agronoma, UBA Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONE INGEBI, CONICET Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONE CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur Facultad de Agronoma, Universidad Nacional de La Plata Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) IBONE Victorian Department of Primary Industries (DPI) FCA, Universidad Nacional del Litoral INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn IRB, INTA Castelar IRB, INTA Castelar Facultad de Ciencias Agrarias, UNR CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur IBR - Facultad de Cs Bioqumicas y Farmaceuticas, UNR Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

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Vellicce Vicario Vicin Vila Vojnov Winzer Wirth Wulff Zappacosta Zelada Zelener

Gabriel Ana Laura Carmen Alejandro J. Adrin Nlida Sonia Arturo Diego C. Alicia Noga

EEAOC, Tucumn Direccin de Calidad INASE Facultad de Agronoma, UBA IBR - Facultad de Cs Bioqumicas y Farmaceuticas, UNR Fundacin Pablo Cassar Universidad Nacional del Sur INGEBI, CONICET Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA IRB, INTA Castelar

PRLOGOS Prlogo a la primera edicin Recientemente, un periodista, que comparta una ensalada con un bilogo, exclam: Si yo slo aspiro a que la lechuga que yo tenga que consumir no tenga genes! Cuando el bilogo le explic que al comer sta no haba ms opcin que engullir unos 25.000 genes del genoma de Lactuca sativa y varios miles de genes adicionales correspondientes a los genomas de los miFURRUJDQLVPRV TXH KDELWXDO \ FyPRGDPHQWH KDELWDQ HQ OD VXSHUFLH GH ODV WXUJHQWHV KRMDV HO periodista qued atnito. Segn un eurobarmetro de hace unos meses, ms de dos tercios de los europeos estaban en contra de los alimentos transgnicos. Sin embargo, en la misma encuesta se inclua una aseveracin - los tomates normales no tienen genes, los transgnicos s - frente a la que tambin ms de dos tercios de los encuestados se mostraban de acuerdo o confesaban su ignorancia. Es una lstima que dicho eurobarmetro no registrara la proporcin correspondiente al encabezamiento no saben, pero s contestan, aunque es fcil colegir que dicha fraccin era alta y en extremo vergonzante. Los avances del conocimiento biolgico y de la biotecnologa destacan en el panorama cienWtFRWpFQLFR GH HVWH Q GH VLJOR \ KDQ LPSUHJQDGR ODV PiV GLYHUVDV YHUWLHQWHV GH QXHVWUD YLGD cotidiana sin que se haya aceptado que un mnimo de estos conocimientos debera formar parte integral de la cultura general. La ignorancia de los hechos bsicos relativos a nuestra herencia JHQpWLFD R D QXHVWUD DOLPHQWDFLyQ VH FRQVLGHUD LQFOXVR GH EXHQ WRQR (VWR VH UHHMD GH HQWUDGD en el caos semntico que se ha creado en torno a la biotecnologa, del que hay que culpar no VyOR D OD LJQRUDQFLD GHO FLXGDGDQR VLQR WDPELpQ D OD WRUSH]D GH ORV FLHQWtFRV \ D OD GLFWDGXUD GH los medios de comunicacin. Es preciso despejar este caos si queremos entendernos a partir de la ciencia, y no a sus espaldas. 7pUPLQRV WDOHV FRPR RUJDQLVPRV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV 2*0V DOLPHQWRV WUDQVJpQLcos, ingeniera gentica, ADN recombinante, transferencia gnica, clonacin, alimentos naturales, mejora gentica e, incluso, biotecnologa, han invadido nuestro lenguaje cotidiano sin orden ni concierto. A estas alturas empieza a ser difcil normalizar la situacin, pero tratemos de contribuir a ello. /D GHQLFLyQ GH ELRWHFQRORJtD DEDUFD D WRGDV ODV WHFQRORJtDV PHGLDGDV SRU XQ VHU YLYR R SRU SDUWHV GH pO VHDQ pVWDV FpOXODV R HQ]LPDV DLVODGDV %DMR HVWD GHQLFLyQ VH LQFOX\HQ GHVGH OD propia agricultura, inventada hace diez milenios, y la fabricacin de las veinticuatro clases de cerveza mesopotmica, que tanto gustaban a Nabucodonosor, hasta la ltima forma de producir


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insulina humana. No es apropiado, por tanto, usar el trmino de forma restringida para referirse exclusivamente a los ltimos avances basados en la biologa molecular. Para esto ltimo resulta ms adecuado el uso de la expresin biotecnologa molecular. 3UiFWLFDPHQWH OD WRWDOLGDG GH OR TXH SRQHPRV HQ QXHVWUD PHVD KD VLGR JHQpWLFDPHQWH PRGLcado. La domesticacin de plantas y animales supuso una alteracin muy drstica de sus genoPDV \ OD PHMRUD JHQpWLFD VXEVLJXLHQWH KD LGR DxDGLHQGR PRGLFDFLRQHV H[WHQVDV \ VXVWDQFLDOHV Lo importante es la naturaleza de los cambios introducidos y no los mtodos empleados para ello. De hecho, la ingeniera gentica es slo uno de esos mtodos - una modalidad ms de meMRUD JHQpWLFD \ VyOR VLUYH SDUD PRGLFDU XQR R SRFRV JHQHV GH IRUPD PX\ VHOHFWLYD 1R VHUYLUtD para obtener razas de perro tan distintas - en su tamao, morfologa y temperamento - como el Chihuahua y el Pit Bull Terrier, que en cambio han surgido de la mano del hombre gracias a los mtodos genticos ms tradicionales. En consecuencia, resulta absurdo denominar OGMs slo a los productos de la ingeniera gentica para contraponerlos a los supuestamente naturales. Casi nada de lo que ponemos en nuestra mesa es natural, hasta el punto que la mayora de los organismos de los que derivamos nuestro alimento han perdido su capacidad de sobrevivir por s mismos en la naturaleza. Es ms, para llegar a nuestra mesa han debido sufrir alteraciones JHQpWLFDV TXH OHV SULYHQ GH LQQLGDG GH VXVWDQFLDV QDWXUDOHV TXH VRQ Wy[LFDV R LQKLELWRULDV SDUD HO VHU KXPDQR 8QD YDULHGDG PRGHUQD PRGLFDGD SRU LQJHQLHUtD JHQpWLFD HVWi WDQ OHMRV GH VHU natural como las que la precedieron. Por fortuna! Ya que es obvio que natural no es sinnimo de inocuo. Se consideran organismos transgnicos aquellos cuyo genoma ha sido alterado por ingeniera JHQpWLFD R VL VH SUHHUH SRU VDVWUHUtD JHQpWLFD \D TXH ODV RSHUDFLRQHV IXQGDPHQWDOHV GH HVWD va experimental consisten en cortar y coser (unir) piezas de ADN. Un gen es un tramo de ADN (una secuencia construida con las bases A, T, G, C) que, en general, determina una protena (una secuencia de aminocidos), de acuerdo con las equivalencias plasmadas en la clave gentica. Mediante la nueva tecnologa se puede alterar un genoma por la adicin de uno o varios (pocos) genes que previamente no formaban parte de l o por la inutilizacin de uno o varios genes entre los ya existentes. Estas operaciones se hacen para conferir caracteres deseables y para eliminar FDUDFWHUHV LQGHVHDEOHV GHO RUJDQLVPR UHVSHFWLYDPHQWH REMHWLYRV TXH QR GLHUHQ GH ORV GH OD mejora gentica tradicional. (Q OR TXH GLHUHQ OD YLHMD \ OD QXHYD WHFQRORJtD HV HQ HO UHSHUWRULR JpQLFR TXH VH SXHGH PDQHjar - genes de la misma especie, en el caso de la vieja, y de cualquier especie, en el de la nueYD \ HQ HO PRGR GH LQWURGXFLU \ WUDQVIHULU OD PRGLFDFLyQ JHQpWLFD SRU YtD VH[XDO R SRU DGLFLyQ H[yJHQD WUDQVIRUPDFLyQ UHVSHFWLYDPHQWH /RV RUJDQLVPRV PRGLFDGRV SRU WUDQVIRUPDFLyQ VH suelen denominar transgnicos. Llamar transgnicos a los alimentos derivados de dichos organismos resulta menos apropiado porque, como dice el refrn, degradado es todo gen que entra por boca de cristiano. Es absurdo llamar transgnico al azcar procedente de una remolacha transgnica, ya que es un producto qumico puro, esencialmente indistinguible del aislado de la remolacha normal o de la caa de azcar. Con acertado criterio, los editores de esta obra han adoptado un tratamiento integral de todos ORV PpWRGRV REMHWLYRV \ ORJURV GH OD DOWHUDFLyQ JHQpWLFD GH ODV SODQWDV FRQ QHV SUiFWLFRV )DOWDQ en nuestro idioma obras que acerquen con rigor a una parte tan importante de nuestra cultura general. Las adaptaciones a los nuevos avances de textos preexistentes, hechas a menudo por un nico autor, suelen adolecer de falta de familiaridad con la nueva tecnologa. De aqu que la aproximacin adoptada en esta obra, segn la cual cada captulo est a cargo de verdaderos especialistas, sea la ms apropiada en la actualidad. Dr. Francisco Garca Olmedo, 2004

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Prlogo a la segunda edicin La buena fortuna de un libro lleva aparejada la esclavitud de su autor o autores, que quedan encadenados a la necesidad de mantenerlo vivo en sucesivas ediciones. Estamos ante la segunda edicin de Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal, un texto que, hace seis aos, supuso una esSOpQGLGD \ DIRUWXQDGD DSRUWDFLyQ D OD UHFHQVLyQ GH XQ iUHD WHFQRFLHQWtFD HQ YLJRURVD HEXOOLFLyQ \ de gran relevancia prctica. La necesidad de esta edicin surge de mltiples circunstancias, entre ODV TXH FDEH UHVDOWDU HO HQRUPH DYDQFH GHO FRQRFLPLHQWR TXH KD WHQLGR OXJDU OD UHGHQLFLyQ GH ORV UHWRV HQWRQFHV SODQWHDGRV \ OD DSDULFLyQ GH RWURV QXHYRV TXH KDQ GLYHUVLFDGR ORV REMHWLYRV prcticos de la disciplina. Adems, entre la aparicin de la primera edicin y la de esta segunda, ha RFXUULGR XQD FULVLV DOLPHQWDULD VLJQLFDWLYD TXH QR HV VHSDUDEOH GH RWUDV WDOHV FRPR OD HFRQyPLFD la climtica o la energtica. Segn todos los indicios, la crisis alimentaria va a ser duradera y obedece a factores mltiples: la subida del precio del petrleo, el bajo nivel de reservas, la especulacin, el incremento de la poblacin y del consumo per capita, el desvo de una parte sustancial de la produccin agraria hacia la fabricacin de biocombustibles, la disminucin de los rendimientos por el estrs debido al cambio climtico y la falta de inversin en innovacin agropecuaria. Parece como si el xito relativo de las ltimas dcadas hubiera hecho bajar la guardia. En particular, la tasa de crecimiento de la produccin de alimentos ha ido por detrs de la del crecimiento de la poblacin durante la ltima dcada, justo el tipo de comportamiento relativo que propuso Malthus hace ms de dos siglos. En el ltimo medio siglo, ha sido la mejora gentica la TXH KD WHQLGR HO SURWDJRQLVPR WpFQLFR HQ OD GHUURWD GH OD DPHQD]D PDOWXVLDQD \D TXH OD VXSHUcie de suelo laborable apenas ha crecido. En la actualidad, se ha adquirido de pronto conciencia de que no se sabe bien cmo se va a conseguir el aumento de la produccin de alimentos en un 70-100 % para el ao 2050, necesidad que se considera mnima para alimentar una poblacin proyectada de unos 9.000 millones de seres humanos que, adems, tendrn una demanda per cpita VLJQLFDWLYDPHQWH VXSHULRU D OD DFWXDO 6L VH TXLHUH ORJUDU GLFKR REMHWLYR KDEUHPRV GH VHU D~Q PiV HFDFHV HQ ODV SUy[LPDV GpFDGDV GH OR TXH OR KHPRV VLGR HQ ODV SUHFHGHQWHV Por supuesto, las respuestas a los retos planteados ni han sido ni sern exclusivamente tcnicas, pero todas las estrategias posibles han tenido y tendrn un importante componente tcnico y es sobre este componente sobre el que se centra el libro que ahora se reedita. El cambio climtico est alterando los estreses biticos y abiticos a que deben hacer frente las cosechas, lo que hace prioritaria la investigacin bsica y aplicada tanto en el esclarecimiento de los mecanismos involucrados como en la adaptacin de las cosechas tradicionales a las nuevas condiciones, as como el desarrollo de nuevas cosechas que sean ms apropiadas para condiciones extremas. La crisis energtica ha impulsado un nuevo inters por los biocombustibles, en los que se han centrado algunas esperanzas infundadas que han dado lugar a la formulacin de objetivos polticos que pueden tener consecuencias perjudiciales para la alimentacin mundial. As por ejemplo, los objetivos declarados para fechas prximas, tanto por lo EEUU como por la UE, estn determinando una competencia por el suelo agrcola de la generacin de biocombustibles con la produccin de DOLPHQWRV TXH QR SXHGH VLQR HQFDUHFHU VLJQLFDWLYDPHQWH ORV DOLPHQWRV \ DXPHQWDU HO Q~PHUR GH hambrientos en el mundo, as como contribuir a la destruccin de bosque tropical. Por otra parte, La bsqueda de especies y variedades aptas para la produccin de biocombustibles plantea retos formidables a la investigacin de su agronoma y a su mejora convencional y biotecnolgica. Es en el escenario que a grandes rasgos acabamos de esbozar, donde la presente edicin de %LRWHFQRORJtD \ 0HMRUDPLHQWR 9HJHWDO ,, PDQLHVWD VX SOHQR SRWHQFLDO \ GHEH DOFDQ]DU VX Pi[Lma funcionalidad. Dr. Francisco Garca Olmedo, 2010


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PARTE I Herramientas bsicas


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I - CAPTULO 1 Establecimiento de cultivos de tejidos vegetalesLuis Mroginski, Pedro Sansberro y Eduardo Flaschland 1 Introduccin El cultivo de tejidos en su acepcin amplia SXHGH VHU GHQLGR FRPR XQ FRQMXQWR PX\ KHWHrogneo de tcnicas que presentan en comn el hecho de que un explante (una parte separada del vegetal que pueden ser protoplastos clulas desprovistas de pared celular clulas, tejidos u rganos) se cultiva aspticamente en XQ PHGLR DUWLFLDO GH FRPSRVLFLyQ TXtPLFD GHQLGD \ VH LQFXED HQ FRQGLFLRQHV DPELHQWDOHV FRQWURODGDV /D LPSUHFLVLyQ GH HVWD GHQLFLyQ puede generar muchas polmicas, pero es actualmente aceptada. Generalmente es comn dividir las tcnicas del cultivo de tejidos en dos grandes grupos: a) cultivos en medios semisOLGRV \ E FXOWLYRV HQ PHGLRV OtTXLGRV ORV TXH a su vez pueden ser agitados (mediante el empleo de agitadores de uso continuo) o estacionarios. Tambin es frecuente dividir al cultivo de tejidos atendiendo a los niveles de complejidad en cultivo de rganos, cultivos celulares y cultivo de protoplastos. Para el establecimiento de los cultivos utilizando cualquiera de los sistemas es necesario tener en cuenta algunos aspectos generales comunes relacionados con el explante, la asepsia, el medio de cultivo y las condiciones de incubacin. La discusin de estos aspectos constituye el objetivo de este FDStWXOR $GLFLRQDOPHQWH VH LQFOX\H HO WHPD GH la aclimatacin de las plantas regeneradas in vitro, TXH HV GH JUDQ LPSRUWDQFLD HQ OD PD\RUtD de las aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura. 2 Explante Varios factores deben ser tenidos en cuenta en la eleccin del explante apropiado para el establecimiento de los cultivos in vitro, entre ellos:

1. Objetivo del cultivo: VL ELHQ HV GLItFLO WUDWDU GH FODVLFDU ODV DSOLFDFLRQHV TXH VH SHUVLJXHQ FRQ HO FXOWLYR GH WHMLGRV VH SRGUtD HVTXHPDWLzarlas en aplicaciones para: Estudios bsicos. En este caso, los explantes cultivados pueden ser diversos. Si lo nico que se quiere lograr es un sistema de callos SDUD HVWXGLDU DOJ~Q SURFHVR VLROyJLFR VH puede cultivar cualquier rgano, tejido o clula viva. En este caso en que lo nico que se busca es la induccin de callos lo ideal es cultivar explantes jvenes, derivados de semillas en germinacin, donde se obtienen respuestas rpidas y, en general, hay menores problemas de FRQWDPLQDFLyQ FRQ PLFURRUJDQLVPRV $ YHFHV se hace uso del cultivo de tejidos porque repreVHQWD XQ VLVWHPD H[SHULPHQWDO TXH VLPSOLFD la complejidad generada por los fenmenos de correlacin entre las distintas partes que normalmente estn presentes en una planta entera. El explante que se usar estar condicionado por lo que se quiere estudiar. Un buen ejemplo lo constituye el cultivo de ovarios fecundados del tomate para estudiar los requerimientos nutricionales durante el crecimiento GH ORV IUXWRV $VLPLVPR HO FXOWLYR GH yYXORV KD sido muy til para estudiar aspectos relacionaGRV FRQ OD IRUPDFLyQ GH ODV EUDV HQ DOJRGyQ El cultivo de discos de tallos brind una valiosa ayuda para estudiar la rizognesis in vitro. Obtencin de plantas con sanidad controlada. Es muy comn la utilizacin del cultivo de tejidos para la obtencin de plantas libres de virus (ver VIII.-9). El explante ideal para ello es el meristema (dependiendo de la especie, de 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo y de un par de primordios foliares. Micropropagacin. En este caso depender del sistema que se quiere utilizar. Si lo que se quiere explotar es la brotacin de meristemas, los pices terminales y los segmentos uninodales de ramas jvenes constituyen excelentes explantes. En este caso el cultivador de tejidos debe conocer perfectamente la ELRORJtD GH OD UHSURGXFFLyQ GH OD SODQWD SDUD aprovechar aquellos explantes que en forma natural son propgulos. En cambio, si se pretende micropropagar mediante el empleo de VHPLOODV VLQWpWLFDV YHU 3DUWH ,9 FDStWXOR HO explante original deber posibilitar la induccin


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de la embriognesis somtica. En este caso, la utilizacin de embriones zigticos inmaduros u hojas, suelen ser frecuentes como explantes. 2EWHQFLyQ GH KtEULGRV LQWHUHVSHFtFRV. Una de las primeras aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura lo constituy su empleo FRPR D\XGD SDUD OD REWHQFLyQ GH KtEULGRV GHULYDGRV GH FUX]DPLHQWRV LQWHUHVSHFtFRV GRQGH se produce el aborto temprano de embriones. En estos casos, el explante cultivado es el embrin cigtico en estadios tempranos de su GHVDUUROOR &RQ OD PLVPD QDOLGDG WDPELpQ VH utilizan ovarios u vulos fecundados. Obtencin de plantas de semillas con embriones rudimentarios 3DUD HVWD QDOLGDG ORV H[SODQWHV SXHGHQ VHU VHPLOODV SRU HM RUTXtGHDV R ELHQ VH DtVODQ ORV HPEULRQHV HQ XQ HVtado temprano de desarrollo (corazn) como en el caso de yerba mate o de algunas variedades de duraznero. Obtencin de plantas haploides (consiGHUDQGR FRPR KDSORLGH D XQ HVSRURWR TXH contiene el complemento gamtico de cromosomas). En este caso, los explantes ms utilizados son las anteras, aunque tambin pueden emplearse microsporas aisladas, vulos y ovarios no fertilizados. Induccin de variacin somaclonal. En este caso se pueden utilizar varios explantes, pero VL OD QDOLGDG GH VX XWLOL]DFLyQ HV OD DSOLFDFLyQ en planes de mejoramiento gentico de plantas, los explantes utilizados deben posibilitar la regeneracin de plantas enteras. Produccin y/o conversin de sustancias tiles. Se puede utilizar una gran variedad GH H[SODQWHV /RV GH UDtFHV VXHOHQ VHU PX\ utilizados. Obtencin de hbridos somticos. Para esta QDOLGDG VH UHFXUUH D OD IXVLyQ GH SURWRSODVWRV (Q OD PD\RUtD GH ORV FDVRV VH DtVODQ ORV SURWRSODVWRV GH PHVyORV GH KRMDV \ GH VXVSHQViones celulares. Conservacin e intercambio de germoplasma. Los meristemas son los explantes preferidos para el desarrollo de sistemas de conservacin D PHGLDQR \ ODUJR SOD]R FUtR FRQVHUYDFLyQ FRQ QLWUyJHQR OtTXLGR \ SDUD HO intercambio de material gentico.

Establecimiento de suspensiones celulares. En este caso se recomienda iniciar los culWLYRV D SDUWLU GH H[SODQWHV H[WUDtGRV GH VHPLOODV en germinacin (hipoctilo, epictilo, cotiledoQHV UDtFHV. 2. Posibilidad de contaminacin con microorganismos. De ser posible, se deben cultivar explantes de plantas donantes que crecen en condiciones de invernadero, con ello se reduce sustancialmente las tasas de contaminacin. Por otra parte, es recomendable evitar HO XVR GH H[SODQWHV VXFLRV UDtFHV UL]RPDV que provienen de plantas crecidas en macetas R HQ HO FDPSR GDGR TXH HQ OD PD\RUtD GH ORV casos no es posible conseguir una buena desinfeccin de los mismos. 3. (GDG VLROyJLFD. Este es un aspecto de JUDQ LQXHQFLD HQ OD PRUIRJpQHVLV &RPR UHJOD general se puede decir que cuando ms joven e indiferenciado se encuentre el explante a cultivar, mejor ser su respuesta in vitro. Es por ello que los meristemas apicales y axilares son ampliamente usados en numerosas especies. En el caso de la micropropagacin de plantas leosas, la edad del explante es un factor FUtWLFR 6L ORV WHMLGRV VRQ MyYHQHV OD PLFURSURpagacin tiene mayores posibilidades de ser exitosa que con tejidos maduros. Este hecho genera la necesidad de realizar tratamientos de rejuvenecimiento de las plantas donantes de explantes. 4. Tamao. En general, cuanto ms grande sea el explante mayores sern las posibilidades de inducir la proliferacin de callos o la regeneracin directa de rganos. Sin embargo, a mayor tamao de explante tambin son mayores las probabilidades de que los cultivos se contaminen con microorganismos. Tambin es necesario tener en cuenta que existe un taPDxR PtQLPR GHO H[SODQWH TXH GHSHQGH GH OD especie y del material vegetal, por debajo del cual no es fcil lograr el establecimiento de los cultivos. Los explantes muy pequeos suelen requerir del empleo de medios ms complejos o de los denominados medios acondicionados. 5. Epoca del ao. Es un factor que suelen tener mucha importancia en la micropropa gacin y que generalmente est asociado al

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grado de dormicin que presentan ciertos explantes (yemas, por ejemplo) y tambin con la posibilidad de mayor o menor proliferacin de microorganismos. 3 Asepsia Uno de los principales problemas que se presentan cuando se tratan de establecer los cultivos es el de la contaminacin de los mismos con diversos tipos de microorganismos KRQJRV OHYDGXUDV EDFWHULDV WRSODVPDV YLrus). El ambiente generado por explante-medio GH FXOWLYRFRQGLFLRQHV ItVLFDV GH LQFXEDFLyQ es altamente propicio para la proliferacin de muchos de estos microorganismos que pueden provocar la destruccin de los cultivos. Es GLItFLO FXDQWLFDU HO LPSDFWR GH HVWDV SpUGLGDV pero en promedio, en laboratorios dedicados a la micropropagacin se lo puede estimar en alrededor del 10%. En el mejor de los casos, estos microorganismos no destruyen los cultivos pero compiten con el explante por los nutrienWHV GHO PHGLR GH FXOWLYR R ELHQ OR PRGLFDQ (V PX\ GLItFLO FRQVHJXLU FXOWLYRV HVWULFWDPHQWH DVpSWLFRV GDGR TXH HQ OD PD\RUtD GH ORV casos es altamente probable que los mismos FRQWHQJDQ YLUXV \ WRSODVPDV SRU OR TXH HQ OD SUiFWLFD FXDQGR VH UHHUH D FXOWLYRV DVpSWLFRV HQ JHQHUDO VH TXLHUH VLJQLFDU TXH VRQ cultivos donde no se produce la proliferacin de hongos y bacterias. Dos son las fuentes de contaminaciones: a) microorganismos presentes en el interior o en OD VXSHUFLH GH ORV H[SODQWHV \ E IDOODV HQ ORV procedimientos de cultivo en el laboratorio. La correcta deteccin de estas fuentes y del tipo de microorganismo son aspectos importantes para el xito de los cultivos, pues por un lado ayuda a determinar la fuente de contaminacin \ SRU RWUR ODGR D\XGD D OD SODQLFDFLyQ GH ORV procedimientos para controlarlos. Varios gneros de bacterias (Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia, Enterobacter, Agrobacterium, Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, Mycobacterium, Corynebacterium) y de honJRV ODPHQWRVRV Aspergillus, Penicilium, Fusarium, Alternaria, Cladosporium y Neurospora) estn frecuentemente en los cultivos. Es conveniente inspeccionar visualmen-

te con la ayuda de un microscopio estereoscpico los cultivos en forma peridica (por lo menos semanalmente). Tambin se pueden realizar pruebas con medios de cultivo difeUHQFLDOHV \ WHVW ELRTXtPLFRV HVSHFtFRV Para evitar y/o minimizar las contaminaciones de los cultivos con microorganismos es necesario: 1) Conocer el material vegetal con que se traEDMD \ ORV SRVLEOHV FRQWDPLQDQWHV HVSHFtFRV 2) Realizar una adecuada preparacin de la planta dadora de explantes, cultivndola preferentemente en invernaderos tratadas con SURGXFWRV TXtPLFRV TXH HOLPLQHQ SDWyJHQRV \ HYHQWXDOHV PLFURRUJDQLVPRV HQGyWRV 3URFHGHU D OD GHVLQIHFFLyQ VXSHUFLDO GH los explantes mediante el uso de compuestos TXtPLFRV FRQ HO REMHWR GH HOLPLQDU ORV PLFURorganismos con el menor dao posible para el explante. Si bien no es posible recomendar un procedimiento general, se puede sealar que el procedimiento ms popularizado consiste en una doble desinfeccin mediante la inmersin de los explantes en etanol (70%v/v) durante 20-60 segundos seguido de hipoclorito de sodio 1 -3%, contenido en el agua de lavandina comercial, durante 3 a 30 minutos, dependiendo de la naturaleza del explante. $OJXQRV SURFHGLPLHQWRV VH EDVDQ HQ HO HPpleo de nicamente etanol o de hipoclorito de sodio. Finalmente, es necesario eliminar los restos de estos productos mediante varios lavados con agua destilada estril. En este ltimo punto hay que aconsejar que se utilice agua destilada estril de reciente preparacin, dado que est demostrado que el almacenaje prolongado del agua estril puede ser la causa de contaminaciones con bacterias. Es aconsejable realizar estas operacioQHV GH GHVLQIHFFLyQ VXSHUFLDO HQ XQD FiPDUD de transferencia con aire estril. En lugar del hipoclorito de sodio se puede utilizar hipoclorito de calcio (6 -12 %) o el cloruro de mercurio (0,1%- 1,5%). Es preciso recomendar extrema cautela con el empleo de este ltimo compuesto, dado que es altamente txico y adems no es removido con facilidad del explante.


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En los casos en que no se utilice etanol, la adicin de agentes tensoactivos junto con el desinfectante es una prctica recomendada. (QWUH ORV PiV XVDGRV JXUDQ 7ZHHQ 0.1%) o unas gotas de Triton. El lavado previo de los explantes con agua corriente y detergentes, ayuda a una mejor desinfeccin. La inmersin de los explantes en soluciones conteniendo sustancias antibiticas y /o antimicticas (gentamicina, sulfato de estreptomicina, ampicilina, tetraciclina, carbenicilina, sulfato de gentamicina, pentacloronitrobenceno, rifampicina, anfotericina B, benomil, carbendazim) puede ser de utilidad, pero deben ser utilizados en casos excepcionales. Estos productos tienen el inconveniente de que alteran la composicin de los medios de cultivo y adems pueden ser metabolizados por los explantes. ltimamente han aparecido soluciones biocidas que matan bacterias y hongos, previenen la germinacin de esporas y a altas concentraciones pueden eliminar contaminaciones GH PLFURRUJDQLVPRV HQGyWRV 8QR GH HVWRV compuestos es el PPM (Plant Preaservative Mixture). Otro ejemplo es el denominado G-1, un compuesto derivado de los furfurales de la FDxD GH D]~FDU (VWH FRPSXHVWR TXtPLFDPHQte: 1-(5-bromofur-2-il)-2- bromo-2-nitroeteno fue desarrollado en la Universidad Central de las Villas (Cuba) y tiene efecto bactericida y fungicida de amplio espectro. En los casos en que se utilicen plntulas crecidas in vitro como plantas donantes de explantes, es necesario desinfectar las semillas para su cultivo y germinacin y luego es aconsejable desinfectar tambin las plntulas resultantes. En algunos materiales vegetales se utiliza la preincubacin de los explantes mediante lo cual stos son desinfectados suavemente y precultivados durante 24 horas en un medio FRQWHQLHQGR VDFDURVD \ QDOPHQWH VRQ GHVLQfectados nuevamente y cultivados. 4) Emplear medios e instrumentos de cultivo esterilizados, es decir, liberados completamente de cualquier microorganismo vivo o espoUDV 3DUD OD HVWHULOL]DFLyQ HQ OD PD\RUtD GH ORV casos se hace uso del calor en sus diversas formas: llama directa, calor hmedo (en forma de vapor abierto o bajo presin), calor seco (aire caliente). Se pueden usar hornos a mi-

croondas. El agua caliente tambin puede ser usada. En el caso de sustancias termolbiles, OD HVWHULOL]DFLyQ VH SXHGH KDFHU PHGLDQWH OWUDFLyQ D WUDYpV GH OWURV EDFWHULROyJLFRV No es posible recomendar ningn sistema de esterilizacin dado que la exitosa destruccin de los microorganismos depende de mltiples factores entre los que interesan el tamao del recipiente, el tiempo de esterilizacin y la naturaleza de la sustancia a esterilizar. Sin embargo, se pueden dar algunas sugerencias: /D HVWHULOL]DFLyQ HQ HVWXIDV PHGLDQWH FDORU seco (aire caliente) es recomendable para esterilizar recipientes de vidrios secos (pipetas, cpsulas de Petri, tubos). En estos casos, 2-4 horas en estufas a 180-200 C brindan excelentes resultados. /D HVWHULOL]DFLyQ FRQ FDORU K~PHGR FRQ YDpor bajo presin (en autoclave o en una olla a presin). Es el procedimiento ms empleado para la esterilizacin de los medios de cultivo (salvo, como se indic ms arriba, para aquellos que posean componentes termolbiles). En este caso, lo ms comn es usar una presin de 1.46 kg.cm-2 durante 20 minutos, con lo que prcticamente se destruyen todas las formas de vida. Es importante que en todos los puntos del autoclave se alcance dicha temperatura, para lo cual hay disponibles cintas detectoras colorimtricas. 5) Cultivar los explantes en una cmara de WUDQVIHUHQFLD FRQ DLUH HVWpULO JDELQHWH GH Xjo laminar), localizada en un ambiente limpio y no expuesta a corrientes de aire. De no disponer este equipamiento, se pueden sustituir con cuartos esterilizados previamente con luz ultravioleta (nunca exponerse a la luz UV en forma directa). La mesada de trabajo y las paredes del gabinete deben ser desinfectadas previamente con etanol al 70%. De la misma manera deben ser desinfectados exteriormente todos los recipientes (conteniendo medios de cultivo, agua, etc.) que ingresen en el rea del aire estril. Los operarios constituyen frecuentemente una importante fuente primaria de contaminacin, porque es recomendable que, antes de comenzar a trabajar laven sus manos y antebrazos con abundante agua y jabn y se des-

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infecten con etanol al 70 %. La utilizacin de guardapolvos, guantes y mscaras protectoras GH OD ERFD \ GH OD QDUL] DVt FRPR ORV JRUURV protectores de los cabellos, ayudan a reducir sensiblemente los niveles de contaminacin. Los instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, tijeras, agujas, cpsulas de Petri) deben ser esterilizados antes de su uso. Muchos de estos instrumentos pueden ser colocados en etanol al 95% y, antes de ser usados, se deben DPHDU FXLGDGRVDPHQWH HQ OD OODPD GH XQ PHFKHUR 7DPELpQ HV QHFHVDULR DPHDU OD ERFD de los recipientes que contienen los medios de cultivo antes y despus de cultivar el explante. 6) Incubar los cultivos en cmaras o cuartos de cultivo, cerrados, libres de corrientes de aire y bien higienizados. En lo posible se debe restringir la circulacin de personas, y los recipientes con cultivos contaminados deben ser rpidamente eliminados de este sector. Es conveniente que antes del lavado, estos cultivos sean esterilizados. 4 Medios de cultivo 8Q PHGLR GH FXOWLYR SXHGH VHU GHQLGR como una formulacin de sales inorgnicas y compuestos orgnicos requeridos para la nutricin y manipulacin de los cultivos. Existen numerosas formulaciones, cada una de las cuales comprende entre 6 y 40 compuestos. Para dar una idea de la cantidad de formulaciones disponibles, George y col., luego de UHYLVDU PiV GH WUDEDMRV FLHQWtFRV GHVcriben en dos tomos (casi 1.000 pginas en total) ms de 2.000 medios de cultivo. Tambin dos empresas multinacionales ofrecen para la venta ms de 60 medios cada una, listos para su utilizacin especialmente en la micropropagacin comercial de plantas. En la Tabla 1 se presentan tres medios que son muy usados en la actualidad. Bsicamente, los medios de cultivo se componen de compuestos que suministran: 8QD IXHQWH GH FDUERQR 1XWULHQWHV PLQHUDOHV 6XVWDQFLDV YLWDPtQLFDV 6XVWDQFLDV UHJXODGRUDV GHO FUHFLPLHQWR $JHQWH JHOLFDQWH HQ HO FDVR GH PHGLRV semislidos)

Tabla 1: Composicin de tres medios bsicos usados en el cultivo in vitro de tejidos.Compuestos Medio bsico MS N6 1.650 1.900 170 440 ----370 ----0,83 ----6,20 22,30 8,60 0,25 0,025 27,80 37,30 0,025 2,00 0,10 0,50 Nicotnico 100,00 30.000,00 5,7-1- 1. 1

B5 ----2.500 ----150 134 250 150 0,75 10,00 3,00 ----2,00 0,25 0,025 27,80 37,30 0,025 ----10,00 1,00 0,50 100,00 20.000,00 5,5

NH 4NO3 KNO 3 KH 2PO4 CaCl 2.2H 2O (NH4) 2SO 4 MgSO4.7H 2O NaH 2PO 4.4H 2O KI MnSO 4.H2O H 3BO 3 MnSO 4.4H 2O ZnSO 4.7H 2O Na2MoO 4.2H 2O CuSO 4.5H 2O FeSO 4.7H 2O Na2EDTA CoCl 2.6H 2O Glicina Tiamina -HCl Piridoxina -HCl cido 1,00 Mioinositol Sacarosa PH1)

----2.830 400 166 463 185 ----0,80 ----1,60 4,40 1,50 --------27,85 37,25 ----2,00 1,00 0,50 0,50 ----50.000,00 5,8

Composicin en mgL

MS = Medio de Murashige y Skoog (Physiol. Plant. 15: 473 - 97. 1962) N6 = Medio de Chu,C.C., Wang,C:C., Sun,C.S., Hsu, C., Yin, K,C., y Chu, C. (Sci. Sinica 18: 6 59- 668. 1975) B5 = Medio de Gamborg, O.L., Miller,R.A. y Ojima, K. (Exp.Cell Res. 50: 151 - 158. 1968)

2WURV FRPSXHVWRV Fuente de carbono: Prcticamente todos los cultivos son hetertrofos (comparativamente unos pocos son auttrofos) y por ende necesitan del suministro de una fuente de carbono. La sacarosa, en concentraciones de 2 al 5%, es el azcar ms utilizado. En algunos medios se la reemplaza por glucosa. En casos particulares se cita el empleo de maltosa o galactosa. Tambin myo-inositol (100 mg/L) suele ser incorporado a los medios resultando un mejor crecimiento de los cultivos. Nutrientes minerales: Los medios de cultivo deben suministrar los mismos macro y micronutrientes que son esenciales para el crecimiento de las plantas enteras. En general se destacan las concentraciones relativamente


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altas de nitrgeno y potasio. El nitrgeno es suministrado en forma de amonio y/o nitrato. Tambin se pueden utilizar urea, glutamina y FDVHtQD KLGUROL]DGD (V IXQGDPHQWDO TXH HO KLHrro sea incorporado juntamente con un agente TXHODQWH 1D('7$ OR TXH OR KDFH GLVSRQLEOH es un amplio rango de pH. Sustancias vitamnicas: De todas las que comnmente se incorporan a los medios, pareciera que la tiamina es la nica realmente imprescindible para el buen crecimiento de los cultivos. Sustancias reguladoras del crecimiento: En OD PD\RUtD GH ORV FDVRV ORV PHGLRV XWLOL]DGRV para el establecimiento de los cultivos conWLHQHQ DX[LQDV $1$ ' $,$ $,% 12$ 'LFDPED 3LFORUDP \R FLWRFLQLQDV %$ .,1 =($ L3 7KLGLD]XUyQ /DV JLEHUHOLQDV HVSHFLDOPHQWH *$ VRQ UHTXHULGDV HQ DOJXQDV ocasiones para el cultivo de meristemas o para OD HORQJDFLyQ GH EURWHV (O $%$ HV XVDGR HQ algunos casos. $JHQWH JHOLFDQWH HQ HO FDVR GH PHGLRV VHmislidos): El agar (entre 0,6 y 1%) es el compuesto ms utilizado. Tambin pueden emSOHDUVH $JDUJHO 7UDQVIHUJHO (2,0-2,60%), Phytagel (0,25- 0,40%), agarosa (0,80-0.90%) y Gelrite (0,10-0,20%). Otros compuestos: Muchas sustancias, de YDULDGD FRPSRVLFLyQ TXtPLFD VXHOHQ VHU DGLFLRQDGDV D ORV PHGLRV EiVLFRV $GHPiV GH OD glicina, otros aminocidos se pueden agregar a los medios. Es el caso de L-tirosina, asparaJLQD \ FLVWHtQD DXQTXH KD\ TXH WHQHU SUHVHQWH que en dosis altas pueden inhibir el crecimiento de los cultivos. El carbn activado (0,1 a 5%) suele ser incorporado al medio, dado que es probable que absorba metabolitos txicos para los cultivos. En algunos medios se incorporan cidos RUJiQLFRV FRPR HO PiOLFR HO FtWULFR HO SLU~YLFR \ HO VXFFtQLFR \ HV IUHFXHQWH HO HPSOHR GH /JOXWDPLQD \ GH FDVHtQD KLGUROL]DGD $~Q KR\ se siguen utilizando ciertos componentes de FRPSRVLFLyQ TXtPLFD QR ELHQ GHQLGD FRPR HO

agua de coco (5 a 15%), jugo de tomate y pur de banana. Tambin en ocasiones es necesaria la incorporacin de agentes antioxidantes /FLVWHtQD iFLGR DVFyUELFR SROLYLQLOSLUUROLGRna) para prevenir el ennegrecimiento tisular causado por la oxidacin de polifenoles presentes en los explantes. Este ennegrecimiento puede causar la muerte de los mismos. La preparacin de los medios de cultivo puede llevarse a cabo de diferentes maneras, en lecturas recomendadas se citan manuales de laboratorio donde se describen detalladamente este punto. 5. Condiciones incubacin. ambientales para la

La incubacin de los cultivos se debe llevar a cabo en condiciones controladas. Por lo meQRV HQ OR TXH VH UHHUH D WHPSHUDWXUD FDOLGDG H LQWHQVLGDG GH OX] IRWRSHUtRGR KXPHGDG DWmosfrica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cmaras climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire DFRQGLFLRQDGR IUtRFDORU \ XQD EXHQD \ XQLforme circulacin de aire en el interior y dotados de un buen sistema de alarma para cortar la iluminacin en caso de no funcionar el aire acondicionado. En general, los cultivos son incubados a temperatura constante de 25-28 C, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz HV JHQHUDOPHQWH SURYLVWD SRU OiPSDUDV XRUHVFHQWHV GHO WLSR OX] GtD FRQ XQD LUUDGLDQFLD GH HQWUH \ PRO PV /D KXPHGDG DWmosfrica debe ser elevada (80- 90%). 6 Aclimatacin de las plantas regeneradas in vitro. 'XUDQWH HO SHUtRGR GH LQFXEDFLyQ ORV FXOWLYRV VRQ H[SXHVWRV D FRQGLFLRQHV DPELHQWDOHV GLVtmiles al ambiente externo. La atmsfera interna se caracteriza por presentar una considerable variacin diurna en la concentracin de CO2, humedad relativa elevada, temperatura consWDQWH H LQWHQVLGDG OXPtQLFD EDMD $ VX YH] HO medio de cultivo compuesto por concentraciones elevadas de azcares (en aquellos sistemas hetertrofos y semiauttrofos de micropropagacin), sales y reguladores del crecimiento,

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sumado a la ausencia de microorganismos, generan anormalidades morfolgicas, anatPLFDV \ VLROyJLFDV TXH ODV SODQWDV GHEHUiQ corregir cuando son transferidas al ambiente H[WHUQR (VWH SHUtRGR GH DGDSWDFLyQ DO QXHYR hbitat es llamado fase o etapa de aclimatacin. La estrategia a implementarse durante el mencionado ciclo deber contemplar el control minucioso de los parmetros ambientales (humedad, temperatura y luz) de tal manera que permita disminuir la deshidratacin y, al mismo WLHPSR HVWLPXODU OD IRWRVtQWHVLV FRQ HO REMHWR GH generar un rpido crecimiento de los plantines. (O UHWUDVR HQ HO GHVDUUROOR GH OD FXWtFXOD \ OD escasa funcionalidad del aparato estomtico TXH SUHVHQWDQ ODV KRMDV GH OD PD\RUtD GH ODV especies cultivadas in vitro, determinan una alta tasa de transpiracin que puede ocasionar la muerte por deshidratacin. El control de este SURFHVR VLROyJLFR HV GH YLWDO LPSRUWDQFLD GXrante la aclimatacin, teniendo en cuenta que la disminucin de la transpiracin ser gradual y depender de la rehabilitacin de los estomas, DVt FRPR WDPELpQ GHO GHVDUUROOR GH OD FXWtFXla. El equipamiento necesario estar sujeto a la especie, pudiendo utilizarse desde tneles de polietileno para plantas que posean un elevado control de la transpiracin (por ej. Malus pumila o Agave tequilana) o bien, a travs del empleo de cmaras climatizadas (Fig.1) equipadas con sensores que permiten un descenso paulatino de la humedad relativa. En algunos casos puede resultar necesaria la aplicacin exgena de $%$ KRUPRQD LQYROXFUDGD HQ HO FRQWURO GHO FLHrre de los estomas) o bien, el empleo de sustancias antitranspirantes que forman una capa VHPLSHUPHDEOH HQ OD VXSHUFLH GH OD KRMD (Q este ltimo caso debern tomarse algunas precauciones debido a que pueden observarse reDFFLRQHV GH WRWR[LFLGDG Resulta imprescindible evitar la exposicin a temperaturas extremas tanto en la fase area como en el substrato. Mediante el empleo de extractores y/o acondicionadores de aire combinados con un sistema de niebla, es posible establecer la temperatura de la fase gaseosa entre los 25 y 30 C durante la estacin estival, mientras que en la poca invernal es necesario, a veces, el empleo de mantas trmicas o serpentinas, sea de agua o aire caliente a nivel

del substrato, para mantener la temperatura por encima de los 18-20 C. Sin lugar a dudas, la opcin ms econmica es el empleo de la luz natural, disminuyendo su irradiancia (20-50%) mediante el agregado de mallas de sombreado (saram). No obstante, en aquellas latitudes donde el nivel medio de OX] QDWXUDO HV EDMR \ ORV GtDV VRQ FRUWRV GXrante una parte considerable del ao, la luz arWLFLDO SXHGH VHU DSOLFDGD FRPR FRPSOHPHQWR GH OD OX] QDWXUDO /DV OiPSDUDV WXEXODUHV XRUHVFHQWHV GHO WLSR OX] GtD VRQ HPSOHDGDV HQ KRUWLFXOWXUD SDUD SURORQJDU HO IRWRSHUtRGR $VLPLVPR ODV OiPSDUDV WXEXODUHV GH VRGLR DOWD presin presentan una distribucin espectral GH OD HQHUJtD DGHFXDGD SDUD HVWLPXODU IRWRVtQWHVLV \ VH HPSOHDQ SDUD WDO Q HQ XQD DPSOLD variedad de cultivos. Otro aspecto importante a tener en cuenta lo constituye la eleccin del substrato, siendo el adecuado aquel que permita el normal creciPLHQWR \ GHVDUUROOR GH ODV UDtFHV 6H SXHGH HPplear: arena, perlita, turba, vermiculita, o mezclas de ellos, teniendo la precaucin de realizar una esterilizacin previa. Es conveniente el agregado de fertilizantes, sea a travs del substrato (fertilizantes de liberacin controlada) o bien mediante el sistema de riego (fertilizantes solubles); emplendose proporcioQHV ULFDV HQ IyVIRUR 13. \ SRWDVLR 13. TXH IDYRUHFHUiQ HO GHVDUUROOR UDGLFXODU \ OD UXVWLFDFLyQ GH ODV SODQWDV En todo momento deber realizarse un riguURVR FRQWURO WRVDQLWDULR HPSOHiQGRVH DQWLELyWLcos, fungicidas e insecticidas de uso universal. En la Figura 1, se detalla un modelo de cmara de aclimatacin diseada por los autores y empleada por el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Instituto de Botnica del Nordeste. Bsicamente, est compuesta por una fase area construida en aluminio y policarbonato alveolar (9) y un recipiente o batea (11) que FRQWLHQH JUiQXORV GH DUFLOOD H[SDQGLGD D Q GH facilitar el drenaje. Mediante el agregado de arena u otro substrato adecuado, esta cmara puede ser utilizada tanto para el enraizamiento ex vitro de los brotes obtenidos en la etapa de PXOWLSOLFDFLyQ DVt FRPR WDPELpQ SDUD HO HQUDL]DPLHQWR FRQYHQFLRQDO D UDt] GHVQXGD de estacas de tallos u hojas.


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La humedad relativa de la fase area es controlada por un sensor (6) ubicado por encima GH OD WXEHUtD GH ULHJR (O VLVWHPD KXPLGLcador est compuesto por picos tipo fog y es alimentado por una bomba de bajo caudal y alta presin (13). Con el propsito de evitar el goteo que pudiese ocasionar el agua remaQHQWH HQ ODV FDxHUtDV HO VLVWHPD FRQVWD GH una vlvula solenoide de descarga y desage (7). La fase gaseosa es renovada en forma intermitente mediante el empleo de extractores ubicados en ambos extremos de la cmara (3) los que, conjuntamente, introducen o extraen aire, generando un movimiento masal.

'HELGR D OD ODWLWXG JHRJUiFD HQ TXH VH HQcuentra, la cmara est equipada con un aconGLFLRQDGRU GH DLUH IULJRUtDV SDUD HYLWDU situaciones de estrs trmico en poca estival. $ VX YH] \ GDGR TXH OD PD\RUtD GH ODV HVSHcies estudiadas son originarias de climas tropicales y subtropicales, el sistema cuenta con mantas trmicas que son colocadas por debajo de los tubetes, manteniendo la temperatura del substrato durante el invierno. En este ltimo caso se agrega un material aislante entre la leca (10) y la malla de hierro (16) de tal manera de dirigir el calor hacia la fase area.

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7. Agradecimientos. /RV DXWRUHV DJUDGHFHQ DO ,QJ 3DEOR $ /XQD SRU OD SODQLFDFLyQ GLJLWDO GH OD FiPDUD GH DFOLPDWDFLyQ $ OD 6HFUHWDUtD *HQHUDO GH &LHQFLD y Tcnica (UNNE) y al Establecimiento La CaFKXHUD SRU HO DSRUWH QDQFLHUR UHFLELGR SDUD construir la misma. 8. Lecturas Recomendadas*(25*( () '-0 38772&. \ +- *(25GE. 1987. Plant Culture Media . Vol. 1 (Formulations and Uses). Exegetics Limited. England. 567 pg. *(25*( () '-0 38772&. \ +- *(25*( 1988. Plant Culture Media . Vol. 2 (Commentary and analysis). Exegetics Limited. England. 420 pg. +857$'2 '9 \ 0(5,12 0( &XOWLYR GH Tejidos Vegetales. Ed.Trillas. Mxico. 232 pg. PREZ PONCE, J.N. 1998. Propagacin y Mejora *HQpWLFD GH 3ODQWDV SRU %LRWHFQRORJtD ,QVWLWXWR GH %LRORJtD GH 3ODQWDV6DQWD &ODUD &XED pg. 326326,/29$ - , 7,&+$ 3 .$'/(&(. ' +$,6(/ 6 3/=$.29$ $FFOLPDWL]DWLRQ of micropropagated plants to ex vitro conditions. Biologia Plantarum 42: 481-497. 52&$ :0 \ /$ 052*,16., VHJXQGD HGLFLyQ &XOWLYR GH WHMLGRV HQ OD $JULFXOWXUD )XQGDPHQWRV \ DSOLFDFLRQHV &,$7 &DOL &RORPbia, 970 pg. 7255(6 $& /$ &$/'$6 \ -$ %862 Cultura de Tecidos e Transformacao Gentica de Plantas. (Vol.1) Embrapa. Brasil.509 pg. 7255(6 $& /$ &$/'$6 \ -$ %862 Cultura de Tecidos e Transformacao Gentica de Plantas. (Vol.2) Embrapa. Brasil.355 pg.


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I - CAPTULO 2 MorfognesisSilvia Radice 1.- Introduccin La embriognesis somtica y la organognesis son dos procesos morfognicos muy frecuentes en el cultivo in vitro de especies vegetales. La embriognesis somtica es el proceso por el cual se obtiene una estructura similar a un embrin cigtico sin que medie la fertilizacin de las gametas, mientras que por organogQHVLV SXHGHQ REWHQHUVH WDOORV UDtFHV R RUHV Estos rganos son inducidos a partir de una clula o de un grupo de clulas que, segn las condiciones de cultivo, tienen la propiedad de mantenerse en activa divisin. Esta totipotencialidad celular fue enunciada por Haberlandt en 1902, quien propuso la teoUtD GH TXH WRGDV ODV FpOXODV YHJHWDOHV WLHQHQ la capacidad de regenerar plantas completas. Haberlandt no lleg a demostrar su hiptesis debido a que no pudo lograr la divisin celular. Los medios de cultivo que empleaba no LQFOXtDQ UHJXODGRUHV GHO FUHFLPLHQWR GHELGR D que esos compuestos eran an desconocidos. Los avances en el cultivo de tejidos vegetales IXHURQ PX\ OHQWRV HQ VXV LQLFLRV (Q :KLte pudo mantener, en forma ilimitada, el creciPLHQWR GH UDtFHV HQ PHGLRV OtTXLGRV D SDUWLU GH iSLFHV GH WRPDWH $O PLVPR WLHPSR VH LGHQWLFy HO iFLGR LQGRO DFpWLFR $,$ TXH SRVLELOLWy HO PDQWHQLPLHQWR LQGHQLGR GH FDOORV GH ]Dnahoria y tabaco in vitro. Posteriormente se descubri el efecto de la leche de coco como estimulante de la formacin de callo sobre el cultivo de embriones de Datura stramonium. En 1948 Skoog y Tsui, trabajando con cultivos de callo de tabaco, demostraron la existencia GH XQD UHJXODFLyQ TXtPLFD HQ OD SDUWH DpUHD \ HQ OD UDt] 7UDEDMRV SRVWHULRUHV HQ FDOORV GH OD misma especie, con el agregado de cinetina, la primera citocinina descubierta, permitieron GHPRVWUDU TXH OD GLIHUHQFLDFLyQ GH EURWHV UDtces o de ambos, era regulada por el balance de auxinas/citocininas.

7LSRV GH PRUIRJpQHVLV 'HQLFLRQHV En condiciones de cultivo in vitro, las clulas somticas pueden regenerar embriones (Fig R EURWHV UDtFHV \R RUHV )LJ FRPR UHVSXHVWD D XQ GHWHUPLQDGR HVWtPXOR /D UHJHQHracin es un proceso que comprende diferentes fases que se suceden de manera similar para los tres tipos de morfognesis citadas. De .OHUN \ FRODERUDGRUHV HQ GHQRPLQDURQ a estas diferentes fases como adquisicin de la competencia; fase de induccin y fase de realizacin. En la primera fase, las clulas no responGHQ DO HVWtPXOR RUJDQRJpQLFR SHUR DGTXLHUHQ esa competencia durante una fase de desdiferenciacin. En la segunda fase o fase de inGXFFLyQ ODV FpOXODV VRQ UHFHSWLYDV DO HVWtPXOR morfognico y hay una relacin directa con el tipo, concentracin y combinacin de reguladores del crecimiento agregados al medio de cultivo y el rgano a desarrollar. En la fase de realizacin, la clula sufre las sucesivas divisiones para formar el rgano determinado. $ SDUWLU GH OD VLHPEUD in vitro de diferentes explantes relativamente grandes y en condiciones de cultivo adecuadas, puede inducirse la formacin de nuevos rganos de manera directa, sin la formacin de callo. Si la formacin es GH EURWHV UDtFHV R RUHV VH GHQRPLQD organognesis directa. Si en cambio se induce la formacin de embriones somticos, este proceso se denominar embriognesis directa (Figs. 1 y 3). Si por el contrario, a partir de la siembra de un explante in vitro se observa la proliferacin de clulas en forma desordenada y sin ninguna funcin predeterminada, se iniciar la produccin de callos o suspensiones celulares (Figs. $ \ /D GLIHUHQFLDFLyQ GH yUJDQRV D SDUWLU de callos, denominada morfognesis indirecta, estar condicionada a la previa formacin de los meristemoides. Morfognesis directa o indirecta fueron trminos propuestos por Hicks en1980. 3.- Histologa de la morfognesis Despus de 48 horas de realizada la siembra del explante en el medio de cultivo adecuado,

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Figura 1: A-F embriognesis somtica obtenida por cultivo in vitro. A-C-E, embriognesis somtica en diferentes fases de crecimiento observada en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivado en MS + 1 mg l-1 de %$3 B-D-F, embriognesis somtica obtenida en diversos cultivares de Prunus sp a partir de embriones zigticos inmaduros cultivados en MS + 0,1 mg l-1 GH $1$ PJ O-1 GH .LQ FRQ XQD SUHYLD LQGXFFLyQ HQ 06 + 2 mg l-1 de 2,4-D. Las reglillas representan 5 mm.

D SDUWLU GH XQD FpOXOD HSLGpUPLFD R GHO PHVyOR IROLDU FRPR RFXUUH HQ ODV FRQtIHUDV VH VXFHGHQ XQD VHULH GH GLYLVLRQHV PLWyWLFDV $Vt VH pueden observar, a travs del estudio histolgico, pequeas masas de clulas que contienen citoplasma denso y grandes nucleolos. Este conjunto de clulas, agrupadas a modo de esferas, fueron denominadas meristemoides por Torrey en 1966, y son responsables de la dife-

renciacin de los nuevos rganos. Este tipo de meristema puede iniciarse en forma directa, a partir de clulas diferenciadas pertenecientes a un explante cultivado in vitro, o indirectamente, a partir de una clula o grupo de clulas diferenciadas que promueven la proliferacin celuODU )LJ $ 6X HYROXFLyQ GHWHUPLQDUi HO FUHcimiento de un rgano, por ejemplo una yema adventicia (Fig 4 B).


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Figura 2: A-E Organognesis somtica obtenida por cultivo in vitro. A, callo organognico obtenido en Abelia sp $QGUp 5HKGHU FXOWLYDGD HQ 06 PJ O-1 de picloran. B ,QLFLR GH EURWHV HFKDV HQ KRMDV crecidas in vitro de Crimson Gold (Prunus persica L.) cultivadas en MS + 0,1 mg l-1 GH $1$ PJ O-1 de .LQ C, Brotes de Gerbera jamesonii %ROXV REWHQLGRV D SDUWLU GHO FXOWLYR GH FDStWXORV RUDOHV HQ 06 mg l-1 GH ,%$ PJ O-1 GH %$3 PJ O-1 GH *$3. D EURWHV RUHFLGRV in vitro de Abelia sp $QGUp Rehder cultivados en MS + 1 mg l-1 GH %$3 E UDtFHV HFKDV FUHFLGDV GH FDOOR GH Abelia sp $QGUp 5Hhder cultivadas en inducidas en MS + 1 mg l-1 de 2iP, previamente inducidas con 1 mg l-1 de picloran. Las reglillas representan 5 mm

Las clulas embriognicas son similares a las clulas meristemticas debido a que no son demasiado voluminosas, tienen gran cantidad de ribosomas, citoplasma denso, un nucleolo agrandado y pequeos granos de almidn. Estas clulas, que en general se agrupan, pueden variar en tamao y nmero. Dentro de un gru-

po de clulas embriognicas, el desarrollo de las mismas no est sincronizado. Estas clulas son capaces de dividirse o de transformarse en embriones segn las condiciones del medio GH FXOWLYR $TXHOODV FpOXODV TXH QR GHVDUUROODQ proembriones comienzan el proceso de diferenciacin, es decir se vacuolizan, disminuye

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noso, sufre divisiones polarizadas formando un embrin globular. Previo a esta polarizacin se deposita almidn, luego se forma la epidermis \ DGTXLHUH VLPHWUtD ELODWHUDO 6XFHVLYDPHQWH VH observa el crecimiento de uno o ms cotiledones, el desarrollo de los tejidos provasculares, la iniciacin de los pices radicales y de tallo y XQD SURJUHVLYD DFXPXODFLyQ GH DOPLGyQ OtSLGRV \ SURWHtQDV En el caso de un origen multicelular de los embriones somticos pueden observarse diversos patrones. Los embriones somticos se forman a partir de grupos de clulas epidrmicas y subepidrmicas (Fig 4 C). Este tipo de ontogenia de origen multicelular se llama comnmente budding o embriognesis adventicia. Estas clulas pequeas tienen una alta relacin ncleo/ citoplasma, citoplasma denso y un nucleolo voluminoso que se tie fuertemente. Se diferencian de las clulas embriognicas por la falta de sustancias de reserva, por su delgada pared celular y su frecuente divisin celular. Estas estructuras se denominan proembriones JOREXODUHV )LJ $ % (Q una etapa posterior desarrollan una epidermis, un tejido provascular, acumulan material de reserva y se polarizan. Estas estructuras globulares desarrollan cotiledones y se transforman en embriones somticos que presentan pices caulinar y radicular. Para una misma especie puede ocurrir uno u otro tipo de inicio segn las condiciones de cultivo. El desarrollo de un embrin somtico de origen unicelular es comparable a la de un embrin cigtico. En dicotiledneas, la etapa globular es seguida por una etapa corazn que Fig. 3: Esquema de los diferentes procesos morfognicos obtenidos se corresponde con la adquia partir de la siembra in vitro GH GLIHUHQWHV H[SODQWHV /DV OtQHDV FRQtinuas expresan organognesis o embriognesis directa mientras que VLFLyQ GH OD VLPHWUtD ELODWHUDO ODV OtQHDV TXHEUDGDV LQGLFDQ TXH OD PRUIRJpQHVLV VH REWLHQH SRU YtD desarrollo de la epidermis, el volumen de ncleo y nucleolo y desaparecen los grnulos de almidn. Las experiencias demuestran que las clulas embriognicas se desarrollan slo cuando se PRGLFDQ ODV FRQGLFLRQHV GH FXOWLYR (Q JHQHral, cuando se reducen las cantidades de auxina y citocinina o se elimina la auxina. Las clulas embriognicas desarrollan como embriones cuando las condiciones experimentales permiten que estas expresen su potencial. Pueden ocurrir dos condiciones ontognicas diferentes, es decir que el origen de los embriones sea unicelular o pluricelular. En el caso de iniciarse a partir de una clula, la PLVPD VH DtVOD GH ODV GHPiV SRU XQD LPSRUWDQWH PRGLFDFLyQ HQ VX SDUHG FHOXODU HQ SDUWLFXODU SRU OD JHOLFDFLyQ GH OD ODPLQLOOD PHGLD (VWD clula, rodeada por un polisacrido mucilagiindirecta.


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Figura 4: A-E Cortes histolgicos de diferentes explantes cultivados in vitro. A PHULVWHPRLGHV HFKDV observados en cultivo de Silybum marianum L. en MS + 1 mg l-1 GH $,$ PJ O-1 GH %$3 [ B, yemas DGYHQWLFLDV HFKDV HQ iSLFHV GH Fragaria x ananassa Duch. cultivados en Boxus + 0,1 mg l-1 GH ,%$ mg l-1 GH %$3 PJ O-1 GH *$3 4 x. C JUXSR GH FpOXODV HPEULRJpQLFDV HFKDV HQ Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn. 20 x. D, embriones somticos en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn 10 x. E, embriognesis secundaria en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn 10 x.

de los estratos procambiales y de manera sucesiva el desarrollo del pice radical. El pice de tallo se desarrolla ms tarde, durante la etapa cotiledonar. En los embriones somticos de algunas especies hay una etapa intermedia entre la globular y corazn llamada oblonga, que corresponde a la individualizacin del pice de

OD UDt] \ DO SURFDPELXP HQ UHVSXHVWD D OD HORQgacin axial del embrin somtico debido al transporte de auxinas (Fig 1 C). Los embriones de origen multicelular obtenidos por budding muestran la misma ontogenia que ORV FLJyWLFRV FRPR DVt WDPELpQ OD SURGXFFLyQ de sustancias de reserva.

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Sin el seguimiento histolgico detallado, la formacin del embrin somtico slo puede ser FRQUPDGD SRU OD JHUPLQDFLyQ )LJ ) 6LQ embargo, debido al bajo porcentaje de embriones que llegan a esta etapa, esta tarea es casi imprescindible para una correcta evaluacin de las respuestas encontradas con los diversos medios de cultivo empleados. Comparados con los embriones cigticos de la misma especie, los embriones somticos frecuentemente desarrollan de manera anormal R VRQ LQPDGXURV /D DQRPDOtD PiV IUHFXHQWHmente encontrada es la formacin doble o triple del sistema vascular, causada por la pobre polarizacin del transporte de auxinas. Tambin se puede encontrar un contenido excesivamente alto, reducido o ausente de las reservas de almidn y/o proteicas, que el meristema apical o radical no estn desarrollados o que la embriognesis sea repetitiva o secundaria (Fig 4 E). La falta del meristema apical o una escasa deposicin de sustancias lipoproteicas en los embriones somticos de algunas especies no GHEH VHU WRPDGD FRPR XQD DQRUPDOtD (VWR SXHGH VHU XQ VtQWRPD GH LQPDGXUH] GHELGR a la rpida formacin de los mismos. En este caso una etapa intermedia que permita la maduracin de las estructuras formadas permitir incrementar el porcentaje de embriones somticos capaces de germinar. 4.- Factores que afectan los procesos morfognicos Los cuatro principales factores que condicionan la obtencin y el crecimiento de nuevos rganos in vitro son: 4.1.- el genotipo 4.2.- las FRQGLFLRQHV TXtPLFDV seleccionadas para realizar el cultivo. 4.3.- las FRQGLFLRQHV ItVLFDV seleccionadas para realizar el cultivo. 4.4.- el explante. 4.1.- El genotipo es un factor determinante en todos los procesos morfognicos, desde la capacidad del explante para su establecimiento en condiciones in vitro a la proliferacin de callo, o la diferenciacin y crecimiento de nuevos rga-

nos. Por esta causa, no es posible generalizar PHWRGRORJtDV R SURWRFRORV GH WUDEDMR GHELGR D TXH ORV PHGLRV GH FXOWLYR DVt FRPR ODV FRQGLciones de cultivo seleccionados, deben ser esSHFtFRV SDUD FDGD VLWXDFLyQ HQ SDUWLFXODU 8Q ejemplo de ello es el protocolo empleado por Stamp and Meredith en diferentes cultivares de Vitis vinifera. En cuatro de ellos fue posible la obtencin de embriones somticos a partir de embriones cigticos, pero estos resultados no se repitieron con el cultivar "Pinot Noir". 9DULRV VRQ ORV FRPSXHVWRV TXtPLFRV TXH LQX\HQ HQ ORV SDWURQHV PRUIRJpQLFRV in vitro dentro de los cuales podemos considerar: 4.2.1.- la composicin salina del medio de cultivo. La composicin salina ms empleada para inducir la formacin de callo, la organognesis GLUHFWD R LQGLUHFWD HQ OD PD\RUtD GH ODV HVSHcies vegetales, es la de Murashige & Skoog (1962) (MS). Sin embargo, existen otras formulaciones diseadas para inducir determinados patrones morfognicos. Existe adems una estrecha relacin entre la composicin hormonal del explante y la concentracin de reguladores del crecimiento agregada al medio de cultivo. 4.2.2.- reguladores del crecimiento. Estos compuestos pueden promover la morfognesis an cuando la concentracin salina no sea la adecuada. En condiciones ptimas de cultivo SXHGHQ DXPHQWDU VLJQLFDWLYDPHQWH OD GLIHrenciacin de rganos. Para la induccin de embriones somticos en muchas especies vegetales es necesario el agregado de auxinas, como ocurre en Tilia spp. Sin embargo para otras, como es el caso del crotn (Codiaeum variegatum HV VXFLHQWH FRQ HO DJUHJDGR GH thidiazurn. El genotipo y el tipo y concentracin de reguladores del crecimiento empleados estn estrechamente relacionados. 4.2.3.- antibiticos. En procesos de transformacin con Agrobacterium tumefaciens es muy comn el agregado de antibiticos del tipo cefotaxime; kanamicina y carbenicilina para la eliminacin de la bacteria. En explantes de hoja de diferentes cultivares de Malus domestica se encontr que 250 mg L1 de cefotaxime DXPHQWDQ VLJQLFDWLYDPHQWH OD UHJHQHUDFLyQ de brotes mientras que 500 mg L1 de carbenicilina promueven la formacin de callo y la


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kanamicina inhibe los procesos morfognicos. 4.2.4.- carbn activado. En general se usa para adsorber compuestos txicos de la micro atmsfera gaseosa o el exceso de reguladores del crecimiento presentes en el medio de cultivo pero (. 3HWWHUVVRQ \ VX HTXLSR GH FRODERUDGRUHV GH OD 6ZHGLVK 8QLYHUVLW\ RI $JULFXOWXUH GHPRVWUDURQ que puede promover la embriognesis somtica debido a la incorporacin de ciertos compuestos al medio de cultivo por difusin. 4.2.5.- agar. Otro aspecto importante a tener en cuenta es la consistencia del medio de cultivo. 3XHGH HPSOHDUVH FRPR VHPLVyOLGR R OtTXLGR (O DJHQWH JHOLFDQWH PiV XWLOL]DGR HQ HO FXOWLYR in vitro HV HO DJDU H[WUDtGR GH GLYHUVDV DOJDV PDrinas. Las diferentes calidades existentes en el PHUFDGR PRGLFDQ OD H[SUHVLyQ PRUIRJpQLFD debido a que pueden contener sustancias inhibitorias o promotoras del crecimiento. Tal es el caso del cultivo de hojas de Actinidia chilensis (en medio de MS con el agregado de 0,1 mg/L de $,$ PJ/ GH %$3 FX\D UHVSXHVWD PRUIRJpQLca vari segn el tipo de agar utilizado. Cuando HO JHOLFDQWH HPSOHDGR IXH &KXEXWDJDU GH SURduccin nacional, se observ una gran diferenciacin de yemas adventicias, mientras que con HO DJUHJDGR GH DJDU 6,*0$ R slo se indujo la proliferacin de callo. (Q FDVR GH VHOHFFLRQDU PHGLRV GH FXOWLYR OtTXLGRV OD UHVSXHVWD PRUIRJpQLFD REVHUYDGD YDUtD GH PDQHUD FRQVLGHUDEOH (O FXOWLYR OtTXLGR HV LPprescindible cuando se busca promover la morfognesis indirecta a travs de suspensiones celulares. Para ello es necesario cultivar los callos HQ PHGLR OtTXLGR FRQ DJLWDFLyQ SDUD SHUPLWLU TXH las clulas se disgreguen y puedan diferenciar UDtFHV EURWHV R HPEULRQHV VRPiWLFRV HQ IRUPD aislada. /D HOHFFLyQ GH XQ PHGLR GH FXOWLYR OtTXLGR R slido depende, adems, de la especie con la que se trabaja. En Cymbidium, por ejemplo, se KD REVHUYDGR TXH HO HPSOHR GH PHGLR OtTXLGR promueve una mayor diferenciacin de protoFRUPRV UHVSHFWR GHO PLVPR JHOLFDGR $ VX YH] este proceso puede mantenerse durante varios subcultivos, mientras que en medio de cultivo geOLFDGR VH REVHUYy TXH ORV SURWRFRUPRV WLHQGHQ a formar tallos. 4.2.6.- atmsfera gaseosa. Es un factor determinante en los procesos morfognicos y esta con-

dicionada por el tipo y tamao del envase selecFLRQDGR SDUD HO FXOWLYR DVt FRPR WDPELpQ SRU HO sistema de cobertura del mismo. Las tapas usadas en cultivo in vitro YDUtDQ GHVGH HO WDSyQ GH DOJRGyQ SDSHO GH DOXPLQLR SHOtFXOD GH UHVLQLWH WUDQVSDUHQWH R WDSDV UtJLGDV GH SROLSURSLOHQR (O intercambio gaseoso es diferente para cada tipo de tapa, en consecuencia la atmsfera interna tambin sufrir variaciones. En condiciones in vivo la atmsfera contiene 78 GH QLWUyJHQR GH R[tJHQR \ GH dixido de carbono. En cultivos in vitro se han registrado adems, etileno y otros compuestos hidrocarbonados. (O QLYHO GH R[tJHQR GLVSRQLEOH SDUD HO H[SODQWH condiciona el crecimiento y los procesos morfognicos. En general se necesita una buena aireacin para obtener cualquier tipo de proceso morfognico. En alfalfa se puede obtener un buen incremento de material a partir de suspensiones celulares embriognicas cuando la solucin se VDWXUD FRQ GH R[tJHQR 3RU HO FRQWUDULR XQD WHQVLyQ GH R[tJHQR GHO HVWLPXOD OD SURGXFcin de plantas a partir de anteras de tabaco. La concentracin de dixido de carbono (CO2) en la atmsfera gaseosa in vitro YDUtD VHJ~Q OD UHVpiracin y la actividad fotosinttica de las plantas. En condiciones de oscuridad, el CO2 incrementa mientras que en condiciones de luz, disminuye. En trabajos realizados con Ficus lyrata se han encontrado concentraciones variables, entre 0,5 % y 8,5 %, segn el tipo de sello o tapa empleados. Concentraciones superiores al 1 %, que son generalmente txicas en condiciones in vivo, probablemente no fueron limitantes para la actividad fotosinttica. La presencia de etileno en condiciones in vitro promueve diversas respuestas. Su acumulacin tiene efectos inhibitorios sobre el cultivo de clulas, callos y anteras, La cantidad de etileno producida in vitro YDUtD FRQ OD HVSHFLH HO WLSR GH explante, la concentracin de citocininas en el medio de cultivo, el tipo de agar utilizado y con la luz. Una forma de incorporar etileno al envase de cultivo es a travs de la esterilizacin del material de diseccin realizada con el material embebido HQ DOFRKRO \ DPHDGR FRQ PHFKHUR %XQVHQ (Q muchos casos el etileno acta como promotor de la morfognesis pero luego es inhibitorio del crecimiento de los rganos diferenciados

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(QWUH ODV FRQGLFLRQHV ItVLFDV SRGHPRV PHQcionar los efectos de la temperatura, la humedad relativa y la luz. 4.3.1.- La temperatura de incubacin de los cultivos es un factor importante a tener en cuenta. Si bien en condiciones naturales las plantas exSHULPHQWDQ GLIHUHQFLDV WpUPLFDV GXUDQWH HO GtD \ la noche, las temperaturas in vitro se mantienen casi estables. Es importante sealar que cuanto ms se asemejen las condiciones in vitro a las ptimas de crecimiento de la especie estudiada, mayor ser la respuesta obtenida. En cultivos de hojas de Streptocarpus x hybridus sometidos a diferentes temperaturas se observ que la regeQHUDFLyQ PD\RU GH EURWHV VH SURGXFtD D & mientras que por encima de los 30 C, prcticamente no se observ diferenciacin. 4.3.2.- La humedad relativa (HR), como medida de la cantidad de vapor de agua contenida en la atmsfera gaseosa, es otro de los parmetros ItVLFRV D WHQHU HQ FXHQWD /D +5 GHSHQGHUi GHO sello o cobertura del envase empleado. Si este cierre es hermtico, la humedad interior ser del 100 %. Si en cambio existe la posibilidad de un intercambio gaseoso la humedad interna puede descender a niveles cercanos al 50 %. Este importante descenso de la HR puede promover una prdida veloz de agua del medio de cultivo variando la concentracin de sus compuestos hasta llegar a niveles txicos (Debergh, comunicacin personal). 4.3.3.- La luz suministrada a los cultivos debe ser evaluada en cuanto a la calidad, intensidad \ SHUtRGR GH VXPLQLVWUR /D UHVSXHVWD PRUIRJpnica de un explante puede variar segn si se le proporciona luz o no. Para estimular la formacin GH FDOOR HV FRP~Q TXH VH SUHHUD OD RVFXULGDG El suministro de luz favorece la diferenciacin de rganos. 4.4.- Tal como ya se seal anteriormente, los proceso morfognicos dependen del genotipo, pero a esto debe sumarse el efecto del explante seleccionado. El tratamiento de la planta madre, ODV FRQGLFLRQHV ItVLFDV \ VLROyJLFDV HQ ODV TXH sta se encuentre y el sector del cual se tome el explante determinarn a su vez la respuesta morfognica en condiciones in vitro. Un ejemplo muy interesante es la diferente respuesta morfognica observada en hojas de Camellia japonica

cultivadas en un mismo medio de cultivo, segn la porcin de la lmina utilizada (Pedroso y Pais, 1993). Estos investigadores cultivaron estas hojas in vitro durante seis semanas previa inmersin GHO H[SODQWH HQ XQD VROXFLyQ GH ,%$ PJ O1) durante 20 minutos (Fig 5).

Figura. 5: Esquema de las diferentes respuestas morfognicas obtenidas despus de seis semanas de cultivo in vitro de hojas de Camellia japonica L. segn la porcin de la lmina. 1, callo organognico. 2 embriognesis somtica directa. 3, regeneraFLyQ GLUHFWD GH UDtFHV FDOOR RUJDQRJpQLFR

Lecturas recomendadas%XGGHQGRUI-RRVWHQ -0& DQG :ROWHULQJ (- 1994. Components of the gaseous environment DQG WKHLU HIIHFWV RQ SODQW JURZWK DQG GHYHORSPHQW LQ YLWUR 3ODQW *URZWK 5HJXODWLRQ 'H .OHUN *- $UQKROGW6FKPLWW % /LHEHUHL 5 DQG 1HXPDQQ .+ 5HJHQHUDWLRQ RI URRWV shoots and embryos: physiological, biochemical and molecular aspects. Biologia Plantarum 39 (1): 53-66. George E. 1993. Plant propagation by tissue culture Part 1 The technology. Butler and Tanner Ltd (ed). Gran Bretaa. 1361pp. Hicks G.S. 1980. Patterns of organ development in plant tissue culture and the problem of organ determination. Bot. Rev. 46: 1-23. :LOOLDPV (* DQG 0DKHVZDUDQ * 6RPDWLF HPEU\RJHQLF IDFWRUV LQXHQFLQJ FRRUGLQDWHG EHKDYLRU RI FHOOV DV DQ HPEU\RJHQLF JURXS $QQ Bot. 57: 443-597.


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I - CAPTULO 3 La citogentica molecular e inmunocitogentica en el estudio de los genomas vegetalesGuillermo Seijo; Graciela I. Lavia; *HUPiQ 5REOHGR $YHOLDQR )HUQiQGH] 9LYLDQD * 6ROtV 1HIID 1 Introduccin La comprensin de la organizacin de los genomas lograda a travs del anlisis citogentico ha tenido un gran impacto en la evaluaFLyQ \ XWLOL]DFLyQ GH OD ELRGLYHUVLGDG DVt FRPR HQ HO PHMRUDPLHQWR JHQpWLFR \ OD LQJHQLHUtD JHntica, en particular, desde el desarrollo de las tcnicas de citogentica molecular. El empleo VRQGDV GH $'1 \ GH DQWLFXHUSRV FRQMXJDGRV FRQ XRURFURPRV HQ XQ Q~PHUR FUHFLHQWH GH especies vegetales ha permitido, entre otros loJURV O

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