MONOGRAFÍA DE TRABAJO DE GRADO

Título: BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA ACUICULTURA: PECES TRANSGÉNICOS

Director(a): Teodora Inés cavaría

Estudiante: Leslie Claudia Díaz Bastidas

Palabras claves: biotecnología, peces, transgénicos, aplicación, genética.

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AGRADECIMIENTOS

Dedicada a mi padre Q.P.D. que desde el cielo me dio las fuerzas para seguir a delante.A mi madre por ayudarme a realizar mis sueños.

TABLA DE CONTENIDO

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pág.

ContenidoRESUMEN..............................................................................................................................................................4

ABSTRACT............................................................................................................................................................5

LISTA DE TABLAS................................................................................................................................................6

INTRODUCCIÓN...................................................................................................................................................7

OBJETIVOS...........................................................................................................................................................8

DESARROLLO DEL TEMA..................................................................................................................................9

CREACIÓN DE UN TRANSGÉN..................................................................................................................10

SELECCIÓN Y CONSTRUCCIÓN DE GENES RECOMBINANTES Y MÉTODOS DE TRANSFERENCIA GÉNICA PARA LA PRODUCCIÓN DE PECES TRANSGÉNICOS.......................13

MICROINYECCION.....................................................................................................................................15

CÉLULAS MADRE......................................................................................................................................16

CONSTRUCCIÓN DEL SALMÓN TRANSGÉNICO.......................................................................................19

PEZ CEBRA TRANSGÉNICO...........................................................................................................................21

EL PEZ CEBRA, AL SERVICIO DE LA INVESTIGACIÓN EN CÁNCER....................................................23

BIBLIOGRAFÍA....................................................................................................................................................27

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RESUMEN

La transgénesis se puede definir como la introducción de ADN en un genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y afecte a todas las células en los organismos multicelulares.Generalmente, en animales, el ADN extraño, llamado transgén, se introduce en zigotos, y los embriones que hayan integrado el ADN extraño en su genoma, previamente a la primera división, producirán un organismo transgénico; de modo que, en algunos, el transgén pasará a las siguientes generaciones a través de la línea germinal (gametos). Entre los métodos para obtener transgénicos se encuentran: Microinyección. Electroporación. Liposomas. Manipulación de células madre

La piscicultura comercial considera a los peces transgénicos más productivos. Crecen más rápido, son más resistentes a enfermedades, soportan mejor las condiciones meteorológicas frías y, por lo tanto, son más fáciles de criar en estas circunstancias. Pero también conllevan riesgos y efectos negativos en el entorno natural: pueden producir una acumulación de toxinas medioambientales y un elevado contenido de hormonas de crecimiento.

La cría comercial de peces transgénicos no está permitida en ningún país, pero las autoridades comunitarias y estadounidenses evalúan una serie de solicitudes para poner en marcha esta práctica. Científicos del Departamento de Zoología de la Universidad de Gotemburgo (Suecia) han advertido de la necesidad de llegar a un acuerdo entre todas las partes implicadas antes de impulsar la piscicultura comercial de estos organismos y aplicar un principio de precaución.

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ABSTRACT

Transgenesis may be defined as the introduction of DNA into the genome, so as to maintain stable inherited form affects all cells in multicellular organisms.Generally, in animals, the foreign DNA, called transgene is introduced into zygotes, and embryos which have integrated the foreign DNA into their genome, prior to the first division, produce a transgenic organism, so that, in some, the transgene pass on to subsequent generations through the germ line (gametes). Among the methods for obtaining transgenic include:     Microinjection, Electroporation,     Liposomes,      Stem cell manipulationThe commercial farming of transgenic fish considered more productive. Grow faster, are more resistant to disease, better withstand cold weather conditions and, therefore, are easier to breed in these circumstances. But also involve risks and negative effects on the natural environment: may cause an accumulation of environmental toxins and a high content of growth hormones.

Commercial farming of transgenic fish is not allowed in any country, but the EU and U.S. authorities evaluate a number of requests to implement this practice. Scientists at the Department of Zoology, University of Gothenburg (Sweden) have warned of the need to reach an agreement between all parties involved before promoting commercial farming of these organisms and applying a precautionary principle.

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LISTA DE TABLAS Y FIGURAS

Fig. 1 Transgen....................................................................................................................................................10Fig. 2. Actividad de la β-galactosidasa.........................................................................................................14Fig. 3 Microinyección pronuclear ................................................................................................................16Fig. 4 Especies acuáticas utilizadas en investigacion ..........................................................................18Fig. 5 Diagrama de producción de salmón transgénico...........................................................................21Fig. 6 crecimiento del salmón..........................................................................................................................22Fig. 7 Introducción de genes fluorescentes en peces Medaka o TK1.................................................23Fig. 8. Lote de peces Cebra transgénicos fluorescentes.........................................................................24Fig. 9 Desarrollo embriones de cebra...........................................................................................................25Fig. 10 Ciclo de vida de la cebra.....................................................................................................................26

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INTRODUCCIÓN

La demanda creciente de pescado para consumo humano junto al agotamiento progresivo de los recursos pesqueros por sobreexplotación o mala gestión de los mismos, ha desencadenado la necesidad de cultivar especies piscícolas de interés comercial. En esta actividad de domesticación y de explotación y al igual que en otras especies animales, es necesario aplicar programas de mejora, para aumentar la rentabilidad. Los métodos convencionales de mejora genética, mucho más antiguos que la genética, como tal ciencia, se basan en programas de “selección artificial” (Muñoz, 1999)Una gran ventaja de la acuicultura frente a la domesticación de especies terrestres, es poder aprovechar desde sus inicios las poderosas herramientas que nos brinda la ingeniería genética, para aplicarla en la mejora genética de las especies que se cultivan. Aparte de esa coyuntura afortunada, los peces reúnen además una serie de características que ls hacen ideales para ser sometidos a alas técnicas de manipulación genética.Dentro de las técnicas de manipulación o de ingeniería genética podemos distinguir dos tipos:Uno que incluye la poliploidia, la ginogenesis o la partenogénesis, las cuales producen cambios en el complemento cromosómico. El otro está representado por la trangenia o injerto de genes objeto de este trabajo y que consiste en la introducción de gene(s) extraño(s), (transgen) a un organismo. El objetivo inicial de la transgenia en peces fue el poder crear líneas genéticamente superiores, introduciendo genes relacionados con la productividad. DEFINICIONDE “TRANGENICO” La palabra “transgénico” fue utilizada por primera vez por Gordon y Ruddle en 1981 para designar a un organismo genéticamente transformado mediante micro inyección de ADN en la actualidad el significado ha evolucionado con los avances de la propia técnica y Beardmore (1997) sugiere como alternativa conciliadora e distintas opiniones, la siguiente definición de transgénico:Células y organismos que contiene secuencias integradas de DNA clonado (transgen), transferido mediante técnicas de ingeniería genética. La incorporación de peces fue posterior y estuvo motivada por el deseo de producir en acuicultura líneas de alta productividad (Muñoz, 1999).La primera referencia en peces se refiere a la trasferencia del gen de la GH humana a la carpa (zhu & cols, 1985).

OBJETIVOS

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conocer la biotecnología utilizada actualmente en la acuicultura comprender como actúa la transgénesis en los peces clasificar e identificar un pez transgénico de uno “natural” Describir los pasos que hacer parte de la trasformación de peces normales a peces

transgénicos Conocer la importancia de estos en los cultivos acuícolas

DESARROLLO DEL TEMA

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CREACIÓN DE UN TRANSGÉN

Aunque el código genético es esencialmente el mismo en todos los organismos, existen pequeñas diferencias en el control de los genes.Por ejemplo, si se introduce un gen de una bacteria sin ninguna modificación en una célula animal, pocas veces funcionará correctamente. En primer lugar, el ingeniero genético debe crear un transgén que contenga el gen que interesa, y ADN adicional que controle correctamente el funcionamiento del gen en el nuevo animal. Este transgén se deberá introducir en el nuevo animal.

Muchos genes se expresan únicamente en tejidos particulares y son controlados por un segmento específico de ADN cercano al gen, denominado secuencia promotora. En el proceso de creación del transgén, los científicos suelen sustituir esta secuencia promotora del donante por otra especialmente diseñada para asegurar que el gen funcionará en los tejidos adecuados del animal receptor. Este procedimiento es crucial cuando, por ejemplo, el gen tiene que expresarse en la leche de un mamífero. Además de la secuencia promotora de ADN, el transgén requiere una secuencia poli-A para funcionar correctamente .

Fig. 1 Transgen

Óvulos se introducen después en los oviductos de madres adoptivas. Este es el principal método que se utiliza actualmente para crear animales genéticamente modificados.Consiste en inyectar físicamente 200-300 copias del gen exógeno en óvulos recientemente fecundados, para después implantarlos en madres adoptivas. Sólo un pequeño porcentaje de los animales que nacen son transgénicos (es decir, transmiten el gen añadido de una generación a la siguiente) y sólo una proporción de estos expresan el gen añadido satisfactoriamente. Mediante este método, sólo se pueden añadir genes (no eliminarlos).Los animales obtenidos se pueden cruzar conanimales no transgénicos y dar como resultado heterozigotos (híbridos) para este gen (EIBE, 1998)

La transferencia génica nos permite modificar las características hereditarias de un animal mediante técnicas de ingeniería genética. Para ello, existen dos estrategias, una sería la

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introducción de genes nuevos (transgénesis convencional) con el objeto de introducir nuevas características; la otra estrategia, consiste en la eliminación de un gen endógeno, o su reemplazamiento por una versión alterada de ese gen, lo que nos permite eliminar características indeseables. Esta segunda aproximación, conocida como knock-out se encuentra totalmente establecida en ratón, pero está poco desarrollada hasta el momento en peces. Esta tecnología depende de la obtención de una línea de células embrionarias totipotentes in vitro, las cuales sean capaces de formar parte de la línea germinal una vez implantadas en un embrión.En cuanto a la metodología para el desarrollo de un pez transgénico convencional, existen varios pasos que se detallan a continuación:

1. El primero sería respecto al DNA foráneo a introducir. Éste debe poseer la secuencia codificante completa del gen que deseamos expresar, junto con todas las secuencias reguladoras que aseguren una expresión eficiente. En la mayoría de estudios básicos que utilizan peces transgénicos se usan promotores de origen viral. Estos se encuentran bien caracterizados, y aseguran una expresión muy fuerte de los genes que se hallan bajo su control (ej. promotor CMV). Sin embargo, en el caso de que el pez transgénico vaya a tener una aplicación biotecnológica es deseable que todas estas secuencias provengan también de un pez y que se eliminen todas las secuencias bacterianas que han sido necesarias para su construcción. Todavía existen pocos promotores y secuencias reguladoras aisladas de peces; una de las más utilizadas en diversas especies de peces ha sido el promotor de la actina ß de carpa (Liu et al. 1990; Maclean et al. 1992; Moav et al. 1993; Alam et al. 1996). Otros promotores de origen piscícola utilizados son los de las proteínas anticongelantes de la babosa vivípara americana (Fletcher et al. 1988; Hew et al. 1992) y los de las metalotioninas de trucha (Inoue et al. 1992; Hong et al. 1993).

2. El paso siguiente es la introducción del DNA en los embriones . Ésta debe hacerse cuando el embrión está en una de sus primeras divisiones (estado de 1 a 4 células), y el método más utilizado es la inyección del DNA en el citoplasma de una de estas células. La inyección de la solución de DNA directamente en el núcleo celular resultaría en una mayor eficacia del proceso, pero desafortunadamente durante estas primeras fases del desarrollo el núcleo de las células embrionarias no es visible.Existen otros métodos en los que se utiliza el esperma como portador del DNA en el momento de la fertilización. Para ello se realiza la electroporación del espermacon el DNA exógeno. Esta técnica, aunque se ha demostrado que es viable (Muller et al. 1992), no ha resultado reproducible en muchos casos (Chourrout & Perrot 1992) o bien, la eficiencia a la hora de integrarse o expresarse el transgen ha resultado muy baja (Sin et al. 2003). También se ha evaluado el uso de retrovirus atenuados que puedan infectar las células del embrión (Lin et al. 1994). Sin embargo, este método tiene algunas limitaciones, como son un tamaño límite del DNA a introducir o la necesidad de altas medidas de seguridad en los primeros pasos de su realización. Por ello, su uso se ha visto limitado sólo a ciertos

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laboratorios. Más recientemente, se han empleado elementos transponibles de pez para la introducción del DNA en el genoma del huésped y se han obtenido muy buenos resultados en integración y expresión en pez cebra (Davidson et al. 2003). En cualquier caso su uso no está de momento lo suficientemente extendido como para comparar su eficacia con la de inyección en el citoplasma, que sigue siendo, por tanto, el método más ampliamente utilizado. Además de la electroporación de esperma, se está evaluando el empleo de otros métodos masivos, como el bombardeo de micropartículas en huevos fecundados para la introducción del DNA. Esta aproximación puede ser valiosa para su aplicación en especies de peces donde se pueda disponer de una gran cantidad de huevos. Estas técnicas evitarían la tediosidad de la introducción del DNA en cada huevo individualmente.

3. Integración del DNA en el genoma del huésped. Una vez el DNA se ha introducido en una de las células del embrión en desarrollo, éste debe dirigirse alnúcleo y posteriormente integrarse en el genoma del organismo huésped. La integración del DNA es un paso limitante en la producción de un pez transgénico. Esta integración ocurre al azar, o sea, el DNA se puede integrar en cualquier sitio del genoma. Además, la integración no se produce inmediatamente después de lainyección. En las primeras fases del desarrollo (blástula, gástrula) cuando las células están dividiéndose activamente, el DNA introducido, que todavía es extracromosomal, empieza a ser replicado por la maquinaria del huésped produciéndose una amplificación del mismo. La integración del DNA se produce en etapas tardías de la embriogénesis, y de manera independiente en las distintas células. Ésto da lugar a la aparición de mosaicismo en esta primera generación, y puede observarse que no todas las células del organismo contienen el transgen. Además, aquellas que lo han integrado, presentan distinto número de copias del mismo. Otra de las consecuencias de la integración tardía es la existencia de mosaicismo también en las células de la línea germinal, esto dará lugar a una baja frecuencia de transmisión del transgen a la descendencia, que es el paso final en la producción de un transgénico estable. Sin embargo, en la segunda generación transgénica ya se obtiene una transmisión mendeliana.

4. Debido a la integración tardía que comentábamos anteriormente, el patrón de la expresión del gen introducido también presentará mosaicismo, esto es, no todas las células del organismo están expresando el transgen. También pueden aparecer problemas de falta de expresión debido a la inactivación del DNA introducido por parte de la célula huésped, a través de metilación o formación de heterocromatina. Para solucionar estos problemas se está ensayando actualmente el uso de secuencias que puedan “aislar” al gen introducido de la formación de cromatina inactiva a su alrededor (Caldovic & Hackett, Jr. 1995; Caldovic et al. 1999). Otro de los puntos importantes en la obtención de un pez transgénico, es el desarrollo de sistemas que permitan un mejor control de la expresión génica. El control exógeno de la expresión de un transgen en peces es una necesidad tanto en los estudios de regulación

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génica como en los trabajos con fines biotecnológicos. Los genes exógenos deben permanecer silenciados cuando su expresión no es necesaria. La experiencia en peces, con los promotores inducibles disponibles hasta el momento (metalotionina, de choque térmico) ha sido frustrante por motivos de escape del promotor (leakness), poca fidelidad en la inducción o problemas con el inductor aplicado exógenamente. Para muchas de las aplicaciones, también sería deseable el control espacial de la expresión del transgen. Este control se puede conseguir mediante el uso de promotores específicos de tejido para dirigir la expresión del transgen.

5. Transmisión a la descendencia. El último paso en la generación de un transgénico sería conseguir la presencia del gen exógeno en la línea germinal, para asegurar que el transgen pasará a la siguiente generación.Debido a la integración tardía, la transmisión en peces es baja, con una media deun 15% de la descendencia que ha incorporado el transgen. Además, esta transmisión es más baja en animales con ciclos vitales más largos (2-5%) (Fletcher et al. 1988), sin embargo en algunos casos, como la trucha, se han encontrado transmisiones a un 20 o incluso 50% de la progenie (Chourrout et al. 1986). Por último, pueden aparecer también fenómenos de silenciamiento incluso después de varias generaciones.

SELECCIÓN Y CONSTRUCCIÓN DE GENES RECOMBINANTES Y MÉTODOS DE TRANSFERENCIA GÉNICA PARA LA PRODUCCIÓN DE PECES TRANSGÉNICOS

La producción de peces transgénicos como se mencionó, se basa en la incorporación de un gene recombinante que producirá las características deseadas, en el tiempo deseado, con fines de aplicación biotecnológica o de investigación básica.En la literatura se ha mencionado que los genes utilizados en transgénesis de peces se pueden dividir en diferentes grupos (Sin F, 1997)El primero comprende a los llamados genes “informativos o descriptores” que sonútiles para identificar y medir el éxito de la transferencia de genes y sus vectores. Los genes de cloranfenicol acetiltransferansa, b-galactosidasa y luciferasa bacterianas pertenecen a este conjunto (Tewari, et al. 2002).

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Fig. 2

Fig. 2. Actividad de la β-galactosidasa (guillen et al, 1996).

Un segundo grupo lo integran los genes de mejoramiento de funciones que son aquellos que se diseñan principalmente para aumentar o añadir nuevas funciones en los organismos genéticamente modificados.Ejemplos de estos genes son los que codifican para las hormonas de crecimiento(GH) de mamíferos y peces y el factor de crecimiento tipo insulina (Du s. et al, 1992). Estos genes se usan para incrementar el potencial endocrino de los peces y por lo general su expresión resulta en mejoramiento de las tasas de crecimiento (Devlin R, 1994). Otros genes relevantes son los que codifican para la lisosima que incrementa la resistencia a enfermedades, y las hormonas de tipo prolactina que estimulan el desove, osmorregulación, comportamiento y el metabolismo en general.Un siguiente grupo de genes son aquellos que tienen regiones regulatoriasinteresantes, y que codifican para proteínas con propiedades y características particulares de los peces. Entre ellos se encuentran los que codifican para las siguientes proteínas: la metalothioneína de salmón y trucha (Zafarullah M, 1988) & (chan k, 1993). La actina B de carpa (Liu z, 1990). La histona de salmón, la protamina (Jankowski J, 1987), y particularmente los genes que codifican para las proteínas anticongelantes PAC (AFP por sus siglas en inglés, aislados de diferentes especies de peces. Estas últimas son glicoproteínas que pueden interactuar con los cristales de hielo y reducir el punto de congelación en la sangre de los peces. La intención de introducir estos genes en peces es incrementar los límites de tolerancia al frío de especies en cultivo, tales como el salmón, para establecer una industria acuacultural en regiones subárticas.

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Un cuarto grupo de genes comprende aquellos que interfieren con la expresión de genes del organismo objeto. Estos genes pueden generar un RNA catalítico con capacidad de digerir RNA específicos y obstruir la traducción normal de un determinado RNA mensajero. Este tipo de genes que inciden en la pérdida de funciones no ha sido probado en peces; sin embargo, potencialmente pueden ser empleados en la generación de líneas resistentes a enfermedades de importancia estratégica para la acuacultura.Una vez seleccionado y construido el gene recombinante que se desea incorporar, el siguiente paso es introducirlo en el genoma del organismo blanco. Para ello, tal y como se ha señalado, existe una gran variedad de métodos que se emplean para la transferencia de genes a animales, y en particular para lograr esta transferencia a los huevos de peces. Entre éstos se encuentran la ruptura de membranas por microinyección, formación de poros en la membrana celular por exposición a corrientes de alto voltaje (electroporación), perforación múltiple de membranas por microproyectiles o interacción de cargas entre membranas DNA/lípidos (lipofección) y uso de retrovirus.

MICROINYECCION

El método más común que se emplea en peces desde 1985 es la microinyección por la cual se transfiere el DNA a los huevos individuales o a los embriones recién fertilizados. Generalmente los huevos y el esperma de los peces son recolectados por separado y se lleva a cabo la fertilización combinando ambos en recipientes con agua y algunos medios mecánicos simples para asegurar la fertilización. Los huevos se inyectan en las primeras horas una vez que ocurrió la fertilización. El equipo que se utiliza para inyectar el DNA consiste de un microscopio de disección estereoscópico y dos micromanipuladores, uno con una aguja microscópican de cristal y el otro con una micropipeta para sujetar el huevo fertilizado.La cantidad de DNA que se inyecta a los huevos de peces depende del tamañode éste y generalmente es cerca de 106 a 108 moléculas del gene .En los embriones de peces el DNA se inyecta en el citoplasma, ya que los pronúcleos de los huevos fertilizados son invisibles y los huevos opacos en la mayoría de las especies de peces. Un problema particular en algunas especies es el corión duro de algunas especies de peces que hace más difícil la microinyección. Para facilitar el proceso se utilizan varias técnicas como: 1) retirar el corión de los huevos por medios enzimáticos o mecánicos; 2) efectuar una abertura en el corión por microcirugía; 3) inyección del DNA a través del micrópilo; 4) evitar el endurecimiento de la membrana agregando sustancias químicas; y 5) inyección de los huevos antes de la fertilización.La microinyección es un método muy laborioso por lo cual se han examinado otras técnicas más rápidas que permitan el tratamiento de un gran número de peces; no obstante, la eficiencia de éstos es variable. La tasa de sobrevivencia de los embriones de peces depende según la especie en estudio; sin embargo, varía de 35 a 80%, mientras que la integración del DNA fluctúa entre 10 a 70% en los organismos cultivados.

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Los estudios realizados en varias especies de peces sugieren que los genes inyectados a los embriones se mantienen como una unidad extracromosomalen las primeras etapas. En etapas de desarrollo posteriores algunos de los genes se integran aparentemente al azar en el genoma de los organismos objeto, mientras que otros se degradan.

Fig. 3

Fig 3. Microinyección pronuclear (centro nacional de biotecnología CNB, Madrid)

CÉLULAS MADREUna de las estrategias más prometedoras en el desarrollo de peces transgénicos es el desarrollo de la tecnología de células madre embrionarias. Estas células provienen de un grupo de células procedentes de un estadío temprano del embrión, y poseen la capacidad de autoregenerarse y de diferenciarse en muchos tipos celulares (Prosper, 2002).

Las células madre embrionarias se extraen del embrión del pez para poder manipularlas in vitro e introducir el transgen en su genoma.Posteriormente, se reintroducen estas células en otros embriones que se encuentran en etapas tempranas de su desarrollo, o bien se realiza una extracción y reimplantación de su núcleo en las células embrionarias. Las células madre pasan a formar parte de los distintos linajes celulares que darán lugar a los tejidos, entre ellos a la línea germinal.Hasta el momento, los peces transgénicos se han producido por medio de la inserción de un transgen directamente en el genoma de los embriones. Como resultado se obtienen a menudo peces con un alto grado de mosaicismo (presencia de células con y sin el transgen en un individuo modificado genéticamente) es decir, la integración del transgen en el genoma no ha ocurrido en todas las células del embrión y, por lo tanto, solo una parte de las células del adulto portan el transgen, siendo necesario llegar a la 2ª generación para obtener peces en

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todas sus células transgénicas. El empleo de células madre podría permitir una mejor integración del transgen en comparación con las técnicas de transgénesis descritas anteriormente, si bien está aún por demostrar. La principal limitación técnica de esta tecnología se encuentra precisamente en la disponibilidad de este tipo de células, ya que en pez cebra, principal especie con la que se ha investigado esta técnica, tan solo se ha conseguido mantener vivas las células madre por un corto periodo de tiempo. Esto es debido a que todavía no se ha conseguido inhibir la diferenciación espontánea de las estas células, lo que sí se ha conseguido en ratón (Melamed, M et al, 2002).

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Fig. 4

Fig. 4 Especies acuáticas utilizadas en investigacion (Gracia, 2006)

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CONSTRUCCIÓN DEL SALMÓN TRANSGÉNICO

Como se ha mencionado, uno de los principales intereses de los acuicultores es obtener el máximo de biomasa con el menor costo posible.Es por ello que el desarrollo de peces transgénicos se ha dirigido particularmentea incrementar las tasas de crecimiento y mejorar las tasas de conversión de alimentos, con el fin de reducir los ciclos de producción. Para crear lo que se conoció como el “super-ratón”, con base en el diseño e introducción de un gene que permitió incrementar al doble el tamaño de los roedores empleados generó muchas expectativas para su aplicación en peces. Sin embargo, varios de los genes derivados de mamíferos no tuvieron el efecto deseado para incrementar las tasas de crecimiento en peces.Por otro lado, las posibles suspicacias y reticencias que generaría entre el público por la utilización de material genético distinto a los peces, propiciaron que se buscara la utilización de un diseño genético que incluyera material genético derivado de peces lo más cercano al DNA original.Uno de los casos más representativos es la serie de experimentos que condujeron a la creación de peces transgénicos conocidos, como “super- salmones”, por la velocidad de crecimiento y talla que alcanzan en cortos periodos. Los experimentos que condujeron a la creación del salmón transgénico se originaron a partir del interés de resolver uno de los principales problemas que enfrenta la industria de la acuacultura en Canadá durante el invierno. En esta temporada, una gran parte de las zonas costeras el agua se congela o alcanza temperaturas muy bajas (-1.8°C), lo que reduce el área disponible para cultivar salmón, ya que dichas temperaturas son letales para estos peces. Algunos peces como los lenguados (Pleuronectes americanus) y el abadejo oceánico (Macrozoarces americanus) son capaces de producir un grupo de proteínas anticongelantes (PAC) que pueden interactuar con los cristales de hielo, de tal forma que se reduce la temperatura de congelación en estos organismos.

En el proceso de detección y transferencia del gene “anticongelante” se descubrió que éste tenía un gran potencial para contender con problemas que afectan el crecimiento. A partir del gene anticongelante del abadejo oceánico, se construyó un gene recombinante ligando la región promotora de este gene “anticongelante” y el gene estructural que codifica para la hormona del crecimiento del salmón del Atlántico. La idea de construir y utilizar un gene recombinante a partir del material genético natural de peces para generar organismos transgénicos productores de la hormona de crecimiento, es porque este producto en principio debe ser considerado como más seguro para el medio ambiente y para consumo humano, además de tener un mejor potencial de aceptación por el público. Desde este enfoque el uso de material genético derivado de peces, en teoría, encontraría menos reticencia que si se usan promotores y/o de origen viral o de otros mamíferos.Los genes de la hormona de crecimiento normalmente se expresan en la glándula pituitaria bajo el control del sistema nervioso central, de tal forma que para que se expresen en varios

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tejidos, es necesario modificar los elementos de expresión específicos del gene. El acoplamiento de la región estructural del gene de la hormona de crecimiento con las regiones regulatorias de genes que codifican para proteínas anticongelantes del abadejo tienen esta función, ya que permiten que la hormona de crecimiento se exprese en forma continua en diferentes tejidos delsalmón ( Tsukasa M &Devlin H, 1999).

Después de cruzar los organismos transgénicos con organismos silvestres se obtuvieron salmones que expresan la hormona de crecimiento y que crecen entre dos y seis veces más rápido que los salmones normales e incluso algunos con tasas individuales de crecimiento hasta trece veces mayor (figura 1).

El material genético diseñado y patentado por instituciones canadienses le confiere a los salmones la capacidad de crecer rápidamente durante el primer año y alcanzar una talla comercial (3-4 kg) un año antes de lo que ocurre en los organismos genéticamente no modificados de salmón del Atlántico (figura 2). Las expectativas para la acuacultura de estos organismos son muy atractivas ya que incluso muestran un incremento de 10-30% en la eficiencia de conversión de alimentos (Cook T et al, 2000).

Fig. 5

Fig. 5. Diagrama de producción de salmón transgénico. (Gracia, 2007).

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Fig. 6

Fig. 6. crecimiento del salmón (gracia, 2007).

PEZ CEBRA TRANSGÉNICO

En el año 2003, la revista americana “Time” eligió como uno de los mejores inventos la creación de “peces brillantes fluorescentes” a cargo de la Universidad Nacional de Taiwán por haber inyectado genes que producen proteínas fluorescentes de medusa abisal y de coral en óvulos fertilizados, primero en el pez Medaka (Oryzias latipes) que fueron denominados TK-1. Y luego hizo lo mismo con el pez Cebra (Danio rerio) o TK-2. De esta forma inicialmente se obtuvo peces que emitían colores verde (GFP) y rojo (RFP) en la oscuridad con éstos genes produciendo proteínas fluorescentes en sus músculos unido al gen mylz2 (Wan et al. 2002; Gong et al, 2001, 2003). Si hoy se da una mirada al portal de de la empresa taiwanesa. Se puede observar que la empresa ofrece colores como el amarillo, el púrpura y otros más (Figura 6).

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Fig. 7

Fig. 7. Introducción de genes fluorescentes en peces Medaka o TK1 (Fotografías tomadas de Taiwán Review, 2006).

Según la empresa Taikong para evitar el aumento de indeseado de éstos peces y que pudiera dañar el medio ambiente o cruzarse con peces de su misma especie pero normales, los peces manipulados genéticamente son “esterilizados” antes de ser vendidos. En todo caso nunca debería haber crías o alevines de los mismos nadando en algún acuario o Pet Shop. Sin embargo, esta regla parece no ser del todo cierta. El laboratorio de Mejora Genética y Reproducción Animal de la Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas de la Universidad Nacional Federico Villarreal obtuvo un lote de aproximadamente 100 peces Cebra de la Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas de la Universidad Nacional Federico Villarreal obtuvo un lote de aproximadamente 100 peces Cebra de color rojo los cuales mantuvo bajo condiciones controladas para realizar ensayos experimentales con sustancias genotóxicas ( Chung Oscar, 2006). Con el tiempo se pudo constatar que estos peces tenían una coloración distinta a las líneas que nuestro laboratorio trabajaba (Blanca y Gris) (Esta coloración resultaba ser ligeramente fluorescente a la luz del día. Por lo que se decidió hacer ensayos con luces de espectro cercanos al Ultravioleta (400 nm) como ya habían reportado otros investigadores (Amsterdam et al., 1995).

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Fig. 8

Fig. 8. Lote de peces Cebra transgénicos fluorescentes (Espinoza C, 2012).

EL PEZ CEBRA, AL SERVICIO DE LA INVESTIGACIÓN EN CÁNCER

Mientras para la mayoría de personas el pez cebra, un pez tropical llamado así por sus rayas, no deja de ser más que una mascota popular, para los científicos se ha convertido en un nuevo modelo de laboratorio que complementa al modelo clásico de ratón.El embrión de pez Mientras para la mayoría de personas el pez cebra, un pez tropical llamado así por sus rayas, no deja de ser más que una mascota popular, para los científicos se ha convertido en un nuevo modelo de laboratorio que complementa al modelo clásico de ratón.El embrión de pez cebra no llega a medir más de 1 mm, mientras que el adulto mide entre 3-4 centímetros. Los machos y las hembras son fácilmente reconocibles (Figura 8).

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Fig. 9

Fig. 9. Desarrollo embriones de cebra

Precisamente su pequeño tamaño es una de las ventajas que tiene para los laboratorios de investigación, ya que se puede tener mayor Cantidad de animales en menos espacio y su mantenimiento es relativamente barato (entre 100 y 1000 veces menos que el coste de mantenimiento de ratonesde laboratorio).cebra no llega a medir más de 1 mm, mientras que el adulto mide entre 3-4 centímetros.Los machos y las hembras son fácilmente reconocibles (figura 1). Precisamente su pequeño tamaño es una de las ventajas que tiene para los laboratorios de

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investigación, ya que se puede tener mayor cantidad de animales en menos espacio y su mantenimiento es relativamente barato (entre 100 y 1000 veces menos que el coste de mantenimiento de ratones de laboratorio).

Cada hembra puede depositar más de 200 embriones por semana. Estos embriones, que se desarrollan fuera de la madre protegidos por una membrana (el corion), son transparentes y su organogénesis ocurre en 24 horas. ¡Todo un milagro de la división y diferenciación celular!. Lo demuestra cuando lo comparamos con el desarrollo embrionario humano, donde después de 22 horas tras la fecundación solo se ha producido una división celular y cinco días después de la fecundación somos un blastocito con 200 células multipotentes. Mientras el embrión de pez cebra ha eclosionado al tercer día y se ha convertido en toda un larva al quinto día después de la fecundación. En un mes se le considera que es un juvenil y en tres meses pude reproducirse de manera continua, manteniéndose fértiles durante más de 18 meses, asegurando un suministro constante de embriones con pocos individuos.El pez cebra llega al final de su vida entre los dos años y los tres años y medio (Figura 2.)

Fig. 10

Fig. 10. Ciclo de vida de la cebra.

Muchas son las ventajas de este pequeño vertebrado con el que compartimos un ancestro común y del que divergimos evolutivamente hace 400 millones de a ˜ nos. Gracias al desarrollo de herramientas como la secuenciación completa de su genoma y el estudio global de los patrones de expresión génica ha permitido poner de manifiesto el alto grado de semejanza Genética y fisiológica con el ser humano en procesos fundamentales. Uno de esos procesos es el cáncer, donde no solo se conservan la mayoría de genes implicados

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en este proceso sino que además también se encuentran alterados de una manera similar a las rutas gen éticas típicamente desreguladas en los Tumores humanos. Esta semejanza no solo ocurre a nivel molecular, a nivel histopatológico las neoplasias de los peces son bastante similares al c ´cáncer en humano.(figura 9).Por otro lado, el pez cebra no es buen modelo para todos los tipos de tumores. El pez no tiene tejido mamario, y tiene branquias en lugar de pulmones. Pero aunque el pez cebra no pueda ser un modelo directo para el cáncer de mama y de pulmón, seguramente el mecanismo molecular que lo produce se conserva en otros tipos de tumores. Pero ¿qué es lo que lo convierte en un modelo atractivo para la investigación en general y el cáncer en particular? Fundamentalmente tres aspectos; Fácil manipulación genética: Para que un organismo pueda ser modelo de una enfermad como el cáncer, es necesario que se pueda manipular /alterar los genes implicados en este proceso. Afortunadamente ha habido un fuerte impulso por parte de la comunidad científica por desarrollar técnicas alrededor del modelo que permiten hacer animales transgénicos

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CONCLUSIÓN

La ingeniería genética es una vía alternativa a la selección artificial dirigida (aplicada ya en algunos casos) . Tecnologías como la manipulación del genoma de estos animales mediante la inserción de genes o la manipulación de los ya existentes permiten conseguir animales transgénicos de alta tasa de crecimiento o resistentes a enfermedades sin necesidad de selección genética, normalmente lenta y limitada.

Desde que varias compañías presentaron su solicitud de permiso para comercializar salmón transgénico, no ha cesado de crecer la controversia en torno a estos salmones transgénicos. La investigación sobre líneas de peces transgénicas ha estado en marcha durante los últimos quince años en todo el mundo, incluyendo fundamentalmente el salmón del Pacífico (Onchorrhynchus kisutch), varios miembros de la familia de los salmónidos y otros peces de interés comercial como el pez gato o la tilapia.

No sabemos si los salmones transgénicos presentan algún tipo de riesgo real pero sí se intuyen riesgos potenciales:

El salmón cultivado (transgénico o no) se escapa de las jaulas en las que se cría en el agua.

El salmón modificado genéticamente puede cruzarse con los salvajes liberando sus genes de la hormona del crecimiento a las poblaciones salvajes con resultados impredecibles.

Las metodologías de esterilización no son eficaces al 100% y existe una gran variación en los resultados entre grupos de animales.

Los salmones modificados genéticamente comen tres veces más en el laboratorio que los no modificados pero es menos cuidadoso con sus depredadores

¿Serían menos capaces de sobrevivir en la naturaleza?

Es necesaria MAS INVESTIGACIÓN sobre el posible impacto ecológico de estos peces modificados genéticamente antes de pasar a su producción comercial.

La Organización para los alimentos y la agricultura de las Naciones Unidas predice que la producción de la acuicultura se doblará en la próxima década. Dado que la acuicultura en aguas costeras está dañando los ecosistemas, extendiendo enfermedades de peces y moluscos, modificando hábitats, causando contaminación por el exceso de nutrientes y antibióticos y mediante la introducción de especies exóticas, se piensa que los legisladores pueden llegar a exigir que las granjas de peces se instalen solo en tierra. Si esto es así los peces modificados genéticamente que crezcan rápido podrían ser la única salida para que esta industria sea económicamente competitiva.

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BIBLIOGRAFÍA

Muñoz J, Sarasquete C, González M. Patología, fisiología y biotoxicología en especies acuáticas. Editorial CSIC, Madrid. 1999; p. 140-150.

Beardmore, Mair G & Lewis R. Biodiversity in aquatic systems in relation to aquaculture. Aquaculture Research 28: 829-839.

Zhu Z, Li G., He L., and Chen S. Novel gene transfer into the fertilized eggs of goldfish (Carassius auratus 1758). Journal of Applied Ichthyology 1985.1:31-33.

European Initiative for Biotechnology Education (EIBE).Animales trangénicos. Garvin W, Ute Harms, Caroline Shearer, Laurence Simonneaux. Reino Unido, 1988.

Liu Z, Moav B, Faras A, Guise K, Kapuscinski A & Hackett P. Development of expression vectors for transgenic fish. Biotechnology (N.Y.) 1990. 8 1268-1272.

Fletcher L, Shears A, King J, Davies L & Hew L. Evidence for antifreeze protein genetransfer in Atlantic salmon. 1988 Can.J.Fish.Aquat.Sci 45 352-357.

Inoue K, Akita N, Shiba T, Satake M & Yamashita S. Metal-inducible activities of metallothionein promoters in fish cells and fry Biochem.Biophys.Res.Commun. 1992. 185 1108-1114.

Muller F, Blader P & Strahle U. Search for enhancers: teleost models in comparative genomic and transgenic analysis of cis regulatory elements. 2002. Bioessays 24 564-572.

Chourrout D, Guyomard R & Houdebine LM. High efficiency gene transfer in rainbow trout (Salmo gairdneri Rich) by microinjection into egg cytoplasma. 1986. Aquaculture 51 143-150.

Lin S, Yang S & Hopkins N. lacZ expression in germ line transgenic zebra fish can be detected in living embryos. 1994. Dev. Biol. 161 77-83.

Davidson AE, Balciunas D, Mohn D, Shaffer J, Hermanson S, Sivasubbu S, Cliff MP, Hackett PB & Ekker SC. Efficient gene delivery and gene expression in zebra fish using the Sleeping Beauty transposon. Developmental Biology. 2003. 263 191-202.

27

Caldovic L, Agalliu D & Hackett PB. Position-independent expression of transgenes in zebra fish. Transgenic Res. 1999. 8 321-334.

Caldovic L & Hackett PB, Jr. Development of position-independent expression vectors and their transfer into transgenic fish. . Mol.Mar.Biol.Biotechnol. 1995; 4 51-61.

Fletcher GL, Shears MA, King MJ, Davies PL & Hew CL. Evidence for antifreeze protein gene transfer in Atlantic salmon. Can.J.Fish.Aquat.Sci. 1988; 45 352-357.

Chourrout D, Guyomard R & Houdebine LM. High efficiency gene transfer in rainbow trout (Salmo gairdneri Rich) by microinjection into egg cytoplasma. Aquaculture. 1986; 51 143-150.

Sin, F. Transgenic fish. Reviews in fish biology and fisheries. 1997; 7: 417-441.

Tewari, R., C. Michard-Vanhee, E. Parrot, D. Chourrout. Mendelian transmission, structure and expression of transgenes following their injection

Into the cytoplasm of trout eggs. Transgenic Res. 1992; 1: 250-260.

Du, S. J., Z. Gong, G. L. Fletcher, M. A. Shears, M. J. King, D. R. Idler C. L.Hew. Growth enhancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an“All fish” chimeric growth hormone gene constructs. Bio techniques. 1992; 10: 176-180.

Devlin, R. H., T. Y. Yesaki, C. A. Biagi, E. M. Donaldson, P. Swanson W. K.Chan, Extraordinary salmon growth. Nature. 1994; 371: 209-210.

Zafarullah, M., K. Bonham L. Gedamu. Structure of the rainbow trout metallothionein B gene and characterization of its metal-responsive region.Mol. Cell. Biol. 1988; 8: 4469-4476.

Chan, K. W., R. H. Devlin. Polymerase chain reaction amplification andfunctional characterization of sockeye salmon histone H3, metallothionein-B,and protamine promoters. Mol. Mar. Biol. Biotech. 1993; 2: 308-318.

Liu B, Moav J, Faras S, Guise R, Kapscinski P. B. Hackett. Development of expression vectors for transgenic fish. Bio/Technology 1990; 8: 1268-1272.

Jankowski, J. M., G. H. Dixon. The GC box as a silencer. Biosci. Rep. 1987; 7: 955-963.

28

Prosper F. Células madre adultas. Congreso Nacional de Bioética, “Estado actual de la investigación y ética en Células Madre”. Canarias; 2002.

Melamed M. The potential impact of modern biotechnology on fish aquaculture. Aquaculture. 2002; 204, 255-269.

Tsukasa M, Devlin, H. Transgene and host growth hormone gene expression in pituitary and nonpituitary tissues of normal and growth hormone Transgenic salmon. Molecular and Cellular Endocrinology. 1999; 149: 129-139.

Cook T, M. A. McNiven F, Richardson M, Sutterlin. “Growth rate, body composition and feed digestibility/conversion of growth-enhanced transgenic Atlantic salmon (Salmon salar). Aquaculture. 2000; 188: 15-32.

Gong Z, Ju B, Wan H. Green fluorescent protein (GFP) transgenic fish and their applications. Genetic. 2001; 111: 213-225.

Wan H, He J, Ju, B, Yan T, Lam, T, Gong Z. Generation of Two-color Transgenic Zebra fish Using the Green and Red Fluorescent Protein Reporter Genes GFP and RFP. Mar. Biotechnology. 2002; 4: 146–154.

Gong Z, Wan H, Leng Tay, Wang H, Chen M, Yan T. Development of transgenic fish for ornamental and bioreactor by strong expression of fluorescent proteins in the skeletal muscle. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2003; 308: 58–63.

Chung Oscar. Biotechnology: Nightlights for the Aquarium. Taiwan Review. April. 2006; 40-45.

Amsterdam A, Lin S, Hopkins N. The Aequorea Victoria green fluorescent protein can be used as a reporter in live zebra fish embryos. Developmental Biology. 1995; 171: 123-129.

Espinosa C. Reproducción e hibridación de peces transgénicos fluorescentes en cautiverio: un alcance prospectivo. Scientia Agropecuaria. 2012; (1) 89 – 93.

Cayuela M, Pérez F, Flageu M. El pez cebra, al servicio de la investigación en cáncer. REV. EUBAC. Especial biomedicina. 2012; 2012. (28).

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