2

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

ERIKA RODRIGUES DA SILVA

CARACTERIZAÇÃO DA BIOENERGÉTICA MITOCONDRIAL

MEDIANTE METABOLISMO PREDOMINANTEMENTE GLICOLÍTICO

EM CÉLULAS DE GLIOMA HUMANO EM CULTURA

CHARACTERIZATION OF MITOCHONDRIAL BIOENERGETICS BY

MOSTLY GLYCOLYTIC METABOLISM IN HUMAN GLIOMA CELLS IN

CULTURE

CAMPINAS

2017

ERIKA RODRIGUES DA SILVA

CARACTERIZAÇÃO DA BIOENERGÉTICA MITOCONDRIAL

MEDIANTE METABOLISMO PREDOMINANTEMENTE GLICOLÍTICO

EM CÉLULAS DE GLIOMA HUMANO EM CULTURA

CHARACTERIZATION OF MITOCHONDRIAL BIOENERGETICS BY

MOSTLY GLYCOLYTIC METABOLISM IN HUMAN GLIOMA CELLS IN

CULTURE

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade

Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do

título de Mestra em Ciências.

Dissertation presented to the Faculty of Medical Sciences of the State

University of Campinas to obtain the master grade in Sciences.

ORIENTADOR: PROF. DR. ROGER FRIGERIO CASTILHO

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO

FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA

ERIKA RODRIGUES DA SILVA E ORIENTADA

PELO PROF. DR.ROGER FRIGERIO CASTILHO.

CAMPINAS

2017

ORIENTADOR: ROGER FRIGERIO CASTILHO

MEMBROS:

1. PROF. DR. ROGER FRIGERIO CASTILHO

2. PROF. DR. SANDRA MARTHA GOMES DIAS

3. PROF. DR. LEONARDO DOS REIS SILVEIRA

Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências

Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora

encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO

ERIKA RODRIGUES DA SILVA

Data: 26 de maio de 2017

DEDICATÓRIA

À minha família pelos inúmeros exemplos de honestidade, dedicação,

superação e união. Em especial àqueles que não estão mais presentes fisicamente:

Vó Catarina, Vô Faria e Tio Maurício. Vocês me ensinaram que sabedoria não é algo

que se aprende na academia.

AGRADECIMENTOS

À Inteligência Suprema, pela Vida cuja beleza e complexidade sempre me

intrigaram.

Ao Everson por me mostrar o quão belo é o amor.

Aos amigos e familiares, que a cada conquista minha vibraram e me

incentivaram a ir mais além, me suportando mesmo nos períodos de crises e

dúvidas que não foram poucos, muito obrigada sem vocês nada disso seria possível.

Aos amigos do laboratório Marcia Fagian, Roberto Stahl, Edilene Santos,

Felipe Ravagnani, Paolo La Guardia (in memoriam), Ivan Cappelli, Guilherme

Michelini, Audrey de Moraes, Juliana Ruas, Juliana Ronchi, Ana Carolina Marques,

Hanan Chweih, Raffaela Ignarro, Arthur Hernandez, Gustavo Facchini, Tiago

Figueira, Genoefa Dal’Bo, Evellyne Figueiroa, Claudia Navarro, Annelise Francisco,

Mayara Bertolini, Kézia de Moura, Estela Busanello, Ana Catarina Leite, Noelia

Lander, Miguel Chiurillo - cujas conversas e companhia fizeram de meus dias mais

alegres, que compartilharam do desespero por resultados inesperados e da

felicidade pelo êxito de protocolos. Pelas palavras de incentivo, aventuras

gastronômicas e outras coisas que no dia a dia fizeram toda a diferença. Em

especial à Edilene que muito contribuiu para a execução desse trabalho - “My Angel”

em muitas situações.

Ao Prof. Dr. Roger Frigério Castilho, pela oportunidade e orientação que

contribuíram significativamente para o meu crescimento pessoal e profissional.

Aos professores que cruzaram meu caminho- a dedicação e amor de vocês

fizeram uma diferença enorme na minha vida.

"Un científico em su laboratorio no es solo un técnico: es también um niño colocado

ante fenómenos naturales que Le impresionan como um cuento de hadas."

Marie Curie

O presente trabalho foi desenvolvido nos Laboratórios de Bioenergética e de

Neurodegeneração Experimental (LABNEX), Núcleo de Medicina e Cirurgia

Experimental (NMCE), Departamento de Patologia Clínica, Faculdade de Ciências

Médicas, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), sob orientação do Prof.

Dr. Roger Frigério Castilho, sob auxílios concedidos pelo Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa

do Estado de São Paulo (FAPESP 11/50400-0) e Fundo de Apoio ao Ensino à

Pesquisa e Extensão da UNICAMP (FAEPEX).

RESUMO

Gliomas são tumores bastante agressivos e altamente glicolíticos. No

presente estudo avaliamos a função respiratória mitocondrial de células de glioma

humano (T98G e U-87MG) e de tecido humano de glioblastoma multiforme (GBM).

Para isso foram realizadas medidas da taxa de consumo de oxigênio (TCO) em

diferentes condições experimentais. Verificou-se que a TCO de células T98G e U-

87MG está acoplada à fosforilação do ADP, uma vez que a quantidade de ATP

produzida por oxigênio consumido (razão ADP/O) foi de ~2.5. A respiração basal de

GBM também se mostrou parcialmente associada à fosforilação oxidativa do ADP.

Além disso, a presença de um inibidor do poro de transição de permeabilidade

mitocondrial não afetou a TCO de células de glioma intactas, indicando integridade

da membrana mitocondrial. A respiração basal de células intactas (T98G e U-87MG)

não se mostrou limitada pela disponibilidade de substratos endógenos, uma vez que

a TCO basal foi estimulada pelo protonóforo FCCP. Essas células também

apresentaram alta afinidade pelo oxigênio, conforme evidenciado pelos valores da

pressão parcial de oxigênio na qual a respiração é metade da máxima (p50). Em

células de glioma permeabilizadas, a TCO estimulada por ADP foi aproximadamente

50% daquela obtida com a adição de FCCP, revelando uma limitação significativa da

fosforilação oxidativa (OXPHOS) em relação à atividade do sistema de transporte de

elétrons (ETS). Essa característica se manteve mesmo quando as células foram

cultivadas sob baixa concentração de glicose. Análises de coeficiente de controle de

fluxo demonstraram que a limitação da OXPHOS pode estar associada a função da

ATP sintase e do translocador de nucleotídeos de adenina, mas não a do

transportador de fosfato. A inibição da OXPHOS em células em cultura promoveu

um aumento da toxicidade do quimioterápico temozolomida na linhagem mais

resistente (T98G) ao tratamento com esta droga. Em conjunto, os dados obtidos

indicam que a disponibilidade e metabolismo de substratos respiratórios bem como o

sistema de transporte de elétrons em células de glioma T98G e U-87MG encontram-

se preservados, apesar dessas células possuírem uma limitação relativa da

capacidade da OXPHOS.

Palavras chave: Neoplasias. Efeito Warburg. Glioma. Mitocôndrias.

ABSTRACT

Gliomas are aggressive and highly glycolytic tumors. In the present study, we

evaluated the mitochondrial respiratory function of glioma cells (T98G and U-87MG)

and fresh human glioblastoma (GBM) tissue. To this end, measurements of oxygen

consumption rate (OCR) were performed under various experimental conditions. The

OCR of T98G and U-87MG cells was well coupled to ADP phosphorylation based on

the ratio of ATP produced per oxygen consumed (ADP/O ratio of ~2.5). In

agreement, the basal OCR of GBM tissue was also partially associated with ADP

phosphorylation. The presence of an inhibitor of the mitochondrial permeability

transition pore did not affect OCR of intact glioma cells, indicating mitochondrial

membrane integrity. The basal respiration of intact T98G and U-87MG cells was not

limited by the supply of endogenous substrates, as indicated by the increased OCR

in response to the protonophore FCCP. These cells also displayed a high affinity for

oxygen, as evidenced by the values of the partial pressure of oxygen when

respiration is half maximal (p50). In permeabilized glioma cells, ADP-stimulated OCR

was only approximately 50% of that obtained in the presence of FCCP, revealing a

significant limitation in oxidative phosphorylation (OXPHOS) relative to the activity of

the electron transport system (ETS). This characteristic was maintained when the

cells were grown under low glucose conditions. Flux control coefficient analyses

demonstrated that the impaired OXPHOS was associated with the function of both

mitochondrial ATP synthase and the adenine nucleotide translocator, but not the

phosphate carrier. The OXPHOS inhibition in cultured cells resulted in an increased

temozolomide toxicity in the cells more resistant (T98G) to this drug. Altogether,

these data indicate that the availability and metabolism of respiratory substrates and

mitochondrial ETS are preserved in T98G and U-87MG glioma cells even though

these cells possess a relatively restrained OXPHOS capability.

Key words: Neoplasms. Warburg effect. Glioma. Mitochondria.

LISTA DE ABREVIATURAS

ADP - Adenosina difosfato

ANT - Translocator de nucleotídeos de adenina

APAD - 3-Acetylpyridine adenine dinucleotide

ATCC - American Type Culture Collection

ATP - Adenosina trifosfato

BHT - Hidroxitolueno butilado

BSA - Albumina de soro bovino

CDKs - Quinases dependentes de ciclinas

DMEM - Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium

EGFR - Receptor do fator de crescimento epidérmico

ETS - Sistema de transporte de elétrons

FADH2 - Flavina adenina dinucleotídeo

FCC - Coeficiente de controle de fluxo

FCCP - Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone

GBM - Glioblastoma multiforme

GTP - Guanosina trifosfato

MTIC - 5-(3-metiltriazeno-1-il)imidazol-4-carboxamida

MTT - Tetrazolium microplate assay

NADH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo (estado reduzido)

NADP+ - Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (estado oxidado)

NADPH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo (estado reduzido)

NO• - Óxido nítrico

OXPHOS - Fosforilação oxidativa

PiC - Transportador de fosfato

PTEN - Phosphatase and tensin homolog

SDS - Sodium Dodecyl Sulfate

SFB - Soro fetal bovino

SNC - Sistema nervoso central

TP53 - Gene da proteína tumoral p53

SUMÁRIO

1 - INTRODUÇÃO .........................................................................................................13

1.1- Glioblastoma Multiforme.........................................................................................13

1.2- Linhagens Celulares T98G e U-87MG ...................................................................16

1.3- Metabolismo Celular de Tecidos Diferenciados .....................................................17

1.4- Bioenergética Tumoral e o Efeito Warburg ............................................................19

1.5- Estudo da Função Mitocondrial em Células ...........................................................21

2- OBJETIVOS ..............................................................................................................23

3- METODOLOGIA .......................................................................................................24

3.1- Manutenção das Células T98G e U-87MG ............................................................24

3.2- Material Humano ....................................................................................................24

3.3- Isolamento de Mitocôndrias ...................................................................................25

3.4- Medida do Consumo de Glicose e Produção de Lactato .......................................25

Figura 3. Princípio dos Métodos de Dosagem de Glicose e Lactato .............................26

3.5- Consumo Mitocondrial de Oxigênio .......................................................................26

3.6- Viabilidade Celular .................................................................................................27

3.7- Determinação do Coeficiente de Controle de Fluxo ...............................................28

3.8- Determinação da Atividade da Citrato Sintase .......................................................29

Figura 4. Princípio da reação da determinação da atividade da citrato sintase ............29

3.9- Determinação da Atividade da Transidrogenase de Nucleotídeos de Nicotinamida ..................................................................................................................................29

3.10- Análise Estatística ................................................................................................30

4- RESULTADOS .........................................................................................................31

4.1- Capítulo I ................................................................................................................31

4.2- Capítulo II ...............................................................................................................42

5- DISCUSSÃO GERAL ...............................................................................................59

6- CONCLUSÕES .........................................................................................................62

7- REFERÊNCIAS ........................................................................................................63

9- ANEXOS ...................................................................................................................69

9.1- ANEXO I: Parecer do Comitê de Ética ................................................................69

9.2- ANEXO II: Parecer do Comitê de Ética ...............................................................70

9.3- ANEXO III: Autorização de “Copyright” ...............................................................73

13

1 - INTRODUÇÃO

As mitocôndrias são de suma importância para a manutenção da

homeostase celular, visto que estas organelas têm participação em diversos

processos tais como na regeneração de ATP, no controle das concentrações

intracelulares do íon cálcio, na morte celular, dentre outras funções. Alterações em

funções mitocondriais fazem parte da fisiopatologia de diversas doenças, dentre elas

do câncer. O câncer caracteriza-se por crescimento celular descontrolado com perda

da função celular e alterações genético-metabólicas diversas que podem ser tecido-

específicas ou não, representando um grande desafio para a medicina moderna.

Tumores como os glioblastomas multiformes (GBMs) são um exemplo desse

desafio, visto a pouca eficácia da terapêutica disponível e sua alta incidência na

população.

Ao longo dessa Introdução serão abordados temas relativos às

características dos GBMs, dos modelos de estudo dessa neoplasia maligna, do

metabolismo energético celular e da bioenergética desse tipo tumoral.

1.1- Glioblastoma Multiforme

Gliomas são neoplasias malignas originárias a partir de células do tecido

nervoso conhecidas como neuroglia, ou simplesmente células da glia, cuja função

no parênquima cerebral normal é a de sustentar, defender e fornecer nutrientes para

a unidade anatomo-funcional do sistema nervoso, os neurônios (1,2).

Vários tipos celulares compõem a neuroglia - os astrócitos,

oligodendrócitos, microgliócitos e células ependimárias; cada um desses tipos

celulares desempenha uma função diferente no sistema nervoso central, como por

exemplo, sustentação e isolamento dos neurônios, armazenamento de glicogênio,

regulação dos níveis de potássio extraneuronal, formação da bainha de mielina dos

axônios, fagocitose de detritos celulares e micro-organismos, dentre outras (1,2).

De acordo com o tipo celular de origem, os gliomas são classificados em

astrocitomas, oligondendrogliomas e ependimomas. Os astrocitomas são

histologicamente classificados de acordo com a Organização Mundial de Saúde

(OMS) em grau I, II, III ou IV, levando-se em conta os seguintes achados

histológicos: atipias nucleares, mitoses, proliferação microvascular e necrose; os

14

astrocitomas de graus de I a IV são conhecidos também como astrocitoma pilocítico,

astrocitoma difuso, astrocitoma anaplásico e glioblastoma multiforme (GBM),

respectivamente. Os GBMs são os tumores gliais mais agressivos e de grande

capacidade infiltrativa, podem ser primários ou secundários e correspondem a 15%

de todas as neoplasias intra-cranianas (3).

Os GBMs tidos como primários, os mais frequentes, apresentam rápida

evolução e acometem principalmente idosos, enquanto que os secundários

acometem indivíduos mais jovens e progridem de forma lenta a partir de

astrocitomas difusos (aquele de grau II). A divisão em primário ou secundário é

realizada a partir da apresentação clínica, principalmente no que diz respeito à

evolução dos sintomas, sendo que a sobrevida média para ambos os tipos de GBM

é de menos de um ano (4,5). Diversas alterações genéticas são encontradas em

GBMs, algumas das quais têm relação direta com a progressão da doença e

consequentemente com prognóstico do paciente. O perfil das principais alterações

genéticas encontradas em GBMs primários e secundários não é o mesmo e varia

conforme ilustrado na Figura 1.

As alterações genéticas mais frequentemente encontradas em GBMs

afetam principalmente as vias de controle e ativação do ciclo celular, apoptose e da

glicólise. Dentre as alterações que envolvem ciclo celular e apoptose podemos citar

alterações de expressão e/ou mutações no receptor do fator de crescimento

epidérmico (EGFR), nas quinases dependentes de ciclinas (CDKs) e seus inibidores

(e.g. a proteína p16), além de mutações nos genes da proteína supressora tumoral

p53 (TP53) e do PTEN (do inglês, phosphatase and tensin homolog) (6–8). Em

relação a via glicolítica, são frequentes as alterações envolvendo aumento da

expressão nas isoformas 2 das proteínas piruvato quinase (PKM2) e hexoquinase

(HKII), além da isoforma A da lactato desidrogenase (LDH-A) (9–11).

O tratamento padrão para o GBM envolve radioterapia, quimioterapia e

remoção cirúrgica do tumor. Um dos principais quimioterápicos preconizados para o

tratamento desse tipo de neoplasia é a temozolomida (TMZ), composto de alta

biodisponibilidade, capaz de atravessar a barreira hemato-encefálica devido a sua

natureza lipofílica (12,13). A temozolomida é convertida em seu metabólito ativo, o 5-

(3-metiltriazeno-1-il)imidazol-4-carboxamida (o MTIC), após hidrólise espontânea no

15

plasma sanguíneo. O MTIC possui atividade citotóxica devido a sua capacidade de

alquilar o DNA nas posições O(6) e N(7) da guanina (13).

Figura 1. Características genéticas dos GBMs. Alterações genéticas em GBMs são

heterogêneas e diferem entre GBM primário e secundário, alterações na via do PI3K/PTEN

no entanto são comuns a ambos os GBMs. As principais proteínas afetadas pelas

alterações genéticas são apresentadas nas laterais das setas azuis. Fonte: Adaptado de

Sathornsumetee e Rich, 2008 (8).

16

1.2- Linhagens Celulares T98G e U-87MG

As linhagens celulares utilizadas na realização deste estudo foram

originárias de GBMs, que como abordado anteriormente são o tipo mais agressivo

dentre os gliomas e cuja conduta, no que diz respeito a tratamento, ainda é bastante

ineficaz, resultando num prognóstico ruim.

Existem várias linhagens celulares imortalizadas que funcionam como

modelo para o estudo de GBM (Glioma Tumor Cell Panel ATCC® TCP­1018™). As

células T98G e U-87MG foram as duas linhagens utilizadas para se estudar à

bioenergética dos GBMs e embora ambas sejam linhagens celulares obtidas do

mesmo tipo tumoral, apresentam diferenças entre si em aspectos genéticos e

morfológicos. Estas linhagens foram obtidas da ATCC (American Type Culture

Collection).

Morfologicamente a linhagem T98G se assemelha a um fibroblasto,

apresenta mutação no gene p53 e tem cariótipo polipentaploide com números

cromossômicos que variam de 128 a 132, enquanto que a linhagem U-87MG se

assemelha a uma célula epitelial, tem prolongamentos citoplásticos característicos,

possui mutações genéticas nos genes CDKN2A, CDKN2C, PTEN e cariótipo

hipopentaploide e ao contrário da célula T98G essa linhagem tem capacidade

tumorigênica.1

Metabolicamente essas células apresentam uma característica comum

não só aos GBMs como a diversos outros tipos de tumores: a oxidação parcial da

glicose com desvio do piruvato à lactato mesmo na presença de oxigênio - fenômeno

este conhecido como Efeito Warburg (14,15). Para discutirmos sobre essa

característica dos GBMs, antes é preciso uma breve contextualização sobre

metabolismo celular.

1T98G:http://www.atcc.org/products/all/CRL-1690.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7

U-87MG: http://www.atcc.org/Products/All/HTB-4.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7

17

1.3- Metabolismo Celular de Tecidos Diferenciados

As células de tecidos diferenciados são capazes de obter energia sob a

forma de adenosina trifosfato (ATP) através da oxidação de diferentes substratos:

carboidratos, ácidos graxos e proteínas. Vários processos e uma série de reações

bioquímicas são necessários para que isso ocorra. Algumas organelas apresentam

papel crucial na regeneração de ATP, a mitocôndria é a organela responsável pela

maioria dessas reações e é o local no qual a regeneração de ATP é a maior por mol

de substrato oxidado. Considerando a glicose como substrato a ser oxidado, a

maioria das células normais se utilizará dos seguintes processos: glicólise, ciclo do

ácido cítrico, sistema de transporte de elétrons (ETS) e fosforilação oxidativa.

A glicólise, oxidação da glicose a duas moléculas de piruvato, desenvolve-

se em duas etapas, uma na qual há um investimento de energia (gasto de ATP) e

outra na qual existe um rendimento de energia, ou seja, de ATP, ambas as etapas

ocorrem no citosol. Ao final da glicólise existe ganho positivo de duas moléculas de

piruvato, duas moléculas da coenzima reduzida NADH (nicotinamida adenina

dinucleotídeo) e de duas moléculas de ATP. Na presença de oxigênio molecular, em

condições aeróbias, o piruvato produzido será convertido à acetil-CoA para participar

do ciclo do ácido cítrico e em condições anaeróbias esse piruvato será convertido a

lactato (16).

O ciclo do ácido cítrico ocorre na matriz mitocondrial e tem início com a

reação de acetil-CoA e oxaloacetato, originando citrato. Após uma série de reações,

o citrato é convertido a oxaloacetato e duas moléculas de CO2. Os grupos acetil

podem ser oriundos da glicólise, através da oxidação de piruvato à acetil-CoA, pelo

complexo da piruvato desidrogenase, da degradação de ácidos graxos através da

beta-oxidação ou ainda da degradação de aminoácidos. Ao longo do ciclo do ácido

cítrico são geradas duas moléculas de guanosina trifosfato (GTP) além das

coenzimas reduzidas NADH e FADH2 (17,18).

No sistema de transporte de elétrons, as coenzimas reduzidas originadas

a partir do ciclo do ácido cítrico são reoxidadas, sendo o oxigênio o aceptor final dos

elétrons. Os elétrons são transportados através dos complexos I, II, III e IV. O

complexo I oxida o NADH e transfere seus elétrons para a coenzima Q (que também

recebe os elétrons derivados da oxidação do succinato pelo complexo II), da

coenzima Q os elétrons são transferidos para o complexo III e deste para o

18

citocromo c e subsequentemente à citocromo c oxidase (complexo IV), de onde são

finalmente transferidos para o oxigênio molecular com a geração de H2O (19).

Acoplado ao transporte mitocondrial de elétrons ocorre também o

transporte de prótons, no qual prótons passam da matriz mitocondrial para o espaço

intermembranas através dos complexos I, III e IV gerando assim um gradiente

eletroquímico cuja energia armazenada - força próton motriz - direciona a síntese de

ATP através da enzima ATP sintase também conhecida como complexo V (16,18).

Acredita-se que para cada NADH oxidado dez prótons sejam

transportados da matriz mitocondrial para o espaço intermembranas, dos quais

quatro seriam transportados pelo complexo I, quatro pelo complexo III e dois pelo

complexo IV. Através da ATP sintase esses prótons retornam do espaço

intermembranas para a matriz mitocondrial, contribuindo assim com a formação de

ATP via OXPHOS. A quantidade gerada de ATP por essa via é bastante grande

(~36 mol ATP/mol glicose), sendo que em células diferenciadas a maior parte do

ATP necessário à manutenção celular é proveniente desta via (19).

Tecidos diferenciados em situação de normóxia (níveis normais de

oxigênio molecular) têm a maior parte do piruvato sendo utilizado para a geração de

ATP via OXPHOS.

19

1.4- Bioenergética Tumoral e o Efeito Warburg

Como já mencionado, em condições aeróbicas a maior parte da energia

necessária à célula é gerada através da respiração celular, processo realizado pelas

mitocôndrias e que compreende o ciclo do ácido cítrico, o sistema de transporte de

elétrons e a OXPHOS.

No entanto, em alguns tipos de tumores, como é o caso dos GBMs é

frequente a observação de que mesmo na presença de oxigênio molecular, a

geração de ATP depende quase que exclusivamente da glicólise, com desvio do

piruvato à lactato, conforme ilustrado na Figura 2. Esse fenômeno foi observado há

nove décadas (20–22) e foi caracterizado em vários aspectos pelo pesquisador Otto

Warburg sendo por isso conhecido como efeito Warburg (23,24). Além de glicose

esses tumores também apresentam alto consumo de glutamina, aminoácido

importante tanto como doador de carbono para as vias de síntese como para

manutenção dos níveis dos intermediários do ciclo do ácido cítrico (anaplerose) (25).

Desta forma, a oxidação parcial da glicose aliada ao aumento da

utilização de glutamina, seria capaz de suprir as necessidades energéticas,

estruturais e replicativas das células tumorais fornecendo além do ATP, outras

moléculas necessárias ao aumento rápido de biomassa como NADPH, acetil-CoA,

intermediários da glicólise e do ciclo do ácido cítrico entre outras (26,27). Além do

mais, diversos aspectos genéticos e de controle da via glicolítica encontram-se

alterados, tornando este processo predominante em células tumorais (28).

São muitos os fatores que podem contribuir para que células tumorais

apresentem metabolismo predominantemente glicolítico mesmo na presença de

oxigênio molecular (efeito Warburg) (24). Dentre as alterações celulares que podem

favorecer o metabolismo glicolítico temos danos à função mitocondrial (29),

ocorrência da transição de permeabilidade mitocondrial (MPT) (30), restrição da

disponibilidade de substratos (25), entre outras principalmente aquelas relacionadas

ao controle da via glicolítica (9,10,31).

20

Figura 2. Metabolismo Celular: Tecidos diferenciados vs. tecidos tumorais. Na

presença de oxigênio molecular (O2), tecidos diferenciados regeneram ATP majoritariamente

através da OXPHOS enquanto que nessa mesma situação tecidos tumorais e/ou em rápida

proliferação utilizam preferencialmente a glicólise. Fonte: Adaptado de Vander Heiden, 2009

(26).

21

1.5- Estudo da Função Mitocondrial em Células

No intuito de verificar os parâmetros bioenergéticos que poderiam

contribuir para a preferência da utilização da glicólise e não da OXPHOS, como fonte

prioritária para a regeneração de ATP nas células de glioma humano, o presente

estudo buscou caracterizar de forma minuciosa a função respiratória mitocondrial

das linhagens celulares T98G e U-87MG bem como de material humano de GBM.

Para isso, análises envolvendo a determinação do consumo de oxigênio foram

realizadas.

A verificação do consumo de oxigênio é uma medida comumente utilizada

para avaliar a função respiratória de diferentes tipos de amostras tais como

mitocôndrias isoladas, células intactas, permeabilizadas e até mesmo fragmentos de

tecidos; dentre os métodos disponíveis um dos mais sensíveis é a determinação do

consumo de oxigênio utilizando oxígrafos com eletrodos sensíveis ao oxigênio (e.g.

oxígrafo OROBOROS) (32,33). Através desse método se obtêm informações

relacionadas a diversos aspectos da função mitocondrial, como por exemplo,

utilização de substratos, acoplamento entre o consumo de oxigênio e a síntese de

ATP, parâmetros envolvendo cinética enzimática, entre muitos outros (34,35).

A função mitocondrial pode ser desafiada utilizando-se uma série de

compostos químicos capazes de alterar a atividade mitocondrial, estimulando-a ou

inibindo-a. Alguns desses compostos têm sua utilização já bastante consolidada

como é o caso do ADP que estimula a OXPHOS; dos desacopladores mitocondriais

(substâncias capazes de fazer o retorno dos prótons do espaço intermembranas

para a matriz mitocondrial, dissipando o potencial de membrana e proporcionando

um aumento da atividade do ETS); da oligomicina (inibidor especifico da ATP

sintase, que acarreta em inibição da OXPHOS) e da antimicina A (inibidor do

complexo III do ETS, que fornece dados sobre o consumo de oxigênio não

mitocondrial), entre outros (19).

Em células intactas é possível obter informações relativas ao consumo de

oxigênio basal, à participação da OXPHOS (porção sensível a oligomicina do

consumo basal), à respiração máxima (obtida com a adição de desacopladores) e ao

consumo de oxigênio não-mitocondrial (pós-adição de antimicina A). A partir desses

dados é possível também verificar a reserva da capacidade respiratória (do inglês,

22

spare respiratory capacity – SRC), através da subtração da respiração basal da

respiração máxima (36).

Parâmetros envolvendo a cinética da utilização de oxigênio também podem

ser determinados através da mensuração do consumo de oxigênio em células

intactas (37). No entanto, existem algumas limitações da utilização de células

intactas envolvendo a complexidade celular e a dificuldade da utilização de alguns

compostos que devido a permeabilidade seletiva da membrana plasmática não

conseguem atingir a mitocôndria.

Em virtude disso, a utilização de células permeabilizadas é útil na

determinação de parâmetros comumente obtidos em mitocôndrias isoladas, como

por exemplo, controle respiratório - razão entre o estado respiratório estimulado por

ADP (estado 3) e o estado na presença de oligomicina (estado 4); acoplamento

entre síntese de ATP e consumo de oxigênio (ADP/O), atividade máxima estimulada

da OXPHOS (adição de ADP), atividade máxima do ETS (adição de FCCP), entre

outros. A principal desvantagem da utilização de células permeabilizadas é o

possível dano à membrana externa mitocondrial e a liberação de citocromo c

(34,38), devido ao uso de detergentes como, por exemplo, digitonina. De modo que

a utilização tanto de células intactas quanto permeabilizadas permite explorar de

forma mais ampla a atividade mitocondrial.

23

2- OBJETIVOS

• Avaliar o perfil glicolítico das células de glioma humano T98G e U-87MG e a

participação relativa da fosforilação oxidativa na regeneração de ATP.

• Avaliar a função respiratória de mitocôndrias das células T98G e U-87MG em

diferentes situações e/ou estímulos, correlacionando os resultados com a

propriedade destas células de apresentarem metabolismo predominantemente

glicolítico, mesmo na presença de oxigênio molecular.

• Verificar se células oriundas de amostras de material humano (GBM) possuem as

mesmas características bioenergéticas que as linhagens celulares T98G e U-

87MG.

24

3- METODOLOGIA

3.1- Manutenção das Células T98G e U-87MG

Todos os procedimentos envolvidos na manutenção das linhagens

celulares foram realizados em fluxo laminar unidirecional após a ação de luz UV por

15 minutos. Ambas as linhagens celulares (T98G e U-87MG) foram mantidas em

estufa de CO2 a 5%, a temperatura de 37°C constantes, utilizando-se frascos de

cultura de 175 cm2 de área de crescimento. O meio de cultura utilizado foi o

Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM)2 2 g/L de glicose suplementado com

10% de soro fetal bovino e 1% de antibiótico (estreptomicina e penicilina). As células

foram divididas duas vezes por semana e o meio de cultivo trocado a cada dois dias.

Para retirada de células mortas e inativação do soro fetal bovino utilizou-se solução

de PBS (tampão fosfato salina) estéril; para desprendimento das células do frasco

de cultura utilizou-se solução de Tripsina/EDTA e para inativação da tripsina foi

utilizado o dobro de volume de meio DMEM 2 g/L suplementado com 10% de soro

fetal bovino e 1% de antibiótico. O pellet contendo as células foi obtido através de

centrifugação (500 g por 6 minutos) e ressuspendido no meio de reação apropriado

para cada experimento.

3.2- Material Humano

Os tumores humanos de pacientes, submetidos à intervenção cirúrgica no

Hospital das Clínicas da UNICAMP, foram transportados imersos em DMEM

suplementado sem fenol com a adição de HEPES 20 mM e 2% de antibiótico sendo

esse material acondicionado em gelo. O material foi cortado em fragmentos de

aproximadamente 1 mm3 utilizando-se o equipamento McIlwain Tissue Chopper (39),

na sequência o material foi pesado (admitindo-se para as análises um peso úmido

de 30 a 80 mg de tecido) e utilizado para análise do consumo mitocondrial de

oxigênio. Este procedimento experimental conta com aprovação pelo Comitê de

2DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium): Meio de cultura utilizado para o cultivo celular (suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibiótico- penicilina/estreptomicina) e para a realização de experimentos com células intactas (não suplementado, mas com adição de HEPES-Na+ 20 mM); comercializado pela VITROCELL COM. DE PROD. P/ LAB. LTDA. É constituído por sais minerais (CaCl2.H2O 265,00 mg/L, Fe(NO3)3.9H2O 0,10 mg/L, KCl 400,00 mg/L, MgSO4.7H2O 200,00 mg/L, NaCl 6.400,00 mg/L, NaH2PO.4H2O 125,00 mg/L e NaHCO3 33.700,0 mg/L), aminoácidos (L-arginina.HCl 84,00 mg/L, L-cistina 62,57 mg/L, L-glutamina 584,00 mg/L, glicina 30,00 mg/L, L-histidina.HCl.H2O 42,00 mg/L, L-isoleucina 105,00 mg/L, L-leucina 105,00 mg/L, L-lisina.HCl 146,00 mg/L, L-metionina 30,00 mg/L, L-fenilanina 66,00 mg/L, L-serina 42,00 mg/L, L-treonina 95,00 mg/L, L-triptofano 16,00 mg/L, L-tirosina 104,20 mg/L e L-valina 94,00 mg/L), vitaminas (cloreto de colina 4,00 mg/L, pantotenato de cálcio 4,00 mg/L, ácido fólico 4,00 mg/L, inositol 7,20 mg/L, nicotinamida 4,00 mg/L, piridoxal.HCl 4,00 mg/L, riboflavina 0,40 mg/L e tiamina.HCl 4,00 mg/L) e outros componentes (glicose 2.000,00 mg/L, piruvato de sódio 110,00 mg/L e vermelho de fenol 15,00 mg/L).

25

Ética em Pesquisa da FCM-UNICAMP (protocolo nº 1164/2011). Em paralelo, para

confirmação de diagnóstico, parte do material foi destinada para análise histológica,

na qual o material foi fixado com paraformaldeído e impregnado com parafina para

obtenção de cortes de 4 µm para análise histológica utilizando-se a coloração de

hematoxilina e eosina (HE).

3.3- Isolamento de Mitocôndrias

As suspensões contendo uma mistura de mitocôndrias sinápticas e não-

sinápticas de cérebro de rato, foram obtidas através do método de centrifugação

diferencial com adição de digitonina para permeabilização da membrana de

sinaptossomas (40,41). Os animais utilizados eram ratos machos da linhagem Wistar

e foram fornecidos pelo biotério central da Universidade Estadual de Campinas

(CEMIB – Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica). Os animais foram

mantidos em gaiolas em sala climatizada a 22 ± 2°C, com ciclo 12 horas claro e

escuro, tendo livre acesso a água e ração, conforme protocolo do LABNEX (Número

do Protocolo Comitê de Ética: CEUA 2534-1). Mitocôndrias de cérebro de

camundongo (C57BL/6/JUnib) foram obtidas da mesma maneira que as

mitocôndrias de cérebro de rato.

3.4- Medida do Consumo de Glicose e Produção de Lactato

Ambas as linhagens celulares foram plaqueadas em placas de 24 poços

com área de crescimento de 1,86 cm2 a uma densidade inicial de 7.500 células/cm2

sendo mantidas em cultura por 4 dias. No terceiro dia as células foram incubadas em

meio de cultura padrão sem vermelho de fenol na presença de oligomicina 1 µg/mL

(OLIGO) ou de seu solvente - DMSO 0,01% (Controle). Após 18 horas de incubação

uma alíquota de 200 µL do meio de cultura foi removida e armazenada para análise,

as células foram desprendidas para contagem em câmara de Neubauer.

As dosagens das concentrações de glicose e lactato foram realizadas

utilizando-se kits de bioquímica clínica comercializados pela Quibasa Química

Básica Ltda – Bioclin, conforme ilustrado na Figura 3, na qual a glicose reage com

as enzimas glicose oxidase (GOD) e peroxidase (POD) com formação de composto

colorido que absorve luz em comprimento de onda de 505 nm, enquanto que a

26

produção de lactato foi estimada através da reação do lactato com a enzima lactato

desidrogenase com geração de piruvato e NADH, sendo a produção de NADH

monitorada em comprimento de onda de 340 nm.

Os valores de consumo de glicose foram obtidos através da subtração da

concentração de glicose presente no DMEM, não incubado com as células, e da

concentração existente nas alíquotas de DMEM removidas após incubação nas

condições experimentais por 18 horas. Os valores da produção de lactato foram

obtidos através da subtração da concentração de lactato encontrada nas alíquotas

de DMEM removidas após a incubação por 18 horas nas condições experimentais e

daquela encontrada no DMEM (sem prévia incubação com células).

Figura 3. Princípio dos Métodos de Dosagem de Glicose e Lactato

3.5- Consumo Mitocondrial de Oxigênio

A determinação do consumo mitocondrial de oxigênio foi realizada em

oxígrafo de alta resolução OROBOROS (OROBOROS Oxygraph-2k, Innsbruck,

Austria), com câmara termostatizada a 37ºC, com volume de 2 mL e agitação

constante (750 rpm). Para garantir a confiabilidade dos dados obtidos o

equipamento era calibrado diariamente com o meio de reação a ser utilizado; a

concentração de oxigênio molecular (O2) inicial foi considerada 200 nmol/mL a 37 ºC

(42).

Para os experimentos com células intactas utilizou-se DMEM (sem SFB)

com HEPES-Na+ 20 mM como meio de reação, já para as amostras de tecido

tumoral humano utilizou-se como meio de reação DMEM (sem SFB e vermelho de

fenol) acrescido de albumina de soro bovino (BSA) 0,1% e do inibidor de

peroxidação lipídica hidroxitolueno butilado (BHT) 5 µM. Tanto para células

27

permeabilizadas com o tenso-ativo digitonina (30 µM) como para mitocôndrias

isoladas de cérebro de rato, utilizou-se meio de reação padrão para estudo da

função respiratória mitocondrial contendo sacarose 125 mM; HEPES-K+ 10 mM;

cloreto de magnésio (MgCl2) 1 mM; hidrogenofosfato de potássio (K2HPO4) 2 mM;

cloreto de potássio (KCl) 65 mM e EGTA 1 mM.

Para a determinação da p50 alguns ajustes na configuração do

equipamento foram necessários, como por exemplo, a alteração do tempo de

obtenção de dados de 2 segundos para 1 segundo, a determinação experimental da

constante de tempo (3.99 s para cuba A e 3.97 s para cuba B) e da correção do sinal

para o background de oxigênio (a= -1,4537; b= 0,0532 para cuba A e a= -1,7380; b=

0,0693 para cuba B).

3.6- Viabilidade Celular

As linhagens celulares de glioma humano foram incubadas na presença

do medicamento antineoplásico temozolomida, na presença e ausência do inibidor

da ATP sintase oligomicina. A viabilidade celular foi estimada através de contagem

por exclusão com azul de tripan 0,1% e pelo teste de MTT (Tetrazolium Microplate

Assay).

Ambas as linhagens foram cultivadas em placas de 24 poços com área de

crescimento de 1,86 cm2 a uma densidade inicial de 10.000 células/cm2 sendo

mantidas em cultura por 6 dias. O dia do plaqueamento foi considerado D-1 e após

tratamento (D0) com as drogas a cada 24 horas passou-se a contar D1, D2, D3, D4

e D5. Para evitar a depleção de substratos, uma troca de meio de cultura, com os

respectivos tratamentos, foi realizada em D3. A viabilidade celular por ambos os

métodos foi avaliada em três tempos de incubação distintos D1, D3 e D5. As

soluções estoques das drogas foram diluídas em DMSO no caso da oligomicina

(OLIGO) e no próprio meio de cultura no caso da TMZ. A solução de TMZ foi

preparada sempre no dia do tratamento e/ou troca de meio. Os grupos avaliados

foram: controle (DMSO 0,01%), OLIGO 1 µg/mL; TMZ 100 µM, TMZ 250 µM, OLIGO

+ TMZ 100 µM e OLIGO + TMZ 250 µM no caso da linhagem celular T98G e

controle (DMSO 0,01%), OLIGO 1 µg/mL, TMZ 50 µM, TMZ 100 µM, OLIGO + TMZ

50 µM e OLIGO + TMZ 100 µM para U-87MG.

28

A viabilidade por MTT foi verificada através da diferença de densidade

óptica da solução (formazan), utilizando-se leitor de microplacas Biotek, nos

comprimentos de onda de 570 nm e 650 nm. Esta técnica colorimétrica baseia-se na

redução do sal MTT a cristais de formazan pelas células viáveis (43). Para

solubilização dos cristais de formazan foi utilizada solução de SDS (sodium dodecyl

sulfate) ácido. Após retirada do meio de cultura, as células foram incubadas com

250 µL de solução de MTT (1 mg/mL), diluído em DMEM sem fenol, por 1 hora e 30

minutos, depois desse período foi adicionado 500 µL de SDS ácido e para a

dissolução completa dos cristais de formazan foi aguardado um período de 24 horas.

Concomitantemente ao teste de MTT, também foi realizada a contagem das células

em câmara de Neubauer com azul de tripan 0,1%.

3.7- Determinação do Coeficiente de Controle de Fluxo

Os coeficientes de controle de fluxo (FCC’s) da ATP sintase, do

translocador de nucleotídeos de adenina (ANT) e do transportador de fosfato (PiC),

foram determinados através do método gráfico (44,45), considerando a regressão

linear do slope inicial da curva e a inibição máxima obtida nas curvas de titulação de

cada inibidor. As diferentes concentrações dos inibidores da ATP sintase

(oligomicina), ANT (carboxiatractilosídeo) e PiC (mersalil) foram testadas em adições

e traçados únicos com o intuito de evitar qualquer viés pelo tempo de exposição das

células às diferentes concentrações dos inibidores. As curvas de titulação de cada

inibidor foram plotadas como a porcentagem de inibição da respiração após a adição

da droga em relação ao consumo de oxigênio basal (situação não inibida).

29

3.8- Determinação da Atividade da Citrato Sintase

A atividade da citrato sintase foi determinada a 37°C por

espectrofotometria baseada na liberação do íon mercaptídeo que absorve luz a 412

nm, a partir da reação de acetil-CoA e 5,5’-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB),

conforme reação descrita na Figura 4 (46). O pellet das células foi ressuspendido

em Tris-HCl 50 mM e tanto as amostras das linhagens quanto das mitocôndrias de

cérebro de camundongo foram diluídas em tampão de homozeinização contendo

Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM; triton 100X 0,1% a fim de se obter uma concentração

de proteína de 0,5 mg/mL. O reagente de trabalho era composto de Tris-HCl 10 mM;

acetil-CoA 50 µM; oxaloacetato 250 µM e DTNB 100 µM (47). Os cálculos foram

realizados considerando o coeficiente de extinção milimolar do TNB 13,6 mM-1 × cm-

1, a concentração final de proteína na reação (12,5 µg/mL), a correção do caminho

ótico (0,617) e a velocidade máxima da reação.

Figura 4. Princípio da reação da determinação da atividade da citrato sintase

3.9- Determinação da Atividade da Transidrogenase de Nucleotídeos de

Nicotinamida

A atividade da transidrogenase de nucleotídeos de nicotinamida foi

determinada também por espectrofotometria baseada na redução do APAD (3-

acetylpyridine adenine dinucleotide), análogo de NAD+, em tampão contendo Tris-

HCl 50 mM e Brij 0,1% (pH=8,0 a 37°C) com adição de rotenona 2 µM, APAD 300

µg/mL, lisolecitina 300 µg/mL e NADPH 300 µM. As medidas foram realizadas em

cubetas de acrílico de 1 mL, em espectrofotômetro (UV- 01800 SHIMADZU) nas

absorbâncias de 375 nm e 425 nm. Os cálculos foram realizados considerando a

diferença das absorbâncias nos comprimentos de onda utilizados (375 – 425 nm) e o

coeficiente de extinção milimolar do APAD 5,1 mM-1 × cm-1 (38,48,49).

30

3.10- Análise Estatística

As análises estatísticas foram realizadas no programa GraphPad Prism 5

utilizando-se o teste One-Way ANOVA, seguido do post hoc de Bonferroni,

considerando-se valores significativos de P˂0,05.

31

4- RESULTADOS

4.1- Capítulo I

Evaluation of Mitochondrial Respiratory Function in Highly Glycolytic Glioma Cells

Reveals Low ADP Phosphorylation in Relation to Oxidative Capacity*

Erika Rodrigues-Silva1, Edilene S. Siqueira-Santos1, Juliana S. Ruas1, Raffaela S.

Ignarro2, Tiago R. Figueira1, Fábio Rogério2 and Roger F. Castilho1.

(Manuscrito aceito para publicação no Journal of Neuro-oncology)

*A análise histológica dos GBMs humanos foi realizada pelo co-autor Dr. Fabio Rogerio.

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

4.2- Capítulo II

Resultados Complementares

43

4.2.1- Protocolo de permeabilização da membrana plasmática de células T98G

e U-87MG com digitonina

Para o estudo da função mitocondrial com adição de ADP faz-se

necessário a permeabilização da membrana plasmática com digitonina. Com o

objetivo de encontrar a concentração que resultasse na melhor permeabilização da

membrana celular, sem o comprometimento da função mitocondrial titulamos

diferentes concentrações de digitonina (5 a 120 µM). A permeabilização celular foi

avaliada pelo estímulo da respiração de células T98G e U-87MG incubadas na

presença de ADP e substratos mitocondriais exógenos.

A permeabilização da membrana plasmática com a adição de digitonina

permite o acesso do ADP às mitocôndrias resultando em estímulo da respiração

mitocondrial conforme apresentado na Figura 5. A partir da análise dos resultados

obtidos, estabeleceu-se que a concentração de 30 µM se encontra dentro de uma

faixa segura na qual a quantidade de digitonina é suficiente para permeabilizar as

células, obtendo-se máximo estímulo da respiração com ADP. Em virtude disso,

essa concentração foi adotada nos experimentos envolvendo células

permeabilizadas. Concentrações altas de digitonina (>50 µM) inibiram parcialmente

a respiração mitocondrial, provavelmente por permeabilizarem a membrana

mitocondrial externa (73) e promoverem a perda de citocromo c, um componente da

cadeia respiratória.

Este protocolo de permeabilização da membrana plasmática com digitonina

foi essencial para a realização de experimentos que permitissem acesso direto não

só de ADP, mas também de substratos exógenos às mitocôndrias.

44

Figura 5. Efeito da permeabilização da membrana plasmática com digitonina

no consumo mitocondrial de oxigênio em células T98G e U-87MG. Ambas as

células foram ressuspendidas em DMEM 2 g/L de glicose, não suplementado com

soro fetal bovino, mas contendo HEPES-K+ 20 mM e mantidas a 22°C. Um volume

de 125 µL da suspensão de células (4×106 células/mL) foi adicionado ao meio

reacional (volume final: 1,4 mL) contendo sacarose 125 mM, MgCl2 1 mM, KCl 65

mM, K2HPO4 2 mM, HEPES-K+ (pH 7,2) 10 mM, EGTA 1 mM e 5 mM de cada um

dos substratos respiratórios malato, glutamato, -cetoglutarato e piruvato. Digitonina

também esteve presente no meio reacional nas concentrações indicadas.

45

4.2.2- Determinação da constante de Michaelis-Mental para o ADP em células

T98G e U-87MG permeabilizadas

Para verificarmos se a concentração de ADP utilizada nos experimentos

(ver Capítulo I) seria realmente capaz de estimular a OXPHOS em sua capacidade

máxima, determinamos a constante de Michaelis-Mentel (Km) para o ADP em células

T98G e U-87MG e em mitocôndrias isoladas de cérebro de rato. Como mostrado na

Figura 6, os valores encontrados de Km para o ADP foram de 9,1 µM e 15,8 µM para

T98G e U-87MG, respectivamente. Mitocôndrias isoladas de cérebro de rato

apresentaram Km para o ADP de 21,9 µM.

Estes valores de Km indicam que mitocôndrias de células T98G e U-87MG

apresentam alta afinidade pelo ADP, assim a adição de ADP exógeno pode ser

utilizada para estudo da OXPHOS em células permeabilizadas. Portanto estes

valores de Km validam resultados apresentados no Capítulo I, já que a

concentração de ADP (500 µM) utilizada para avaliar a capacidade máxima da

OXPHOS foi superior em mais de 30 vezes ao Km (74).

46

Figura 6. Determinação da constante de Michaelis e Mentel do ADP em células

de glioma humano permeabilizadas. Ao meio reacional (pH 7,2) contendo

sacarose 125 mM, MgCl2 1 mM, KCl 65 mM, K2HPO4 2 mM, HEPES-K+ 10 mM

foram adicionados: T98G (2×106 células/mL) ou U-87MG (4×106 células/mL), EGTA

1 mM e 5 mM de cada um dos substratos respiratórios malato, glutamato, α-

cetoglutarato e piruvato. ADP foi adicionado após 6 minutos ao meio de reacional

para se obter as concentrações finais de 25, 50, 100, 200, 500 e 1000 µM.

Cell / Mito Km (µM)

T98G 9.1 4.2

U-87MG 15.8 3.4

Brain Mitochondria 21.5 3.2

47

4.2.3- Avaliação do efeito do inibidor do poro de transição de permeabilidade

mitocondrial ciclosporina A no consumo de oxigênio de células intactas

O poro de transição de permeabilidade mitocondrial já fora associado

como fator contribuinte ao efeito Warburg em células de osteossarcoma (30). Assim,

avaliamos se a transição de permeabilidade mitocondrial estaria contribuindo

diretamente para a ocorrência do efeito Warburg nas células de glioma humano.

A presença de ciclosporina A (CsA), um potente inibidor do poro de

transição de permeabilidade (75), não teve efeito significativo no consumo

mitocondrial de oxigênio (Figura 7), sugerindo que a disfunção mitocondrial pela

abertura do poro de transição de permeabilidade não é um fator determinante para a

observação do efeito Warburg em células T98G e U-87MG. Em caso de ocorrência

de transição de permeabilidade esperaríamos observar um estímulo da respiração

nos estados basal e na presença de oligomicina, devido a uma permeabilização

inespecífica da membrana mitocondrial interna a íons H+.

As adições de CsA foram realizadas de forma pontual e por um curto

período de tempo, pois durante algumas tentativas de verificar o efeito da inibição da

transição de permeabilidade mitocondrial na proliferação e viabilidade celular,

verificou-se que a CsA exercia efeito tóxico às células em cultura, principalmente às

células U-87MG que apresentaram a formação de vesículas intracelulares. Esta

observação está de acordo com trabalhos já publicados que associam essa

toxicidade a mecanismos de morte celular não-apoptóticos (76,77).

48

Figura 7. Efeito do inibidor do poro de transição mitocondrial ciclosporina A no

consumo mitocondrial de oxigênio. Ao meio DMEM contendo HEPES-Na+ 20 mM

foram adicionados: T98G (2×106 células/mL) ou U-87MG (4×106células/mL). Adições

independentes de oligomicina 1 µg/mL e FCCP 400 nM foram realizadas após 10

minutos do início do traçado. Os experimentos foram conduzidos na presença e

ausência (controle) de ciclosporina (CsA) 1 µM. As barras representam a média ±

SEM.

49

4.2.4- Consumo de oxigênio por células T98G e U-87MG intactas na presença

dos substratos glicose, piruvato e/ou glutamina

Considerando os três possíveis substratos respiratórios (glicose, piruvato

e glutamina) presentes no meio de cultivo celular (DMEM) utilizado, verificamos o

consumo de oxigênio basal e o estimulado por FCCP de células T98G e U-87MG, na

presença e ausência de cada um dos substratos e com todos presentes

simultaneamente (Figura 8).

A presença exclusiva da glicose como substrato acarretou em diminuição

nos valores basais de consumo de oxigênio, quando comparados com aqueles

obtidos em DMEM contendo glicose, piruvato e glutamina. Somente glicose não foi

capaz de suportar a respiração estimulada por FCCP. Já o piruvato foi capaz de

manter níveis basais de consumo de oxigênio semelhantes àqueles com todos os

substratos, mas ainda não foi capaz de suportar uma respiração estimulada. A

presença de glutamina, por sua vez, levou a um aumento do consumo de oxigênio

basal superior aos obtidos com todos os substratos, enquanto que a respiração

estimulada por FCCP foi semelhante (T98G) ou um pouco superior (U-87MG) àquela

obtida na presença de todos os substratos.

Os valores de consumo de oxigênio basal na presença de todos os

substratos foram menores que os obtidos com glutamina, provavelmente porque a

presença de glicose estimula a via glicolítica e dessa forma produz-se grandes

quantidades de ATP o que leva a uma diminuição no consumo de oxigênio

mitocondrial no estado basal. A eficiência da glutamina em estimular o consumo

mitocondrial de oxigênio se deve ao fato da mesma ser convertida à glutamato que

pode ser convertido à alfa-cetoglutarato, abastecendo assim o ciclo do ácido cítrico.

50

51

Figura 8. Consumo de oxigênio em células intactas incubadas em meio de

cultivo contendo diferentes substratos: Glicose, piruvato e/ou glutamina.

Painéis A-D: Traçados representativos do consumo de oxigênio da linhagem T98G.

As células foram incubadas (1.5×106/mL) em DMEM com HEPES-Na+ 20 mM na

presença ou ausência dos substratos metabólicos glicose (2 g/L), piruvato (1.25 mM)

e/ou glutamina (4 mM). Como indicado, o consumo de oxigênio foi determinado em

células incubadas em DMEM contendo somente glicose (Painel A), piruvato (Painel

B) ou glutamina (Panel C), enquanto os traçados do Painel D mostram os

resultados de células incubadas na ausência (No Substr.) ou presença (All Substr.)

de todos os substratos. Adições sequenciais de FCCP (100 nM cada) foram

realizadas conforme indicado pelas setas. Painéis E e F: Valores do consumo de

oxigênio basal e o estimulado por FCCP em linhagens de glioma humano na

presença de diferentes substratos do cultivo celular.

52

4.2.4- Estimativa da contribuição da glicólise e da OXPHOS na regeneração de

ATP baseada em dados da liberação de lactato e da TCO

Os dados de consumo de glicose e de liberação de lactato apresentados

no Capítulo I (em mg/dL) foram normalizados para serem apresentados na mesma

unidade utilizada para as TCO’s (pmol/s/106cells). A partir dos dados de liberação de

lactato e da TCO foi possível estimar o ATP regenerado pela glicólise e OXPHOS.

Obtivemos os dados apresentados na Figura 9- Painéis B e C, considerando que

através da glicólise seriam regeneradas duas moléculas de ATP (um ATP por lactato

liberado) e que através da OXPHOS seriam regeneradas 5 moléculas de ATP por

oxigênio molecular consumido (fração da TCO sensível a oligomicina), baseado na

razão ADP/O de 2,5 para ambas as linhagens celulares.

Para normalização dos dados mencionados acima foi necessário à

determinação do tempo que cada linhagem leva para duplicar sua população

(doubling time). A linhagem T98G apresentou tempo de duplicação de 21 horas e a

U-87MG de 24 horas. Através do cálculo da área sob a curva de crescimento,

dividido pelo tempo de incubação obteve-se a média do número de células presente

nas 18 horas finais do experimento (tempo de incubação), valor este utilizado para

normalizar o consumo de glicose e a liberação de lactato.

53

Figura 9. Estimativa da contribuição da glicólise e da OXPHOS na regeneração

de ATP baseado em dados da liberação de lactato e da TCO. Painel A: Dados de

consumo de glicose e liberação de lactato normalizados pela média do número de

células presentes no período de incubação (18 horas) utilizado. Painel B: Estimativa

da regeneração de ATP, baseada na taxa de liberação de lactato (LRR). Painel C:

Dados comparativos das estimativas de regeneração de ATP através da glicólise

(baseado na quantidade de ATP por lactato formado) ou da OXPHOS (baseado na

quantidade de ATP por oxigênio consumido- TCO sensível a oligomicina).

54

4.2.6- Atividade de transidrogenase de nucleotídeos de nicotinamida e citrato

sintase em células T98G e U-87MG

Em relação à atividade da transidrogenase de nucleotídeos de

nicotinamida (NNT), as células T98G apresentaram atividade superior em duas

vezes àquela obtida em mitocôndrias de cérebro de camundongos, enquanto que

células U-87MG apresentaram valores quase quatro vezes menores (T98G: 33,0 ±

7,5 mU/mg; U-87MG: 3,7 ± 1,2 mU/mg; mitocôndrias de cérebro de camundongo:

14,3 ± 1,3 mU/mg) (Figura 10- Painel A). Os valores obtidos para atividade de

citrato sintase (CS) em ambas as linhagens de células de glioma humano foram

cerca de quatro vezes menores àquelas encontrados para mitocôndrias isoladas de

cérebro de camundongo (Figura 10- Painel B). Uma reduzida atividade da citrato

sintase em glioma está de acordo com o encontrado em outros trabalhos (78).

Ao normalizarmos a atividade de NTT pela atividade de citrato sintase

(Figura 10- Painel C), enzima comumente utilizada para normalização funcional da

massa mitocondrial (79), obtivemos que células U-87MG e mitocôndrias isoladas de

cérebro de camundongo apresentaram valores semelhantes, enquanto que células

T98G apresentaram valores quase dez vezes superiores (T98G: 0,53 ± 0,13; U-

87MG: 0,06 ± 0,02; mitocôndrias de cérebro de camundongo: 0,06 ± 0,01).

55

Figura 10. Atividade de transidrogenase de nucleotídeos de nicotinamida (NNT)

e de citrato sintase (CS) em células de glioma humano. Ambas as células foram

ressuspendidas em tampão Tris-HCl 50 mM pH 8,0. As barras representam a média

± SEM. Painel A: Para as células utilizou-se 100 µg/mL de proteína e para

mitocôndrias isoladas de cérebro de camundongo 200 µg/mL. As amostras foram

pré-incubadas por cerca de 5 minutos e a reação iniciada com a adição de NADPH

300 µM. Painel B: Para a reação foi utilizada uma concentração final de proteína de

12,5 µg/mL, sendo a mesma monitorada por 20 minutos em espectrofotômetro.

Painel C: Valores da normalização da atividade da NNT por CS (razão NNT/CS). As

determinações de atividade de NNT e CS em mitocôndrias de cérebro de

camundongo foram realizadas pela doutoranda Annelise Francisco.

56

4.2.7- Avaliação do efeito da inibição da OXPHOS na citotoxicidade promovida

pela TMZ em células T98G e U-87MG

As linhagens celulares T98G e U-87MG foram incubadas na presença do

medicamento antineoplásico temozolomida (TMZ), na presença e ausência do

inibidor da ATP sintase oligomicina, com o intuito de verificar se a inibição da

OXPHOS poderia alterar a sensibilidade destas linhagens celulares à TMZ (Figuras

11 e 12).

Uma variação significativa na determinação da viabilidade celular foi

encontrada de acordo com o método utilizado: MTT ou exclusão de azul de tripan.

Como a contagem de células com azul de tripan (0,1%) se baseia na capacidade da

membrana plasmática de impedir a penetração do corante quanto íntegra, a menor

viabilidade celular verificada neste método pode estar relacionada com uma maior

sensibilidade e menor especificidade desta técnica, já que alterações da

permeabilidade seletiva da membrana plasmática acarretariam numa marcação com

o corante, mesmo que a morte celular ainda não tenha ocorrido (80). Portanto as

diferenças na viabilidade celular encontradas de acordo com o método estão

relacionadas a fatores intrínsecos de cada método que envolvem princípio,

sensibilidade e especificidade. De forma geral a linhagem celular T98G é tida como

mais resistente ao tratamento com TMZ (81–83), em virtude disso concentrações

maiores deste composto foram utilizadas para esta linhagem celular.

A linhagem celular T98G, como já era esperado, se mostrou resistente à

incubação com TMZ mesmo em concentrações mais altas (250 µM), no entanto foi

verificado um pequeno efeito sinérgico na associação das drogas oligomicina e TMZ,

estaticamente significativo somente considerando-se os dados de contagem (Figura

11- Painel B).

Já a linhagem celular U-87MG foi bastante sensível à TMZ, contudo a

presença de oligomicina não resultou em efeitos sinérgicos à resposta a TMZ na

redução de viabilidade celular (Figura 12). De forma geral estes resultados indicam

que a inibição da OXPHOS aparentemente só é capaz de potencializar a toxicidade

de TMZ em células resistentes a esse medicamento (T98G).

57

Figure 11. Efeito da inibição da OXPHOS na citotoxicidade promovida pela

temozolomida (TMZ) em células T98G em cultura. As células foram plaqueadas a

densidade inicial de 10.000 céls/cm2 em placas de 24 poços, na presença de DMSO

(0,01%), oligomicina (Oligo) 1 µg/mL, TMZ 100 µM, TMZ 250 µM, Oligo + TMZ 100

µM e Oligo + TMZ 250 µM, sendo a viabilidade celular avaliada em três tempos

distintos D1, D3 e D5. Painel A: Densidade óptica do produto da reação de MTT

(formazan). Painel B: Contagem das células viáveis com azul de tripan 0,1%.

58

Figure 12. Efeito da inibição da OXPHOS na citotoxicidade promovida pela

temozolomida (TMZ) em células U-87MG em cultura. As células foram

plaqueadas a densidade inicial de 10.000 céls/cm2 em placas de 24 poços, na

presença de DMSO (0,01%), oligomicina (OLIGO) 1 µg/mL, TMZ 50 µM, TMZ 100

µM, OLIGO + TMZ 50 µM e OLIGO + TMZ 100 µM, sendo a viabilidade celular

avaliada em três tempos distintos D1, D3 e D5. Painel A: Densidade óptica do

produto da reação de MTT (formazan). Painel B: Contagem das células viáveis com

azul de tripan 0,1%.

59

5- DISCUSSÃO GERAL

Os resultados apresentados nesta Dissertação demonstram que mesmo

mediante metabolismo predominantemente glicolítico (efeito Warburg), característica

marcante dos gliomas (Fig. 1 do Capítulo I), diversos parâmetros bioenergéticos de

mitocôndrias de linhagens celulares de glioma humano (T98G e U-87MG) e de

amostras de GBM de pacientes não estão alterados. Em ambas as linhagens

celulares utilizadas foi verificado um elevado acoplamento entre a taxa do consumo

de oxigênio (TCO) e a fosforilação do ADP. Estas células também apresentaram alta

afinidade pelo oxigênio (p50) (Fig. 1 e Fig. 2 do Capítulo I). Estes resultados indicam

a existência de mitocôndrias capazes de responder a estímulos e consumir oxigênio

não só nas células T98G e U-87MG, mas também em amostras de GBM humano

(Fig. 5 do Capítulo I).

Resultados da TCO obtidos na presença e ausência de ciclosporina A (CsA)

(Figura 7 do Capítulo II) descartaram a ocorrência de disfunção mitocondrial por

transição de permeabilidade em células T98G e U-87MG. Esta observação indica

que a abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial não é um fator

crucial na preferência pela glicólise como via principal na regeneração de ATP em

detrimento da fosforilação oxidativa (OXPHOS), como tinha sido proposto em

trabalho anterior com células de osteossarcomas (30). Além do mais, a

disponibilidade e utilização de substratos (Fig. 1 do Capítulo I e Figura 8 do

Capítulo II) também se encontraram preservadas em células de glioma, sendo que a

glutamina se mostrou o substrato mais eficiente para suportar a respiração

mitocondrial estimulada pelo protonóforo FCCP.

Embora vários dos parâmetros bioenergéticos avaliados em células U-87MG

e T98G não tenham apresentado prejuízos significativos, experimentos evidenciaram

uma importante restrição da capacidade máxima da OXPHOS em relação ao ETS

nestas células (Fig. 2c do Capítulo I). Enquanto a razão OXPHOS/ETS em células

de glioma se mostrou ao redor de 0,5, o mesmo índice esteve próximo a 0,85 em

mitocôndrias isoladas de cérebro de ratos adultos. Analises de coeficiente de

controle de fluxo (Fig. 3 do Capítulo I) revelaram que a ATP sintase e o translocador

de nucleotídeos de adenina (ANT) exercem maior controle sobre a OXPHOS nas

células de glioma, sugerindo que a restrição da OXPHOS está relacionada a uma

60

menor capacidade de reserva destes componentes mitocondriais, mas não a do

transportador de fosfato (PiC).

A limitação relativa da OXPHOS se manteve mesmo quando as células foram

cultivadas em ambiente com concentração de glicose quatro vezes menor que o

padrão, i.e. 50 mg/dL versus 200 mg/dL (Fig. 4 do Capítulo I). Na presença da

concentração mais baixa de glicose não observamos alteração importante do

consumo deste substrato, indicando uma alta capacidade dessas células em captar

e consumir glicose. Isso suporta a proposta da existência de uma via glicolítica

“supereficiente”, capaz de suprir as demandas energéticas de tecidos em rápida

proliferação (9,10,26,31), como é o caso dos glioblastoma multiformes.

A existência de mitocôndrias funcionais relatada no presente trabalho em

células de glioma e em outros estudos em diferentes tipos de tumores (24,56–

58,84), contraria a hipótese inicial de Otto Warburg sobre a ocorrência do fenômeno

por ele observado ter ligação direta com danos no processo de respiração celular.

No entanto outras alterações mitocondriais podem ter um papel importante no perfil

glicolítico apresentado por células tumorais. Estudos mais recentes como o de

Gaude e Fezza (2016) (72), apontam que a diminuição da expressão de genes

associados à OXPHOS tem relação com desenvolvimento e agressividade de

diferentes tipos de tumores, inclusive de GBMs. Portanto, a limitação encontrada na

OXPHOS pode ser uma das diversas adaptações metabólicas que fazem parte da

fisiopatologia dos glioblastomas multiformes.

A utilização de oligomicina, um inibidor da OXPHOS, teve efeito interessante

na citotoxicidade promovida pelo quimioterápico temozolomida (TMZ) (Figuras 11 e

12 do Capítulo II). Na linhagem tida como resistente a esse medicamento (T98G)

(81,83) houve um efeito citotóxico sinérgico quando foram associadas as drogas

oligomicina e TMZ, já na linhagem U-87MG tida como sensível à TMZ esse efeito

sinérgico não foi observado. A linhagem T98G se mostrou menos glicolítica que a

linhagem U-87MG (Figura 9 do Capítulo II) e apresentou valores normalizados da

atividade da transidrogenase de nucleotídeos de nicotinamida (NNT) mais altos

(Figura 10- Painel C do Capítulo II), sugerindo uma dependência maior da

mitocôndria nessa linhagem, principalmente em relação ao potencial de membrana

mitocondrial. Essa maior dependência da mitocôndria, na linhagem celular T98G

pode explicar o efeito sinérgico encontrado na citotoxicidade com a associação de

61

um inibidor da OXPHOS e do alquilante de DNA TMZ na viabilidade celular. A

oligomicina inibe todas as funções da ATP sintase inclusive a de hidrólise de ATP

que também é capaz de gerar potencial de membrana mitocondrial, processo que é

bastante eficiente nas células de glioma humano [Dados não mostrados e (85)].

Em suma, os resultados apresentados nesta Dissertação fornecem dados

importantes sobre a função respiratória mitocondrial de linhagens de células de

glioma (T98G e U-87MG), bem como de material de GBM humano, demonstrando

que o metabolismo de substratos e o ETS encontram-se preservados, embora exista

uma limitação relativa da capacidade da OXPHOS, relacionado à baixa reserva de

atividade da ATP sintase e do ANT.

62

6- CONCLUSÕES

Os resultados obtidos nos permitem concluir que:

• Ambas as linhagens celulares T98G e U-87MG apresentam acentuado efeito

Warburg nas condições de cultivo celular utilizadas.

• A membrana mitocondrial se encontra integra e o poro de transição de

permeabilidade mitocondrial parece não contribuir diretamente para a ocorrência

do efeito Warburg nessas células.

• Não existem deficiências quanto ao aproveitamento da força eletromotriz no

direcionamento da ressíntese de ATP pela ATP sintase.

• Ambas as linhagens celulares de glioma apresentam grande afinidade pelo

oxigênio (p50).

• Existe uma limitação relativa da capacidade máxima da fosforilação oxidativa

(OXPHOS).

• A restrição da OXPHOS está relacionada a uma baixa capacidade de reserva da

ATP sintase e ANT, mas não do PiC.

• A célula T98G possui maior atividade de NNT, sugerindo maior dependência do

potencial de membrana mitocondrial nessa linhagem celular.

• O inibidor da OXPHOS oligomicina potencializou o efeito citotóxico do

quimioterápico temozolomida em células T98G.

63

7- REFERÊNCIAS

1. Machado AMB. Neuroanatomia Funcional. 2a ed. Atheneu, editor. São Paulo;

2006.

2. Perea G, Sur M, Araque A. Neuron-glia networks: integral gear of brain function. Front Cell Neurosci. 2014 Nov 6;8:378.

3. Louis DN, Ohgaki H, Wiestler OD, Cavenee WK, Burger PC, Jouvet A, et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Vol. 114, Acta Neuropathologica. 2007. p. 97–109.

4. Kleihues P, Ohgaki H. Primary and secondary glioblastomas: From concept to clinicaldiagnosis. Neuro Oncol. 1999 Jan 1;1(1):44–51.

5. Aldape K, Zadeh G, Mansouri S, Reifenberger G, von Deimling A. Glioblastoma: pathology, molecular mechanisms and markers. Acta Neuropathol. 2015 Jun 6;129(6):829–48.

6. Beckner ME, Gobbel GT, Abounader R, Burovic F, Agostino NR, Laterra J, et al. Glycolytic glioma cells with active glycogen synthase are sensitive to PTEN and inhibitors of PI3K and gluconeogenesis. Lab Invest. 2005;85(12):1457–70.

7. Parsons DW, Jones S, Zhang X, Lin JC, Leary RJ, Angenendt P, et al. An Integrated Genomic Analysis of Human Glioblastoma Multiforme. Sience. 2008;321(5897):1807–12.

8. Sathornsumetee S, Rich JN. Designer therapies for glioblastoma multiforme. Ann N Y Acad Sci. 2008 Oct;1142:108–32.

9. Wolf A, Agnihotri S, Micallef J, Mukherjee J, Sabha N, Cairns R, et al. Hexokinase 2 is a key mediator of aerobic glycolysis and promotes tumor growth in human glioblastoma multiforme. J Exp Med. 2011;208(2):313–26.

10. Yang W, Zheng Y, Xia Y, Ji H, Chen X, Guo F, et al. ERK1/2-dependent phosphorylation and nuclear translocation of PKM2 promotes the Warburg effect. Nat Cell Biol. 2012;14(12):1295–304.

11. Valvona CJ, Fillmore HL, Nunn PB, Pilkington GJ. The Regulation and Function of Lactate Dehydrogenase A: Therapeutic Potential in Brain Tumor. Brain Pathol. 2016 Jan;26(1):3–17.

12. Hart MG, Garside R, Rogers G, Stein K, Grant R. Temozolomide for high grade glioma. Hart MG, editor. Cochrane Database Syst Rev. 2013 Apr 30;4(4):Cd007415.

13. Wang T, Pickard AJ, Gallo JM. Histone methylation by temozolomide; A classic DNA methylating anticancer drug. Anticancer Res. 2016 Jul;36(7):3289–99.

14. Ramão A, Gimenez M, Laure HJ, Izumi C, Vida RCS, Oba-Shinjo S, et al. Changes in the expression of proteins associated with aerobic glycolysis and cell migration are involved in tumorigenic ability of two glioma cell lines. Proteome Sci. 2012;10(1):53.

15. San Martín A, Ceballo S, Ruminot I, Lerchundi R, Frommer WB, Barros LF. A Genetically Encoded FRET Lactate Sensor and Its Use To Detect the Warburg

64

Effect in Single Cancer Cells. Jekabsons M, editor. PLoS One. 2013 Feb 26;8(2):e57712.

16. Pratt CW CK. Bioquímica essencial. São Paulo: Guanabara Koogan; 2006.

17. Marzzoco A TB. Bioquímica básica. 2a. Ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan;

18. Koolman J and Rohn KH. Bioquímica: texto e atlas. 3a. Ed. Porto Alegre: Artmed; 2005.

19. Nelson DL CM. Lehninger Princípios de Bioquímica. 3a. Ed. São Paulo: Sarvier; 2002.

20. Warburg O, Posener K, Nagelein E. Uber den stoffwechsel der carcinomzelle. KlinWochenschr. 1925;4:534–6.

21. Otto Warburg B, Wind F, Negelein N. THE METABOLISM OF TUMORS IN THE BODY. The Journal of General Physiology. Biochem Z Biochem Z Biochem Z. Biol Chem. 1923;309(2):397–519.

22. Cori CF, Cori GT. The carbohydrate metabolism of tumours. I. The free sugar, lactic acid, and glycogen content of malignant tumours. J Biol Chem. 1925;64(1):11–22.

23. WARBURG O. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 1956 Aug 10;124(3215):269–70.

24. Koppenol WH, Bounds PL, Dang C V. Otto Warburg’s contributions to current concepts of cancer metabolism. Nat Rev Cancer. 2011;11(5):325–37.

25. DeBerardinis RJ, Mancuso A, Daikhin E, Nissim I, Yudkoff M, Wehrli S, et al. Beyond aerobic glycolysis: transformed cells can engage in glutamine metabolism that exceeds the requirement for protein and nucleotide synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(49):19345–50.

26. Vander Heiden M, Cantley L, Thompson C. Understanding the Warburg effect: The metabolic requiremetns of cell proliferation. Science (80- ). 2009;324(5930):1029–33.

27. Dai Z, Shestov AA, Lai L, Locasale JW. A Flux Balance of Glucose Metabolism Clarifies the Requirements of the Warburg Effect. Biophys J. 2016;111(5):1088–100.

28. Liberti M V., Locasale JW. The Warburg Effect: How Does it Benefit Cancer Cells? Vol. 41, Trends in Biochemical Sciences. 2016. p. 211–8.

29. Birsoy K, Possemato R, Lorbeer FK, Bayraktar EC, Thiru P, Yucel B, et al. Metabolic determinants of cancer cell sensitivity to glucose limitation and biguanides. Nature. 2014;508(7494):108–12.

30. Giang AH, Raymond T, Brookes P, De Mesy Bentley K, Schwarz E, O’Keefe R, et al. Mitochondrial dysfunction and permeability transition in osteosarcoma cells showing the warburg effect. J Biol Chem. 2013;288(46):33303–11.

31. Bayley J-P, Devilee P. The Warburg effect in 2012. Curr Opin Oncol. 2012;24(1):62–7.

65

32. Gnaiger E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high- resolution\rrespirometry to assess mitochondrial function. Vol. 327, Mitochondrial dysfunction in drug-induced toxicity. 2008. p. 327–52.

33. Diepart C, Verrax J, Calderon PB, Feron O, Jordan BF, Gallez B. Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro. Anal Biochem. 2010 Jan;396(2):250–6.

34. Brand MD, Nicholls DG. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 2011;435(2):297–312.

35. Pesta D, Gnaiger E. High-Resolution Respirometry: OXPHOS Protocols for Human Cells and Permeabilized Fibers from Small Biopsies of Human Muscle. In: Methods in molecular biology (Clifton, NJ). 2012. p. 25–58.

36. Ruas JS, Siqueira-Santos ES, Amigo I, Rodrigues-Silva E, Kowaltowski AJ, Castilho RF. Underestimation of the Maximal Capacity of the Mitochondrial Electron Transport System in Oligomycin-Treated Cells. Pizzo S V, editor. PLoS One. 2016 Mar 7;11(3):e0150967.

37. Scandurra FM, Gnaiger E. Cell Respiration Under Hypoxia: Facts and Artefacts in Mitochondrial Oxygen Kinetics [Internet]. Vol. 662, Advances in Experimental Medicine and Biology. 2010. p. 7–25. Available from: http://link.springer.com/10.1007/978-1-4419-1241-1_2

38. Ronchi JA, Figueira TR, Ravagnani FG, Oliveira HCF, Vercesi AE, Castilho RF. A spontaneous mutation in the nicotinamide nucleotide transhydrogenase gene of C57BL/6J mice results in mitochondrial redox abnormalities. Free Radic Biol Med. 2013 Oct;63:446–56.

39. Melo DR, Kowaltowski AJ, Wajner M, Castilho RF. Mitochondrial energy metabolism in neurodegeneration associated with methylmalonic acidemia. J Bioenerg Biomembr. 2011 Feb 27;43(1):39–46.

40. Rosenthal RE, Hamud F, Fiskum G, Varghese PJ, Sharpe S. Cerebral ischemia and reperfusion: prevention of brain mitochondrial injury by lidoflazine. J Cereb Blood Flow Metab. 1987;7(6):752–8.

41. Michelini LGB, Figueira TR, Siqueira-Santos ES, Castilho RF. Rotenone exerts similar stimulatory effects on H2O2 production by isolated brain mitochondria from young–adult and old rats. Neurosci Lett. 2015 Mar;589:25–30.

42. Robinson J, Cooper J. Method of determining oxygen concentrations in biological media, suitable for calibration of the oxygen electrode. Anal Biochem. 1970;33:390–9.

43. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983 Dec;65(1–2):55–63.

44. Gellerich FN, Kunz WS, Bohnensack R. Estimation of flux control coefficients from inhibitor titrations by non-linear regression. FEBS Lett. 1990;274(1– 2):167–70.

45. Small JR. Flux control coefficients determined by inhibitor titration: the design and analysis of experiments to minimize errors. Biochem J. 1993;296(2):423–

66

33.

46. Shepherd D, Garland PB. The Kinetic Properties of Citrate Synthase from Rat Liver Mitochondria. Biochem J. 1969;114.

47. Figueira TR, Castilho RF, Saito Â, Oliveira HCF, Vercesi AE. The higher susceptibility of congenital analbuminemic rats to Ca 2+-induced mitochondrial permeability transition is associated with the increased expression of cyclophilin D and nitrosothiol depletion. Mol Genet Metab. 2011 Dec;104(4):521–8.

48. Yamaguchi M, Hatefi Y. Mitochondrial energy-linked nicotinamide nucleotide transhydrogenase. Membrane topography of the bovine enzyme. J Biol Chem. 1991 Mar 25;266(9):5728–35.

49. Sheeran FL, Rydström J, Shakhparonov MI, Pestov NB, Pepe S. Diminished NADPH transhydrogenase activity and mitochondrial redox regulation in human failing myocardium. Biochim Biophys Acta - Bioenerg. 2010 Jun;1797(6–7):1138–48.

50. Hao W, Chang C-PB, Tsao C-C, Xu J. Oligomycin-induced Bioenergetic Adaptation in Cancer Cells with Heterogeneous Bioenergetic Organization. J Biol Chem. 2010 Apr 23;285(17):12647–54.

51. Maroon J, Seyfried T, Donohue, JosephP, Bost J. The role of metabolic therapy in treating glioblastoma multiforme. Surg Neurol Int. 2015;6(1):61.

52. Cardaci S, Ciriolo MR. TCA Cycle Defects and Cancer: When Metabolism Tunes Redox State. Int J Cell Biol. 2012;2012:1–9.

53. Srinivasan S, Guha M, Dong DW, Whelan K a, Ruthel G, Uchikado Y, et al. Disruption of cytochrome c oxidase function induces the Warburg effect and metabolic reprogramming. Oncogene. 2016 Mar 24;35(12):1585–95.

54. Lemarie A, Grimm S. Mitochondrial respiratory chain complexes: apoptosis sensors mutated in cancer. Oncogene. 2011;30(38):3985–4003.

55. Vyas S, Zaganjor E, Haigis MC. Mitochondria and Cancer. Cell. 2016;166(3):555–66.

56. Villalobo A, Lehninger AL. Stoichiometry of H+ Ejection Coupled to Electron Transport through Site 2 in Ascites Tumor Mitochondria’. Arch Biochem Biophys. 1980;205(1):210–6.

57. LeBleu VS, O’Connell JT, Gonzalez Herrera KN, Wikman H, Pantel K, Haigis MC, et al. PGC-1α mediates mitochondrial biogenesis and oxidative phosphorylation in cancer cells to promote metastasis. Nat Cell Biol. 2014;16(10):992–1003.

58. Weinhouse S. On respiratory impaiment on cancer cells. Science (80- ). 1956;124(3215):267–9.

59. Senyilmaz D, Teleman AA. Chicken or the egg: Warburg effect and mitochondrial dysfunction. F1000Prime Rep. 2015 Apr 2;7:41.

60. Wolf A, Agnihotri S, Guha A, Wolf A, Agnihotri S, Guha A. Targeting Metabolic Remodeling in Glioblastoma Multiforme. Oncotarget. 2010;1(7):552–62.

67

61. Sullivan LB, Gui DY, Hosios AM, Bush LN, Freinkman E, Vander Heiden MG. Supporting Aspartate Biosynthesis Is an Essential Function of Respiration in Proliferating Cells. Cell. 2015;162(3):552–63.

62. Michelini LGB, Figueira TR, Siqueira-santos ES, Castilho RF. Neuroscience Letters Rotenone exerts similar stimulatory effects on H 2 O 2 production by isolated brain mitochondria from young – adult and old rats. Neurosci Lett [Internet]. 2015;589:25–30. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.neulet.2015.01.030

63. Castilho RF, Meinicke AR, Almeida AM, Hermeslima M, Vercesi AE. Oxidative Damage of Mitochondria Induced by Fe(II)Citrate Is Potentiated by Ca2+ and Includes Lipid Peroxidation and Alterations in Membrane Proteins. Vol. 308, Archives of Biochemistry and Biophysics. 1994. p. 158–63.

64. Steinlechner-Maran R, Eberl T, Kunc M, Margreiter R, Gnaiger E. Oxygen dependence of respiration in coupled and uncoupled endothelial cells. Am J Physiol. 1996 Dec;271(6 Pt 1):C2053-61.

65. Cooper CE, Canevari L, Dobbie M. Nitric oxide and peroxynitrite cause irreversible increases in the K m for oxygen of mitochondrial ... Arch Biochem Biophys. 2003;(1016):27–34.

66. Poteet E, Choudhury GR, Winters A, Li W, Ryou MG, Liu R, et al. Reversing the Warburg effect as a treatment for glioblastoma. J Biol Chem. 2013;288(13):9153–64.

67. Burk D S AL. On respiratory impairment in cancer cells. Science (80- ). 1956;124:270–2.

68. Ordys BB, Launay S, Deighton RF, McCulloch J, Whittle IR. The role of mitochondria in glioma pathophysiology. Mol Neurobiol. 2010;42(1):64–75.

69. Santandreu FM, Brell M, Gene AH, Oliver J, Couce ME, Roca P. Differences in Mitochondrial Function and Anti- oxidant Systems between Regions of Human Glioma. Cell Physiol Biochem. 2008;22:757–68.

70. Birsoy K, Wang T, Chen WW, Freinkman E, Abu-Remaileh M, Sabatini DM. An Essential Role of the Mitochondrial Electron Transport Chain in Cell Proliferation Is to Enable Aspartate Synthesis. Cell. 2015 Jul;162(3):540–51.

71. Martínez-Reyes I, Diebold LP, Kong H, Schieber M, Huang H, Hensley CT, et al. TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions. Mol Cell. 2016 Jan 21;61(2):199–209.

72. Gaude E, Frezza C. Tissue-specific and convergent metabolic transformation of cancer correlates with metastatic potential and patient survival. Nat Commun. 2016 Oct 10;7(13041):13041.

73. Ronchi JA, Vercesi AE, Castilho RF. Reactive oxygen species and permeability transition pore in rat liver and kidney mitoplasts. J Bioenerg Biomembr. 2011 Dec 1;43(6):709–15.

74. Fontaine EM, Keriel C, Lantuejoul S, Rigoulet M, Leverve XM, Saks VA. Cytoplasmic cellular structures control permeability of outer mitochondrial membrane for ADP and oxidative phosphorylation in rat liver cells. Biochem

68

Biophys Res Commun. 1995 Aug 4;213(1):138–46.

75. Crompton M, Ellinger H, Costi A. Inhibition by cyclosporin A of a Ca2+- dependent pore in heart mitochondria activated by inorganic phosphate and oxidative stress The capacity of cyclosporin A to inhibit opening of a Ca2"- dependent pore in the inner membrane of heart. Biochem J. 1988;255:357–60.

76. Ciechomska I a, Gabrusiewicz K, Szczepankiewicz a a, Kaminska B. Endoplasmic reticulum stress triggers autophagy in malignant glioma cells undergoing cyclosporine A-induced cell death. Oncogene. 2012;32(12):1518– 29.

77. Ram BM, Ramakrishna G. Endoplasmic reticulum vacuolation and unfolded protein response leading to paraptosis like cell death in cyclosporine A treated cancer cervix cells is mediated by cyclophilin B inhibition. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 2014 Nov;1843(11):2497–512.

78. Feichtinger RG, Weis S, Mayr JA, Zimmermann F, Geilberger R, Sperl W, et al. Alterations of oxidative phosphorylation complexes in astrocytomas. Glia. 2014 Apr;62(4):514–25.

79. Larsen S, Nielsen J, Hansen CN, Nielsen LB, Wibrand F, Stride N, et al. Biomarkers of mitochondrial content in skeletal muscle of healthy young human subjects. J Physiol. 2012 Jul;590(Pt 14):3349–60.

80. Tymianski M, Charlton MP, Carlen PL, Tator CH. Source specificity of early calcium neurotoxicity in cultured embryonic spinal neurons. J Neurosci. 1993;13(5):2085–104.

81. Kanzawa T, Bedwell J, Kondo Y, Kondo S, Germano IM. Inhibition of DNA repair for sensitizing resistant glioma cells to temozolomide. J Neurosurg. 2003 Dec;99(6):1047–52.

82. Huang H, Lin H, Zhang X, Li J. Resveratrol reverses temozolomide resistance by downregulation of MGMT in T98G glioblastoma cells by the NF-κB- dependent pathway. Oncol Rep. 2012 Jun 12;27(6):2050–6.

83. Ignarro RS, Facchini G, Vieira AS, De Melo DR, Lopes-Cendes I, Castilho RF, et al. Sulfasalazine intensifies temozolomide cytotoxicity in human glioblastoma cells. Mol Cell Biochem. 2016 Jul;418(1–2):167–78.

84. Burk D, Schade A. On respiratory impairment in cancer cells. Science (80- ). 1956;124:270–2.

85. Ruas JS. Metabolismo energético mitocondrial na proliferação de células de glioblastoma U-87MG e T98G em cultura. 2015 [cited 2017 Mar 13]; Available from: http://www.bibliotecadigital.unicamp.br/document/?code=000942627

69

9- ANEXOS

9.1- ANEXO I: Parecer do Comitê de Ética

70

9.2- ANEXO II: Parecer do Comitê de Ética

71

72

73

9.3- ANEXO III: Autorização de “Copyright”

• Artigo apresentado no Capítulo I: A editora “Elsevier” concedeu licença para

inclusão do artigo nesta dissertação. Abaixo consta a página principal do termo de

licença.