Colín Cossio Dulce María de Lourdes

Colín Cossio Dulce María de Lourdes

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Jurado asignado:

M. en C. Esther Bautista Ramírez

M. en C. Nora Isela Ríos Sanabria

El presente trabajo fue desarrollado en la Unidad de Investigación Médica en

Inmunoquímica del Hospital de Especialidades del Centro Médico Nacional Siglo XXI del

Instituto Mexicano del Seguro Social.

Bajo la asesoría de:

ASESOR EXTERNO

Dr. Armando Isibasi Araujo

Jefe de la Unidad de Investigación Médica en Inmunoquímica

ASESOR INTERNO

Dr. Juan Silvestre Aranda Barradas

Profesor Investigador de la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

SUSTENTANTE

Dulce María de Lourdes Colín Cossio


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DEDICATORIA.

A mis padres por todo el apoyo y

comprensión que me han dado día a día.

A mis hermanos por compartir tantos

momentos conmigo, los quiero.

A mis Tíos Alejandro, Lourdes, Pedro y

Rodolfo que siempre creyeron en mí.

A mis amigos (Edith, Edgar, Amado, Mariana,

Pablo, Carlos, Fernando, Olivia, Ivon y Gaby),

por haber pasado tantos momentos importantes

conmigo, apoyarme en los tiempos difíciles, estar

conmigo cuando lo necesitaba y hacer que esta

etapa haya sido inolvidable.


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AGRADECIMIENTOS.

Al Dr. Armando Isibasi gracias por considerarme para este proyecto, por la

confianza, apoyo y consejos brindados durante mi formación.

Al Dr. Juan Aranda por las enseñanzas, paciencia y consejos, que contribuyeron

de manera muy importante en la realización de este trabajo.

A la M. en C. Nora Ríos, Dr. Manuel Carrera y Dr. Ramírez, por su comprensión,

consejos y apoyo durante la elaboración de este trabajo.

A Yuri, Diana, Vicente, Rosa y Alma, quienes me brindaron su apoyo y amistad en

todo momento y me ayudaron a sacar adelante este proyecto, siempre con la mejor

disposición.

A Rosalía, Noemí, Isabel, Ismael, Manuel, Nora, Eduardo, Luz María y el Dr.

Ramirez, mis compañeros y amigos de laboratorio, por toda la ayuda brindada para la

realización de este trabajo, por los consejos, las pláticas y todos los momentos que

hicieron mi estancia en el laboratorio más agradable.


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INDICE

I. Abreviaturas

II. Resumen

III. Antecedentes

IV. Planteamiento del problema

V. Justificación

VI. Hipótesis

VII. Objetivo General

VIII.Objetivos Específicos

IX. Materiales y métodos.

X. Actividades realizadas

XI. Estrategia de trabajo

XII. Resultados y Discusión

XIII.Conclusiones

XIV.Perspectivas

XV. Bibliografía

XVI.Anexo


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I. ABREVIATURAS

ABS Albúmina Sérica Bovina

DN Demanda de nutrientes

DL50 Dosis Letal Media

DO Densidad óptica

EDTA Etilen diaminotetraacetato disódico

FC Fuente de carbono

FN Fuente Nutricia

IgG Inmunoglobulina G

IgM Inmunoglobulina M

Isipor Candidato a vacuna a base de porinas de S. typhi

KDO Ácido 2-ceto-3-desoxioctulónico

LPS Lipopolisacárido

OD Oxígeno Disuelto

OmpC Porina OmpC

OmpF Porina OmpF

ON Oferta de Nutrientes

PBS Solución amortiguadora de fosfatos- salina

SDS Dodecil Sulfato de Sodio

SDS-PAGE Electroforesis en gel de Poliacrilamida con Dodecil sulfato de sodio

SSI Solución salina isotónica

TBS Solución amortiguadora Tris salina

TE Solución amortiguadora Tris EDTA

ufc Unidades formadoras de colonias

µmax Velocidad específica de crecimiento máxima

µ Velocidad específica de crecimiento


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II. RESUMEN.

Con el fin de desarrollar una vacuna que induzca protección de larga duración, que

sea estable a temperatura ambiente y barata, en la Unidad de Investigación Médica en

Inmunoquímica se desarrolló una vacuna contra Fiebre Tifoidea llamada Isipor a base de

porinas (OmpC y OmpF) de Salmonella enterica serovar Typhi (S. typhi), de la cual,

mediante estudios previos se evaluó su inmunogenicidad y seguridad en voluntarios

sanos, para probar que protegían contra el resto de la bacteria.

Tomando en cuenta que los bioreactores son utilizados en procesos encaminados

a la producción de insumos a través de microorganismos, la importancia de un biorreactor

radica en la necesidad de tener en los cultivos un control que permita optimizar el

proceso. La estrategia de control del proceso comienza con la medición de las variables

que proveen un ambiente adecuado en un proceso de fermentación, por lo que se

consideran las características físicas y de operación del recipiente en donde se lleva

acabo la transformación de materias primas a producto, y las operaciones que se

efectúan antes y después de la fermentación. Las variaciones de estos parámetros

modifican substancialmente la producción y el desarrollo de estos microorganismos. En

este estudio se realizó la optimización de la fermentación para la obtención de porinas a

partir de biomasa de Salmonella typhi, buscando las condiciones en el fermentador para

una producción óptima.


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III. ANTECEDENTES.

3.1. La Fiebre Tifoidea

La fiebre tifoidea es una infección aguda generalizada del sistema

retículoendotelial, del tejido linfoide endotelial y de la vesícula biliar; esta infección es

causada por Salmonella enterica serovar Typhi. Los síntomas característicos de este

padecimiento son fiebre persistente, dolor abdominal y dolor de cabeza. La transmisión de

la fiebre tifoidea está ligada a lugares en donde no se cuenta con los servicios sanitarios

necesarios, el agua no es de una calidad adecuada y existen portadores crónicos de S.

typhi que sirven como reservorio de la infección. En las zonas endémicas, la mayor

incidencia de fiebre tifoidea se presenta generalmente en niños en edad escolar (Keusch

GT., 1994; Levine MM., 1999).

Las cuatro etapas características de la fiebre tifoidea son:

1. Incubación: El tiempo desde la ingestión de Salmonella typhi hasta la

aparición de los primeros síntomas por lo general es de 1–2 semanas

aproximadamente (Caygill, C.P., Hill, M.J., Braddick, M., Sharp, J.C.,

1994).

2. Fase de invasión: Los primeros signos y síntomas son generalmente una

fiebre intermitente elevada acompañada de cefalea persistente, tos no

productiva, cansancio, insomnio, pérdida de apetito y malestar abdominal

asociado frecuentemente con estreñimiento.

3. Periodo de estadio: Aproximadamente una semana más tarde, el paciente

desarrolla una fiebre continua, bradicardia, pulso dicrótico, hepatomegalia y

esplenomegalia. La hepatomegalia puede documentarse en un 33% de los

casos y en una tercera parte de estos pacientes se encontrará ictericia. Los

síntomas respiratorios pueden predominar en los primeros días de la fiebre

tifoidea y ocasionalmente puede documentarse neumonía en parches. En

algunos pacientes la enfermedad semeja un proceso pulmonar primario.

Los pacientes se quejan con frecuencia de malestar abdominal incluyendo

estreñimiento, diarrea, dolor abdominal, sensibilidad del íleo o abdomen. La

roséola tífica (pápulas rosas de aproximadamente de 2-4 mm de diámetro)

aparece en el tronco de los pacientes caucásicos hasta en un 50% de los


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casos (Keusch GT.,1994; Hook EW., 1990). Durante las etapas crónicas de

la infección, se presenta necrosis hemorrágica en las placas de Peyer

(Fig.1), con úlceras y perforaciones intestinales acompañadas de peritonitis

y septicemia.

Fig. 1. roséola tífica (pápulas rosas de aproximadamente 2-4 mm de diámetro) y Placas de peyer,

con úlceras y perforaciones intestinales acompañadas de peritonitis y septicemia.

4. Evolución: Los pacientes no tratados comienzan a mejorar por lo general

4 semanas después de la aparición de la enfermedad. La fiebre disminuye

lentamente a lo largo de 2-3 semanas y pueden persistir los trastornos

gastrointestinales. La recuperación completa puede requerir hasta 3-4

meses. Los pacientes tratados con antibióticos apropiados responden con

una reducción gradual de la fiebre en un periodo de 3-5 días. En un 5-12%

de casos la enfermedad es recurrente, en un 2-5% de los casos el paciente

se convierte en portador crónico a pesar del tratamiento con antibióticos

(Caygill, C.P., Hill, M.j., Braddick, M., Sharp, J. C., 1994). Los portadores


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crónicos están predispuestos a cáncer de vías biliares y también

colorrectal, de páncreas, de pulmón y otros (Figura 2).

Fig. 2. Evolución clínica de la fiebre tifoidea.

3.2. Epidemiología y Estadísticas

La Organización mundial de la salud reporta alrededor de 17 millones de casos de

fiebre tifoidea a nivel mundial, de las cuales 600,000 son letales.

En México hasta la semana 51 del 2003 se reportaron 18,435 casos de fiebre

tifoidea, de los cuales 34.5% son hombres y 65.5% mujeres, la mayoría de los casos se

presentan en personas entre 25 y 44 años de edad. (Sistema Único de Información para

la Vigilancia Epidemiológica, Información preliminar).

Las entidades con una mayor incidencia de la enfermedad son: Sinaloa,

Tamaulipas, Chiapas, Coahuila y Nuevo León, ésto se debe a que en estos lugares se

registran temperaturas muy altas a lo largo del año y que en la mayoría de ellos la


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infraestructura sanitaria no es la adecuada. Debido a que en nuestro país todavía se

registra una gran incidencia de fiebre tifoidea es necesario la implementación de planes

de vacunación, y sobre todo, la creación de vacunas que respondan a las necesidades de

la población ya que como se demuestra en las estadísticas los lugares en donde se

presentan la mayoría de los casos, son de clima cálido, de difícil acceso, además existe

un alto índice de marginación en la población.

3.3. Salmonella enterica serovar Typhi (S. typhi).

S. typhi es un bacilo no esporulado perteneciente a la familia Enterobacteriaceae,

Gram-negativo, móvil, de flagelos perítricos, mide dos a tres micras, anaerobio facultativo,

intracelular (Figura 3). Es una bacteria altamente adaptada al hombre ya que no se

conocen otros reservorios naturales (Levine MM., 1999).

Se han clasificado alrededor de 2463 serotipos (serovares) de Salmonella. En

cuanto a la nomenclatura, existen diferentes propuestas, debido a estas los Centros para

Control y Prevención de Enfermedades (CDC de sus siglas en inglés) la consideran de la

siguiente manera; el genero Salmonella esta compuesto por dos especies, S. enterica en

la cual se encuentran agrupadas 6 subespecies que se dividen en diferentes serotipos los

cuales se designan de acuerdo a su fórmula antigénica (F.W.Brenner,

R.G.V.F.J.A.R.T.a.B.S, 2000). De acuerdo a la clasificación de Kauffman-White

Salmonella typhi pertenece al grupo D y comparte con diferentes especies de ese grupo

los antígenos somáticos 9,12. Los flagelos corresponden al antígeno “d” y en la superficie

se encuentra el antígeno “Vi” (Hook EW, 1990).

La Salmonella typhi tiene una envoltura celular constituida por la membrana

citoplásmica, la peptidoglicana y la membrana externa (Fig. 5); la primera se compone de

fosfolípidos (predominantemente fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol y cardiolipina) y

una gran variedad de proteínas. Los flagelos están anclados en el citoplasma y atraviesan

la membrana citoplasmática. La peptidoglicana confiere rigidez y esta formada por

cadenas paralelas de polisacaridos constituidos por ácido muramico y N-

acetilglucosamina (Keusch GT., 1994). La membrana externa esta formada por proteínas,

fosfolípidos y lipopolisacarido (LPS); este ocupa aproximadamente el 45% de la

superficie. La membrana actúa como barrera, impidiendo la entrada de sustancias tóxicas

como antibióticos y detergentes; contiene los receptores para bacteriofagos y colicinas, se


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relaciona con los procesos de conjugación, división celular y transporte de sustancias al

interior de la célula (Puente, J.L., Verdugo-Rodríguez, A., Calva, E, 1991; Gilleland,

H.E., Jr., Guilleland, L.B., Matthews-Greer, J.M., 1988). Asociados a la membrana

externa se encuentran los pili y el antígeno “Vi”.

Fig. 3. Micrografía electrónica se S. typhi, es un bacilo no esporulado perteneciente a la familia

Enterobacteriaceae, Gram-negativo, móvil, de flagelos perítricos, mide dos a tres micras, es

anaerobio facultativo y posee flagelos anclados a la membrana.

3.4. Características Bioquímicas de S. typhi.

S. typhi es un bacilo móvil fermentador de glucosa con producción de ácido es

lactosa y sacarosa negativo, además de producir ácido sulfhídrico (Romero Cabello,

R., 1999).

Tabla 1. Características bioquímicas de S.typhi.

Glu Lac Gas Sul Ind Mov Cit Sac Ure Man V

+ - - + - + - - - + -


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3.5. Infección por Salmonella typhi.

S. typhi entra al organismo a través de la ingestión de agua o alimentos

contaminados, se multiplica rápidamente en el intestino delgado, y penetra la membrana

basal sin causar daño importante en los tejidos hasta llegar a la placas de Peyer (Fig. 1),

este proceso se lleva a cabo por las células M que son una población de células

especializadas asociadas con la captación de antígenos del lumen intestinal (Romero

Cabello, R., 1999); la bacteria posteriormente es fagocitada por los macrófagos y células

dendríticas y es transportada a los ganglios linfáticos regionales donde se multiplica

activamente (Mastroeni, P. Menager, N., 2003).

Los sujetos infectados presentan una fase de bacteremia por la cual, los bacilos se

distribuyen en el sistema fagocítico mononuclear en donde se reproducen y son liberadas

nuevamente al sistema circulatorio. La bacteria ocasiona un proceso inflamatorio en los

ganglios linfáticos, bazo e hígado, con muy escasa cantidad de polimorfonucleares y gran

acumulación de mononucleares, en el interior de los cuales es capaz de proliferar (Levine

MM., 1999; Mastroeni, P. Menager, N., 2003; Levine, M.M., 2001; Mittrucker, H.W.

Kaufmann, S.H., 2000).

3.6 Tratamiento contra la fiebre tifoidea.

La fiebre tifoidea se trata invariablemente con antibióticos. Un tratamiento eficaz

reduce drásticamente el padecimiento y pérdida de vidas. Una respuesta clínica favorable

se observa usualmente 1-2 días después de iniciar el tratamiento.

De manera más significativa, han aparecido y se han diseminado en todo el mundo

muchas cepas de S. typhi que son resistentes a los antibióticos comúnmente utilizados

(Rowe, B., Ward, L.R., Threlfall, E.J., 1997).

Desde 1948 hasta la década de 1970 se utilizó ampliamente el cloranfenicol en

todo el mundo, y en algunos países en vías de desarrollo, todavía es considerado el

tratamiento estándar. Sin embargo, se han generado cepas de S. typhi resistentes al

cloranfenicol. Lo anterior, unido al hecho de que el fármaco produce numerosos efectos

colaterales indeseables incluyendo anemia aplásica, ha llevado a la búsqueda de nuevos

fármacos. La amoxicilina, el cotrimazol y el trimetroprim-sulfametoxazol son tan eficaces


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como el cloranfenicol, y son seguros para el tratamiento en niños, sin embargo, en

algunos lugares se han aislado cepas resistentes por lo que actualmente las quinolonas

como la ciprofloxacina y las cefalosporinas de tercera generación son los fármacos de

elección para el tratamiento de la fiebre tifoidea. Desafortunadamente, estos fármacos son

caros, en el caso de los países en desarrollo no se encuentran al alcance de la mayoría

de la población y representan una carga sustancial para los presupuestos sanitarios de

estos países (Keusch G.T.,1994), por lo que la prioridad es la prevención de la

enfermedad y por lo tanto la generación y empleo de vacunas.

3.7. Vacunas contra la fiebre tifoidea.

3.7.1. Vacuna de bacteria completa inactivada por calor (L)

La vacuna de bacteria completa inactivada por calor “L” (Pfeiffer y Kolle, Wright y

colaboradores, 1896; Levine M.M., 1999), fue por mucho la vacuna parenteral de bacteria

completa inactivada mas ampliamente utilizada en el mundo, es relativamente fácil de

preparar y estandarizar. Se produce básicamente calentando el medio en donde haya

crecido S. typhi previamente por una hora a 56°C y resuspendiéndola en una solución al

0.5% de fenol en una concentración de 1x109 microorganismos por mililitro. La

administración de dos dosis de esta vacuna proporciona una protección de

aproximadamente 3 años, sin embargo, los efectos secundarios ocasionados

principalmente por la cantidad de endotoxina son muy comunes, pueden ser fiebre,

malestar generalizado, eritema local, induración y dolor; esto es un gran inconveniente

para la administración de esta vacuna por lo que actualmente ya no se utiliza (Levine

M.M., 1999).

3.7.2. Vacuna de bacteria completa inactivada por Acetona (K).

Esta vacuna se preparó por la evidencia de que la inactivación por acetona

preserva el antígeno Vi, lo que incrementa la protección de esta vacuna comparada con la

vacuna L mejorando también su estabilidad para el almacenamiento. Para su preparación,

las bacterias son inactivadas con acetona después se secan o liofilizan. Aún cuando la

protección conferida por esta vacuna es mayor que la de la vacuna L, aproximadamente

de 7 años, los efectos secundarios son iguales por lo que presenta las mismas

desventajas que la anterior (Levine M.M., 1999).


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3.7.3. Vacuna de cepa atenuada TY21a (Vivotif™)

La cepa Ty21a (Levine M.M., 1999; Germanier, R. Fuer, E., 1975 ; Germanier, R.

Levine, M.M., 1986), es una cepa rugosa mutante de gal E, proviene de la cepa silvestre

Ty2 de S. typhi tratada con nitrosoguanidina, un agente mutagénico no específico. Se

escogió una mutante que exhibía ausencia total de actividad de la enzima uridin difosfato

galactosa-4-epimerasa y una reducción de aproximadamente el 80% de actividad de las

enzimas galactocinasa y galactosa-1-fosfato uridil transferasa. De esta mutante se

escogió una cepa que además estaba mutada para carecer del antígeno Vi, esta cepa se

llamó Ty21a (Levine M.M., 1999).

Esta vacuna se administra en cuatro dosis orales, produce una protección de

aproximadamente 5 años y no provoca reacciones adversas, sin embargo su costo es

muy alto, por lo que no se utiliza en campañas de vacunación en países en desarrollo,

(Levine M.M., 1999; Germanier, R. Fuer, E., 1975)

3.7.4. Vacuna de Antígeno capsular Vi. (Thyphim Vi™)

Esta vacuna esta compuesta por el polisacárido Vi de la superficie celular extraído

de la cepa Ty21 de Salmonella typhi (Robbins, J.D. Robbins, J.B., 1984; Wong, K.H.,

Feeley, J.C., Northrup, R.S., Forlines, M.E., 1974). El organismo se crece en medio de

cultivo y el polisacárido capsular se precipita del cultivo con bromuro de

hexadeciltrimetilamonio y se purifica por centrifugación diferencial y precipitación. Este

método de extracción da por resultado un polisacárido Vi no desnaturalizado que preserva

sus residuos O- y N- acetilos. La potencia y capacidad protectora del polisacárido Vi

(Fig.4) depende del peso molecular y la cantidad de residuos o-acetilo.

O

O

AcO

NHAc

n

CO2H

Fig. 4. Composición química del polisacárido Vi, un homopolímero de (14)--D-GalANAC que

es acetilado variablemente en el carbono 3.


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Esta vacuna no provoca efectos adversos notorios, sin embargo por su naturaleza

polisacarídica la protección proporcionada es de corta duración, aproximadamente 3 años

ya que no induce memoria, por lo que no es ideal para utilizarse en zonas endémicas .

Además el reporte de brotes de tifoidea por S. typhi sin Ag Vi, hace necesario buscar

nuevas vacunas. Esta vacuna ha sido conjugada con el toxoide tetánico con el fin de

incrementar la capacidad protectora y la memoria inmunológicas inducidas por el Ag Vi.

Esta vacuna se encuentra en estudios de fase 3 de desarrollo de vacunas (Levine M.M.,

1999).

3.8. La membrana externa.

Las proteínas de membrana externa (PME) se clasifican en proteínas principales y

menores (Mastroeni, P. Menager, N., 2003; Gilleland, H.E., Jr., Gilleland, L.B.,

Matthews-Greer, J.M., 1988). Las primeras pueden expresarse con más de 100 mil copias

por célula y se han descrito alrededor de diez diferentes, aunque por lo general,

solamente se encuentran cinco de ellas en la bacteria.

Dentro de las proteínas principales están:

1) Proteínas matrices o porinas: relacionadas con el transporte pasivo de sustancias

de bajo peso molecular.

2) Proteína modificable por el calor: relacionada con los procesos de conjugación y

actúa como receptor de fagos y colicinas.

3) Lipoproteína de Braun: esta unida covalentemente a la peptidoglicana y su función

es mantener su integridad estructural y funcional de la membrana.

Las proteínas menores intervienen como acarreadores en el transporte de las

sustancias de alto peso molecular a través de la membrana.

Otro componente importante de la membrana externa es el LPS ya que se encuentra

en gran cantidad y establece interacciones con las otras moléculas que forman parte de la

membrana. El LPS es un complejo macromolecular que representa el antígeno O y la

endotoxina de las bacterias gram- negativas; estructuralmente se trata de un

heteropolímero constituido por 3 regiones diferentes (Fig. 5).

1.- Antígeno O.

2.- Núcleo o core.

3.- Lípido A.


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(b)

Fig. 5. (a)Componentes de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas. . (b)El LPS es

un complejo macromolecular que representa el antígeno O y la endotoxina de las bacterias gram-

negativas; estructuralmente se trata de un eteropolímero constituido por 3 regiones diferentes:

Antígeno O, Núcleo o core, Lípido A.


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3.9. Porinas

Las porinas son poros o canales proteicos no específicos que pueden ser

atravesados por pequeñas moléculas hidrofílicas. En la membrana externa se encuentran

otras proteínas que funcionan como canales de difusión específicos y facilitan el paso de

di, tri y oligosacáridos.

Las porinas se encuentran formando parte de la membrana externa de las

bacterias Gram-negativas, mitocondrias y cloroplastos. Forman canales o poros que

permiten el paso de pequeñas moléculas hidrofílicas con límite de exclusión de solutos

aproximadamente de 600Da. Estas proteínas transmembranales se ensamblan como

trímeros de subunidades idénticas de forma cilíndrica semejante a un barril y cada

homotrímero es muy estable a la acción de detergentes y proteasas (Figura 7) (Nikaido,

H., 1994).

El término porina fue empleado por primera vez por Nakae para señalar en

Escherichi coli las propiedades de difusión general de las proteínas que forman poros,

este tipo de canales permiten el paso de moléculas menores a 600Da, pero también

facilitan el paso de cationes o aniones con cierto grado de selectividad.

Debido a la hidrofobicidad de las porinas, no se posee información cristalográfica

de la mayoría de estas proteínas transmembranales. La primer porina en cristalizarse

dando los primeros datos sobre su estructura mediante difracción de rayos X fue OmpF

de E. Coli, obtenida por Garavito y Ronsenbursch (Garavito, R.M.a.R.J.P.,1980). Se

demostró que son trímeros compuestos de subunidades idénticas, cada subunidad

consiste de 16 hojas -plegadas antiparalelas unidas por asas con algunas - hélices

intercaladas. Cada monómero expone ocho asas cortas hacia el espacio periplásmico y

ocho asas largas situadas hacia el exterior de la membrana externa. La forma cilíndrica

que caracteriza a las porinas se forma al cerrarse las estructuras -plegadas de forma

pseudocíclica, mediante un enlace iónico entre el extremo carboxilo de la hoja -16 y el

extremo amino de la hoja -1 (Bing K. Jap Peter J. Walian, 1996) (Figura 6).


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Figura 6. Estructura secundaria de la porina OmpF de E. coli. Estructura definida mediante

el código de aminoácidos de una letra. Los rectángulos muestran a los residuos contenidos en las

regiones de α-hélices. Tomado de Cowan, S. W. y col. L, asas externas; T, asas internas.

La entrada al poro la delimitan largas prolongaciones del cilindro que al inclinarse

hacia el centro del canal restringen su acceso. A la mitad de la altura, el diámetro del poro

se reduce por el doblamiento de la hoja -3 hacia el interior lo que constituye la zona de

restricción que determina el paso de moléculas por su tamaño y polaridad. El poro se

vuelve a abrir y conserva sus dimensiones hasta el otro extremo que desemboca en el

espacio periplásmico de la bacteria. Esto le confiere una forma parecida a un reloj de

arena. En el centro del barril se forma un canal inclinado con respecto al eje longitudinal,

que esta rodeado de “cinturones” de aminoácidos aromáticos que por su orientación e

interacción con la membrana le permiten anclarse fuertemente a la misma (Bing K. Jap

Peter J. Walian, 1996).

La estructura del trímero se forma mediante el entrecruzamiento de regiones

hidrofóbicas de las vueltas -15 y -16, donde los diez residuos carboxilo de la región -

16, en particular el último (una fenilalanina conservada en las porinas) son esenciales


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para el ensamblaje correcto y estabilidad de las porinas. Además la inserción de la hoja -

2 de una porina en el espacio que deja la internalización de la hoja -3 en el poro de la

porina adyacente y la inserción de su respectiva hoja -2 en el espacio de la tercera,

refuerza la forma trimerita (Jap, B.K. Walian, P.J., 1996; Nikaido, H., 1994; Nikaido H.,

1983). Las porinas entre si presentan gran homología, siendo las regiones más

conservadas los segmentos transmembranales y las más variables las asas externas

(Sing, S.P., Singh, S.R., Williams, Y.U., Jones, L., Abdullah, T., 1995).

En la figura 7 se representa la estructura de las porinas en forma tridimensional,

donde puede apreciarse la disposición espacial del trímero en una vista superior (A),

lateral (B), vertical (C).

A ) Vista superior

B ) Vista lateral

C ) Vista vertical

C ) Vista vertical

Figura 7. Modelo tridimensional de las porinas. Disposición espacial propuesto para las porinas

basado en la estructura definida por cristalografía de rayos X. A ) Vista superior del trimero; B )

Vista lateral del trímero; C ) Vista vertical del trímero.


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La cantidad de porinas presente en la membrana externa es relativamente

constante aproximadamente de 2x105 siendo además una de las proteínas más

abundantes en términos de masa que pueden llegar a representar hasta un 2% de las

proteínas totales en la célula (Neidhardt, Frederick C., 1996). Se ha señalado que la

cantidad relativa de las porinas OmpF, OmpC y PhoE de E. coli y S. typhimurium, son

reguladas por las condiciones del medio como son la osmolaridad, temperatura,

concentración de fosfatos y disponibilidad de oxígeno (Martinez-Flores, I., Cano, R.,

Bustamante, V.H., Calva, E., Puente, J.L., 1999). La regulación recíproca de las porinas

se ha propuesto como una respuesta adaptativa de las bacterias a diferentes entornos

(Bing K. Jap Peter J. Walian, 1996).

3.9.1. Diferencias entre OmpC y OmpF de S. typhi.

En S. typhi, la porina OmpC se presenta de manera constante tanto en alta como

en baja osmolaridad, mientras que OmpF se osmorregula de manera similar a la de E. coli

y S. typhimurium (Martinez-Flores, I., Cano, R., Bustamante, V.H., Calva, E., Puente,

J.L., 1999). En un medio con contenido de nutrientes pobre y baja temperatura, la porina

OmpF se expresa preferentemente en cambio la expresión de OmpC se efectúa cuando

la bacteria se desarrolla en un medio con alto contenido de nutrientes, como el intestino

de un hospedero mamífero, donde se presentan condiciones de alta osmolaridad,

temperatura y baja disponibilidad de oxígeno. La concentración de oxígeno influye en la

expresión de las porinas, en anaerobiosis se induce la expresión de OmpC en S. typhi y

E. coli, sin embargo, OmpF se desregula. Con respecto a la temperatura, cuando esta

cambia de 30 C a 37 C se induce OmpC en S. typhi (Contreras, I., Muñoz, L., toro, C.S.,

Mora, G.C., 1995).

La expresión de las porinas se regula mediante el operón ompB que codifica para

las proteínas OmpR y EnvZ (Puente, J.L., Verdugo-Rodríguez, A., Calva, E., 1991).

La porina OmpC por tener un diámetro mas pequeño, reduce la permeabilidad a

las sales biliares y otras moléculas hidrofóbicas grandes, también a los antibióticos, pero

aun permite aproximadamente el 50% de la permeabilidad de OmpF para la glucosa.

OmpC es mas útil para la bacteria dentro del hospedero debido a que restringe la entrada


- 16 -

de solutos dañinos para la misma, además de que dentro del hospedero se encuentran

condiciones suficientes de nutrientes para su supervivencia (Nikaido, H., 1996).

Mientras que el diámetro de OmpF es mas grande que el de OmpC lo que le

permite tener un flujo mas alto para moléculas importantes como la glucosa (Kenney, L.

J., 1997).

Tabla 2.Diferencias en la estructura y expresión de las porinas OmpC y OmpF

Porina Radio Peso

molecular Osmolaridad Temperatura

Concentración

de oxigeno

OmpF 0.58nm 38306 Da

Se expresa a

baja

osmolaridad

Menor

expresión a

37 C

Se expresa

mayormente en

aerobiosis

OmpC

0.54nm

37083 Da

Expresión

Constante

Mayor

expresión a

37 C

Se expresa

mayormente en

anaerobiosis

En la Unidad de Investigación Médica en Inmunoquímica del Hospital de

Especialidades del Centro Médico Nacional Siglo XXI del IMSS, se diseño una vacuna a

base de porinas de S. typhi a la que se le denominó Isipor, que además de inducir la

protección, por su naturaleza proteica, es capaz de producir memoria y no requiere de

cadena fría por ser estable a temperatura ambiente. Esta vacuna se encuentra

actualmente en estudio clínico fase I (Rosa María Salazar-González, C.M.-B. J. C. N. C. J.

A. P.-A. M. C. C. L.-M. a. A. I., 2003).

3.10. Ingeniería Biotecnológica como alternativa en la producción de vacunas

La rentabilidad de un proceso biotecnológico a nivel industrial depende de

numerosos factores, tanto biológicos como ingenieriles. La optimación económica de un

proceso de fermentación puede involucrar el mejoramiento genético de cepas, la

selección de medios de cultivo, la definición de las condiciones de crecimiento, el

establecimiento de sistemas de control y el diseño de equipos que satisfagan las

demandas específicas del proceso. Para la etapa de producción y particularmente para

productos de gran volumen y bajo precio, se tiene que seleccionar un biorreactor que


- 17 -

solucione el mayor número de las siguientes demandas (Schuegerl, 1982; Knecht y col.,

1977; Blenke, 1985).

1 Satisfacer económicamente los requerimientos de transferencia de oxígeno y de

calor.

2 Factibilidad técnica de construir unidades de gran volumen.

3 Bajos costos de operación y mantenimiento.

4 Operación aséptica.

5 Patrón de flujo que favorezca la conversión del sustrato.

6 Condiciones de mezclado que favorezcan la distribución de nutrientes en todo el

reactor.

La fermentación se inicia con la inoculación del medio de cultivo con el

microorganismo de interés. El inóculo consiste de un volumen determinado de medio de

cultivo en el que se ha crecido previamente dicho microorganismo.

La relación del volumen de inóculo al volumen de fermentación oscila normalmente

entre 5 a 10%v/v. En un proceso por lote, la fermentación termina hasta que casi la

totalidad de la materia prima ha sido transformada a producto, el cual puede ser la

biomasa misma, un metabolito primario o uno secundario. El objetivo de toda

fermentación industrial es maximizar dicha transformación en el menor tiempo posible. En

una fermentación ocurren distintas reacciones bioquímicas complejas.

La caracterización de cualquier proceso de fermentación en el que los

microorganismos consumen las materias primas para reproducirse, mantenerse y formar

productos, requiere necesariamente del conocimiento de la estequiometria del proceso,

de la relación entre las materias primas y energía involucradas y de los rendimientos

celulares. En consecuencia, es necesario determinar, entre otras cosas, las distintas

velocidades que ocurren en el proceso (de crecimiento celular, de consumo de sustrato,

de síntesis del producto, de producción de calor, etc.), de tal forma que sea posible tanto

la predicción del comportamiento celular con fines de control, como el diseño,

construcción o implementación del equipo de fermentación.


- 18 -

3.11. Crecimiento Microbiano

La célula bacteriana es esencialmente una maquinaria de síntesis capaz de

duplicarse a sí misma. Una vez sintetizados los polímeros, el crecimiento continúa con el

ensamblaje y formación de nuevas estructuras celulares que finalizan con la división en

dos células hijas. En un medio apropiado física y nutricionalmente, un cultivo se reproduce

continuamente como células vegetativas, los nutrientes absorbidos y metabolizados

permiten crecer al microorganismo.

3.11.1. FACTORES QUE INFLUYEN EN EL CRECIMIENTO

Factores externos

Condiciones ambientales: pH, T°, Aw, O2, CO2

Condiciones nutricionales: Tasa C/N 10:1, 12:1

Factores internos

Capacidad metabólica

3.11.2. FUENTES NUTRICIAS

La selección de las fuentes nutricias componentes de un medio de cultivo para la

producción de un metabolito de interés, dependerá, entre otras cosas, del tipo de

microorganismo; de la finalidad de la producción (fines comerciales o no); de si se

requiere de una rápida velocidad de crecimiento; del valor agregado del producto, etc.

3.11.2.1. FUENTE DE CARBONO

Todas las fuentes nutricias son importantes, sin embargo, debido a la naturaleza

orgánica del proceso fermentativo, la fuente de carbono (FC) es la más relevante. El

carbono contenido en la biomasa, en el producto o productos y en el bióxido de carbono

producido, provienen de dicha fuente. De aquí su importancia. Puesto que las materias

primas representan del 30 al 50% del costo de producción es muy importante la selección

de la FC.

Entre las características más importantes que debe cubrir cualquier fuente nutricia

para utilizarse en un proceso fermentativo a escala industrial, se encuentran las

siguientes:


- 19 -

1 Abundante

2 Disponible

3 Bajo costo

4 Producción centralizada

5 Alta miscibilidad en agua

6 Parcialmente oxidado

7 De fácil degradación por parte del microorganismo

8 Que muestre altos rendimientos de producto

3.11.2.2. FUENTE DE NITRÓGENO

Después del carbono el nitrógeno es el elemento que normalmente se encuentra

en mayor concentración en el medio de cultivo. Se utiliza en la síntesis de aminoácidos,

de proteínas, purinas y pirimidinas (constituyentes de los ácidos nucleicos), etc.

3.11.2.3. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE NUTRIENTES

La concentración de nutrientes puede afectar tanto a la velocidad de crecimiento como al

rendimiento del crecimiento de un microorganismo (Fig. 8). A concentraciones muy bajas

de nutrientes, la velocidad de crecimiento se reduce, mientras que a niveles moderados y

altos de nutrientes llega a ser máxima. Si la concentración aumenta aún más la tasa de

crecimiento no se modifica La dependencia de la tasa de crecimiento con la concentración

de nutrientes fue descrita por J. Monod en 1950 y recuerda la cinética enzimática

establecida por la ecuación de Michaelis & Menten. La concentración de nutrientes afecta

la tasa de crecimiento microbiano y el rendimiento en masa de los microorganismos. A

una tasa máxima de crecimiento, el incremento en la concentración de nutrientes da lugar

a un aumento en la biomasa total a cosechar.


- 20 -

Fig. 8. Efecto de concentración de nutrientes

3.12. CULTIVO EN LOTE (BATCH)

Es el crecimiento de microorganismos en un volumen fijo de nutrientes que

continuamente es alterado hasta su agotamiento por el crecimiento. Se realiza sin

intercambio de materia con los alrededores. Este sistema ofrece como principal

característica su simpleza, tanto desde el punto de vista de equipo necesario como de su

operación. Al mismo tiempo, esta modalidad de cultivo presenta limitaciones, como la falta

de control sobre diversos parámetros del cultivo y el hecho que las células se desarrollan

en un estado fisiológico poco definido y cambiante (Fig.9).

Fig.9. Cultivo Bach


- 21 -

IV. Planteamiento del problema.

Se ha demostrado que el candidato a vacuna contra la fiebre tifoidea basado en

las porinas (OmpC/OmpF) de S. enterica serovar Typhi es un inmunógeno capaz de

inducir protección en un modelo murino mediante la activación del sistema inmune celular

y humoral.

Se conoce que las porinas están expuestas al medio externo por lo que son el

blanco de los anticuerpos y, por lo tanto constituyen uno de los principales antígenos

reconocidos durante la fiebre tifoidea. Sin embargo, no se ha estudiado la producción de

estas proteínas en biorreactores, ni sus características de cultivo en ellos basando los

experimentos en pruebas con respecto a su función biológica y la capacidad de inducción

para síntesis de las porinas. Por ello surge la inquietud de analizar la capacidad y

rendimientos de un proceso de fermentación para la producción de la biomasa de S.

enterica serovar Typhi con el objeto de obtener proteínas de membrana externa y evaluar

su rendimiento con respecto a la cantidad presente de porinas: OmpC y OmpF que son

las responsables de conferir respuesta de anticuerpos y efecto protector.

V. Justificación

Para los ensayos que se realizan con objeto de la elaboración de una vacuna a

base de porinas de S. enterica serovar Typhi es necesaria la obtención de grandes

cantidades de biomasa, la cual puede ser suministrada por la fermentación del

microorganismo bajo condiciones controladas.

VI. Hipótesis

Dado que la vacuna Isipor está comprobada a nivel laboratorio bajo ciertas

condiciones de operación y volúmenes de producción, la utilización de un biorreactor

incrementara la productividad del proceso, al aumentar el rendimiento y disminuir los

volúmenes de producción, y los tiempos de operación.


- 22 -

VII. Objetivo General

Establecer los parámetros de operación en el fermentador Bioflo II para la

optimización de biomasa de S. enterica serovar Typhi.

VIII. Objetivos Específicos

1 Probar el crecimiento de S. enterica serovar Typhi con diferentes tiempos de

incubación e inóculos.

2 Calcular la velocidad de crecimiento del microorganismo.

3 Obtener la cantidad de biomasa producida.

4 Determinar condiciones de crecimiento óptimo en el fermentador.

IX. MATERIALES Y METODOS.


- 23 -

DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCEDIMIENTO GENERAL DE PRODUCCIÒN Y CONTROL DE CALIDAD PARA FABRICACIÓN DE VACUNA CONTRA FIEBRE

TIFOIDEA A BASE DE PORINAS DE Salmonella typhi

Producción Control de calidad

Fig. 10. Metodología

Acondicionar los viales dosificados

Almacenar los viales

Dosificar las porinas en viales de 2 ml

Monitoreo ambiental Aspecto Control de purificación de porinas Control de eliminación de LPS Concentración de proteinas Peso molecular Concentración de ácidos nucleicos Pirógenos antigenicidad Esterilidad Potencia Seguridad

Monitoreo ambiental Control de purificación de porinas Control de eliminación de LPS Concentración de proteinas Peso molecular Concentración de ácidos nucleicos Endotoxinas bacterianas antigenicidad

Extraer las porinas por método de Nikaido

Romper bacterias en molino y agregar DNAasa y RNAasa

Purificar las porinas en columna FPLC

Tinción de Gram

Control de extracción de porinas

Sanitizar el área de producción

Preparar el medio mínimo A suplementado

Separar biomasa por centrifugación

Inocular matraces semilla e incubar

Inocular fermentador para cultivo

Monitoreo ambiental

Biomasa húmeda

Curva de crecimiento Caracterización macroscópica, microscópica y bioquímica

pH

Caracterización macroscópica, microscópica y bioquímica pH


- 24 -

9.1. Microorganismo

La bacteria usada en este trabajo es la cepa ATCC 9993 de Salmonella typhi 9,12,

proporcionada por el área de investigación en viales de 1.5 ml conservada en LB –

glicerol 20%. Las principales características de esta cepa de bacterias se describen en la

Tabla 3.

Tabla 3. Cepa de bacteria empleada.

Cepa Descripción Referencia

S. enterica serovar Typhi

ATCC 9993 Cepa tipo silvestre, aislada de un

paciente con fiebre tifoidea.

ATCC


- 25 -

9.2. Diagnostico técnico del biorreactor. Dentro de las actividades realizadas para la evaluación del equipo (Fig. 11) se

encontró lo siguiente:

Fig. 11. Biorreactor con control automático y capacidad total de 4L útiles, utilizado para la

obtención de biomasa de S. typhi.


- 26 -

9.2.1. Estado físico inicial del biorreactor

El biorreactor (Fig. 12) fue comprado en el año de 1994, para la producción de

porinas a nivel planta piloto. Este equipo no fue instalado correctamente sino hasta el año

de 2004. En este año el biorreactor contaba con las siguientes características:

1 Falta Electrodo de pH

2 Membrana del electrodo de oxígeno (membrana rota)

3 El vaso del fermentador presenta daños físicos como ralladuras y una parte del

borde que toca la tapa esta roto.

4 Las 4 bombas peristálticas del fermentador funcionan.

5 El control de temperatura es adecuado ya que va en aumento y se mantiene en

donde se calibra.

6 No hay flujo de agua por lo que no es posible bajar la temperatura.

7 El flujo de aire se puede controlar con el rotámetro.

8 El vaso del fermentador presenta daños físicos como ralladuras y una parte del

borde que toca la tapa esta roto.

9.2.2. Observaciones del estado físico actual del biorreactor

1 El vaso del fermentador se encuentra en perfectas condiciones (se cambio a uno

nuevo)

2 Las cuatro bombas peristálticas del fermentador funcionan.

3 El control de temperatura es adecuado ya que va en aumento y se mantiene en

donde se le indica.

4 Hay flujo de agua por lo que es posible manipular la temperatura.

5 La velocidad de agitación varía de 0 a 500 rpm.

6 El flujo de aire se puede controlar con el rotámetro.

7 Instalaciones de servicio en buen estado.


- 27 -

9.2.3. Características importantes del biorreactor indicadas en el manual de

operación.

1 Se esteriliza en autoclave a 15 lb/cm2 durante 15 minutos.

2 Se puede utilizar nitrógeno para la calibración del electrodo de OD para hacer el ajuste

a cero.

9.3. Condiciones de cultivo.

9.3.1. Área de esterilidad.

Una mesa de trabajo de acero inoxidable se límpia perfectamente, se colocan 2

mecheros Fischer en 2 extremos de la mesa (aproximadamente a 40 cm), las mangueras

de los mecheros se limpian con una solución de hipoclorito de sodio y la mesa también,

después de estos se utiliza otra solución para mantener esterilidad, en este caso se trata

de cloruro de benzalconio al 1%, se encienden los mecheros y se deja pasar un tiempo de

10 minutos. Transcurrido este periodo se comienza el trabajo microbiológico.

9.3.2. Desarrollo del inóculo.

La prueba de esterilidad de 24 horas permitió afirmar que el proceso de

esterilización fue correcto. Con el inoculo preparado a partir de viales y con una densidad

óptica de aproximadamente 1.0 medido a una longitud de onda visible de 540 nm, se

adicionó el 10% del volumen del reactor (400 ml) al medio estéril, todo esto se llevo a

cabo en condiciones asépticas.

9.3.3. Desarrollo de la fermentación

Las fermentaciones tenían una duración en promedio de 5 horas desde el

momento de la inoculación. Se hacia un seguimiento durante el desarrollo del

microorganismo por densidad óptica y se detenía cuando las células entraban a la fase

estacionaria (dos lecturas similares después de la fase de crecimiento exponencial).


- 28 -

9.3.4. Identificación Bioquímica de la cepa.

La cepa de S. typhi, ATCC 9993 fue identificada bioquímicamente con las

siguientes pruebas:

*TSI (Triple azúcar y hierro)

*MIO (movilidad, indol, ornitina)

*Citrato de Simmons.

9.3.5. Agitación.

Al inocularse el biorreactor la agitación se mantuvo para diferentes experimentos

en 200, 300 y 400 revoluciones por minuto (rpm) durante el tiempo de la fermentación.

9.3.6. Temperatura. Se monitoreo la temperatura durante toda la fermentación y se vario en un rango

de 35 a 37ºC, para encontrar la temperatura óptima (con la que se obtiene mayor cantidad

de biomasa), durante el proceso fermentativo.

9.3.7. pH.

Se mantuvo el pH =7 y la agitación a 300 rpm, mientras que se vario la

temperatura en el Bioflo IIc

9.3.8. Oxígeno disuelto.

Se observo el comportamiento del oxígeno disuelto durante la fermentación en el biorreactor de 14L. 9.4. Medios de cultivo. 9.4.1. Medio Mínimo A (MMA) Para un litro de Medio mínimo A pesar:

K2HPO4 7.0g

KH2PO4 ** 3.1g

(NH4)2SO4 1.0g

Citrato de Na 0.5g

Agua destilada cbp 1000ml.


- 29 -

Suplementar las sales con las siguientes soluciones según el procedimiento adecuado.

a) Sulfato de Magnesio al25%

Pesar 25g de MgSO4 y disolver en 100ml de agua

Esterilizar a 15lb de presión por 15 minutos.

b) Glucosa al 12.5%

Pesar 75g de glucosa y disolver en 600ml de agua


c) Extracto de levadura al 5%

Pesar 15g de levadura y disolver en 300ml de agua


Medir el pH. Se deja a prueba de esterilidad 24 horas a 37oC/120rpm.

**Nota: El MMA-K+ y MMANa+, solo son diferentes en el KH2PO4 ó NaH2PO4 .

9.4.2. MEDIO LURIA-BERTANI (LB)

Para 1lt de Agua destilada pesar:

Peptona *** 10g

Extracto de Levadura 5g

Cloruro de Sodio 5g

Hidróxido de Sodio 1N 1ml


***Nota: El medio LB y Medio LBB, solo varían en el tipo de peptona, para LB es bacto triptona y para LBB es Peptona biotriptasa.


- 30 -

9.5. Toma y tratamiento de muestra.

La toma de muestras se realizó utilizando el puerto que tiene integrado el

biorreactor donde se pueden realizar tomas sin necesidad de abrir el vaso, este se

mantiene constantemente cerrado y la presión se regula por el condensador que en un

extremo tiene un filtro de 0.22 micras para evitar contaminaciones, las muestras tomadas

fueron de 5 ml (1 ml para medir densidad óptica, 1 ml para pruebas bioquímicas y cuenta

viable, 3 ml para peso seco y cuantificación de etanol y azúcares reductores).

Inmediatamente que se tomaron fueron analizadas en un espectrofotómetro

(Beckman DU-600) para conocer su densidad óptica leyendo en absorbancia a 540 nm

con un 100% de transmitancia.

La primera muestra se tomó cuando se acababa de adicionar el inoculo al vaso del

biorreactor, este fue el tiempo t=0, antes de esta muestra se extrajeron 10 ml para

utilizarlos como blancos en las determinaciones espectrofotométricas.

9.6. Cosecha de biomasa.

Una vez alcanzada la fase estacionaria se detenía el suministro de aire cerrando la

válvula de control del rotámetro, posteriormente se cerraba la toma de aire de la

instalación del laboratorio. El siguiente paso para detener la fermentación era apagar la

agitación y por último se pagan los demás instrumentos , control de temperatura y

oxígeno disuelto. Con una bomba peristaltica (Watson-Marlow) se extraía el contenido del

vaso y se colectaba en dos matraces de cuatro litros cada uno, estos se colocaban en el

interior del cuarto frío y se dejaban hasta que su temperatura fuera aproximadamente la

misma que el cuarto frío (4 oC).

9.7. Rompimiento celular y eliminación del DNA y RNA.

El procedimiento establecido para la realización del trabajo incluye el método de

Nikaido y la cuantificación de las proteínas totales sin embargo, la primera etapa que se

esta realizando no requerirá de estos pasos hasta realizar 3 ó 4 fermentaciones en el

biorreactor para establecer las condiciones de operación estándares y de esta manera

hacer repetible este paso y poder continuar con los siguientes procedimientos.


- 31 -

9.8. Sonicador y prensa francesa.

Cuando se trata de obtener un producto celular que se encuentra dentro de la

célula (no extracelular), es necesario utilizar un método para romper la integridad de la

célula. En este trabajo se utilizaron dos métodos, el primero de ellos fue con un sonicador

y el segundo se realizo con una prensa francesa. Cuando la biomasa estaba contenida en

volúmenes grandes como en el caso de una cosecha obtenida del biorrector (100 ml), se

utilizó la prensa francesa y cuando se trató de romper células obtenidas del matraz (20 ml

de biomasa suspendida) se utilizó el sonicador.

9.9. Técnicas analíticas.

9.9.1. Método de Nikaido.

Para la obtención de proteínas de membrana externa se utiliza como protocolo de

trabajo en esta área de investigación la técnica desarrollada por Nikaido (Nikaido, 1981)

(ANEXO P-5)

9.9.2. Cuantificación de proteinas totales.

9.9.2.1. Método de Lowry

Se aplicó el método de Lowry (Lowry, 1951) para cuantificar la proteína total. Se elaboro

una curva de concentración utilizando albúmina sérica bovina, desde una concentración

de 0 hasta 0.60 mg/ml haciendo un escalamiento de 0.05mg/ml en las concentraciones

desde 0 hasta 20mg/ml.


- 32 -

9.9.3. Identificación de las proteínas por SDS

9.9.3.1. Electroforesis en gel de poliacrilamida

Para identificar las porinas de 34 y 36 kDa. Se empleo esta técnica utilizando

poliacrilamida al 10%, las electroforesis se efectuaron a 100 Volts constantes por tiempos

de 60 a 90 minutos. El teñido y desteñido de los geles se llevó a cabo empleando ácido

tricloroacético al 12.5% para fijar las proteínas, el ácido residual se extrae de los geles,

que después se sumergen en una solución con azul de Coomasie por 3 horas (en

ocasiones toda la noche), después de desteñirse se secan en papel filtro celofán, durante

1 hora a 60oC.

9.10. Actividades realizadas.

Las primeras actividades para trabajar en los objetivos de este proyecto

consistieron en hacer una revisión bibliográfica, recibir capacitación por parte del personal

de la Unidad de Investigación, para manejar la bacteria, ya que es altamente patógena, y

en el uso de los equipos de trabajo.

Se hizo una revisión minuciosa de los manuales de operación del biorreactor de 4L

y se identificaron sus componentes, alimentación de agua y fuente de energía eléctrica.

Se verificó que el funcionamiento del biorreactor fuera correcto, para esto se utilizó agua

simple y se realizaron las conexiones necesarias para poner en marcha el equipo. Tanto

la agitación, temperatura, aireación y sistemas hidráulicos funcionaron correctamente, al

igual que los sistemas de control de pH y detección de oxígeno disuelto.

9.11. Estrategia de trabajo.

El objetivo planteado fue producir suficiente biomasa mediante el cultivo de la bacteria en

el biorreactor, para obtener porinas que constituyen a la vacuna contra Fiebre tifoidea.

1. Como primer paso se sugirió realizar ensayos en matraz para conocer las

características del crecimiento de Salmonella typhi. Esto fue útil para conocer las

técnicas de ruptura, identificación y cuantificación de las proteínas.

2. Se produjo un lote de cepa semilla para utilizarlo durante las pruebas siguientes.


- 33 -

3. Se realizaron cinéticas en matraces de 50 y 450ml de medio para probar la

cantidad de inóculo y tiempo más adecuado para los preinóculos.

4. Una vez teniendo la cantidad de inóculo y los tiempos se probo esta cantidad con

diferentes medios de cultivo, para verificar cual era el más adecuado.

5. Una vez conocidos los procedimientos, tiempos y cantidades de los preinóculos,

fue factible realizar la primera fermentación en el biorreactor, utilizando las

condiciones establecidas con anterioridad para el crecimiento de la bacteria en

matraces.

6. Concluidas las 2 primeras fermentaciones se puso en marcha la primera parte del

proyecto. Se diseño el siguiente experimento para señalar el efecto de la

temperatura, sobre la producción de Salmonella typhi. Realizar 4 fermentaciones

alterando la temperatura de operación a 35oC, 36 oC, 37 oC y 38 oC. El control del

biorrector sobre este parámetro es de 0.5 oC lo que permite tomar estos rangos.

7. El siguiente paso fue detectar a cual número de revoluciones por minuto

corresponde la máxima expresión de proteínas, esto se logró manteniendo fijas las

condiciones de temperatura (37ºC) y pH inicial (7.0). Se probó a 200, 300 y 400

rpm. En este caso el reactor es sensible en 1 rpm.

8. Por último se realizó un experimento donde se corrieron cinéticas simultaneas de

Salmonella typhi a diferentes pH, esto se realizo en matraces de 1000 ml con 450

ml útiles de medio mínimo A y un inoculo inicial del 10%,

9. Con los resultados obtenidos fue posible mencionar cuales fueron las condiciones

máxima (por cada variable un valor individual, no se puede combinar) donde se

obtuvo mayor cantidad de proteína (proteínas totales).


- 34 -

X. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

10.1. Identificación bioquímica de la Cepa.

Se realizaron las pruebas bioquímicas TSI, MIO y Citrato de Simmons para

identificar la cepa utilizada durante el desarrollo de los experimentos.

Tabla 4. Resultados de las pruebas bioquímicas de la cepa ATCC9993.

Prueba Característica

Evaluada

Características reportadas

para S. typhi

Cepa ATCC9993

Glucosa + +

Sacarosa/Lactosa - -

H2S + +

Producción de gas - -

Movilidad + +

Indol - -

Ornitina + +

Citrato de Simmons

Crecimiento - -

10.2. Cinéticas.

10.2.1. Determinación de cantidad de inóculo y tiempos de incubación.

Se realizaron cinéticas de crecimiento para evaluar la cantidad de inóculo (Fig. 12a

y 12b) y tiempos de incubación para matraz semilla (Fig. 13) arrojando los siguientes

resultados:


- 35 -

Figura 12a. Crecimiento de Salmonella typhi en medio LB con diferente cantidad de inóculo,

considerando que a una densidad óptica de 1 se tienen 1x 109 bacterias/ml, la fermentación estaria

completada para fines de inoculación en Densidad óptica de 1.

Cinetica de 50 ml de MMA

0

0.5

1

1.5

2

0 2 4 6 8

Horas

DO

- 5

40

nm

50 microlitros

100 microlitros

150 microlitros

300 microlitros

Figura 12b. Crecimiento de Salmonella typhi en MMA con diferente cantidad de inóculo,




- 36 -

Cinética de 50ml de medio LB con cantidad de

inóculo distintas

0.8

0.85

0.9

0.95

1

1.05

1.1

1.15

1.2

1.25

1.3

0 2 4 6 8h

X (

g/m

l)

50 microlitros

100 microlitros

150 microlitros

300 microlitros

Figura 12 a). Crecimiento de Salmonella typhi en LB con diferente cantidad de inóculo,



Conc. de biomasa en ml de medio LB

-0.15

-0.1

-0.05

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0 2 4 6 8

h

Ln X

(g/L

)

50 microlitros

100 microlitros

150 microlitros

300 microlitros

Figura 12 b). Crecimiento de Salmonella typhi en MMA con diferente cantidad de inóculo,




- 37 -

Cinetica de crecimiento en matraces con

450ml y distintos tiempos de incubación

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

0 5 10 15Tiempo (hr)

Ab

s (

54

0n

m) 2 hr

4 hr

6 hr

Fig.13. Tiempos de incubación en 450 ml de MMA, para determinar el tiempo de incubación del preinoculo para el biorreactor de 4L.

Considerando que a una densidad óptica de 1, se tiene una concentración de 109

bacterias/ml (dato obtenido por cuenta viable) y que esta cantidad es suficiente para la

inoculación, se puede observar en las gráficas que el inóculo que alcanza más rápido

dicha densidad óptica es el de 300 l en un tiempo de aproximadamente 2 horas y entra

en fase estacionaria alrededor de las 5 horas para ambos medios, además de presentar la

curva más Homogénea (con forma sigmuidal) a comparación de los demás inóculos, por

lo que se eligió esta cantidad para realizar la siguiente prueba.

El experimento mostrado en la Figura 13 se realizó inoculando matraces con 450 ml de

MMA inoculados con 50 ml de MMA, pero a diferentes tiempos, es decir, para el matraz 1

de 50 ml, se dejó solamente fermentar por 2 horas y se inóculo al de 450 ml, el matraz 2

por 4 horas y el 3 por 6 horas, para ver si se mostraba alguna variación en cuanto a

concentración en los matraces de 450 ml de MMA, pero como se observa, la variación

entre 4 y 6 horas es casi imperceptible y a su vez la variación de 6 y 4 horas, con respecto

a 2 horas es mínima, y como se recordara en 4 y 6 horas el cultivo esta en fase

estacionaria, mientras que a las 2 horas esta en fase exponencial, por lo que se considera

que debido a la poca variación en tiempo y concentración alcanzada en los matraces de


- 38 -

450 ml de MMA, podemos decir que el matraz de 450ml es inoculado satisfactoriamente

con un matraz de 50 ml fermentado durante 2 horas. Así mismo se observa que el tiempo

aproximado de fermentación para el matraz de 450 ml es de aproximadamente 7 horas.

Comparación de medios de cultivo

Se compararon los medios LB, LBB y MMA con sus respectivas variantes (Na+, K+, se

refiere al uso de NaH2PO4 ó KH2PO4, en la formulación del medio), obteniendo los

siguientes resultados:

Comparación de medios para cienticas de 50ml

(300 microlitros de inóculo)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Horas

DO

- 5

40n

m

LB

MMA

LBB

Fig.14. Comparación de medios de cultivo para preinoculo de 50 ml


- 39 -

Comparación de 450ml de médio

0

0.5

1

1.5

2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Horas

DO

- 5

40n

m

MMA - K

MMA - Na

LB

LBB

Fig.15. Comparación de medios de cultivo para preinoculo de 450 ml

Gramos de biomasa obtenidos en 450ml

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

MMA, K+ MMA, Na+ LB LB, biotriptasa

Medios

gr

Fig.16 Comparación de biomasa y proteínas obtenidas con medios de cultivo para

preinoculo de 450 ml

En las gráficas observamos un comportamiento muy similar entre los medios de cultivo,

con la excepción que los medios LB presentan un tiempo de fermentación superior al de

los MMA pero su cantidad de biomasa (primera barra de izquierda a derecha) producida

es superior a la de los MMA, mientras que se observa lo contrario en el caso de la


- 40 -

cantidad de proteínas (segunda barra de izquierda a derecha), y considerando que lo que

nos interesa es la cantidad de proteínas se elegirá el MMA con K+, como medio óptimo,

debido a la concentración de proteínas que presenta.

Comportamiento del pH

Se realizo también el experimento con los diferentes medios para ver cual era el que

presentaba menor variación de pH, obteniendo los siguientes resultados:

Comportamiento del pH

5

5.5

6

6.5

7

7.5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Horas

pH

MMA - K

MMA - Na

LB

LBB

Fig.17. Comparación de biomasa y proteínas obtenidas con medios de cultivo para

preinoculo de 450 ml

En los que podemos observar que el medio más estable es el MMA- K por lo que de

nuevo corroboramos la elección de este ya que no deseamos que nuestro pH varié

demasiado durante el proceso de fermentación.

Los microorganismos regulan su pH interno mediante un sistema de transporte de

protones que se encuentra en la membrana citoplasmática, que incluye una bomba de

protones ATP dependiente.

El rango de pH óptimo para el desarrollo de los microorganismos es estrecho debido a

que frente a un pH externo muy desfavorable se requiere un gran consumo de energía

para mantener el pH interno.


- 41 -

Influencia del pH sobre la biomasa

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

Tiempo (hr)

DO

pH 4

pH 5

pH 6

pH 7

pH 8

Fig.18. Influencia de pH sobre la biomasa

Comparación de pH

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

4 5 6 7 8

pH

g/L

, h

-1

Biomasa

u max

Proteínas

Fig.19. Comparación de biomasa, velocidades máximas de crecimiento y proteínas obtenidas a diferentes pH en el prefermentador Bioflo IIc

En la gráfica 7 observa que el pH en el que hay mayor cantidad de biomasa es a 7,

mientras que al que se presenta mayor cantidad de proteína es a 5. a pesar de que la

proteína es constitutiva (Lewin, 1994. Albert, 1994) el aumento de la biomasa no tiene una

relación lineal con el aumento de proteínas, esto es una evidencia que puede


- 42 -

interpretarse como un aumento en el grosor de la pared celular para proteger la integridad

de la célula contra las condiciones tan hostiles del medio cuando se encuentra a pH’s

bajos, sin embargo no toda la proteína producida a pH 5 son porinas, mientras que a pH 7

el 60% lo son, por lo que se determino usar en los siguientes experimentos el pH de 7.

Efecto de la temperatura sobre el crecimiento

Se mantuvo el pH =7 y la agitación a 300 rpm, mientras que se vario la temperatura en el

Bioflo IIc

Tabla 5. Resultados de las pruebas del efecto de la temperatura

Temperatura oC

Biomasa (g/L)

Densidad óptica máxima 540 nm

Porinas (g/L)

max h-1

Rendimiento

%

35 5.707 0.6931 0.286 0.54 19.95

36 9.42 0.9587 0.42 0.618 22.43

37 11.37 1.0536 0.431 0.522 26.38

38 10.213 0.9955 0.460 0.534 22.20

Efecto de la temperatura sobre el crecimiento

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 1 2 3 4 5 6

Horas

OD

- 5

40n

m

35 oC

36 oC

37 oC

38 oC

Fig.20. Comparación de temperaturas en el biorreactor de 4L

En la tabla se observa que la mayor cantidad de biomasa y el mejor rendimiento de

porinas se obtuvo a 37ºC tal y como se ha considerado para todas las fermentaciones que

se han hecho hasta ahora, ya que a esta temperatura los nutrientes se encuentran en


- 43 -

óptimas condiciones y la osmolaridad del medio es la óptima, permitiendo una asimilación

de nutrientes adecuada. En contraste podemos ver que a 35ºC la concentración de

porinas es muy baja, porque la disminución de la temperatura retrasa el crecimiento de

los microorganismos y ha 35ºC parece ser que la bacteria reduce bastante su

metabolismo.

La temperatura afecta la estabilidad de las proteínas celulares porque induce cambios

conformacionales que alteran la actividad biológica de estos compuestos, especialmente

la de enzimas.

Efecto de la agitación sobre el crecimiento

Tabla 6. Resultados de las pruebas del efecto de la agitación

RPM Biomasa

(g/L)

Porinas

(g/L) max

h-1

Rendimiento

%

200 2.8 0.462 0.0103 6.06

300 3.28 0.536 0.0143 6.12

400 1.72 0.3208 0.0101 5.36

Efecto de la agitación sobre el crecimiento

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

Horas

OD

- 5

40

nm

200 rpm

300 rpm

400 rpm

Fig.21. Comparación de agitación a diferentes rpm

Cuando se aumento el número de revoluciones por minuto se incremento la concentración

de células y proteínas (300rpm), al seguir incrementado las revoluciones el efecto se

revierte produciendo menos células y menor concentración de proteínas (400 rpm). A 200

rpm las condiciones de crecimiento fluctuaron entre 0.01 y 0.0143 (400 y 300 rpm), esta

última ha sido la velocidad más grande encontrada experimentalmente.


- 44 -

Comparación de cinéticas en matraz y en los Fermentadores o biorreactores Comparación Matraz vs Biorreactor de 4L

Tabla 7. Resultados de las cinéticas

Preinóculo

(matraz 50ml

MMA)

Matraz semilla

(matraz 450ml

MMA)

Biorreactor de 4L Producción en

matraces

Cantidad de inóculo

300 L 50 ml 500 ml Aprox. 338 L

Volumen 50 ml 450 ml 4450 ml 10 L

Tiempo 2 hr 5 hr 7 hr 5 hr

Densidad óptica final

N/A 1.318 2.057 1.0

Todos en condiciones de 37ºC, 300 rpm y pH de 7.0 en Medio Mínimo A

Cinetica de crecimiento de Salmonella typhi en

matraces de 10L de MMA

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 1 2 3 4 5 6

h

DO

- 5

40 n

m

Fig.22. Crecimiento de biomasa entre matraces de 10L de MMA

La grafica muestra un crecimiento muy superior de cantidades de biomasa del

fermentador (FS) a comparación de las obtenidas en matraces (S0), además de alcanzar

la densidad óptica de 1 en un tiempo más corto y aún en fase exponencial por lo que se

garantiza que las células estén viables.


- 45 -

Cinéticas de crecimiento en el Biorreactor de 4L

Se inocula el matraz de 50ml de MMA con 300 l de cepa semilla y se incuba por 2 horas

a 37ºC, y 300rpm, transcurrido las 2 hr, se vierten esos 50ml en el matras de 450ml de

MMA y se incuba por 5 hr a las mismas condiciones, transcurridas esas 5hr, se procede a

inocular con el matraz de 450ml de MMA al Biorreactor de 4L, para el cual las

condiciones de inicio serán las siguientes (previamente se abra cubierto la prueba de

esterilidad durante 24 hr):

Condiciones iniciales:

Volumen final: 4450 ml

Aeración inicial: 1 VVM

Agitación: 300 rpm

pH: 7

Temperatura: 37ºC

La siguiente tabla (tabla 8) muestra los resultados obtenidos en 3 fermentaciones en el

biorreactor de 4L:

Tabla 8. Resultados de las fermentaciones en el biorreactor de 4L

Producción de biomasa

Lote Biomasa húmeda (g)

A 24.50

B 24.00

C 25.18

Tomando en cuenta solo el lote C obtuvimos los siguientes resultados:

Tabla 9. Resultados de la concentración de proteínas para el lote C.

Extracción de porinas FS007-011104

Porinas Conc. (mg/ml) Vol. (ml) Porinas (mg)

Sin purificar 1.4 20 28

Purificadas 0.17 12.5 21.6

Rendimiento: 77%

La gráfica se muestra a continuación:


- 46 -

Fig.23. Comparación de Fermentaciones en biorreactor de 4L.

Como se puede ver todas las fermentaciones alcanzaron la DO = 1, alrededor de las 2-

3hr, y estando aún en fase log, por lo que podemos pensar que las células están viables,

sin embargo con la finalidad de obtener la mayor cantidad de biomasa la cosecha de la

bacteria se realiza a las 4 h de haber comenzado la fermentación.

Purificación de la proteína.

Con el fin de analizar la eficiencia de la purificación y verificar la pureza e identidad

de la porina, se estudiaron muestras de los diferentes pasos de la purificación y el

producto final por medio de electroforesis en geles de poliacrilamida. La eliminación de

bandas y el enriquecimiento de una banda con un corrimiento electroforético relativo a 36

KDa que corresponde a la porina OmpC, nos indica que la purificación fue eficiente y que

se obtuvo un producto sin contaminación con otras proteínas de diferentes pesos

moleculares.


- 47 -

Tinción de Comassie Tinción de plata

Fig.24. Tinción de Comassie y tinción de plata Recuperación de Porinas, lote FS007-11004

Velocidad específica de crecimiento, producción de biomasa y recuperación de porinas con Salmonella typhi en matraces.

Tabla 10. Resultados de los lotes producidos en matraces de 10L

Lote (h-1

) Biomasa (g) Porinas (mg)

1 1.6474 26.4 16.80

2 1.5927 27.0 22.50

3 1.1903 N/A N/A

4 1.8989 25.1 N/A

5 1.3591 25.0 15.60

6 1.3095 26.4 17.51

7 1.3417 27.0 10.25

8 1.0275 19.7 N/A

La gráfica se muestra a continuación:


- 48 -

Comparación de fermentaciones en matraces de 10L de

MMA y Fermentador de 4L de MMA

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 2 4 6 8

h

DO

- 5

40 n

m

Matraces (10L)

Biorreactor (4L)

Fig.25. Fermentaciones en Matraces con 10L de MMA

Todas las cinéticas en matras alcanzan su DO =1, en la fase estacionaria

Cinética de crecimiento y % de oxígeno disuelto durante la fermentación de Salmonella typhi.

Tabla 11. Condiciones iniciales de las fermentaciones en los biorreactores

Condiciones Prefermentador (4L) Condiciones finales

Fermentador de producción (14L) Condiciones finales

Volumen 4.450 L 14 L

Densidad óptica 1.67 1.58

Agitación 250 rpm 200rpm

Temperatura 37ºC 37ºC

pH 7.0 7.0

Aireación 1 VVM 1 VVM

Tiempo 5 hr 7 hr

Tabla 12. Cantidad de biomasa obtenida en las fermentaciones del biorreactor de 20L

Lote Biomasa húmeda (g)

AA 68

BB 70


- 49 -

Cinética de crecimiento y % de oxígeno disuleto durante la fermentación de

Salmonella typhi en biorreactor de 14Lde M M A

0

1

2

3

4

5

6

7

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

h

mg

/ml

%D

O-5

40

nm

%O

D

AA BB mg Glu %OD-AA %OD-BB

Fig.26. Comparación de crecimiento de biomasa vs % Oxígeno disuelto

Ambas graficas comparadas fueron hechas en el biorreactor de 20L con 14L de

MMA, inoculado con el biorreactor de 4L, podemos observar la relación del crecimiento

con respecto del consumo de oxígeno mostrando que durante las primeras 4 horas,

donde es crítica la cantidad de oxígeno disuelto, es decir la demanda de aireación es

mayor en la primera hora de cultivo a comparación del resto de la fermentación, porque

en la primera hora es en la que se obtiene la mayor velocidad de crecimiento y a las 5 hr

un agotamiento de nutrientes casi total, por lo que se observa también que la cosecha

puede ser realizada a las 4hr de haber empezado la fermentación.


- 50 -

Fig. 27. Tinción de Comassie y tinción de plata

Tabla 13. Composición elemental de un microorganismo promedio

Microorganismo % C % H % N % O % S % P Fórmula química empírica

Bacterias 47.1 7.8 13.7 31.3 2.4 N/A CH2N0.25O0.5

Atkinson and F. Mavintuna, Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook, Nature Press

(1983)


- 51 -

Tabla 14. Composición elemental de la biomasa con respecto al sustrato

Fuente Materia

prima

Contenido

de la

fuente

Rendimiento Requerimiento

(g/L) 4 L 10 L

X

(g/L)

Nitrógeno Sulfato de

amonio 21.4 1.562 1 4 10 21.869

Nitrógeno

Extracto

de

Levadura

0.07 0.005 1 4 10 0.072

Carbono Glucosa 40 0.849 5 20 50 59.448

Se ha encontrado que la composición elemental de un microorganismo dado durante un

cultivo no se modifica mayormente y, lo que es más, las composiciones elementales de

distintos tipos de microorganismos (bacterias y hongos) son semejantes. De este modo se

puede definir un "microorganismo promedio" como aquél cuya composición es (% p/p),

(Tabla 13), siendo el contenido de sales aproximadamente 5%. Es importante recalcar

que si bien la composición elemental de la biomasa se mantiene constante durante el

cultivo, no ocurre lo mismo con la composición macromolecular, esto es: proteínas, ácidos

nucleicos, cte., la cual puede variar sensiblemente.

Para un volumen final de 14L de caldo fermentado de Salmonella typhi la concentración

celular máxima puede ser 29.7 a 35.6


- 52 -

XIII. CONCLUSIONES

Existen diversos métodos para medir el crecimiento de los microorganismos como

peso seco, absorbancia, número de células viables, contador de células, etc haciendo una

combinación de estos métodos es posible lograr una idea más clara de la verdadera

cantidad de biomasa que se esta obteniendo.

Se logro llevar a cabo la producción de porinas de membrana externa de

Salmonella typhi 9,12, Vi:d, en el biorreactor Bioflo IIc (4L), Bioflo IV (14L) y en matraces

(4L), según la metodología proporcionada en los manuales de operación para la

producción de la vacuna contra fiebre tifoidea.

Se encontraron parámetros fisicoquímicos en forma independiente que permiten

establecer una base para un futuro análisis factorial de los mismos, trabajando en un

rango más reducido y producir las porinas para la vacuna en condiciones cercanas a las

óptimas (como los sistemas biológicos no son ideales los valores óptimos son relativos)

Los parámetros fisicoquímicos que se observo influyen en la producción de

proteínas de membrana externa se establecen en un pH de 7.0, a una temperatura de

37ºC y 300rpm. Lo anterior sugiere que la presencia de factores de estrés para la bacteria

influyen en el mecanismo de síntesis de las proteínas de membrana externa de

Salmonella typhi 9,12,Vi:d, cuando esta aumenta el grosor de la membrana en busca de

condiciones menos adversas para su crecimiento y reproducción, estos serían entonces

los parámetros de operación buscados en este proyecto.

También se demostró que debido a que los biorreactores deben inocularse con

aproximadamente 5 a 10% de su volumen total se estableció que la producción se inicia

cuando se inocula el matraz de 50ml de MMA con 300 l de cepa semilla y se incuba por

2 horas a 37ºC, y 300rpm, transcurrido las 2 hr, se vierten esos 50ml en el matraz de

450ml de MMA y se incuba por 5 hr a las mismas condiciones, transcurridas esas 5hr, se

procede a inocular con el matraz de 450ml de MMA al Biorreactor de 4L, que servirá para

inocular al biorreactor de 14L, con el uso de dichos biorreactores los tiempos de operación

se disminuyen aproximadamente a la mitad y la cantidad obtenida aumenta casi al doble,

por lo que se optimiza el proceso de fermentación ya que se obtiene la misma cantidad de

proteína con menos recursos y en menor tiempo.


- 53 -

Se ha señalado que la cantidad relativa de las porinas OmpF y OmpC son

reguladas por las condiciones del medio como son la osmolaridad, temperatura,

concentración de fosfatos y disponibilidad de oxígeno. La regulación recíproca de las

porinas se ha propuesto como una respuesta adaptativa de las bacterias a diferentes

entornos.

XIV. PERSPECTIVAS

Este trabajo busco como objetivo principal dejar en uso los equipos del área de

producción de porinas y el establecer las primeras pruebas para determinar la estrategia a

seguir para la producción de porinas obtenidas de la biomasa de Salmonella typhi, sin

embargo el trabajo para realizar el montaje de la producción a nivel planta piloto de las

porinas como se tiene planeado hacer en un futuro y que este trabajo sirve como

antecedente, tiene aún un largo camino por recorrer, como establecer los balances de

materia que se dan lugar durante la transformación de las materias primas en la

fermentación, hacia donde es posible que se desvié la fermentación, el estudio de los

subproductos o metabolitos secundarios que pudieran obtenerse durante la fermentación,

también para corroborar la identidad de la proteína purificada es necesario realizar una

inmunoelectrotransferencia (western blot), identificar y probar el tipo de cultivo más

indicado para el proceso y su optimización, e incluso el medio de cultivo optimo, ya que el

MMA contiene extracto de Levadura el cual según la ley de Salud no se puede usar ahora

como parte de la formulación de un medio de cultivo que será usado en la fabricación de

productos de uso farmacéutico en humanos, todos estos factores aún están por

investigarse, para la implementación de una planta piloto dentro de la Unidad de

Investigación Médica en Inmunoquímica del Hospital de Especialidades del Centro Médico

Nacional Siglo XXI.

XV BIBLIOGRAFÍA


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44. Paniagua J, Isibasi A, Pelayo R, Ortiz V, Muy M, González C, García JA, Islas S,

Kumate J. Anticuerpos monoclonales anti-lipopolisacárido de Salmonella typhi

9,12,Vi:d. Ensayo de protección pasiva en un modelo murino de fiebre tifoidea.

Arch Invest Med (Mex) 1989; 20: 315-320.


- 58 -

XVI. ANEXO

M-1. MEDIO MINIMO A

Para un litro de Medio mínimo A pesar:

K2HPO4 7.0g

KH2PO4 3.1g

(NH4)2SO4 1.0g

Citrato de Na 0.5g

Agua destilada cbp 1000ml.

Suplementar las sales con las siguientes soluciones según el procedimiento adecuado.

a) Sulfato de Magnesio al25%

Pesar 25g de MgSO4 y disolver en 100ml de agua


b) Glucosa al 12.5%

Pesar 75g de glucosa y disolver en 600ml de agua


c) Extracto de levadura al 5%

Pesar 15g de levadura y disolver en 300ml de agua



M-2. MEDIO LURIA-BERTANI

Para 1lt de Agua destilada pesar:

Peptona 10g

Extracto de Levadura 5g

Cloruro de Sodio 5g

Hidróxido de Sodio 1N 1ml


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M-3. TRIS-HC1 pH 7.7 SDS AL 2%

Pesar para 1lt de Tris- HC1- SDS:

Tris base 1.21g

SDS 20g

Colocar las sales en un matraz y disolver en 500ml de agua destilada y con HC1

Ajustar el pH hasta 7.7, después llevar a 1lt.

M-4. BUFFER DE NIKAIDO

Pesar:

Tris base 12g

Cloruro de sodio 46.8g

EDTA 3.7g

SDS 20g

Disolver todas las sales (excepto el SDS) en 500ml de Agua para Inyectables.

Tomar una muestra de 2ml y medir pH, ajustar a pH 7.7 con HC1 0.2N.

Disolver el SDS en la solución.

Agregar Agua para Inyectables hasta 4 litros.

Filtrar a través de poro 0.2 .

Recibir en un matraz despirogenizado y etiquetar.

M-5. MEZCLA DE REACCIÓN PAR ALE MÉTODO DE LOWRY.

Solución de Carbonato de Sodio al 2% 100ml

Solución de Sulfato de Cobre al 1% 1.0ml

Solución de Tartrato de Sodio y Potasio al 2% 1.0ml

Esta mezcla debe de prepararse al momento y protegerse de la luz.


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M-6. SOLUCIÓN DE CORRIMIENTO PH 8.3

Puse exactamente:

Glicina 14.4g

Tris-(hidroximetil)metilamina 3.0g

Dodecilsulfato de sodio (SDS) 1.0g

Disuelva y afore a 1 lt con agua destilada.

M-7. COLORANTE DE COOMASIE

Pese exactamente 0.25g de azul de Coomasie y disuelva en 125ml de metanol.

Adicione 25ml de ácido acético glacial y 100 ml de agua destilada.

Filtre por gravedad a través de papel filtro.

M-8. DESCOLORANTE

Tome y mezcle lo siguiente:

Ácido acético glacial 100ml

Agua destilada 800ml

Metanol 100ml

Agite vigorosamente durante 1 minuto.

Esta solución puede reutilizarse si es tratada con carbón activado.

M-9. SOLUCIÓN FIJADORA PARA TINCIÓN DE PLATA


Metanol 40ml o 25ml si utiliza isopropano.

Ácido acético 70ml

Agua deionizada 68ml

Esta solución debe prepararse en el momento de su utilización


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M-10. SOLUCIÓN OXIDANTE PARA TINCIÓN DE PLATA

Pese exactamente 0.35g de ácido periódico

Disuelva en 50ml de agua deionizada y agregue 1.33ml de solución fijadora para

tinción de plata.

Esta solución debe prepararse al momento de su utilización.

M-11. SOLUCIÓN TEÑIDORA PARA TINCIÓN DE PLATA


Solución de hidróxido de sodio 0.1N 9.3ml

Hidróxido de amonio 0.66ml

Agregue agitando continuamente 1.7ml de solución de nitrato de plata al 20%

Adicione 38.3 ml de agua deionizada.

Esta solución debe de usarla dentro de los 5 minutos después de su preparación.

NOTA: Si después de agregar la solución de nitrato de plata el precipitado no se

disuelve, adicione gota a gota hidróxido de amonio hasta que desaparezca el

precipitado.

M-12. SOLUCIÓN REVELADORA PARA TINCIÓN DE PLATA

Pese exactamente 0.0025g de ácido cítrico

Disuelva en 50ml de agua deionizada.

Agregue 25 l de formaldehído al 37%


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M-13. SOLUCIÓN REGULADORA DE CARBONATOS pH 9.5

Pese exactamente:

Bicarbonato de sodio 7.0g

Carbonato de sodio 2.8g

Disuelva en 500ml de agua destilada

Ajuste el pH y afore a 1000ml con agua destilada.

M-14. SOLUCIÓN REGULADORA DE FOSFATOS (PBS) pH 7.4

Pese exactamente:

Cloruro de sodio 8.7g

Fosfato monobásico de sodio 0.7g

Fosfato dibásico de sodio 2.7g

Disuelva en 500ml de agua destilada.

Ajuste el pH y afore a 1000ml con agua destilada.

M-15. SOLUCIÓN DE BLOQUEO

Pese exactamente 5.0g de leche descremada

Disuelva en 100ml de solución reguladora de fosfatos (PBS) pH 7.4

NOTA: Debe prepararse el día de su utilización.

M-16. SOLUCIÓN DE LAVADO

Disuelva 1ml de tween 20 en 1000ml de agua destilada o de la llave.

M-17. SOLUCIÓN REGULADORA DE CITRATOS pH 5.6

Pese exactamente:

Ácido cítrico

Citrato de sodio


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Disuelva en 500ml de agua destilada

Ajuste el pH y afore a 1000ml con agua destilada

M-18. SOLUCIÓN REVELADORA

Pese exactamente 0.006g de o-fenildiamina

Disuelva en12 ml de solución reguladora de citrato de pH 5.6

Adicione 10 l de agua oxigenada, en el momento de su utilización.

P- 1. PRODUCCIÓN DE CEPA SEMILLA Y CEPA DE TRABAJO

El procedimiento para la producción de la cepa semilla y cepa de trabajo se describe en el

manual de Aseguramiento de la Calidad y procedimientos Estándar de Operación para la

Producción y el Control de Calidad de la vacuna contra Fiebre tifoidea a base de Porinas

de S. Typhi 9,12,Vi:d para aplicación en humanos (Fase I)1, el cual describe su producción

a partir de un liofilizado de la cepa ATCC 9993 de Salmonella typhi. Como nuestra

producción de cepa semilla se inicio a partir de una conservada en LB-glicerol proveniente

del liofilizado de la cepa ATCC 9993 de Salmonella typhi la metodología se a modificado

de la siguiente forma:

1. De los criotubos ya existentes con la cepa (conservada en LB - glicerol) tomar 100

μl e inocularlos en un tubo con 15 ml de medio LB líquido esterilizado previamente

durante 20 min/15 lb/m2.

2. Incubar el tubo inoculado a 37oC/120rpm/ Toda la noche no importa que se quede

más de las 3 horas que es cuando alcanza su fase log, porque solamente es el

preinoculo.

3. En condiciones asépticas inocular 1L de medio LB con el tubo del preinoculo.

4. Incubar a 37oC/120rpm.

5. Realizar el proceso de curva de crecimiento tomando muestra cada hora y

deteniendo el crecimiento cuando la abs llegue a 1 +-0.05.

6. Vaciar el cultivo en botellas Nalgene® para centrifugar estériles.

7. Centrifugar a 7000 rpm / 4 h / 10 min.

8. Repetir el paso 7 hasta obtener el botón con toda la biomasa.

9. Resuspender cada botón con 5 ml de medio LB – glicerol 20% y homogenizar.


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10. Juntar las suspensiones en una botella, hogenizar y hacer alícuotas de 1.5 ml en

criotubos.

11. Conservar a -70oC.

P-2. PREPARACIÓN DE INOCULO

Para preparar el inóculo se tomo un vial de 1.5 ml de S. Typhi conservado en glicerol a

una temperatura de 70oC. Para el caso del cultivo en el biorrector (4L) se utilizaron 40 ml

de solución salina y estos se pasaron a un matraz de 1L con 400 ml del MMA. Este se

colocó en el agitador orbital (Innova 4000 New Brunswick Scientific).

Al matraz con el MMA se le extrajo una muestra de 4 ml para leer densidad óptica a 540

nm y tomarlo como blanco de referencia para el desarrollo de las células en el matraz. Se

tomaron muestras cada media hora hasta alcanzar una lectura de 1 aproximadamente, se

sacaba del agitador y se preparaba para vaciar en el Bioflo II-C®.

P-3. PRUEBA DE ESTERILIDAD

El biorreactor se colocaba en la base de su consola después de haberse enfriado lo

suficiente como para poder cambiarlo de lugar; del autoclave a su base.

Se conectan las mangueras del aire, del detector de temperatura, las mangueras con

agua de enfriamiento y se ajustan las condiciones como se menciono anteriormente en el

manejo del biorreactor.

El biorreactor se enciende y se establecen los parámetros de la fermentación (aire: 1

VVM, temperatura: 37 oC, Agitación: 200rpm). Se deja funcionando durante 24 horas para

comprobar que no exista presencia de microorganismos causando contaminación al

medio de cultivo.


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P-4. COSECHA DE BIOMASA

Los matraces con caldo de cultivo se tomaron uno por uno y el tratamiento que se siguió

en cada caso fue el siguiente:

1. Se vaciaban aproximadamente 200 ml del caldo en frascos nalgene®.

2. Se balanceaban por pares en una balanza granataria de 2 platos (ohaus), cada

vez se hacían tres pares.

3. Se colocaban en el rotor de la centrífuga.

4. Se tapa y rosca el rotor y se cierra la centrífuga.

5. Se ajusta a 7000 revoluciones y a un tiempo de 10 minutos (15 en total; 10 en

7000 y 5 en aceleración) con un rango de temperatura de 2 oC a 5 oC.

6. Los paquetes celulares se juntan en un solo tubo nalgene® y se repite la

operación con los frascos vacíos y más caldo de cultivo.

7. Una vez concentrado todo el caldo de cultivo se procedió a lavar la biomasa con

una solución de Tris-HCl 7.7%, 200 ml en cada frasco con biomasa concentrada,

se hacen dos lavados y siempre se tira el sobrenadante.

8. El paquete celular final obtenido se colecta en un matraz aforado de 500 ml con

Tris-HCl 7.7% y se guarda a una temperatura de 4 oC en el cuarto frío.

P-5. MÉTODO DE NIKAIDO

EstE consiste en varios pasos de ultracentrifugación que se mencionan a continuación.

Material:

8 Tubos para centrífuga Nalgene® de 70 ml.

Solución Tris-HCl 7.7-con dodecíl sulfato de sodio al 2% (SDS 2%)

Dos mecheros Fisher

Solución Nikaido-SDS 1%

Ultracentrífuga (Sorvall 80, Dupon)

Rotor de Ultracentrífuga para tubos de 70 ml.


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Paso No.1

En área de esterilidad se vacía el producto de la ruptura celular y se centrifugó a 7000

rpm por 20 min y 4oC en un tubo nalgene® de 200 ml, el paquete celular se desecha y se

conserva la fracción que no sedimento (sobrenadante).

Paso No. 2

En área de esterilidad se vacían 20 ml de suspensión en un homogenizador, se

homogeniza perfectamente y se llenan los tubos nalgene® para ultracentrifugación con el

homogenizado (se utilizó Tris-HCl- SDS 2%) y a 4oC. Se colocan dentro del rotor y este se

inserta en el eje de rotación de la centrífuga, se maneja una velocidad de 45 000 rpm

durante 45 minutos (se adicionan 8 minutos para que alcance en este tiempo la velocidad

programada) a una temperatura de 4oC. Al finalizar la centrifugación se desecha el

sobrenadante y conservamos el botón.

Paso No. 3

El paquete celular se resuspende en solución A y se homogeniza. El paquete celular

homogenizado en solución A se incuba por 30 minutos a 32oC y 120 rpm. Después de la

incubación se llenan perfectamente los tubos de centrífuga sin que queden burbujas, se

colocan en el rotor y se centrifugan a 40 000 rpm durante 30 minutos a 20oC, al final del

tiempo se sacan los tubos y en condiciones de esterilidad se vacía el sobrenadante en un

matraz con los restos de las anteriores purificaciones (este se aparta para después

esterilizarse), el paquete celular se resuspende en 20 ml de solución A y se vierte en un

homogenizador de vidrio estéril, se homogeniza hasta que no se distingan partículas ni

aglomerados, la solución A queda un poco turbia después de este procedimiento, el

homogenizado se vació de nuevo en el tubo y se procede con el siguiente paso del

método de Nikaido.

Paso No. 4

La solución A que contiene al paquete celular anterior se coloca en el rotor y se inserta en

la ultracentrífuga, la velocidad en esta ocasión es de 40 000 rpm durante 30 minutos a


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20oC. Se tira el sobrenadante en el matraz de residuos y el paquete celular se resuspende

y se homogeniza como en los pasos anteriores.

Paso No. 5

En el último paso del método de Nikaido se utiliza una velocidad de 45 000 rpm por un

tiempo de 45 minutos con solución Nikaido-SDS 1%, al término de la operación el paquete

celular se elimina y se conserva el sobrenadante que contiene a las proteínas de

membrana externa.

Paso No. 6

El sobrenadante del último paso se coloca en una celda de cuarzo previamente

desinfectada con cloro, cloruro de benzalconio y limpiada con agua estéril, se cubre con

un papel parafilm® y se mide su absorción a una longitud de onda de 260nm y 280nm, las

lecturas se anotan y esta es la concentración en densidad óptica de la porina.

O-1. BIORREACTOR

La bacteria se cultivo en un biorreactor de 6.7 L (Bioflo II-C, New Brunswick Scientific).

Con las siguientes características generales:

Vasija de vidrio con acero inoxidable con fondo hemisferico enchaquetado.

Capacidad total: 6.7 L

Máxima capacidad de trabajo: 5.0 L

Dimensiones: 17.0 cm x 31.7 cm

Entradas: 4 puertas laterales montadas para adición

de medio. Requerimientos eléctricos: 120

Volts/60 Hz Unifase

Presión máxima de aire: 10 psig

Presión máxima de agua: 30 psig

Rango de agitación: 25 – 1000 (+/- 1 rpm)

Rango de temperatura: 20 oC – 60 oC (+/- 0.5 oC)

Proporción de transferencia de oxígeno:


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350 mMO2 /L/h

Rango de pH: 2.0 – 12.0

Normalmente la temperatura y el pH son controlados automáticamente por el biorreactor.

Los parámetros 37 oC / pH = 7 / 200rpm.

Las condiciones de operación del biorreactor para llevar a cabo el cultivo bacteriano se

ingresan en el sistema de mando del biorreactor usando los botones de selección y modo

en el tablero frontal. El de aire al biorreactor se controla por el rotametro que tiene

integrado en el mismo tablero. El volumen del funcionamiento del reactor es

aproximadamente 4L.

O-2. ESTERILIZACIÒN DEL BIORREACTOR

Para llevar a cabo la esterilización se procedió a llenar el vaso del biorreactor con el

medio de cultivo previamente preparado, sin adicionar sales de magnesio, ni la glucosa,

estos se esterilizan aparte. Una vez llenado el vaso del reactor se tapan todas las salidas

y entradas que se tienen cuando se desconecta de la consola, estas son:

1 La entrada del condensador

2 Entrada de aire (esta dispone de un filtro de 0.22 micras de poro)

3 La alimentación del medio de cultivo.

4 El puerto de cosecha.

Se debe de tener cuidado de no dejar la llave de toma de muestra abierta pues el medio

al esterilizarse hierve y aumenta la presión interna, esto provoca que al intentar

compensar las presiones busque cualquier salida aún cuando esta se encuentre por

arriba del nivel del medio, es por eso que el puerto de muestreo debe permanecer cerrado

durante la esterilización.

Las condiciones del cultivo se mantienen controladas automáticamente por el sistema

integrado de control de aparato, la temperatura se mantuvo a 37 oC ( el control es por

adición de agua calentada por una resistencia interna y flujos de agua corriente). Como se

menciono no se realizo el control de pH.

Colín Cossio Dulce María de Lourdes

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