DESARROLLO DE UN MÉTODO PARA EL ANÁLISIS … · diseño factorial fraccionado del tipo 27-3 a dos...
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REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD DE INGENIERÍA DIVISIÓN DE POSGRADO PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIAS DEL AMBIENTE DESARROLLO DE UN MÉTODO PARA EL ANÁLISIS DE NONILFENOL Y OCTILFENOL EN MUESTRAS DE AGUA Trabajo de Grado presentado ante la Ilustre Universidad del Zulia Para optar al Grado Académico de MAGISTER SCIENTIARUM EN CIENCIAS AMBIENTALES Autor: Lcda. Yaritza Guanipa Tutor: Dr. Avismelsi Prieto Co- Tutora: Dra. Lilia Araujo Maracaibo, julio 2012
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REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA
UNIVERSIDAD DEL ZULIA
FACULTAD DE INGENIERÍA
DIVISIÓN DE POSGRADO
PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIAS DEL AMBIENTE
DESARROLLO DE UN MÉTODO PARA EL ANÁLISIS DE
NONILFENOL Y OCTILFENOL EN MUESTRAS DE AGUA
Trabajo de Grado presentado ante la
Ilustre Universidad del Zulia
Para optar al Grado Académico de
MAGISTER SCIENTIARUM EN CIENCIAS AMBIENTALES
Autor: Lcda. Yaritza Guanipa
Tutor: Dr. Avismelsi Prieto
Co- Tutora: Dra. Lilia Araujo
Maracaibo, julio 2012
Guanipa, Yaritza Josefina. Desarrollo de un método para el análisis de nonilfenol y
octilfenol en muestras de agua. (2012). Trabajo de Grado. Universidad del Zulia. Facultad
de Ingeniería. División de Posgrado. Laboratorio de Análisis Químico-Electroquímico,
Maracaibo-Venezuela. 90 p. Tutor: Dr. Avismelsi Prieto. Cotutor: Dra. Lilia Araujo
RESUMEN
El nonilfenol y octilfenol son contaminantes ambientales, que actúan como disruptores
endocrinos, se originan de la biodegradación de los alquilfenoles etoxilados. Estos son
ampliamente usados en la industria, la agricultura y en aplicaciones domésticas, en
consecuencia, el nonilfenol y el octilfenol, son liberados continuamente al ambiente en las
aguas residuales municipales e industriales. En este estudio, se desarrolló una nueva
metodología analítica para el análisis y cuantificación de residuos de octilfenol y nonilfenol
en muestras de agua a niveles trazas, mediante microextracción en fase liquida con gota
suspendida, silanización y cromatografía de gases-espectrometría de masas. Se realizó un
diseño factorial fraccionado del tipo 27-3
a dos niveles, para estudiar la influencia de las
variables experimentales: efecto salino, pH, velocidad de agitación, tiempo de extracción,
volumen de derivatizante, tiempo y temperatura de derivatización. Para establecer las
condiciones óptimas de las variables que resultaron significativas, se realizó un diseño de
Box- Behnken de superficie de respuesta. El método presentó una buena correlación lineal,
0,9959 para octilfenol y 0,9843 para nonilfenol, para un rango de concentración de 0,1 a 20 y
0,5 a15µg/L para octilfenol y nonilfenol respectivamente. Los límites de detección fueron
0,0048 µg/L para el octilfenol y 0,036 µg/L para el nonilfenol, mientras que los límites de
cuantificación se ubicaron en 0,016 y 0,12µg/L para cada analito respectivamente. El método
fue validado para muestras de agua proveniente del lago de Maracaibo, encontrándose
porcentajes de recuperación entre 80,6 y 109,9%. El método desarrollado es de adecuada
sensibilidad, rápido, económico, sencillo y amigable con el ambiente, por esto es
recomendado para el análisis de octilfenol y nonilfenol en muestras de agua.
Palabras Claves: alquilfenoles, nonilfenol, octilfenol, microextracción con gota suspendida, derivatización, cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), muestras de agua.
Correo electrónico del autor: [email protected]
Guanipa, Yaritza J. “Development of a method for the analysis of nonylphenol and
octylphenol in water samples. (2012). Trabajo de Grado. Universidad del Zulia. Facultad de
Ingeniería. División de Postgrado. Maracaibo Laboratorio de Análisis Químico-
Electroquímico, Maracaibo-Venezuela. 90 p.Tutor: Dr. Avismelsi Prieto. Cotutor: Dra. Lilia
Araujo
ABSTRACT
Nonylphenol, octylphenol are environment contaminant with endocrine disrupting activities
coming up from the biodegradation of ethoxylates alkylphenols. They have been largely used
in industrial, agricultural, and domestic applications, consequently the nonylphenol and
octylphenol are continually discharged industrial and municipal wastewater into the
environment. This study developed a new method to analysis and quantifies of trace amounts
of nonylphenol, octylphenol in water samples, by single drop liquid-phase microextraction,
silylation and gas chromatography-mass spectrometry. A factorial fraccionated design of type
27-3
at two levels was performed, to study the influence of experimental variables: salt effect,
pH, stirring rate, extraction time, silylating reagent volume, time and temperature for
derivatization. To establish the optimal conditions for the variables that were significant, a
Box-Behnkan design response surface was performed. The method showed a good linear
correlation, 0,9959 for octylphenol and 0,9843 for nonylphenol, for a concentration range
from 0,1 to 20 µg/L and 0,5 to 15 µg/L respectively. Detection limits were 0,0048 µg/L to
octylphenol and 0,036 µg/L to nonylphenol. while quantification limits were 0,016 and 0,12
µg/L for each analyte respectively. Method developing was validated for water sample fron
Maracaibo lake and found a recuperation varying from 80,6% to 109.9%. This method figures
out as simple, fast, economic, sensitive and environment friendly and; very high recommend
for octylphenol and nonylphenol analysis in water samples.
Key words:alkylphenols, nonylphenol, octylphenol, single drop microextraction.
e-mail: [email protected]
AGRADECIMIENTO
A Usted Dios Padre, por darme la fortaleza que me permitió el desarrollo y culminación
de esta etapa de mi vida profesional.
A la Facultad de Ingeniería de la Universidad del Zulia, por darme la oportunidad de seguir
creciendo profesionalmente.
Al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico (CONDES), a la Oficina de Planificación
del sector Universitario (OPSU) y la División de Investigación de la facultad de Ingeniería.
A los tutores: Dr. Avismelsi Prieto y Dra. Lilia Araujo, por su valiosa asesoría,
dedicación, paciencia y apoyo incondicional.
Al prof. Dr. Gilberto Colina por su dedicación a la evaluación de este trabajo y por sus
valiosos aportes.
A todos los profesores de la Maestría Ciencias Ambientales, por sus enseñanzas.
A mis hijos: Carlos Daniel, Carlos Arturo y Carlos Javier, quienes a pesar de sus cortas
edades me han brindado su comprensión, amor y apoyo.
A todos mis familiares por su cariño y apoyo.
A los profesores: Dalia Cubillán, Gerardo Aldana, María Elena Troconis, por sus valiosos
aportes y gran AMISTAD.
A mis compañeros y amigos profesores: Nuris Camargo, Noreiva Villa, Jean Portillo, Teiddy
Mesa, Paola Valle, Nelly Prieto, Gisela López, Jair Mercado, por su colaboración, apoyo
incondicional, palabras de aliento y simplemente por estar conmigo.
A todos, les estoy muy AGRADECIDA…..
DEDICATORIA
A mis hijos:
Carlos Daniel, Carlos Arturo y Carlos Javier,
Quienes son mi razón de vida y lucha….
TABLA DE CONTENIDO
Página
RESUMEN……………………………………………………………………………... 4
ABSTRACT……………………………………………………………………………. 5
AGRADECIMIENTO ………………………………………………………………… 6
DEDICATORIA………………………………………………………………………. 7
TABLA DE CONTENIDO……………………………………………………………. 8
LISTA DE TABLAS ………………………………………………………………….. 10
LISTA DE FIGURAS…………………………………………………………………. 11
INTRODUCCION…………………………………………………………………….. 13
CAPITULO I. FUNDAMENTOS TEORICOS……………………………………….. 15
1.1. Generalidades sobre los alquilfenoles……………………………………………… 15
1.1.1. Nonilfenol…………………………………………………………………… 15
1.1.2. Octilfenol……………………………………………………………………. 16
1.1.3. Alteradores endocrinos……………………………………………………… 17
1.1.4. Liberación y rutas de los alquilfenoles en el ambiente……………………… 18
1.1.5. Exposición y efectos tóxicos………………………………………………… 18
1.1.6. Legislación…………………………………………………………………... 21
1.1.7. Síntesis de los alquilfenoles…………………………………………………. 23
1.2. Métodos de análisis de alquilfenoles……………………………………………… 26
1.2.1. Métodos utilizando cromatografía de gases……………………………….. 26
1.2.2. Métodos empleando cromatografía liquida………………………………… 28
1. 3. Cromatografía de gases-espectrometría de masas………………………………... 30
1. 4. Derivatización en cromatografía de gases………………………………………... 31
1.4.1. Ventajas de la derivatización………………………………………………. 32
1.4.2. Métodos de derivatización ………………………………………………… 33
1.5. Microextración en fase líquida……………………………………………………. 35
1.5.1. Microextracción en fase líquida con gota suspendida por inmersión)……... 35
1.5.2. Microextracción en fase líquida con gota suspendida en el modo
headspace . ……………………………………………………………………….
37
1.5.3. Microextracción en fase líquida con gota suspendida en flujo continuo…. 37
1.5.4. Parámetros que afectan a la microextracción en gota suspendida…………. 38
1.6. Diseño de experimento factorial………………………………………………………….. 41 1.7. Diseño de experimento superficie de respuesta…………………………………………… 42 1.8. Validación de un método analítico………………………………………………………… 43
1.8.1.Especificidad……………………………………………………………….. 43 1.8.2. Linealidad…………………………………………………………………………. 44 1.8.3. Exactitud…………………………………………………………………………… 44 1.8.4. Precisión…………………………………………………………………………… 45 1.8.5. Intervalo de validez………………………………………………………………… 46 1.8.6. Límites de detección y cuantificación……………………………………………… 46
CAPITULO II. MARCO METODOLÓGICO…………………………………………. 48
2.1. Reactivos y soluciones…………………………………………………………... 48
2.1.1. Soluciones patrón…………………………………………………………. 48
2.1.2. Solución del patrón del estándar interno…………………………………... 48
2.1.3. Reactivo derivatizante…………………………………………………….. 48
2.1.4. Reactivos y gases empleados…………………………………………….. 48
2.2. Materiales de laboratorio instrumentación y programas ………………………… 48
2.2.1. Instrumentos……………………………………………………………….. 48
2.2.3. Material de laboratorio……………………………………………………… 49
2.2.4. Programas 49
2.3. Procedimiento experimental 50
2.3.1. Caracterización de octilfenol y nonilfenol mediante cromatografía de
gases - espectrometría de masas………………………………………………….. 50
2.3.2. Optimización de las variables estudiadas…………………………………. 50
a.- Microextracción con gota suspendida y reacción de derivatización………… 51
b.- Optimización de los parámetros experimentales de la microextracción con
gota suspendida y de la reacción de derivatización……………………………… 51
c.- Diseño superficie de respuesta de Box Behnken……………………………… 52
2.4. Aplicación y validación del método propuesto…………………………………… 55
2.4.1. Curvas de calibración………………………………………………………. 55
2.4.2. Estudio de recuperación……………………………………………………. 55
2.4.3. Parámetros de calidad del método analítico………………………………... 55
2.4.4. Aplicación del método analítico…………………………………………… 56
CAPITULO III RESULTADOS Y DISCUSIÓN ……………………………… 58
3.1. Caracterización de los derivados silanizados del octilfenol y nonilfenol mediante
cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)…………………………………..
58
3.2. Optimización de los parámetros experimentales de la microextracción con gota
suspendida y de la reacción de derivatización………………………………………… 61
3.3. Validación y aplicación del método analítico…………………………………….. 77
3.3.1. Curva de calibración……………………………………………………….. 77
3.3.2. Parámetros de calidad del método analítico………………………………… 79
3.3.3 Estudio de recuperación …………………………………………………….. 80
3.3.4. Aplicación del método desarrollado en muestras de agua del lago de
Maracaibo………………………………………………………………………… 81
CONCLUSIONES…………………………………………………………………… 83
RECOMENDACIONES…………………………………………………………….. 84
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………………. 85
LISTA DE TABLAS
Tabla Página
1 Condiciones utilizadas para la cromatografía de gases-
espectrometría de masas………………………………………….
51
2 Resumen de las variables con sus niveles altos y bajos…………. 52
3 Matriz de optimización codificada para diseño factorial 27-3
….. 53
4 Matriz de optimización codificada para el diseño Box Behnken.. 54
5 Resumen de los factores y diferentes niveles para el diseño de
Box Behnken……………………………………………………..
54
6 Tiempos de retención y fragmentos de masa para OP y NP……. 61
7 Resultados del diseño diagnostico factorial fraccionado 27-3
…. 63
8 Análisis estadístico de varianza (ANOVA) para octilfenol……. 65
9 Analisis de varianza ANOVA para el nonilfenol……………… 66
10 Resultados del diseño Box-Behnken ………………………….. 67
11 Analisis de varianza de los efectos principales de Octilfenol
(Box-Behnken)…………………………………………………..
68
12 Análisis estadístico de varianza (ANOVA) para nonilfenol (Box-
Behnken)…………………………………………………………
73
13 Resultados obtenidos de la optimización de las condiciones
experimentales del método analítico empleando la
microextracción con gota suspendida con reacción de
derivatizaciòn……………………………………………………
77
14 Parámetros estadísticos de las curvas de calibración para la
extracción liquido-liquido con gota suspendida…………………
79
15 Parámetros de calidad del método analítico……………………. 79
16 ValoValores de recuperación para el octilfenol en muestras de agua
del l del lago de Maracaibo………………………………………….
80
17 Val Valores de recuperación para el nonilfenol en muestras de agua
del l del lago de Maracaibo…………………………………………..
81
19 Resultados de la cuantificación de los analitos en las muestras ..
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
1 Estructura molecular del Nonilfenol………………………………. 15
2 Estructura molecular del Octilfenol……………………………….. 16
3 Concentración máxima permisible para nonilfenol y octilfenol….. 22
4 Reacción de fenol con cloroparafina………………………………. 23
5 Reacción de dímero de isobutileno con fenol para producir ter-
octilfenol…………………………………………………………..
25
6 Proceso de dos etapas para la etoxilación de un alquilfenol………. 29
7 Detector de masa de cuadrupolo………………………………….. 32
8 Reacción general de silanización…………………………………… 35
9 Representación esquemática del método de microextracción con
gota suspendida introducido en 1996……………………………….
36
10 Representación del diseño de Box-Behnken 44
11 Ubicación geográfica de los puntos de muestreo…………………... 57
12 Cromatograma obtenido experimentalmente para el derivado
silanizado del octilfenol……………………………………………..
58
13 Espectro de masa obtenido experimentalmente del derivado
silanizado de octilfenol……………………………………………...
58
14 Espectro de masa del derivado silanizado del octilfenol de
referencia…………………………………………………………….
59
15 Cromatograma obtenido experimentalmente para el derivado
silanizado del nonilfenol…………………………………………….
60
16 Espectro de masa obtenido experimentalmente del derivado
silanizado del nonilfenol……………………………………………
60
17 Espectro de masa del derivado silanizado del nonilfenol de
referencia…………………………………………………………..
61
18 Gràfica de pareto de los efectos estudiados a partir del diseño
factorial fraccionado 73-1
para Octilfenol…………………………..
65
19 Representación del diseño de Box-Behnken………………………. 66
20 Influencia de los factores principalesen en la respuesta del
octilfenol (Box-Behnken)…………………………………………..
68
21 Influencia factores principales para nonilfenol (Box-Behnken)…... 70
22 Gráfica obtenida del diseño de Box-Behnken para el efecto de la
concentración de NaCl vs. velocidad de agitación. para octilfenol:
a) Superficies respuesta b) Contorno superficie respuesta…………
71
23 Gráfica obtenido del diseño de Box-Behnken para el efecto de la
concentración de NaCl vs. Volumen de derivatizante. para
octilfenol: a) Superficie respuesta b) Contorno superficie respuesta..
73
24 Gráfica obtenida del diseño de Box-Behnken para el efecto de
velocidad de agitación vs.volumen de derivatizante de .octilfenol:
a) superficie respuesta b) Contorno superficie respuesta……………
73
25 .Gráfica obtenido del diseño de Box-Behnken para el efecto de la
concentración de NaCl vs. Volumen de derivatizante de nonilfenol:
a) superficie respuesta b) Contorno superficie respuesta……………
74
26 Gráfica obtenida del diseño de Box-Behnken para el efecto de la
concentración de NaCl vs.velocidad de agitación para nonilfenol:
a) superficie respuesta b) Contorno superficie respuesta……………
74
27 Gráfica obtenida del diseño de Box-Behnken para el efecto de la
velocidad de agitación vs. Volumen de derivatizante. para
nonilfenol: a) superficie respuesta b) Contorno superficie respuesta.
75
28 Curva de calibrado del octilfenol…………………………………. 78
29 Curva de calibrado del octilfenol………………………………… 78
INTRODUCCIÓN
A partir de los años cuarenta, con el uso de plaguicidas en las actividades agrícolas y otros
productos químicos en actividades industriales, se inicia la liberación continua de sustancias
químicas al ambiente (1), muchas de ellas, con alto potencial para perturbar el sistema endocrino
de los animales. A este tipo de sustancias se le ha denominado disruptores endocrinos, definido
como un conjunto diverso y heterogéneo de compuestos químicos capaces de alterar el equilibrio
hormonal (2). Estos pueden originar múltiples efectos adversos, como la feminización de peces, la
pérdida de capacidad reproductiva, defectos congénitos y en ocasiones se ha relacionado con el
origen de algunos tipos de cáncer en el ser humano.
Los disruptores endocrinos son muy diversos y se encuentran repartidos por todo el mundo
como consecuencia de su empleo generalizado. Estos pueden ser transportados a otros lugares por
el aire, el agua y la bioacumulación en la cadena trófica, siendo la vía digestiva la principal ruta de
exposición para el hombre. Además, los compuestos acumulados en la grasa son transmitidos a la
descendencia a través de la madre durante la gestación y después de la lactancia.
Aunque los disruptores endocrinos pueden ser de origen natural, los introducidos por el
hombre son los que más preocupan a organismos internacionales por su perjuicio sobre los
ecosistemas y la vida salvaje. Existe un amplio y diverso grupo de compuestos químicos que están
considerados como disruptores endocrinos tales como; alquilfenoles, ftalatos, organoclorados y
bisfenol, presente en plásticos, cosméticos y detergentes.
El nonilfenol y el octilfenol, son alquilfenoles productos de la degradación de los alquilfenoles
polietoxilado (APE), estos son muy utilizados como productos industriales y domesticos, por
ejemplo, como antioxidantes, surfactantes en la síntesis de detergentes, en la industria textil y
papelera, en la fabricación de productos de limpieza y también como espermicidas.
El octilfenol etoxilados y nonilfenol etoxilados son dos de los surfactantes más vendidos; que
una vez utilizados, son desechados en el agua, siendo en algunos casos liberados al medio ambiente
sin tratamiento alguno. La degradación primaria de estos compuestos, en las plantas de tratamiento
de aguas residuales o en el ambiente, genera alquilfenoles etoxilados de cadenas más cortas, y
alquilfenoles, tales como el nonilfenol y octilfenol que además de imitar a las hormonas son más
persistentes que su precursor etoxilado (56).
EL lago de Maracaibo, frecuentemente se encuentra sometido al vertido de aguas residuales
de origen domestico e industrial; lo que lleva a pensar que pudiera encontrarse altas
concentraciones de nonilfenol y octilfenol en sus aguas. Actualmente en Venezuela no se cuenta
con información acerca de las concentraciones de tales sustancias en los cuerpos de agua, y no se
han implementado normas y leyes que regulen la concentración de las mismas en los vertidos de
aguas residuales.
Esta situación crea la necesidad de diseñar a corto plazo, técnicas o métodos que faciliten la
determinación de dichos analitos, que sean económicos, rápidos y confiables. La finalidad de esta
investigación es desarrollar un método para la determinación de residuos de alquilfenoles en
muestras de agua, mediante la técnica de microextracción con gota suspendida, cromatografía de
gases – espectrometría de masa.
El producto que se generará en esta investigación, permitirá contar con un nuevo método de
análisis para detectar los analitos mencionados a niveles aproximados de µg/L, en muestras de
agua, lo cual facilitará a los organismos competentes la toma de decisiones sobre la normativa que
debe aplicarse y a las empresas generadores del contaminante, sobre los tratamiento que deben
aplicarse a sus efluentes.
El nuevo método desarrollado, será aplicado a muestras de agua del lago de Maracaibo
específicamente de la zona del estrecho en las cercanías de los vertidos industriales.
CAPÍTULO I
FUNDAMENTO TEÓRICO
1.1. Generalidades de los alquilfenoles objeto de estudio
Los alquilfenoles, son compuestos sencillos, productos de la degradación microbiana de
los alquilfenoles polietoxilados (APE), estos son muy utilizados como productos industriales
y domésticos, por ejemplo, como antioxidantes, surfactantes en la síntesis de detergentes, en
la industria textil y papelera, en la fabricación de productos de limpieza y también como
espermicidas. Las formulaciones industriales están compuestas generalmente por mezclas en
las que los principales alquilfenoles usados, son nonilfenol y octilfenol etoxilado, cuya
longitud de la cadena varían entre 1 y 50 unidades dependiendo de la aplicación.
El nonilfenol (NP) y el octilfenol (OP) son considerados importantes disruptores
endocrinos, son relativamente persistentes y se acumulan en el hígado y en el tejido adiposo de
los organismos vivos. Están presente en los sedimentos acuáticos y en la superficie de las
aguas. Debido a su empleo generalizado y a la frecuencia de su presencia medioambiental, la
exposición humana y animal es un hecho bien documentado en la actualidad (2). Se ha
demostrado que los alquilfenoles son estrogénicos, siempre y cuando la cadena alquílica tenga al menos
cuatro átomos de carbono en posición para con respecto al grupo hidroxilo (51-52).
1.1.1.- Nonilfenol
Es un producto de la degradación del tensoativo no iónico nonilfenol etoxilado, es considerado un
disruptor endocrino altamente toxico en el medio ambiente (3).
Nomenclatura Química: Nonilfenol (mezcla de isómeros). Dimetilheptilfenol (mezcla de
isómeros) C6H4OHC9H19.
OH
C9H19
Figura 1. Estructura molecular del Nonilfenol
Propiedades físicas: líquido amarillo pálido. Ligero olor a fenol. Punto de ebullición: 293-
297 °C. Solubilidad en agua: ligeramente soluble en agua.
Principales usos: es ampliamente utilizado en la preparación de detergentes para productos
de limpieza, tintorería, limpiadores abrasivos, lustradores de plata , detergentes para
automóviles, limpiadores para superficies duras.
Toxicidad: su inhalación, ingestión o contacto con piel y ojos, puede ocasionar severos
daños al organismo. Muy tóxico para los organismos acuáticos.
Medios de primeros auxilios: en caso de inhalación se debe proporcionar aire limpio,
reposo, y asistencia médica. En caso de contacto con la piel se deben quitar las ropas
contaminadas, aclarar la piel con agua abundante y proporcionar asistencia médica. En caso de
contacto con los ojos se debe enjuagar con agua abundante durante varios minutos (quitar los
lentes de contacto, si puede hacerse con facilidad) y proporcionar asistencia médica. En caso de
ingestión enjuagar la boca, no provocar el vómito, beber agua abundante y proporcionar
asistencia médica (4-5).
1.1.2.- Octilfenol
Es un compuesto alquilfenólico, ampliamente utilizado como alquilfenol etoxilado, en la
actualidad es considerado un agente xenobiótico y un disruptor endocrino (4).
Nomenclatura Química: p-tert-Octilfenol. C14H22O
OH C
CH3
CH2
CH3
C
CH3
CH3
CH3
Figura 2. Estructura molecular del Octilfenol
Propiedades físicas: sólido amarillo pálido. Punto de ebullición: 278 °C. Punto de fusión:
77°C Solubilidad en agua: 1.3%.
Toxicidad: causa quemaduras de los ojos y de la piel, irritación en las vías respiratorias,
puede causar efectos nocivos en el sistema nervioso, toxico para organismos acuáticos y puede
ocurrir bioconcentración.
Medios de primeros auxilios: en caso de contacto con la piel se debe retirar la ropa
contaminada, si existe contacto con la piel se debe lavar con abundante agua. En caso de
contacto con los ojos se debe enjuagar con suficiente agua y proporcionar asistencia médicaEn
caso de inhalación se debe llevar a la persona a un lugar con aire fresco, si se dificulta la
respiración se debe proporcionar respiración artificial y buscar asistencia médica. En caso de
ingestión se debe conseguir asistencia médica inmediata, nunca se debe suministrar nada por
vía oral a una víctima inconsciente (7).
1.1.3.- Alteradores Endocrinos
Uno de los efectos más preocupantes que pueden tener los alquilfenoles, es su acción
como alteradores endocrinos. Este tipo de compuestos pueden alterar el sistema hormonal y
por tanto la salud de los organismos vivos al mimetizar el comportamiento de los estrógenos
naturales. Los alteradores endocrinos comprenden desde productos químicos sintetizados por el
hombre hasta sustancias que se encuentran de manera natural en el medio ambiente. Los
alteradores endocrinos pueden actuar sobre el equilibrio hormonal de las siguientes formas:
o Mimetizar la acción de las hormonas.
o Antagonizar la acción de las hormonas.
o Alterar el patrón de síntesis y metabolismo hormonal.
o Modular los niveles de los receptores correspondientes.
Sus efectos varían en función del alterador y del ser vivo, pero existen una serie de
características comunes como son:
o Los efectos de los contaminantes pueden ser distintos sobre el embrión, el feto, el
organismo perinatal, niños o adultos.
o Los efectos se manifiestan con mayor frecuencia en la progenie que en el progenitor
expuesto.
o El momento de la exposición en el organismo en desarrollo es decisivo para
determinar el carácter, la gravedad y su evolución.
o Aunque la exposición crítica tenga lugar durante el desarrollo embrionario, las
manifestaciones pueden no ser evidentes hasta la madurez del individuo.
En cuanto a los efectos que tiene este tipo de compuesto, en los animales están bién
documentado en la actualidad, dentro de estos efectos tenemos (54):
En invertebrados provocan cambios en las características sexuales.
o En peces provocan un funcionamiento anormal del tiroides, reducción de fertilidad,
aparición de características del sexo opuesto.
o En mamíferos provocan reducción de la fertilidad, desarrollo de características
femeninas en los machos y alteración del sistema inmunológico.
o En reptiles provocan reducción en la puesta y desarrollo de características
femeninas.
Entre los posible efectos que pueden ocasionar sobre la salud humana destacan:
disminución de la calidad del esperma, criptorquidismo e hipospadias, cáncer testicular, cáncer
de próstata, cáncer de mama, endometriosis, efectos sobre la fertilidad, efectos sobre la
relación de sexos, efectos sobre la tiroides, efectos neuroendocinos, pubertad adelantada y
obesidad (54)
1.1.4.- Liberación y rutas de los alquilfenoles en el ambiente
Debido a su amplio uso como detergentes, los etoxil-alquilfenoles son liberados al
ambiente principalmente a través de las descargas de aguas residuales industriales y domésticas
e incluso a través de los efluentes de plantas de tratamiento, donde la eliminación de estos
compuestos no suele ser muy eficientes. De esta forma pueden contaminar los cuerpos de agua
superficiales, estuarios, océanos y también los suelos, cuando dichas descargas se emplean para
riesgo o cuando se aplican plaguicidas que los contengan (8). Tanto en el agua como en el
suelo los etoxil-alquilfenoles son degradados por la acción de los microorganismos, generado
sus respectivos alquilfenoles, además de otros metabolitos, los cuales son más persistentes, más
hidrofóbicos y biológicamente más activos (15). Los procesos de biodegradación suelen
reducirse de forma significativa en condiciones anóxicas o anaeróbicas y por la fuerte
tendencia de los alquilfenoles a adsorberse a las partículas de suelo o sedimentos. Se ha
propuesto que estos contaminantes pueden sufrir fotodegradación tanto en agua como en suelo,
pero ésta es generalmente baja en condiciones naturales (14). A pesar de su baja volatilidad,
estos compuestos han sido detectados en el aire urbano, lo cual indica que pueden transferirse a
la atmósfera desde el agua o el suelo contaminados (10). En los suelos contaminados una
pequeña fracción de los alquilfenoles puede lixiviase hasta las aguas subterráneas (14). Estos
compuestos se bioacumulan en diferentes especies acuáticas (peces, algas, aves, moluscos y
crustáceos), de esta forma los alquilfenoles sufren biomagnificación a través de la cadena
alimenticia; no obstante, este proceso puede reducirse por la capacidad metabólica de los
organismos (14). Por otra parte, se ha detectado que los alquilfenoles pueden contaminar el
agua potable al liberarse de los recubrimientos de las tuberías de plástico (10). En la Figura 3
se presenta un esquema de las posibles rutas de contaminaciòn ambiental por alquilfenoles.
1.1.5.- Exposición y efectos tóxicos.
El contacto con los alquilfenoles sólo es posible una vez que se producen en el ambiente,
por ello las principales rutas de exposición en el humano es la ingestión de agua, o alimentos
contaminados. Una ruta menor la constituye la inhalación de aire contaminado en zonas
urbanas o en zonas rurales tras la aplicación de plaguicidas en forma de spray (8-9).
A pesar de que los alquilfenoles han sido reconocidos como disruptores endocrinos, no se
encontraron estudios acerca de los efectos reproductivos de estos contaminantes en humanos.
Los efectos documentados se limitan a las respuestas que ocasiona la exposición a
espermicidas en algunas mujeres, caracterizada por irritación local vaginal y del tracto urinario,
comezón y dermatitis por contracto, así como la exposición a algunos cosméticos y productos
de higiene personal, que pueden producir critema, fotosensibilidad y dermatitis por contacto
(9).
Por otra parte los estudios realizados en animales en condiciones de laboratorios se
enfocan casi exclusivamente a los efectos reproductivos de los etoxil-alquilfenoles y
alquilfenoles. Estos compuestos pueden imitar a los estrógenos (hormonas femeninas),
uniéndose a los receptores de esta forma estimulan la proliferación de células de tumor de seno
sensibles al estradiol y la producción de la proteína femenina vitelogenona en hígado de ratas
truchas macho. Asimismo, disminuyen el peso y tamaño de los testículos y glándulas
accesorias, los niveles de gonadotropinas y testosterona circulantes e interrumpen la
producción de espermas (13) y demás, en las hembras pueden alterar el control en la secreción
de gonadotropinas que controlan el ciclo mestrual.
Los efectos reproductivos de los alquilfenoles han suscitado una gran controversia. Los
puntos controversiales incluyen:1) toxicidad diferente de los distintos congéneres estudiados,
considerados algunos muy tóxicos y otros prácticamente inocuos o de efectos desconocidos; 2)
la mayoría de las evidencias toxicológicas se han derivado de estudios en laboratorio y en
muchos casos se desconoce si los efectos adversos se pueden producir en condiciones
naturales; 3) se considera que las concentraciones de estos contaminantes deben ser varios
órdenes de magnitud mayor para producir los mismo efectos que las hormonas endógenas; 4)
varios de los efectos se han atribuido a los metabolitos de estos compuestos y existe poca
información acerca de las diferencias metabólicas entre especies; 5) en muchas ocasiones se
desconocen las concentraciones ambientales, aunque en algunos cuerpos de agua se estima que
éstas podrían alcanzar los niveles tóxicos de respuestas; 6) en varios casos los organismos se
expusieron a mezclas de compuestos, lo cual dificulta atribuir los efectos adversos a los
alquilfenoles, sobre todo porque dichas mezclas podrían contener otros disruptores endócrinos
y 7) existen múltiples métodos para cuantificar estos de las concentraciones descritas en
distintos estudios (14).
Es importante resaltar que los organismos acuáticos expuestos ambientalmente, en
particular, en diferentes especies de peces, se han realizado múltiples investigaciones para
evaluar los efectos reproductivos de los alquilfenoles.
Entre los efectos tóxicos encontrados se describe hermafroditismo, disminución de la tasa
de crecimiento, aumento en la producción de huevos, tumores y otros desordenes morfológicos
(14). Dichos efectos pueden, en momento dado, alterar la capacidad reproductiva y la
sobrevivencia de algunas poblacinoes expuestas, con las consiguientes alteraciones en el
equilibrio de los ecosistemas.
Los efectos tóxicos de los alquilfenoles han sido estudiados por un gran número de
investigadores entre estos se pueden citar los siguientes:
Ferrara y col., (2004) condujeron una investigación para determinar la contaminación por
alquilfenoles y alquilfenoles etoxilados de crustáceos y peces del mar Adriático (Italia). Se
analizaron ocho especies comestibles de mar, donde se encontraron altas concentraciones de
estos compuestos, lo que permite estimar que la ingesta diaria de octilfenol, nonilfenol y
octilfenoles etoxilados es aproximadamente de 12-0,1 μg por día a lo largo de la costa
Adriática (15).
Ademollo y col., (2008) investigaron la presencia de octilfenol y nonilfenol en la leche
materna, donde se determino que el nonilfenol fue el contaminante encontrado a mayor nivel
de concentración media con 32 ng/ml, luego el octilfenol con 0,08 ng/ml. También se estudio
una correlación positiva entre el consumo de pescado y los niveles de nonilfenol en la leche
materna, lo que evidencia que el pescado constituye una de las fuentes más importantes de la
exposición a este grupo de contaminantes en Italia (16).
Andreu y col., (2007) determinaron cuantitativamente el octilfenol, nonilfenol,
alquilfenoles etoxilados y etoxilatos de alcohol mediante extracción liquida presurizada y
cromatografía liquida-espectrometría de masa en suelos tratados con lodos de aguas residuales.
De los datos obtenidos a partir de las muestras de suelo se demostró que los compuestos están
presentes en niveles de posible riesgo y se llego a la conclusión de la presencia de tensioactivos
no iónicos en el suelo (17).
Michelangeli y col., (2008) estudiaron los requisitos estructurales de los alquilfenoles para
sus efectos adversossobre las bombas de Ca2 +
, homeostasis del Ca2+
y viabilidad de las
células de Sertoli TM4. Encontraron que para todos los alquilfenoles se observó inhibición de
la bomba de Ca2+
y la hidrofobicidad, también se determinó que los alquilfenoles causan
elevaciones anormales intracelulares [Ca2+
] en las células de Sertoli TM4 (células implicadas)
en la maduración de los espermatozoides), despolarizan sus mitocondrias e inducen a la muerte
celular(18).
Isidori y col., (2006) desarrollaron un estudio de la toxicidad en los crustáceos y la
actividad de lo disruptores endocrinos en saccharomyces cerevisiae de ocho alquilfenoles. Los
resultados mostraron que la exposición de los crustáceos a los ocho xenoestrógenos causaba
efectos agudos y crónicos y la actividad toxica se observa a largo plazo (19).
1.1.6.- Legislación
A pesar que la toxicidad del nonilfenol y el octilfenol a quedado claramente demostrada en
la mayoría de los países no existe legislación con respecto a las concentraciones máximas
permitidas de estos contaminante, solo la Union Europea a establecido normas de calidad
ambiental para el nonilfenol (NP) y el octilfenol (OP).
En 1998, la reunión ministerial del Convenio sobre protección del medio marítimo del
Nordeste Atlántico (Convenio OSPAR) acordó el cese de todas las emisiones de NP y
nonilfenol etoxilado (NPE) antes de 2020.
Como consecuencia, la UE incluyó este compromiso en su Directiva Marco del Agua
(2000/60/CE, DMA), que establece el cese o eliminación progresiva de los vertidos, las
emisiones y las pérdidas de sustancias peligrosas prioritarias en un plazo no superior a los
veinte años, con el objetivo último de conseguir concentraciones próximas a cero en el medio
marino. El nonilfenol fue identificado como sustancia peligrosa prioritaria en 2001 (Decisión
nº 2455/2001/CE).
En 2003 la UE prohibió la comercialización y la mayoría de los usos de NP y NPE, como
tales o en preparados con un contenido superior al 0,1 % (Directiva 2003/53/CE). Quedan
excluidos de la prohibición los usos industriales que puedan garantizar que sus emisiones al
medio ambiente no son intencionadas. La presencia de NP o NPE en productos acabados, por
ejemplo, que pueden haberse importado de regiones en las que no se aplican este tipo de
restricciones, también escapan al control de esta prohibición. En 2006 se adoptó una nueva
reforma de la política de seguridad química en la UE: REACH (Reglamento nº 1907/2006/CE),
que establece la obligación general de que las empresas sustituyan las sustancias
extremadamente preocupantes por alternativas más seguras. Se trata de sustancias químicas que
suponen un riesgo por sus propiedades intrínsecas, es decir, que podrían acumularse en el
medio ambiente o causar daños irreversibles.
En 2008 la UE estableció Normas de Calidad Ambiental (NCA) para sustancias
prioritarias según la DMA, incluyendo todas las sustancias peligrosas prioritarias según la
Directiva 2008/105/CE. La NCA para el NP y OP se fijó en 0,3 y 0,1µg/Lde media anual y en
2,0 y 0.01µg/l de concentración máxima permitida respectivamente (50). En la Figura 3 se
presenta informacion acerca de la concentracion máxima permisible para NP y OP.
Figura 3. Concentraciones máxima permisibles para nonilfenol y octilfenol según las normas
de calidad ambiental para sustancias prioritaria según la Union Europea.
1.1.7.- Síntesis de los alquilfenoles
Los alquilfenoles se producen por dos métodos, dependiendo del tipo de materia prima
disponible. La primera vía consiste en producir cloroparafinas en las cuales el átomo de cloro
está distribuido aleatoriamente. Luego, como se muestra en la Figura 4, se hace reaccionar la
cloroparafina con el fenol en presencia de un catalizador de tipo Friedel - Crafts. Con n-
parafinas se obtienen así alquilfenoles con cadena alquilo lineal y por lo tanto fácilmente
biodegradable.
Figura 4. Reacción de fenol con cloroparafina (20).
Se utiliza todavía la segunda vía de adición de olefinas, generalmente trímero o tetrámero
de propileno, o dímero del isobutileno, los cuales producen alquilfenoles altamente ramificados
de tipo nonil, dodecil y octi1 respectivamente. La Figura 5 muestra la reacción del dímero del
isobutileno con fenol produce un ter-octilfenol, base de los surfactantes TRITON X.
Figura 5. Reacción de dímero de isobutileno con fenol para producir ter-octilfenol (20)
En presencia del catalizador trifloruro de boro, se obtiene más de 90% de alquilación en
posición para, con exceso de olefina se obtiene una cierta cantidad de dialquil (orto/para)
fenoles, que en general no tienen mucho interés (20).
a.- Surfactantes no iónicos
En los últimos 40 años los surfactantes no iónicos han tenido cada vez más importancia,
hasta llegar al 35% del mercado mundial que les corresponde hoy en día. Estos surfactantes no
producen iones en solución acuosa y por lo tanto son compatibles con los demás tipos de
surfactantes y pueden integrarse en formulaciones complejas.
Por otra parte son muchos menos sensibles que los surfactantes iónicos a la presencia de
electrolitos, especialmente cationes divalentes. Los surfactantes no iónicos son en general
buenos detergentes humectantes y emulsionantes. Algunos de ellos tienen excelentes
propiedades espumantes. Por todas estas propiedades, se encuentran hoy en día en todos los
tipos de formulaciones detergentes líquidos o en polvo, y en otras aplicaciones.
Existen diferentes tipos de surfactantes no iónicos, pero el mercado está dominado por los
derivados conteniendo una cadena polióxido de etileno fijada sobre un grupo hidroxilo o
amino.
Típicamente se requiere por lo menos 5 a 7 grupos óxidos de etileno para obtener una
buena solubilidad en agua, dependiendo del lipofílico. Sin embargo, para ciertas aplicaciones
se usan surfactantes con 40 o más grupos EO, en los cuales la parte hidrofílica, a saber la
cadena polióxido de etileno (PEO) es mucho más voluminosa que la parte lipofílica. Las
cadenas polióxido de etileno poseen dos grupos metileno por cada oxígeno, y por lo tanto
presentan una doble afinidad hidrofílica-lipofílica con dominante hidrofílica. Si se añade un
grupo metileno adicional, como en las cadenas polióxido de propileno (PPO), se obtiene una
dominante lipofílica. Eso significa que la cadena polióxido de etileno puede considerarse solo
como levemente hidrofílica.
Ambos tipos de cadenas (PEO/PPO) tienen una tendencia a doblegarse sobre si misma
para formar "pelotas", los cuales optimizan las interacciones con el solvente. La solubilidad en
agua de las cadenas PEO está asegurada por un mecanismo de solvatación de los átomos de
oxígeno; cuando la temperatura aumenta las interacciones de solvatación disminuyen y el
surfactante se torna menos hidrosoluble, hasta llegar a una cierta temperatura llamada "punto
de turbidez" (cloud point) a la cual el surfactante forma una fase separada, en forma de
pequeñas gotitas que producen una turbidez antes de separarse por gravedad.
Al contrario de los surfactantes iónicos, los surfactantes no iónicos polietoxilados se
vuelven menos hidrosolubles o menos hidrofílicos cuando la temperatura aumenta. Esta
propiedad puede ser de cierta utilidad, pero también puede producir problemas en ciertas
aplicaciones.
Los surfactantes que poseen una cadena PEO amarrada a un grupo OH representan la gran
mayoría de la producción (70%) de no iónicos, particularmente para uso detergente (20).
b.- Síntesis de alquilfenoles etoxilados
La etoxilación del alquilfenol se realiza a 150-200ºC con una presión de óxido de etileno
de 1,5 a 5 atmósferas y en presencia de 0,5 - 1 % de catalizador alcalino (KOH). En la Figura 7
se puede observar el proceso, el cual es similar al caso de la etoxilación de los alcoholes. Sin
embargo la reacción ocurre en dos etapas distintas, ya que el ión fenolato es más ácido que el
etoxilato, se produce primero la condensación de un mol de óxido de etileno sobre todos los
radicales fenol.
Figura 6. Proceso de dos etapas para la etoxilación de un alquilfenol (20).
Luego se produce la policondensación de óxido de etileno sobre el etoxilado formado, con
la velocidad independiente del número de grupos de óxido que puede expresarse por:
Mol % con EON = e-EONM+1
EONM EONM-1
/(EON-1)
Donde, EONM es el valor promedio de EON en la distribución.
Los productos comerciales más corrientes son los octi1, noni1, dodeci1 fenoles etoxilados
con 4 a 40 grupos EO. Para uso de detergentes se prefieren los octi1 o noni1 fenoles con EON
entre 8 y 12. Con EON inferior a 5, se usan como agentes antiespumantes y tensioactivos
liposolubles. Con EON entre 6 y 8, son excelentes tensioactivos. Para EON superiores a 10 son
agentes humectantes, detergentes o dispersantes liposolubles. Cuando el EON supera 20, ya
son buenos detergentes a alta temperatura y en presencia de electrolito, y se usan como
dispersantes de jabones de calcio. El mayor uso de los alquilfenoles etoxilados es la
preparación de detergentes domésticos e industriales. Los detergentes líquidos contienen
típicamente 20% de materia activa no iónica de este tipo. Se usan en productos de limpieza
para piso, y en detergentes industriales para metales (en medio ácido), en emulsiones
herbicidas y pesticidas, en los procesos de polimerización en emulsión de acetato de vinilo y
acrilatos, en emulsiones de ceras, etc.
Con el aumento del uso de los no iónicos, se está presentando el mismo problema de
biodegradabilidad que con los alquilbenceno sulfonatos, los alquilfenoles etoxilados con
cadena alquil ramificada son poco biodegradables y además poseen una cierta toxicidad
biológica, por lo cual tenderán en el futuro a desaparecer para ser reemplazados por los
alcoholes alquilfenoles lineales (20).
1.2. Métodos de análisis de alquilfenoles
Los alquilfenoles son compuestos utilizados mundialmente como surfactantes, debido a
esto, hoy día se pueden encontrar presentes en diferentes matrices medioambientales como,
agua, sedimentos, suelos y muy especialmente en sedimentos procedentes de depuradoras.
Debido a su amplio uso y demostrada toxicidad de los mismos, han despertado el interés de
los investigadores y son varios los métodos desarrollados para su determinación.
1.2.1.- Métodos utilizando cromatografía de gases
Las técnicas más empleadas para la determinación de los alquilfenoles son: cromatografía
gaseosa acoplada a espectrometría de masa (GC-MS), cromatografía líquida (LC) y
cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masa (LC-MS). Entre ellas, la
cromatografía de gases con espectrometría de masas es usada generalmente para la
determinación de alquilfenoles en muestras medioambientales, debido a su alta capacidad de
separación y bajos límites de detección.
La Cromatografía de Gases es una técnica de separación ampliamente utilizada debido a su
rapidez y buena resolución en análisis de mezclas complejas de hidrocarburos, pesticidas en el
suelo y productos vegetales, solventes de uso industriales y sustancias ecotóxicas, consideradas
contaminantes ambientales (23). Entre los métodos de análisis de alquilfenoles se tiene:
Yafeng Nie y col., (2009) pertenecientes al Departamento de Ingeniería Civil, Ambiental y
Arquitectónica de la Universidad de Kansas en EEUU, publicó el fruto de su investigación
referente a un método para la determinación simultánea de dos clases de químicos disruptores
endocrinos, incluyendo estrona (E1), 17β-estradiol (E2), estriol (E3), 17α-etinilestradiol (EE2),
4-nonilfenol y bisfenol A (BPA), en las fases sólidas y líquidas de lodo activado. Para la
preparación de la muestra se realizo una derivatización de los extractos seguido de
cromatografía de gases con espectrometría de masa. El método mostró buena linealidad de
calibración, recuperación, precisión y un bajo limite de cuantificación para todo los EDCs en
ambas fases (24).
Yang Bai-Juan y col., (2007)del Departamento de Química y el Laboratorio Principal de
Ciencia Analítica de el Ministerio de Educación de la Universidad de Xiamen, introducen un
método basado en la extracción en fase sólida (SPE) con derivatización in situ seguido por
cromatografía de gases con espectrometría de masa desarrollado para la determinación de
alquilfenoles en muestras de agua, seleccionando dos importantes alquilfenoles como lo son el
4-n-nonilfenol y 4-t-octilfenol como compuestos de estudio para el método desarrollado. La
extracción en fase sólida fue conducida en un cartucho de extracción c-18 con una columna de
silanización por bis (trimetilsilil)trifluoroacetamida, los parámetros operacionales incluyen el
reactivo silanizante, tiempo de silanización, valor de pH, concentración de sales, y eluentes, los
cuales se espera que tengan un impacto en la recuperación de analitos; esto muestra que la
acetona es el mejor agente de silanización mientras que el diclorometano fue eficiente en la
elución de alquilfenoles de SPE. El método optimizado fue verificado posteriormente llevando
a cabo experimentos fortificados en agua ultra-pura y matrices de agua marina, con buena
recuperación y reproducibilidad para todos los compuestos seleccionados (25).
Li y col., (2008) describieron un método simple y sensible para la determinación de
alquilfenoles tales como 4-terc-octilfenol y los isómeros de 4-nonilfenol presentes en distintos
tipos de purés para alimentos de bebe. El método consiste en extraer de la muestra los analitos
con n-hexano por 1 hora, utilizando un sistema de extracción por destilación al vapor Nielson–
Kryger, luego una identificación y cuantificación de los alquilfenoles utilizando cromatografía
de gases-espectrometría de masas (GC-MS) en modo SIM. Las condiciones de extracción
fueron evaluadas en función del pH de la solución de la muestra. Los limites de cuantificación
para este método fueron 0.2 ng/g de 1 g (peso húmedo) de muestra de 4-terc-octilfenol y 4-
nonilfenol, se obtuvo una D.S.R< 8%. La mayoría de los porcentajes de recuperación supero el
60%. Los residuos de alquilfenoles se detectaron en concentraciones de hasta 19 ng/g de 4-
terc-octilfenol y 21 ng/g para el 4-nonilfenol (26).
Por otro lado en Canadá, Hing-Biu Lee y col., (2005) determinaron fenoles disruptores
endocrinos, ácidos farmacéuticos y productos de cuidado personal en aguas residuales por
extracción en fase sólida y cromatografía de gases con espectrometría de masa, donde los
fenoles y ácidos fueron selectivamente eluidos en fracciones separadas y fueron convertidos en
derivados de pentafluoropropionil (PFP) y en tert-butildimetilsilil (TBDMS), respectivamente,
para la determinación de cromatografía de gases con espectrofotometría de masa. Concluyeron
que cuando es aplicado a las muestras residuales bajo estudio, los resultados para nonilfenol,
bisfenol A, triclosan, 17B-estradiol, estrona, ácido salicílico, ibuprofeno, naproxen, diclofenac,
entre otras drogas; fueron consistentes con aquellos determinados previamente por métodos
individuales (27).
Hernando y col., (2004) utilizaron dos métodos de GC-MS, basados en la aplicación de N,
O-bis(O-bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida-derivado- GC-MS y GC-MS-MS sin
derivatizacion, respectivamente, en la determinación y optimización de un grupo de cinco
compuestos disruptores endocrinos en aguas residuales. Ambos métodos incluyen extracción
en fase sólida con cartuchos Oasis HLB. Los disruptores endocrino investigados fueron 17β-
estradiol, 17α-etinilestradiol, 4-tert-octilfenol and bisfenol A. Los porcentajes de recuperación
en la muestras de agua residual fueron mayores al 90% con excepción del 4-terc-
octilfenol (75%). La repetibilidad y reproducibilidad fueron adecuadas variando desde 1.6 a
14%. Los límites de detección calculados oscilaban en un rango de 2.5 a 27.5 ng/l. Ambos
métodos fueron aplicados con éxito para el análisis de los compuestos de interés en el efluente
de aguas residuales. Las trazas de bisfenol A, 4-terc-octilfenol, estrona y 17β-estradiol se
detectaron a niveles de concentración que van desde 13.3-1105.2 ng/L (28).
1.2.2.- Métodos empleando Cromatografía liquida
Sodre y col., (2010) realizaron la evaluación seleccionada de estrógeno y xenoestrógenos
en las agua superficiales de Brasil por cromatografía liquida-espectrometría de masas. La
separación cromatográfica se realizo con soluciones de hidróxido de amonio en agua y en
metanol como fase móvil. El múltiple control de la reacción se optimizo para la estrona, 17α-
etinilestradiol, el bisfenol A,4-n-octilfenol, y 4-n-nonilfenol. El método fue lineal desde 0.1
ng/L hasta 10 μg/l. los limites de cuantificación varían entre 0.1 y 3.1 ng/L y una recuperación
entre 72-140%. El método fue utilizado con éxito para determinar los niveles de estrógenos y
xenoestrógenos en muestras de agua recogidas a lo largo del rio Atibaia en el Estado de Sao
Paulo en Brasil (29).
Wang y col., (2009) desarrollaron un nuevo método para la determinación
de alquilfenoles en el suelo por cromatografía líquida de alta eficiencia empleando partículas
pequeñas, combinado con espectrometría de masas. Las muestras de suelo fueron extraídas con
extracción líquida presurizada y luego limpiadas con extracción en fase solida. Los extractos
fueron separados en columnas de C-18 (1.7 μm, 50 mm x 2.1 mm) con un gradiente de elución
y una fase móvil compuesta de agua y acetonitrilo, y luego detectados por espectrometría de
masa por ionización de electrospray en modo de iones negativos con múltiples control de
reacción. La cromatografía líquida de alta eficiencia-espectrometría de masaproduce fiabilidad
satisfactoria, sensibilidad y precisión. El promedio de recuperación de los tres analitos fueron
de 74,0 a 103,4 % con una D.S.R<15%. Las curvas de calibración para los alquilfenoles fueron
lineales en el rango de 0.01-0.4μg/ml, con coeficientes de correlación mayores a 0.99. Cuando
la muestra de suelo de 10 g se utilizo para el análisis, los límites de cuantificación de los tres
alquilfenoles eran de 1.0 μg/kg (30).
Loos y col.,(2008) en apoyo a la implementación de la Unión Europea (EU) Water
Framework Directive (WFD), la Comisión Europea (EC) Joint Research Centre (JRC)
organizó un estudio comparativo de laboratorio y muestreo para el monitoreo químico de
hidrocarburos poliaromáticos (PAHs), éteres difenílicos polibromados (PBDEs), nonilfenol y
octilfenol (NP/OP), sustancias prioritarias de la WFD, en agua de río. Los laboratorios EU
Member State fueron invitados a analizar una solución estándar con niveles de concentración
desconocida y un extracto de agua de río, así como también una muestra de agua real del Río
Po (Italia). Para la solución estándar y el extracto de agua de río, se logró un buen acuerdo por
cinco laboratorios. La cromatografía líquida de triple cuadrupolo con espectrometría de masas
(LC-MS) y la cromatografía de gases con espectrometría de masas (GC-MS) con y sin
derivatización probaron ser métodos comparables para el análisis de Nonilfenol y Octilfenol.
La detección de fluorescencia también puede ser usada para analizar Nonilfenol y Octilfenol,
pero es menos específica. Los resultados de la muestra de agua de Río Po mostraron que
algunos laboratorios tienen problemas analizando Nonilfenol a niveles de concentración por
debajo de 100 ng/L debido a contaminación de los blancos de laboratorio. Materiales plásticos
no deben ser utilizados durante la extracción y la preparación de las muestras (31).
Alberto Zafra-Gómez y col., (2007) pertenecientes al departamento de Química Analítica
de la Universidad de Granada, desarrollaron el método de extracción en fase sólida (SPE),
empleando cromatografía liquida con espectrometría de masa (LC-MS) para la determinación
de químicos disruptores endocrinos (EDCs) tales como bisfenol y sus derivados clorados
(monocloro, dicloro, tricloro y tetraclorobisfenol A), tres alquilfenoles (4-n-octil y 4-(tert-
octil)fenol) y seis ester ftalatos (dimetil, dietil, di-n-butil, butilbenzil, bis(2-etilhexil) y di-n-
octilftalato) en muestras de aguas residuales urbanas. El método involucra extracción desde las
muestras y pre-concentración de los analitos usando procedimiento de extracción en fase solida
seguido de una separación de cromatografía liquida con detección de espectrofotometría de
masa; bisfenol F fue usado como sustituto; los limites de cuantificación encontrados fue un
rango de 12 ng.L-1
para el dietilftalato y 69 ng.L-1
para el 4-(tert-octil)fenol (32).
Kawaguchi y col., (2004) describieron un método para determinar 4-tert-octilfenol y 4-
nonilfenol en muestras de alimentos para animales, que consiste en la extracción por sorción
con barras magnéticas agitadoras (SBSE), seguida de la desorción del líquido y la
cromatografía líquida-espectrometría de masa (CS-LC-MS), con una extracción en fase sólida.
Una muestra de alimento se homogeneizó con metanol y ultrasonido, luego se centrifugo y el
sobrenadante fue sometido a la extracción 120 minutos a temperatura ambiente (25°C) con una
barra de agitación recubierta con polidimetilsiloxano. Después de la extracción, el analito
desorbido de la barra de agitación utilizando acetonitrilo. La muestra de líquido se analizo por
la CS-LC-MS. El promedio de recuperación de las muestras fortificadas con
octilfenol y nonilfenol es de 99.5-103.8%, con limites de cuantificación de 1 ng/g para
Octilfenol y 5 ng/g para Nonilfenol (33).
KoichiInoue y col., (2003) hicieron la determinación simultánea de xenoestrógenos
fenólicos como el bisfenol A, 2,4-diclorofenol, 4-terc-fenol, 4-n-pentilfenol, 4-n-hexilfenol, 4-
n-heptilfenol, 4-octilfenol, 4-nonilfenol mediante cromatografía líquida en fase inversa. Un
gradiente de elución con acido fosfórico en agua-acetonitrilo. Las curvas de calibración fueron
lineales en el rango de 5.0 -1000 ng/ml con un coeficiente de correlación de 0.9978-0.9999,
con limites de detección de 0.01-0.02 ng/ml. La limpieza se realizo mediante extracción en fase
sólida utilizando discos C-18. Se obtuvieron porcentajes de recuperación alrededor de 70% con
una D.S.R<15%. El método propuesto se aplico en la determinación de xenoestrógenos
fenólicos en muestras de agua (34).
1. 3. Cromatografía de gases-espectrometría de masas
La cromatografía de gases es una técnica separativa que tiene la cualidad de conseguir la
separación de mezclas muy complejas. Pero una vez separados, detectados, e incluso
cuantificados todos los componentes individuales de una muestra problema, el único dato del
que se dispone para la identificación de cada uno de ellos es el tiempo de retención de los
correspondientes picos cromatográficos. Este dato puede ser no concluyente para una
identificación, sobre todo cuando se analiza muestras con un número elevado de componentes,
como es frecuente en cromatografía de gases capilar.
Por otra parte, la espectrometría de masas es una poderosa técnica microanalítica usada
para identificar compuestos desconocidos, para cuantificar compuestos conocidos, y para
elucidar la estructura y propiedades químicas de moléculas. Puede identificar de manera casi
inequívoca cualquier sustancia pura, pero normalmente no es capaz de identificar los
componentes individuales de una mezcla sin separar previamente sus componentes, debido a la
extrema complejidad del espectro obtenido. Existen diferentes tipos de analizadores de masas
magnéticos, de cuádrupolo simple y triple, trampa de iones, trampa de iones magnética, o
tiempo de vuelo (time-of-flight). El analizador de cuádrupolo (Figura 8) es probablemente el
analizador de masas más utilizado, ya que además de su alto desempeño analítico combina
facilidad de uso. Este tipo de analizador está compuesto de cuatro barras organizadas
paralelamente como dos grupos de dos barras conectadas eléctricamente. Una combinación de
voltajes de radiofrecuencia (rf) y corriente directa (df) se aplica a cada par de barras, este
arreglo simétrico permite producir campos hiperbólicos.
Superficies diagonalmente opuestas están conectadas juntas a fuentes de voltajes rf y dc.
Los iones se extraen de la fuente de iones y son acelerados (5-15 V) dentro del espacio central
formado por el cuádrupolo a lo largo del eje longitudinal hacia el detector. Millar y Denton
describieron el concepto de filtro de masas cuádruplo como la combinación o superposición de
filtros de pase bajo y pase alto. Al menos para iones relativamente ligeros (<300 Da), el
análisis m/z no es afectado por la estructura del ion. El filtro cuádrupolo m/z es examinado al
modificar la magnitud de la amplitud de voltaje de rf y manteniendo dc a una proporción fija.
El poder de resolución es establecido por la relación de los voltajes rf y dc. La trayectoria de
los iones a través del espacio central de la barras es complicado, y para cada par de voltajes dc
y rf solo iones de un valor m/z especifico evitaran colisionar con las barras y pasaran el filtro
cuádrupolo a través del eje Z hasta alcanzar el detector, todos los demás iones chocaran con la
superficie del cuádrupolo a estos valores de rf y dc. El espectro de masas completo puede
examinarse ya que se hace un barrido desde un valor de voltaje mínimo preestablecido hasta un
máximo, pero manteniendo la relación dc/rf constante (35).
Por lo tanto, la asociación de las dos técnicas, GC (“Gas Cromatography”) y MS (“Mass
Spectrometry”) da a lugar a una técnica combinada GC-MS que permite la separación e
identificación de mezclas complejas. La utilización de la cromatografía de gases acoplada a un
espectrómetro de masas requiere sistemas especiales de conexión. En principio, se trata de dos
técnicas que trabajan en fase gaseosa y necesitan una muy pequeña cantidad de muestra para su
análisis, por lo que son muy compatibles.
Actualmente, el acoplamiento directo resulta fácil cuando se utiliza la cromatografía de
gases capilar, que es el caso más habitual. En resumen, una mezcla de compuestos inyectada en
el cromatógrafo de gases se separa en la columna cromatográfica obteniendo la elución
sucesiva de los componentes individuales aislados que pasan inmediatamente al espectrómetro
de masas cada uno de estos componentes se registra en forma de pico cromatográfico y se
identifica mediante su respectivo espectro de masas. En este proceso, el espectrómetro de
masas, además de proporcionar los espectros, actúa como detector cromatográfico al registrar
la corriente iónica total generada en la fuente iónica, cuya representación grafica constituye el
cromatograma o “TIC” (total ion current).
1. 4. Derivatización en cromatografía de gases
Una de las condiciones indispensables en el análisis por cromatografía de gases es la
necesidad de que los analitos posean la suficiente volatilidad como para ser transportados por
la fase móvil hasta el detector. Si a esto unimos la necesidad de utilizar en ocasiones
temperaturas muy elevadas, con graves consecuencias para las moléculas inestables o
termolábiles, resulta sencillo comprender el gran interés que para la investigación puede tener
la posibilidad de formación de derivados, más volátiles, estables o sean capaces de suministrar
mayor información respecto a su estructura cuando el detector es un espectrómetro de masas.
Figura 7. Detector de masa de cuadrupolo
1.4.1.- Ventajas de la derivatización
o Conferir Volatilidad.
Es el caso de los compuestos que son prácticamente no volátiles a causa de las fuerzas
intermoleculares, como es el caso de los aminoácidos y poli-hidroxicompuestos unidos por
enlaces de hidrogeno.
o Mejorar la estabilidad.
Como resultado de la presencia en la molécula de grupos sensibles e interactivos, algunos
compuestos pueden sufrir degradación térmica que puede ser mitigada por el uso de derivados
protectores, como es el caso de los grupos OH en esteroles y prostaglandinas por conversión a
sus trimetilsilil éteres.
o Mejora de las propiedades cromatográficas.
La congruencia entre las muestras y la fase estacionaria, a fin de establecer los adecuados
coeficientes de partición por una parte y, por otra, la ausencia de efectos de absorción
significativos, son dos importantes elementos en la estabilización del comportamiento
cromatográfico.
o Separaciones más eficaces.
La juiciosa elección de derivados y fases estacionarias ofrece amplias posibilidades para el
control de los parámetros de retención. Así, la formación de derivados que incrementen
sensiblemente el peso molecular es a veces practico, porque de esta forma el pico puede ser
eluído en zonas alejadas del alto background, como en el caso de los esteres bencílicos de
ácidos cortos o separación de grupos analíticos como las benciloximas, cetoesteroides, etc.
1.4.2.- Métodos de derivatización
La derivatización de especies químicas que serán separadas por cromatografía de gases
puede realizarse de dos formas:
o Derivatización de los analitos antes de la inyección de la muestra.
o Derivatización en el puerto de inyección.
En el caso de la derivatización de los alquilfenoles se han empleado diferentes estrategias,
a continuación se presentan los trabajos más resaltantes en el área:
En la Universidad de Osaka, Miki Kojima y col., (2005) del Centro de Investigación para
la Prevención Ambiental, realizaron la derivatización extractiva de 4-alquilfenoles con
pentaflouropiridina para cromatografía de gases acoplada a un espectrómetro de masa. Bajo
condiciones alcalinas, 4-alquilfenoles podría ser eficientemente adsorbido en cartuchos c-18
SPE condicionado con un reactivo de par iónico, el tetra-n-bromuro de hexilamonio, este es
eluido con solventes que contienen el reactivo derivatizante, después de la optimización de la
adsorción y derivatización se establece un método para la determinación de 4-alquilfenoles en
muestras de agua, el cual mostro buena linealidad entre 20 y 1000 ng (200-10000 ng para
nonilfenol) (36).
Basheer y col., (2004) realizaron el análisis de alquilfenoles disruptores endocrinos,
clorofenoles y bisfenol-A en muestras acuosas usando microextracción en fase liquida
(LPME) junto con una inyección de derivatización en puerto y cromatografía de
gases/espectrometría de masas. Estos compuestos son altamente polares por ello es necesario
su derivatización antes del análisis por GC-MS. El reactivo derivatizante utilizado fue
bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida (BSTFA). Los analitos fueron extraídos directamente de
una muestra de 5 ml de solución usando 5 μl de solvente orgánico a través de una fibra hueca
porosa de polipropileno. La fibra hueca, llena de un solvente orgánico inmiscible (aprox. 5 μl)
fue sumergida en la muestra la cual fue agitada por 30 min. Una alícuota (2 μl) de extracto y 2
μl de BSTFA fueron inyectados consecutivamente en el puerto de inyección del GC.los
parámetros de extracción tales como tiempo de extracción, pH de la muestra, concentración de
sal agregada, y velocidad de agitación fueron optimizados. La LPME provee un buen factor de
enriquecimiento promedio de hasta 162 veces, una reproducibilidad de 5.9 a 3.9%, y una buena
linealidad (r2
= 0.995) para las muestras de agua fortificadas. Los limites de detección oscilaron
entre 0.005 y 0.015 μl/l usando GC-MS y limites de cuantificación de 0.012-0.026 μl/l.
Realizaron un estudio comparativo entre LPME y la extracción líquido –líquido obteniendo
como resultado que el LPME es una técnica rápida, sencilla y eficaz para estos compuestos
(37).
Lou y col., (2010) determinaron octilfenol y nonilfenol en muestras acuosas usando una
derivatización simultánea y una micro extracción líquido-líquido seguido por cromatografía de
gases/espectrometría de masa. En este método combinaron dispersante/derivatización
catalizada (metanol/mezcla de piridina), fue lo primero que se agregó a la muestra de agua,
luego un reactivo de derivatización /extracción de solvente (metil cloroformiato/cloroformo)
fue inyectado con rapidez para combinar la derivatización in situ y la extracción en un simple
paso. Después de la centrifugación, la fase de sedimento que contiene los analitos se inyectó en
el puerto del GC por inyector automático para el análisis. En las condiciones optimizadas
observaron una buena linealidad en el rango de 0.1-1000 μl/l y 0.01-100 μl/l con límites de
detección de 0.03 μl/l y 0.002 μl/l para nonilfenol y octilfenol respectivamente. Las muestras
recogidas en el Rio de Las Perlas se analizaron con el método propuesto, la concentración de
NF y OF resultaron ser de 2.40 ± 0.16 μl/l y 0.037 ± 0.001 μl/l respectivamente. La
recuperación relativa estuvo en el rango de 88.3-106.7% (38).
Nakamura y col., (2004) utilizaron un método para la determinación de siete alquilfenoles
y bisfenol A por extracción sobre barras magnéticas (SBSE) con derivatización en situ-
desorción térmica (TD)-cromatografía de gas (GC)-espectrometría de masas. El SBSE se
realizó con la acetilización en situ. Los límites de detección del método oscilaban en 0.1-3.2
ng/l. las recuperaciones de los analitos de las muestra de agua de río fueron 85.3-105.9%
(RSD, 3.0-11.0 %) y 88,3-105.8% (RSD 1.6-8.3%) (39).
Jonsson y col., (2008)realizaronla derivatización analítica en fase sólida (ADSP) con
bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA) ha sido usada exitosamente como método de
preparación de muestras para determinación de alquilfenoles (AP) en bilis de pez tratada con β-
glucoronidase y sulfatase. Los alquilfenoles derivatizados fueron analizados mediante
cromatografía de gases-espectrometría de masas en modo de ionización de electrón (GC-EI-
MS). En general los límites de detección (LODs) variaron desde 5 a 18 ng/g bilis para 19 de los
21 compuestos investigados. Los límites de detección no fueron determinados para 4-
metilfenol y 4-tert-octilfenol debido a niveles altos de base en la bilis de control. Las
recuperaciones oscilaron entre 83 y 109%. Los alquilfenoles analizados varíaron en grados de
alquilación desde metil (C1) a nonil (C9), y representan varias fuentes de contaminación,
incluyendo la descarga de agua producida (PW) desde la industria petrolera costa afuera. La
aplicabilidad y la sensibilidad del método fue demostrada mediante el análisis de bilis tomada
de bacalao del Atlántico (Gadus morhua L.) expuesta a dos diluciones de agua producida
(1:500 y 1:1500) en un sistema de flujo continuo (40).
La silanización es el procedimiento de derivatización más ampliamente usado para análisis
de cromatografía de gases. En la silanización, un hidrógeno activo es reemplazado por un
grupo alquilsilil, comúnmente un trimetilsilil (TMS). Comparado con los compuestos
originales, los derivados silanizados generalmente son más volátiles, menos polares, y más
estables térmicamente. Los derivados silanizados están formados por el desplazamiento del
protón activo en grupos -OH, -COOH, =NH, NH2, y -SH. La reacción general para la
formación de derivados trialquil silanizados es como se observa en la Figura 8.
Figura 8. Reacción general de silanización
1. 5. Microextracción en fase líquidacon gota suspendida (SDME)
El proceso de microextracción se basa en la diferencia de concentración de los analitos,
entre dos fases líquidas inmisibles (acuosa y orgánica). La trasferencia de masa del analito
desde la fase acuosa (muestra) a la fase orgánica (microgota) continua hasta que se alcanza el
equilibrio termodinámico es decir hasta que se alcanza el equilibrio termodinámico o se
interrumpe la extracción (41)
En la actualidad existe varias modalidades para la técnica de microextracción con gota
suspendida(SDME), dentro de las cuales tenemos: la inmersión directa (DI-SDME), la
headspace (HS-SDME) y la micro extracción en flujo continuo (CFME).
1.5.1.- Microextracción en fase líquida con gota suspendida por inmersión (DI-SDME)
La técnica de microextracción a evolucionado con el tiempo, en 1996 Liu y Dasgupta,
reportaron un sistema de gota sobre gota para extraer dodecil sulfato de sodio(42). En este se
reportó una microgota de 1.3 μl de un solvente orgánico inmiscible en agua fue sumergida en
una gota acuosa para lograr el proceso de extracción, al mismo tiempo Jeannot y Cantwell
introdujeron un procedimiento que ellos llamaron microextracción con solvente en el
cual el medio de extracción era una gota (8μl) de 1- octanol sostenida en la punta de una vara
de teflón y mantenida en una solución acuosa con agitación constante. Después de la
extracción, la vara de teflón fue retirada de la solución; la fase orgánica fue retirada con una
microjeringa e inyectada en el cromatógrafo gaseoso para su análisis. En este trabajo los
autores también propusieron el equilibrio y la cinética de la extracción (43).
Una desventaja de la técnica mencionada anteriormente es que la extracción y la inyección
deben hacerse por separado, utilizando diferentes instrumentos. Para solventar este
inconveniente Jeannot y Cantwell introdujeron la idea de usar una microjeringa para sostener el
solvente en vez de una vara de teflón. Un microlitro del solvente fue introducido en la jeringa,
luego la punta de la microjeringa fue pasada a través del septum del vial e introducida en la
muestra acuosa con agitación constante, tal como se muestra en la figura 9; luego de la
extracción, la fase orgánica fue devuelta a la microjeringa e inyectada directamente en el GC
(44).
En la SDME los analitos son extraídos desde la fase acuosa hacia el solvente orgánico
presente en la punta de la jeringa. Este proceso se puede ilustrar como sigue: (45)
A (muestra) A (solvente)
El factor de enriquecimiento Ef para una solución diluida, por ejemplo de 5 ml de muestra
y 3 μl de solvente extractor se calcula mediante la siguiente ecuación;
En la Ecuacion 1,K es el coeficiente de distribución, V0 es el volumen del solvente
orgánico y Va es el volumen de muestra acuosa, K se calcula mediante la siguiente fórmula
Donde C0eq es la concentración del analito en la fase orgánica y Caeq es la concentración del
analito en la fase acuosa. El valor máximo del factor de enriquecimiento es igual al coeficiente
de distribución entre los analitos.
Figura 9. Representación esquemática del método de microextracción con gota suspendida
introducido en 1996 por Cantwell y Jeannot.
1.5.2.- Microextracción en fase líquida con gota suspendida en el modo headspace (HS-
SDME).
En la HS-SDME la gota se coloca por encima de la muestra acuosa, este tipo de extracción
se utiliza mayormente para analitos volátiles o semi-volatiles. El primer reporte de HS-SDME
fue del 2001 y continuó ganando atenciones los años siguientes debido a sus ventajas. Este
método permite altas velocidades de agitación sin afectar la estabilidad de la gota,
Adicionalmente se reducen la interferencias no volátiles. En este modo los analitos están
distribuidos en tres fases: la muestra acuosa, el headspace y la gota. La transferencia de masa
desde la solución acuosa es el paso determinante de la velocidad de extracción en el proceso
como lo explican Theis y col., (46).
Comparando DI-SDME con HS-SDME son muy similares en términos de precisión y
velocidad de análisis, sin embargo la última ofrece dos ventajas distintivas. Primero la
selección de solventes es mucho mayor comparado con el limitado número de fibras
disponibles en el mercado y segundo el costo de los solventes es insignificante comparado con
el costo comercial de las fibras SPME disponibles. Sin embargo, el uso de HS-SDME parece
relativamente difícil ya que se prefieren los solventes con presión de vapor relativamente baja,
pero los solventes preferidos para GC deben tener presiones de vapor relativamente altas. La
Microjeringa de
inyección
cromatográfica
Muestra acuosa
Barra magnética
agitadora
Aguja de la
jeringa
Fase orgánica
dificultad con estos solventes es que se evaporan muy rápido en el headspace durante la
extracción.
1.5.3.- Microextracción en fase líquida con gota suspendida en flujo continuo (CFME)
La CFME evoluciónó de la SDME convencional y fue descrita por primera vez por Liu y
Lee (2000). Una muestra acuosa es bombeada continuamente a un caudal constante usando un
sistema de bombeo de HPLC en una cámara de extracción de vidrio a través de una tubería.
Después que la cámara ha sido llenada con la solución de la muestra, y el exceso fluye a través
de una salida, el volumen requerido de la gota de solvente orgánico fue introducido en el
sistema a través de una válvula de inyección de HPLC convencional. La gota es colocada en la
salida de la tubería de entrada de la muestra. La solución es bombeada continuamente
alrededor de la gota, luego de transcurrido el tiempo necesario se introduce en la cámara una
jeringa y se extrae una pequeña cantidad del extracto para su análisis. Se alcanzan factores de
concentración en un rango de 260 a 1600 para 10 min de extracción (47).
La CFME difiere de otros procedimientos de extracción en que la gota de solvente está
totalmente y continuamente en contacto con una solución fresca y fluida. Con el uso de una
válvula de inyección HPLC, se puede alcanzar un control preciso del tamaño de la gota de
solvente mientras que se evita la entrada de burbujas de aire. Otra ventaja es que gracias a los
altos factores de concentración que pueden ser alcanzados se necesitan pequeñas cantidades de
muestras acuosas para hacer la extracción.
1.5.4.- Parámetros que afectan a la microextracción con gota suspendida
o Fuerza Iónica
El aumento de la fuerza iónica en muestras acuosas por adición de sales (NaCl, KCl,
Na2SO4) presenta varios efectos en la microextracción [41].Dependiendo de la solubilidad de
los analitos, la extracción se ve mejorada debido a que las moléculas de agua tienden a
solvatar a los iones presentes en la misma y no a las moléculas neutras de los analitos. La
reducción de la solubilidad en la fase acuosa por incremento de la fuerza iónica se conoce
como efecto “salting- out”( efecto salino desplazante) el cual modifica el coeficiente de
partición de muchas sustancias y , por tanto facilita la extracción de los analitos por la fase
orgánica, disminuyendo la solubilidad de los analitos en el agua, facilitando su pase a la fase
orgánica, gota o espacio de cabeza, originando un aumento de la sensibilidad.
o El pH de la muestra
El pH de la muestra afecta el equilibrio de disociación de los analitos en medio acuoso.
Anteriormente se ha visto que la extracción es más eficaz si los analitos están sin disociar.
Si se asume que solamente serán extraídas por la gota las formas no disociadas de los
analitos (ácidos o básicas), el ajuste del pH de una disolución acuosa a valores que
promocionen la forma neutra de los analitos cambiará la relación de distribución de las
especies disociables, incrementando la transferencia de masa hacia la gota y, por lo tanto,
mejorando la extracción de dichos analitos. Por ejemplo, cuando el pH disminuye se produce
un aumento de la concentración del ácido en su forma no disociada resultando un aumento de
la cantidad extraída por la gota, y por lo tanto, un incremento de la sensibilidad. Por ello, se
recomienda trabajar a un pH al menos dos unidades por debajo (especies ácidas) o por encima
(especies básicas) del correspondiente pKa. En la práctica, en las extracciones afectadas por el
pH las muestras deben tamponarse para conseguir buena reproducibilidad.
o Agitación de la muestra.
Cuando se extraen compuestos volátiles mediante headspace, el tiempo necesario para
alcanzar el equilibrio es corto y generalmente está limitado por la difusión de los analitos en la
gota. En este caso los analitos se encuentran en el espacio de cabeza dando lugar a extracciones
relativamente rápidas incluso cuando el sistema no se agita. La agitación facilita la transmisión
de masa entre la fase acuosa y la fase orgánica, originando extracciones más rápidas de las
especies menos volátiles, sin embargo en inmersión directa, en la mayor parte de las muestras
liquidas es conveniente agitar el sistema para facilitar el trasporte de masa desde la muestra
acuosa hasta la gota y, de esta forma, acelerar la cinética del proceso reduciendo el tiempo de
extracción la agitación magnética produce el incremento a la respuesta analítica del
instrumento en todos los casos. Sin embargo, cuando la micro gota esta directamente expuesta
a la fase acuosa hay un límite superior el cual no puede superar ya que elevadas velocidades de
agitación puede provocar el desprendimiento y la disolución de la gota, especialmente con
tiempos prolongados de agitación. El uso de pequeñas barras de agitación puede superar ese
tipo de inconvenientes.
o Disolvente de Extracción.
La elección del disolvente más adecuada para la extracción es muy importante para
alcanzar una buena selectividad para los compuestos de interés. Deben probarse varios
disolventes inmiscibles en el agua de diferente polaridad y solubilidad en agua. La elección
final del disolvente debe basarse en la comparación de la selectividad, eficiencia de la
extracción, posibilidad de desprendimiento de gota, velocidad de disolución de
gota(especialmente para velocidades elevadas de agitación y tiempos de extracción largos),
nivel de toxicidad y presión de vapor, en el caso en el que se trabaje en modalidad de espacio
cabeza.
o Tiempo de Extracción.
El objetivo de todo proceso de extracción es alcanzar el equilibrio de distribución en el
sistema, ya que cuando esto ocurra se extraerá la máxima cantidad de analito. El tiempo de
equilibrio se define como el tiempo tras el cual la cantidad de analito en cada fase permanece
constante y corresponderá a la cantidad extraída a tiempo infinito. La agitación de la muestra
reduce el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio ya que favorece la difusión el tiempo
necesario para alcanzar el equilibrio ya que favorece la difusión de los analitos hacia la gota.
Los compuestos con constantes de distribución bajas poseen tiempos de equilibrio
mayores. Desde un punto de vista práctico, generalmente se trabaja a un tiempo de extracción
menor, sin llegar a alcanzar el equilibrio, siempre y cuando se tenga un control estricto del
mismo para obtener suficiente reproducibilidad en la extracción. Además, un tiempo de
extracción prolongado puede provocar la disolución de la gota.
o Volumen de la Gota.
El uso de las gotas grandes produce un incremento en la respuesta analítica del
instrumento debido a un aumento en la cantidad de analito extraída. Sine embargo, gotas
grandes son difíciles de manipular. Además, la inyección de volúmenes grandes produce un
ensanchamiento de las bandas en cromatografía. En la microextracción en gota el volumen de
la gota con el que se suele trabajar oscila entre 1 y 10 µL, pero el volumen más común es 1-2
µL, ya que asegura la formación de una gota estable y reproducible, y permite emplear una
elevada velocidad de agitación.
o Temperatura.
La temperatura es un parámetro muy importante en la microextracción en gota, ya que
afecta tanto a la cinética como a la termodinámica del proceso de absorción y, por tanto, a la
sensibilidad y selectividad del proceso. La temperatura presenta dos efectos opuestos en el
proceso de microextracción en gota. Por un lado, el incremento de la temperatura durante la
extracción aumenta la difusión de los analitos hacia la gota. Además, en el modo headspace,, la
temperatura favorece la transferencia de los analitos hacia la gota. Por otra parte, como la
etapa de extracción es un proceso exotérmico, el incremento de temperatura reduce el
coeficiente de partición de los analitos (entre la fase orgánica y la fase gaseosa o acuosa) y, por
lo tanto produce una disminución en la absorción del analito en la gota.
Si la muestra y la gota cambian su temperatura de T0 a T el coeficiente de partición
cambia según la expresión:
( )
K0 es el coeficiente de partición entre la gota y la muestra a temperatura T0(K), ΔH es la
variación de entalpía del analito cuando se mueve desde la muestra a la gota y R es la constante
de los gases. El cambio de entalpía, ΔH, se considera constante en el intervalo de temperatura
que se utiliza en SDME. Así, según la ecuación un incremento de temperatura produce la
disminución K y, por lo tanto, una disminución de la sensibilidad.
o Adición de disolventes
Hasta el momento, los estudios que se han realizado sobre el efecto de la adición de
undisolvente orgánico auxiliar en muestra acuosas han indicado que se reduce la cantidad de
analito extraído. Por ejemplo, en una disolución acuosa con un 3% de metanol la K del
benceno se reduce en un 20%.
Por otra parte, la adición de agua o de disolventes orgánicos a muestras de suelos y lodos
ha demostrado ser muy eficaz para facilitar la liberación de analitos desde la matriz y mejorar
su difusión hasta la gota.
1.6. Diseño de experimento factorial
Un diseño de experimentos factorial o arreglo factorial es el conjunto de puntos
experimentales o tratamientos que pueden formarse considerando todas las posibles
combinaciones de los niveles de los factores. Por ejemplo, con k = 2 factores, ambos con 2
niveles de prueba se forma el diseño factorial 2 x 2 = 22 que consiste de cuatro combinaciones
o puntos experimentales. El nombre del diseño factorial va implícito en el número de
tratamientos que lo componen. Para obtener el número de corridas experimentales se multiplica
el número de tratamientos por el número de réplicas, donde una réplica se lleva a cabo cada vez
que se repite el arreglo completo. En general, la familia de diseños factoriales 2k consiste de k
factores, todos con dos niveles de prueba.
El objetivo de un diseño factorial es estudiar el efecto de varios factores sobre una o varias
respuestas, es decir, lo que se busca es estudiar la relación entre los factores y la respuesta, con
la finalidad de conocer mejor cómo es esta relación y generar conocimiento que permita tomar
acciones y decisiones. Por ejemplo, uno de los objetivos particulares más importantes que en
general tiene un diseño factorial es determinar una combinación de niveles de los factores en la
cual, el desempeño del proceso sea mejor que en las condiciones de operación del proceso que
eliminen o disminuyen cierto problema de calidad en la variable de salida. Problema que
muchas veces en la práctica se traduce a buscar centrar la media de la respuesta de interés en su
valor objetivo y con variabilidad mínima (4)
Los factores pueden ser de tipo cualitativo (máquinas, tipos de material, operador, la
presencia o ausencia de una operación previa, etc.), o de tipo cuantitativo (temperatura,
humedad, velocidad, presión, etc.). Para poder estudiar la manera en que influye cada factor
sobre la variable de respuesta, es necesario elegir al menos dos niveles de prueba para cada uno
de ellos (dos máquinas, dos operadores, dos velocidades, dos temperaturas). Con el diseño
factorial completo se corren aleatoriamente en el proceso todas las posibles combinaciones que
pueden formarse con los niveles seleccionados.
Cuando crece el número de factores también crece rápido el número de tratamientos en los
diseños factoriales completos 2k. Por ejemplo, para k = 6 factores una sola réplica del diseño
factorial completo 26 implica correr 64 pruebas, que corresponden al número de tratamientos
del diseño; para k = 7 son 27 = 128 puntos de diseño. En la práctica aunque es posible hacer
tantas corridas experimentales, pueden resultar costoso e innecesario.
Para experimentar con esta cantidad de factores se requiere una estrategia que permita
reducir de manera importante el número de puntos experimentales, pero que al mismo tiempo
se pierda el mínimo de información valiosa. Tal estrategia la conforman los diseños factoriales
fraccionados, los cuales, gracias al exceso de información que acumulan los diseños factoriales
completos cuando se estudian muchos factores, permiten sacrificar información poco
importante en aras de un diseño manejable en cuanto al número de puntos experimentales. Es
decir, los diseños factoriales fraccionados, que como su nombre lo indica, son una parte o una
fracción de los diseños factoriales completos, permite reducir el número de corridas
experimentales, y al mismo tiempo obtener la información acerca de los efectos considerados
de antemano relevantes. La teoría de diseño factoriales fraccionados se basa en una
jerarquización de los efectos: son más importantes los efectos principales, seguidos por las
interacciones dobles, luego las triples, cuádruples, etc. (4)
1.7. Diseño de experimento superficie de respuesta
Los diseños de superficie de respuesta se clasifican de acuerdo al grado del modelo que se
pretende utilizar. El nombre de diseños de superficie de respuesta es porque se parte de que el
objetivo es describir el comportamiento de la respuesta con un modelo de regresión, y éste
describe una superficie sobre la región experimental. Después se analiza dicha superficie con
técnicas de optimización que también se clasifican de acuerdo al modelo y que permiten
localizar puntos en la dirección óptima de movimiento, el mejor punto posible dentro de la
región experimental, o bien, el punto o tratamiento óptimo cuando existe.
Algunas propiedades deseables en los diseños de superficie respuesta son:
Que genere una distribución satisfactoria de la información sobre la región experimental.
Los diseños más utilizados son puntos distribuidos en forma uniforme sobre la región
experimental, o cuando menos tienen algunas simetría respecto al centro de ésta.
El diseño debe requerir un número mínimo de corridas experimentales, ya que en cada
prueba que se realiza se gastan recursos que siempre son escasos.
El diseño debe permitir que otros diseños de orden mayor puedan construirse a partir de él.
Cuando el comportamiento de la respuesta resulta ser más complicado de lo que se pensaba
(por ejemplo: se detecta curvatura), se agregan puntos adicionales al diseño para tratar de
explicar ese comportamiento. Muchos diseños complicados se construyen a partir de diseños
más simples.
Debe permitir detectar la falta de ajuste del modelo. Se dice que un modelo no se ajusta
bien cuando existen términos todavía no incluidos en el modelo que contribuyen de manera
significativa en la explicación de la respuesta. Para poder detectar la falta de ajuste del modelo
se requieren repeticiones, al menos en el centro del diseño.
El diseño debe proporcionar un estimador puro de la varianza del error, lo que se logra con
repeticiones al menos en el punto central. Esto permite dar intervalos de confianza más
precisos para la respuesta predicha sobre el punto óptimo.
Los diseños de superficie respuesta de segundo orden son aquellos que permiten estudiar,
además de los efectos lineales y de interacción, a los efectos cuadráticos o de curvatura pura.
Por tanto estos diseños se emplean cuando se quiere explorar una región que se espera sea más
compleja o cuando se cree que el punto óptimo se encuentra ya dentro de la región
experimental. El modelo de segundo orden viene dado por
∑ ∑
∑ ∑
+€
El diseño debe tener al menos tres niveles en cada factor para poder estimar la curvatura de
la superficie en la dirección de cada factor. Es deseable que estos diseños sean ortogonales,
pero a veces no es fácil que cumplan esta propiedad y se admite alguna dependencia entre las
columnas de los contrastes. Los más utilizados tienen la propiedad de ser rotables.
Entre los diseños de superficie de respuesta destacan los diseños de Box-Behnken.
Los diseños de Box-Behnken se forman al combinar diseños factoriales en dos niveles con
los llamados diseños en bloques incompletos balanceados (60). En la figura 10 se presenta la
geometría de un diseño de Box-Behnken para tres factores.
1.8. Validación de un método analítico
La validación de un método es el procedimiento para demostrar que el método analítico es
aceptable para el fin que se pretende (48).
Figura 10. Representación del diseño de Box-Behnken
1.8.1.- Especificidad
Es la capacidad de un método analítico para distinguir un analito de todo lo que pueda
existir además de él y la muestra.
1.8.2.- Linealidad
La linealidad mide el grado en que la respuesta analítica representa a la concentración (o
cantidad) del analito se ajusta a una función lineal. Una medida superficial, pero frecuente, de
linealidad es el coeficiente de correlación al cuadrado, R2: por la Ecuación 2.
22
2
2
yyxx
yyxxR
ii
ii
Donde x es la media de todos los valores de x, e y es la media de todos los valores de y.
Para un componente mayoritario de un problema, un valor mayoritario de R2 por encima de
0,995 o quizá 0,999, se considera un buen ajuste para la mayoría de los fines.
Un mejor indicador de linealidad es un gráfico con las desviaciones verticales de los datos
experimentales respecto a la línea recta obtenida por mínimos cuadrados. Otro criterio de
linealidad es que la ordenada en el origen de la curva de calibrado (después de restar la
X3
X2
X
1
(0,0,0)
respuesta del blanco de cada estándar) debe ser próxima a 0. Un grado aceptable de proximidad
a cero podría ser un 2% de la respuesta del valor buscado del analito.
1.8.3.- Exactitud
La exactitud es la proximidad a la verdad. Los métodos de demostrar la exactitud son:
o Analizar un material estándar de referencia con una matriz semejante a la de la
muestra desconocida. El método debe encontrar el valor certificado del analito en
el material de referencia, dentro de la precisión (incertidumbre aleatoria del
método).
o Comparar los resultados de métodos analíticos diferentes. Deben coincidir con la
precisión esperada.
o Analizar una muestra de blanco dopado con una cantidad conocida de analito, La
matriz debe ser la misma matriz que la del problema.
o Si no se puede preparar un blanco con la misma matriz que la muestra problema
hay que hacer adiciones de estándar de analito a la muestra. Un análisis exacto
debe encontrar la cantidad conocida de analito que se ha añadido.
Analizar un blanco dopado es el método más común de evaluar la exactitud, porque
normalmente no se dispone de materiales de referencia, y puede no sr fácil tener a mano un
segundo método analítico. Este método asegura que la matriz de la muestra y el estándar
añadido son esencialmente los mismos. Los criterios de exactitud dependen del método
analítico y del nivel de analito.
1.8.4.- Precisión
La precisión es la reproducibilidad de un resultado. La precisión instrumental, también
llamada precisión de inyección, es la reproducibilidad observada cuando la misma cantidad de
muestra se introduce repetidas veces en un instrumento. La falta de precisión instrumental
podría provenir de variaciones en la cantidad inyectada y en variaciones de la respuesta del
instrumento.
La precisión entre ensayos se evalúa analizando alícuotas de un material homogéneo varias
veces por una misma persona, un mismo día y con un mismo equipo. Cada análisis es
independiente, de manera que la precisión entre ensayos indica la reproducibilidad del método
analítico. La variabilidad entre ensayos es de esperar que sea mayor a la variabilidad del
instrumento, porque incluye más pasos y cada uno de ellos tiene su propia variación aleatoria.
También se puede hablar de una precisión dentro de un laboratorio o precisión
intermedia, que es la variación observada cuando diferentes personas hacen un ensayo en
diferentes instrumentos y en diferentes días en un mismo laboratorio. La precisión entre
laboratorios es la reproducibilidad observada cuando se analizan alícuotas de la misma muestra
por diferentes analistas en diferentes laboratorios. Es ésta la medida más general de
reproducibilidad de un procedimiento.
1.8.5.- Intervalo de validez
Es la franja de concentraciones dentro de las cuales son aceptables la linealidad, exactitud
y precisión.
1.8.6.- Límites de detección y cuantificación
El límite de detección es la menor cantidad de analito que es significativamente distinto
del blanco. Dado que se puede definir “significativamente distinto” de varias formas, existen
varias maneras de definir el límite de detección. Si se supone que la desviación estándar de la
señal de las muestras en las proximidades del límite de detección es semejante a la desviación
estándar de los blancos (48)
o Después de estimar el límite de detección a partir de experiencias previas en la
aplicación del método, preparar una muestra cuya concentración sea de
aproximadamente 1 a 5 veces el límite de detección.
o Medir la señal de n muestras replicadas.
o Calcular la desviación estándar de las n medidas.
o Medir la señal de n blancos y hallar el valor medio, que se designará como yblanco.
o Multiplicar por el valor de la t de Student correspondiente a n-1 grados de libertad
y un nivel de confianza del 98%. La señal que se llamará límite de detección, yld, es
styy blancold (1)
Por una señal límite detectable se entiende la respuesta más pequeña del
instrumento a una muestra que es significativamente distinta de la del blanco.
o La concentración mínima detectable se puede obtener a partir de la señal límite
detectable usando la curva de calibrado. Una curva de calibrado lineal afirma que la
señal corregida, blancomuestra yy es proporcional a la concentración de la muestra:
Recta de calibrado: muestra la deión concentrac myy blancomuestra (2)
Donde ymuestra es la señal observada de la muestra, y m es la pendiente de la curva de
calibrado. La concentración de la muestra en el límite de detección se obtiene sustituyendo yld
de la ecuación de la (1) en lugar de ymuestra en la ecuación (2):
m
st detectable mínimaión Concentrac
Resumiendo, el límite de detección es la concentración de muestra que es un 99% superior
a las lecturas del blanco, pero que tiene sólo un 50% de probabilidad de ser identificado como
analito.
El límite de cuantificación se define comúnmente como syy blancold 10 . Esta señal es
suficientemente intensa para medirse con más exactitud. Otra manera de hallar el límite de
cuantificación es a partir de la ecuación de la curva de calibrado obtenida por mínimos
cuadrados, con la pendiente (m) y la ordenada en el origen (b) y una estimación de la
desviación estándar Sy, una estimación del límite de detección es, pues, ySb 3
CAPÍTULO II
MARCO METODOLÓGICO
2.1. Reactivos y soluciones
2.1.1.- Soluciones patrón
Las soluciones madres de los alquilfenoles objetos del estudio, se prepararon a una
concentración de 1000 mg/L al disolver por separado 0.0100 g de octilfenol y 0.0100 g
nonilfenol, en 10 mL de acetonitrilo. Las soluciones madres se almacenaron bajo refrigeración,
para el uso diario en la preparación de disoluciones de concentraciones intermedias, estas otras
por dilución con acetonitrilo.
2.1.2.- Solución del patrón del estándar interno
Esta solución se preparó a una concentración de 10 mg /L a partir de una solución madre
de 1000 mg/L, Para esto se tomó 100 µL de la solución madre y se transfirió a un balón de
10,0 mL, el cual se enrasó con metanol.
2.1.3.- Reactivo derivatizante
Como reactivo derivatizante se utilizó N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida +
Trimetilclorosilano (BSTFA+TMCS 99:1). Se preparó a partir del contenido de una ampolla
SUPELCO de 1 mL, el cual se mezcló con acetato de etilo en igual proporción (1:1), este se
conservó bajo refrigeración y protegido de luz.
2.1.4.- Reactivos y gases empleados
o Acetato de etilo, Burdick & Jackson
o Metanol, Sigma-Aldrich
o Acetonitrilo, Sigma-Aldrich
o n-heptano, Burdick & Jackson
o Agua desionizada y destilada con resistividad controlada a 17MΩ/cm.
o Nonilfenol alta pureza
o Octilfenol alta pureza
o Helio (AGA de Venezuela) U.A.P
2.2. Materiales de laboratorio, instrumentación y programas
2.2.1.- Instrumentos
Cromatógrafo de gases AGILENT 6890N, provisto de:
o Puerto de inyección para columnas capilares.
o Horno cromatográfico con un rango de temperatura de 50-250 ° C.
o Columna capilar HP-5ms (5% fenilsilicona-95%metilsilicona), 30 m de longitud,
0,25 mm de diámetro interno y 0,25 μm de espesor de la fase estacionaria.
o Interfase de transferencia de muestra al espectrómetro de masas.
o Espectrómetro de masas AGILENT 5973, provisto de:
o Fuente de ionización por impacto electrónico a 70 Ev.
o Separador de iones tipo cuadrupolo.
o Bomba de vacío auxiliar y turbomolecular.
o Medidor de vacío.
o Otros aparatos y accesorios:
o Balanza analítica precisa modelo XT220A.
o Termómetro Corning.
o Plancha de agitación y calentamiento Corning PC-420D.
o Estufa Shutzart Dim 40050-IP 20.
o Destilador Barstead modelo MP3A, caudal de 10 mL/min.
o Desionizador Nano pure ultrapure water system BARNSTEAD modelo D4741.
o Campana de extracción de gases.
o Reloj cronómetro.
o Baño de ultrasonido; Ultrasonic Cleaner; Cole-Parmer; alimentación 300 w; salida
100w.
2.2.3.- Material de laboratorio
o Microjeringas HAMILTON de 10 µL de capacidad.
o Barras magnéticas de agitación de diferentes longitudes y diámetros.
o Botellas Boeco tapa azul de 50, 100 y 250 mL.
o Soporte universal.
o Pipetas graduadas y volumétricas clase A, de diferentes capacidades.
o Viales de inyección cromatográfica de 5 mL de capacidad con tapa enroscable.
o Viales de vidrio de diferentes capacidades.
o Pinzas para soporte universal.
o Vasos de precipitado, pesa muestras, así como otro tipo de material elemental de
vidrio encontrado en cualquier laboratorio analítico.
o Balones aforados clase A, de diferentes capacidades.
2.2.4.- Programas
El almacenamiento y tratamiento de los datos del sistema GC-MS se realizó mediante el
programa MSD productivity chemstation. Revisión D.01.02. Librería NISTL Rev.D.04.00
(Mass Spectral Libraries). Por otro lado, los cálculos y gráficas se ejecutaron en los programas
Statgraphics plus versión 5.1 y Microsoft Excel 2007.
El tratamiento y elaboración de texto se realizo mediante Microsoft Word 2007.
2.3. Procedimiento experimental
2.3.1.- Caracterización de octilfenol y nonilfenol mediante cromatografía de gases -
espectrometría de masas.
El estudio an lítico se inicio con la caracterización de octilfenol y nonilfenol mediante GC-
MS de modo individual. Con tal fin se prepararon disoluciones de cada uno de los analitos en
acetonitrilo hasta obtener una concentración final de 100 mg/L. Utilizando una jeringa de 10
µL de capacidad, se tomaron 2 µL de la solución patrón de 100 mg/L, y se mezcló en la misma
jeringa con un microlitro del reactivo derivatizante BSTFA/TMCS y se esperó que
trascurrieran cinco minutos, se inyectó manualmente al puerto de inyección del GC-MS para
ser analizado en el modo Scan. Este procedimiento se realizó con la finalidad de conocer los
tiempos de retención de los analitos a estudiar mediante cromatografía de gases y
espectrometría de masa. En la Tabla 1 se presentan las condiciones utilizadas para la
cromatografía de gases-espectrometría de masas. Cabe destacar que la temperatura inicial del
horno en el programa cromatográfico es en todos los casos, mayor que el punto de ebullición
del solvente, así, éste último que representa la mayor parte del volumen inyectado- volatiliza y
es expulsado a la atmósfera, los analitos entonces se desplazan a través de la columna con la
rampa de temperatura.
2.3.2.- Optimización de las variables estudiadas:
a.- Microextracción con gota suspendida y reacción de derivatización.
El método de microextracción de la gota suspendida consta de una extracción líquido-
líquido a pequeña escala, que puede tener diferentes condiciones experimentales, las cuales
requirieron de diferentes ensayos para su optimización final. Para todos los casos en forma
general se utilizó un vial de 5,0 mL, al cual se le colocaron 4,0 mL de agua desionizada a pH
3,00. Esta fue fortificada con 4,0 µL de una mezcla de los analitos para que al final en el vial
las concentraciones fueran de 15 y 40 µg/L de octilfenol y nonilfenol respectivamente.
Posteriormente se introdujo en el vial un agitador magnético y se le colocó la tapa, la
cual consta de un septum de silicon/PTFE. Luego con una jeringa cromatográfíca de 10 µL
semidieron 2 µL de n- heptano, se perforó el septum del vial con la aguja de la jeringa y
seintrodujo hasta el seno de la solución para formar una microgota de un microlitro, quedando
ésta en contacto directo con la solución; inmediatamente se da inició a la agitación a una
velocidad de 500 rpm durante 30 minutos. Culminada la extracción la gota se retrae
cuidadosamente al interior de la jeringa con ayuda del embolo. Finalmente con la jeringa que
contiene el solvente de extracción se midió 1 µL de reactivo derivatizante (BSTFA/TMCS) y
se esperó que trascurrieran 5 minutos, posteriormente se inyectó en el cromatógrafo para su
posterior análisi.
Tabla 1 Condiciones utilizadas para la cromatografía de gases-espectrometría de masas.
b.- Optimización de los parámetros experimentales de la microextracción con gota
suspendida y de la reacción de derivatización.
Para la optimización de las variables experimentales que influyen en la microextracción
con gota suspendida y en la reacción de derivatización, se inició el análisis con un diseño
diagnóstico factorial fraccionado 27-3
para 7 factores a dos niveles: volumen de derivatizante,
tiempo de reacción, temperatura de reacción, velocidad de agitación, pH, efecto salino, tiempo
CROMATÓGRAFO DE GASES ESPECTRÓMETRO DE MASAS
Inyección modo Splitless Tiempo de encendido del
detector 6 min
Tiempo de abertura del
Split 1 min
Temperatura de la
interfase 280 ºC
Flujo de gas de arrastre
(He) 1 mL/min
Voltaje electrón
multiplicador 1300-1800 V
Temperatura del puerto de
inyección 250 ºC Modo Scan 50-300 uma
Programa del horno
65 ºC (1 min)
30 ºC/min hasta
100 ºC (0min)
20 ºC/min hasta
250 ºC (5 min)
Tiempo de Corrida 14.67 min
de extracción, esto con el propósito de determinar las variables significativas que están
involucradas en el sistema analítico objeto de estudio. Las variables estudiadas y sus niveles
alto y bajo son mostrados en la Tabla 2.
La matriz codificada del diseño factorial fraccionado 27-3
involucró 32 experimentos
(Tabla 3). Los experimentos fueron realizados utilizando muestras de agua desionizada
fortificadas con los volúmenes adecuados para obtener concentraciones finales de 15 y 40
µg/L para octilfenol y nonilfenol respectivamente.
c.- Diseño superficie respuesta de Box Behnken
Con la finalidad de determinar los valores óptimos para cada uno de los factores que
resultaron significativos del diseño factorial 27-3
se realizó el diseño superficie respuesta de
Box Behnken de tres factores y tres niveles. En la tabla 4 se muestra la matriz codificada para
el diseño de superficie respuesta de Box Behnken y la tabla 5, muestra un resumen de los
factores y sus diferentes niveles.
Tabla 2. Resumen de las variables con sus niveles altos y bajos
Nivel
Factores Código Alto (+1) Bajo (-1)
Volumen de BSTFA (µL)
A
1,8
1
Tiempo de Reacción (Min) B 5 1
Temperatura de Reacción (°C) C 50 25
pH D 4,5 3
Velocidad de agitación (rpm) E 500 150
Concentración de NaCl
(µg/L)
F 0,1 0
Tiempo de extracción G 30 15
Tabla 3. Matriz de optimización codificada para diseño factorial 27-3
Nro. Exp A B F C D E G
1 1 -1 1 -1 1 1 -1
2 -1 1 -1 -1 1 1 1
3 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1
4 1 1 1 1 1 1 1
5 -1 -1 -1 1 1 1 -1
6 -1 -1 1 -1 1 -1 1
7 1 -1 1 1 -1 -1 -1
8 1 1 1 -1 -1 -1 1
9 1 -1 -1 1 1 -1 1
10 -1 1 1 1 1 -1 -1
11 1 -1 -1 1 -1 1 -1
12 1 -1 -1 -1 -1 1 1
13 -1 1 -1 1 -1 -1 1
14 -1 -1 1 1 -1 1 1
15 1 1 -1 -1 1 -1 -1
16 -1 1 1 -1 1 1 -1
17 1 -1 1 -1 1 1 -1
18 -1 1 -1 -1 1 1 1
19 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1
20 1 1 1 1 1 1 1
21 -1 -1 -1 1 1 1 -1
22 -1 -1 1 -1 1 -1 1
23 1 -1 1 1 -1 -1 -1
24 1 1 1 -1 -1 -1 1
25 1 -1 -1 1 1 -1 1
26 -1 1 1 1 1 -1 -1
27 1 -1 -1 1 -1 1 -1
28 1 -1 -1 -1 -1 1 1
29 -1 1 -1 1 -1 -1 1
30 -1 -1 1 1 -1 1 1
31 1 1 -1 -1 1 -1 -1
32 -1 1 1 -1 1 1 -1
Tabla 4. Matriz de optimización codificada para el diseño Box Behnken
Nro. Exp Bloque A B C
1 1 0 0 0
2 1 0 -1 -1
3 1 -1 1 0
4 1 -1 0 -1
5 1 0 0 0
6 1 1 0 -1
7 1 1 -1 0
8 1 0 0 0
9 1 -1 -1 0
10 1 1 1 0
11 1 0 1 -1
12 1 1 0 1
13 1 0 0 0
14 1 0 -1 1
15 1 0 1 1
16 1 -1 0 1
17 2 0 0 0
18 2 0 -1 -1
19 2 -1 1 0
20 2 -1 0 -1
21 2 0 0 0
22 2 1 0 -1
23 2 1 -1 0
24 2 0 0 0
25 2 -1 -1 0
26 2 1 1 0
27 2 0 1 -1
28 2 1 0 1
29 2 0 0 0
30 2 0 -1 1
31 2 0 1 1
32 2 -1 0 1
Tabla 5. Resumen de los factores y diferentes niveles para el diseño de Box Behnken
Nivel
Factores Código -1 0 1
Volumen de BSTFA (µL) B 1 1,4 1.8
Velocidad de agitación (rpm) A 100 250 500
Concentración de NaCl(µg/L) C 0 0.05 0.1
2.4. Aplicación y validación del método propuesto
2.4.1.- Curvas de calibración
Para establecer el rango lineal de trabajo para el método estudiado, se construyeron las
curvas de calibrado, aplicando el método del estándar interno. Para ello se preparó por
duplicado un vial, con 4,0 mL de agua desionizada, la cual fue fortificada con el estándar
interno (Trifenilfosfato) para obtener una concentración final de 10 µg/L y disoluciones patrón
de los analitos, para obtener concentraciones finales de 0,1- 5,0 -10 - 15 - 20 µg/L para el
octilfenol y 0,5 - 4,0 - 7,0 - 12 y 15 µg/L para el nonilfenol. Posteriormente se aplicó la
metodología descrita.
2.4.2.- Estudio de recuperación
Se realizó un estudio de recuperación, sobre muestras de agua del lago de Maracaibo. Las
muestras fueron fortificadas a niveles de concentración de 1,0 y 2,0 µg/L para cada analito.
Cada nivel de concentración fue analizado seis (6) veces empleando la metodología
optimizada. El porcentaje de recuperación fue calculado empleando la expresión:
100ón Recuperaci %exp
teoC
C
Donde,
Cteo: concentración teórica
Cexp: concentración experimental
2.4.3. Parámetros de calidad del método analítico
a. Precisión:
La precisión del método analítico se evaluó a partir de la repetibilidad de la señal analítica
obtenida independientemente de 6 soluciones de concentración de 1,0; 2,5 y 5,0 µg/L.
b.- Limites de detección y cuantificación:
Los límites de detección (LD) y de cuantificación (LQ) se calcularon, a partir del criterio
IUPAC de 3 y 10 veces la relación señal/ruido (S/R) para las señales cromatográficas,
correspondientes a una concentración de 0,1μg/L para octilfenol y de 0,5 μg/L, en el caso del
nonilfenol.
c. Sensibilidad:
El valor de la sensibilidad del calibrado es determinado por la pendiente de la curva de
calibración.
2.4.4.- Aplicación del método analítico
El método optimizado fue aplicado a ocho (8) muestras de agua del lago de
Maracaibo, tomadas en diferentes puntos del cuerpo lacustre. Figura 11.
El análisis se realizó por duplicado a cada una de las muestra según la metodología
desarrollada.
En primer lugar las muestras fueron filtradas en un embudo de filtración de vidrio
sinterizado marca ADVANTEC, utilizando un filtro de ester de celulosa (ADVANTEC) con
poro 0,45 µm y 47 mm.
Se trazó una curva de calibración para cada analito, utilizando disoluciones patrones de
concentración de 0,1 – 1,0 y 2,0 µg/L para el octilfenol y 0,5 – 1,0 y 2,0 para el nonilfnol.
Luego se procedió a la cuantificación de los analitos en las diferentes muestras, a partir de la
ecuación de la línea recta proporcionada por las curvas de calibrado respectivas.
Figura 11. Ubicación geográfica de los puntos de muestreo
D
F
A – B- E
H-G
c Ubicación geográfica de
los
puntos de muestreo A-B : Vertidos industrial
E: La Rita
H: Plaza Santa Rosa de
Agua
G: Plaza Buen Maestro
F : Santa Cruz de Mara
D; Nazaret del Mojan
C: San Francisco
CAPÍTULO III
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Caracterización de los derivados silanizados del octilfenol y nonilfenol mediante
cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)
El estudio analítico se inicio con la caracterización cromatográfica de los derivados
silanizados del octilfenol y el nonilfenol, mediante GC-MS de modo individual. Con tal fin se
sometieron a un proceso de silanización, disoluciones de nonilfenol y octilfenol con una
concentración de 100 mg/L. Como reactivo silanizante se utilizo la mezcla BSTFA/TMCS
99:1. Los productos de la reacción de derivatización, se inyectaron en el GC-MS para ser
analizados en el modo Scan y de esta forma obtener los tiempos de retención y los espectros
de masa respectivos.
Las Figuras 12, 13 y 14, representan el cromatograma, el espectro de masa obtenido
experimentalmente para el derivado silanizado del octilfenol y el espectro de masa de
referencia de octilfenol encontrado en la literatura respectivamente.
Figura 12. Cromatograma obtenido experimentalmente para el derivado silanizado del
octilfenol.
Figura 13. Espectro de masa obtenido experimentalmente del derivado silanizado de
octilfenol.
Figura 14. Espectro de masa del derivado silanizado del octilfenol de referencia (56).
Las Figuras 15 y 16, representan el cromatograma y el espectro de masa obtenido para
nonilfenol de manera experimental, y la Figura 17 representa el espectro de masa de referencia
de nonilfenol encontrado en la literatura.
Las Figuras 13 y 14; 16 y 17 muestran correlaciones exactas entre los espectros de masa
experimentales y los reportados en la literatura tanto para los derivados silanizados del
octilfenol como para los del nonilfenol. Esto permitió confirmar el proceso de derivatización.
Con respecto al cromatograma del nonilfenol (Figura 15), se puede observar que existen
varias señales, esto se debe a la presencia de los diferentes isómero presentes. Cabe destacar
que todos estos isómeros presentan el mismo espectro de masa.
Los espectros de masa y los tiempos de retención son los elementos de caracterización que
permiten distinguir los analitos dentro de una muestra. Una vez establecidos los fragmentos
principales para cada alquilfenol (Tabla 6) se cambió el modo de operación del espectrómetro
de masa al modo SIM para realizar los análisis posteriores.
Figura 15. Cromatograma obtenido experimentalmente para el derivado silanizado del
nonilfenol
Figura 16. Espectro de masa obtenido experimentalmente del derivado silanizado del
nonilfenol
Figura 17. Espectro de masa del derivado silanizado del nonilfenol de referencia (56)
Tabla 6. Tiempos de retención y fragmentos de masa para octilfenol y nonilfenol
Analito Tiempo de retención
(min) Fragmentos principales
Octilfenol 8,54 73 - 207
Nonilfenol 9,05 - 9,11 -9,15-9,21-9,30 73 - 179 - 193 - 207 - 221
3.2. Optimización de los parámetros experimentales para la reacción de derivatización y
la microextracción con gota suspendida
El proceso de la microextracción con gota suspendida, puede estar afectado por múltiples
variables, tales como: efecto salino, pH de la muestra, velocidad de agitación y tiempo de
extracción (58).
Efecto salino: consiste en el aumento de la fuerza iónica, por adición de una sal, con la
finalidad de disminuir la solubilidad de los analitos en el agua, facilitando su pase a la fase
orgánica o gota originando un aumento de la sensibilidad.
pH de la muestra: Este parámetro afecta el equilibrio de disociación de los analitos en
medio acuoso. El pH de la disolución acuosa debe ajustarse a valores que promocionen la
forma neutra de los analitos, de tal manera que favorezca la transferencia de masa de los
mismos a la gota, mejorando la extracción.
Velocidad de agitación: la agitación facilita el trasporte de masa desde la muestra acuosa
hasta la gota, para acelerar la cinética del proceso reduciendo el tiempo de extracción. Es
importante resaltar que altas velocidades de agitación, puede provocar el desprendimiento de la
gota a la solución.
Tiempo de extracción: este factor debe ser optimizado y controlado de tal manera que
permita obtener suficiente reproducibilidad y eficiencia en la extracción. Además, es importante
resaltar que un tiempo prolongado de extracción puede provocar la disolución de la gota.
Por otra parte los factores que pueden, afectar la reacción de derivatizaciòn son:
temperatura, volumen de derivatizante y tiempo de reacción. Estos parámetros deben
optimizarse a valores que permitan una reacción completa, de tal manera que favorezca la señal
analítica.
Todas estas variables en conjunto pueden interactuar entre ellas mismas, y afectar el
proceso de extracción y derivatización. Por tal razón, se recomienda la optimización
multivariante como una metodología experimental que permite al investigador obtener la
información buscada con el mínimo costo y garantizando la máxima fiabilidad de los resultados
(58-59).
La primera etapa de una optimización multivariante, consiste de una fase de diagnóstico
de los factores que influyen significativamente sobre la respuesta. Con este propósito se
emplean los diseños factoriales a dos niveles.
Esta etapa de optimización de las variables experimentales se inicio con un diseño
diagnostico factorial fraccionado 27-3
para los siguientes 7 factores a dos niveles: volumen de
derivatizante, tiempo de reacción, temperatura de reacción, velocidad de agitación, pH, efecto
salino y tiempo de extracción, esto con el propósito de determinar las variables significativas
que están involucradas en el sistema analítico objeto de estudio. Las variables estudiadas y sus
niveles alto y bajo son mostrados en la Tabla 7. Los experimentos fueron realizados utilizando
muestras de agua desionizada fortificadas con los volúmenes adecuados para obtener
concentraciones finales de 15µg/L para octilfenol y 40µg/L para nonilfenol.
En este estudio se seleccionó como solvente de extracción el n- heptano, basado en
experiencias anteriores (61), en donde es reportado como mejor solvente de extracción al
compararlo con otros solventes (hexano, iso- octano) debido a la estabilidad de la gota,
consistencia durante la extracción y eficiencia de extracción, la cual fue demostrada por el
tamaño de las áreas.
Los experimentos del diseño fueron realizados en un orden al azar. Los resultados
obtenidos se presentan en la Tabla 7. Para evaluar los resultados se aplicó un análisis de la
varianza (ANOVA) el cual permite determinar qué efectos eran estadísticamente significativos
al 95% de confianza. En la gráfica de Pareto (Figura 18) y la tabla de ANOVA (Tabla 8), se
puede observar las variables que resultaron significativas, en el caso de octilfenol fueron:
tiempo de extracción, velocidad de agitación, volumen de derivatizante y efecto salino (p˂
0,05); y en la Figura 19 y la Tabla 9, se observan las variables significativas para el nonilfenol:
volumen de derivatizante y velocidad de agitación (p˂0,05).
El pH y la temperatura de reacción, no son factores significativos para la respuesta analítica
de los alquilfenoles estudiados, en consecuencia estas variables pueden mantenerse fijas durante
la optimización, sin embargo el tiempo de extracción a pesar que resultó ser un parámetro
significativo en el caso del octillfenol se deja constante, ya que esta variable requiere de mucho
tiempo para alcanzar el punto de equilibrio, y de esta manera simplificar el siguiente paso de la
optimización a tres factores: velocidad de agitación, volumen de derivatizante y efecto salino.
Una vez establecidas las variables significativas se procedió a determinar los valores
óptimos de estas variables mediante un estudio de superficie de respuesta.
Se aplicó un diseño Box-Behnken, para la optimización de las tres variables que resultaron
significativas: velocidad de agitación, volumen de derivatizante y efecto salino. Este diseño
consistió de 32 experimentos de tres factores a tres niveles, el cual se realizó con agua
desionizada a 15 y 40 µg/mL de octilfenol y nonilfenol respectivamente, a pH 3, 0; y cinco
minutos para la reacción de derivatización a 25 ºC. Los experimentos fueron realizados en un
orden al azar. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla.10
Tabla 7. Resultados del diseño diagnostico factorial fraccionado 27-3
Factores
¨
Áreas
Nro. Exp
A
B
F
C
D
E
G
Octilfenol
Nonilfenol
1 1.8 1 0,1 25 4,5 500 15 3512002 4748909
2 1 5 0 25 4,5 500 30 13143459 23926722
3 1.8 1 0 25 3 150 15 1138550 2029323
4 1.8 5 0,1 50 4,5 500 30 1858776 2622788
5 1 1 0 50 4,5 500 15 9530306 11915235
6 1 1 0,1 25 4,5 150 30 583230 1238812
7 1.8 1 0,1 50 3 150 15 2075970 2275312
8 1.8 5 0,1 25 3 150 30 912734 1452514
9 1.8 1 0 50 4,5 150 30 929842 1520919
10 1 5 0,1 50 4,5 150 15 228439 812445
11 1.8 1 0 50 3 500 15 4665959 8819455
12 1.8 1 0 25 3 500 30 8496701 10871323
13 1 5 0 50 3 150 30 11098829 9617159
14 1 1 0,1 50 3 500 30 16604307 25476012
15 1.8 5 0 25 4,5 150 15 2740005 4116569
16 1 5 0,1 25 4,5 500 15 5052074 34198841
17 1.8 1 0,1 25 4,5 500 15 3138050 5870249
18 1 5 0 25 4,5 500 30 12992224 19649434
19 1 1 0 25 3 150 15 2724013 3524658
20 11.8 5 0,1 50 4,5 500 30 2569152 7491776
21 1 1 0 50 4,5 500 15 8137347 11566987
22 1 1 0,1 25 4,5 150 30 3851548 4979003
23 1.8 1 0,1 50 3 150 15 627689 1812388
24 1.8 5 0,1 25 3 150 30 1335766 2530405
25 1.8 1 0 50 4,5 150 30 2264239 4382203
26 1 5 0,1 50 4,5 150 15 1228676 2473848
27 1.8 1 0 50 3 500 15 4681014 12738708
28 1.8 1 0 25 3 500 30 4891614 9859307
29 1 5 0 50 3 150 30 3181900 4616528
30 1 1 0,1 50 3 500 30 13233933 13323103
31 1.8 5 0 25 4,5 150 15 861052 1800839
32 -1 5 0,1 25 4,5 500 15 3839418 6575081
Tabla 8. Análisis estadístico de varianza (ANOVA) para octilfenol
Figura 18. Gràfica de pareto de los efectos estudiados a partir del diseño factorial fraccionado
27-3
para octilfenol
Tabla 9. Analisis de varianza ANOVA para el nonilfenol
Figura 19. Gràfica de pareto de los efectos estudiados a partir del diseño factorial fraccionado
27-3
para nonilfenol.
Tabla 10. Resultados del diseño Box-Behnken
Factores
Área
Nro. Exp Bloque A B C
Octilfenol
Nonilfenol
1 1 250 1,4 0,05 3422453 4107838
2 1 250 1 0 3184927 2391566
3 1 100 1,8 0,05 1128047 2326927
4 1 100 1,4 0 819920 2053328
5 1 250 1,4 0,05 2694552 4515079
6 1 250 1,4 0 4532587 1183698
7 1 500 1 0,05 3707523 4650785
8 1 250 1,4 0,05 343240 644472
9 1 100 1 0,05 664406 604703
10 1 500 1,8 0,05 1261144 3078126
11 1 250 1,8 0 1239532 4026138
12 1 500 1,4 0,1 4508061 6003464
13 1 250 1,4 0,05 2073063 3003119
14 1 250 1 0,1 3755184 2921703
15 1 250 1 0,1 1290152 2857665
16 1 100 1,4 0,1 726669 1551354
17 2 250 1,4 0,05 2841812 4267447
18 2 250 1 0 4914923 6689653
19 2 100 1,8 0,05 530067 698416
20 2 100 1,4 0 802035 2548420
21 2 250 1,4 0,05 2566511 6088512
22 2 500 1,4 0 6491605 12551755
23 2 500 1 0,05 5310882 6975301
24 2 250 1,4 0,05 2307235 5568669
25 2 100 1 0,05 635003 75384
26 2 500 1,8 0,05 3548311 6743192
27 2 250 1,8 0 1977849 5347519
28 2 500 1 0,1 2708796 3715358
29 2 250 1 0,05 2899872 5147486
30 2 250 1 0,1 5157798 5037374
31 2 250 1,8 1 2083741 3296320
32 2 100 1,4 1 872739 2213620
Los resultados del diseño de Box-Behnken fueron evaluados mediante un análisis de la
varianza (ANOVA). En la Figura 20 y la Tabla 11 se observan los efectos principales de las
variables estudiadas para octilfenol.
Tabla 11. Analisis de varianza de los efectos principales de Octilfenol (Box-Behnken.)
Analysis of Variance for AOctilfenol
--------------------------------------------------------------------------------
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
--------------------------------------------------------------------------------
A:VAgit 4.18933E13 1 4.18933E13 47.43 0.0000
B:uLBSTFA 1.27303E13 1 1.27303E13 14.41 0.0011
C:ConcNaCl 5.1131E11 1 5.1131E11 0.58 0.4552
AA 6.34233E11 1 6.34233E11 0.72 0.4063
AB 2.60793E12 1 2.60793E12 2.95 0.1004
AC 1.79058E12 1 1.79058E12 2.03 0.1692
BB 1.53542E9 1 1.53542E9 0.00 0.9671
BC 5.38937E10 1 5.38937E10 0.06 0.8073
CC 2.60627E12 1 2.60627E12 2.95 0.1005
blocks 3.31384E12 1 3.31384E12 3.75 0.0663
Total error 1.85473E13 21 8.83206E11
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corr.) 8.46905E13 31
R-squared = 78.0999 percent
R-squared (adjusted for d.f.) = 69.1407 percent
Standard Error of Est. = 939790.0
Mean absolute error = 601778.0
Durbin-Watson statistic = 1.82129
Figura 20. Influencia de los factores principalesen en la respuesta del octilfenol (Box-
Behnken.)
En Tabla 11 Correspondiente al análisis estadístico de varianza ANOVA, se demuestra
que para el octilfenol, las variables más significativas en el proceso de extracción y
derivatización son la velocidad de agitación y el volumen de reactivo derivatizante, dado que el
p-value es menor a 0,05. En cuanto a las interacciones, las que resultaron significativas fueron
las interaciones entre la velocidad de agitación y la concentración de NaCl y entre la
velocidad de agitación y el volumen de derivatizante. Dichas interacciones son observadas en
las figuras: 21; 22; 23.
En la Figura 21 se puede observar, un aumento de la señal analítica, a menores
concentraciones de cloruro de sodio (0g) y mayores valores en la velocidad de agitación (500
rpm).
La Figura 22, muestra una tendencia al aumento de la señal analítica a menores volumen
de reactivo derivatizante (1µL), y menores concentraciones de cloruro de sodio (0g).
La Figura 23, muestra una tendencia al aumento de la señal analítica a menores volúmenes
de reactivo derivatizante y mayores velocidades de agitación.
En la Figura 24, se muestran los principales efectos de las variables estudiadas en la señal
analítica del octifenol, y se observa que ésta aumenta a menor volumen de derivatizante y
mayores velocidades de agitación. También se observa como la señal analítica se ve
desfavorecida con la adición de sal.
En la Tabla 12 correspondiente al análisis estadístico de varianza ANOVA para nonilfenol,
se observa, que el único parámetro significativo en la extracción y derivatización del nonilfenol,
es la velocidad de agitación, ya que es la única variable con un p-value menor a 0,05. Con
respecto a las interacciones, ninguna es reportada con valores menores 0.05, por lo cual se
consideran no significativa. En las figuras: 25; 26. y 27. se observan las interacciones entre los
diferentes factores.
En la figura 24, se muestran los principales efectos de las variables estudiadas en la señal
analítica del nonilfenol, y se observa que ésta aumenta a mayores velocidades de agitación,
mientras que el volumen de derivatizante no causa un efecto importante. También se observa
como la señal analítica se ve desfavorecida con la adición de sal.
En la Figura 25 se observa un leve aumento de la señal analítica para nonilfenol a los
valores centrales de volumen de derivatizante y un aumento de la señal analítica a menores
valores de concentración de NaCl.
La Figura 26, muestra una tendencia al aumento de la señal analítica para el nonilfenol a
menores concentraciones de NaCl y mayores velocidades de agitación.
La Figura 27, se muestra una tendencia al aumento de la señal analítica para el nonilfenol
a menor volúmen de reactivo derivatizante y mayor velocidad de agitación.
Los resultados obtenidos confirman que la velocidad de agitación es la variable que
mayor significancia tiene sobre la extracción de ambos analitos, mientras que el volumen de
derivatizante resultò solo ser significativo para octilfenol.
En forma general, hay una tendencia al aumento de la señal analítica a menor volumen de
reactivo derivatizante, mayor velocidad de agitación y a menor concentración de NaCl. Es
importante destacar, que en el caso del nonilfenol la señal analítica se ve ligeramente
favorecida a valores intermedio de volumen derivatizante, sin embargo, de fija como valor
optimo el menor volumen de reactivo derivatizante, para no sacrificar la señal analítica del
octilfenol Dado que la velocidad de agitación se estudió al máximo de sus posibles valores
(valores mayores a 500 rpm hacen caer la gota) y la concentración de NaCl posible, la
optimización puede ser considerada como satisfactoria.
En la tabla 13 se presenta un resumen de todas las variables estudiadas con los resultados
obtenidos a partir del diseño factorial fraccionado y del diseño diseños de Box-Behnken., para
optimizar las condiciones de trabajo experimental del método desarrollado.
(a)
(b)
Figura 21 Gráfica obtenida del diseño de Box-Behnken para el efecto de la concentración de
NaCl vs. velocidad de agitación. para octilfenol: a) superficies de respuesta b) contorno
superficie de respuesta.
(a)
(b)
Figura 22 Gráfica obtenido del diseño de Box-Behnken para el efecto de la concentración de
NaCl vs. volumen de derivatizante para octilfenol: a) superficie de respuesta b) contorno
superficie de respuesta.
(a)
(b)
Figura 23. Gráfica obtenida del diseño de Box-Behnken para el efecto de velocidad de
agitación vs. volumen de derivatizante para el octilfenol: a) superficie respuesta b) contorno
superficie respuesta.
Tabla 12 Análisis estadístico de varianza (ANOVA) para nonilfenol (Box-Behnken.)
Figura 24. Influencia factores principales para nonilfenol (Box-Behnken)
Analysis of Variance for ANonilfenol
--------------------------------------------------------------------------------
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
--------------------------------------------------------------------------------
A:VAgit 6.73611E13 1 6.73611E13 17.25 0.0005
B:uLBSTFA 5.90692E10 1 5.90692E10 0.02 0.9033
C:ConcNaCl 5.2845E12 1 5.2845E12 1.35 0.2578
AA 2.49579E12 1 2.49579E12 0.64 0.4330
AB 2.15284E12 1 2.15284E12 0.55 0.4661
AC 1.26394E12 1 1.26394E12 0.32 0.5755
BB 1.73112E12 1 1.73112E12 0.44 0.5128
BC 5.49954E11 1 5.49954E11 0.14 0.7112
CC 1.08541E12 1 1.08541E12 0.28 0.6036
blocks 3.01175E13 1 3.01175E13 7.71 0.0113
Total error 8.20227E13 21 3.90584E12
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corr.) 1.94124E14 31
R-squared = 57.7473 percent
R-squared (adjusted for d.f.) = 40.462 percent
Standard Error of Est. = 1.97632E6
Mean absolute error = 1.14257E6
Durbin-Watson statistic = 2.17449
(a)
(b)
Figura 25. Gráfica obtenido del diseño de Box-Behnken para el efecto de la concentración de
NaCl vs. Volumen de derivatizante.nonilfenol: a) superficie respuesta b) Contorno superficie
respuesta.
(a)
(b)
Figura 26. Gráfica obtenida del diseño de Box-Behnken para el efecto de la concentración
NaCl vs.velocidad de agitación. para nonilfenol: a) superficie respuesta b) Contorno superficie
respuesta.
(a)
(b)
Figura 27. Gráfica obtenida del diseño de Box-Behnken para el efecto de la velocidad de
agitación vs. Volumen de derivatizante. para nonilfenol: a) superficie respuesta b) Contorno
superficie respuesta.
Tabla 13. Resultados obtenidos de la optimización de las condiciones experimentales del
método analítico empleando la microextracción con gota suspendida con reacción de
derivatizaciòn.
Se utilizó n - heptano para la gota de extracción.
3.3. Validación y aplicación del método analítico
3.3. 1.- Curva de calibración
Una vez obtenidas las condiciones experimentales óptimas para la microextracción con
gota suspendida y la reacción de derivatización, se procedió a validar y aplicar la metodología
desarrollada para la determinación de octilfenol y nonilfenol en muestras de agua. La misma
se inició con la construcción de las curvas de calibrado, aplicando el método del estándar
interno. Para ello se preparó por duplicado un vial, con 4,0 mL de agua desionizada, la cual fue
fortificada con el estándar interno (Trifenilfosfato) y con disoluciones patrón de los analitos,
para obtener concentraciones finales de 0,1- 5,0 – 10 – 15 – 20 µg/L para el octilfenol y 0,5 –
4,0 – 7,0 – 12 y 15 µg/L para el nonilfenol.
En la Tabla 14 se muestran los principales parámetros estadísticos de calibrado, calculados
mediante el método de mínimos cuadrados. En las Figuras 28 y 29 se representan las curvas de
Variables Condición
óptima
Efecto salino, NaCl (%m/v) 0
Tiempo de extracción (min.)
30
Velocidad de agitación (rpm)
500
Tiempo de reacción (min)
Volumen de derivatizante (µL)
5
1,0
pH de la muestra
3,00
Temperatura de reacción (°C)
25
calibrado obtenidas. Los valores obtenidos para los coeficientes de correlación son buenos,
indicando un buen ajuste de la respuesta analítica a la ecuación de la línea recta
Figura 28. Curva de calibrado del Octilfenol
Figura 29. Curva de calibrado del Nonilfenol
Tabla 14. Parámetros estadísticos de las curvas de calibración para la extracción liquido-
liquido con gota suspendida.
Parámetro A Sa B Sb r
Octilfenol 0,1167 0.0674 0,2104 0.0060 0,9959
Nonilfenol 0,2149 0,0693 0.1439 0.008156 0.9843
A: Intercepto Sa: desviación estándar de intercepto B: pendiente Sb: desviación estándar de la pendiente r:
coeficiente de correlación.
3.3.2.- Parámetros de calidad del método analítico
En la Tabla 15 se reportan los distintos parámetros analíticos calculados para el método de
análisis de Octilfenol y Nonilfenol propuesto. Resaltan los bajos límites de detección y
cuantificación de estos alquilfenoles, lo cual permiten su determinación a niveles de
concentración muy bajos incluso trazas, calificando dicha metodología como útil, ya que dichos
contaminantes representan una amenaza para la vida acuática, y además sus características de
persistencia y bioacumulación los convierten en un peligro para los seres humanos, ya que
pueden llegar a ellos a través de las cadenas tróficas.
Es importante también destacar que la desviación estándar relativa, calculada con base a seis
(6) determinaciones consecutivas bajo las condiciones óptimas, coincidieron con las
encontradas por otros investigadores que emplearon microextracción con gota suspendida en
sus análisis, tales como, Lorena vidal y col. un 2,1 a 13,2 % para el caso de clorobencenos en
muestras de agua (62) Saraji y col. con un 12,3% en la detección de ácidos haloacéticos (63) y
Romero y col. con valores hasta 19% para el caso de antibióticos (49).
Tabla.15 Parámetros de calidad del método analítico
Parámetros de calidad del método analítico % DER
LD Lg / LQ Lg / 1
Lg /
2.5
Lg / 5,0
Lg /
Octilfenol 0.0048 0,016 12,24 4,27 11,46
Nonilfenol 0.036 0.12 10,08 8,23 8,49
µg/L
LD:Límite de detección. LQ:Límite de cuantificación. %DER:Porcentaje de desviación estándar relativa
3.3.3.- Estudio de recuperación en muestras de agua del lago de Maracaibo
Se realizó un estudio de recuperación, sobre muestras de agua del lago de Maracaibo. Las
muestras fueron fortificadas a niveles de concentración de 1,0 y 2,0 µg/L para cada analito.
Cada nivel de concentración fue analizado seis (6) veces empleando la metodología
optimizada. Los resultados obtenidos se muestran en las Tablas 16 y 17.
Se observa, que los porcentaje de recuperación obtenidos en las muestras de agua a los
niveles de concentración estudiados, se encuentran entre el 87 y el 91.5 % para el nonilfenol
y el 86 y 92 % para el octilfenol, por tanto el método puede considerarse válido para la
detección y cuantificación de dichos analitos.
Tabla.16 Valores de recuperación para el octilfenol en muestras de agua del lago de Maracaibo.
Concentració
n añadida
( Lg / )
Concentración
encontrada
( Lg / ) sx
Porcentajes de
Recuperación
(%) sR %
1,00
1,08
0,86
0,83
0,82
1,20
0,86
108,0
86,0
0.94±0.16 83,0 86,0±1.17
82,0
105,0
86,0
2,00
1,74
1,84 0,19
86,8
92,0 9,96
1,89 94,4
1,84 91,9
1,61 80,6
1,77 88,4
2,20 109,9
Tabla17. Valores de recuperación para el nonilfenol en muestras de agua del lago de Maracaibo.
Concentració
n añadida
( Lg / )
Concentración
encontrada
( Lg / ) sx
Porcentajes de
Recuperación
(%)
sR %
1,0
0,83
0,98
0,98
0,96
0,86
0,93
83,0
98,0
0,93±0.064 98,0 91,5±5.82
96,0
86,0
93,0
2,00
1,61
1.73±0.35
80,4
87,55±9.92
1,64 82,4
2,14 107,0
1,74 87,2
1,63 81,6
1,73 86,7
3.3.4.- Aplicación del método desarrollado en muestras de agua del lago de Maracaibo.
El método optimizado fue aplicado a ocho (8) muestras de agua del lago de Maracaibo,
tomadas en diferentes puntos del cuerpo lacustre. El análisis se realizó por duplicado a cada una de
las muestras según la metodología desarrollada. En la Tabla 18 se presentan los resultados de la
cuantificación de los alquilfenoles en muestras de agua del lago de Maracaibo, observándose
mayores concentraciones de los analitos en aquellas tomadas en las cercanías de los vertidos
industriales (vertidos Industriales A; vertidos Industriales B). Las concentraciones encontradas
oscilan entre 0,12 – 0,79 µg/L y 0,20 – 1.43 µg/L para octilfenol y nonilfenol respectivamente,
lo cual podrían considerarse importantes si se compara con los valores máximos permitidos,
establecidos en la Norma de Calidad Ambiental (NCA) de la UE. Estos valores son 2,0 y
0.01µg/l para nonilfenol y octilfenol respectivamente (41).
También es importante destacar la presencia de los alquilfenoles en la mayoría de las
muestras tomadas en los diferentes puntos, demostrandose su persistencia en el medio
ambiente y la contaminación de las aguas por diferentes fuentes. Todo esto justifica la
continuidad de los estudios para el desarrollo de metodologías que permitan el monitoreo y
cuantificación de los alquilfenoles, y así de esta manera, los organismos competentes
desarrollen normativas que regulen el vertido de estos contaminantes en los diferentes cuerpos
de agua.
Tabla.18 Resultados de la cuantificación de los analitos en muestras de agua del lago de
Maracaibo.
Muestra
Octilfenol
( Lg / )
Nonilfenol
( Lg / )
San Francisco (C) 0,12 N.D
San Francisco (C) 0.14 N.D
Nazaret ( El Mojan) (D) 0,15 0,23
Nazaret( El Mojan) (D) 0,15 0,20
La Rita (E) 0,12 0,59
La Rita (E) 0,14 0,58
Santa cruz de Mara (F) ND ND
Santa cruz de Mara (F) N D N D
Plaza Buen Maestro (G) 0,79 0,60
Plaza Buen Maestro (G) 0,68 0,65
Plaza Santa Rosa de Agua
(H) 0,47 0,42
Plaza Santa Rosa de Agua (H) 0,43 0,46
Vertidos Industriales (A) 0,77 1,12
Vertidos Industriales (A) 0,78 1,3
Vertidos Industriales (B) 0,43 1,4
Vertidos Industriales (B) 0,38 1,43
CONCLUSIONES
1. Se desarrolló un nuevo método para la determinación de octilfenol y nonilfenol en muestras
de agua mediante microextracción con gota suspendida, derivatización y cromatografía de
gases-espectrometría de masas.
2. Para el método propuesto las mejores respuestas analíticas se encontraron empleando
muestras de agua a pH 3,0; una gota de 1 L heptano como fase orgánica de extracción, una
velocidad de agitación de 500 rpm, un tiempo de extracción de 30 min, 1,0 L de
derivatizante (BSTFA/TMCS) con un tiempo de 5 min de reacción y una temperatura de 25C.
3. El método SDME-GC/MS presenta una adecuada linealidad en el rango de 0.1 a 20 Lg
para octilfenol y de 0,5 a 15 Lg para octilfenol (r entre 0,9959 y 0,9843)
4. Los límites de detección son 0,0048 - 0,036 Lg para el octilfenol y nonilfenol
respectivamente, mientras que los de cuantificación varían entre 0,016 - 0,12 Lg para dichos
alquilfenoles. La desviación estándar relativa del método estuvo entre 1,17 – 9,96 %.
5. Se validó y aplicó el método de análisis desarrollado para el análisis de octilfenol y
nonilfenol sobre muestras de agua del lago de Maracaibo. El estudio de recuperación llevado a
cabo en dos niveles de concentración arrojó porcentajes entre 86,0 – 92,0 % en el caso del
octilfenol, mientras que se encontraron entre 91,5– 92,0% para el nonilfenol.
6. La concentraciones de nonilfenol y octilfenol encontradas en las muestras tomadas en los
diferentes puntos del lago de Maracaibo, oscilaron entre 0,20 a 1,43 µg/L y 0,12 a 0,79 µg/L
respectivamente, lo que demuestra la contaminación por diferentes fuentes, ya sea por
descargas industriales o domesticas, lo que implica los posibles efectos estrogenícos de estos
contaminantes en la vida acuática de dicho ambiente.
7. El método desarrollado se caracteriza por su bajo costo, simplicidad, adecuada sensibilidad
y lo que es muy importante es respetuoso con el medio ambiente
RECOMENDACIONES
1. Debido a que el método desarrollado es simple, de bajo costo, de alta sensibilidad y
ecológico, se recomienda su empleo para la determinación y cuantificación de residuos de
nonilfenol y octilfenol en muestras de agua ya sea para fines ambientales o toxicológicos.
2. En vista a que se encontraron concentraciones importantes de los alquilfenoles estudiados,
en la mayoría de los puntos muestreados, se recomienda un estudio más profundo que
involucre todos los factores influyentes en la toma de las muestras, tales como: tiempo
estacional, dirección del viento y fenómenos hidrológicos.
3. Se recomienda extender el método que acopla microextracción con gota suspendida
(SDME), derivatización y cromatografía de gases – espectrometría de masa ( GC-MS), para el
anàlisis de otros fenoles, como por ejemplo bisfenol A, que actualmente está causando un
impacto negativo en la vida acuática y a la vez amenazan la salud de los seres humanos.
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