19/03/2015

1

1

CALIBRACION EN ANALISIS INSTRUMENTAL

CURVA DE CALIBRACION:

GRAFICAS DE SEAL ANALITICA vs CANTIDAD DE ANALITO

(USUALMENTE CONCENTRACION)

PROCEDIMIENTO GENERAL:

Se prepara una serie de muestras (n>3) en las cuales se conocela concentracin del analito (muestras estndares)

Se mide en el instrumento la propiedad de inters (seal

analtica) para cada muestra estndar bajo las mismas

condiciones que se utilizaran en las muestras desconocidas

Se grafica la curva de calibracin, siempre con la respuesta

instrumental sobre el eje vertical (y) y las concentraciones

estndares sobre el horizontal (x)2

CURVAS DE CALIBRACION

IMPLEMENTACION

La concentracin de la muestra desconocidas se

obtiene por interpolacin

En general, es esencial que los estndares cubran

el rango completo de concentracin requerido por

las muestras

Siempre se incluye un blanco (un blanco

procedimental)

3

CURVA DE CALIBRACIN

Muestra

desconocida

Puntos de

calibracin

4

CALIBRACIN

Se asume que:

Los errores aleatorios en el experimento de calibracin

ocurren solamente en los valores (y)

(recordar que la curva de calibracin se construye con la

respuesta analtica sobre las y y las concentraciones

estndares sobre las x)

La magnitud del error aleatorio en y es independientede la concentracin del analito

El error aleatorio en y sigue una distribucin normal

19/03/2015

2

5

PREGUNTAS ESTADISTICAS A RESOLVER EN UNA

CURVA DE CALIBRACIN

La curva de calibracion es lineal? si no lo es, cul es la

forma (ecuacin) de la curva?

Teniendo en cuenta que cada uno de los puntos de la

grfica est sometido a error aleatorio, cul es la mejor

lnea recta (o curva) a travs de estos puntos?

Asumiendo que la grfica es en verdad lineal, cules son

los errores aleatorios estimados y los lmites de confianza

de la pendiente y el intercepto de la lnea recta?

6

PREGUNTAS ESTADISTICAS A RESOLVER EN UNA

CURVA DE CALIBRACIN

Cuando se utiliza la curva de calibracin en una muestradesconocida, cul es el error aleatorio y los lmites de

confianza de la concentracin encontrada?

Cul es el lmite de deteccin del mtodo? Es decir, cules la mnima concentracin del analito que se puede

detectar con un nivel predeterminado de confianza?

Mediante la comparacin estadstica de curvas regulares decalibracin con curvas de adicin de estndar, establecer si

se presentan efectos de matriz. (Estudio estadstico de

dos resultados).

7

Contiene todos los reactivos y solventes utilizados con la muestra (sin analito adicionado deliberadamente)

Ser sometido a la misma secuencia de procedimientos analticos que a la muestra

La seal del blanco est sujeta a las mismas variaciones (error aleatorio) que los estndares y muestras

Es indispensable en cualquier anlisis qumico

La seal instrumental proveniente del blanco es a

menudo diferente de cero

PREPARACIN BLANCO

8

COEFICIENTE DE CORRELACIN

Es una medida de la asociacin

lineal entre dos variables

Dada una serie de parejas de datos:

(x1,y1), (x2,y2), (xi,yi), (xn,yn)

El coeficiente de correlacion, r, esta dado por:

yyxx

xy

SS

Sr

19/03/2015

3

9

Donde:

n

1i iixy)y)(yx(xS

2

ixx)x(xS

2

iyy)y(yS

Suma de los cuadrados

de las desviaciones de

cada media

x : La media de todos los valores de x

y : La media de todos los valores de y

(x,y) : El centrode de todos los puntos

r2*100 : Porcentaje de ajuste de los datos a la lnea de

regresin

COEFICIENTE DE CORRELACIN

10

42 91.7 0 112 0 418.28 216.2

Sxx Syy Sxy

CALCULO DE rEJEMPLO: Se examina una serie de soluciones estndar de

fluorescena en un fluormetro, con los siguientes resultados de

intensidad de fluorescencia, I.F.(en unidades arbitrarias)

I.F.: 2.1 5.0 9.0 12.6 17.3 21.0 24.7

Conc., pg/mL: 0 2 4 6 8 10 12

6742 x

1.1377.91 y

9989.028.418*112

2.216r

11

ACERCA DE LOS VALORES DE r

A menudo, una curva que no luce muy lineal produce

valores muy altos de r

Un valor alto de r podra ser interpretado erroneamente

como una relacin lineal

La curva de calibracin debe graficarse siempre

Es importante reportar r con el nmero adecuado de

cifras significativas

12

VALORES DEL COEFICIENTE DE CORRELACIN r

-1 < r < +1

CURVAS ANALITICAS: r > 0.99 (Al menos dos nueves)

19/03/2015

4

13

INTERPRETACIONES ERRONEAS DEL

COEFICIENTE DE CORRELACION r

Esta curva es suave,

como para generar un

valor de r bastante alto

(la calibracin siempre

debe graficarse)

Un r igual a cero no

siempre significa que no

hay relacin entre x y y

14

PRUEBA t PARA EVALUAR r

En caso de un valor bajo de r:

Es significativo de verdad?

Ho: no hay correlacin entre x y y

2calc r1

2nrt

tcrit Para (n-2) grados de libertad, prueba t de dos colas

SI tcalc > tcrit, se rechaza Ho

15

ECUACIN DE LA CURVA LINEAL

Hay una fuerte relacin lineal entre la seal analtica (y) y la concentracin (x)

La mejor lnea que pasa por los puntos de la curva de calibracin:

y = a + bx

Pendiente

xx

xy

S

Sb

Intercepto

xbya

La ecuacin slo es vlida cuando r es por lo menos 0.99 y hay evidencia visual de linealidad

16

Ejemplo de lnea de regresin:

Se examina una serie de soluciones estndar de fluorescena

en un fluormetro, con los siguientes resultados de intensidad

de fluorescencia (I.F.) (unidades arbitrarias)

I. F. : 2.1 5.0 9.0 12.6 17.3 21.0 24.7

CONC. pg/mL: 0 2 4 6 8 10 12

Sxx SyySxy

19/03/2015

5

17

Ejemplo de lnea de regresin

6x

1.13y

93.1112

2.216

xx

xy

S

Sb

52.16*93.11.13 xbya

9989.0yyxx

xy

SS

Sr

52.193.1 xy

centrode

18

Residuos de y en una regresin

Residuo = Valor medido valor predicho

iy iy ibxa

19

Desviacin estndar de los residuos o

desviacin estndar de la regresin

iii yyResiduo

xxyyiiSbSyySCR 22)( Suma de

cuadrados

residualxxyy

SbSSCR 2

22

2

n

SbS

n

SCRS xxyy

r

Desviacin

estndar

residual

Desviacin

estndar de

la regresino

La lnea de regresin debe tener la mnima SCR

(mnimos cuadrados)20

Errores en la pendiente (b) y el

intercepto (a) de la lnea de regresin

Desviacin

estndar de

la pendiente xx

Rb

S

Ss

Intervalo de confianza: btsb

Desviacin

estndar del

interceptoxx

RaS

x

nSs

2

1

Intervalo de confianza: atsa

f: (n-2)

f: (n-2)

19/03/2015

6

21

4672.05

112*93.128.418

2

22

n

SbSS

xxyy

R

11.093.104415.0*57.293.1 b

tsb

318.0112

6

7

14672.0

1 22

xx

RaS

x

nSs

81.052.13183.0*57.252.1 a

tsa

7n

6x

52.1a 93.1b

112xxS

28.418yyS57.2t

Del ejemplo anterior:

)5%,95( f

04415.0112

4672.0

xx

Rb

S

Ss

22

Clculo de la concentracin de una muestra

desconocida

bxay

00bxay

yo es el valor experimental de y a partir

del cual se determina xo

xx

Rx

Sb

yy

nmb

Ss

1112

0

0

Intervalo de confianza: x0 tsx0 f : (n-2)

m es el nmero de lecturas para obtener y0

b

ayx

0

0

23

Del ejemplo anterior:

72.093.1

52.19.20

0

b

ayx

Para un y0=2.9

284.0112

1

93.1

1.139.2

7

1

1

1

93.1

4672.02

0

xS

Intervalo de confianza: x0 = 0.72 2.57*0.284

= 0.72 0.73

Si m fuera 3 0.72 0.53

Para un y0=13.5 (cerca del centrode) 6.21 0.67

Para un y0=23.0 (lejos del centrode) 11.13 0.7324

Forma general de los lmites de confianza

en una recta de regresin

19/03/2015

7

25

UN EXPERIMENTO DE CALIBRACION

DE MAYOR TAMAO

valor de t ancho intervalo

n para (n-2) GdL de conf ianza 95%

3 12,71 14.68(SR/b)

6 2,78 3.00(SR/b)

12 2,23 2.32(SR/b)

24 2,07 2.12(SR/b)

48 2,01 2.03(SR/b)

1,96 1.96(SR/b)

INTERVALO DE CONFIANZA vs TAMAO DEL EXPERIMENTO

n=36

12

24

48

CONCENTRACION

ESTIMADA

SR/b-10 +10

26

LIMITE DE DETECCION

Es la mnima concentracin del analito que se puede

detectar por el mtodo con un cierto nivel de confianza

Concentracin mnima de analito que produce una

seal que es significativamente diferente del blanco

DEFINICION DE LA IUPAC:

Concentracin del analito que produce una seal igual a la

del blanco mas k veces la desviacin estndar del blanco

i.e.: LA CONCENTRACION CD PARA LA CUAL:

BBD ksyy

27

COMO SE DETERMINA CD

BBD ksyy De la definicin de la IUPAC:

De la ecuacin de regresin:DD bCay

DBB bCaksy

ayB DB bCks

b

skC BD

RB Ss

b

SkC RD

Cada punto de la curva de calibracin (incluyendo el blanco) tiene

una variacin (normalmente distribuida) sobre el eje y que puede

estimarse con la desviacin estndar de los residuos sr 28

LIMITE DE DETECCION

Dos problemas al analizar trazas:

1. Informar la presencia de analito cuando realmente

no lo hay

2. Informar la ausencia de analito cuando en verdad

esta presente

Debe minimizarse la posibilidad de cada uno de

estos errores utilizando una correcta definicin del

lmite de deteccin

19/03/2015

8

29

blanco muestra

yBLmite de

deteccin

3sB

sB

A B

Para k = 3 (como se muestra arriba) la probabilidad (P) de cada error (1 o 2) est alrededor del 7%

y7% 7%

CONCENTRACIONES LIMITE

Lmite de

decisin

30

DETECCION Y CUANTIFICACION

RECUERDE SIEMPRE:

Las definiciones son bastante arbitrarias.- es el usuarioquien escoje k

Cuando se reporta un lmite de deteccin, debeincluirse informacin (k) sobre la definicin utilizada

0 CD CC CONCENTRACION

0 yB yD yC SEAL

yB + 3sB yB + 10sB

ANALITO SIN

DETECTAR

REGION DE DETECCION REGION DE CUANTIFICACION

31

EJEMPLO:

En la serie de soluciones estndar de fluoresceina, estimar

los limites de deteccion y cuantificacion

xi yi xi-x (xi-x)2 yi-y (yi-y)

2 (xi-x)(yi-y)

0 2.1 -6 36 -11.0 121.00 66.0

2 5.0 -4 16 -8.1 65.61 32.4

4 9.0 -2 4 -4.1 16.81 8.2

6 12.6 0 0 -0.5 0.25 0

8 17.3 2 4 4.2 17.64 8.4

10 21.0 4 16 7.9 62.41 31.6

12 24.7 6 36 11.6 134.56 69.6

42 91.7 0 112 0 418.28 216.2

93.1b 4672.0RS

7.093.1

4672.0*33

b

SC RLD

4.293.1

4672.0*1010

b

SC RLC

32

EFECTOS DE MATRIZ

METODO REGULAR DE CALIBRACION:

Calibracin con soluciones estndar que contienen slo el analito

El mtodo es vlido solamente si esta solucion estndar del analito

produce la misma seal instrumental que soluciones de la muestra

que contenga la misma concentracin del analito

Al utilizar soluciones puras del analito para establecer la grfica de

calibracin, se asume que no hay efectos de matriz

Con frecuencia, tal asuncin no es aceptable en muchas reas de anlisis

Disminucin o aumento de la seal analtica debido a

la presencia de otros componentes en la muestra

19/03/2015

9

33

SOLUCIONES AL PROBLEMA DE

EFECTOS DE MATRIZ

Preparar estndares de calibracin que sean

idnticos a la muestra problema en todo aspecto

excepto en la concentracin del analito. Mtodo de

estndar con ajuste de matriz: Es poco prctico

Preparar estndares de calibracin que contengan la

propia muestra en una proporcion fija y conocida.

Mtodo de adicin de estandar (es)

34

METODO DE ADICION DE ESTANDAR

Se toman volmenes iguales de solucin problema

Todas, salvo una son tratadas (dopadas) por

separado mediante la adicin de cantidades conocidas e

incrementales del analito

Todas se diluyen al mismo volumen

Se mide la seal instrumental producida por cada

una de estas soluciones

Como de costumbre, la seal se presenta en el eje y,mientras que en el eje x se presenta la cantidad de

analito aadida

35

CURVAS DE ADICIN DE ESTNDAR

Con el mtodo de adicin de estndar se corrigen los efectos de matriz

EstndarMuestra

Solvente

C0 S1 S2 S3 S4

C0 S1 S2 S3 S4

Ecelda

pion (estndar)

Concentracin de la muestra diluida

36

METODO DE ADICION DE ESTANDAR

b

axE

xx

Rx

Sb

y

nb

Ss

E 2

2

1

19/03/2015

10

37

EJEMPLO DE METODO DE ADICION DE ESTANDAR

La concentracion de plata en una muestra de deshechos fotograficos

se determino por absorcion atomica (AA) con el metodo de adiciones

de estandar. se obtuvieron los siguientes resultados:

Ag adicionada, mg/mL

de solucion original 0 5 10 15 20 25 30

Absorbancia 0.32 0.41 0.52 0.60 0.70 0.77 0.89

Determinar la concentracin de plata en la muestra y los lmites de

confianza al 95% para esta concentracin

38

259.1701864.0

3216.0

b

axE

15x 601.0y

3216.0a01864.0b

700xxS

01093.0RS

)5%,95(57.2 ft

70001864.0

601.0

7

1

01864.0

01093.012

2

2

2

xx

Rx

Sb

y

nb

Ss

E= 0.748

0.23.17 Ex mg/mL

39

DESVENTAJAS DEL METODO DE

ADICION DE ESTANDAR

Requiere cantidades de muestra ms grandes que el

mtodo regular de calibracin

Estadsticamente, su principal desventaja consiste en

ser un mtodo de extrapolacin, por lo tanto menos

preciso que las tcnicas de interpolacin

No es fcil de automatizar40

CALIBRACION vs ADICION DE ESTANDAR

211 nf

222 nftcrit para (f1+f2) grados de libertad

Si no hay evidencia slida de efectos de matriz no es necesario el mtodo de adicin de estndar (esfuerzo inoficioso)

Si no hay efectos de matriz, las sensibilidades (pendientes) son estadsticamente iguales por ambos mtodos

Cualquier diferencia entre los dos mtodos se puede chequear mediante una prueba de significancia

21

21

11

xxxx

R

calc

SSS

bbt

21

2

22

2

11

ff

SfSfS RRR

19/03/2015

11

41

EJEMPLO

Se analiz el contenido de cadmio en sangre por absorcin

atmica electrotrmica mediante dos mtodos, curva regular de

calibracin (1) y curva de adicin de estndar (2),

obtenindose los siguientes resultados:

Mtodo 1 Mtodo 2

Pendiente 0.0210 UA/ppb 0.0193 UA/ppb

SXX 10 10

SR 0.00147 0.00097

n 5 5

Establecer si se presentan efectos de matriz en el mtodo 1

42

Determinacin del rango lineal en una regresin

Regresin con r

cercano a 1

Puntos desviados

de la regresin

43

Determinacin del rango lineal en una

regresin

El coeficiente de correlacin no es un buen parmetro paraestablecer rangos lineales en una curva de calibracin (puede

interpretarse errneamente)

Un mtodo ms eficiente es mediante el anlisis de los residuos (yi i)

Los residuos deberan estar distribuidos normalmente entorno al valor cero, si no es cierto esto, entonces se debe

sospechar que la recta de regresin ajustada no es la

correcta

(yi i) debe ser cero (teniendo en cuenta errores de redondeo) y estar distribuido simtricamente en torno a cero

44

CONC. INTENS.

mg/mL FLUOR.

0 0.1

2 8.0

4 15.7

6 24.2

8 31.5

10 33.0

Determinar el rango lineal en la siguiente curva

Intercepto = 1.357

Pendiente = 3.479

r = 0.9878

Se sospecha del ltimo punto

Determinacin del rango lineal en una

regresin

19/03/2015

12

45

n a b r R E S I D U O S

6 1.357 3.479 0.9878 -1.257 -0.314 0.429 1.971 2.314 -3.143

5 0.100 3.950 0.9998 0.000 0.000 -0.200 0.400 -0.200

4 0.000 4.000 0.9998 0.100 0.000 -0.300 0.200

Determinacin del rango lineal en una

regresin

46

IDENTIFICAR ERROR(ES) SISTEMATICO(S)

Produce el nuevo mtodo resultados significativamente ms

altos o ms bajos que un procedimiento bien establecido?

Utilice una serie de muestras analizadas por ambos mtodos

Calcular : la pendiente (b), el intercepto (a) y el coeficiente de correlacion (r)

Si cada muestra conduce a un resultado idntico por

ambos mtodos, a = 0 b = 1 r = 1

47

REGRESION PARA COMPARAR DOS METODOS

ANALITICOS

Los resultados del mtodo ms preciso se presentan en el eje

x (puede utilizarse la prueba F para comparar la precisin de

los dos mtodos)

Debe incluirse un nmero razonable de puntos (n > 10) para

construir la grfica de comparacin (recordar que se pierden

dos grados de libertad al efectuar los clculos)

Los puntos (parejas de datos de concentracin) deben cubrir el rango de inters con un distanciamiento uniforme

REGRESION LINEAL PARA COMPARAR

DOS METODOS ANALITICOS

a - perfecto acuerdo entre los dos mtodos

b - Los dos mtodos difieren en una cantidad fija (error

absoluto)

c - Los mtodos difieren en una cantidad que aumenta con la

concentracin (error relativo)

d - Evidencia de errores absoluto y relativo

a=0

a0

a=0

a0

b=1

b=1

b

19/03/2015

13

49

REGRESION LINEAL PARA COMPARAR

DOS METODOS ANALITICOS

Ejemplo

Se determin el nivel de plomo en diez muestras de jugo de frutas

mediante un nuevo mtodo potenciomtrico y los resultados se

compararon con aquellos obtenidos mediante absorcin atmica con

horno de grfito. Se obtuvieron los siguientes datos (todos en mg/l):

MUESTRA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

RESULTADO AAS 35 75 75 80 125 205 205 215 240 350

RESULTADO MET. POT. 35 70 80 80 120 200 220 200 250 330

En la prctica, si los intervalos de confianza para el intercepto y la

pendiente incluyen los valores ideales de 0 y 1 respectivamente,

se habr demostrado, ms alla de una duda razonable, que no hay

evidencia de errores fijo y relativo 50

87.3a 963.0b 9945.0r 56.10RS

64.6as 0357.0bs )8(31.2 ft

34.1587.3 a

083.0963.0 b

(Incluye el cero)

(Incluye el uno)

El intercepto y la pendiente

calculados NO difieren

significativamente de los valores

ideales 0 y 1 respectivamente

REGRESION LINEAL PARA COMPARAR

DOS METODOS ANALITICOS

51

Ejemplo comparacin de mtodos:

Comparar los resultados obtenidos para el anlisis de cido ftico en

20 muestras por dos mtodos analticos (fluorimtrico, CF y

fotomtrico, EF). Las concentraciones en mg/L. Los resultados del

mtodo EF presentan mayor precisin.

52

LIMITACIONES DE LA LINEA DE REGRESION

NO PONDERADA

Una lnea de regresin no solo asume que el error aleatorio en los valores del eje x es cero, sino tambin que el error aleatorio en los valores de y es constante (homocedasticidad)

A menudo dichas asunciones no son vlidas en la prctica

Con mucha frecuencia es la desviacin estndar relativa de la seal instrumental la que es aproximadamente constante dentro de un rango de concentracin

A pesar de estas objeciones, las lneas de regresin no ponderadas proporcionan informacin til en muchos casos

Todos los puntos de la recta tienen igual ponderacin cuando se calculan la pendiente y el intercepto de la lnea de regresin

syy

19/03/2015

14

53

EST LA PRECISIN DEL MTODO RELACIONADA

CON LA CONCENTRACIN?

tetanconssy

Precisin absoluta constante

Precisin

relativa

constante

tetanconsy

sy

54

PONDERACION DE ERRORES EN UN

CLCULO DE REGRESIN

Los errores en los diferentes puntos de la grfica se representan mediante barras de error (lmites de 1s) que se alargan a

medida que la concentracin aumenta

Se debe dar una mayor ponderacin a aquellos puntos donde las

barras de error son ms cortas: es ms importante que la recta

calculada pase ms cerca de estos puntos

55

LNEAS DE REGRESIN PONDERADAS

Se utilizan cuando el error aleatorio en la respuesta instrumentales una funcin (aproximadamente lineal) de la concentracin del

analito

Los clculos involucrados son slo ligeramente ms complicados

que aquellos de la regresin no ponderada

Se requiere informacin adicional de la precisin de la seal a los

diferentes niveles de concentracin o, al menos, una formulacin

de suposiciones adicionales acerca de tal precisin (por esta razn

las curvas ponderadas son menos utilizadas)

Las lneas de regresin ponderada se usan exclusivamente en lacalibracin de instrumentos (no para comparar dos mtodos

analticos)

56

Parejas de datos: (x1,y1), (x2,y2), (xi,yi), (xn,yn)

Desviaciones estndar (en y) s1 s2 si sn

Ponderaciones w1 w2 wi wn

2

1

i

is

w

nwi

A cada punto se asigna una ponderacin, wi, inversamente

proporcional a la varianza correspondiente, si2

2

2

1i

i

i

nw

ss

LNEAS DE REGRESIN PONDERADAS

19/03/2015

15

57

LNEAS DE REGRESIN PONDERADA

(ECUACIONES)

Centro de gravedad ponderado (xw, yw) :

iii

ii

w xwnw

xwx

1

iii

ii

w ywnw

ywy

1

wxx

wxy

w

S

Sb

Pendiente

wwwxbya

Intercepto 22

wiiwxxxnxwS

22wiiwyy

ynywS

wwiiiwxy

yxnyxwS

58

Ejemplo de regresin ponderada:

Calcular las rectas de regresin ponderadas y no ponderadaspara los siguientes datos de calibracin. Calcular tambin

para cada recta la concentracin de la muestras de ensayo

con absorbancias de 0.100 y 0.600

Regresin no ponderada:Pendiente: 0.0725

Ordenada: 0.0133

* Para 0.100 : 1.20 ppm (1.20 0.65)

* Para 0.600 : 8.09 ppm (8.09 0.63)

Concentraciones:Intervalo de confianza

59

Ejemplo de regresin ponderada :

Regresin ponderada:

yw = 0.1558/6 = 0.0260 xw = 1.372/6 = 0.229

aw = 0.0091bw = 0.0738

Concentraciones:

* Para 0.100 : 1.23 ppm (1.23 ? )

* Para 0.600 : 8.01 ppm (8.01 ? )

Intervalo de confianza

xi yi si 1/s2i wi wixi wiyi wixiyi wix

2i

60

Ejemplo de regresin ponderada :

La regresin ponderada produce datos (pendiente, intercepto y concentraciones de muestras) muy parecidos a los obtenidos a

partir del mtodo de regresin no ponderada

La estimacin de los lmites de confianza de las concentraciones con la regresin ponderada produce resultados mucho ms reales

wxx

wwRx

Sb

yy

nwb

SS

w 2

2

0

0

)(110

y0 seal analtica de la muestra

2

2

n

SbSS

wxxwyy

wRdonde,

* Para 0.100 : 1.23 ppm (1.23 0.12 )

* Para 0.600 : 8.01 ppm (8.01 0.72 )

Concentraciones:Intervalo de confianza

19/03/2015

16

61

LMITES DE CONFIANZA PARA UNA CONCENTRACIN

CALCULADA MEDIANTE UNA REGRESIN LINEAL

PONDERADA

Mucho ms cercano

al origen que el

centroide no

ponderado