MATERIAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL.LIMPIEZA, DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO I

I. OBJETIVOS.

Reconocer los materiales del laboratorio de microbiología ambiental: su funcionamiento, utilidad y correcta utilización.

Diferenciar los tipos y equipos de esterilización y su adecuada forma de uso.

Entender los conceptos de limpieza, desinfección y esterilización, sus diferentes técnicas de aplicación así mismo conocer las técnicas de descontaminación física y química.

Conocer las principales sustancias de desinfección que se usan comúnmente en laboratorio de microbiología y forma de uso.

Ensayar con los materiales de laboratorio, en la elaboración de medios de cultivo y agua peptonada asi también practicar la técnica para la utilización del autoclave como equipo de esterilización.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO.

Manipulación de material en laboratorio.

Todo material utilizado en laboratorio de microbiología puede ser, o desechable o reutilizable.

. Material desechable. Aquí se incluyen agujas, jeringas, guantes, gorros, calzas, lancetas, placas Petri de plástico, etc. En este caso, dicho material se adquiere estéril, se utiliza una sola vez y, una vez utilizado, se desecha y se destruye. Si el material es punzante o cortante se tirara en recipientes resistentes a la puntuación. Si el material no es punzante o cortante, primeramente se introduce en el autoclave con el fin de destruir sus gérmenes (medios de cultivo con germen problema) y posteriormente se tirara en contenedores especiales (bolsas de color rojo o naranja) o incluso sin pasar por el autoclave se tirara directamente a dichos contenedores para que posteriormente y a través de tratamientos específicos sean destruidos.

. Material reutilizable. Aquí se incluye todo el material de vidrio utilizado en microbiología, batas, gorras de tela y en general cualquier material que permita ser esterilizado de nuevo. En estos casos, después de la utilización, es preciso someter este material a un proceso de descontaminación, para lo que es necesario una limpieza y una desinfección o esterilización; según los casos.

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Todo instrumento deberá limpiarse inmediatamente después de haber sido utilizado, siguiendo el protocolo preciso para cada caso. En microbiología se puede decir que primero se destruye el gérmen (por técnicas de esterilización) como medida cautelar muy importante, ya que es necesaria la eliminación de todo gérmen, por los menos los patógenos. Posteriormente se limpia y una vez realizadas estas tareas, se efectuará o una desinfección o una esterilización, según se requiera. La esterilización es el método que se utiliza generalmente. Su objetivo es la destrucción total de cualquier forma de vida, incluidas formas de resistencia o esporas. Hay otros casos, los menos, en los que se podrán utilizar materiales no esterilizados previamente, como, por ejemplo, los portaobjetos para realizar alguna tinción, frascos lavadores con agua destilada, frascos que contengan colorantes, etc. En estos casos, dichos materiales se someten a desinfección, cuyo objetivo es la destrucción de toda forma de vida patógena.

Principios básicos de descontaminación. Concepto de limpieza, desinfección y esterilización.

LIMPIEZA. En microbiología primeramente se destruye el gérmen por técnicas de esterilización o desinfección y posteriormente se limpia. A partir de aquí se suele proceder de la siguiente forma:

. Se separa el material de uso séptico del de uso aséptico, procediendo inmediatamente a su limpieza. Se tendrá la precaución de no dejar demasiado tiempo el material en agua. ……………………. Se limpiarán los instrumentos primeramente con agua fría, ya que el calor hace que muchos de los residuos, por ejemplo pus o sangre, se adhieran más. ……... Se lavará con agua caliente y jabón frotando especialmente en los sitios o lugares más angulosos. …………………... Tras el lavado y enjuagado se volverá a aclarar de nuevo en agua destilada. ……. Se secará y se comprobará su estado. ……………………….. Se protegerá si es necesario.

DESINFECCIÓN. Este método en microbiología se utilizará para la descontaminación de materiales o superficies inertes y para la descontaminación de manos, piel, mucosas, etc.

. Materiales o superficies inertes (suelos o cualquier superficie del laboratorio, incluidos sus materiales). Se utilizan sobre todo los métodos químicos, es decir, los desinfectantes (detergentes, hipocloritos, etc.), que van a producir la destrucción de todos los gérmenes patógenos, no destruyendo los gérmenes no patógenos.

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. Desinfección de manos, piel y mucosas. La desinfección sobre tejidos vivos corresponde a técnicas de antisepsia y lo que se aplica sobre ellos no son desinfectantes sino antisépticos. En lugar donde se aplican producen una destrucción de los gérmenes patógenos.

ESTERILIZACIÓN. Este método es utilizado en microbiología para la reutilización de cualquier me pueda y que deba utilizarse como material aséptico. Existen distintas técnicas pero en cualquier caso van a producir la destrucción de cualquier forma de vida.

Técnicas de descontaminación física.

a) Tratamientos térmicos por calor seco o húmedo.

. Descontaminación por calor seco. Dependiendo de la temperatura y del tiempo de esterilización se consigo o no esterilización. Las técnicas de esterilización por calor seco, son:

- Flameado. Consiste en exponer un objeto o parte de un material a la llama de un mechero durante uno o varios minutos, según el material de que se trate. Este método se utiliza para esterilizar la punta del asa de siembra (hasta incandescencia), las bocas de los tubos de ensayo o matraces cuando se abren por el motivo que sea y siempre antes de cerrarlo, puntas de pipeta, etc.

- Incineración. Consiste en destruir en hornos crematorios el material. Es utilizado para destruir material de un solo uso, por ejemplo jeringas, guantes, catéteres, etc.

- Horno seco. Estufas Pasteur o Poupinel. Son hornos metálicos formados por doble pared y con bandejas ajustables a su alrededor. Suelen calentarse mediante resistencias eléctricas, pudiendo regularse su temperatura. Externamente estas estufas presentan un termómetro que indica en todo momento la temperatura que existe en el interior del horno (que deberá coincidir con la temperatura elegida). También incluye un selector de temperatura y en ocasiones un reloj. La esterilización se consigue a 1800C durante 2 horas o 1600C durante 3 horas y media. Este tipo de esterilización actúa sobre los materiales en profundidad. La esterilización se llevara a cabo de la siguiente forma:1. Se preparan los instrumentos o materiales a esterilizar, que deberán estar

debidamente protegidos, por ejemplo envolviéndose en papeles especiales, colocándolos en el interior de cajas, etc.

2. Se introducen en la estufa y se conecta ésta seleccionando la temperatura en el termostato y el tiempo en el reloj (si lo hubiera), comenzará a contabilizar cuando alcance la temperatura seleccionada.

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3. Transcurrido el tiempo deseado a la temperatura elegida se desconecta el interruptor y dejamos descender la temperatura hasta unos 50-600C.

4. Abrimos la estufa y recogemos el material.

Los materiales que se pueden esterilizar por este método son todo tipo de materiales, vidrio, porcelanas, metal, etc. No se utiliza para esterilizar medios de cultivo, productos líquidos, telas, plásticos, etc.

Horno Pasteur o Poupinel

. Descontaminación por calor húmedo.

- Autoclave. Es un recipiente cilíndrico grande o pequeño que se cierra herméticamente. Externamente lleva un manómetro que registra la presión que existe en el interior del autoclave cuando éste está en marcha. Existe un sistema que nos permite seleccionar la presión que deseamos. Además presenta una válvula de seguridad que se abrirá espontáneamente cuando la presión interna supere la elegida o resulte peligrosa, una llave de purga que permite la salida del vapor y un reloj que selecciona el tiempo deseado con alarma que indica el final del proceso. Interiormente en todo autoclave puede observarse en el fondo una rejilla por debajo de la cual hay agua destilada y un sistema de tuberías que la calienta generalmente por electricidad. Dicho calentamiento origina vapor de agua que asciende por la rejilla y llega a los objetos. El autoclave es un aparato muy utilizado y sus propiedades esterilizadoras dependerán de las condiciones de presión y tiempo elegidos, es decir, se conseguirá esterilización si sometemos el autoclave a 0.8 atm durante 3 minutos (1180C), 1 atm durante 20 minutos (1200C), 2 atm durante 10 minutos (1340C) o 3 atm durante 5 minutos (1440C).

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Autoclave de esterilización

Técnica para utilizar el autoclave:1. Con la autoclave apagada y abierta, añadimos agua destilada hasta la rejilla,

cubriéndola ligeramente.2. Se pondrá algún soporte metálico para evitar que el material que se desee

esterilizar contacte directamente con el agua. Esto no es siempre necesario Se colocarán adecuadamente (en cestillos, cajas, etc.) los objetos que se van a esterilizar. Se cierra la tapa y se ajusta a presión.

3. Se pondrá la llave de purga para que permita la salida de vapor y se ajustará la presión deseada para la esterilización, así como el tiempo (por ejemplo, 1 atm-20 minutos).

4. Se pondrá en marcha el aparato y se esperará hasta que salga vapor por la llave de purga.

5. Se cerrará la llave de purga y la presión comenzará a subir hasta llegar al nivel programado. A partir de aquí comenzará a contar el tiempo de esterilización.

6. Una vez realizada la esterilización se apagará el interruptor del autoclave y se esperará a que el manómetro baje a 0.

7. Cuando la presión esté a 0, abriremos la llave de purga para que salga gran parte del vapor que todavía se encuentra contenido. Esto se realizará con cuidado para evitar descomprensiones bruscas que podrían originar la apertura de aquellos recipientes tapados con algodón graso.

8. Una vez comprobado la salida de vapor, se abre la tapa del autoclave y se extrae el material.

b) Tratamientos a temperatura ambiente.

. Radiaciones ionizantes. Las utilizadas en microbiología son:

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- Rayos ultravioletas. Más que para esterilizar, se usan para mantener la esterilidad de superficies y/o recintos. Se caracterizan porque tienen poca penetración. Actúan impidiendo y alterando la duplicación del ADN celular. Se debe evitar su presencia en la piel.

- Rayos gamma. Se utilizan para conseguir esterilización en frío. Son producidos por isótopos radiactivos. Presentan un poder de penetración muy alto, constituyendo el método de esterilización más utilizado a nivel industrial. Se utiliza para esterilizar materiales de uso único o desechable (guantes, jeringas, válvulas, etc.) y en general cualquier tipo de material que pudiera alterarse por calor.

. Sistemas de filtración. Son dispositivos que, como su nombre lo indica, van a separar del medio a filtrar todas aquellas estructuras que sobrepasen un determinado tamaño, según el tipo de filtro. La efectividad de un filtro va a ser proporcional al tamaño del poro, pudiendo conseguirse esterilización. Otra característica es la presencia de presión, vacío e incluso la carga de filtro, que generalmente suele ser positiva, ya que las bacterias en medios neutros tienen carga negativa. Los más utilizados son:

- Filtros de membrana. Son filtros de celulosa muy purificada y con un tamaño de poro generalmente fino o muy fino. Estos sistemas pueden ser, desde muy sencillos a estar formados por sistemas de piezas desmontables que en muchas ocasiones llevan acoplada una bomba de vacío para ejercer succión sobre el medio a filtrar.

- Filtros de vidrio poroso o de fibra de vidrio. Se utilizan en cayos específicos y tienen más resistencia que los anteriores.

- Filtros de Chamberland. Son filtros de porcelana porosa, pero resultan más caros que los anteriores y son menos utilizados.

- Filtros de flujo laminar. Son dispositivos de filtrado donde entra aire contaminado y sale estéril. Son utilizados como mecanismo de esterilización en campanas de flujolaminar, en quirófanos y en, general, en cualquier recinto en el que se pretenda crear o mantener un ambiente estéril.Pueden ser de flujo vertical u horizontal.

- Ultrasonidos. Consiste en introducir el material en tanques de distintos tamaños que contienen un liquido generalmente desinfectante. Una vez puesto en marcha el dispositivo, comienza a vibrar a gran velocidad originando pequeñísimas burbujas que entran en todos los recodos del material consiguiendo eliminar los microorganismos. Es un método poco utilizado, ya que resulta caro y poco práctico.

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Medios de cultivo.

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. La diversidad metabólica de los microorganismos es enorme; por ello, la variedad de medios de cultivo universal adecuado para todos ellos. A continuación; una idea general sobre algunos de los constituyentes habituales de un medio de cultivo que fueron utilizados en la práctica de laboratorio.

Constituyentes habituales de los medios de cultivo:

. Agar. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. El componente dominante en el agar bacteriológico es un polisacárido, al que acompañan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Un gel de agar al 1-2 % en agua licua hacia los 1000C y gelifica alrededor de los 400C. Dependiendo de su grado de pureza. Con la excepción de algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado como nutriente.

. Extractos. Para su preparación. Ciertos órganos o tejidos animales o vegetales (ej. , carne, hígado, cerebro, semillas) son extraídos con agua y calor. Y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confección de medios de cultivo. Ejemplos: extractos de carne, de levadura, de malta, etc.

.Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales minerales que se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja, carne, gelatina, caseína, etc.).Las peptonas son ricas en péptidos y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales.

Agar agar preparado en placa Petri

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III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.

Preparación de agua peptonada:

1. Medir con una probeta 150 ml de agua destilada.2. Pesar 0.15 g de peptona.3. Colocar la peptona pesada en un matraz erlenmeyer y diluirla con los 150 ml de

agua destilada.4. Calentar en el mechero el matraz, durante un tiempo prudente, para que la

peptona se diluya completamente.5. Tomar otro matraz de 250 ml y colocar 90 ml del medio preparado.6. Repartir el resto del medio en tubos de ensayo (16x 150) 9 ml por cada tubo.7. Tapar la boca del matraz y de los tubos de ensayo con algodón.8. Envolver con papel craft la boca del matraz y atarlo con pabilo, lo mismo con

los tubos de ensayo, cogidos en conjunto.9. Colocar el matraz y los tubos preparados en una canastilla de metal y colocarlos

en el autoclave para esterilización.10. La esterilización en el autoclave se realiza durante 30’ a 1210C y 15Lb de

presión.11. Una vez terminado el proceso de esterilización (la presión en el autoclave debe

indicar cero) se retira la canastilla y se dejara enfriar por media hora para luego colocarlo en el refrigerador.Diagrama de flujo (preparación de agua peptonada):

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Materiales

nombre Caracteris.

Cant.

probeta de 500 mL 1

matraz erlenmeyer

de 250 mL 2

tubos de ensayo

de 16 X 150 7

Papel craft - 1 pliego

pabilo - 2 m

Compuestos

nombre Cant.

peptona 0.15g

triptona 0.75g

glucosa 0.15g

Extracto de levadura 0.38g

Agar agar 2.3g

Agua destilada 300mL

Equipos

Balanza analítica

Autoclave de esterilización

Sistema de disolución por calor

Preparación de Agar plate court (medio enriquecido):

1. Pesar : - triptona 0.75 g- glucosa 0.15 g- extracto de levadura 0.38 g- agar agar 2.3 g

2. Medir con una probeta 150 ml de agua destilada

3. Colocar todos los elementos pesados en un matraz y diluirlos con los 150 ml de agua destilada.

4. Calentar el matraz preparado en el mechero para una mejor disolución, durante un tiempo prudente.

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5. Tapar la boca del matraz con algodón, envolver hasta el cuello del mismo con papel craft y atarlo con pabilo.

6. Colocar el matraz en una canastilla de metal para ser introducida en el autoclave junto con los otros preparados de agua peptonada.

7. La esterilización en el autoclave se realiza durante 30’ a 1210C y 15Lb de presión.

8. Una vez terminado el proceso de esterilización (la presión en el autoclave debe indicar cero) se retira la canastilla y se dejara enfriar por media hora para luego colocarlo en el refrigerador.

Diagrama de flujo (preparación de Agar plate court (medio enriquecido)

IV. OBSERVACIONES.

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Al trabajar con constituyentes de medios de cultivos en ellos se notó que algunos de ellos como la peptona y el agar agar se encuentran en estado sólido y otros como el extracto de levadura que se encontraba en forma de polvo, así también la glucosa se encontró en una forma muy viscosa y poco manejable.

Los procedimientos de elaboración de ambos componentes (tanto el agua peptonada como el agar plate court) se obtuvieron en un tiempo aproximado de 30 a 40 minutos debido a los inconvenientes que se tuvo que se darán a conocer en la discusión de este informe.

El proceso de esterilización fue realizado sin ningún inconveniente, los matraces preparados fueron sacados cuando la presión del autoclave indicaba cero, y con mucho cuidado se dejaron enfriar durante 30 minutos para su posterior colocación en el refrigerador.

El medio de cultivo Agar plate court toma forma solida al estar refrigerado.

V. DISCUCIÓN.

En los procedimientos realizados en el laboratorio se tuvieron ciertas dificultades en el manejo de los instrumentos ya que no se cuenta aun con la suficiente destreza para su manipulación, esta se adquirirá durante el transcurso del curso, estas dificultades traen retrasos en el tiempo lo cual significa riesgos por contaminación del ambiente.

Durante la disolución del agar plate court en el mechero, debido a la falta de experiencia, se obtuvo un sobrecalentamiento donde el medio comenzó a hervir o burbujear bruscamente rebalsando gran parte de este, esto se dio debido a la falta de movimiento durante el calentamiento y a un exceso de exposición al fuego.

VI. CONCLUSIONES.

Mediante el desarrollo de la práctica se define, estudia y aplica los procedimientos que se deben realizar para la elaboración de un medio de cultivo, por otro lado se practicó también la técnica de esterilización de los medios de cultivo en el autoclave.

La importancia de este primer laboratorio radica en el aprendizaje práctico que se obtuvo para la elaboración de medios de cultivo en este caso el agar plate court y el agua peptonada que serán elementos fundamentales para la

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elaboración de la segunda práctica de laboratorio donde se incubaran ciertos microorganismos.

VII. RECOMENDACIONES.

Para evitar la contaminación por el ambiente siempre es recomendable trabajar con el mechero encendido ya que en el ambiente existen diversos microorganismos que pueden ser perjudiciales para las operaciones que se están realizando, así también se debe evitar hablar, como norma de seguridad.

Es ideal que todo el proceso de preparación de los medios de cultivo y agua peptonada dure un tiempo aproximado de 10 minutos, ya que así se evita problemas por contaminación.

Cuando se realiza la disolución calentando el matraz con el mechero, se debe tener mucho cuidado, este proceso debe ser durante un tiempo prudente ya que se corre el riesgo de que rebalse la solución por ello durante la operación se debe hacer pequeños movimientos circulares con el matraz cuidadosamente.

Al extraer los compuestos como la glucosa que tienen una alta viscosidad se recomienda colocarlo sobre un plato de vidrio o plástico y que ocupe la menor área posible ya que si se embarra la glucosa por toda la superficie del plato, va ser más laborioso el trabajo de traspasarla al matraz con el riesgo de una pérdida de peso en esta.

Cuando se mide el volumen de agua destilada en la probeta se suele agregar unos 0.3 ml de más ya que siempre ocurre una pequeña variación en el volumen al transvasar el agua de la probeta al matraz y/o al calentar el matraz para la disolución.

Antes de someter a esterilización los componentes se los debe cubrir la tapa adecuadamente con algodón evitando que estos tengan contacto con el medio, asi mismo se debe tener cuidado en atar correctamente los tubos.

VIII. BIBLIOGRAFÍA. URMETEA, Alonso y otros, Manual Práctico de microbiología, 2da edición. Masson.

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GRANADOS, Raquel; Villaverde, Carmen. Microbiología. Bacteriología. Características y clasificación bacteriana, virología. Características y técnicas bioquímicas.Tomo I .Thomson

IX. ANEXOS.

Fotografías en laboratorio de microbiología tomadas durante la preparación de agua peptonada.

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Agua peptonada preparada para el proceso de esterilización.

Fotografías en laboratorio de microbiología tomadas durante la preparación del agar plate court.

Agar plate court preparado para el proceso de esterilización.

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