INSTRUCTIVO: CONTROL DE ESTERILIZACIÓN POR …

OFICINA CENTRO DE CONTROL Y DIAGNOSTICO

DE LA PRODUCCION

Unidad del Centro de Control de Insumos y

Residuos Tóxicos

ITR-UCCIRT/Lma-08

INSTRUCTIVO: CONTROL DE ESTERILIZACIÓN POR INDICADORES BIOLOGICOS DE

AUTOCLAVES Y HORNOS

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TABLA DE CONTENIDO

1. Objetivo.

2. Alcance.

3. Referencias.

4. Definiciones.

5. Descripción.

6. Registros.

7. Anexos.

1. OBJETIVO


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Evaluar la correcta esterilización de las autoclaves y hornos de esterilización del

Laboratorio de Microbiología de Alimentos a través del uso de indicadores biológicos de

esterilización para calor húmedo (MagnaAmp) y calor seco (DriAmp), para asegurar la

esterilidad de los medios de cultivo y materiales empleados en los ensayos

microbiológicos.

2. ALCANCE.

Aplica al control de esterilidad de todas las autoclaves del Laboratorio de

Microbiología de Alimentos.

Las actividades establecidas en el presente instructivo aplican tanto a las

colaboradoras como a los colaboradores del SENASA, sin distinción de género y

promoviendo la interculturalidad.

3. REFERENCIAS.

Manuel de Bioseguridad de Laboratorio. Tercera edición. Organización mundial de

Salud.2005

Instructivo de uso MagnaAmp. Biological Indicators for Monitoring Steam

Sterilization of Liquids.

Instructivo de uso DriAmp. Biological Indicator Culturing Set with Releasat Culture

Medium.

Intructivo de uso SterilAmp II. Biological Indicators Monitoring Low

Temperature Steam Sterilization.

PRO-UCCIRT/Lab-11: MANEJO DE EQUIPOS

This Spore article will explore reported issues wich are BI imposible.

SporeNews biological indicator newletters. Volume 11 N°.6 Kelie Matzinger.

4. DEFINICIONES.

4.1 Autoclave: Equipo para esterilizar por vapor (calor húmedo), el cual consiste en un

recipiente cilíndrico, de paredes resistentes; metálicas, y con cierre hermético autoclave,

en su interior contiene un líquido (agua). Es sometido a presiones y temperaturas

elevadas.

4.2 Horno esterilizador: Equipo eléctrico utilizado para esterilización, se utiliza calor seco para

esterilizar los objetos que se introducen en él.

4.3 Esterilización: Proceso que mata o elimina todas las clases de microorganismos o

esporas.


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4.4 Tratamiento de autoclave: Aplicación de vapor de agua saturado a presión. Es el medio

más eficaz y fiable de esterilizar material de Laboratorio.

4.5 MagnaAmp: Es una ampolla de indicadores biológicos autocontenidos para el monitoreo

de la esterilización por vapor de líquidos en ampollas, contenedores grandes o lavadores

esterilizadores. Las ampollas de indicadores biológicos MagnaAmp contienen

esporas Geobacillus stearothermophilus y un medio de cultivo formulado especialmente

que cambia drásticamente a amarillo si crecen esporas.

4.6 DriAmp: es una ampolla de vidrio de 1ml con parte superior desprendible fácilmente que

contiene material de silicio inoculado con esporas Bacillus atrophaeus. Todos los

materiales son compatibles con temperaturas extremadamente altas tales como las

entregadas por los túneles u hornos de calor seco para la esterilización de instrumentos

y despirogenización en la fabricación de líquidos farmacéuticos llenados asépticamente.

4.7 SterilAmp II: es una ampolla de vidrio que contienen esporas de Bacillus subtilis

"5230" suspendido en una medio de cultivo especialmente formulado, diseñado

para esterilización a vapor de medios líquidos a baja temperatura: 110°C, 115°C

y 121°C.

5.DESCRIPCIÓN

5.1 De la aplicación del procedimiento.

El especialista del laboratorio asignado formalmente es el responsable de la

elaboración, implementación y supervisión del cumplimiento de este instructivo.

El personal técnico es el encargado de cumplir adecuadamente el instructivo

siguiendo a punto los lineamientos presentes en el documento.

5.2 Esterilización en autoclave (temperatura 121°C ): Uso de MagnaAmp

Para la esterilización por calor húmedo con las ampollas indicadoras MagnaAmp, realizar

los siguientes pasos:

1. Colocar la ampolla Magna Amp dentro de un contenedor con líquido (medio de

cultivo), empacar o sellar como se realiza rutinariamente.

Se coloca una ampolla que se presentan de la siguiente manera:


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Imagen 1

Las ampollas que serán usadas en el proceso esterilización son las que presentan el

nombre MagnaAmp, tal como se observa en imagen.

2. Incluir una ampolla de CONTROL NEGATIVO.

Imagen 2

Las ampollas de Control negativo no presentan nombre MagnaAmp, como se

muestra en la imagen.

3. La ampolla en el medio de cultivo y se coloca en medio de la autoclave. (Imagen

3)

4. Las condiciones del proceso de esterilización serán las usadas rutinariamente de

acuerdo a la autoclave que se está empleando.

5. Después de la esterilización, llevar el frasco conteniendo la ampolla al laboratorio

para realizar las pruebas correspondientes.


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Imagen 3

Ampolla dentro del frasco con medio se coloca en medio de la autoclave para realizar

el proceso.

5.2.1 Prueba de Laboratorio

1. Todas las MagnaAmp no requieren ser subcultivados.

2. Procedimiento:

a. Las ampollas pueden mantenerse en el contendor donde fueron esterilizadas

o pueden ser transferidos a un rack o contenedor que permita su mejor

visualización durante la incubación.

b. Incluir una ampolla no esterilizada y rotular como CONTROL POSITIVO.

c. Incubar las ampollas por 48 horas a 55-60°C. Las 48 horas de incubación son

de acuerdo a lo establecido en el protocolo de validación de reducción del

tiempo de incubación en la FDA (RIT).

d. Observar diariamente el crecimiento, se observan los siguiente colores:


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Amarillo o turbio = crecimiento = no estéril

Púrpura = no hay crecimiento = estéril

Imagen 4

5.2.2 Interpretación

MagnaAmp: No debería mostrar crecimiento si la esterilización ha sido exitosa

El cambio de color o la presencia de turbidez en los cultivos de MagnaAmp, indica

que las esporas han sobrevivido al proceso de esterilización y no esta estéril.

Control positivo: El cambio de color de púrpura a amarillo o la presencia de

turbidez indica que el medio posee cualidades promotoras del crecimiento

adecuadas y que el amplificador Magna contiene esporas viables. Si el control

positivo no presenta crecimiento, no usar las unidades del kit. Contactar al

proveedor.

Control negativo: No debe presentar cambio de color, lo cual evidencia que el

medio se encuentra estéril y que esto no ha afectado el proceso, en caso presente

crecimiento no usar las unidades del kit. Contactar al proveedor.

Estéril No estéril


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Imagen 5

Proceso de esterilización satisfactorio: M1: estéril (púrpura), C+: no estéril (amarillo),

C-: estéril (púrpura)

En la interpretación de resultados se debe tomar en cuenta que en el proceso de

esterilización puede ocurrir una ligera degradación de los componentes del medio

MagmaAmp por lo que el medio se observará como marrón-morado debido a los

ciclos largos o altas temperaturas de esterilización por tal motivo es importante

observar los cambios en el CONTROL NEGATIVO y comparar.

Incubación: 48 horas a 55-60°C

Proceso Satisfactorio

C+ M1 C- Proceso de autoclave

M1: prueba; C+: Control positivo; C-: Control negativo

C-

M1


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Se puede observar esta variedad de colores en las ampollas:

Imagen 6

1. No expuesto, crecimiento positivo

2. Exposición sub-letal, crecimiento positivo

3. Exposición letal, crecimiento negativo

4. Exposición extendida muestras degradación térmica del medio, crecimiento

negativo

5. Larga exposición extendida muestra una degradación adicional del medio,

crecimiento negativo

6. No expuesto, no incubado para comparación de color


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5.2.3 Almacenamiento

Antes del uso se debe mantener en refrigeración a 2-8°C. Protegido de la luz.

Para desechar incinerar o autoclavar a 121°C por no menos de 30 minutos.

Los indicadores biológicos MagnaAmp tiene un tiempo de vida, indicado en la caja.

5.3 Esterilización en autoclave (temperaturas >121°C): Uso Steril Amp II

Para esterilización por calor húmedo con ampollas Steril AmpII, realizar los

siguientes pasos:

1. Color la ampolla Colocar la ampolla SterilAmpII dentro de un contenedor con

líquido (medio de cultivo), empacar o sellar como se realiza rutinariamente.

Se coloca una ampolla que se presenta de la siguiente manera:

Imagen 6

1. La ampolla se coloca en medio de la autoclave. (Imagen 7)

2. Control negativo: Agregar un control negativo en la carga a esterilizar.

Imagen 7

El control negativo presenta

una perla que la distingue

de las otras ampollas.


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3. Las condiciones del proceso de esterilización serán las usadas rutinariamente

de acuerdo a la autoclave que se está empleando. (<121°C)

4. Después de la esterilización, llevar el frasco conteniendo la ampolla al

laboratorio para realizar las pruebas correspondientes.

Imagen 8

Ampolla dentro del frasco con medio se coloca en medio de la autoclave para

realizar el proceso.


1. Todas las SterilAmpII no requieren ser subcultivados.

2. Procedimiento:

a. Las ampollas pueden mantenerse en el contendor donde fueron

esterilizadas o pueden ser transferidos a un rack o contenedor que

permita su mejor visualización durante la incubación.

b. Incubar las ampollas por 3 días a 35-39°C.

c. Observar diariamente el crecimiento

Amarillo o turbio = crecimiento = no estéril


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Rojo = no hay crecimiento = estéril

Imagen 9


SterialAmpII: No debería mostrar crecimiento si la esterilización ha sido

exitosa

El cambio de color o la presencia de turbidez en los cultivos de SterilAmpII,

indica que las esporas han sobrevivido al proceso de esterilización y no

esta estéril.

Control positivo: El cambio de color de rojo anaranjado a amarillo o la

presencia de turbidez indica que el medio posee cualidades promotoras

del crecimiento adecuadas y que el amplificador SterilAmpII contiene

esporas viables. Si el control positivo no presenta crecimiento, no usar las

unidades del kit. Contactar al proveedor.

Control negativo: No debe presentar cambio de color, lo cual evidencia que

el medio se encuentra estéril y que esto no ha afectado el proceso, en caso

presente crecimiento no usar las unidades del kit. Contactar al proveedor.



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5.3.4 Almacenamiento y disposición de residuos:

Antes del uso se debe mantener en refrigeración a 2-8°C. Protegido de la luz.

Para desechar incinerar o autoclavar a 121°C por no menos de 30 minutos.

Los indicadores biológicos SterilAmpII tiene un tiempo de vida, indicado en la

caja.

Imagen 10

Proceso de esterilización satisfactorio: M1: estéril (rojo), C+: no estéril (amarillo),

C-: estéril (rojo)

5.4 Esterilización en horno: Uso de DriAmp

Para la esterilización por calor seco con ampollas DriAmp, realizar los siguientes pasos:

Proceso de autoclave

Proceso satisfactorio

Incubación: 72 horas a 35-39°C

C- M1 C+ C- M1

M1: prueba; C+: Control positivo; C-: Control negativo


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1. Colocar la ampolla con material a ser esterilizado. Empacado como usualmente se

realiza.

Imagen 11

Ampolla DriAmp

2. Localizar las ampollas de pruebas en las áreas a evaluar (parte superior e inferior)

empacado de la manera que se realiza rutinariamente.

Imagen 12

3. Después de la esterilización llevar las ampollas al laboratorio, y agregar una ampolla

de iguales características, la cual no ha sido esterilizada y marcar como CONTROL

POSITIVO.


1. Todas las pruebas deben de realizarse en lámina de flujo laminar. Todas las

trasferencias y manipulaciones deben hacerse siguiendo técnicas asépticas

rigurosas para evitar “falsos positivos”.


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2. Procedimiento:

a. Dejar enfriar las ampollas por al menos 10 minutos antes de cultivarlas.

b. Antes de colocar la ampolla en el lugar de trabajo, rociar con isopropanol al

70%.

c. Remover las tapas de las ampollas de la siguiente manera:

- Sostener la parte superior de la ampolla con una mano y la otra

parte con la otra mano.

- Colocar los pulgares en la punta a la parte superior sobre la línea

de vidrio marcado en el cuello de la ampolla.

- Retirar la parte superior de la ampolla utilizando las puntas del

pulgar como una bisagra y aplicar presión en la línea de vidrio

marcado.

Imagen 13

d. Lentamente verter el contenido de la ampolla a el tubo de medio Releasat, un

tubo por cada ampolla.

Imagen 14

e. Incluir un CONTROL POSITIVO en cada de serie de pruebas. Transferir una

ampolla no esterilizada a un tubo de medio de cultivo Releasat y rotular.

f. Incubar los tubos a 36-38 °C.

Línea


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g. Los resultados se leen a 72 horas.

h. Observar el crecimiento en los tubos diariamente.

Amarillo = crecimiento = no estéril

Rojo= no hay crecimiento = estéril


DriAmp: Los cultivos no deben mostrar crecimiento si ha sido el proceso de

esterilización satisfactorio. El color amarillo y/o la turbidez en el medio indican

crecimiento bacteriano en los tubos. Los tubos pueden ser sub-cultivados si desea

realizar la identificación de tubos positivos.

Control positivo: El color amarillo y la turbidez indican que el medio contiene posee

cualidades promotoras del crecimiento adecuadas y que el DriAmp contiene esporas

viables. Si el control positivo no crece, no usar las demás unidades del kit.

Contactarse con el proveedor.



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Imagen 15

Proceso de esterilización satisfactorio: M1: estéril (naranja), C+: no estéril (amarillo)

5.4.3 Almacenamiento

Almacenar los indicadores biológicos DriAmp a temperatura ambiente. No desecar. Los

indicadores biológicos DriAmp tienen un tiempo de vida designado en cada caja. Los

indicadores expirados deben ser eliminados por incineración o por exposición a calor seco.

5.5 Frecuencia

De acuerdo al PRO-UCCIRT/Lab-11: MANEJO DE EQUIPOS donde se señala lo

siguiente en el punto 5.1.1:

“En las comprobaciones intermedias de las refrigeradoras, congeladoras, estufas e

incubadoras del laboratorio de microbiología se realiza con una frecuencia según el

uso de equipos, cuando los equipos son utilizados diariamente se realiza cada 6

meses y cuando el uso sea esporádico la verificación se realiza una vez por año

siempre y cuando su periodo de calibración supere el año”.

Las pruebas se realizar cada 6 meses, siguiente este esquema:

Proceso Satisfactorio

Proceso de

esterilización y

posterior siembra

en caldo

Incubación: 72 horas

36-38 °C

M1 C+

M1: Ampolla esterilizada en horno de esterilización; C+: Control positivo


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Indicador Biólogico Enero Julio

MagnaAmp

4 o 5 ampollas por autoclave

4 o 5 ampollas por autoclave

SterilAmpII

Mínimo 12 ampollas por autoclave

Mínimo 12 ampollas por autoclave

DriAmp

6 a 12 ampollas por autoclave

6 a 14 ampollas por autoclave

Los resultados de las pruebas realizadas según el esquema de la frecuencia deben ser

llenadas en el siguiente registro: REG-UCCIRT/Lma-11 Control de esterilización por

indicadores biológicos de Autoclaves y Hornos.

6. REGISTROS

REG-UCCIRT/Lma-11: Control de esterilización por indicadores biológicos de

Autoclaves y Hornos

7.ANEXOS.

No aplica.


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REG-UCCIRT/Lma-11 Control de esterilización por indicadores biológicos de

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Equipo : Marca:

Código de Equipo:

Temperatura de trabajo: Número de Serie:

Año:

Modelo:

FechaNúmero de

ampollas Color C+

Realizado

por:ObservacionesProceso

* Proceso: Satifactorio "S"/ No satisfactorio "NS" ; C+: control positivo: C-: control negativo

C -

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