Proteínas
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PROTEÍNAS
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Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos
¿Qué es un aminoácido?
¿Cómo se llama el enlace que une dos aminoácidos?
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El DNA tiene 2 funciones
REPLICARSE TRADUCIRSE
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Figura tomada de “LehningerPrinciples of Biochemistry” D.L. Nelson & M.M. Cox. Third Edition Worth Publishers.
TRANSCRIPCIÓN
TRADUCCIÓN
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TRANSCRIPCIÓN
Transferencia de la información contenida en el DNA hacia una
secuencia de proteínas
ARNmARN Polimerasa
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TRADUCCIÓN Se traduce el mensaje genético del DNA-RNAm-RNAt-Aminoácidos-Enzimas La información del RNAm se organiza en tripletesCODÓN
GUC AAU UCG CUGcodón 1
aa1
codón 2
aa2
codón 3
aa3
codón 4
aa4
¿Quién aporta los aminoácidos?
aa1 aa2 aa3 aa4
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CODIGO GENÉTICO
UniversalEspecíficoContinuo Redundante
AUG Codón de inicio
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Frecuencia de substituciones Anemia Falciforme
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Evolución y diversidad de secuencias
Diversidad actual 10 millones de especies x 5,000 genes/especie ≈ 5 x1010 secuencias de proteína diferentes. Conocemos una pequeña fracción(6.7 x 107 secuencias)
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Las proteínas son cadenas lineales de aminoácidos
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Estructura secundaria
Es el plegamiento entre residuos de aminoácidos cercanos en la cadena polipeptídica.
Puentes de hidrógeno entre los grupos carbonilo (-CO) y los amino (-NH-)
Hélices Alfa Beta Plegada
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Estructura Terciaria
Se denomina estructura terciaria de una proteína a la distribución tridimensional de todos los átomos que constituyen la proteína.
Hélices, hebras y estructuras no repetitivas como asas y giros forman dominios compactos y globulares
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DominiosRegión compacta con mayores contactos consigo misma que con el
resto de la proteína.
Unidad de plegamiento autónomo.
Unidad funcional.
Tamaño promedio 200 aa.
El 49% de los dominios identificados tienen entre 51 y 150 aa.
Domino mas grande 907 aa
Hasta 13 dominios diferentes por proteína
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Dominios helicoidales
Manojos de cuatro hélices
Citocromo b652 Hormona de crecimiento humano
Mioglobina
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Dominios beta
Compuestas principalmente por hojas antiparalelas
Conexión entre hebras adyacentes “sube y baja”
Proteína que une retinol (sube y baja)
Barriles Sandwiches
Proteína A Bacterioclorofila (Sube y baja)
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Dominios alfa/beta
Hojas abiertas Barriles
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Estructura Cuaternaria
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STRUCTURE OF BETA-GLYCOSIDASE FROM SULFOLOBUS SOLFATARICUS
Hipertermófila
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Cloroperoxidasa (CPO)
4,6 Dimetil dibenzotiofeno (DMDBT) Sulfoxido (DMDBT) Sulfona(DMDBT)
SH2O2 OH2
SO H2O2 OH2
SO O
CPO
NH
CPO
H2O2 KClNH
Cl
NH
Cl Cl+
Carbazol 3- Cloro carbazol 3,6 Dicloro carbazol
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Capside Viral
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BASES DE DATOS DE SECUENCIAS DE PROTEÍNAS
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BASES DE DATOS DE ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS
Protein Data Bank
http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
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Existen programas que nos permiten analizar las estructuras de proteínas
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LAS PROTEÍNAS SON VITALES PARA EL BUEN FUNCIONAMIENTO CELULAR
FUNCIÓN EJEMPLOS Catálisis
Defensa
Transporte
Soporte
Movimiento
Regulación
Señalización
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LAS PROTEÍNAS SON VITALES PARA EL BUEN FUNCIONAMIENTO CELULAR
FUNCIÓN EJEMPLOS Catálisis Enzimas : proteasas, polimerasas, cinasas
Defensa Inmunoglobulinas, anticuerpos, toxinas
Transporte Hemoglobina, mioglobina, canales membranales
Soporte Colágeno, queratina Movimiento Actina, miosina Regulación Factores de transcripción (proteínas de
unión al DNA)
Señalización Hormonas (insulina)
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Propiedades de las proteínas
Å
Å
MASA
TAMAÑO
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Carga
PI = pKa1+pKa2
2
Existe un pH para el cual la carga eléctrica media de las moléculas es cero. Este pH se llama punto isoeléctrico (pI). El pI es el pH en el que la molécula se disocia por igual en ambos sentidos, y como
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Reconocimiento molecular
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¿ PARA QUÉ NECESITAMOS PURIFICAR PROTEÍNAS?
ESTUDIAR SU FUNCIÓN y regulación enzimática
REALIZAR ANÁLISIS ESTRUCTURALES: cristalografía de rayos X, espectroscopía NMR.
Estudiar sus interacciones con otras proteínas o con ácidos nucleícos
Para la producción de anticuerpos
Si no se conoce el gen que codifica a la proteína aislada: La proteína purificada se puede usar para determinar la secuencia de aminoácidos y por tanto la secuencia del gen que la codifica!!!!
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1. Seleccionar la muestra biológica (fuente) 2. Definir objetivos: PUREZA Y CANTIDAD REQUERIDA
Algo que debemos saber….
Muy alta > 99% Usos terapeúticos , estudios in vivo
Alta > 95-99% Estudios estructurales, cristalografía de rayos X, Caracterización fisicoquímica
Moderada > 95% Obtención de antigeno(s) para la producción de anticuerpos
Secuenciación Espectrometría de masas
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¿Y cómo comienzo la purificación?
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Contar con un método adecuado para la detección de la proteína de interés.
Monitorear el progreso de la purificación
Cuantificación de proteína total
Detectar específicamente la proteína de interés
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ROTURA CELULAR
MÉTODOS PARA REALIZAR LA ROTURA CELULAR Algunos ejemplos son:
1. Lisis celular válido para células sin pared celular como las células de tejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias.
2. Destrucción mecánica Congelación-descongelación, prensa de French, sonicación, macerado con N2 líquido
3. Lisis con detergentes
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Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno natural está expuesta a muchos agentes que pueden dañarla!!!!!!.
¿Cómo protegemos a la proteína de interés?
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UTILIZAR: Soluciones amortiguadoras
Inhibidores de proteasas Bajas temperaturas (4°C)
EVITAR Altas temperaturas
Manipular demasiado la muestra
PROCURAR que el proceso sea lo más corto posible.
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Algunos agentes estabilizadores son:
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Métodos de purificación de proteínas
BAJA RESOLUCIÓN
Precipitación con sales, precipitación con temperatura y pH
ALTA RESOLUCIÓN
Métodos cromatográficos: filtración en gel, intercambio iónico,
afinidad
Métodos electroforéticos: electroforesis no desnaturalizante,
desnaturalizante, isoelectroenfoque
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Precipitación con sales Sal más usada: Sulfato de Amonio
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EXISTEN TABLAS QUE ESPECIFICAN LA CANTIDAD DE SULFATO DE AMONIO QUE SE DEBE AGREGAR PARA LLEGAR A UN % DE
SATURACIÓN ESPECÍFICO
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ALTA RESOLUCIÓN
CromatografíaEs un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar dichos componentes
Volumen de columna
Muestra aplicada
Matriz
Tapón poroso
Eluyente
Eluyente Proteínas separadas
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Cromatografía de intercambio iónico
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Intercambio catiónico
Fase estacionaria cargada negativamente
Intercambio aniónico
Fase estacionaria cargada positivamente
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GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN
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Factores)que)afectan)a)la)retención)
1. Fuerza)Iónica)
2.)pH)
3.)Modificadores)Orgánicos)
![Page 49: Proteínas](https://reader038.fdocuments.co/reader038/viewer/2022103022/55cf8ff6550346703ba1c753/html5/thumbnails/49.jpg)
PRINCIPIO:(! Tamaño(de(partícula(y(masa(molecular.(! Mayor(masa(molecular(eluye(primero(! El(gel(retiene(particuas(de(menor(masa(
molecular((
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!APLICACIONES!!!! Desalado!de!proteínas!! Purificación!de!proteínas!! !Determinación!del!peso!
molecular!de!las!proteínas!
TIPOS!DE!MATRIZ!GRANULOS!DE!UN!MATERIAL!
ESPONJOSO!E!HIDRATADO!
! Dextranos!con!enlaces!cruzados!
! Agarosa!! Poliacridamida!
![Page 51: Proteínas](https://reader038.fdocuments.co/reader038/viewer/2022103022/55cf8ff6550346703ba1c753/html5/thumbnails/51.jpg)
Cromatografía de Afinidad
![Page 52: Proteínas](https://reader038.fdocuments.co/reader038/viewer/2022103022/55cf8ff6550346703ba1c753/html5/thumbnails/52.jpg)
Utiliza la alta especificidad entre las moléculas biológicas para separar componentes específicos de mezclas complejas.
![Page 53: Proteínas](https://reader038.fdocuments.co/reader038/viewer/2022103022/55cf8ff6550346703ba1c753/html5/thumbnails/53.jpg)
VENTAJAS: No hay restricción por volumen. Especificidad Pureza del producto final
DESVENTAJAS: Precio (alto) Condiciones de elución drásticas Ligando específico no disponible o inadecuado
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DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA
Absorción en el ultravioleta. Es un método no destructivo. El intervalo de concentración que se puede determinar depende del contenido de los
aminoácidos Tyr y Trp, y oscila entre 0,05 y 2 mg/ml. La presencia de sustancias absorbentes a 280 nm conduce a interferencias.
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Reacción del Biuret.
Las características más importantes de la reacción son:
La reacción del Biuret se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los péptidos y proteínas. Su intervalo de determinación es de 1 a 6 mg/ml. No depende de la composición de aminoácidos. Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reacción.
Método de Lowry. REACCIÓN DE BIURET + REACTIVO DE FOLIN-CIOCALTEU
Esta coloración se atribuye a la reducción del ácido fosfomolíbdico/fosfotúngstico a azul de heteropolimolibdeno de composición no definida, por medio de los residuos tirosilos, triptofanilos, y en menor grado, cisteinilos e histidilos de las proteínas que forman el complejo con el Cu2+.
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Método de BRADFORD
El intervalo de determinación de proteína es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y de 0,5 -1,4 mg/ml (ensayo estándar).
La intensidad de absorción depende del contenido de aminoácidos básicos y aromáticos.
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