UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA

Estudio Farmacocinético Preclínico de una Formulación en

Nanopartículas de Liberación Inmediata a base de Glimepirida.

Autora: Wendy Sofía Chávez Naranjo

([email protected])

Tesis de Grado para optar por el Título Profesional de

QUÍMICA - FARMACÉUTICA

Tutora: Dra. Liliana del Rocío Naranjo Balseca

([email protected])

Co-Tutora: Dra. Inés Fuentes Noriega (UNAM)

([email protected])

Quito, Septiembre del 2015

ii

Chávez Naranjo Wendy Sofía (2015). Estudio

Farmacocinético Preclínico de una Formulación en

Nanopartículas de Liberación Inmediata a base de

Glimepirida. Trabajo de investigación para optar por el

grado de Química Farmacéutica. Carrera de Química

Farmacéutica. Quito: UCE. 211p.

iii

DEDICATORIA

Con todo mi amor para:

Camila, Inés, Benjas,

Fely y Antonio

iv

AGRADECIMIENTOS

El tiempo y el lugar de Dios son perfectos, gracias por darme finalmente la sabiduría para

comprender que todo llega en su momento y guiarme hasta la culminación de este

maravilloso sueño.

Gracias a mi gloriosa Universidad Central del Ecuador y por supuesto a mi querida

Facultad de Ciencias Químicas por todos los inolvidables momentos vividos y las

lecciones aprendidas a lo largo de mi paso por sus aulas, a mis maestros por todo el

conocimiento transmitido y los valores inculcados durante mi educación, en especial a la

Dra. Liliana Naranjo por creer en mí, por su paciencia y apoyo incondicional, a la Dra.

Janeth Montalvo y el Dr. Wilmer Narváez por dedicar un espacio de su tiempo a este

sueño, Dr. Fernando Novillo por su apoyo y amistad sincera y al Dr. Patricio Miño (+) por

sus consejos, su amistad y cada tirón de orejas que me ayudó en los momentos de

mayor debilidad para darme cuenta de lo que soy capaz.

Mi sincero agradecimiento a la Facultad de Química de la Universidad Nacional

Autónoma de México y a todo el equipo que conforma el Laboratorio 113 del Edificio E,

por ser protagonista en la realización de este proyecto, en especial a la Dra. Inés Fuentes

Noriega quien desde el inicio me apoyó en este hermoso viaje que emprendí y con su

paciencia, afecto y amistad supo guiarme en el desarrollo de esta tesis, a la Maestra

Kenneth Rubio por sus enseñanzas y a los médicos veterinarios del bioterio Hector y

Lucy por su confianza y apoyo sincero.

A mi maravillosa madre porque eres mi heroína, mi mejor amiga, mi motor, mi apoyo, mi

todo, gracias hermosa por tu amor TE AMO MÁS QUE EL CIELO, a mi papá por su

apoyo y todas las cosas buenas que me ha inculcado, a mis hermanos Benjas y Fely y a

mi hermana Camila que es la luz de mi vida porque este camino lo hemos recorrido

juntos y siempre contaremos el uno con el otro.

A Papá Lucho (+) porque sé que estás orgulloso de mi y es lo que con tu amor deseabas

para todos nosotros, a mi familia por su apoyo, preocupación y todo el empuje que me

han brindado, a mi Ángel porque llegaste a mi vida cuando menos lo esperaba pero

cuando más lo necesité y me entregaste tu amor puro y sincero, a mis amigos Pao, Vero,

Andrés, Magy, Vivi, Juanjo, Vane, Mary, Raquel, Mayrita, Geomy, Carlos, Marisol y Gaby

porque su amistad ha sido un pilar fundamental en mi desarrollo profesional y personal y

a ti David por todos los años que caminamos juntos solo puedo decirte GRACIAS.

viii

LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN

El presente trabajo de investigación ESTUDIO FARMACOCINÉTICO PRECLÍNICO DE

UNA FORMULACIÓN EN NANOPARTÍCULAS DE LIBERACIÓN INMEDIATA A BASE

DE GLIMEPIRIDA, se desarrolló en el Laboratorio 113 del Edificio E de la Facultad de

Química de la Universidad Nacional Autónoma de México bajo la dirección de la Dra Inés

Fuentes Noriega y la supervisión técnica de la Maestra Kenneth Rubio Carrasco y en el

Bioterio de la Facultad de Química bajo la guía de los médicos veterinarios Lucía y

Héctor.

ix

CONTENIDO

CAPÍTULO I ................................................................................................................... 1

1.1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 1

1.2. EL PROBLEMA .............................................................................................. 2

1.2.1. Planteamiento del Problema .................................................................... 2

1.2.2. Formulación del Problema ....................................................................... 2

1.3. OBJETIVOS ................................................................................................... 3

1.3.1. Objetivo General ...................................................................................... 3

1.3.2. Objetivos Específicos ............................................................................... 3

1.4. IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN ............................................................... 3

1.5. HIPÓTESIS (Ho) .............................................................................................. 4

CAPÍTULO II .................................................................................................................. 5

MARCO TEÓRICO ........................................................................................................ 5

2.1. ANTECEDENTES ........................................................................................... 5

2.2. FUNDAMENTO TEÓRICO.............................................................................. 7

2.2.1. NANOTECNOLOGÍA ............................................................................... 7

2.2.1.1. Definición ............................................................................................. 7

2.2.1.2. Clasificación ......................................................................................... 8

2.2.2. NANOMEDICINA ....................................................................................11

2.2.2.1. Definición ............................................................................................11

2.2.2.2. Aplicaciones ........................................................................................12

2.2.2.3. Nanodiagnóstico ..................................................................................13

2.2.2.4. Nano-imagen .......................................................................................13

2.2.2.5. Nanomateriales y nanodispositivos .....................................................13

2.2.2.6. Sistemas terapéuticos y suministros de medicamentos .......................14

2.2.2.7. Aspectos clínicos, regulatorios y toxicológicos ....................................15

2.2.3. NANOFARMACIA ...................................................................................15

2.2.3.1. Definición ............................................................................................16

2.2.3.2. Importancia .........................................................................................16

2.2.3.3. Aplicaciones ........................................................................................17

2.2.4. NANOPARTÍCULAS ...............................................................................18

2.2.4.1. Definición ............................................................................................18

2.2.4.2. Métodos de elaboración de nanopartículas .........................................18

x

2.2.4.2.1. Nanopartículas Poliméricas .............................................................. 19

2.2.4.2.1.1. Nanocristalización ......................................................................... 19

2.2.4.2.1.2. Extrusión ....................................................................................... 21

2.2.4.2.1.3. Tecnología de fluidos supercríticos ................................................ 21

2.2.4.2.2. Nanopartículas Lipídicas .................................................................. 22

2.2.4.2.2.1. Homogeneización a alta presión .................................................... 22

2.2.4.2.2.2. Microemulsiones ............................................................................ 23

2.2.4.2.2.3. Membrana de contacto .................................................................. 24

2.2.4.2.2.4. Ultrasonidos .................................................................................. 24

2.2.4.3. Control de calidad de nanopartículas .................................................. 24

2.2.5. PROCESOS FARMACOCINÉTICOS. SISTEMA LADME ....................... 25

2.2.5.1. Liberación ........................................................................................... 25

2.2.5.2. Absorción ............................................................................................ 27

2.2.5.2.1. Estructura y Composición de las Membranas Absorbentes .............. 27

2.2.5.2.2. Tipos de Proteínas ........................................................................... 27

2.2.5.2.3. Mecanismos de Absorción ............................................................... 28

2.2.5.3. Distribución ......................................................................................... 32

2.2.5.3.1. Unión del fármaco a proteínas plasmáticas ...................................... 33

2.2.5.3.2. Tipos de Proteínas ........................................................................... 35

2.2.5.3.3. Unión del fármaco a componentes tisulares ..................................... 36

2.2.5.3.4. Irrigación tisular ................................................................................ 37

2.2.5.4. Metabolismo ....................................................................................... 37

2.2.5.4.1. Fase I ............................................................................................... 38

2.2.5.4.2. Fase II .............................................................................................. 40

2.2.5.5. Excreción ............................................................................................ 40

2.2.6. ANÁLISIS FARMACOCINÉTICO ............................................................ 41

2.2.6.1. Modelos farmacocinéticos compartimentales ...................................... 41

2.2.6.1.1. Modelo Monocompartimental ........................................................... 41

2.2.6.1.2. Modelo Bicompartimental ................................................................. 43

o Características ........................................................................................... 43

2.2.6.2. Modelos farmacocinéticos lineales ...................................................... 43

2.2.6.3. Modelos farmacocinéticos no lineales ................................................. 44

2.2.6.4. Análisis farmacocinético no compartimental ........................................ 44

2.2.6.5. Análisis farmacocinético poblacional ................................................... 44

2.2.7. CURVAS DE NIVEL PLASMÁTICO ........................................................ 45

2.2.7.1. Parámetros Farmacocinéticos ............................................................. 46

xi

2.2.7.2. C máx ..................................................................................................46

2.2.7.3. T máx ..................................................................................................46

2.2.7.4. Área bajo la curva (AUC) .....................................................................46

2.2.7.5. Volumen de distribución Vd .................................................................46

2.2.7.6. Clearance Cl........................................................................................46

2.2.7.7. Constante de eliminación Ke ...............................................................46

2.2.7.8. Constante de absorción Ka .................................................................47

2.2.7.9. Tiempo medio de eliminación (t ½) .......................................................47

2.2.8. GLIMEPIRIDA .........................................................................................47

2.2.8.1. Características físico-químicas ............................................................47

2.2.8.2. Farmacocinética ..................................................................................48

2.2.8.3. Farmacodinamia ..................................................................................49

2.2.8.4. Mecanismo de acción ..........................................................................49

2.2.8.5. Interacciones .......................................................................................50

2.2.8.6. Efectos secundarios ............................................................................50

2.2.8.7. Posología ............................................................................................51

2.2.9. MÉTODO DE CUANTIFICACIÓN HPLC/UV ...........................................51

2.2.9.1. Instrumentación para cromatografía de líquidos ..................................52

2.2.10. Métodos analíticos para extracción de fármacos de la matriz biológica ...53

2.2.10.1. Precipitación de proteínas .................................................................53

2.2.10.2. Extracción Líquido-líquido (LLE) ........................................................55

2.2.10.3. Extracción en Fase Sólido (SPE) .......................................................56

2.2.11. VALIDACIÓN DE MÉTODOS..................................................................56

2.2.11.1. Características del Desempeño Analítico ..........................................58

2.2.11.2. Verificación de Sistema .....................................................................58

2.2.11.3. Precisión del Sistema ........................................................................59

2.2.11.3.1. Repetibilidad ...................................................................................60

2.2.11.3.2. Reproductibilidad ............................................................................60

2.2.11.4. Linealidad del Sistema .......................................................................60

2.2.11.5. Exactitud ............................................................................................61

2.2.11.6. Intervalo .............................................................................................62

2.2.11.7. Robustez ...........................................................................................63

2.2.11.8. Límite de Detección ...........................................................................63

2.2.11.9. Límite de Cuantificación.....................................................................63

2.3. FUNDAMENTO LEGAL .................................................................................64

2.3.1. Ecuador ..................................................................................................64

xii

2.3.1.1.1. Constitución de la República de Ecuador ......................................... 64

2.3.1.1.2. Ley Orgánica de Salud ..................................................................... 64

2.3.1.1.3. Política Nacional de Medicamentos .................................................. 65

2.3.2. Normas ISO para productos Nanotecnológicos a nivel Mundial .............. 65

2.3.3. México .................................................................................................... 66

2.3.3.1. REGLAMENTO de la Ley General de Salud en Materia de

Investigación para la Salud ............................................................................... 66

2.3.3.2. Ley Protectora de Animales del Estado de México ............................. 67

2.3.3.3. Código de Nuremberg: ........................................................................ 68

2.3.3.4. Declaración de Helsinki ....................................................................... 68

2.3.4. España ................................................................................................... 68

2.3.4.1. Ley 29/2006, de 26 de julio, de garantías y uso racional de los

medicamentos y productos sanitarios. .............................................................. 68

CAPÍTULO III .............................................................................................................. 70

METODOLOGÍA.......................................................................................................... 70

3.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN ........................................................................... 70

3.2. POBLACION Y MUESTRA ........................................................................... 70

3.3. DISEÑO EXPERIMENTAL ............................................................................ 70

3.3.1. Primera etapa: Desarrollo del método .................................................... 70

3.3.2. Segunda etapa: Validación ..................................................................... 70

3.3.3. Tercera etapa: Aplicación del método desarrollado ................................ 71

3.4. VARIABLES .................................................................................................. 71

3.4.1. Independientes ....................................................................................... 71

3.4.2. Dependientes ......................................................................................... 71

3.5. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................... 71

3.5.1. Materiales, Reactivos e Instrumentos analíticos ..................................... 71

3.5.2. Preparación de Reactivos ....................................................................... 75

3.5.2.1. Fase móvil ACN:Buffer de acetato de amonio 20mM pH= 4.5 (50:50) 75

3.5.2.2. Solución Stock de Glimepirida 1000µg/mL .......................................... 76

3.5.2.3. Solución Stock de Glimepirida 100µg/mL ............................................ 76

3.5.2.4. Solución Stock de Pioglitazona 1000µg/mL ........................................ 76

3.5.2.5. Solución Stock de Pioglitazona 60µg/mL ............................................ 76

3.5.2.6. Preparación de soluciones stock para la curva de calibración y puntos

de control .......................................................................................................... 77

3.5.2.7. Preparación para puntos de curva de calibración y puntos control en

método 77

xiii

3.5.3. Métodos ..................................................................................................78

3.5.3.1. Primera etapa: Desarrollo del método .................................................78

3.5.3.2. Segunda etapa: Validación del método ...............................................80

3.5.3.3. Validación del Sistema ........................................................................81

3.5.3.3.1. Estandarización del equipo en Sistema ............................................81

3.5.3.3.2. Linealidad del Sistema ......................................................................81

3.5.3.4. Validación el Método ...........................................................................82

3.5.3.4.1. Selectividad ......................................................................................82

3.5.3.4.2. Linealidad .........................................................................................82

3.5.3.4.3. Límite de Detección ..........................................................................83

3.5.3.4.4. Límite de Cuantificación ....................................................................84

3.5.3.4.5. Recuperación Absoluta (Recobro) ....................................................84

3.5.3.4.6. Precisión ...........................................................................................85

3.5.3.4.6.1. Repetibilidad ..................................................................................85

3.5.3.4.6.2. Reproducibilidad ............................................................................86

3.5.3.4.7. Exactitud ...........................................................................................86

3.5.3.4.8. Estabilidad ........................................................................................87

3.5.3.4.8.1. Estabilidad a t = 0 ..........................................................................87

3.5.3.4.8.2. Estabilidad en muestras de refrigeración a las 24 horas ................87

3.5.3.4.8.3. Estabilidad de la muestra a temperatura ambiente .........................88

3.5.3.4.9. Tolerancia .........................................................................................89

3.5.3.5. Tercera etapa: Aplicación de la metodología .......................................90

3.5.3.5.1. Condiciones experimentales .............................................................90

3.5.3.5.2. Toma de muestras ............................................................................90

3.5.3.5.3. Administración de fármaco................................................................93

3.5.3.5.4. Obtención de muestras .....................................................................95

3.5.3.5.5. Tratamiento de las muestras: ............................................................96

3.5.3.5.6. Método de extracción por precipitación de proteínas ........................96

3.5.3.5.7. Estructura del DCA ...........................................................................97

3.5.3.5.8. Determinación del orden de reacción ................................................99

3.5.3.5.9. Cálculo de las constantes farmacocinéticas ......................................99

CAPÍTULO IV ............................................................................................................ 102

ANALISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS ............................................... 102

4.1. Desarrollo del método analítico ................................................................ 102

4.1.1. Condiciones cromatográficas ................................................................ 107

xiv

4.2. Validación del método analítico ............................................................... 108

4.2.1. Estandarización del equipo en sistema ................................................. 108

4.2.2. Linealidad del sistema .......................................................................... 108

4.2.3. Selectividad del método ........................................................................ 109

4.2.4. Linealidad del método ........................................................................... 113

4.2.5. Precisión ............................................................................................... 114

4.2.5.1. Repetibilidad ..................................................................................... 114

4.2.5.2. Reproducibilidad ............................................................................... 115

4.2.6. Exactitud ............................................................................................... 120

4.2.7. Límite de detección............................................................................... 121

4.2.8. Límite de cuantificación ........................................................................ 122

4.2.9. Recobro ................................................................................................ 123

4.2.10. Estabilidad ............................................................................................ 123

4.2.10.1. A tiempo cero t = 0 .......................................................................... 123

4.2.10.2. Temperatura ambiente por 24 horas ............................................... 125

4.2.10.3. Refrigeración por 24 horas .............................................................. 126

4.2.10.4. Dos ciclos de congelación ............................................................... 128

4.2.11. Tolerancia (Punto control medio 3600 ng/mL) ...................................... 129

4.2.11.1. Fase móvil ACN:Buffer acetato de amonio Proporción (58:42) ........ 129

4.2.11.2. Fase móvil ACN:Buffer acetato de amonio Proporción (52:48) ........ 130

4.3. Aplicación del método analítico ............................................................... 131

4.3.1. Primer día de análisis ........................................................................... 131

4.3.1.1. Estandarización del equipo en Método ............................................. 131

4.3.1.2. Curva de Calibración......................................................................... 131

4.3.2. Segundo día de análisis ....................................................................... 132

4.3.2.1. Estandarización del equipo en Método ............................................. 132

4.3.2.2. Curva de Calibración......................................................................... 133

4.3.3. Procesamiento de los Datos ................................................................. 134

4.3.4. Determinación del orden de reacción ................................................... 134

4.3.5. Cálculo de las Constantes Farmacocinéticas........................................ 136

4.3.5.1. Ejemplo de cálculo (Datos de GLM comercial 2° determinación) ...... 143

4.3.5.2. Constantes Farmacocinéticas ........................................................... 147

4.3.6. Análisis estadístico de los resultados ................................................... 148

4.3.6.1. Análisis estadístico de la Constante de Absorción ............................ 148

4.3.6.2. Análisis estadístico de la Constante de Eliminación .......................... 150

4.3.6.3. Análisis estadístico del Tiempo medio de Eliminación ....................... 152

xv

4.3.6.4. Análisis estadístico del Tiempo máximo (t máx) ................................ 153

4.3.6.5. Análisis estadístico de Cmáx ............................................................. 155

4.3.6.6. Análisis estadístico del Área bajo la curva AUC ................................ 157

CAPITULO V ............................................................................................................. 159

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................................. 159

5.1. Conclusiones.............................................................................................. 159

5.2. Recomendaciones ..................................................................................... 161

BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................. 162

ANEXOS .................................................................................................................... 166

xvi

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Mecanismos de absorción de fármacos ............................................................ 31

Tabla 2. Afinidad a las proteínas .................................................................................... 34

Tabla 3. Componentes tisulares que fijan fármacos ........................................................ 37

Tabla 4. Modelos del Análisis Compartimental ................................................................ 41

Tabla 5. Datos requeridos para la validación .................................................................. 58

Tabla 6. Preparación de soluciones iniciales y puntos control para la curva ................... 77

Tabla 7. Preparación de puntos para la curva patrón y puntos control. ........................... 77

Tabla 8. Cuadro indicativo del desarrollo del método analítico. ....................................... 80

Tabla 9. Criterios de aceptación para la estandarización del equipo en sistema ............. 81

Tabla 10. Criterios de aceptación para la linealidad del sistema ..................................... 82

Tabla 11. Criterios de aceptación para la linealidad del método ...................................... 83

Tabla 12. Criterios de aceptación para estabilidad a tiempo cero ................................... 88

Tabla 13. Criterios de aceptación para la tolerancia del método ..................................... 89

Tabla 14. Tratamiento del animal y condiciones experimentales ..................................... 90

Tabla 15. Periodo de muestreo tras la administración de nanopartículas de Glimepirida.91

Tabla 16. Periodo de muestreo tras la administración de Glimepirida comercial. ............ 92

Tabla 17. Peso, dosis individual y volumen a administrar de Glimepirida comercial ........ 94

Tabla 18. Peso, dosis y volumen a administrar de nanopartículas de Glimepirida .......... 94

Tabla 19. Preparación de las muestras de la curva patrón y puntos control en plasma... 96

Tabla 20. Puntos de la gráfica Conc. vs Tiempo para la GLM en nanopartículas ............ 98

Tabla 21. Puntos de la gráfica Conc. vs Tiempo para la GLM comercial ......................... 98

Tabla 22. Condiciones cromatográficas finales determinadas para el método analítico. 107

Tabla 23. Resultados de la estandarización del equipo en sistema .............................. 108

Tabla 24. Repetibilidad del método punto control bajo. ................................................. 114

Tabla 25. Repetibilidad del método punto control medio. .............................................. 114

Tabla 26. Repetibilidad del método punto control alto. .................................................. 115

Tabla 27. Reproducibilidad del método punto control bajo, día 1. ................................. 115

Tabla 28. Reproducibilidad del método punto control medio, día 1. .............................. 116

Tabla 29. Reproducibilidad del método punto control alto, día 1. .................................. 116


Tabla 31. Reproducibilidad del método punto control medio, día 2. .............................. 117

Tabla 32. Reproducibilidad del método punto control alto, día 2. ................................. 118


xvii

Tabla 34. Reproducibilidad del método punto control medio, día 3. ............................... 119

Tabla 35. Reproducibilidad del método punto control alto, día 3. ................................... 119

Tabla 36. Exactitud del método punto control bajo. ....................................................... 120

Tabla 37. Exactitud del método punto control medio. .................................................... 120

Tabla 38. Exactitud del método punto control alto. ........................................................ 121

Tabla 39. Límite de detección del método analítico. ...................................................... 121

Tabla 40. Límite de cuantificación del método analítico. ................................................ 122

Tabla 41. Promedio de recobro del método analítico. .................................................... 123

Tabla 42. Estabilidad del método a tiempo cero. Punto control bajo. ............................. 123

Tabla 43. Estabilidad del método a tiempo cero. Punto control medio. .......................... 124

Tabla 44. Estabilidad del método a tiempo cero. Punto control alto. .............................. 124

Tabla 45. Estabilidad del método a temperatura ambiente por 24h. Punto control bajo . 125

Tabla 46. Estabilidad del método a temperatura ambiente por 24h. Punto control medio

...................................................................................................................................... 125

Tabla 47. Estabilidad del método a temperatura ambiente por 24h. Punto control alto .. 126

Tabla 48. Estabilidad del método en refrigeración por 24h. Punto control bajo. ............. 126

Tabla 49. Estabilidad del método en refrigeración por 24h. Punto control medio. .......... 127

Tabla 50. Estabilidad del método en refrigeración por 24h. Punto control alto. .............. 127

Tabla 51. Estabilidad del método tras dos ciclos de congelación. Punto control bajo. ... 128

Tabla 52. Estabilidad del método tras dos ciclos de congelación. Punto control medio . 128

Tabla 53. Estabilidad del método tras dos ciclos de congelación. Punto control alto. .... 129

Tabla 54. Resultados punto control medio tolerancia del método (58:42). ..................... 129

Tabla 55. Resultados punto control medio tolerancia del método (52:48). ..................... 130

Tabla 56. Estandarización del equipo en Método, primer día de análisis. ...................... 131

Tabla 57. Curva de calibración primer día de análisis. ................................................... 131

Tabla 58. Estandarización en Método, segundo día de análisis. ................................... 132

Tabla 59. Curva de calibración segundo día de análisis. ............................................... 133

Tabla 64. Regresión lineal GLM comercial 1° determinación. ........................................ 134

Tabla 65. Regresión lineal GLM comercial 2° determinación. ........................................ 135

Tabla 66. Regresión lineal Nanopartículas de GLM 1° determinación. .......................... 135

Tabla 67. Regresión lineal Nanopartículas de GLM 2° determinación. .......................... 136

Tabla 68. Concentración vs tiempo de GLM comercial 1° determinación. ..................... 137

Tabla 69. Concentración vs tiempo de GLM comercial 2° determinación. ..................... 138

Tabla 70. Concentración vs tiempo de Nanopartículas de GLM 1° determinación. ........ 140

Tabla 71. Concentración vs tiempo de Nanopartículas de GLM 2° determinación. ........ 141

Tabla 72. Método de los Residuales, fase de absorción. ............................................... 144

Tabla 73. Áreas determinadas por el Método de los trapecios, segmento A-B-C. ......... 146

xviii

Tabla 74. Constantes farmacocinéticas GLM Comercial 1° determinación ................... 147

Tabla 75. Constantes farmacocinéticas GLM Comercial 2° determinación ................... 147

Tabla 76. Constantes farmacocinéticas GLM Nanopartículas 1° determinación ............ 147

Tabla 77. Constantes farmacocinéticas GLM Nanopartículas 2° determinación ............ 148

Tabla 78. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Constante de absorción (Ka) ......... 148

Tabla 79. Análisis de Varianza (ADEVA) – Constante de absorción (Ka) ...................... 149

Tabla 80. Prueba de t – Constante de absorción (Ka) ................................................... 149

Tabla 81. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Constante de eliminación (Ke) ....... 150

Tabla 82. Análisis de Varianza (ADEVA) – Constante de eliminación (Ke) ................... 151

Tabla 83. Prueba de t – Constante de eliminación (Ke) ................................................ 151

Tabla 84. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Tiempo medio de eliminación (t ½ e)

...................................................................................................................................... 152

Tabla 85. Análisis de Varianza (ADEVA) – Tiempo medio de eliminación (t ½ e).......... 152

Tabla 86. Prueba de t – Tiempo medio de eliminación (t ½ e)....................................... 153

Tabla 87. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Tiempo máximo (t máx) ................. 153

Tabla 88. Análisis de Varianza (ADEVA) – Tiempo máximo (t máx).............................. 154

Tabla 89. Prueba de t – Tiempo máximo (t máx)........................................................... 154

Tabla 90. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Concentración máxima (C máx) ..... 155

Tabla 91. Análisis de Varianza (ADEVA) – Concentración máxima (C máx) ................. 155

Tabla 92. Prueba de t – Concentración máxima (C máx) .............................................. 156

Tabla 93. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Área bajo la curva (AUC) ............... 157

Tabla 94. Análisis de Varianza (ADEVA) – Área bajo la curva (AUC) ........................... 157

Tabla 95. Prueba de t – Área bajo la curva (AUC) ........................................................ 158

xix

LISTA DE ILUSTRACIONES

Ilustración 1. Clasificación de la Nanotecnología ..................................................................... 8

Ilustración 2. Nanoherramientas ............................................................................................... 11

Ilustración 3. Etapas de desarrollo de la Nanomedicina ....................................................... 12

Ilustración 4. Representación esquemática del desarrollo de una nanomedicina. ........... 18

Ilustración 5. Tecnología de fluidos supercríticos para la producción de nanopartículas 22

Ilustración 6. Sistema LADME ................................................................................................... 25

Ilustración 7. Ley de Fick ............................................................................................................ 28

Ilustración 8. Curva de Nivel Plasmático ................................................................................. 45

Ilustración 9. Estructura química de la glimepirida. ................................................................ 47

Ilustración 10. Cromatógrafo líquido de alta eficiencia HPLC .............................................. 52

Ilustración 11. Balanza analítica ............................................................................................... 72

Ilustración 12. Sistema HPLC................................................................................................... 73

Ilustración 13. Sistema HPLC .................................................................................................... 74

Ilustración 14. Agitador horizontal ........................................................................................... 74

Ilustración 15. Centrifuga ........................................................................................................... 74

Ilustración 16. Cámara de CO2 ................................................................................................ 75

Ilustración 17. Toma de pesos de las ratas. ........................................................................... 93

Ilustración 18. Administración intramuscular en rata ............................................................. 95

Ilustración 19. Obtención de muestra sanguínea del seno retro orbital de la rata ............ 95

Ilustración 20. Curva de nivel plasmático. Fase de absorción A-B-C. .............................. 100

Ilustración 21. Curva de nivel plasmático segmentada por trapecios ............................... 100

Ilustración 22. Glimepirida (10 µg/mL) en metanol. ............................................................. 102

Ilustración 23. Glimepirida con Glibenclamida como estándar interno (1 µg/mL). .......... 103

Ilustración 24. Cromatograma de pioglitazona (3 µg/mL) como estándar interno en

metanol. ........................................................................................................................................ 103

Ilustración 25. Cromatograma muestra Glimepirida con Pioglitazona como estándar

interno (Concentraciones: 12 µg/mL PGZ, 1 µg/mL GLM). .................................................. 104

Ilustración 26. Glimepirida con Pioglitazona (Concentraciones: 12 µg/mL PGZ, 1 µg/mL

GLM). Extracción éter:diclorometano (70:30). ........................................................................ 105


GLM). Extracción con éter (100 %). ......................................................................................... 105


GLM). Extracción por precipitación de proteínas con ACN. ................................................. 106

Ilustración 29. Cromatograma de muestra a las condiciones cromatográficas finales... 107

Ilustración 30. Linealidad del sistema. ................................................................................... 108

Ilustración 31. Selectividad del método. Blanco de plasma. .............................................. 109

Ilustración 32. Selectividad del método. Blanco de plasma con PGZ. .............................. 110

Ilustración 33. Selectividad del método. Fase móvil. ........................................................... 110

Ilustración 34. Selectividad del método. Metanol. ................................................................ 110

Ilustración 35. Selectividad del método. Sulfato de zinc. ................................................... 111

xx

Ilustración 36. Selectividad del método. Heparina. .............................................................. 111

Ilustración 37. Selectividad del método. S.I. Pioglitazona................................................... 111

Ilustración 38. Selectividad del método. Glimepirida. .......................................................... 112

Ilustración 39. Selectividad del método. Muestra de 800 ng/mL GLM + PGZ. ................ 112

Ilustración 40. Resultados de linealidad del método. ........................................................... 113

Ilustración 41. Curva de calibración primer día de análisis. ............................................... 132

Ilustración 42. Curva de calibración segundo día de análisis. ........................................... 133

Ilustración 43. Curva de nivel plasmático GLM comercial 1° determinación. .................. 137

Ilustración 44. Gráfica ln Conc. vs tiempo GLM comercial 1° determinación. ................. 138

Ilustración 45. Curva de nivel plasmático GLM comercial 2° determinación. .................. 139

Ilustración 46. Gráfica ln Conc. vs tiempo GLM comercial 2° determinación. ................. 139

Ilustración 47. Curva de nivel plasmático Nanopartículas de GLM 1° determinación. .. 140

Ilustración 48. Gráfica ln Conc. vs tiempo Nanopartículas de GLM 1° determinación. . 141

Ilustración 49. Curva de nivel plasmático Nanopartículas de GLM 2° determinación. .. 142

Ilustración 50. Gráfica ln Conc. Vs tiempo Nanopartículas de GLM 2° determinación. 142

Ilustración 51. Curva de nivel plasmático. Fase de absorción A-B-C. .............................. 143

LISTA DE ECUACIONES

Ecuación 1. Ley de Fick. Difusión pasiva ....................................................................... 29

Ecuación 2. Difusión por poros ....................................................................................... 30

Ecuación 3. Tiempo medio de eliminación ..................................................................... 99

Ecuación 4. Tiempo máximo .......................................................................................... 99

Ecuación 5. Concentración máxima ............................................................................... 99

Ecuación 6. Área de un trapecio .................................................................................. 101

Ecuación 7. Ecuación de Dost ...................................................................................... 101

xxi

LISTA DE ANEXOS

Anexo 1. Tablas de la estructura del Diseño Completamente al Azar para nanopartículas

de GLM y GLM comercial. Primer día de análisis. ................................................................. 166

Anexo 2. Tablas de la estructura del Diseño Completamente al Azar para nanopartículas

de GLM y GLM comercial. Segundo día de análisis. ............................................................. 169

Anexo 3. Datos cromatográficos y de concentración de GLM comercial 1° determinación.

........................................................................................................................................................ 172


........................................................................................................................................................ 173

Anexo 5. Datos cromatográficos y de concentración de GLM Nanopartículas 1°

determinación ............................................................................................................................... 174

Anexo 6. Datos cromatográficos y de concentración de GLM Nanopartículas 2°

determinación ............................................................................................................................... 175

Anexo 7. Carta de aceptación Universidad Nacional Autónoma de México ..................... 176

Anexo 8. Cromatogramas de la 1° Determinación de GLM Comercial .............................. 177

Anexo 9. Cromatogramas de la 2° Determinación de GLM Comercial .............................. 179

Anexo 10. Cromatogramas de la 1° Determinación de GLM en nanopartículas .............. 181

Anexo 11. Cromatogramas de la 2° Determinación de GLM en nanopartículas .............. 183

Anexo 12. Traducción de Resumen Documental .................................................................. 185

Anexo 13. Diagrama de Flujo Desarrollo del Método Analítico ........................................... 186

Anexo 14. Diagrama de Flujo Validación del Método Analítico .......................................... 187

Anexo 15. Diagrama de Flujo Aplicación del Método Analítico ........................................... 188

xxii

RESUMEN DOCUMENTAL

Los estudios farmacocinéticos preclínicos permiten la evaluación de un medicamento en

desarrollo mediante la obtención de constantes farmacocinéticas que nos permiten

determinar la eficacia y seguridad del mismo tras la administración en animales de

experimentación previo a la evaluación clínica en pacientes, de manera que se logre la

disminución de posibles efectos tóxicos o letales que pueda causar el medicamento en

desarrollo.

La Glimepirida es un medicamento hipoglicemiante perteneciente al grupo de las

sulfonilureas de tercera generación que se utiliza en el tratamiento de la diabetes no

insulino-dependiente, la Industria Farmacéutica Mexicana Silanes desarrolló una

formulación de dicho medicamento en Nanopartículas para la cual no existen estudios

farmacocinéticos.

En el presente trabajo de tesis se desarrolló y validó un método para la cuantificación por

HPLC/UV de Glimepirida en plasma de rata y posteriormente se aplicó el método en un

estudio farmacocinético preclínico en el que se estableció un análisis comparativo entre

las constantes farmacocinéticas determinadas para la Glimepirida comercial y para la

Glimepirida en Nanopartículas.

Los resultados demostraron que no existe diferencia estadísticamente significativa entre

las constantes farmacocinéticas determinadas para las dos formulaciones motivo de

estudio, determinándose que a nivel farmacocinético las Nanopartículas desarrolladas y

la Glimepirida comercial son similares.

PALABRAS CLAVE: DESARROLLO, VALIDACIÓN, MÉTODO, CUANTIFICACIÓN,

NANOPARTÍCULAS, GLIMEPIRIDA, CONSTANTES FARMACOCINÉTICAS, ESTUDIO

FARMACOCINÉTICO PRECLÍNICO.

xxiii

ABSTRACT

Preclinical pharmacokinetic studies enable the evaluation of a developing drug through

the procurement of pharmacokinetic constants which allow us to determine the

effectiveness and safety of such drugs, achieved through the administration to

experimental animals before they are subject of clinical evaluation in patients; therefore

reducing the possible toxic or lethal side effects the drug may produce.

Glimepiride is a hypoglycemic drug which belongs to the group of third generation

sulphonylureas, used in the treatment of non-insulin dependent diabetes, The Mexican

Pharmaceutical Company Silanes developed a formulation of these drugs in

Nanoparticles, for which there is no supporting pharmacokinetic studies.

This graduation thesis study developed and validated a quantification method using

Glimepiride HPLC/UV in rat plasm, and subsequently applied the method in a preclinical

pharmacokinetic study in which a comparative analysis was established between the

pharmacokinetic constants determined for commercial Glimepiride and for Glimepiride in

Nanoparticles.

The results demonstrated that there is no statistically significant difference between the

pharmacokinetic constants determined for both formulations considered in this study,

therefore determining that on a pharmacokinetic level the developed Nanoparticles and

commercial Glimepiride are similar.

PALABRAS CLAVE: DEVELOPMENT, VALIDATION, METHOD, QUANTIFICATION,

NANOPARTICLES, GLIMEPIRIDE, PHARMACOKINETIC CONSTANTS, PRECLINICAL

PHARMACOKINETIC STUDY.

z

1

CAPÍTULO I

1.1. INTRODUCCIÓN

La simplicidad del entorno ha existido desde siempre, todo a nuestro alrededor está

compuesto por átomos y moléculas que son la base de toda estructura, sin embargo no

habíamos tenido con anterioridad los medios para poder explorar estos sistemas tan

pequeños de los cuales está compuesta toda materia.

Hoy en día esto es una realidad, con el apoyo de los microscopios electrónicos y equipo

de alta resolución el hombre ha sido capaz de adentrarse en este universo tan pequeño y

misterioso que conforma el origen de la vida misma, al cual se ha denominado “Mundo

Nano”, a partir de esto nace la era de la Nanotecnología, la cual abarca varios campos de

la investigación científica, tecnológica, industrial y financiera, generando productos

nanotecnológicos para un sinfín de aplicaciones, como, electrónica, metalúrgica,

construcción, alimentos, agroquímicos, cosméticos, medicamentos y demás.

Dentro de este conjunto de posibilidades se encuentran la Nanomedicina y la

Nanofarmacia, por medio de las cuales se busca aplicar esta gama de nuevos e

innovadores conocimientos en pro de satisfacer las necesidades de salud y vida

aceptable que el hombre ha buscado desde los inicios de la humanidad, para lo cual, el

enfoque va dirigido a tres áreas principales de desarrollo: el nanodiagnóstico, la liberación

dirigida y controlada de fármacos y la medicina regenerativa; siendo motivo del presente

estudio el área de liberación dirigida y controlada de fármacos.

Dentro de este contexto los estudios farmacocinéticos preclínicos de los medicamentos

desarrollados con nanotecnología se enfocan en el estudio del tránsito del fármaco en el

organismo vivo describiendo mediante modelos matemáticos los principales procesos

que ocurren tras la administración.

2

1.2. EL PROBLEMA

1.2.1. Planteamiento del Problema

De manera ideal se espera que el uso de medicamentos produzca un efecto beneficioso

para la salud sin causar riesgo alguno al paciente, sin embargo en la práctica esto no

ocurre ya que el uso de la mayoría de medicamentos produce un efecto benéfico y uno o

varios efectos secundarios.

Una de las preocupaciones más importantes de la industria farmacéutica se enfoca en la

producción de medicamentos seguros y eficaces así como la reducción al mínimo de los

efectos adversos causados tras la administración de fármacos.

Para esto, mediante la aplicación de la Nanotecnología, se busca la producción de

sistemas especializados de liberación de fármacos, que faciliten la acción farmacológica

del principio activo incorporándolo en un sistema que libere el fármaco de forma

controlada, tanto temporal como espacialmente, con acceso directo al sitio de acción, que

permanezca el tiempo que sea necesario para ejercer su acción terapéutica mejorando

su biodisponibilidad y potencial terapéutico y finalmente salga del organismo.

Los estudios farmacocinéticos preclínicos permiten evaluar el medicamento

nanoparticulado en desarrollo de manera que se obtengan constantes farmacocinéticas

que nos permitan determinar la eficacia y seguridad del mismo tras la administración en

animales de experimentación previo a la evaluación clínica en pacientes, de manera que

se logre la disminución de posibles efectos tóxicos o letales que pueda causar el

medicamento en desarrollo.

1.2.2. Formulación del Problema

No existen estudios farmacocinéticos de la formulación en nanopartículas de liberación

inmediata de Glimepirida ya que es un medicamento que se encuentra en fase de

desarrollo.

3

1.3. OBJETIVOS

1.3.1. Objetivo General

Realizar un estudio farmacocinético preclínico de una formulación en nanopartículas

de liberación inmediata a base Glimepirida.

1.3.2. Objetivos Específicos

Desarrollar un método analítico por HPLC para la cuantificación de Glimepirida en

plasma de rata

Validar la metodología analítica por HPLC para la cuantificación de Glimepirida en

plasma de rata.

Aplicar la metodología validada en el estudio farmacocinético preclínico de una

formulación de Glimepirida en nanopartículas de liberación inmediata.

Determinar y comparar los parámetros farmacocinéticos de la formulación de

nanopartículas de Glimepirida con los parámetros farmacocinéticos de la Glimepirida

comercial.

Analizar e Interpretar los resultados obtenidos para las dos formas farmacéuticas

1.4. IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN

La aplicación de la nanotecnología en la industria farmacéutica es de gran importancia

para la terapia farmacológica debido a la posibilidad de suministrar fármacos de bajo

peso molecular así como macromoléculas de manera localizada o dirigida, hacia un tejido

específico.

Por lo tanto la formulación de medicamentos en forma de nanopartículas representa una

nueva alternativa tecnológica capaz de mejorar la farmacocinética de muchos principios

activos, incluidos los péptidos, así como para mejorar la capacidad de estas sustancias

para atravesar las barreras biológicas de forma eficiente.

La importancia de realizar estudios farmacocinéticos preclínicos de un medicamento en

desarrollo radica en la necesidad de obtener información para evaluar de manera

preliminar la eficacia y seguridad de un fármaco y por medio de esto establecer si se

4

justifica continuar con la siguiente fase del proceso que son los estudios clínicos en

pacientes que por primera vez serán expuestos a nuevas formulaciones.

Así al igual que con cualquier medicina nueva el primer paso son los estudios preclínicos

farmacocinéticos y toxicológicos, donde se somete a la nueva formulación de

nanopartículas de Glimepirida a estudios en animales, para esto es importante desarrollar

y validar un método que nos permita cuantificar las concentraciones de fármaco en los

fluidos biológicos del animal para la obtención de las constantes farmacocinéticas.

Por lo tanto el propósito del presente estudio es la determinación de parámetros

farmacocinéticos para evaluar de manera preliminar, en animales de experimentación,

una formulación en nanopartículas de Glimepirida previa su evaluación en seres

humanos.

1.5. HIPÓTESIS (HO)

Los parámetros farmacocinéticos obtenidos para el medicamento nanopartículado de

Glimepirida son similares a los del medicamento de Glimepirida comercial.

5

CAPÍTULO II

MARCO TEÓRICO

2.1. ANTECEDENTES

El nombre Nanotecnología aparece por primera vez el año de 1974 en un artículo

científico escrito por el Prof. Norio Taniguchi de la Universidad de Ciencias de Tokio, con

el siguiente título: “Nanotecnología consiste en el procedimiento de separación,

consolidación y deformación de materiales átomo por átomo o molécula por molécula”.

Sin embargo la tecnología a escala submicrónica surgió mucho antes en 1959 con el Dr.

Richard Feynman (Premio Nóbel de Física, 1965) quien en su famoso discurso del 29 de

Diciembre de 1959 titulado “There is plenty of room at the bottom” aseguraba que en un

futuro no muy lejano el hombre sería capaz de escribir los 24 tomos de la Enciclopedia

Británica en la punta de un alfiler, además observando el comportamiento de los

fenómenos naturales a escala nanométrica, concluyó que se podría manipular y controlar

objetos a escala molecular e incluso atómica.

El gran despertar de la nanotecnología comenzó en los años 80, a partir del desarrollo de

una amplia gama de microscopios de sonda de barrido, que logran imágenes a escala

atómica. (Alonso & Avendaño, 2006)

Los finlandeses dieron su gran colaboración a esta nueva ciencia cuando consiguieron

realizar un “proceso de camadas atómicas”. Este trabajo hizo que toda la comunidad

científica terminase por aceptar e instaurar definitivamente la nanotecnología como una

ciencia del futuro. Desde entonces el nombre Nanotecnología, viene siendo utilizado para

caracterizar los nuevos avances tecnológicos desenvueltos por la nanociencia, que tiene

por principio, controlar y manipular la materia en una escala menor que un micrómetro, es

decir, a nivel de átomos y moléculas. (Quintilli, 2012)

A partir de esto se han logrado un sinnúmero de importantes descubrimientos tales como

los nanotubos de carbono (NTC), nanobiosensores de excelentes propiedades

mecánicas y eléctricas, realizado en Japón por Sumio Iijima en 1991. Hoy existen cerca

de 3 mil productos generados con nanotecnología, la mayoría para usos industriales,

aunque las investigaciones más avanzadas se registran en el campo de la medicina y la

biología. (Cintas & M, 2006)

6

A nivel mundial los avances en Nanotecnología no solo representan una importante

contribución científica sino también una vía de inversión a la que actualmente muchos

países le apuntan, disponiendo una parte del presupuesto para este fin.

A este respecto, las inversiones públicas millonarias en Nanotecnología realizadas por

EE.UU., Japón, China y Europa ponen de manifiesto que la investigación del

“nanomundo” es considerada una macroárea estratégica por las potencias mundiales.

(Cintas & M, 2006)

Además, según se desprende de un estudio realizado por la Organización para la

Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE) y Allianz Group, el mercado de la

Nanotecnología generará en 2014 unos ingresos de 2,6 billones de dólares en todo el

mundo. (Euroresidentes.com)

Por otro lado, en América del norte, específicamente el gobierno canadiense invirtió

aproximadamente 32 millones de dólares canadienses en nanomedicina entre 2000 y

2006 a través de los institutos canadienses de investigación en salud, de igual manera en

EE.UU. se encuentran en comercialización (algunos de venta sin prescripción)

medicamentos desarrollados a base de nanotecnología.

La llamada explosión farmacológica posterior a la Segunda Guerra Mundial dió lugar, en

los años 70 a 90, a grandes avances en el tratamiento de enfermedades que antes eran

inexorablemente mortales o incapacitantes.

Este fenómeno de renovación tecnológica no se ha limitado a la terapéutica

farmacológica, sino también en otros campos de la medicina, este proceso no ha estado

exento de accidentes, por efectos adversos no detectados oportunamente, como los

atribuidos a la Talidomida a principios de los años 60.

Desde entonces la preocupación por la seguridad de los medicamentos ha contribuido al

desarrollo y aplicación de métodos clínicos y epidemiológicos para evaluar los beneficios

y los riesgos potenciales de cualquier tipo de intervención terapéutica, ya sea

farmacológica o no.

A partir de esto la farmacocinética se ha consolidado durante los últimos 30 años como

una disciplina de gran interés sanitario, cuya aplicación se centra en 2 áreas

7

principalmente: desarrollo de nuevos medicamentos y la optimización de regímenes de

dosificación de los tratamientos farmacológicos. (García, 2001)

En México el Plan Nacional de Desarrollo 2007-2012 considera a la nanotecnología como

sector estratégico y como tecnología precursora porque tiene una fuerte incidencia sobre

el desarrollo de muchas actividades productivas y porque se prevé que en el futuro su

utilización será determinante para el desarrollo en diversas áreas industriales influyendo

en la competitividad y productividad del país.

El presente es un proyecto INNOVA, Conacyt- Silanes, siendo esta última la empresa que

está desarrollando el medicamento y por lo tanto apoya económicamente la realización

del mismo para completar una línea prioritaria de fármacos ya que existe una demanda

de mercado no cubierta y la empresa tiene ya una presencia y canales de

comercialización en esta área de productos. (Información proporcionada por la Dra. Inés

Fuentes de la UNAM)

2.2. FUNDAMENTO TEÓRICO

2.2.1. NANOTECNOLOGÍA

“…El gran auge de las nanotecnologías aplicadas en el campo de la salud humana a lo

largo de la historia ha hecho [...] re-surgir en el imaginario colectivo, el sueño del dominio

técnico sobre la vida y la muerte...”.

(Barona Vilar, 2004).

2.2.1.1. Definición

La nanotecnología es la ciencia capaz de manipular directamente los átomos con el

objetivo de construir estructuras a escala nanométrica que puedan ejercer funciones

específicas, por lo tanto la nanotecnología se define como “la investigación científica y el

desarrollo tecnológico que permiten entender, a nivel atómico y molecular, todos los

fenómenos que ocurren en la nanoescala, con el fin de utilizar este conocimiento para

crear estructuras, materiales, dispositivos y sistemas de complejidad creciente que

posean nuevas propiedades y realicen nuevas funciones debido al pequeño tamaño de

sus componentes”. (Serena & Pedro, 2010)

8

2.2.1.2. Clasificación

La especificidad que caracteriza los campos de aplicación de la tecnología a escala nano

dependen directamente de las formas, procedimientos y fines para los que se da la

manipulación de la materia en la escala nano.

Con la intención de delimitar de forma específica cada uno de los campos de aplicación

nanoescalar, se plantea una clasificación particular a la nanotecnología, que la tipifica de

acuerdo al medio en el que se desarrolla y bajo el fin particular de cada campo de

aplicación:

Ilustración 1. Clasificación de la Nanotecnología Fuente. Cuadro adaptado de http://dawnanotecnologia.blogspot.com/

a. Según el medio en el que se desarrolla

HUMEDA

La nanotecnología húmeda va dirigida al desarrollo de sistemas biológicos para la

manipulación de material genético, membranas, enzimas y componentes celulares y todo

sistema que necesite un medio acuoso. También se basan en organismos vivientes

cuyas formas, funciones y evolución, son gobernados por las interacciones de estructuras

de escalas nanométricas.

CLASIFICACION DE LA NANOTECNOLOGÍA

Según el medio en que se desarrolla

Humeda

Seca

Según la técnica de aplicación

Bottom up

Top down

Computacional

9

SECA

Derivada de la ciencia de superficies y la físicoquímica, la nanotecnología seca se centra

en la fabricación de estructuras de carbón (por ejemplo fullerenos y nanotubos), silicio y

otros materiales inorgánicos. Permite el uso de metales y semiconductores, que poseen

electrones que proporcionan las propiedades físicas que resultan interesantes para

aparatos electrónicos, magnéticos y ópticos.

En el lenguaje de difusión, "Nanotecnología seca" se emplea frecuentemente al referirse

al diseño de dispositivos mecánicos diminutos pero tradicionales con pequeñas

cantidades de átomos.

b. Según la Técnica de Aplicación

BUTTON UP

Nanotecnología molecular, se centra en la construcción de estructuras y objetos a partir

de sus componentes atómicos y moleculares; este tipo de nanotecnología es acogida

como el enfoque principal de la nanotecnología ya que ha de permitir que la materia

pueda controlarse de manera precisa.

TOP DOWN

Se trata de diseñar y miniaturizar el tamaño de estructuras para obtener a nanoescala

sistemas funcionales, algunas de sus aplicaciones se presentan de forma clara en la

producción de nano electrónica (miniaturización de sistemas electrónicos a nano escala).

Dentro de las categorías de arriba hacia abajo y de abajo hacia arriba, hay un número

creciente de nuevos procesos que permiten la nanofabricación, entre ellas se encuentran:

- Deposición de vapor químico es un proceso en el que los productos químicos

reaccionan para producir películas de alto rendimiento muy puras.

- Epitaxia de haz molecular que es un método para depositar películas finas

altamente controladas.

10

- Epitaxia capa atómica es un proceso para depositar capas de un átomo de

espesor sobre una superficie.

- Dip pluma litografía es un proceso en el que la punta de un microscopio de

fuerza atómica se " sumerge " en un fluido químico y luego se usa para "escribir "

sobre una superficie, como una vieja pluma de tinta sobre el papel de moda.

- Litografía por nanoimpresión es un proceso para crear características a

nanoescala por " estampar " o " impresión " que sobre una superficie.

- Procesamiento de rollo a rollo es un proceso de alto volumen de producción de

dispositivos a nanoescala en un rollo de plástico o de metal ultrafino.

- El autoensamblaje describe el proceso en el que un grupo de componentes se

unen para formar una estructura ordenada sin dirección fuera.

COMPUTACIONAL

Con esta rama se puede trabajar en el modelado y simulación de estructuras complejas

de escala nanométrica. Se puede manipular átomos utilizando los nanomanipuladores

controlados por computadoras.

Analizando en detalle la cadena de valor implícita en el desarrollo de la nanotecnología,

se puede identificar los siguientes eslabones:

a. Nanomateriales: estructuras de la materia desarrolladas artificialmente con

dimensiones inferiores a los 100 nanómetros que exhiben propiedades

dependientes del tamaño y que han sido mínimamente procesadas.

Por ejemplo: nanopartículas; nanotubos; puntos cuánticos; fulerenos; dendrímeros y

materiales nanoporosos.

b. Nanointermediarios: productos intermedios que no caen en la categoría de

nanomateriales ni de productos de consumo final, que incorporan nanomateriales

o que han sido construidos con características nanométricas: revestimientos;

11

tejidos; memorias y chips lógicos; componentes ópticos; materiales ortopédicos;

entre otros.

c. Productos nanoenriquecidos: productos del final de la cadena de valor que

incorporan nanomateriales o nanointermediarios: autos; vestimenta; aviones;

computadoras; dispositivos electrónicos; alimentos procesados; productos

farmacéuticos; etc.

d. Nanoherramientas: instrumentos técnicos y software utilizados para visualizar,

manipular y modelar la materia a escala nanométrica. Por ejemplo: microscopios

de fuerza atómica; nanomanipuladores y equipamiento de nanolitografía.

Ilustración 2. Nanoherramientas Elaborado por: Wendy Chávez (2014)

Fuente: Cuadro adaptado de http://dawnanotecnologia.blogspot.com/

2.2.2. NANOMEDICINA


La Nanomedicina denota a la ciencia y a la tecnología que se ocupan de diagnosticar,

tratar y prevenir enfermedades y lesiones traumáticas mediante la aplicación de los

resultados obtenidos en la Nanociencia y Nanotecnología.

Con los dispositivos, estructuras, medicamentos, compuestos, etc., utilizándolos como

herramientas moleculares, la nanomedicina busca aliviar el dolor o preservar y mejorar la

salud humana. (Sancén, 2010)

12

El desarrollo de la nanomedicina se puede ubicar en periodos de tiempo que van desde

lo ya logrado y que está en uso, hasta las previsiones más difíciles siquiera de imaginar,

pero en cuya dirección ya se está trabajando, como podemos observar en el siguiente

cuadro de tiempo.

Ilustración 3. Etapas de desarrollo de la Nanomedicina Fuente: Revista Interdisciplinaria en Nanociencia y Nanotecnología Nano Mundo, Vol 3, 2010.

2.2.2.2. Aplicaciones

La Nanomedicina aplicada abarca una gran cantidad de posibilidades, se considera que

dentro de las aplicaciones de la Nanociencia y la Nanotecnología (NyN), la Nanomedicina

es una de las principales ramas de desarrollo, investigación y aplicación, sin embargo en

el presente trabajo consideraremos las 5 principales subdisciplinas:

a. Herramientas de análisis (Nanodiagnóstico)

b. Nano-imagen

c. Nanomateriales y nanodispositivos

13

d. Nuevos sistemas terapéuticos y suministros de medicamentos

e. Aspectos clínicos, regulatorios y toxicológicos

2.2.2.3. Nanodiagnóstico

Las actuales pruebas de diagnóstico basadas en nanodispositivos están haciendo que el

diagnóstico sea realizado en la etapa presintomática de cualquier posible enfermedad.

Esto permitirá la introducción de medidas terapéuticas previas sin necesidad de utilizar

métodos curativos o de extracción, tal como sucede en la actualidad. En efecto, los

sistemas de diagnóstico basados en las nanotecnologías tendrán mayor eficiencia en

términos de resolución, sensibilidad, especificidad, confiabilidad, reproducibilidad e

integración, además de su disposición casi inmediata y permanente.

2.2.2.4. Nano-imagen

Las nuevas técnicas de diagnóstico basadas en las nanotecnologías que utilizan la

imagenología proporcionan información más precisa que las actuales vinculadas con la

imagen del organismo para detectar enfermedades.

En efecto, la imagenología derivada de la nanotecnología ofrece mejores resultados que

la tomografía, la resonancia magnética, o el ultrasonido, etc., actualmente en uso. Se

sabe, por ejemplo, que los óxidos de acero súperparamagnéticos con un diámetro menor

a 5 nanómetros, permite obtener imágenes nítidas su utilización ha sido exitosa para

detectar metástasis en su etapa inicial.

2.2.2.5. Nanomateriales y nanodispositivos

Las nanotecnologías aplicadas a los biomateriales mejoran los resultados actuales

obtenidos con base en aleaciones metálicas, cerámicas, polímeros, y compuestos. Los

nanobiomateriales permiten comprender e imitar las estructuras y rutas bioquímicas que

guían a la cicatrización natural, para inducir y apoyar la cicatrización más allá de las

capacidades normales.

Se trabaja también para obtener mejores propiedades mecánicas y compatibilidad

biológica en las prótesis e implantes dentales, catéteres, vendajes, y en todo el

instrumental médico.

14

2.2.2.6. Sistemas terapéuticos y suministros de medicamentos

El suministro de fármacos es y será una de las más importantes aplicaciones de las

nanotecnologías a la medicina. Los fármacos incorporados a nanotransportadores

permiten mejorar su especificidad y su eficacia. Los nanofármacos se caracterizan por su

complejidad, y pueden hacer llegar moléculas curativas específicamente al sitio donde se

requieren atravesando las barreras biológicas que todo organismo posee. Al mismo

tiempo, pueden contener reactivos específicos, como anticuerpos que alcanzan objetivos

predefinidos como moléculas cancerígenas o células inflamadas y, una vez alcanzado su

objetivo, se desintegrarán ahí mismo. Esto hará posible también otras formas de terapia,

como la termoterapia que consiste en dotar de dispositivos a las nanopartículas para que

ellas mismas se alojen en células malignas y luego sean calentadas localmente mediante

radiaciones dirigidas especialmente a esos dispositivos para obtener efectos particulares

en la quimioterapia o la radiación.

Liberación dirigida y controlada de fármacos:

Los tratamientos habilitados con nanotecnología podrán ser dispositivos multifuncionales

capaces de detectar e identificar enfermedades particulares a nivel celular y, en el

momento propicio, suministrar la droga correcta en la dosis correcta, confeccionando el

tratamiento según el paciente individual, con información, en tiempo real; de tal modo que

se evalúe el estado de la enfermedad.

Medicina regenerativa

Además de las terapias antes y después del diagnóstico que actualmente se desarrollan

en las NyN, se trabaja en la medicina regenerativa mediante la activación de genes que

estimulan la regeneración de tejidos, con la producción de nanomembranas

biocompatibles; mediante el mejoramiento en el funcionamiento y duración de prótesis

neuronales, y mediante la creación de un nuevo linfocito que restablece la respuesta

inmune normal en el paciente. Además de esto, la manipulación de las relaciones

biológicas a escala nanométrica incrementará sensiblemente la funcionalidad y

longevidad de tejidos implantados. También las nanotecnologías se están desarrollando

en el campo de la terapia con células madre y esto ofrece posibilidades alentadoras para

la regeneración de tejidos dañados. Una aplicación nanotecnológica en el caso de los

implantes es la utilización de nanodispositivos electrónicos.

15

Específicamente en el campo de la visión, se están utilizando dichos dispositivos en el ojo

en forma de nanovideocámara cuyas señales serán procesadas por una

microcomputadora que a su vez transmitirá la señal a una red de electrodos ubicados en

el ojo. Con esto se logrará restaurar la visión en los invidentes. Lo mismo se está

desarrollando para el caso de la audición

2.2.2.7. Aspectos clínicos, regulatorios y toxicológicos

La medicina no es la única forma en que se utilizan los avances obtenidos por las NyN.

Sus resultados se emplean en una amplia gama de aplicaciones que van desde la

industria automotriz hasta los textiles y cosméticos, pasando por los aparatos de la

electrónica, con frecuencia utilizados para diferentes diagnósticos y mediciones. Aunque

la mayor parte de las aplicaciones de las NyN no se ubican en la medicina, el uso de los

nanomateriales puede traer consecuencias a la salud si se dispersan en el entorno. En

estudios realizados en animales para detectar la presencia y la fuerza de las

nanopartículas en células, se ha demostrado la presencia de algunos efectos tóxicos

derivados de la presencia de nanopartículas en las células. Se sabe también que los

efectos de las nanopartículas en el cuerpo humano provenientes del entorno, pueden

tener efectos diferentes a las partículas normales que se encuentran en el medio

ambiente.

En consecuencia, las repercusiones tóxicas de la nanotecnología proyectan la necesidad

de ser contemplada como parte de la nanomedicina, y dado que esto entraña la

responsabilidad para cuidar, normar y desarrollar condiciones que la controlen, la

toxicología es un punto de unión de la nanomedicina con la ética. (Sancén, 2010)

2.2.3. NANOFARMACIA

Cuando un compuesto farmacéutico es formulado como nanopartícula, éste existe en una

escala más cercana a la escala en que ocurren los procesos biológicos y de esta manera

aumenta su nivel de disponibilidad biológica permitiendo que el cuerpo lo absorba más

pronto y fácil y como tal utilizarlo más eficazmente.

El nivel de disponibilidad biológica de una droga es uno de los elementos importantes

para determinar su eficacia.

16

Las industrias farmacéuticas confían en sus formulaciones nanoparticuladas para mejorar

el valor terapéutico de “drogas de bajo desempeño”, pero también buscan mejorar sus

ganancias.

Es posible que viejos medicamentos, que ya no están en el mercado por su baja eficacia

o por sus efectos colaterales potencialmente adversos en ciertas poblaciones de

pacientes, puedan hacerse más eficaces o más seguros si se reformulan

nanoscópicamente, lo que reduciría significativamente el costo del proceso de desarrollo

de medicamentos. Las compañías farmacéuticas ya sacan ventaja de la expansión de la

protección de sus patentes, algo que es posible mediante sus formulaciones

nanoparticuladas. (Hermida, 2008)


Se define a la nanofarmacia como la aplicación de la nanotecnología para la prevención,

diagnóstico y tratamiento de enfermedades con el propósito de mejorar la salud y el

funcionamiento del cuerpo humano y otros sistemas vivos.

Las aplicaciones de la nanofarmacia incluirían el descubrimiento de nuevos agentes

farmacéuticos, el desarrollo de sistemas de liberación de fármacos con localización o

direccionamiento específico; además de la creación de “laboratorios en un chip” que

desempeñen múltiples funciones in Vitro e in Vivo así como implantes y plataformas para

tejidos. (Villafuerte, 2013)

2.2.3.2. Importancia

La importancia de la nanotecnología farmacéutica para la terapia con fármacos reside en

la posibilidad de suministrar tanto fármacos de bajo peso molecular así como

macromoléculas como los péptidos, proteínas y genes, de manera localizada o dirigida,

hacia un cierto tejido de interés. (Villafuerte, 2013)

La nanotecnología farmacéutica se enfoca al desarrollo de formulaciones de agentes

terapéuticos en nano-complejos biocompatibles entre los que se cuentan las nano-

partículas, las nano-cápsulas, los sistemas micelares, los dendrímeros, los fulerenos o

nanoestructuras de carbono, las huellas cuánticas, los nanocomponentes derivados de la

bioimitación o biomimética y los productos conjugados derivados de los anteriores. Estos

17

sistemas se podrían utilizar para dar dirección al suministro de los fármacos, hacia un tipo

de células o tejido específicos.

También se podrían utilizar para mejorar la biodisponibilidad oral, para sostener el efecto

de fármacos o genes en un tejido seleccionado, para solubilizar fármacos para una

administración intravascular, y para mejorar la estabilidad de los agentes terapéuticos

contra la degradación enzimática de las nucleasas y proteasas, especialmente en el caso

de los fármacos en forma de proteínas, péptidos y ácidos nucleicos.

2.2.3.3. Aplicaciones

Entre las principales aplicaciones y líneas de estudio e investigación que se atribuyen a la

nanofarmacia se describen las siguientes:

El diseño de materiales estructurados, multifuncionales, capaces de atacar

enfermedades específicas.

El diseño de materiales conteniendo funciones que permitan el transporte a través

de las barreras biológicas.

El diseño de plataformas nanoestructuradas para la ingeniería de tejidos.

El diseño de dispositivos sensibles a estímulos para la liberación de fármacos.

El diseño de tratamientos orientados físicamente para la administración local de

productos terapéuticos (Vía pulmón, ojo o piel).

Transportadores de fármacos y sistemas de liberación de genes,

supramoleculares autoensamblables.

Nanopartículas y nanocápsulas.

Tecnologías de anticuerpos.

Conjugados de polímero-fármaco.

Conjugados de polímero-proteína y anticuerpo.

Nanoprecipitación y nanocristales.

Tecnologías de emulsificación.

Tecnología de los liposomas.

Polimerización in situ.

Reparación e ingeniería de los tejidos.

Tecnologías con dendrímeros.

Impresión molecular.

18

2.2.4. NANOPARTÍCULAS


Se denomina Nanopartículas a todas aquellas partículas que cuyo rango de tamaño está

comprendido entre 1 – 100 nanómetros (nm).

2.2.4.2. Métodos de elaboración de nanopartículas

Los nanosistemas se sintetizan en el laboratorio usando diferentes técnicas que varían

significativamente de un caso a otro.

Por lo tanto, se hace necesario entender el método de producción de estos nanosistemas

y las cuestiones a gran escala de los diversos sistemas diseñados para llevar a cabo las

aplicaciones biomédicas específicas.

Ilustración 4. Representación esquemática del desarrollo de una nanomedicina. Fuente: (Paliwal, Babu, & Palakurthi, 2014)

19

2.2.4.2.1. Nanopartículas Poliméricas

2.2.4.2.1.1. Nanocristalización

La nanocristalización convierte directamente medicamentos pobremente solubles en

agua en nanopartículas con propiedades físicas alteradas.

Varias formulaciones desarrolladas por el método de nanocristalización están disponibles

en el mercado, incluyendo aprepitant, fenofibrato, y sirolimus. La nanopartícula puede ser

cristalino o amorfa, dependiendo de la producción, la tecnología y el procesamiento del

material.

Los nanocristales de medicamentos son desarrollados por tres enfoques, es decir, la

precipitación, métodos de homogeneización (tales como la tecnología microfluidizador), y

fresado. (Paliwal, Babu, & Palakurthi, 2014)

a. Nanoprecipitación

Es una técnica sencilla que generalmente se adopta para los polímeros preformados,

brevemente, el polímero se disuelve en un disolvente orgánico miscible en agua y el

disolvente se difunde a continuación en el medio acuoso en presencia de un tensioactivo,

que conduce a la formación instantánea de una suspensión coloidal. Esto también se

conoce como técnica de desplazamiento del disolvente.

El método es útil para la preparación de nanocápsulas, que es un tipo de nanosistemas

de depósito.

Una alta carga útil de fármaco se puede lograr utilizando esta técnica en nanocápsulas;

sin embargo, su utilidad se limita a disolventes miscibles en agua (mejor para la

encapsulación del fármaco lipofílico) y no se pueden adoptar para disolventes inmiscibles

en agua (ineficiente encapsular fármacos hidrofílicos).

Los factores de control para el método de nanoprecipitación son cinéticas de nucleación y

crecimiento, que definen el tamaño y la distribución final del tamaño de la partícula. Del

mismo modo, la fase de la droga en forma de nanopartículas (es decir, cristalina o

amorfa) tiene importantes impacto en la estabilidad y la biodisponibilidad in vivo. (Paliwal,

Babu, & Palakurthi, 2014)

20

b. Tecnología de Microfluidizador

Es bastante reciente y una de las tecnologías más emergentes adoptada para la

producción de nanopartículas (Microfluidizer®, Microfluídica Inc.). Una colisión frontal se

produce entre dos fluidos bajo condiciones de alta presión (hasta 1700 bar). Durante la

colisión de los fluidos, muchos cambios se llevan a cabo simultáneamente, tales como

fuerzas de cizallamiento y las fuerzas de cavitación.

Para estabilizar las nanopartículas desarrolladas, se añaden los tensioactivos en la

solución. Con el fin de obtener el tamaño deseado de las nanopartículas, son necesarios

varios ciclos (pueden variar de 50 a incluso 100) y esta es la limitación de este método.

Esta tecnología ofrece un número de ventajas sobre métodos más tradicionales de

preparación de liposomas, tales como extrusión y sonicación.

El enfoque hidrodinámico de los microfluidos se ha utilizado para sintetizar nanopartículas

y vesículas de varios lípidos. (Paliwal, Babu, & Palakurthi, 2014)

c. Método de fresado.

La molienda es un proceso tradicional de producción de nanocristales, esta tecnología

NanoCrystals® emplea en general, una perla o un molino de perlas a fin de obtener

nanopartículas de fármaco.

Uno puede desarrollar suspensiones ultrafinas de drogas usando un molino de bolas, el

principio de la reducción de tamaño es la generación de fuerzas de cizalla de impacto de

los medios de molienda, que conduce a nanopartículas.

Los factores que afectan el tamaño y la estabilidad física de las nanopartículas incluyen

medios de molienda, el medio de dispersión y el estabilizador.

Sin embargo, las posibilidades de contaminación del producto por la erosión del material

de molienda, un comparativamente largo tiempo de molienda en el caso de fármacos

cristalinos, son algunas de las características desfavorables de esta técnica. (Paliwal,

Babu, & Palakurthi, 2014)

21

2.2.4.2.1.2. Extrusión

La conversión de fármacos hidrófobos directamente en nanopartículas es un método

escalable y menos costoso. La extrusión manual utilizando jeringas herméticas de gas y

membranas de policarbonato es una técnica común, sin embargo, se puede desarrollar la

heterogeneidad especialmente cuando uno utiliza tamaños de poro de menos de 100 nm,

esto sucede debido a la variabilidad de la presión manual aplicada cada vez.

Recientemente, Guo et al., informó de un método de extrusión de membrana nanoporosa

para la producción de nanopartículas de medicamentos hidrófobos. Este método induce

la precipitación de nanopartículas fármaco-cargadas en las salidas de nanoporos.

Khinast et al. ha reportado un proceso novedoso de un solo paso para la conversión de

una nano-suspensión líquida estabilizada en una formulación sólida a través de la

extrusión de fusión en caliente combinado con un proceso de desvolatilización interna.

En este proceso, el polímero se alimenta a la extrusora y se deja fundir, posteriormente,

se añade una nano-suspensión estable a este a través de dispositivos de alimentación

secundarios, el agua se elimina por desvolatilización y se obtiene el polímero solidificado.

(Paliwal, Babu, & Palakurthi, 2014)

2.2.4.2.1.3. Tecnología de fluidos supercríticos

Una de las técnicas más prometedoras de la producción de nanopartículas es la

tecnología de fluidos supercríticos (SCF). Condiciones de temperatura suave y evitar el

uso de disolventes orgánicos en la producción de nanopartículas poliméricas son claros

beneficios de esta técnica sobre los demás. La presión y la temperatura son

simultáneamente más alta que aquellos en el punto crítico. SCF se puede utilizar para

diversos fines en la producción de nanopartículas como sigue:

solvente: rápida expansión en el proceso de soluciones supercriticas;

agente de hinchazón y plastificación: gas saturado en el proceso de soluciones;

antidisolvente: gas antidisolvente o antidisolvente supercrítico de proceso

un disolvente para la polimerización en medios disperos.

22

Con el fin de obtener las propiedades deseadas de nanopartículas tales como el tamaño

y distribución de tamaño, morfología, estructura de núcleo interno, y la concentración de

disolvente residual mínima, este método es el más adecuado.

La característica notable de la técnica de SCF es que las partículas tienen superficies

lisas, pequeño tamaño de partícula, buena distribución y flujo libre. Sin embargo, el pobre

poder disolvente del CO2, el costo y el uso de gran cantidad de CO2 son algunas de sus

limitaciones. (Paliwal, Babu, & Palakurthi, 2014)

En la figura 5 podemos observar que tanto el fármaco y el polímero (ejemplo: celulosa

microcristalina) se procesan juntos para lograr la estabilidad de las nanopartículas.

Ilustración 5. Tecnología de fluidos supercríticos para la producción de nanopartículas Fuente: (Paliwal, Babu, & Palakurthi, 2014)

2.2.4.2.2. Nanopartículas Lipídicas

2.2.4.2.2.1. Homogeneización a alta presión

La homogeneización a alta presión se puede clasificar en dos partes: homogeneización

en caliente y homogeneización en frío.

a. Homogeneización caliente

Esta se lleva a cabo a temperatura por encima del punto de fusión de los lípido y se

aplica a fármacos lipófilos.

23

Los lípidos cargados con las drogas (en forma fundida) y la fase acuosa se mezclan por

medio de un mezclador de alto cizallamiento, manteniendo a ambos a la misma

temperatura.

Es importante tener en cuenta que la forma final de las nanopartículas depende en gran

medida de la calidad de la pre-emulsión que a menudo es una nanoemulsión.

La fase dispersa en la nanoemulsión se congela tras el enfriamiento a temperatura

ambiente generando la formación de las nanopartículas lipídicas, pero este método no es

adecuado para medicamentos termolábiles.

b. Homogenización en frío

Este es un tipo de molienda de alta presión de la suspensión en la que los lípidos con el

fármaco se funden y se solidifican rápidamente para obtener las micropartículas lipídicas.

Las micropartículas se procesan posteriormente mediante la agitación a alta velocidad en

un surfactante acuoso frío, seguido de homogeneización por debajo de la temperatura

ambiente para convertirlas en nanopartículas. (Paliwal, Babu, & Palakurthi, 2014)

2.2.4.2.2.2. Microemulsiones

Las nanopartículas lipídicas se obtienen de una microemulsión caliente, a base de

lípidos de bajo punto de fusión, un emulsionante, un co-tensioactivo y agua.

A la microemulsión se añade exceso de agua fría con agitación que resulta en la

precipitación de la fase lipídica generando las nanopartículas.

Posteriormente, el exceso de agua se elimina por un método adecuado como

ultrafiltración o liofilización.

La característica notable de este método es que las nanopartículas pueden ser

producidas sin la necesidad de suministrar energía y por lo tanto es adecuado para

cargar medicamentos termolábiles en nanopartículas lipídicas. (Paliwal, Babu, &

Palakurthi, 2014)

24

2.2.4.2.2.3. Membrana de contacto

Se utiliza para la producción a gran escala de nanopartículas lipídicas, para esto se pasa

un lípido fundido a través de una membrana porosa que permite la formación de gotitas

nanométricas, en el interior del módulo de membrana, la fase acuosa se distribuye

barriendo la gota lejos de los puntos de salida de los poros, así las gotitas se enfrían lo

suficiente para conseguir solidificarse.

Factores como la temperatura tanto de la fase acuosa como de la fase lipídica, la

velocidad de flujo transversal de la fase acuosa, la presión de la fase lipídica y el tamaño

de poro de la membrana, determinan el tamaño de partícula de las nanopartículas

lipídicas.

Las características ventajosas de este método incluyen el uso de un aparato simple,

control sobre el tamaño de las nanopartículas mediante una cuidadosa selección de los

parámetros del proceso, y la ampliación de factibilidades.

2.2.4.2.2.4. Ultrasonidos

El tamaño de las nanopartículas puede controlarse variando la frecuencia y la intensidad

de ultrasonidos. Por otra parte, una combinación de agitación a alta velocidad y

ultrasonidos en mayor temperatura también puede se puede aplicar. Sin embargo, el

tamaño de partícula es una limitación importante junto con la contaminación potencial de

metal resultante de la sonda de sonicación. (Paliwal, Babu, & Palakurthi, 2014)

2.2.4.3. Control de calidad de nanopartículas

El tamaño, forma, morfología, distribución de tamaño y la funcionalidad de las

nanopartículas desarrolladas son los parámetros clave para sus aplicaciones biomédicas

eficaces, tales características deseadas deben ser reproducibles y escalables.

Se requiere un perfil de liberación del fármaco de nanopartículas reproducible para

establecer la uniformidad lote a lote y un rendimiento de calidad in vitro e in vivo.

En la actualidad, existen muy pocos datos disponibles para establecer los parámetros de

importancia crítica de control de calidad, incluso, hasta la fecha, el método de liberación

del fármaco no está establecido oficialmente y disponible para su evaluación.

25

Los métodos convencionales de disolución (oficiales establecidos para formas de

dosificación sólidas), tales como paleta o método de la cesta se utilizan generalmente.

El método de diálisis también se utiliza para estimar la liberación de fármaco de

nanopartículas de rotación; sin embargo, estos métodos necesitan validación.

A pesar de los importantes avances en la ciencia médica y la industria farmacéutica, la

selección del método y el material se ve afectada por las demandas del mercado

también.

Uno de los aspectos importantes para el aumento de la producción a gran escala de las

nanopartículas es el costo del producto acabado y también el mercado consumible.

(Paliwal, Babu, & Palakurthi, 2014)

2.2.5. PROCESOS FARMACOCINÉTICOS. SISTEMA LADME

El sistema LADME está constituido por una serie de etapas que sigue el fármaco en el

proceso de incorporación al organismo para llegar a ejercer su acción farmacológica,

profiláctica o de diagnóstico.

Ilustración 6. Sistema LADME

Fuente: (Betés de Toro, 2008)

2.2.5.1. Liberación

Todos los fármacos que se administran al organismo están contenidos en una forma

farmacéutica específica que permite la disposición individualizada de las sustancias

26

medicamentosas y facilita su administración, en base a lo anterior podemos entender a la

liberación como el proceso por el cual el fármaco se libera de la forma farmacéutica que

lo contiene y queda disponible para su absorción.

El proceso de liberación está constituido por 3 etapas:

a. Disgregación de la forma farmacéutica. En esta etapa el comprimido se

disgrega, convirtiéndose en gránulos pudiendo disgregarse aún más

(microdisgregación) hasta polvos y cristales.

En la formulación de comprimidos es importante la adición de un desintegrante para

facilitar este proceso, cuya acción se produce por la penetración de agua en forma capilar

que genera un hinchamiento de las moléculas de desintegrante facilitando la disgregación

de la forma farmacéutica para que de esta manera se incremente la superficie de

contacto con el medio de disolución.

b. Disolución del Principio Activo (PA). Es el subproceso más importante de la

liberación ya que puede ser un factor limitante en la absorción del fármaco el cual

debe estar disuelto en los fluidos acosos del lugar de absorción.

Cuanto mayor es la superficie que puede alcanzar el PA después de haberse disgregado,

mayor es la disolución. Los polvos y cristales son los que se disuelven más rápido (polvos

> gránulos > comprimidos).

Esta etapa es la más importante ya que ningún fármaco está en disposición de

absorberse si no se ha disuelto previamente.

c. Difusión del principio activo. La difusión consiste en llevar los componentes

hasta la membrana absorbente, pero no la atraviesan, lo que ocurre es un proceso

de absorción basado en la naturaleza del compuesto y su afinidad con los

componentes de la membrana.

Este proceso no se considera que influya directamente en la absorción ya que si el

fármaco esta disuelto difunde fácilmente a través de la membrana.

La difusión influye cuando en la formulación hay sustancias viscosantes o cuando se

administra con sustancias ricas en grasa.

27

2.2.5.2. Absorción

La absorción estudia la entrada de los fármacos en el organismo desde el lugar donde se

depositan cuando se administran. (Lorenzo, 2008)

El proceso de absorción consiste en la entrada del fármaco al organismo por las

diferentes vías y debe atravesar una serie de barreras según la vía de administración que

se utilice y esto influye en el inicio e intensidad de la actividad farmacológica.

Estudia el paso de los fármacos desde el exterior al medio interno, es decir, a la

circulación sistémica. Tanto este proceso como los restantes procesos a los que se

encuentra sometido el fármaco en el organismo requieren que éste sea capaz de

atravesar membranas biológicas. (Lorenzo, 2008)

2.2.5.2.1. Estructura y Composición de las Membranas Absorbentes

Son estructuras formadas por una bicapa lipídica en las que hay proteínas que actúan

como transportadores, la parte polar, que en su mayoría son fosfolípidos se encuentra en

la parte externa mientras que los ácidos grasos se encuentran en la parte interior,

dándole al núcleo características hidrofóbicas.

2.2.5.2.2. Tipos de Proteínas

a. Proteínas Integrales: Están unidas a los lípidos y constituyen parte importante de

la estructura de membrana ya que si estas se extraen se produce el rompimiento

de la bicapa lipídica, estas proteínas intervienen en los mecanismos de transporte.

b. Proteínas Periféricas: Se sitúan en el interior de la membrana y su extracción no

altera la estructura de la bicapa lipídica

La membrana también contiene carbohidratos y canales acuosos a través de los cuales

se absorben moléculas con determinadas características en cuanto a peso molecular y

pKa para que puedan absorberse.

28

2.2.5.2.3. Mecanismos de Absorción

Entre los diferentes mecanismos para la absorción de los fármacos los más importantes

son la difusión pasiva y el transporte mediado.

a. Difusión pasiva: Consiste en el paso de los componentes a través de la

membrana a favor del gradiente de concentración y sin consumo de energía, la

mayoría de los fármacos se absorben por medio de este mecanismo.

Los componentes polares o iónicos no se absorben o lo hacen de manera muy lenta a

través de la membrana, en cambio los compuestos no ionizados, no polares atraviesan

fácilmente la membrana celular, la mayoría de fármacos son ácidos o bases parcialmente

ionizados por lo que tienden atravesar fácilmente la membrana.

El paso a través de la membrana viene regido por leyes fisicoquímicas determinadas

como la Ley de Fick, según la cual existe un gradiente de concentraciones que se origina

por un flujo irreversible de materia desde un lugar de mayor concentración hacia uno de

menor concentración.

Ilustración 7. Ley de Fick Elaborado por: Wendy Chávez (2015)

dQ

dt= DPS

dc

dx

dQ

dt=

DPS

δΔC

29

dQ

Vdt= −

dA

dt=

DPS

δ(𝐴 − 𝐶)

−𝒅𝑨

𝒅𝒕= 𝐊𝐚 (𝐦𝐞𝐦𝐛𝐫𝐚𝐧𝐚)𝐀

Ecuación 1. Ley de Fick. Difusión pasiva

Donde:

dQ

dt = Velocidad de difusión

DPS

δ = Ka (membrana)

D= Coeficiente de difusión

P= Coeficiente de reparto

S= Superficie de absorción

A= Cantidad de fármaco que queda en el lugar de absorción

dc

dx = Diferencia de concentración a ambos lados de la membrana

dA

dt = Velocidad con que desaparece el fármaco del lugar de absorción

Difusión por poros: Es un mecanismo que sirve para moléculas hidrofílicas de bajo

peso molecular como el agua y la úrea y el número y tamaño de los poros depende del

lugar de acción, los poros so estructuras móviles y dependiendo del peso molecular de

las moléculas estas atraviesan los poros ubicados en varios sitios.

La absorción por poros no tiene mayor influencia cuando la administración es por vía oral

sin embargo es un mecanismo que se aplica para otras formas de administración como

subcutánea e intramuscular y este mecanismo también está regido por la Ley de Fick.

dQ

dt= DńMr2 dc

dt

dQ

dt=

DńMr2

δΔC

dQ

Vdt= −

dA

dt=

DńMr2

δ(A − C)

30

−𝐝𝐀

𝐝𝐭= 𝐊𝐚 (𝐩𝐨𝐫𝐨𝐬)𝐀

Ecuación 2. Difusión por poros

Donde:

dQ

dt = Velocidad de difusión

D´nMr2

δ = Ka (poros)

D´= Coeficiente de difusión (canales acuosos)

n = Número de poros

r = Radio de los poros

M = Peso molecular

dc

dt = Diferencia de concentración a ambos lados de la membrana

dA

dt = Velocidad con que desaparece el fármaco del lugar de absorción

b. Transporte activo: Existe un número de fármacos cuya polaridad es muy alta y

sui peso molecular elevado como para atravesar los poros, en estos casos la

absorción esta mediada por las proteínas integrales que actúan como

transportadores de la membrana.

En este mecanismo el fármaco primero se une a una zona específica de la molécula

transportadora formando un complejo fármaco-trasportador sufriendo así un cambio

conformacional que le permite atravesar la membrana para que se produzca la disolución

en su interior.

Existen dos aspectos importantes a considerar cuando se trata de este mecanismo:

i. Selectividad

Para que el fármaco sea transportado debe tener características conformacionales que le

permitan unirse al transportador de manera selectiva y específica.

31

El número de moléculas que se absorben por este mecanismo depende del número de

portadores existentes en la membrana y la cantidad máxima de moléculas que puedan

ser transportadas depende de la velocidad máxima de transporte.

ii. Saturabilidad

Se refiere a la capacidad del portador de llevar al fármaco al otro lado de la membrana,

es decir su capacidad de transporte.

Cuando se llega a la capacidad máxima de transporte se dice que el sistema está

saturado y por lo tanto ya no es capaz de trasportar más moléculas hacia el otro lado de

la membrana.

La siguiente tabla muestra algunos ejemplos de sustancias que se absorben por los

diferentes mecanismos antes mencionados:

Tabla 1. Mecanismos de absorción de fármacos

MECANISMO CARACTERÍSTICAS DEL

PROCESO EJEMPLOS

Difusión por membrana

- pKa fármaco

- pH del medio

- Coef. de reparto

- Gradiente de

concentración

- Coef. de difusión

Ácidos y bases débiles

Mayoría de los fármacos

Difusión por poros

- Diámetro del poro

- Número de poros

- Carga eléctrica

A nivel intestinal: Compuestos

polares con un tamaño de 250-

300 daltons como agua y urea

Endotelios: Fármacos de hasta

10000 daltons

Transporte activo

- Transportadores

- Contra el gradiente de

concentración

- Saturabilidad y

Selectividad

Sustancias fisiológicas y

naturales y fármacos como

Betalactámicos, Antitumorales,

Levodopa, entre otros

Elaborado por: Wendy Chávez (2015)

32

2.2.5.3. Distribución

Es un proceso reversible de transferencia del fármaco desde la sangre a los diferentes

espacios extravasculares, órganos, tejidos y fluidos.

Para que el fármaco alcance desde su lugar de absorción su lugar de acción debe

atravesar diversas membranas para llegar a la sangre y para pasar de esta al líquido

intersticial y, en su caso, al interior de las células e, incluso, de estructuras intracelulares.

El paso del fármaco de la sangre a los tejidos depende de la fijación del fármaco a las

proteínas del plasma, ya que solo el fármaco libre difunde libremente a los tejidos.

(Florez, 2008)

Existen una serie de mecanismos implicados en este proceso:

I. Convección: Consiste en el transporte del fármaco a través del torrente

sanguíneo por medio de la fracción acuosa de la sangre.

II. Dispersión: Proceso por el cual el fármaco se dispersa en los espacios

acuosos corporales.

III. Paso a través de las membranas: Proceso por el cual el fármaco atraviesa

las membranas vasculares o celulares.

IV. Unión a las proteínas plasmáticas: Unión del fármaco a las proteínas o

componentes tisulares de carácter proteico y lipídico.

El fármaco en el torrente circulatorio se fija a varios soportes:

Esquema de Shanker:

1.- Receptores: Responsables de la acción farmacológica

2.- Aceptores: Cumplen la función de almacenamiento o reserva del fármaco, el cual van

liberando lentamente para que se produzca la acción farmacológica

3.- Lugares enzimáticos: Responsables del metabolismo y excreción del fármaco.

33

El fármaco disuelto en la sangre pasa de los capilares a los tejidos a favor del gradiente

de concentración depende de los siguientes factores:

o Características del fármaco (tamaño de la molécula, liposolubilidad y grado de

ionización),

o Unión del fármaco a las proteínas plasmáticas,

o Flujo sanguíneo del órgano,

o Luz capilar,

o Grado de turgencia y

o Características del endotelio capilar.

Un fármaco muy liposoluble accederá más fácilmente a los órganos muy irrigados, como

el cerebro, el corazón, el hígado o los riñones, más despacio al músculo y con mayor

lentitud a la grasa y otros tejidos poco irrigados, como las válvulas cardíacas.

Incluso puede haber deferencias dentro de un órgano, por ejemplo, entre la corteza y la

médula renales, o entre el hueso cortical y esponjoso. Un fármaco menos liposoluble

llegará bien a los tejidos cuyos capilares son ricos en hendiduras intercelulares, como es

el caso de las sinusoides hepáticas cuyas abundantes fenestraciones y hendiduras

intercelulares permiten el paso de sustancias con elevado peso molecular, pero tendrá

dificultad para acceder a los tejidos que carecen de ellas, como el SNC.

La inflamación produce vasodilatación y aumento de la permeabilidad capilar, lo que

puede aumentar la concentración alcanzada en algunos tejidos. Cuando la concentración

plasmática disminuye, el fármaco pasa de nuevo a los tejidos a favor del gradiente de

concentración.

Dentro del proceso de distribución del fármaco en el organismo es importante considerar

los subprocesos que este sufre y que pueden afectar de manera significativa la

distribución optima del mismo, existen 3 subprocesos importantes a tomar en cuenta:

2.2.5.3.1. Unión del fármaco a proteínas plasmáticas

Las moléculas de un fármaco son transportadas en la sangre disueltas en el plasma,

fijadas a las proteínas plasmáticas o unidas a las células sanguíneas.

34

La unión de los fármacos a las proteínas del plasma es muy variable, haciendo que el

porcentaje de fármaco libre que pasa a los tejidos fluctúe desde el 100 % del atenolol al

0,1% del flurbiprofeno.

La fijación a la albúmina es la más frecuente e importante, aunque la carga de la

albúmina es negativa, fija tanto fármacos ácidos como bases mediante enlaces iónicos y

ocasionalmente enlaces covalentes. Los fármacos ácidos suelen fijarse a la albúmina en

el sitio I (tipo Warfarina) o II (tipo Diazepam).

Las bases débiles y las sustancias no ionizables liposolubles suelen unirse a las

lipoproteínas y las bases débiles, además, a la albúmina α-glucoproteína, no siendo

infrecuente que una base débil se una simultáneamente a varias proteínas. (Florez, 2008)

La unión del fármaco a proteínas puede condicionar la distribución y eliminación del

fármaco, esto debido a la afinidad específica de cada fármaco frente a las proteínas, así:

- Un fármaco con gran afinidad por las proteínas va a tener una fracción libre

pequeña por lo tanto un bajo volumen de distribución.

- Un fármaco con baja afinidad por las proteínas tendrá una fracción libre mayor y

por lo tanto mayor volumen de distribución.

La unión a proteínas plasmáticas también influye en la intensidad y duración del efecto

farmacológico de acuerdo a la siguiente tabla:

Tabla 2. Afinidad a las proteínas

AFINIDAD A PROTEINAS

Baja Alta

CARACTERÍSTICA

Fracción libre Mayor Menor

Intensidad Mayor Menor

Duración del efecto Menor Mayor

Volumen de distribución Mayor Menor


35

La fijación a proteínas es reversible y sigue la ley de acción de masas. La cantidad de

fármaco unido a proteínas (FP) depende de la concentración de fármaco libre (F), de la

constante de asociación (K1/K2), del número de sitios de fijación libres por mol de proteína

y de la concentración molar de proteína:

Habitualmente el porcentaje de la concentración total del fármaco que se encuentra unido

a proteínas permanece constante dentro de un intervalo amplio de concentraciones, pero

hay fármacos, como el valproato sódico, que, cuando se utilizan concentraciones altas,

saturan los puntos de fijación, aumentando la proporción de fármaco libre. (Florez, 2008)

También se puede unir de manera irreversible a las proteínas por uniones covalentes,

cuyo caso se necesita la activación química del fármaco para lograr esta unión con las

proteínas, como consecuencia de este proceso se genera toxicidad en el organismo.

2.2.5.3.2. Tipos de Proteínas

a. Albúmina

Constituye la proteína más abundante en el organismo, tiene un peso molecular PM de

69000 daltons, se ubica en el plasma en un 40 % y en varios órganos y tejidos, la

cantidad en el organismo va de 35 a 45 g/L.

Presenta en su estructura 4 sitios de fijación para los fármacos:

A esta proteína se unen fármacos de carácter neutro o ligeramente ácidos

b. Glicoproteínas

Proteína plasmática más pequeña que presenta un peso molecular de 41000 daltons,

tiene ácido siálico en su estructura y la cantidad en el organismo es de 0,4 a 1 g/L, siendo

esta una cantidad variable bajo ciertas condiciones fisiológicas, así por ejemplo, la

36

cantidad sube en casos inflamatorios, estrés y procesos malignos y disminuye cuando

existen problemas renales y hepáticos.

A esta proteína se unen fármacos de carácter básico como: metadona, lidocaína,

propanolol, betabloqueantes y antirrítmicos.

c. Lipoproteínas

Son proteínas de alto peso molecular 2,5 millones de daltons, presentan una cantidad

importante de lípidos en su estructura y su concentración en el organismo varía de

acuerdo a la edad, la dieta y la existencia de patologías.

A este grupo de proteínas se unen fármacos liposolubles como la imipramina,

diclofenaco, clorpromazina, quinidina y ciclosporinas A.

d. Globulina (α, β, δ)

Estas proteínas presentan gran afinidad por sustancias endógenas y exógenas, su peso

molecular es variable y la cantidad en el organismo varía de acuerdo a condiciones

fisiológicas específicas.

Se fijan a esta proteína esteroides como la prednisona, tiroxina y vitamina B12.

2.2.5.3.3. Unión del fármaco a componentes tisulares

Esta unión es de carácter proteínica – lipofílica formando complejos de adsorción que

liberan lentamente el fármaco, la formación de complejos depende de las características

fisicoquímicas del fármaco, ya que existen fármacos muy liposolubles que quedan

retenidos a nivel del tejido adiposo.

La velocidad de formación de los complejos es inversamente proporcional a la liberación

del fármaco.

37

Tabla 3. Componentes tisulares que fijan fármacos

MATERIAL FÁRMACO UNIDO

ADN Agentes antineoplásicos y antimaláricos

Melanina Cloroquina y fenotiazona

Tejido calcificado Tetraciclinas

Mucopolisacaridos Aminas

Fracciones celulares Sustancias lipofílicas

Dihidrofolato reductasa Metotrexato

Transcortinas Corticoides


2.2.5.3.4. Irrigación tisular

Existen fármacos que llegan fácilmente a todos los órganos y fármacos cuyo proceso es

más lento o no llegan; esto ocurre debido a que existen zonas altamente irrigadas y

zonas poco irrigadas a las que el fármaco puede o no llegar según sus características

fisicoquímicas.

Zonas altamente irrigadas: Cerebro, hígado, pulmón, riñón, en estas zonas la

dosis absorbida es del 70 %.

Zonas poco irrigadas: Piel y músculo esquelético (15 %), médula ósea y tejido

adiposo (10 %), huesos y cartílagos (5 %), en total la dosis absorbida en estas

zonas es del 30 %.

2.2.5.4. Metabolismo

Es un proceso irreversible de eliminación del fármaco cuyo objetivo es transformar un

fármaco lipofílico en hidrofílico para que pueda ser eliminado del organismo y además

conducir a un metabolito activo hacia el lugar donde ejercerá su actividad farmacológica.

En el proceso de metabolización existen dos fases importantes:

I. Creación de centros de conjugación, para lo cual se utilizan varias reacciones

químicas como hidroxilación, oxidación, reducción, hidrólisis y epoxidación.

38

II. La primera fase consiste en la conjugación con una molécula endógena formando

un compuesto inicial que posteriormente se une al ácido glucurónico dando lugar

al conjugado que es eliminado fácilmente.

2.2.5.4.1. Fase I

- Oxidación: Es la reacción metabólica más frecuente producida por el sistema

oxidativo del microsoma hepático, en este proceso intervienen dos enzimas:

Citocromo P-450 y NADH – citocromo P-450 reductasa.

Los procesos de oxidación ocurren por reacciones de hidroxilación arilo-alquilo, oxidación

de alcoholes, formación de sulfóxidos y apertura de anillos.

a. Hidroxilación alifática

b. Hidroxilación aromática

39

c. Desaminación oxidativa

d. Desalquilación

- Reducción: Es un proceso menos frecuente que la oxidación y se produce sobre

compuestos con grupos N en su estructura o compuestos azoicos.

Se aplica para compuestos azoicos, para el hidrato de cloral, reducción de alcoholes y

aldehídos.

40

- Hidrólisis: Es una reacción que se produce en ésteres y amidas, es menos

frecuente que la oxidación pero más común que la reducción, son reacciones que

ocurren por la acción enzimática de estearasas y amidasas.

2.2.5.4.2. Fase II

Una vez creado el centro de conjugación el fármaco se conjuga con el ácido glucurónico

para que pueda ser eliminado del organismo, la glucurono conjugación se produce con

hidroxilos, carboxilos, aminas o sulfhidrilos.

El 80 % de conjugación se produce con el ácido glucurónico, generalmente en el hígado

pero también ocurre a nivel de la piel, tejidos, intestinos y riñones.

2.2.5.5. Excreción

Una vez metabolizado el fármaco por medio de la conjugación, se elimina del organismo

por varios mecanismos, siendo el principal el mecanismo de excreción renal que a su vez

está dividido en 3 sub mecanismos:

a. Filtración glomerular: Se eliminan por esta vía fármacos iónicos o no iónicos de

bajo peso molecular y es un mecanismo de carácter pasivo.

b. Secreción tubular: Es un proceso de carácter activo, es decir, existe consumo de

energía, ya que ocurre en contra del gradiente de concentración, las moléculas

que se elimina por esta vía dependen del flujo sanguíneo.

c. Reabsorción tubular: Este proceso ocurre después de que el fármaco se filtró

por los glomérulos y puede ser de carácter activo o pasivo.

41

2.2.6. ANÁLISIS FARMACOCINÉTICO

Un modelo farmacocinético consiste en la representación simbólica de los diferentes

procesos que tienen lugar en un organismo vivo, conocidos en conjunto como sistema

LADME, cuyo objetivo es analizar el comportamiento del fármaco en el sistema mediante

un diseño matemático, fisicoquímico y/o fisiológico.

Tabla 4. Modelos del Análisis Compartimental

Modelo N° de

Compartimentos

Características Matemáticas

Compartimental 1-3 Ajuste de datos a los

parámetros del medio

No compartimental 0 Utilización de

momentos estadísticos


2.2.6.1. Modelos farmacocinéticos compartimentales

Es difícil establecer relaciones cuantitativas entre la dosis, vía de administración y la

concentración del fármaco en el organismo debido a la complejidad que presenta el

cuerpo humano, debido a esto para poder estudiar el tránsito del medicamento en el

organismo es necesario agrupar las diferentes zonas fisiológicas en compartimentos.

Compartimento: Se define como una fracción del material biológico en la que el fármaco

se encuentra uniformemente distribuido y presenta iguales propiedades fisicoquímicas.

2.2.6.1.1. Modelo Monocompartimental

En este modelo se considera al organismo como un compartimiento único constituido por

agua plasmática, fluido intersticial y agua intracelular en los tejidos altamente irrigados.

El equilibrio entre los tres componentes es instantáneo y no existe un proceso de

distribución como tal.

42

Este modelo agrupa la liberación y la absorción en un solo proceso al que denomina

Absorción y agrupa el metabolismo y la excreción en un solo proceso llamado

eliminación.

Si la administración es intravenosa (iv)

Ecuación:

−𝐝𝐐

𝐝𝐭= 𝐊𝐞𝐐

Donde:

−𝐝𝐐

𝐝𝐭 = Velocidad de eliminación del fármaco

Kel = Constante de eliminación

Qel = Cantidad de fármaco eliminado

Si la administración es extravasal (a)

Ecuación:

−𝐝𝐐

𝐝𝐭= 𝐐𝐚𝐊𝐚 − 𝐐𝐞𝐊𝐞

Donde:

−𝐝𝐐

𝐝𝐭 = Velocidad de eliminación del fármaco

Ka = Constante de absorción

Qa = Cantidad de fármaco absorbido

Kel = Constante de eliminación

Qel = Cantidad de fármaco eliminado

43

2.2.6.1.2. Modelo Bicompartimental

Este modelo existen ya que se considera que el organismo no es un todo homogéneo y

por lo tanto la distribución del fármaco no es homogénea ni instantánea debido a la

presencia de zonas altamente irrigadas a las que el fármaco accede rápidamente y zonas

poco irrigadas a las que accede lentamente, en este modelo se considera que el

organismo está constituido por dos compartimientos el central y el periférico.

o Características

I. El plasma, fluidos intersticiales y agua intracelular de los tejidos altamente

irrigados forman el compartimiento central donde la distribución del fármaco es

instantánea y por lo tanto el plasma se considera una alícuota del mismo.

II. El agua intracelular profunda de los tejidos poco irrigados y los depósitos acuosos

de carácter proteico y lipídico forman complejos de absorción con el fármaco y

constituyen el compartimiento periférico a donde el fármaco accede lentamente y

se demora en lograr el equilibrio.

III. En el compartimiento central se materializa el proceso de eliminación regido por la

constante de eliminación (ke) y el proceso de distribución hacia el compartimiento

periférico regido por la constante correspondiente.

IV. En el compartimiento periférico desprovisto de procesos de metabolismo y

excreción, facilita la materialización del proceso de retorno o distribución hacia el

compartimiento central.

2.2.6.2. Modelos farmacocinéticos lineales

Un modelo farmacocinético lineal es aquel cuyos procesos cinéticos corresponden a una

cinética de 1er orden.

En este modelo existe una proporción directa entre la velocidad y la concentración del

fármaco en el compartimento, al variar la dosis no cambian los parámetros

farmacocinéticos, la concentración del fármaco a un tiempo determinado es directamente

44

proporcional a la dosis administrada y el área bajo la curva de nivel plasmático está

relacionada con la dosis administrada. (Lopez, 2012)

2.2.6.3. Modelos farmacocinéticos no lineales

En este modelo no existe una relación entre la concentración y la dosis y la velocidad y la

concentración, los parámetros farmacocinéticos cambian según la dosis administrada y

son modelos que se ajustan a situaciones en las que puede existir una saturación.

2.2.6.4. Análisis farmacocinético no compartimental

En el análisis farmacocinético no compartimental se aplica un análisis de las curvas de

nivel plasmático para obtener parámetros farmacocinéticos basados en criterios

estadísticos.

Los valores que se obtienen se definen como “esperanza matemática” que es la media de

la variable aleatoria y se determina mediante densidad de probabilidad.

2.2.6.5. Análisis farmacocinético poblacional

La experiencia en estudios farmacológicos ha permitido apreciar la gran variabilidad que

presentan los parámetros farmacocinéticos en una población de pacientes; esto ha

originado la realización de estudios poblacionales orientados a cuantificar el efecto de

diferentes factores (edad, peso, género, enfermedades concomitantes, entre otros) en los

procesos farmacocinéticos, con el fin de minimizar la variabilidad que, en principio, era

inexplicable. (Barranco, 2011)

La farmacocinética poblacional puede ser definida como el estudio de variabilidad inter e

intraindividual en las concentraciones plasmáticas de los fármacos, así como de los

parámetros farmacocinéticos que las condicionan cuando se administran mediante

regímenes estándar de dosificación a un grupo amplio de individuos o animales con

características fisiopatológicas y clínicas definidas. (Lopez, 2012)

45

Dentro de la farmacocinética poblacional existen tres parámetros básicos:

1. Parámetros de efectos fijos: Cuantifican el comportamiento farmacocinético

medio de un fármaco en una población y la relación entre los parámetros

farmacocinéticos y factores fisiopatológicos.

2. Parámetros de efectos aleatorios interindividuales: Cuantifican la magnitud

típica de la variabilidad interindividual de los parámetros farmacocinéticos, es

decir, describen la distribución de las desviaciones de los valores de estos

parámetros en los individuos con respecto a los valores medios de la población.

Estos parámetros son las desviaciones estándar de dichas distribuciones.

3. Parámetros de efectos aleatorios intraindividuales: Cuantifican la magnitud

típica de la variabilidad intraindividual (error residual) que incluye la variabilidad

cinética intraindividual, el error analítico y el error de especificación del modelo.

2.2.7. CURVAS DE NIVEL PLASMÁTICO

Son las más usadas para el estudio del LADME, el medicamento de administra a un

tiempo inicial t = 0 y se toman muestras a diferentes intervalos de tiempo para realizar la

gráfica y obtener las constantes farmacocinéticas.

Ilustración 8. Curva de Nivel Plasmático

Fuente: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/farmacocinetica_1_4325.pdf

46

2.2.7.1. Parámetros Farmacocinéticos

Parámetros cuantitativos que permiten obtener información acerca de los fenómenos

implicados en los procesos de LADME. (Betés de Toro, 2008)

2.2.7.2. C máx

Representa la mayor concentración de droga alcanzada después de una administración

oral y se expresa como una cantidad por unidad de volumen. (Remington, 2003)

2.2.7.3. T máx

Es la medida del lapso necesario para alcanzar la concentración máxima después de la

administración de la droga. (Remington, 2003)

2.2.7.4. Área bajo la curva (AUC)

Es el área bajo la curva de concentración en suero, sangre o plasma en función del

tiempo (ABC) y se expresa en peso/volumen por unidad de tiempo y puede considerarse

representativa de la cantidad de droga absorbida luego de la administración de una sola

dosis del fármaco. (Remington, 2003)

2.2.7.5. Volumen de distribución Vd

Es una constante de proporcionalidad que relaciona la concentración de la droga en un

líquido de referencia, típicamente plasma, con la cantidad de droga distribuida en todo el

organismo. (Remington, 2003)

2.2.7.6. Clearance Cl

Es el volumen de plasma que queda libre de fármaco por unidad de tiempo, y se expresa

en ml/min o ml/hora.

2.2.7.7. Constante de eliminación Ke

Expresa el porcentaje de fármaco eliminado por unidad de tiempo y principalmente se

expresa en horas.

47

Esta constante rige la velocidad de eliminación del proceso ya que se encuentra en la

pendiente de la ecuación exponencial y de la recta semilogarítimica y determina la

persistencia o fugacidad del efecto farmacológico.

2.2.7.8. Constante de absorción Ka

Expresa el porcentaje de fármaco que ha pasado al torrente sanguíneo por unidad de

tiempo.

2.2.7.9. Tiempo medio de eliminación (t ½)

Tiempo necesario para que la concentración plasmática del fármaco se reduzca al 50 %,

generalmente se expresa en horas.

2.2.8. GLIMEPIRIDA

2.2.8.1. Características físico-químicas

Ilustración 9. Estructura química de la glimepirida. Fuente: (FEUM, 2011)

Nombre: Trans- 3- Etil- 2,5- dihidro– 4- metil- N- [2-[4 [[[[( 4- metilciclohexil)amino]

carbonilamino] sulfonil] fenil] etil]- 2- oxo- 1H- pirrol- 1- carboxamida.

Fórmula Molecular: C24H34N4O5S

Peso Molecular: 490.62 g/mol

Punto de Fusión: 207° C

Características: Polvo cristalino blanco a blanco amarillento soluble en Metanol,

acetonitrilo y cloroformo. Insoluble en agua, 0.0012 mg/mL en agua a pH de 7.

48

Además de tener una solubilidad de 0.00087 mg/mL en una solución buffer con

pH de 6,8.

Clasificación Biofarmacéutica: Clase II.

2.2.8.2. Farmacocinética

Absorción

La biodisponibilidad de la glimepirida tras su administración oral es completa. Las

concentraciones máximas en suero (Cmáx) se alcanzan alrededor de las 2,5 horas

después de la toma oral (media de 0,3 mg/ml durante dosis múltiples de 4 mg diarios),y

hay una relación lineal entre la dosis y ambos, la Cmáx y el AUC (área bajo la curva

tiempo/concentración).

Distribución

La glimepirida tiene un volumen de distribución muy reducido (aproximadamente 8,8

litros), semejante al espacio de distribución de la albúmina, una alta capacidad de unión a

proteínas (99 %) y una baja tasa de aclaramiento (aprox. 48 ml/min).

Biotransformación y eliminación

La semivida media sérica dominante, que es relevante para las concentraciones séricas

en condiciones de dosis múltiple, es de 5-8 horas aproximadamente. Después de dosis

más altas, se han encontrado valores de semivida ligeramente superiores.

Tras una dosis única de glimepirida marcada radiactivamente, el 58 % de la radiactividad

se recuperó en la orina y el 35 % en las heces. No se detectó sustancia sin metabolizar

en la orina.

Se detectaron dos metabolitos en orina y heces, procedentes muy probablemente del

metabolismo hepático (la enzima mayoritaria es CYP2C9): el hidroxiderivado y el

carboxiderivado. (Goodman, 2001)

49

2.2.8.3. Farmacodinamia

Grupo farmacoterapéutico: Hipoglucemiantes orales: Sulfonamidas, derivados

de urea.

Código ATC: A10BB12.

La glimepirida es una sustancia con actividad hipoglucemiante por vía oral, que pertenece

al grupo de las sulfonilureas que puede utilizarse en la diabetes mellitus no insulino-

dependiente.

La glimepirida actúa principalmente estimulando la liberación de insulina por las células

beta-pancreáticas. Este efecto se basa, al igual que en otras sulfonilureas, en el

incremento de la respuesta de las células beta pancreáticas al estímulo fisiológico de la

glucosa. (Google, 2014)

El efecto de la glimepirida es reproducible y dependiente de la dosis y no existen

diferencias significativas en su efecto, independientemente de que el medicamento se

administre 30 minutos o inmediatamente antes de una comida.

A pesar de que el metabolito hidroxilado de la glimepirida causa disminuciones pequeñas

pero significativas de la glucosa sérica en personas sanas, este hecho representa

solamente una pequeña parte del efecto total del medicamento.

2.2.8.4. Mecanismo de acción

La glimepirida disminuye la concentración de glucosa en sangre, al estimular la liberación

de insulina desde las células beta-pancreáticas, tanto en sujetos sanos como en

pacientes con diabetes mellitus tipo 2.

Regula la secreción de insulina al interactuar con el canal de potasio sensible al ATP en

la membrana de las células beta uniéndose específicamente a una proteína de 65 kDa.

La glimepirida cierra los canales de potasio, lo que induce la despolarización de las

células beta, que resulta en la apertura de los canales de calcio sensibles al voltaje y el

influjo de calcio hacia la célula. Finalmente, el incremento en la concentración intracelular

de calcio activa la liberación de insulina a través de exocitosis.

50

Se asume que por su alto grado de intercambio con la proteína de unión, produce una

pronunciada sensibilización a la glucosa y protege a las células beta de la

desensibilización y del agotamiento temprano. (Goodman, 2001)

2.2.8.5. Interacciones

- Potenciación, que aumentará la actividad hipoglicemiante por:

a. Incrementar la fracción libre al desplazarlas de proteínas plasmáticas: fibratos,

salicilatos.

b. Inhibir su biotransformación hepática: dicumarínicos, antihistamínicos anti-H2-.

c. Reducir su excreción urinaria: salicilatos, probenacida.

d. Interacción farmacodinámica: etanol, salicilatos, bloqueantes β.

- Antagonismo, al disminuir su actividad hipoglicemiante mediante:

a. Supresión de la secreción insulínica por las células β pancreáticas: tiacidas,

furosemida, fenitoína, diazóxido.

b. Interferencia con la insulina liberada: corticoides, estrógenos, simpaticomiméticos.

c. Inducción enzimática de su metabolismo hepático: etanol, barbitúricos,

rifampicina. (Lorenzo, 2008)

2.2.8.6. Efectos adversos

La frecuencia de reacciones adversas en los pacientes que reciben sulfonilureas es baja

(2-5 %); dichas reacciones suelen ser de carácter leve y reversible tras retirar la

medicación casual.

La hipoglucemia es la complicación más frecuente, que se verá favorecida en caso de

interacciones medicamentosas que potencien sus efectos de aspectos relacionados con

la cinética del preparado usado u otras circunstancias.

Los resultados del University Group Diabetes Program (UGDP) sugeríasn que las

sulfonilureas podían facilitar la aparición de afecciones cardiovasculares. Sin embargo,

las conclusiones del amplio estudio de cohortes realizado por el United Kingdom

Prospective Diabetes Study (UKPDS) indican claramente que, después de un

51

seguimiento de 14 años, los diabéticos de tipo 2 tratados con sulfonilureas no

presentaron mayor incidencia de mortalidad atribuible a cardiopatía isquémica.

Con menor frecuencia pueden observarse manifestaciones por hipersensibilidad de tipo

cutáneo (exantema, prurito, fotosensibilidad, eritema nudoso, eritema multiforme,

síndrome de Stevens-Jonhson, púrpura) y, más raramente, reacciones anafilácticas.

Con clorpropamida se ha descrito hiponatremia por secreción inapropiada de ADH y

reacción vasomotora tipo efecto Antabús. La glipicida puede ocasionar manifestaciones

digestivas (epigastralgia, pirosis, nauseas, vómitos y alteración de las pruebas de función

hepática).

A pesar de la escasa experiencia con glimepirida, se ha comunicado púrpura

trombocitopénica asociada a su utilización. (Lorenzo, 2008)

2.2.8.7. Posología

Al iniciar el tratamiento con sulfonilureas debe prescribirse la mínima dosis efectiva e

incrementarla progresivamente (cada 2 semanas) hasta alcanzar un control glucémico

óptimo.

Se administra por vía oral, preferentemente, 15 – 30 minutos antes de las comidas

principales y repartiendo la dosis diaria total para mantener niveles de glucemia

aceptables.

Aunque no se dispone de datos clínicos que indiquen la superioridad de algún fármaco en

particular, lo cierto es que la glimepirida presenta la ventaja de una sola administración

diaria. (Lorenzo, 2008)

2.2.9. MÉTODO DE CUANTIFICACIÓN HPLC/UV

La cromatografía líquida de alta eficacia es actualmente la técnica de separación más

utilizada debido a su versatilidad y amplio campo de aplicación.

Los componentes de la muestra, previamente disueltos en un disolvente adecuado (fase

móvil), son forzados a atravesar la columna cromatográfica gracias a la aplicación de

altas presiones, el material interno de la columna conocido como fase estacionaria, está

52

constituido por un relleno capaz de retener de forma selectiva los componentes de la

mezcla.

La resolución de esta separación depende de la interacción entre la fase estacionaria y la

fase móvil, pudiendo ser manipulada a través de la elección de diferentes mezclas de

disolventes y distintos tipo de rellenos como resultado final los componentes de la

mezcla salen de la columna separados en función de sus tiempos de retención en lo que

constituye el cromatograma a través del cual se puede realizar la identificación cualitativa

y cuantitativa de las especies separadas.

Los disolventes más usados en HPLC son: agua, disoluciones tampón acuosas y

disolventes orgánicos como el metanol estos deben ser espectroscópicamente puros,

exentos de partículas sólidas y desgasificados, esto se lleva a cabo con un gas inerte

muy poco soluble como el helio.

Como fase estacionaria lo más común es usar partículas microporosas esféricas de sílice

muy puro que son permeables al disolvente. (Skoog, Holler, & Nieman, 2001)

2.2.9.1. Instrumentación para cromatografía de líquidos

Como consecuencia de las elevadas presiones que se utiliza en este tipo de

cromatografía, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser más sofisticado y caro que

el que se utiliza en otros tipos de cromatografía, la figura muestra un esquema de los

componentes fundamentales de un cromatógrafo de líquidos de alta eficacia típico.

Ilustración 10. Cromatógrafo líquido de alta eficiencia HPLC Fuente: (Skoog, Holler, & Nieman, 2001)

53

2.2.10. Métodos analíticos para extracción de fármacos de la matriz biológica

El objetivo del proceso de preparación de la muestra es proporcionar una muestra

adecuada, por lo general para el análisis cromatográfico, que no se contamine la

instrumentación y donde la concentración en la muestra preparada es un reflejo de la que

se encuentra en el original. (Watt, Morrison, & Evans, 2000)

El método de preparación de la muestra seleccionada está dictado generalmente por la

técnica analítica disponible y las características físicas de los analitos investigados. Los

dos métodos principales de preparación de muestras son la limpieza de la matriz o de

inyección directa. En un procedimiento de limpieza de la matriz, el objetivo es eliminar la

mayor cantidad de material endógeno como sea posible de la muestra de drogas. (Watt,

Morrison, & Evans, 2000)

Preparación de la muestra se lleva a cabo tradicionalmente (a) por extracción líquido-

líquido, (b) extracción en fase sólida o (c) por precipitación de las proteínas del plasma,

mientras que el análisis final en la mayoría de los casos se lleva a cabo por cromatografía

líquida de interfaz con espectrometría de masas o espectrometría de masas o

cromatografía de gases con columna capilar. (Prabu & Suriyaprakash, 2012)

Este método muy utilizado en los análisis bioanalíticos, es una técnica muy sencilla para

la extracción del analito de la matriz. Si se sospecha de una unión de proteína con el

fármaco, entonces la precipitación de proteínas como método de extracción de la muestra

puede ser considerado. Reactivos para realizar la precipitación pueden ser perclórico,

tricloroacético y ácidos túngstico, y disolventes orgánicos tales como acetonitrilo o

metanol. Con todo esto, es necesario tener en cuenta la capacidad de los analitos y los

requisitos para llevar a cabo el procedimiento de extracción de la matriz biológica.

2.2.10.1. Precipitación de proteínas

El requisito principal de esta técnica es que el analito debe ser libremente soluble en la

reconstitución de disolvente. La preparación de la muestra a través de la precipitación de

proteínas logra la separación por conversión de proteínas solubles a un estado insoluble

por desplazamiento salino o mediante la adición de algún disolvente de precipitación

miscible o disolventes orgánicos tales como acetona, etanol, acetonitrilo o metanol.

(Backes, 2000)

54

Los resultados de la precipitación se utilizan a menudo en la secuencia de purificación de

muestras, ya que reducen el volumen y el aumentan la pureza de la proteína antes de

cualquier análisis por cromatografía. Las proteínas pueden pegarse entre sí a través de

una de las tres fuerzas: electrostática, hidrofóbica, y Van Der Waals. El último es difícil de

distinguir del hidrófobo y opera en un rango muy corto. Las fuerzas electrostáticas operan

a larga distancia, pero entre las moléculas son fuerzas de repulsión en vez de atracción.

(Wells D. , 2003)

Las proteínas pueden volverse insolubles mediante la alteración de sus propiedades

superficiales, características de carga o cambiar las características de disolvente, el

cambio de las características de disolventes siendo los preferidos. Las proteínas son

menos solubles cuando su punto isoeléctrico (pI) oscila entre el 4 - 10. Se recomienda la

selección de un buffer en o cerca del punto isoeléctrico de la proteína. Sin embargo,

algunas proteínas pueden desnaturalizarse a su pI y por encima de su pI. (Backes, 2000)

La solubilidad de una proteína aumenta con la adición de la sal y alcanza un máximo

después de lo cual hay una disminución lineal en la solubilidad rápida. Hay varios

métodos para reducir la solubilidad de proteínas, que son iónica precipitación, con

compuestos como sulfato de amonio, cloruro de sodio; iones metálicos, como Cu +2, Zn+2

y Fe +2. (Wells D. , 2003)

En la práctica, la precipitación se realiza generalmente a baja temperatura. La condición

para la proteína es que se manejen en un medio frío, por ejemplo en un baño de hielo,

porque las proteínas tienden a desnaturalizarse a temperaturas más altas, aunque si el

control se puede conseguir suficiente y su proteína es más estable que otras, esto puede

ser selectivo y lograr una mayor purificación. (Wells D. , 2003)

Comúnmente la muestra se centrifuga a alta velocidad durante un tiempo suficiente,

todos los componentes precipitados de plasma se liquidarán en el fondo del

sobrenadante.

El líquido sobrenadante obtenido se puede inyectar directamente en la HPLC o puede ser

evaporado y se reconstituye con la fase móvil para tener más limpia la muestra. Puede

llevarse a cabo mediante el uso de micro centrífuga a muy alta velocidad para mejorar la

limpieza de muestra. (Wells D. , 2003)

55

2.2.10.2. Extracción Líquido-líquido (LLE)

Una de las técnicas más útiles para el aislamiento de los componentes deseados de una

mezcla es la extracción líquido-líquido (LLE). LLE es un método utilizado para la

separación de una mezcla utilizando dos disolventes inmiscibles. En la mayoría de LLEs,

una de las fases es acuosa y el otro es un disolvente orgánico inmiscible.

La capacidad para separar los compuestos en una mezcla utilizando la técnica de LLE

depende cómo interactúan los componentes de la muestra a analizar entre los dos

disolventes inmiscibles. La partición selectiva del compuesto de interés en una de las dos

fases no miscibles o parcialmente miscibles se produce por la adecuada elección del

disolvente de extracción. (Harris, 2004)

En esta técnica la muestra se distribuye en dos fases, en donde una fase es inmiscible a

otra. LLE separa los analitos de interferencias partiendo la muestra entre dos líquidos o

fases inmiscibles.

En primer lugar, la mezcla de componentes se disuelve en un disolvente adecuado y se

añade un segundo disolvente que es inmiscible con el primer disolvente. A continuación,

los contenidos se mezclan a fondo (agitación) y los dos disolventes inmiscibles permiten

separar en capas las diferentes fases. (Harris, 2004)

Generalmente después de la extracción los compuestos hidrófilos se encuentran en la

fase acuosa polar y compuestos hidrofóbicos se encuentran principalmente en los

disolventes orgánicos.

El analito que se extrae en la fase orgánica es fácilmente recuperado por evaporación del

disolvente, el residuo se reconstituye con un pequeño volumen de un disolvente

apropiado fase de preferencia móvil mientras analito extraído en la fase acuosa puede

ser inyectado directamente en una columna RP. (Harris, 2004)

LLE técnica es simple, rápida es costo relativo efectiva por muestra, en comparación con

otras técnicas y se puede tener un porcentaje de recuperación alto que permite ser

cuantitativo (90 %).

56

2.2.10.3. Extracción en Fase Sólido (SPE)

Los objetivos de la SPE son reducir el nivel de interferencias, minimizar el volumen de la

muestra final para maximizar la sensibilidad del analito y proporcionar la fracción de

analito en un disolvente que es compatible con las técnicas de medición analíticos. Como

un beneficio adicional, la SPE sirve como un filtro para eliminar partículas de la muestra.

(Zief & Kiser, 2000)

El grado de enriquecimiento alcanzable para una muestra particular depende de:

La selectividad de la fase unida para el analito

La fuerza relativa de la interacción

Con la SPE se puede preparar múltiples muestras en paralelo (normalmente 12-24

muestras) y utiliza relativamente bajas cantidades de disolventes y los procedimientos se

pueden automatizar con facilidad. Como su nombre indica el principio de SPE es una

técnica de extracción similar a la de LLE, que implica una partición de los solutos entre

dos fases. Sin embargo, en lugar de dos fases líquidas inmiscibles, como en LLE, SPE

implica la partición entre un líquido (matriz de la muestra o disolvente con los analitos) y

una fase sólida (absorbente). (Zief & Kiser, 2000)

SPE es un proceso de separación más eficiente que LLE, se obtiene fácilmente una

mayor recuperación de analito mediante el empleo de una pequeña columna de plástico

desechable o cartucho, a menudo el barril de una jeringa médica con una cantidad de 0,1

a 0,5 g de sorbente que es comúnmente un material de sílice-C18.

Los componentes de interés pueden adsorber preferentemente al sólido, o pueden

permanecer en la segunda fase no sólida. Una vez que se ha alcanzado el equilibrio, las

dos fases se separan físicamente por decantación, filtración, centrifugación o un proceso

similar. (Zief & Kiser, 2000)

2.2.11. VALIDACIÓN DE MÉTODOS

La validación de un método es el proceso que establece, mediante estudios de

laboratorio; que las características de desempeño del método, satisfacen los requisitos

para su aplicación analítica. (FEUM, 2011)

57

El proceso de validación de los métodos analíticos puede comprender, pero no está

limitado al estudio de las características de desempeño recomendadas para la validación

de los métodos analíticos que se describen a continuación:

Verificación del sistema

Precisión del sistema

Linealidad del sistema

Especificidad/Selectividad del método

Exactitud del método

Linealidad e intervalo del método

Precisión del método

Límite de detección del método

Límite de cuantificación del método

Robustez del método

Tolerancia del método

Fuente: (FEUM, 2011)

Los métodos analíticos para fines de validación se clasifican en cuatro categorías, ya que

requieren de diferentes esquemas de estudio:

Categoría I. Métodos analíticos para cuantificar a un componente específico en muestra

de producto terminado o en pruebas de estabilidad, ya sea en fármacos, aditivos o

preparados farmacéuticos u otros analitos de interés.

Categoría II. Métodos analíticos para la determinación de impurezas (productos de

degradación, sustancias relacionadas, isómeros ópticos, etc.) en muestras de fármacos,

preparados farmacéuticos y aditivos.

Estos métodos pueden incluir determinaciones cuantitativas o pruebas límite. En estas

últimas, el interés es establecer si el analito, excede o no, un valor límite. Los métodos de

pureza quedan incluidos en esta categoría.

Categoría III. Métodos analíticos utilizados en la determinación de un analito en una

muestra con el objeto de evaluar una característica de desempeño del preparado

farmacéutico (disolución de cápsulas, liberación controlada de tabletas, entre otras).

58

Categoría IV. Pruebas de identificación de un analito en muestras de fármacos, aditivos o

preparados farmacéuticos, cuyo propósito es establecer la presencia del analito de

interés.

En términos del estudio de laboratorio, los requisitos mínimos de las características de

desempeño, deben documentarse en un protocolo, ejecutarse, y al término de éste,

elaborar un informe donde se establezca su validez. (FEUM, 2011)

Tabla 5. Datos requeridos para la validación

Fuente: (USP-34-NF-29, 2011)

2.2.11.1. Características del Desempeño Analítico

Características Analíticas Típicas Utilizadas para la Validación de Métodos:

Exactitud

Precisión

Especificidad

Límite de Detección

Límite de Cuantificación

Linealidad

Intervalo

Robustez

Fuente: (USP-34-NF-29, 2011)

2.2.11.2. Verificación de Sistema

Son pruebas utilizadas para verificar que el sistema funciona correctamente, con base en

criterios establecidos previamente. (FEUM, 2011)

59

Se determina en base a características del equipo definidas en función de la respuesta

analítica como sus propiedades, su variabilidad, su forma, tiempos de respuesta,

indicadores de separación, indicadores de eficiencia, respuesta de blancos, entre otros.

2.2.11.3. Precisión del Sistema

Es el grado de concordancia relativa de la respuesta analítica de soluciones de referencia

de concentración o magnitud conocida.

Para su determinación el analista prepara a partir de una sustancia de referencia, por lo

menos seis soluciones que representen 100 % de la calidad o concentración del analito

en la muestra y medir la respuesta dentro de una misma corrida analítica. (FEUM, 2011)

La precisión de un procedimiento analítico es el grado de concordancia entre los

resultados de las pruebas individuales cuando se aplica el procedimiento repetidamente a

múltiples muestreos de una muestra homogénea. (USP-34-NF-29, 2011)

La precisión habitualmente se expresa como la desviación estándar o la desviación

estándar relativa (coeficiente de variación) de una serie de mediciones. La precisión

puede ser una medida del grado de reproducibilidad o de repetitibilidad del procedimiento

analítico en condiciones normales de operación. En este contexto, la reproducibilidad se

refiere al uso del procedimiento analítico en diferentes laboratorios, como por ejemplo en

un estudio en colaboración.

La precisión intermedia expresa la variación dentro de un laboratorio, por ejemplo en

diferentes días, con diferentes analistas o con equipos diferentes dentro del mismo

laboratorio.

La repetitibilidad se refiere a la utilización del procedimiento analítico en un laboratorio

durante un período corto por el mismo analista con el mismo equipo. (USP-34-NF-29,

2011)

La precisión se determina mediante el análisis de un número suficiente de alícuotas de

una muestra homogénea que permita calcular estadísticamente estimaciones válidas de

la desviación estándar o la desviación estándar relativa (coeficiente de variación).

60

Los análisis en este contexto son análisis independiente de muestras que se han llevado

a cabo mediante el procedimiento analítico completo, desde la preparación de las

muestras hasta el resultado final de las pruebas. (USP-34-NF-29, 2011)

Desviación Estándar:

Coeficiente de Variación:

Los documentos de ICH recomiendan que se evalúe la repetibilidad utilizando un mínimo

de 9 determinaciones que cubran el intervalo especificado para el procedimiento (es

decir, tres concentraciones y tres determinaciones de cada concentración) o usando un

mínimo de seis determinaciones al 100 % de la concentración de prueba. (USP-34-NF-

29, 2011)

2.2.11.3.1. Repetibilidad

Se define como la precisión de un método analítico, que expresa la variación dentro de

un mismo laboratorio, obtenida entre determinaciones independientes, pero bajo las

mismas condiciones.

2.2.11.3.2. Reproductibilidad

Este parámetro se define como la precisión de un método analítico, que expresa la

variación obtenida entre determinaciones independientes, en el mismo laboratorio, pero

bajo diferentes condiciones de análisis.

2.2.11.4. Linealidad del Sistema

Es la verificación de que la respuesta analítica y la concentración del analito se ajustan al

modelo matemático, en un intervalo de concentraciones pertinentes a la aplicación

analítica, este concepto se denomina generalmente “curva de calibración”

61

La determinación se basa en investigar la relación concentración-respuesta en un

intervalo que incluya al menos cinco niveles, por triplicado de la concentración del analito.

La linealidad de un procedimiento analítico es su capacidad para obtener resultados de

prueba que sean proporcionales ya sea directamente, o por medio de una transformación

matemática bien definida, a la concentración de analito en muestras dentro de un

intervalo dado. La linealidad se refiere a la relación entre la concentración y la medida de

valoración.

Debe establecerse inicialmente mediante examen visual de un gráfico de señales en

función de la concentración de analito del contenido. Si parece existir una relación lineal,

los resultados de la prueba deberían establecerse mediante métodos estadísticos

adecuados (p. ej., método de mínimos cuadrados).

Los datos obtenidos a partir de la línea de regresión pueden ser útiles para proporcionar

estimaciones matemáticas del grado de linealidad. Se deberían presentar el coeficiente

de correlación, la intersección con el eje de ordenadas, la pendiente de la línea de

regresión y la suma de los cuadrados residuales. (USP-34-NF-29, 2011)

La ICH recomienda que, para establecer la linealidad, se utilicen normalmente un mínimo

de cinco concentraciones, y en la valoración de un fármaco puede estar en un rango de

80 % a 120 % de la concentración de prueba.

2.2.11.5. Exactitud

La exactitud de un procedimiento analítico es la proximidad entre los resultados de la

prueba obtenidos mediante ese procedimiento y el valor verdadero. (USP-34-NF-29,

2011)

En la valoración de un fármaco, la exactitud puede determinarse mediante la aplicación

del procedimiento analítico con respecto a un analito de pureza conocida (p.ej., un

Estándar de Referencia), o comparando los resultados del procedimiento con los de un

segundo procedimiento bien caracterizado, cuya exactitud se haya comprobado o

definido. (USP-34-NF-29, 2011)

62

En la valoración de un fármaco en un producto formulado, la exactitud puede

determinarse mediante la aplicación del procedimiento analítico a mezclas sintéticas de

los componentes del producto farmacéutico al que se hayan añadido cantidades

conocidas de un analito dentro del intervalo del procedimiento. (USP-34-NF-29, 2011)

La exactitud se calcula como el porcentaje de recuperación de la cantidad valorada con

respecto a la cantidad conocida de analito añadida a la muestra, o como diferencia entre

la media de valoración y el valor verdadero aceptado, considerando los intervalos de

confianza. (USP-34-NF- 29, 2011)

La exactitud puede determinarse de varias maneras, mediante la evaluación de la

recuperación del analito (porcentaje de recuperación) en todo el intervalo de valoración, o

evaluando la linealidad de la relación entre las concentraciones estimadas y las reales.

(USP-34-NF-29, 2011)

Los documentos de ICH recomiendan que se evalúe la exactitud utilizando un mínimo de

nueve determinaciones sobre un mínimo de tres niveles de concentración, cubriendo el

intervalo especificado (es decir, tres concentraciones y tres determinaciones repetidas de

cada concentración). (USP-34-NF-29, 2011)

2.2.11.6. Intervalo

El intervalo es la amplitud entre la concentración inferior y superior del analito en la cual

se puede determinar al analito con un nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad

utilizando el procedimiento según se describe por escrito.

El intervalo se expresa normalmente en las mismas unidades que los resultados de la

prueba obtenidos mediante el procedimiento analítico.

El intervalo se valida verificando que el procedimiento analítico proporciona precisión,

exactitud y linealidad aceptables cuando se aplica a muestras que contienen el analito en

los extremos del intervalo, al igual que dentro del intervalo. (USP-34-NF-29, 2011)

63

2.2.11.7. Robustez

Es una medida de la capacidad del método analítico para no ser afectado por variaciones

pequeñas, aunque deliberadas, en los parámetros del procedimiento indicados en la

documentación, y provee una indicación de su aptitud durante condiciones normales de

uso. (USP-34-NF-29, 2011)

2.2.11.8. Límite de Detección

Es una característica de las pruebas de límite. Es la cantidad mínima de analito que

puede detectarse en una muestra, aunque no necesariamente cuantificarse, en las

condiciones experimentales indicadas. Las pruebas de límite simplemente comprueban

que la cantidad de un analito se encuentra por encima o por debajo de un nivel

determinado.

El límite de detección puede expresarse como concentración de analito en la muestra.

(USP-34-NF-29, 2011)

En el caso de procedimientos presentados para su consideración como procedimientos

farmacopeicos oficiales, casi nunca es necesario determinar el límite de detección real.

Más bien debe demostrarse que el límite de detección es lo suficientemente bajo

mediante el análisis de muestras con concentraciones conocidas de analito superiores e

inferiores al nivel de detección requerido. (USP-34-NF-29, 2011)

2.2.11.9. Límite de Cuantificación

Es una característica de las valoraciones cuantitativas de compuestos que se encuentran

en baja concentración en la matriz de una muestra, tales como: impurezas en fármacos a

granel y productos de degradación en productos farmacéuticos terminados.

Es la mínima cantidad de analito en una muestra que se puede determinar con precisión

y exactitud aceptables en las condiciones experimentales indicadas. El límite de

cuantificación se aplica habitualmente como concentración de analito en la muestra.

64

En el caso de procedimientos presentados para su consideración como procedimientos

farmacopeicos oficiales casi nunca resulta necesario determinar el límite de cuantificación

real.

Más bien debe demostrarse que el límite de cuantificación es lo suficientemente bajo

mediante el análisis de muestras con concentraciones conocidas de analito superiores e

inferiores al nivel de cuantificación. (USP-34-NF-29, 2011)

2.3. FUNDAMENTO LEGAL

2.3.1. Ecuador

2.3.1.1.1. Constitución de la República de Ecuador

TITULO VII: RÉGIMEN DEL BUEN VIVIR

Artículo 363: El estado será responsable de garantizar la disponibilidad y acceso a

medicamentos de calidad, seguros y eficaces, regular su comercialización y promover la

producción nacional y la utilización de medicamentos genéricos que respondan a las

necesidades epidemiológicas de la población.

2.3.1.1.2. Ley Orgánica de Salud

CAPÍTULO II: De la autoridad sanitaria nacional, sus competencias y responsabilidades.

Artículo 6.

Numeral 18: Regular y realizar el control sanitario de la producción, importación,

distribución, almacenamiento, transporte, comercialización, dispensación y expendio de

alimentos procesados, medicamentos y otros productos para uso y consumo humano; así

como los sistemas y procedimientos que garanticen su inocuidad, seguridad y calidad, a

través del Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical Dr. Leopoldo Izquieta Pérez y

otras dependencias del Ministerio de Salud Pública.

CAPÍTULO VI.

LIBRO TERCERO.- Vigilancia y control sanitario. Disposiciones comunes.

65

Artículo 131: El cumplimiento de la Normas de Buenas Prácticas de Manufactura,

Almacenamiento, Distribución, Dispensación y Farmacia será controlado y certificado por

la Autoridad Sanitaria Nacional.

CAPÍTULO XI.- De los medicamentos

Artículo 154: El Estado garantizará el acceso y disponibilidad de medicamentos de

calidad y su uso racional, priorizando los intereses de la salud pública sobre los

económicos y comerciales.

Artículo 157: La Autoridad Sanitaria Nacional garantizará la calidad de los medicamentos

en general y desarrollará programas de fármacovigilancia y estudios de utilización de

medicamentos, entre otros, para precautelar la seguridad de su uso y consumo.

2.3.1.1.3. Política Nacional de Medicamentos

Objetivo

Garantizar que las especialidades farmacéuticas disponibles en el mercado respondan a

las exigencias internacionales en cuanto a eficiencia terapéutica, seguridad fármaco-

clínica, contenido cuantitativo, costo-beneficio derivado de su utilización, eficacia y

seguridad en la dispensación; para lo cual, el país deberá disponer de la tecnología

necesaria que permita aplicar adecuados controles de calidad.

2.3.2. Normas ISO para productos Nanotecnológicos a nivel Mundial

ISO/TC 229 Nanotechnologies

Alcance

Normalización en el campo de las nanotecnologías que incluye uno o ambos de los

siguientes aspectos:

1. La comprensión y el control de la materia y los procesos a escala nanométrica, por

lo general, aunque no exclusivamente, por debajo de 100 nanómetros de una o más

66

dimensiones, donde la aparición de fenómenos dependientes del tamaño por lo general

permite nuevas aplicaciones

2. La utilización de las propiedades de los materiales a nanoescala que difieren de las

propiedades de los átomos individuales, moléculas, y la materia a granel, para crear

materiales mejorados, los dispositivos y sistemas que explotan estas nuevas

propiedades.

Las tareas específicas incluyen la elaboración de normas para: la terminología y la

nomenclatura, la metrología e instrumentación, incluidas las especificaciones para los

materiales de referencia, metodologías de prueba, modelado y simulaciones, y la salud

basadas en la ciencia, la seguridad y prácticas ambientales.

2.3.3. México

2.3.3.1. REGLAMENTO de la Ley General de Salud en Materia de Investigación

para la Salud

TÍTULO SEGUNDO

De los Aspectos Éticos de la Investigación en Seres Humanos

CAPÍTULO I

Disposiciones Comunes

ARTÍCULO 14.- La Investigación que se realice en seres humanos deberá desarrollarse

conforme a las siguientes bases:

II.- Se fundamentará en la experimentación previa realizada en animales, en laboratorios

o en otros hechos científicos.

TÍTULO SÉPTIMO

De la Investigación que incluya a la utilización de animales de experimentación.

CAPÍTULO ÚNICO

ARTÍCULO 121.- En las investigaciones experimentales con animales, referidas a la

salud humana, se deberán llenar los requisitos que establezcan las normas de las propias

67

instituciones de salud, autorizadas por la Secretaría y satisfacer lo señalado en este

Capítulo.

ARTÍCULO 122.- Las investigaciones se diseñarán a modo de evitar al máximo el

sufrimiento de los animales.

ARTÍCULO 123.- Cuando sea necesario sacrificar a un animal de experimentación, se

empleará un procedimiento que asegure en lo posible su muerte sin sufrimiento.

ARTÍCULO 124.- Los bioterios deberán estar de acuerdo con la especie, conformación

corporal, hábitos, preferencias posturales y características locomotoras de los animales,

para proporcionarles comodidad, excepto cuando las variables experimentales justifiquen

otras situaciones.

ARTÍCULO 125.- Los bioterios de producción o mantenimiento crónico serán

supervisados por profesionales calificado y competente en la materia y deberán permitir

el crecimiento, maduración, reproducción y comportamiento normal de los animales, de

conformidad con las normas que la propia institución emita.

ARTÍCULO 126.- El titular de la institución de salud en donde se realice investigación a la

que se refiere este Capítulo, deberá establecer y vigilar el cumplimiento de las medidas

de seguridad para el cuidado y manejo de los animales, así como las medidas de

profilaxis y vacunación necesarias para la protección del personal ocupacionalmente

expuesto.

2.3.3.2. Ley Protectora de Animales del Estado de México

CAPÍTULO QUINTO

DE LOS EXPERIMENTOS CON ANIMALES

Artículo 23.- Para realizar algún experimento con animales los interesados deberán

justificar ante las autoridades correspondientes, que la naturaleza del acto por realizar, es

en beneficio de la investigación científica, y que para ello cuentan con la autorización de

experimentación en animales, que se expidan por la Autoridades Sanitarias del Estado, y

demostrar los siguientes requisitos:

68

a) Que los experimentos no pueden realizarse con otras alternativas;

b) Que son necesarios para el control, prevención y diagnóstico, para el tratamiento de

enfermedades que afecten al hombre y a los animales;

c) Que los animales no pueden ser substituidos por esquemas, dibujos, películas,

fotografías, videocintas o cualquier otro procedimiento análogo.

Al experimentador que no cumpla con algunos de los requisitos anteriores, se le aplicará

la sanción respectiva de acuerdo a lo dispuesto por esta Ley o reglamentos.

Artículo 24.- Los animales que vayan a ser utilizados en experimentos de disección,

deberán previamente ser insensibilizados y al término de la operación, curados y

alimentados en forma debida, si las heridas causadas son considerables o implican

mutilación grave, el animal será sacrificado bajo los medios más adecuados que eviten

sufrimiento.

2.3.3.3. Código de Nuremberg:

“cualquier experimento hecho en seres humanos debe ser diseñado y basado en los

resultados de investigación animal”

2.3.3.4. Declaración de Helsinki

“la investigación médica en sujetos humanos debe estar basada en pruebas de

laboratorio adecuadamente realizadas y en experimentación con animales”

2.3.4. España

2.3.4.1. Ley 29/2006, de 26 de julio, de garantías y uso racional de los

medicamentos y productos sanitarios.

Artículo 13. Garantías de eficacia.

1. La eficacia de los medicamentos para cada una de sus indicaciones deberá

establecerse con base en la realización previa de estudios preclínicos y ensayos clínicos

que se ajustarán a las exigencias normativas y a las que se deriven de los avances en el

conocimiento científico de la materia.

69

2. Los estudios en animales deberán diseñarse y realizarse de forma que permitan

conocer el perfil farmacológico global de la sustancia. En todo caso, se cumplirá la

normativa en materia de protección de animales utilizados para fines científicos.

70

CAPÍTULO III

METODOLOGÍA

3.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN

La presente investigación es de tipo analítica-experimental cuantitativa, preclínica “in

vivo” para la recolección de datos en el laboratorio los mismos que fueron analizados e

interpretados de manera numérica por medio del análisis estadístico.

3.2. POBLACION Y MUESTRA

La población está constituida por 32 ratas Wistar de las cuales se obtuvo la muestra

individual de plasma para la cuantificación del fármaco.

La muestra está constituida por la población en su totalidad, que de manera aleatoria se

dividió en 4 grupos de muestreo de 4 ratas cada uno, es decir, 16 ratas para la

formulación en nanopartículas y 16 ratas para la formulación comercial.

3.3. DISEÑO EXPERIMENTAL

El desarrollo experimental del presente proyecto de investigación se llevó a cabo en tres

etapas:

3.3.1. Primera etapa: Desarrollo del método

Para el desarrollo del método analítico se buscaron condiciones óptimas para la

extracción del analito desde su matriz biológica, en este caso plasma de rata, así como

los mejores resultados en sistema.

3.3.2. Segunda etapa: Validación

Se realizó la validación de la metodología analítica para la cuantificación de Glimepirida

desde su matriz biológica, en este caso plasma de rata por HPLC/UV.

71

3.3.3. Tercera etapa: Aplicación del método desarrollado

Se procedió a la aplicación de la metodología validada en un estudio farmacocinético

preclínico en ratas en el que se realizó la comparación de los parámetros

farmacocinéticos de una formulación de nanopartículas de Glimepirida con una

formulación comercial de Glimepirida mediante un diseño completamente al azar DCA.

3.4. VARIABLES

3.4.1. Independientes

Forma farmacéutica

Tiempo de muestreo

3.4.2. Dependientes

Concentraciones de fármaco en plasma

Constantes farmacocinéticas

3.5. MATERIALES Y MÉTODOS

3.5.1. Materiales, Reactivos e Instrumentos analíticos

a. Materiales

Balones volumétricos de 250 mL, 100 mL, 50 ml y 25 mL

Cofia

Espátulas de acero

Frascos para fase móvil de 500 y 1000 mL

Gradilla

Guantes

Mascarilla

Matraces Erlenmeyer de 250 mL

Micropipeta BRAND 100 – 1000 µL No. Serie 02Z6359

Micropipeta Science MED 1000 – 5000 µL No. Serie DP03854

Cápsulas de pesado

Pipetas Pasteur

Probetas de 25 mL y 1000 mL

Tubos eppendorf de 1 mL

72

b. Reactivos

Acetato de amonio (cristales) J.T Baker

Acetonitrilo HPLC TECNOLAB

Ácido acético glacial J.T Baker

Agua HPLC Milli-Q

Capilares con heparina 75 mm

Duralágrima lubricante ocular ungüento Grin Medicamentos

Estándar de Glimepirida 99 % BH

Estándar de Pioglitazona 98.3 % BH

Éter anhidro J.T Baker

Glimepirida (Comercial) Lote: 1205006212

Heparina 1000 UI/mL PiSA Farmaceútica

Metanol HPLC Tecsiquim

Sistemas especializados de Glimepirida (Nanopartículas) Lote: DFF1303-36

Solución isotónica

Reactivo biológico

Ratas wistar

c. Equipos e Instrumentos

Balanza analítica Sartorius A9

Modelo: A210P

No. Serie: 40040065

Ilustración 11. Balanza analítica Fotografiado por: Wendy Chávez (2013)

73

Sistema HPLC Agilent 1100

i. Detector

Modelo: G1315B

No. Serie: DE11113489

ii. Termostato

Modelo: G1316A


iii. Desgasificador

Modelo: G1322A

No. Serie: JP05030769

iv. Bomba

Modelo: G1311A


v. Sistema de Inyección

Modelo: G1313A


Ilustración 12. Sistema HPLC Fotografiado por: Wendy Chávez (2013)

74

Sonicador BRANSON

Modelo: 3510R-MTH

No. Serie: CPN-952-317R

Ilustración 13. Sistema HPLC Fotografiado por: Wendy Chávez (2013)

Agitador Heidolph

Modelo: Multi reax

No. Serie: 031001361

Ilustración 14. Agitador horizontal Fotografiado por: Wendy Chávez (2013)

Centrifuga EPPENDORF

Modelo: Centrifuge 5416

No. Serie: 5416B01202

Ilustración 15. Centrifuga Fotografiado por: Wendy Chávez (2013)

75

Cámara de CO2

CBIN-UNIPREC-01

Ilustración 16. Cámara de CO2 Fotografiado por: Wendy Chávez (2013)

3.5.2. Preparación de Reactivos

3.5.2.1. Fase móvil ACN:Buffer de acetato de amonio 20 mM pH= 4.5 (50:50)

a. Acetonitrilo

- Colocar 1000 mL de acetonitrilo (ACN) HPLC en un frasco de vidrio para fase

móvil.

- Filtrar al vacio el ACN HPLC por una membrana de nitrocelulosa de 0.45 µm.

- Colocar el ACN HPLC filtrado en el sonicador por 25 minutos.

b. Buffer de acetato de amonio 20 mM pH= 4.5

- Pesar en una cápsula 1.54 g de acetato de amonio

- Disolver en 800 mL de agua desionizada

- Ajustar el pH a 4.5 con ácido acético (1:9)

- Aforar la solución a 1000 mL con agua desionizada

- Filtrar la mezcla al vacío por una membrana de nitrocelulosa de 45 µm.

- Colocar la mezcla filtrada en el ultrasonido por 25 minutos.

76

3.5.2.2. Solución Stock de Glimepirida 1000 µg/mL

- Pesar en una cápsula 0.0100 g de estándar de Glimepririda (GLM)

- Transferir el contenido a un matraz de 10 mL

- Añadir aproximadamente 5 mL de metanol

- Agitar la solución por 5 minutos en vortex

- Colocar la solución en el ultrasonido por 5 minutos

- Aforar la solución con metanol y mezclar hasta disolución.

3.5.2.3. Solución Stock de Glimepirida 100 µg/mL

- Tomar una alícuota de 10 µL de la solución estándar de GLM de 1000 µg/mL

- Trasferir cuantitativamente a un matraz de 10 mL

- Aforar la solución con metanol y mezclar.

3.5.2.4. Solución Stock de Pioglitazona 1000 µg/mL

- Pesar en una cápsula 0.0100 g de estándar de Pioglitazona (PTZ)

- Transferir el contenido a un matraz de 10 mL

- Añadir aproximadamente 5 mL de metanol

- Agitar la solución por 5 minutos en vortex

- Colocar la solución en el ultrasonido por 5 minutos

- Aforar la solución con metanol y mezclar hasta disolución.

3.5.2.5. Solución Stock de Pioglitazona 60 µg/mL

- Tomar una alícuota de 600 µL de la solución estándar de PTZ de 1000 µg/mL.

- Trasferir cuantitativamente a un matraz de 10mL

- Aforar la solución con metanol y mezclar.

77

3.5.2.6. Preparación de soluciones stock para la curva de calibración y puntos de

control

Tabla 6. Preparación de soluciones iniciales y puntos control para la curva

Soluc. Stock GLM

1000µg/mL

(µL)

Soluc. Stock GLM

100µg/mL

(µL)

Aforo

(mL)

Conc. Stock

(µg/mL)

- 400 5.0 8

- 800 5.0 16

- 1200 5.0 24*

- 1600 5.0 32

- 2000 5.0 40

360 5.0 72*

400 5.0 80**

800 5.0 160

1200 5.0 240*

1600 5.0 320

2000 5.0 400

Elaborado por: Wendy Chávez (2014) *Puntos control Bajo, Medio y Alto ** Muestra para estandarización del equipo en sistema

3.5.2.7. Preparación para puntos de curva de calibración y puntos control en

método

Tabla 7. Preparación de puntos para la curva patrón y puntos control.

Conc. Stock

(µg/mL)

Alicuota

(µL)

Aforo

(mL)

Conc. Final

(µg/mL)

8 50 950 0.4

16 50 950 0.8

24 50 950 1.2*

32 50 950 1.6

40 50 950 2.0

72 50 950 3.6*

80 50 950 4.0**

160 50 950 8.0

240 50 950 12.0*

320 50 950 16.0

400 50 950 20.0

Elaborado por: Wendy Chávez (2014) *Puntos control Bajo, Medio y Alto ** Muestra para estandarización del equipo en método

78

3.5.3. Métodos

3.5.3.1. Primera etapa: Desarrollo del método

Para esto se partió de diferentes métodos ya desarrollados que utilizan HPLC y una

detección por UV para la cuantificación de glimepirida, por ejemplo los estudios de Sarita

Kumari Y. et. al. y Milena G et. al. La fase móvil que utilizan son similares tanto en

compuestos como en proporción, al igual que las columnas cromatográficas utilizadas.

(Milena G, 2005) (Kumari, Mishra, & Mishra, 2012)

La primera parte del desarrollo consistió en establecer las mejores condiciones de

separación cromatográfica en sistema (metanol) para lo cual las condiciones iniciales de

prueba se basaron en los trabajos antes mencionados, pero una vez que se realizó las

corridas cromatográficas no se obtuvo los resultados esperados en cuanto a selectividad

del método y resolución de los picos por lo que se realizó varias correcciones con el

objetivo de optimizar las condiciones ya probadas.

Inicialmente se trabajó con la Glibenclamida como estándar interno, como se observa en

los estudios de Milena G et. al., ya que esta sustancia presenta similares características a

la Glimepirida en su estructura y propiedades fisicoquímicas, sin embargo una vez

realizadas las pruebas no se obtuvo resultados adecuados principalmente en cuanto a

selectividad ya que se observó que los picos de Glibenclamida y Glimepirida no se

separaban completamente por lo tanto se dificultaba la integración de los mismos para la

determinación de las áreas respectivas.

Por esta razón se procedió a buscar otro compuesto que cumpla con las características

necesarias tanto en estructura como propiedades fisicoquímicas, respecto de la

Glimepirida, así como para la obtención de buenos resultados de separación

cromatográfica.

De esta manera en base a estudios anteriores realizados por Karthik y col., se realizaron

pruebas usando Pioglitazona como estándar interno obteniéndose muy buenos

resultados se separación en sistema, picos con buena resolución y muy buena

selectividad respecto de la Glimepirida, por lo tanto se estableció a al Pioglitazona como

estándar interno del método analítico.

79

La segunda etapa del desarrollo consistió en establecer las condiciones óptimas para la

cuantificación de Glimepirida en método, es decir, la extracción del analito desde la matriz

biológica que lo contiene y para esto se partió de condiciones reportadas por Milena y

col., que utilizan la extracción líquido-líquido, de esta manera se realizaron las pruebas

respectivas en base a las condiciones descritas pero los resultados no fueron adecuados,

los picos no tuvieron buena resolución y la separación entre el estándar y la muestra se

vio comprometida por lo que fue necesario buscar otro método de extracción.

El método establecido para la extracción fue la precipitación de proteínas, debido a que

tras realizar las pruebas correspondientes se obtuvo buenos resultados de separación y

resolución de los picos así como buen porcentaje de recuperación y selectividad del

método además este método resultó ser más sencillo y con menor tiempo para la

preparación de muestra. Así después de una larga búsqueda se logró obtener una buena

cuantificación y una buena recuperación de glimepirida y del estándar interno, por lo que

se procedió a la validación del método.

Karthik et al., T. Rajesh. et al., reportan en sus estudios con Glimepirida y Pioglitazona

rangos de concentraciones que van de los 20 ng/mL hasta una máxima concentración de

5000 ng/mL. En la mayoría teniendo un límite de cuantificación entre 100-200 ng/mL.

Todo esto, debido a que la concentración máxima plasmática (Cmax) en humanos está

entre 1800 ng/mL hasta 4000 ng/mL, dependiendo del peso de los individuos.

80

Tabla 8. Cuadro indicativo del desarrollo del método analítico.

Parámetros Condiciones iniciales Condiciones modificadas

Fase móvil ACN:Agua acidificada pH=3.3

con ácido acético glacial

ACN:Buffer acetato de

amonio 20 mM pH=4.5

Proporción fase

móvil

70:30

45:55

50:50

55:45

Columna Agilent Eclipse Plus C18

3.0x100 mm 3.5 µm

Agilent Zorbax C18

4.6x150 mm 3.5 mm

Agilent Eclipse XDB C18

4.6x150 mm 5 mm

Precolumna Eclipse XDB C18 4.6x12.5 mm

5 µm

Phenomenex C18

4.0x3.0 mm

Velocidad de flujo 1.5 mL/min

1.0 mL/min

0.5 mL/min

Volumen de

inyección 20 µL

30 µL

50 µL

100 µL


3.5.3.2. Segunda etapa: Validación del método

Se realizó la validación de la metodología analítica para la cuantificación de Glimepirida

en plasma de rata por HPLC/UV, para lo cual se llevaron a cabo los siguientes ensayos:

81

3.5.3.3. Validación del Sistema

3.5.3.3.1. Estandarización del equipo en Sistema

o Procedimiento:

Para realizar esta prueba se debe considerar el punto medio de la curva de calibración y

en base a esto preparar una solución que se inyecta en el equipo por lo menos seis

veces consecutivamente antes de realizar la corrida de una curva de calibración.

Para este caso se determinó una concentración media de la curva de calibración que

corresponde a 4000 ng/mL.

Criterio de aceptación:

Tabla 9. Criterios de aceptación para la estandarización del equipo en sistema

Parámetro Criterio

Repetibilidad (área del analito y su estándar interno) C.V. ≤ 2.0 %

Repetibilidad (tiempo de retención) C.V. ≤ 2.0 %


3.5.3.3.2. Linealidad del Sistema

o Procedimiento:

Se prepara dos curvas de calibración en base a las tablas 6 y 7 utilizando metanol para el

respectivo aforo.

Las curvas se corren en el HPLC el mismo día y se obtiene los cromatogramas para la

tabulación y gráfica de los datos obtenidos contra la concentración utilizada.

Determinar la regresión lineal para cada curva, la relación entre la concentración y la

respuesta, verificando la reproducibilidad y la continuidad a lo largo de todo el periodo de

trabajo.

82

Criterio de Aceptación:

Tabla 10. Criterios de aceptación para la linealidad del sistema

Parámetro Criterio

Coeficiente de correlación r ≥ 0.98


3.5.3.4. Validación el Método

3.5.3.4.1. Selectividad

o Procedimiento:

Se prepara una muestra control de 800 ng/mL, un blanco de plasma y un blanco de

plasma con estándar interno, en base a las tablas 6 y 7 y el Proceso de Extracción.

En un vial se coloca 500 µL de metanol HPLC 100 %, en otro vial se coloca 500 µL de

ACN HPLC 100 % y finalmente en otro vial se coloca 500 µL de Heparina.

Las muestras se inyectan en el HPLC y se observa en las respuestas cromatográficas

obtenidas que no haya interferencia de estas sustancias con la señal obtenida para el

fármaco analizado en su tiempo específico de retención.


Ninguna de las sustancias debe presentar interferencia en el tiempo de retención del

analito de interés. Si hay alguna señal debe ser menor a 20 % de la respuesta obtenida

para la concentración más baja de la curva.

3.5.3.4.2. Linealidad

o Procedimiento:

Se prepara tres curvas de calibración en base a las tablas 6 y 7 utilizando plasma para

los aforos respectivos.

83

Las curvas se corren el HPLC el mismo día y se obtiene los cromatogramas para la

tabulación y gráfica de los datos obtenidos contra la concentración utilizada.

Determinar la regresión lineal para cada curva, la relación entre la concentración y la

respuesta, verificando la reproducibilidad y la continuidad a lo largo de todo el periodo de

trabajo.


Tabla 11. Criterios de aceptación para la linealidad del método

Parámetro Criterio

Coeficiente de correlación r ≥ 0.98

Desviación estándar absoluta

Concentración adicionada vs recuperada

Cada nivel de concentración

Nivel más bajo de concentración

DEA ≤ 15 %

DEA ≤ 20 %


3.5.3.4.3. Límite de Detección

o Procedimiento:

Preparar por quintuplicado una muestra que corresponde a un punto control de

concentración conocida en este caso 400 ng/mL. Preparar una curva de calibración en

base a las tablas 6 y 7 utilizando plasma para los aforos respectivos. La curva se corre el

HPLC y se obtiene los cromatogramas para la tabulación y gráfica de los datos obtenidos

contra la concentración utilizada y después se inyecta las cinco muestras preparadas el

mismo día.

Se calcula el coeficiente de variación, la concentración recuperada y la desviación

estándar relativa a todos los puntos.

84


Los resultados deben cumplir con un coeficiente de variación de menor a 15 %. Si la

desviación estándar relativa de todos los puntos es menor a 20 %, cumple con el

parámetro de exactitud.

3.5.3.4.4. Límite de Cuantificación

o Procedimiento:

Preparar por quintuplicado una muestra de concentración conocida, para este caso se

utiliza como punto control que para este caso será de 800 ng/mL.

Preparar una curva de calibración en base a las tablas 6 y 7 utilizando plasma para los

aforos respectivos.

La curva se corre el HPLC y se obtiene los cromatogramas para la tabulación y gráfica de

los datos obtenidos contra la concentración utilizada y después se inyectan las cinco

muestras preparadas el mismo día.


Los resultados deben cumplir con un coeficiente de variación menor a 15 %. La

desviación estándar relativa de todos los puntos es menor a 20 %, con esto cumple con

el parámetro de exactitud y precisión.

3.5.3.4.5. Recuperación Absoluta

o Procedimiento:

Preparar por triplicado tres puntos control de concentración conocida, en metanol y

plasma, para este caso se utilizan las siguientes concentraciones:

- Punto bajo: 1200 ng/mL

- Punto medio: 3600 ng/mL

- Punto alto: 12000 ng/mL

85

Las muestras preparadas se inyectan en el equipo por triplicado y se obtienen los

cromatogramas respectivos.

Calcular el promedio, la desviación estándar y el coeficiente de variación de la respuesta

obtenida para cada concentración.

Determinar el parámetro mediante la siguiente fórmula:

% 𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑎 =𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑚é𝑡𝑜𝑑𝑜

𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑠𝑖𝑠𝑡𝑒𝑚𝑎𝑥100


La diferencia de recuperación entre los tres niveles de concentración, no debe ser mayor

a 15 %.

La recuperación no necesariamente debe ser de un 100 % pero si preciso para cada

concentración.

3.5.3.4.6. Precisión

o Procedimiento:

Este parámetro está relacionado con la dispersión de las medidas alrededor de un valor,

corresponde al valor de concordancia entre diferentes ensayos.

La precisión se evalúa con la repetibilidad y reproducibilidad intralaboratorio.

3.5.3.4.6.1. Repetibilidad

o Procedimiento:

Preparar en un mismo día una curva de calibración y tres puntos control (alto, medio y

bajo), los cuales se inyectan por quintuplicado, todas las muestras se analizan en una

misma corrida analítica.

Calcular la concentración recuperada en cada nivel de concentración, interpolando los

datos obtenidos para los puntos control.

86

Calcular el promedio, la desviación estándar y el coeficiente de variación en cada una de

las concentraciones analizadas.


El método es repetible si el coeficiente de correlación para cada una de las tres

concentraciones no es mayor a 15 %.

3.5.3.4.6.2. Reproducibilidad

o Procedimiento:

Preparar una curva de calibración y tres puntos control (alto, medio y bajo), los cuales se

inyectan por triplicado, durante tres días.

Calcular la concentración recuperada y tabular los resultados obtenidos para cada uno de

los puntos control.

Determinar el promedio, la desviación estándar y el coeficiente de variación en cada una

de las concentraciones analizadas.


El método es reproducible si el coeficiente de variación para cada concentración no es

mayor a 15 %.

3.5.3.4.7. Exactitud

o Procedimiento:

Con los datos obtenidos de repetibilidad y reproducibilidad, se calcula el porcentaje de la

desviación absoluta de por lo menos seis datos para cada nivel de concentración.

Determinar el parámetro con la siguiente fórmula:

% 𝐷𝑒𝑠𝑣𝑖𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑎 =𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑛𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎𝑙 − 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜

𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑛𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎𝑙𝑥100

87


El método es exacto si el porcentaje de la desviación absoluta para cada concentración

no es mayor al 15 %.

3.5.3.4.8. Estabilidad

3.5.3.4.8.1. Estabilidad a t = 0

o Procedimiento:

Preparar tres muestras correspondientes a los puntos de control (alto, medio y bajo), de

cada muestra tomar un volumen determinado e inyectar por quintuplicado en el equipo

para realizar el primer análisis que corresponde a t=0.

Se toma un volumen de aproximadamente 1 mL de cada muestra y se almacena por 24

horas en refrigeración (2-3 °C), otro volumen igual de cada muestra se almacena por 24

horas a temperatura ambiente y por último un tercer volumen igual de cada muestra se

somete a congelación durante 15 días (este último se descongela a la semana y se

vuelve a congelar para posteriormente descongelar para su análisis respectivo una vez

que se ha cumplido el tiempo establecido).

El día del análisis se prepara una curva de calibración y los puntos de control respectivos

por triplicado.

3.5.3.4.8.2. Estabilidad en muestras de refrigeración a las 24 horas

o Procedimiento:

Preparar puntos control (alto, medio y bajo) por triplicado y analizar a tiempo cero, otra

serie de muestras procesarlas hasta antes de la reconstitución y almacenarlas en

refrigeración por 24 horas.

El día del análisis preparar por triplicado puntos control y una curva de calibración.

Calcular la concentración recuperada interpolando los valores en la curva de calibración,

calcular la % DEA y comparar con los resultados obtenidos a tiempo cero

88

3.5.3.4.8.3. Estabilidad de la muestra a temperatura ambiente

o Procedimiento:

Preparar puntos control (alto, medio y bajo) por triplicado y analizar a tiempo cero, otra

serie de muestras procesarlas hasta antes de la reconstitución y almacenarlas a

temperatura ambiente por 24 horas.

El día del análisis preparar por triplicado puntos control y una curva de calibración.

Calcular la concentración recuperada interpolando los valores en la curva de calibración,

calcular la % DEA y comparar con los resultados obtenidos a tiempo cero.

Para todas las pruebas de estabilidad se utilizó la siguiente fórmula para determinar la

desviación absoluta y el mismo criterio de aceptación.




Tabla 12. Criterios de aceptación para estabilidad a tiempo cero

Parámetro Criterio

Cumple criterio de precisión CV ˂ 15 %

Valor de la desviación estándar absoluta DEA ˂ 15 %


89

3.5.3.4.9. Tolerancia

o Procedimiento:

Preparar por triplicado un punto control en este caso medio (3600 ng/mL) y preparar una

curva de calibración en base a las tablas 3.3-1 y 3.3-2 utilizando plasma para los aforos

respectivos.

Se debe modificar la composición de la fase móvil en un 5% obteniendo de esta manera

dos condiciones de trabajo a las que se someterán las muestras:

a) 58 % ACN : 42 % Buffer de acetatos

b) 52 % ACN : 58 % Buffer de acetatos

En un mismo día se analiza en el HPLC por triplicado el punto control preparado y una

curva de calibración a cada una de las condiciones establecidas y se obtiene los

cromatogramas respectivos.

Criterio de aceptación

Tabla 13. Criterios de aceptación para la tolerancia del método

Parámetro Criterio

Cumple criterio de precisión CV ˂ 15 %

Valor de la desviación estándar absoluta DEA ˂ 15 %




90

3.5.3.5. Tercera etapa: Aplicación de la metodología

La metodología validada se aplicó en un estudio farmacocinético preclínico en ratas en el

que se realizó la comparación estadística de los parámetros farmacocinéticos de Cmáx,

Tmáx, AUC, constante de eliminación (Kel), constante de absorción (Ka), y tiempo medio

de eliminación (t ½ e) de la formulación de Glimepirida en nanopartículas con los

parámetros obtenidos para la formulación comercial de Glimepirida.

3.5.3.5.1. Condiciones experimentales

Tabla 14. Tratamiento del animal y condiciones experimentales

Tratamientos

Condiciones

experimentales

Glimepirida en

Nanopartículas

Glimepirida

comercial

Especie Rata Rata

Variedad Wistar Wistar

Peso 250-300 g 250-300 g

n = 16 16

Dosis 4 mg/kg 4 mg/kg

Vía Administración intramuscular intramuscular

Alimento y agua ad libitum ad libitum


Los cuidados de los animales cumplirán con las guías de NIH Guide for Care and Use of

Laboratory Animals.

3.5.3.5.2. Toma de muestras

La toma de muestras se realizó en base a los periodos de muestreo establecidos

considerando que el estudio se llevó a cabo en dos días, así para la formulación

comercial el primer día se muestreo las ratas de la 1 a la 8 y el segundo día las ratas de

la 9 a la 16, del mismo modo para la formulación en nanopartículas el primer día se

realizó el muestreo de las ratas de la 9 a la 16 y el segundo día las ratas de la 1 a la 8, de

esta manera se obtuvo 4 datos para cada tiempo de muestreo.

91

Tabla 15. Periodo de muestreo tras la administración de nanopartículas de Glimepirida.

Tiempos de toma de

muestras (min)

Cantidad

de muestra

GR

UP

O N

1

Rata 1

(R1N) 0 ; 60 ; 240 ; 1440 0,5 ml

Rata 2

(R2N) 0 ; 60 ; 240 ; 1440 0,5 ml

Rata 9

(R9N) 0 ; 60 ; 240 ; 1440 0,5 ml

Rata 10

(R10N) 0 ; 60 ; 240 ; 1440 0,5 ml

GR

UP

O N

2

Rata 3

(R3N) 0 ; 120 ; 480 ; 720 0,5 ml

Rata 4

(R4N) 0 ; 120 ; 480 ; 720 0,5 ml

Rata 11

(R11N) 0 ; 120 ; 480 ; 720 0,5 ml

Rata 12

(R12N) 0 ; 120 ; 480 ; 720 0,5 ml

GR

UP

O N

3

Rata 5

(R5N) 15 ; 180 ; 360 ; 540 0,5 ml

Rata 6

(R6N) 15 ; 180 ; 360 ; 540 0,5 ml

Rata 13

(R13N) 15 ; 180 ; 360 ; 540 0,5 ml

Rata 14

(R14N) 15 ; 180 ; 360 ; 540 0,5 ml

GR

UP

O N

4

Rata 7

(R7N) 30 ; 300 ; 420 ; 660 0,5 ml

Rata 8

(R8N) 30 ; 300 ; 420 ; 660 0,5 ml

Rata 15

(R15N) 30 ; 300 ; 420 ; 660 0,5 ml

Rata 16

(R16N) 30 ; 300 ; 420 ; 660 0,5 ml


92

Tabla 16. Periodo de muestreo tras la administración de Glimepirida comercial.

Tiempos de toma de

muestras (min)

Cantidad de

muestra

GR

UP

O C

1

Rata 1

(R1C) 0 ; 60 ; 240 ; 1440 0,5 ml

Rata 2

(R2C) 0 ; 60 ; 240 ; 1440 0,5 ml

Rata 9

(R9C) 0 ; 60 ; 240 ; 1440 0,5 ml

Rata 10

(R10C) 0 ; 60 ; 240 ; 1440 0,5 ml

GR

UP

O C

2

Rata 3

(R3C) 0 ; 120 ; 480 ; 720 0,5 ml

Rata 4

(R4C) 0 ; 120 ; 480 ; 720 0,5 ml

Rata 11

(R11C) 0 ; 120 ; 480 ; 720 0,5 ml

Rata 12

(R12C) 0 ; 120 ; 480 ; 720 0,5 ml

GR

UP

O C

3

Rata 5

(R5C) 15 ; 180 ; 360 ; 540 0,5 ml

Rata 6

(R6C) 15 ; 180 ; 360 ; 540 0,5 ml

Rata 13

(R13C) 15 ; 180 ; 360 ; 540 0,5 ml

Rata 14

(R14C) 15 ; 180 ; 360 ; 540 0,5 ml

GR

UP

O C

4

Rata 7

(R7C) 30 ; 300 ; 420 ; 660 0,5 ml

Rata 8

(R8C) 30 ; 300 ; 420 ; 660 0,5 ml

Rata 15

(R15C) 30 ; 300 ; 420 ; 660 0,5 ml

Rata 16

(R16C) 30 ; 300 ; 420 ; 660 0,5 ml


93

3.5.3.5.3. Administración de fármaco

Se preparó una solución de Glimepirida comercial de 1,7 mg/mL y una solución de

nanopartículas de Glimepirida de 2,5 mg/mL, en ambos casos se disolvió las sustancias

en solución isotónica, se agitó por 10 minutos en vortex y se mantuvo en refrigeración

hasta el momento de la administración.

Las ratas previamente colocadas en las jaulas metabólicas desde el día anterior, se

pesaron para realizar el cálculo de volumen de las soluciones de fármaco a administrar

en base a una dosis de 4 mg/kg de peso.

Ilustración 17. Toma de pesos de las ratas. Fotografiado por: Wendy Chávez (2013)

Para cada rata se realizó el cálculo de la dosis individual en base a su peso obteniéndose

la siguiente tabla de datos:

94

Tabla 17. Peso, dosis individual y volumen a administrar de Glimepirida comercial

GLM COMERCIAL

RATA PESO (g) Dosis (mg) VOLUMEN

(mL)

1C 284,6 1,1 0,7

2C 265,5 1,1 0,6

3C 264,2 1,1 0,6

4C 263,6 1,1 0,6

5C 253,2 1,0 0,6

6C 253,1 1,0 0,6

7C 251,3 1,0 0,6

8C 255,7 1,0 0,6

9C 325,8 1,3 0,8

10C 302,7 1,2 0,7

11C 294,3 1,2 0,7

12C 292,2 1,2 0,7

13C 270,7 1,1 0,6

14C 272,1 1,1 0,7

15C 270,0 1,1 0,6

16C 265,6 1,1 0,6


Tabla 18. Peso, dosis y volumen a administrar de nanopartículas de Glimepirida

GLM NANOPARTICULAS

RATA PESO (g) Dosis (mg) VOLUMEN

(mL)

1C 327,3 1,3 0,5

2C 378,6 1,5 0,6

3C 298,8 1,2 0,5

4C 302,9 1,2 0,5

5C 298,1 1,2 0,5

6C 297,3 1,2 0,5

7C 282,4 1,1 0,5

8C 290,2 1,2 0,5

9C 260,0 1,0 0,4

10C 270,0 1,1 0,4

11C 263,1 1,1 0,4

12C 263,3 1,1 0,4

13C 261,1 1,0 0,4

14C 261,5 1,0 0,4

15C 256,2 1,0 0,4

16C 254,7 1,0 0,4


95

Una vez que las ratas fueron pesadas y agrupadas en parejas considerando la

homogeneidad de pesos se colocó el número de identificación en la cola y se realizó la

administración de las soluciones de Glimepirida comercial y nanopartículas de

Glimepirida respectivamente por vía intramuscular.

Ilustración 18. Administración intramuscular en rata Fotografiado por: Wendy Chávez (2013)

3.5.3.5.4. Obtención de muestras

La muestra de sangre se extrajo del seno retro-orbital de la rata y se colectó en un tubo

eppendorf con heparina debidamente rotulado, el procedimiento fue el siguiente:

a. En un recipiente con cierre hermético se coloca una cama de algodón y luego se

añade 4 mL de éter etílico (mantener correctamente cerrado el recipiente).

b. Se coloca la rata en el interior del recipiente y se cierra de manera adecuada para

evitar fugas de éter.

c. Una vez que la rata no presenta movimientos reflejos es retirada del recipiente y

se coloca sobre la mesa de manera lateral.

d. Con un capilar heparinizado se procede a la obtención de la muestra sanguínea

colocando este de manera suave pero firme en el canto medial de la órbita ocular

de la rata y con movimientos lentos y rotativos avanzar con el capilar hacia la

parte dorsal hasta que la sangre empiece a fluir a través del mismo, como se

observa en la siguiente ilustración:

Ilustración 19. Obtención de muestra sanguínea del seno retro orbital de la rata Fotografiado por: Wendy Chávez (2013)

96

e. Colectar en el tubo eppendorf un volumen de 0.5 mL, homogenizar con la

heparina y tapar correctamente.

f. Retirar el capilar y con una torunda de algodón hacer presión sobre el ojo para

detener la salida de sangre, finalmente aplicar el lubricante ocular y colocar a la

rata en la jaula para su recuperación.

3.5.3.5.5. Tratamiento de las muestras:

Centrifugar la muestra durante 15 minutos, separar cuidadosamente el plasma

con una pipeta Pasteur y colocarlo en otro tubo eppendorf debidamente rotulado.

Mantener las muestras en congelación a -23 °C hasta el día del análisis.

Las muestras se analizaron según el método validado por HPLC con detector UV.

3.5.3.5.6. Método de extracción por precipitación de proteínas

Preparación de puntos para curva de calibración y puntos control en método.

Tabla 19. Preparación de las muestras de la curva patrón y puntos control en plasma.

Conc. Final

(ng/mL)

Alicuota

(µL)

S.I. 3 µg/mL

(µL)

ACN

(µL)

Aforo

(mL)

400 100 20 280 400

800 100 20 280 400

1200* 100 20 280 400

1600 100 20 280 400

2000 100 20 280 400

3600* 100 20 280 400

4000** 100 20 280 400

8000 100 20 280 400

12000* 100 20 280 400

16000 100 20 280 400

20000 100 20 280 400

Elaborado por: Wendy Chávez (2015) *Puntos control Bajo, Medio y Alto ** Muestra para estandarización del equipo en sistema *** S.I.: Estándar interno Pioglitazona

97

Tomar 100 µL de muestra (plasma) y colocar en un tubo eppendorf debidamente

rotulado.

Agregar 20 µL de estándar interno (Pioglitazona).

Añadir 280 µL de Acetonitrilo ACN

Colocar 2 gotas de solución al 10 % de ZnSO4

Agitar en el vortex horizontal durante 60 segundos a nivel 10.

Centrifugar a 10000 rpm durante 10 minutos y posteriormente decantar el

sobrenadante.

Colocar el sobrenadante en tubo para muestra, tapar y colocar en el equipo

Inyectar un volumen de 50 µL para el análisis cromatográfico.

3.5.3.5.7. Estructura del DCA

En el presente estudio se utilizó un diseño de bloques completamente al azar (DCA)

considerando 2 tratamientos (dosis de nanopartículas de Glimepirida y dosis de

medicamento comercial de Glimepirida), utilizando 16 ratas para cada formulación

divididas en 4 grupos de manera aleatoria según las horas de toma de muestra. Ver

Anexo 1 y 2.

A continuación se determinó los puntos de la gráfica Concentración vs Tiempo para cada

forma farmacéutica combinando el tiempo con la media de las dos repeticiones

correspondientes.

Donde:

TN(t): TN es la dosis de 4 mg de nanopartículas de Glimepirida a los diferentes

intervalos de toma de muestra y t es el tiempo asignado en minutos.

XN(t): XN es la media de las concentraciones plasmáticas de nanopartículas de

Glimepirida de cada uno de los grupos de muestreo para este tratamiento.

TC(t): TC es la dosis de 4 mg de Glimepirida comercial a los diferentes intervalos de

toma de muestra y t es el tiempo asignado en minutos.

XC(t): XC es la media de las concentraciones plasmáticas de Glimepirida comercial de

cada uno de los grupos de muestreo para este tratamiento.

98

Tabla 20. Puntos de la gráfica Conc. vs Tiempo para la GLM en nanopartículas

Tiempo min

(x)

XN

(y)

0 TN0XN1

15 TN15XN2

30 TN30XN3

60 TN60XN4

120 TN120XN5

180 TN180XN6

240 TN240XN7

300 TN300XN8

360 TN360XN9

420 TN420XN10

480 TN480XN11

540 TN540XN12

660 TN660XN13

720 TN720XN14

1440 TN1440XN15


Tabla 21. Puntos de la gráfica Conc. vs Tiempo para la GLM comercial

Tiempo min

(x)

XC

(y)

0 TC0XC1

15 TC15XC2

30 TC30XC3

60 TC60XC4

120 TC120XC5

180 TC180XC6

240 TC240XC7

300 TC300XC8

360 TC360XC9

420 TC420XC10

480 TC480XC11

540 TC540XC12

660 TC660XC13

720 TC720XC14

1440 TC1440XC15


99

Nota: El tiempo se grafica en el eje X y la media de la concentración de las dos

repeticiones en el eje Y.

3.5.3.5.8. Determinación del orden de reacción

Posteriormente se determina el orden de la reacción para lo cual se realiza la regresión

lineal de los datos considerando 3 posibilidades y se grafica de la siguiente manera:

Orden 0: Concentración vs tiempo

Orden 1: ln Concentración vs tiempo

Orden 2: 1 / Concentración vs tiempo

Para la determinación del orden de reacción se toma como criterio de aceptación el

coeficiente de correlación cuyo valor sea el más cercano a la unidad.

3.5.3.5.9. Cálculo de las constantes farmacocinéticas

Para el cálculo de las constantes farmacocinéticas se usaron las siguientes ecuaciones:

Tiempo medio de eliminación

t ½ e =0,693

Ke

Ecuación 3. Tiempo medio de eliminación

Tiempo máximo t máx

𝑡𝑚á𝑥 =2,303

Ka− Ke𝑙𝑜𝑔

𝐾𝑎

𝐾𝑒

Ecuación 4. Tiempo máximo

Concentración máxima C máx

𝐶𝑚á𝑥 = Co𝐾𝑎

Ka−Ke(

𝑒−𝐾𝑒(𝑡𝑚á𝑥)

1−𝑒−𝐾𝑒𝜏−

𝑒−𝐾𝑎(𝑡𝑚á𝑥)

1−𝑒−𝐾𝑎𝜏)

Ecuación 5. Concentración máxima

100

Área bajo la curva (AUC)

El cálculo del área total bajo la curva de nivel plasmático resulta de la suma de dos áreas,

el área bajo el segmento A-B-C de la curva y el área que comprende el segmento C-D,

como se observa en la siguiente figura:

Ilustración 20. Curva de nivel plasmático. Fase de absorción A-B-C. Fase de eliminación C-D.


- Cálculo del Área del segmento A-B-C

Ilustración 21. Curva de nivel plasmático segmentada por trapecios Fuente:http://sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/cide02/capitulo02/09a.html

101

Para el cálculo del área consideramos a la curva como un conjunto de trapecios como se

observa en la ilustración 21, de los cuales calculamos el área individual utilizando la

siguiente fórmula:

𝐀𝐫𝐞𝐚 𝐝𝐞𝐥 𝐭𝐫𝐚𝐩𝐞𝐜𝐢𝐨 =𝐲𝟏 + 𝐲𝟐

𝟐(∆𝐱)

Ecuación 6. Área de un trapecio

El área total del segmento ABC es el resultado de la sumatoria de las áreas individuales

de los trapecios comprendidos entre los tres puntos que delimitan este segmento.

- Cálculo del Área del segmento C-D

Para el cálculo del área de este segmento consideramos a la curva como administración

intravenosa I.V, para lo cual aplicamos el Método de Dost con la siguiente ecuación:

(Aguilar A., 2008)

𝐴𝑟𝑒𝑎 𝐶𝐷 =𝐶𝑜

Ke

Ecuación 7. Ecuación de Dost

Donde:

Co = Valor de concentración del punto C

Ke = Constante de eliminación

102

CAPÍTULO IV

ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

4.1. DESARROLLO DEL MÉTODO ANALÍTICO

La obtención de las condiciones cromatográficas adecuadas se realizó en base a dos

artículos científicos S. Kumari et. al 2012 y Milena G. et. al 2005, sin embargo los picos

obtenidos no tenían buena resolución por lo que se realizó una modificación en la

proporción de la fase móvil considerando un tercer artículo científico Karthik A., et. al,

2008, hasta que finalmente se obtuvo la resolución adecuada.

Posteriormente se detectó un segundo problema con la cuantificación de Glimepirida ya

que a pesar de que las muestras se preparaban de manera adecuada, los resultados

obtenidos de concentración no eran los correctos por lo que en base a los artículos

consultados, en los que se indicaba que para obtener el área y altura adecuadas para los

picos era necesaria la inyección de mayor volumen de muestra, se probaron tres

volúmenes de inyección hasta que se obtuvo el resultado óptimo de concentración,

además se realizaron varias pruebas con la columna y la velocidad de flujo para la

determinación del mejor tiempo de retención de analito de interés.

Para el desarrollo del método se dividió el estudio en dos fases, inicialmente se debió

establecer las condiciones cromatográficas ideales para el método y la segunda fase

consistió en obtener las condiciones óptimas para la extracción del analito desde su

matriz biológica, para esto lo primero que se estableció fue el compuesto que se utilizó

como estándar interno.

a. Prueba de condiciones cromatográficas para la cuantificación de glimepirida.

Ilustración 22. Glimepirida (10 µg/mL) en metanol.

Glimepirida

103

En este cromatograma se muestra una prueba realizada para determinar el tiempo de

retención de la Glimepirida que es el analito de interés, obteniendo un resultado de 5.7 a

partir de lo cual podemos determinar si existe interferencia con la sustancia que será

utilizada como estándar interno.

b. Prueba de condiciones cromatográficas que pudieran separar las señales y

mejorar la cuantificación de ambos analitos.

Ilustración 23. Glimepirida con Glibenclamida como estándar interno (1 µg/mL).

En base la información obtenida de varios artículos la primera opción a considerar para

estándar interno fue la Glibenclamida debido a sus características similares con el analito

de interés, es decir, la Glimepirida, sin embargo no se obtuvo las características

adecuadas de altura y resolución de los picos, en este cromatograma podemos observar

que no se obtuvieron condiciones para separar y tener buena resolución en las

respuestas de los compuestos, por lo que se probó con otra sustancia

c. Identificación del tiempo de retención del estándar interno Pioglitazona a las

condiciones cromatográficas desarrolladas hasta ese momento.

Ilustración 24. Cromatograma de pioglitazona (3 µg/mL) como estándar interno en metanol.

Glibenclamida

Glimepirida

Pioglitazona

104

La Pioglitazona es un hipoglicemiante de características estructurales y fisicoquímicas

similares a la Glimepirida por lo que fue una excelente opción a usar como estándar

interno, dando resultados adecuados de tiempo de retención, altura y resolución del pico,

lo que permite una buena cuantificación tanto del analito como del estándar interno.

d. Para probar el nuevo estándar interno se analizó a altas concentraciones y

posteriormente se ajustó la concentración.

Ilustración 25. Cromatograma muestra Glimepirida con Pioglitazona como estándar interno

(Concentraciones: 12 µg/mL PGZ, 1 µg/mL GLM).

Las pruebas con el nuevo estándar interno Pioglitazona fueron buenas ya que como se

puede observar en la Ilustración 25 el tiempo de retención es de 3.6 minutos lo cual no

interfiere con el tiempo de retención de la Glimepirida, además se observa una

separación adecuada entre las dos sustancias y el ruido generado por el plasma de rata

no afecta los tiempos de retención de las mismas, en base a estos resultados se decide

trabajar con la Pioglitazona como estándar interno para el método.

Para la determinación del método de extracción se probó dos opciones: extracción

líquido-líquido para la que se usaron dos solventes, éter etílico al 100 % y una mezcla de

éter etílico y diclorometano (70:30),

e. Se utilizó la mezcla éter:diclorometano para el proceso de extracción líquido-

líquido

Pioglitazona

Glimepirida

105

Ilustración 26. Glimepirida con Pioglitazona (Concentraciones: 12 µg/mL PGZ, 1 µg/mL GLM).

Extracción éter:diclorometano (70:30).

Como se puede observar en el cromatograma con este método no se obtuvo buenos

resultados de resolución y separación de los picos por lo que se realizó una serie de

modificaciones como aumento del tiempo de agitación, evaporación con nitrógeno,

congelación de las muestras a -70°C antes de la evaporación, pero aun así no se logró

resultados óptimos, ya que el estándar interno no logró ser cuantificado, por lo que se

realizó una prueba con otro solvente.

f. La cuantificación de Glimepirida con el método de extracción éter 100 % fue

buena, sin embargo la cuantificación de Pioglitazona no dio buenos resultados.

Ilustración 27. Glimepirida con Pioglitazona (Concentraciones: 3 µg/mL PGZ, 1 µg/mL GLM).

Extracción con éter (100 %).

Pioglitazona

Pioglitazona

Glimepirida

Glimepirida

106

En el cromatograma se puede observar que la resolución del pico de Glimepirida mejora

con respecto al cromatograma anterior sin embargo, el área y altura no son óptimas,

además la Pioglitazona sigue causando dificultad para su cuantificación.

g. Finalmente se probó la extracción por el método de precipitación de proteínas con

ACN, obteniéndose buenos resultados de separación y resolución de las señales

cromatográficas para la GLM y la PGZ.

Ilustración 28. Glimepirida con Pioglitazona (Concentraciones: 3 µg/mL PGZ, 1 µg/mL GLM). Extracción por precipitación de proteínas con ACN.

Tiempo de retención PGZ: 3.6 minutos. Tiempo de retención GLM: 5.7 minutos.

El cromatograma muestra la segunda prueba realizada para la extracción que es la

precipitación de proteínas, para lo cual se utilizó inicialmente el metanol como disolvente

considerando que las muestras se prepararon en dicho disolvente, sin embargo la

precipitación no fue adecuada y los picos no tuvieron buena resolución por lo que se optó

por usar como disolvente el acetonitrilo.

La extracción resultante fue bastante satisfactoria sin embargo la recuperación promedio

fue menor a 50 % por lo que se utilizó Sulfato de Zinc para mejorar la precipitación de las

proteínas y de esta manera mejoró la resolución de los picos y la recuperación aumentó a

valores por encima de 80 %.

Una vez determinado el estándar interno y el método de extracción se procedió a realizar

las pruebas para establecer el tiempo de agitación adecuado para las muestras, para lo

cual se probaron 3 tiempos: 30, 60 y 90 segundos; no se observó una diferencia

altamente significativa sin embargo se determinó que el mejor tiempo de agitación es 60

Pioglitazona

Glimepirida

107

segundos con lo cual se obtienen picos con mejor altura que a 30 segundos y se optimiza

el proceso en términos de reducción de tiempo con relación a los 90 segundos.

De este cromatograma se partió para corregir detalles en las condiciones

cromatográficas y de extracción y obtener la resolución adecuada.

4.1.1. Condiciones cromatográficas

Las condiciones cromatográficas finales que se utilizaron para la validación del método

analítico y su aplicación fueron las siguientes:

Tabla 22. Condiciones cromatográficas finales determinadas para el método analítico.

Parámetro Condición

Fase móvil ACN:Buffer acetato de amonio 20 mM pH=4.5

(55:45)

Columna cromatográfica Agilent Eclipse XDB C18 4.6x150 mm

Precolumna Phenomenex C18 4.0x3.0 mm

Temperatura 40 °C

Velocidad de flujo 1.0 mL/min

Volumen de inyección 50 µL

Longitud de onda 230 nm

Tiempo de retención Pioglitazona 3.7 minutos

Tiempo de retención Glimepirida 5.7 minutos


Ilustración 29. Cromatograma de muestra a las condiciones cromatográficas finales


108

4.2. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO

4.2.1. Estandarización del equipo en sistema

Tabla 23. Resultados de la estandarización del equipo en sistema

Datos Pioglitazona Glimepirida

(400 ng/mL)

Relación

de áreas

Área T.

Retención Área

T.

Retención

1 304,50 3,696 109,50 5,737 0,3596

2 305,90 3,697 108,90 5,734 0,3560

3 306,50 3,635 109,20 5,731 0,3563

4 307,10 3,695 109,52 5,728 0,3566

5 306,40 3,688 106,20 5,721 0,3466

Promedio 306,0800 3,6822 108,6640 5,7302 0,3550

Desv. Est. 0,9808 0,0266 1,4005 0,0061 0,0049

% C.V. 0,3 0,7 1,3 0,1 1,4


4.2.2. Linealidad del sistema

Ilustración 30. Linealidad del sistema. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)

y = 0,0001x - 0,0299r² = 0,9997

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 5000 10000 15000 20000 25000

Re

laci

ón

de

Áre

as

Concentración (ng/mL)

Linealidad del Sistema

109

La estandarización del equipo en sistema es un parámetro que se analiza para cada

inyección o corrida de muestras con el objetivo de asegurar que el equipo funciona de

manera adecuada y bajo las mismas condiciones arrojando resultados similares durante

todo el estudio, en la tabla 26 podemos observar los resultados para esta prueba, donde

el CV no fue mayor al 2 % durante todo el estudio por lo que al igual que en la curva de

calibración para este parámetro con un coeficiente de correlación de 0,9997 cumple con

el criterio de aceptación establecido por la farmacopea.

En consecuencia a partir de estos criterios se establece que el sistema es lineal y preciso

en un rango de 800 ng/mL a 20000 ng/mL.

4.2.3. Selectividad del método

Para establecer la selectividad del método se consideraron todas las sustancias que se

utilizan como reactivos para la extracción del fármaco desde su matriz biológica (plasma),

los componentes de la fase móvil así como las sustancias necesarias para la

conservación de las muestras y extracción de muestras sanguíneas.

Una vez que se obtuvieron los cromatogramas respectivos se observa que ninguna de las

sustancias anteriores presenta interferencia en el tiempo de retención de los analitos de

interés.

a. Blanco de Plasma

Ilustración 31. Selectividad del método. Blanco de plasma.

110

b. Blanco de plasma con estándar interno (Pioglitazona)

Ilustración 32. Selectividad del método. Blanco de plasma con PGZ.

c. Fase Movil

Ilustración 33. Selectividad del método. Fase móvil.

d. Metanol

Ilustración 34. Selectividad del método. Metanol.

111

e. Sulfato de Zinc

Ilustración 35. Selectividad del método. Sulfato de zinc.

f. Heparina

Ilustración 36. Selectividad del método. Heparina.

g. Estándar interno (Pioglitazona) en metanol

Ilustración 37. Selectividad del método. S.I. Pioglitazona.

112

h. Glimepirida en metanol

Ilustración 38. Selectividad del método. Glimepirida.

i. Muestra de 4000 ng/mL

Ilustración 39. Selectividad del método. Muestra de 800 ng/mL GLM + PGZ.

En los cromatogramas comprendidos entre la Ilustración 30 a la 38, se puede observar

que no existe interferencia entre los tiempos de retención de todas estas sustancias con

los analitos de interés como son la Pioglitazona y la Glimepirida, además no existe

interferencia a causa del ruido generado por las muestras de blanco de plasma y plasma

hemolizado, ya que a pesar de que existen pequeñas señales debido al plasma y a la

fase móvil, estas no superan el 20 % de respuesta por lo que la extracción y

cuantificación no se ven afectadas.

A partir de esto se establece que el método desarrollado es selectivo para los analitos de

interés.

113

4.2.4. Linealidad del método


Relación de áreas

400 0,03434

800 0,06914

1600 0,14732

2000 0,17374

4000 0,41743

8000 0,86140

16000 1,75240

20000 2,22785

m = 0,0001

b = 0,0299

r = 0,99999

r2 = 0,999976

Ilustración 40. Resultados de linealidad del método. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)

En la gráfica de linealidad del método podemos observar un coeficiente correlación de

0,999976 por lo que cumple con el criterio de aceptación y podemos establecer que el

método desarrollado para la cuantificación de Glimepirida en plasma de rata es lineal y

preciso en el rango de 400 ng/mL a 20000 ng/mL.

y = 0.0001x + 0.0299R² = 0.999976

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 5000 10000 15000 20000 25000

Re

laci

ón

de

Áre

as


Linealidad del Método

114

4.2.5. Precisión

4.2.5.1. Repetibilidad

Para la prueba de Repetibilidad se realizó el análisis por quintuplicado de los tres puntos

control bajo 1200 ng/mL, medio 3600 ng/mL y alto 12000 ng/mL obteniéndose los

siguientes resultados:

Punto control bajo 1200 ng/mL

Tabla 24. Repetibilidad del método punto control bajo.


Relación de áreas

Concentración recuperada

(ng/mL)

1200 0,1685 1235,8

1200 0,1763 1305,7

1200 0,1845 1351,1

1200 0,1738 1282,4

1200 0,1701 1249,2

Promedio 1284,7

Desv. Est. 46,0

% C.V. 3,6


Punto control medio 3600 ng/mL

Tabla 25. Repetibilidad del método punto control medio.


Relación de áreas


(ng/mL)

3600 0,4616 3848,2

3600 0,4334 3596,8

3600 0,3990 3290,1

3600 0,4199 3476,4

3600 0,3975 3276,8

Promedio 3497,7

Desv. Est. 237,2

% C.V. 6,8


115

Punto control alto 12000 ng/mL

Tabla 26. Repetibilidad del método punto control alto.

Concentración

(ng/mL)

Relación

de áreas

Concentración

recuperada

(ng/mL)

12000 1,4650 12792,9

12000 1,5043 13143,3

12000 1,7263 15122,3

12000 1,4706 12842,9

12000 1,4913 13027,4

Promedio 13385,8

Desv. Est. 980,9

% C.V. 7,3


En los tres casos podemos observar que el CV no supera el 15 % por lo tanto cumple con

el criterio de aceptación establecido y podemos determinar que el método desarrollado es

repetible a las condiciones de estudio.

4.2.5.2. Reproducibilidad

Día 1


Tabla 27. Reproducibilidad del método punto control bajo, día 1.

Concentración

(ng/mL)

Relación

de áreas

Concentración

recuperada

(ng/mL)

1200 0,1685 1235,8

1200 0,1763 1305,2

1200 0,1845 1377,8

Promedio 1306,3

Desv. Est. 71,0

% C.V. 5,4


116


Tabla 28. Reproducibilidad del método punto control medio, día 1.

Concentración

(ng/mL)

Relación

de áreas

Concentración

recuperada

(ng/mL)

3600 0,4616 3848,2

3600 0,4334 3596,8

3600 0,3990 3290,1

Promedio 3578,4

Desv. Est. 279,5

% C.V. 7,8



Tabla 29. Reproducibilidad del método punto control alto, día 1.

Concentración

(ng/mL)

Relación

de áreas

Concentración

recuperada

(ng/mL)

12000 1,4650 12792,9

12000 1,5043 13143,3

12000 1,7263 13339,4

Promedio 13091,9

Desv. Est. 276,8

% C.V. 2,1


Los resultados obtenidos para el CV en el primer día de análisis para los tres puntos

control por triplicado no superan el 15 % por lo que cumplen con el criterio de aceptación

establecido para este parámetro.

117

Día 2




Relación de áreas


(ng/mL)

1200 0,1738 1282,4

1200 0,1701 1249,2

1200 0,1638 1193,1

Promedio 1241,6

Desv. Est. 45,1

% C.V. 3,6





Relación de áreas


(ng/mL)

3600 0,4199 3476,5

3600 0,3975 3276,8

3600 0,4806 3839,3

Promedio 3530,8

Desv. Est. 285,2

% C.V. 8,1


118




Relación de áreas


(ng/mL)

12000 1,4706 12842,9

12000 1,4913 13027,4

12000 1,5703 13107,6

Promedio 12992,6

Desv. Est. 135,8

% C.V. 1,1


Los resultados obtenidos para el CV en el segundo día de análisis para los tres puntos



Día 3




Relación de áreas


(ng/mL)

1200 0,1646 1200,4

1200 0,1635 1190,7

1200 0,1644 1198,9

Promedio 1196,7

Desv. Est. 5,2

% C.V. 0,4


119




Relación de áreas


(ng/mL)

3600 0,4805 3838,4

3600 0,4871 3897,2

3600 0,4820 3851,8

Promedio 3862,4

Desv. Est. 30,8

% C.V. 0,8





Relación de áreas


(ng/mL)

12000 1,3803 12037,9

12000 1,4891 13007,8

12000 1,4432 12598,6

Promedio 12548,1

Desv. Est. 486,9

% C.V. 3,9


Los resultados obtenidos para el CV en el tercer día de análisis para los tres puntos



En consecuencia se establece que el método desarrollado es reproducible dentro de las

condiciones de trabajo determinadas.

120

4.2.6. Exactitud

Para la prueba de exactitud se realizó el cálculo de la DEA con seis datos obtenidos de

las pruebas de reproducibilidad y repetibilidad para cada punto control.


Tabla 36. Exactitud del método punto control bajo.


Relación de áreas


(ng/mL) % DEA

1200 0,1685 1235.8 2,9

1200 0,1763 1305.2 8,8

1200 0,1845 1287.9 7,3

1200 0,1738 1282.4 6,9

1200 0,1701 1249.2 4,1

1200 0,1646 1200.4 0,1

Promedio 1260,2

Desv. Est. 38,9

% C.V. 3,1



Tabla 37. Exactitud del método punto control medio.


Relación de áreas


(ng/mL) % DEA

3600 0,1685 3848,2 6,9

3600 0,1763 3596,8 0,1

3600 0,1845 3290,1 8,6

3600 0,1738 3476,5 3,4

3600 0,1701 3276,8 8,9

3600 0,1646 4016,7 11,6

Promedio 3584,2

Desv. Est. 299,8

% C.V. 8,4


121


Tabla 38. Exactitud del método punto control alto.


Relación de áreas


(ng/mL) % DEA

12000 0,1685 12792,9 6,6

12000 0,1763 13143,3 9,5

12000 0,1845 13339,4 11,1

12000 0,1738 12842,9 7,0

12000 0,1701 13027,4 8,6

12000 0,1646 12598,6 4,9

Promedio 12957,4

Desv. Est. 266,2

% C.V. 2,6


Como se observa en las tablas de la 36 a la 38, para cada caso la desviación estándar

absoluta no superó un valor de 15 % por lo que cumple con el criterio de aceptación y

podemos establecer que el método desarrollado es exacto a las condiciones de trabajo

determinadas.

4.2.7. Límite de detección

Tabla 39. Límite de detección del método analítico.


Relación de áreas


(ng/mL) % DEA

400 0,0876 514,2 28,5

400 0,0820 464,3 16,0

400 0,0832 474,9 18,7

400 0,0924 556,9 39,2

400 0,0964 592,5 48,1

Promedio 520,6

Desv. Est. 54,3

% C.V. 10,4


122

La tabla 39 muestra los resultados obtenidos para la determinación del límite de

detección y en base a esto se establece un valor de 400 ng/mL como límite de detección

para el método desarrollado, ya que cumple con el criterio de aceptación de precisión con

un coeficiente de variación inferior a 15 %, sin embargo no cumple con el parámetro de

exactitud ya que para tres de los puntos analizados la desviación estándar absoluta es

superior al 20 % y están fuera del criterio de aceptación.

4.2.8. Límite de cuantificación

Tabla 40. Límite de cuantificación del método analítico.


Relación de áreas


(ng/mL) % DEA

800 0,1190 794,1 0,7

800 0,1174 779,8 2,5

800 0,1102 715,2 10,6

800 0,1253 850,3 6,2

800 0,1302 893,9 11,7

Promedio 806,7

Desv. Est. 68,5

% C.V. 8,5


En la tabla 40 se muestra los resultados para la determinación del límite de

cuantificación, el punto utilizado para esta prueba es de 800 ng/mL y como podemos

observar cumple con el criterio de aceptación establecido ya que tiene un coeficiente de

variación menor a 15 % y todos sus puntos tienen una desviación estándar absoluta

menor a 20 %.

123

4.2.9. Recuperación

Tabla 41. Promedio de recuperación del método analítico.

Conc. Relación de áreas

Conc. recuperada

(ng/mL) % C.V

Relación de áreas

Conc. recuperada

(ng/mL) % C.V

% Recuperación (ng/mL)

Sistema Método

1200 0,1737 1281,7 9,9 0,1685 304,40 8,2 96,677

3600 0,3460 2817,7 5,4 0,3986 833,90 6,8 103,777

12000 1,5043 13143,3 3,8 1,4913 2948,60 2,4 99,122

Promedio 99,859

Desv. Est. 3,6069

% C.V. 3,6


La recuperación se analizó con los tres puntos control por triplicado en sistema y en

método, la tabla 41 muestra los resultados promedio de recuperación para cada punto,

que como podemos observar son valores por encima de 90 % y donde el CV es inferior a

15 %, por lo tanto el método desarrollado cumple con el criterio de aceptación establecido

para este parámetro.

4.2.10. Estabilidad

4.2.10.1. A tiempo cero t = 0


Tabla 42. Estabilidad del método a tiempo cero. Punto control bajo.


Relación de áreas


(ng/mL) % DEA

1200 0,1685 1235,4 2,9

1200 0,1763 1304,9 8,7

1200 0,1845 1287,9 7,3

Promedio 1276,1

Desv. Est. 36,3

% C.V. 2,8


124


Tabla 43. Estabilidad del método a tiempo cero. Punto control medio.


Relación de áreas


(ng/mL) % DEA

3600 0,4616 3848,2 6,9

3600 0,4334 3596,8 0,1

3600 0,3990 3290,1 8,6

Promedio 3578,4

Desv. Est. 279,5

% C.V. 7,8



Tabla 44. Estabilidad del método a tiempo cero. Punto control alto.


Relación de áreas


(ng/mL) % DEA

12000 1,4650 12792,9 6,6

12000 1,5043 13143,3 9,5

12000 1,7263 13339,4 11,1

Promedio 13091,9

Desv. Est. 276,8

% C.V. 2,1


En las tablas de la 42 a la 44 correspondientes a los resultados del ensayo de estabilidad

a tiempo cero se observa que el CV al igual que la DEA para cada punto de estudio

nunca superan el 15 % por lo que establecemos que al analizar las muestras el día de la

preparación el método desarrollado es estable, exacto y preciso.

125

4.2.10.2. Temperatura ambiente por 24 horas


Tabla 45. Estabilidad del método a temperatura ambiente por 24 h. Punto control bajo


Relación de áreas Concentración

recuperada (ng/mL)

% DEA

1200 0,1858 1300.7 8.4

1200 0,1686 1236.6 3.0

1200 0,1740 1284.0 7.0

Promedio 1273,8

Desv. Est. 33,2

% C.V. 2,6



Tabla 46. Estabilidad del método a temperatura ambiente por 24 h. Punto control medio


Relación de áreas


(ng/mL) % DEA

3600 0,5610 4026.5 11.8

3600 0,5003 3953.4 9.8

3600 0,5003 3316.0 7.9

Promedio 3765,3

Desv. Est. 390,8

% C.V. 10,4


126


Tabla 47. Estabilidad del método a temperatura ambiente por 24 h. Punto control alto


Relación de áreas


(ng/mL) % DEA

12000 1,4975 13082.7 9.0

12000 1,4571 12722.5 6.0

12000 1,4081 12285.7 2.4

Promedio 12696,9

Desv. Est. 399,1

% C.V. 3,1


Al igual que para la prueba de estabilidad a tiempo cero, en las tablas de la 45 a la 47

correspondientes a los resultados del ensayo de estabilidad a las 24 horas a temperatura

ambiente se observa que el CV al igual que la DEA para cada punto de estudio nunca

superan el 15 % por lo que establecemos que el método desarrollado es estable, exacto y

preciso al analizar las muestras después de 24 horas a temperatura ambiente.

4.2.10.3. Refrigeración por 24 horas


Tabla 48. Estabilidad del método en refrigeración por 24 h. Punto control bajo.


Relación de áreas


(ng/mL) % DEA

1200 0,1725 1270.8 5.9

1200 0,1762 1304.1 8.7

1200 0,1964 1305.6 8.8

Promedio 1293,5

Desv. Est. 19,7

% C.V. 1,5


127


Tabla 49. Estabilidad del método en refrigeración por 24 h. Punto control medio.


Relación de áreas


(ng/mL) % DEA

3600 0,4809 3931.1 9.2

3600 0,4582 3817.9 6.1

3600 0,4582 3817.9 6.1

Promedio 3855,6

Desv. Est. 65,4

% C.V. 1,7



Tabla 50. Estabilidad del método en refrigeración por 24 h. Punto control alto.


Relación de áreas


(ng/mL) % DEA

12000 1,4866 12985.5 8.2

12000 1,7294 13367.0 11.4

12000 1,6925 13038.1 8.7

Promedio 13130,2

Desv. Est. 206,5

% C.V. 1,6


En las tablas de la 48 a la 50 correspondientes a los resultados del ensayo de estabilidad

a refrigeración por 24 horas se observa que el CV al igual que la DEA para cada punto de

estudio nunca supera el 15 % por lo que establecemos que el método desarrollado es

estable, exacto y preciso bajo las condiciones mencionadas.

128

4.2.10.4. Tres ciclos de congelación


Tabla 51. Estabilidad del método tras dos ciclos de congelación. Punto control bajo.


Relación de áreas


(ng/mL) % DEA

1200 0,2050 1293.6 7.8

1200 0,1780 1320.3 10.0

1200 0,1827 1362.2 13.5

Promedio 1325,4

Desv. Est. 34,6

% C.V. 2,6


Tabla 52. Estabilidad del método tras dos ciclos de congelación. Punto control medio


Relación de áreas


(ng/mL) % DEA

3600 0,4703 3926.1 9.1

3600 0,4635 3864.8 7.4

3600 0,4329 3592.3 0.2

Promedio 3794,4

Desv. Est. 177,7

% C.V. 4,7


129


Tabla 53. Estabilidad del método tras dos ciclos de congelación. Punto control alto.


Relación de áreas


(ng/mL) % DEA

12000 1,4194 12386.1 3.2

12000 1,6263 13338.9 11.1

12000 1,3872 12099.3 0.8

Promedio 12608,1

Desv. Est. 648,9

% C.V. 5,1


Al igual que en los ensayos anteriores los resultados tras dos ciclos de congelación

muestran que el CV al igual que la DEA para cada punto de estudio nunca superan el 15

% cumpliendo con los criterios de aceptación, por lo que establecemos que al analizar las

muestras bajo las condiciones mencionadas el método desarrollado es estable, exacto y

preciso.

4.2.11. Tolerancia (Punto control medio 3600 ng/mL)

4.2.11.1. Fase móvil ACN:Buffer acetato de amonio Proporción (58:42)

Tabla 54. Resultados punto control medio tolerancia del método (58:42).


T. Retención SI T.

Retención GLM

Relación de áreas


(ng/mL) % DEA

3600 3.205 4.537 0.46548 3882.8 7.9

3600 3.218 4.557 0.45839 3819.6 6.1

3600 3.207 4.545 0.44473 3697.8 2.7

Promedio 3800,1

Desv. Std 94,2

% C.V. 2,5


130

4.2.11.2. Fase móvil ACN:Buffer acetato de amonio Proporción (52:48)

Tabla 55. Resultados punto control medio tolerancia del método (52:48).

Concentración

(ng/mL)

T.

Retención

SI

T. Retención

GLM

Relación

de áreas

Concentración

recuperada

(ng/mL)

% DEA

3600 4.269 6.986 0.4543 3783.1 5.0

3600 4.269 6.986 0.4334 3596.8 0.1

3600 4.268 6.985 0.4784 3997.9 11.0

Promedio 3792,6

Desv. Std 200,7

% C.V. 5,2


Al analizar los resultados del ensayo de tolerancia del método para la primera proporción

ACN:Buffer acetato de amonio (58:42), observamos como varía el tiempo de retención de

ambos analitos pero aun así cumple con el criterio de aceptación cuando se utiliza la fase

móvil en dicha proporción, posteriormente observamos que de igual manera la segunda

variación de proporción de fase móvil ACN:Buffer acetato de amonio (52:48), cumple con

su criterio de aceptación, en base a lo cual establecemos que el método desarrollado es

preciso y exacto aun con variaciones de 5 % en la proporción de la fase móvil.

131

4.3. APLICACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO

4.3.1. Primer día de análisis

4.3.1.1. Estandarización del equipo en Método

Tabla 56. Estandarización del equipo en Método, primer día de análisis.

Datos Pioglitazona Glimepirida (400 ng/mL) Relación de áreas

Área T. Retención Área T. Retención

1 237,882 3,682 143,757 5,726 0,604

2 234,185 3,683 139,623 5,729 0,596

3 236,832 3,684 138,925 5,729 0,587

4 237,053 3,684 138,597 5,726 0,585

5 237,636 3,684 138,549 5,730 0,583

Promedio 236,718 3,683 139,890 5,728 0,591

Desv. Est. 1,478 0,001 2,204 0,002 0,009

% C.V. 0,6 0,02 1,6 0,03 1,5


4.3.1.2. Curva de Calibración

Tabla 57. Curva de calibración primer día de análisis.


T. retención S.I. Área S.I. T. retención

GLM Área GLM

Relación de áreas

100 3,6380 216,2869 5,6950 15,1428 0,0700

200 3,6440 198,1404 5,6900 35,3010 0,1782

400 3,6370 207,0275 5,6760 55,4885 0,2680

500 3,6310 220,7652 5,6570 71,1458 0,3223

1000 3,6370 218,1838 5,6770 129,8668 0,5952

2000 3,6360 222,5149 5,6710 225,5890 1,0138

4000 3,6300 246,2078 5,6490 483,5401 1,9640

5000 3,6170 234,7825 5,6310 597,5046 2,5449

m = 0,0005

b = 0,0649

r = 0,9992

r2 = 0,9984 Elaborado por: Wendy Chávez (2015)

132

Ilustración 41. Curva de calibración primer día de análisis. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)

4.3.2. Segundo día de análisis

4.3.2.1. Estandarización del equipo en Método

Tabla 58. Estandarización en Método, segundo día de análisis.

Datos Pioglitazona Glimepirida (400ng/mL) Relación de áreas

Área T.

Retención Área

T. Retención

1 246,952 3,675 145,911 5,628 0,591

2 244,556 3,705 155,030 5,685 0,634

3 248,647 3,707 158,207 5,682 0,636

4 252,695 3,691 152,054 5,657 0,602

5 246,444 3,702 153,531 5,688 0,623

Promedio 247,859 3,696 152,947 5,668 0,617

Desv. Est. 3,072 0,013 4,546 0,026 0,020

% C.V. 1,2 0,6 3,0 0,4 3,3


y = 0,0005x + 0,0649r² = 0,9984

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

Rela

ció

n d

e á

rea

s


Curva de Calibración

133

4.3.2.2. Curva de Calibración

Tabla 59. Curva de calibración segundo día de análisis.


T. retención

S.I. Área S.I.

T. retención GLM

Área GLM Relación de áreas

100 3,6380 273,5400 5,6470 13,8907 0,0508

200 3,6460 266,6200 5,6690 35,4000 0,1328

400 3,6290 277,8730 5,6550 55,8000 0,2008

500 3,6370 274,1500 5,6690 73,2408 0,2672

1000 3,6340 274,0660 5,6670 140,0950 0,5112

2000 3,6330 276,5350 5,6650 273,6980 0,9897

4000 3,6400 276,4450 5,6640 578,6210 2,0931

5000 3,6400 270,8470 5,6860 793,5130 2,9297

m = 0,0006

b = -0,0336

r = 0,9933

r2 = 0,9967 Elaborado por: Wendy Chávez (2015)

Ilustración 42. Curva de calibración segundo día de análisis. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)

y = 0,0006x - 0,0336r² = 0,9933

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

Rela

ció

n d

e á

rea

s


Curva de Calibración

134

4.3.3. Procesamiento de los Datos

Los datos de área obtenidos de los cromatogramas tanto de Nanopartículas de GLM

como de GLM comercial se procesaron en base a las curvas de calibración para cada día

de estudio, así, mediante una interpolación de la relación de áreas en la curva de

calibración respectiva se obtuvo la Concentración en ng/mL, posteriormente realizamos el

cálculo de la concentración promedio para cada tiempo de toma de muestra y con esto

obtenemos los puntos para la gráfica de Conc. (ng/mL) vs tiempo.

Además se realizó el cálculo de la desviación estándar y el coeficiente de variación entre

los datos de un mismo tiempo para determinar que la variabilidad biológica no afecta de

manera significativa los resultados, para esto manejamos un criterio de aceptación de %

CV < 30 % para este tipo de estudios. Ver anexos 3, 4, 5 y 6.

4.3.4. Determinación del orden de reacción

Una vez que se obtuvo el promedio de concentración para cada tiempo de toma de

muestra para los dos tratamientos, Nanopartículas de GLM y GLM comercial, se realizó la

determinación del orden de reacción, para lo cual realizamos la regresión lineal de Conc.

vs tiempo, ln Conc. vs tiempo y 1/Conc. vs tiempo, obtenemos el coeficiente de

correlación y aquel que se acerque a la unidad determina el orden de reacción del

presente estudio.

Tabla 60. Regresión lineal GLM comercial 1° determinación.

tiempo (min) Conc. ng/mL ln Conc 1/Conc

15 107,1123 4,6739 0,0093

30 727,2204 6,5892 0,0014

60 1121,1299 7,0221 0,0009

120 550,9329 6,3116 0,0018

180 493,2924 6,2011 0,0020

240 476,7298 6,1669 0,0021

300 463,7840 6,1394 0,0022

360 441,7494 6,0907 0,0023

420 267,9560 5,5908 0,0037

480 176,7810 5,1749 0,0057

540 103,2144 4,6368 0,0097

r2 0,1096 0,2487 0,1259

r 0,3311 0,4987 0,3549


135

El coeficiente de correlación que más se acerca a la unidad es el que se obtuvo de la

regresión lineal de ln Conc. vs tiempo, con un valor de r = 0,4987 por lo tanto el proceso

corresponde a una reacción de primer orden.

Tabla 61. Regresión lineal GLM comercial 2° determinación.

tiempo (h) Conc. ng/mL ln 1/C

15 156,6866 5,0542 0,0064

30 435,1462 6,0757 0,0023

60 775,7592 6,6538 0,0013

120 344,2340 5,8413 0,0029

180 268,9239 5,5944 0,0037

240 211,8825 5,3560 0,0047

300 188,4348 5,2388 0,0053

360 169,3276 5,1318 0,0059

420 162,0441 5,0879 0,0062

480 120,7280 4,7935 0,0083

540 111,9140 4,7177 0,0089

r2 0,4011 0,5543 0,6400

r 0,6333 0,7445 0,8000


El coeficiente de correlación que más se acerca a la unidad es el que se obtuvo de la

regresión lineal de 1/Conc. vs tiempo, con un valor de r = 0,8000 por lo tanto el proceso

corresponde a una reacción de segundo orden, sin embargo por motivos experimentales

y en vista de que la diferencia entre las dos constantes no es alta se trabajó considerando

a este proceso como una reacción de primer orden.

Tabla 62. Regresión lineal Nanopartículas de GLM 1° determinación.

tiempo (h) Conc. ng/mL ln Conc 1/Conc

15 191,0881 5,2527 0,0052

30 437,6005 6,0813 0,0023

60 1229,0529 7,1140 0,0008

120 376,2788 5,9303 0,0027

180 308,1843 5,7307 0,0032

240 217,2945 5,3813 0,0046

300 169,1447 5,1308 0,0059

360 145,3495 4,9412 0,0071

420 139,9422 4,7936 0,0083

480 120,7393 4,7936 0,0083

540 113,9149 4,7355 0,0088

r2 0,3193 0,5924 0,7808

r 0,5651 0,7697 0,8836


136

De la misma manera en este caso al determinar el coeficiente de correlación observamos

que el que más se acerca a la unidad es el que se obtuvo de la regresión lineal de

1/Conc. vs tiempo, con un valor de r = 0,8836 por lo tanto el proceso corresponde a una

reacción de segundo orden, sin embargo por motivos experimentales y en vista de que la

diferencia entre las dos constantes no es alta se trabajó considerando a este proceso

como una reacción de primer orden.

Tabla 63. Regresión lineal Nanopartículas de GLM 2° determinación.

tiempo (min) Conc. ng/mL ln 1/C

15 243,6145 5,4956 0,0041

30 573,9973 6,3526 0,0017

60 746,8429 6,6159 0,0013

120 466,1810 6,1446 0,0021

180 336,6083 5,8189 0,0030

240 268,8166 5,5940 0,0037

300 201,1732 5,3042 0,0050

360 177,0076 5,1762 0,0056

420 144,9382 4,9763 0,0069

480 122,4661 4,8078 0,0082

540 115,6328 4,7504 0,0086

r2 0,6030 0,7682 0,8528

r 0,7766 0,8765 0,9235


Al determinar el coeficiente de correlación observamos que el que más se acerca a la

unidad es el que se obtuvo de la regresión lineal de 1/Conc. vs tiempo, con un valor de r

= 0,9235 por lo tanto el proceso corresponde a una reacción de segundo orden, sin

embargo por motivos experimentales y en vista de que la diferencia entre las dos

constantes no es alta se trabajó considerando a este proceso como una reacción de

primer orden.

4.3.5. Cálculo de las Constantes Farmacocinéticas

Una vez determinado el orden de la reacción realizamos el cálculo de las constantes

farmacocinéticas para cada tratamiento y para cada determinación considerando las

ecuaciones que corresponden a una cinética de primer orden, además realizamos las

gráficas curva de nivel plasmático Conc. ng/mL vs tiempo y la gráfica que corresponde a

la cinética de primer orden ln Conc vs tiempo, obteniendo de esta manera la ecuación en

base a la cual realizaremos los cálculos respectivos.

137

Tabla 64. Concentración vs tiempo de GLM comercial 1° determinación.

tiempo (min) Conc. ng/mL ln Conc.

0 0 -

15 107,1123 4,6739

30 727,2204 6,5892

60 1121,1299 7,0221

120 550,9329 6,3116

180 493,2924 6,2011

240 476,7298 6,1669

300 463,7840 6,1394

360 441,7494 6,0907

420 267,9560 5,5908

480 176,7810 5,1749

540 103,2144 4,6368


Ilustración 43. Curva de nivel plasmático GLM comercial 1° determinación. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)

0

200

400

600

800

1000

1200

0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600

Co

nc

. n

g/m

L

Tiempo (min)

Concentración vs Tiempo

138

Ilustración 44. Gráfica ln Conc. vs tiempo GLM comercial 1° determinación. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)

Tabla 65. Concentración vs tiempo de GLM comercial 2° determinación.

tiempo (min) Conc. ng/mL ln Conc.

0 0 -

15 156,6866 5,0542

30 435,1462 6,0757

60 775,7592 6,6538

120 344,2340 5,8413

180 268,9239 5,5944

240 211,8825 5,3560

300 188,4348 5,2388

360 169,3276 5,1318

420 162,0441 5,0879

480 120,7280 4,7935

540 111,9140 4,7177


4,0000

4,5000

5,0000

5,5000

6,0000

6,5000

7,0000

7,5000

0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600

ln C

on

c. n

g/m

L

Tiempo (min)

ln Concentración vs Tiempo

139

Ilustración 45. Curva de nivel plasmático GLM comercial 2° determinación. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)

Ilustración 46. Gráfica ln Conc. vs tiempo GLM comercial 2° determinación. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600

Co

nc

. n

g/m

L

Tiempo (min)

Concentración vs tiempo

4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600

ln C

on

c. n

g/m

L

Tiempo (min)


140

Tabla 66. Concentración vs tiempo de Nanopartículas de GLM 1° determinación.

tiempo (min) Conc. ng/mL

ln Conc.

0 0 -

15 191,0881 5,2527

30 437,6005 6,0813

60 1229,0529 7,1140

120 376,2788 5,9303

180 308,1843 5,7307

240 217,2945 5,3813

300 169,1447 5,1308

360 145,3495 4,9412

420 139,9422 4,7936

480 120,7393 4,7936

540 113,9149 4,7355


Ilustración 47. Curva de nivel plasmático Nanopartículas de GLM 1° determinación. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600

Co

nc

. n

g/m

L

Tiempo (min)


141

Ilustración 48. Gráfica ln Conc. vs tiempo Nanopartículas de GLM 1° determinación. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)

Tabla 67. Concentración vs tiempo de Nanopartículas de GLM 2° determinación.

Tiempo (min)

Conc. ng/mL

ln Conc.

0 0 -

15 243,6145 5,4956

30 573,9973 6,3526

60 746,8429 6,6159

120 466,1810 6,1446

180 336,6083 5,8189

240 268,8166 5,5940

300 201,1732 5,3042

360 177,0076 5,1762

420 144,9382 4,9763

480 122,4661 4,8078

540 115,6328 4,7504


4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

7,5

0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600

ln C

on

c. n

g/m

L

Tiempo (min)


142

Ilustración 49. Curva de nivel plasmático Nanopartículas de GLM 2° determinación. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)

Ilustración 50. Gráfica ln Conc. Vs tiempo Nanopartículas de GLM 2° determinación. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600

Co

nc

. n

g/m

L

Tiempo (min)


4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600

ln C

on

c. n

g/m

L

Tiempo (min)


143

4.3.5.1. Ejemplo de cálculo (Datos de GLM comercial 2° determinación)

Para el cálculo de las constantes farmacocinéticas primeramente separamos los datos

considerando una fase de absorción y una fase de eliminación, la fase de absorción está

comprendida entre los puntos A hasta B, donde A es cero y B es el punto con el valor

más alto de concentración, mientras que la fase de eliminación está comprendida entre

los puntos C hasta D, donde C es el punto después de B y de es el último punto de curva

de nivel plasmático.

Ilustración 51. Curva de nivel plasmático. Fase de absorción A-B-C. Fase de eliminación C-D.


Posteriormente realizamos la regresión lineal entre ln Conc. vs tiempo con los datos de la

fase eliminación para obtener la ecuación de la recta y la constante de eliminación.

Tiempo (min) Conc ng/mL ln Conc

120 344,2340 5,8413 C

180 268,9239 5,5944

240 211,8825 5,3560

300 188,4348 5,2388

360 169,3276 5,1318

420 162,0441 5,0879

480 120,7280 4,7935

540 111,9140 4,7177 D

144

Datos de la regresión lineal fase de eliminación:

a = 6,0570

Ke = b -0,0025 min-1

r = 0,9839

Con estos datos calculamos el tiempo medio de eliminación utilizando la siguiente

formula:

t ½ =0,693

Ke

t ½ =0,693

0,0025

t ½ = 𝟐𝟕𝟑, 𝟐𝟕 𝐦𝐢𝐧

Para la fase de absorción utilizamos la ecuación de la resta de la regresión lineal de la

fase de eliminación.

Ecuación de la recta:

y = 6,0570-0,0025x

En base a esta ecuación interpolamos los datos de tiempo de la fase de absorción y

obtenemos los datos de Concentración residual con los que realizamos la regresión lineal

y obtenemos la constante de absorción, este procedimiento se denomina Método de los

Residuales.

Tabla 68. Método de los Residuales, fase de absorción.

tiempo (min)

Conc. ng/L Conc.

estimada

Antilog Conc.

estimada

Conc. Residual

ln Conc. Residual

0 0 6,0570 427,1087 427,1087 6,0570

15 156,6866 6,0190 411,1672 254,4806 5,5392

30 435,1462 5,9810 395,8207 -39,3255 -

60 775,7592 5,9049 366,8247 -408,9345 -


145

Debido a que los datos obtenidos para 30 y 60 minutos son valores negativos de los

cuales no podemos obtener el logaritmo natural para realizar la regresión lineal, estos

datos se descartan y se trabaja con los valores para 0 y 15 minutos.

Datos de la regresión lineal fase de absorción:

a = 6,0570

Ka = b -0,0345 min-1

r = 1,0000

Con estos datos calculamos el tmáx utilizando la siguiente formula:

𝑡𝑚á𝑥 =2,303

Ka − Ke𝑙𝑜𝑔

𝐾𝑎

𝐾𝑒

𝑡𝑚á𝑥 =2,303

0,0345 − 0,0025𝑙𝑜𝑔

0,0345

0,0025

𝒕𝒎á𝒙 = 𝟖𝟏, 𝟔𝟓 𝐦𝐢𝐧

Para el cálculo de Cmáx utilizamos la siguiente fórmula:

𝐶𝑚á𝑥 = Co𝐾𝑎

Ka−Ke(

𝑒−𝐾𝑒(𝑡𝑚á𝑥)

1−𝑒−𝐾𝑒𝜏 −𝑒−𝐾𝑎(𝑡𝑚á𝑥)

1−𝑒−𝐾𝑎𝜏 )

Donde:

Co = Concentración a tiempo 0 calculada tras la interpolación de datos en la

regresión lineal de la fase de eliminación.

Ka = Constante de absorción

Ke = Constante de eliminación

𝜏 = Tiempo medio de eliminación t ½ e

𝐶𝑚á𝑥 = 427,10870,0345

0,0345−0,0025(

𝑒−0,0025∗(81,65)

1−𝑒−(0,0025)∗273,27−

𝑒−0,0345∗(81,65)

1−𝑒−(0,0345)∗273,27)

𝑪𝒎á𝒙 = 𝟕𝟐𝟐, 𝟏𝟏𝟐𝟏 𝐧𝐠/𝐦𝐋

146

Realizamos el cálculo del Área bajo la curva (AUC) considerando dos segmentos: el

segmento A-B-C y el segmento C-D.

Segmento A-B-C

Se calculó por el método de los trapecios y se obtuvo los siguientes resultados:

Tabla 69. Áreas determinadas por el Método de los trapecios, segmento A-B-C.

Tiempo (min)

Área del trapecio (ng/mL)

0 1175,14913

15 4438,74563

30 18163,5803

60 33599,7945

∑ = 57377,2695 ng/mL


Segmento C-D

Se calculó por el método de Dost y se obtuvo el siguiente resultado:

𝐴𝑟𝑒𝑎 𝐶𝐷 =𝐶𝑜

Ke

𝐴𝑟𝑒𝑎 𝐶𝐷 =344,2340(ng/mL)

0,0025(𝑚𝑖𝑛−1)

𝑨𝒓𝒆𝒂 𝑪𝑫 = 𝟏𝟑𝟕𝟔𝟗𝟑, 𝟔 (𝐧𝐠

𝐦𝐋) ∗ 𝐦𝐢𝐧

Por lo tanto:

Área total (AUC) = Área (A-B-C) + Área (C-D)

Área total (AUC) = 57377,2695 (ng/mL)*min + 137693,6 (ng/mL)*min

Área total (AUC) = 195070,87 (ng/mL)*min

147

4.3.5.2. Constantes Farmacocinéticas

Tabla 70. Constantes farmacocinéticas GLM Comercial 1° determinación

Constante farmacocinética

Dato Unidades

Ka 0,0479 min-1

Ke 0,0037 min-1

t 1/2 187,50 min

t máx 57,98 min

C máx 1861,11 ng/mL

AUC 233848,74 (ng/mL)*min


Tabla 71. Constantes farmacocinéticas GLM Comercial 2° determinación


Dato Unidades

Ka 0,0345 min-1

Ke 0,0025 min-1

t 1/2 273,27 min

t máx 81,65 min

C máx 722,11 ng/mL



Tabla 72. Constantes farmacocinéticas GLM Nanopartículas 1° determinación


Dato Unidades

Ka 0,0546 min-1

Ke 0,0030 min-1

t 1/2 232,82 min

t máx 56,36 min

C máx 825,40 ng/mL



148

Tabla 73. Constantes farmacocinéticas GLM Nanopartículas 2° determinación


Dato Unidades

Ka 0,0393 min-1

Ke 0,0033 min-1

t 1/2 208,00 min

t máx 68,67 min

C máx 1023,60 ng/mL



4.3.6. Análisis estadístico de los resultados

El diseño estadístico utilizado es un Diseño de Bloques Completamente al Azar con 2

tratamientos y 2 repeticiones dando un total de 4 datos procesados mediante un análisis

de varianza y una prueba de significancia en este caso la prueba t de student.

4.3.6.1. Análisis estadístico de la Constante de Absorción

Tabla 74. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Constante de absorción (Ka)

Tratamientos Constante de Absorción (Ka) Promedio

Nomenclatura

asignada (T) R1 R2

GLM Comercial 0,0479 0,0345 0,0412 T1

GLM Nanopatículas 0,0546 0,0393 0,0469 T2

Promedio 0,0441

Desv 0,0040

% CV 9,18


Hipótesis:

Ho = Hipótesis nula = GLM Comercial = GLM Nanopartículas

Ha = Hipótesis alternativa = GLM Comercial ≠ GLM Nanopartículas

149

Tabla 75. Análisis de Varianza (ADEVA) – Constante de absorción (Ka)

Origen de

las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados

de

libertad

Promedio

de los

cuadrados

F(calculada) Probabilidad F(tabulada)

Entre

grupos 0,000033 1 0,000033 0,316 0,631 18,513

Dentro de

los grupos 0,000207 2 0,000104

Total 0,000240 3


Interpretación de los resultados

Debido a que F calculada (0,3157) es < a F tabulada (18,513) se acepta la hipótesis

nula y se concluye que las constantes de absorción (Ka) determinadas para los dos

tratamientos no presentan diferencia significativa en los resultados obtenidos a un

intervalo de confianza del 95 %.

Adicionalmente se realiza una prueba de significancia en este caso la prueba de t (t de

student) para verificar si existe o no diferencia significativa entre los datos determinados

para los dos tratamientos.

Prueba de significancia t de student – Constante de absorción (Ka)

Tabla 76. Prueba de t – Constante de absorción (Ka)

T1 T2

Media 0,0412 0,0469

Varianza 0,00009 0,00012

Observaciones 2 2

Coeficiente de correlación de Pearson

1

Diferencia hipotética de las medias 0

Grados de libertad 1

Estadístico t -5,792

P(T<=t) dos colas 0,109

Valor crítico de t (dos colas) 12,706


150

Criterio de significancia:

Si el resultado de P es mayor al valor crítico de t (determinado en tablas) se

rechaza la hipótesis nula y por lo tanto GLM Comercial ≠ GLM Nanopartículas, es

decir, que los resultados obtenidos para los dos tratamientos presentan una

diferencia estadísticamente significativa.

Si el resultado de P es menor al valor crítico de t (determinado en tablas) se

rechaza la hipótesis alternativa y por lo tanto GLM Comercial = GLM

Nanopartículas, es decir, que los resultados obtenidos para los dos tratamientos

no presentan una diferencia estadísticamente significativa.


Debido a que el valor de P (0,109) es < al Valor crítico de t (12,706) se acepta la hipótesis

nula y se concluye que las constantes de absorción (Ka) determinadas para los dos



4.3.6.2. Análisis estadístico de la Constante de Eliminación

Tabla 77. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Constante de eliminación (Ke)

Tratamientos Constante de Eliminación (Ke) Promedio

Nomenclatura asignada (T) R1 R2

GLM Comercial 0,0037 0,0025 0,0031 T1

GLM Nanopartículas 0,0030 0,0033 0,0032 T2

Promedio 0,0031

Desv 0,00004

% CV 1,13


Hipótesis:



151

Tabla 78. Análisis de Varianza (ADEVA) – Constante de eliminación (Ke)

Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de los

cuadrados

F (calculada)

Probabilidad F

(tabulada)

Entre grupos

0,0000000025 1 0,0000000025 0,0065 0,943 18,513

Dentro de los grupos

0,0000007650 2 0,0000003825

Total 0,0000007675 3



Debido a que F calculada (0,0065) es < a F tabulada (18,513) se acepta la hipótesis

nula y se concluye que las constantes de eliminación (Ke) determinadas para los dos



Prueba de significancia t de student – Constante de eliminación (Ke)

Tabla 79. Prueba de t – Constante de eliminación (Ke)

T1 T2

Media 0,0031 0,0032

Varianza 0,00000072 0,00000005

Observaciones 2 2


-1



Estadístico t -0,067






nula y se concluye que las constantes de eliminación (Ke) determinadas para los dos

152



4.3.6.3. Análisis estadístico del Tiempo medio de Eliminación

Tabla 80. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Tiempo medio de eliminación (t ½ e)

Tratamientos Tiempo medio de eliminación (t ½ e) Promedio

Nomenlatura asignada (T) R1 R2

GLM Comercial 187,50 273,27 230,39 T1


Promedio 225,40

Desv 7,06

% CV 3,13


Hipótesis:



Tabla 81. Análisis de Varianza (ADEVA) – Tiempo medio de eliminación (t ½ e)

Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de los

cuadrados

F (calculada)

Probabilidad F

(tabulada)

Entre grupos

99,556 1 99,556 0,050 0,844 18,513


3986,648 2 1993,324

Total 4086,204 3



Debido a que F calculada (0,050) es < a F tabulada (18,513) se acepta la hipótesis nula

y se concluye que los tiempos medios de eliminación (t ½ e) determinados para los dos

153



Prueba de significancia t de student – Tiempo medio de eliminación (t ½ e)

Tabla 82. Prueba de t – Tiempo medio de eliminación (t ½ e)

T1 T2

Media 230,39 220,41

Varianza 3678,65 308,00

Observaciones 2 2


-1



Estadístico t 0,180






nula y se concluye que los Tiempos medios de eliminación (t ½ e) determinados para los

dos tratamientos no presentan diferencia significativa en los resultados obtenidos a un


4.3.6.4. Análisis estadístico del Tiempo máximo (t máx)

Tabla 83. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Tiempo máximo (t máx)

Tratamientos Tiempo máximo (t máx) Promedio


GLM Comercial 57,98 81,65 69,82 T1

GLM Nanoparticulas 56,36 68,67 62,52 T2

Promedio 66,17

Desv 5,16

% CV 7,80


154

Hipótesis:



Tabla 84. Análisis de Varianza (ADEVA) – Tiempo máximo (t máx)

Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de los

cuadrados

F (calculada)

Probabilidad F

(tabulada)

Entre grupos

53,290 1 53,290 0,299 0,639 18,513


355,903 2 177,951

Total 409,193 3




y se concluye que los tiempos máximos (t máx) determinados para los dos tratamientos

no presentan diferencia significativa en los resultados obtenidos a un intervalo de

confianza del 95 %.

Prueba de significancia t de student – Tiempo máximo (t máx)

Tabla 85. Prueba de t – Tiempo máximo (t máx)

T1 T2

Media 69,82 62,52

Varianza 280,13 75,77

Observaciones 2 2


1







155



nula y se concluye que los Tiempos máximos (t máx) determinados para los dos



4.3.6.5. Análisis estadístico de Cmáx

Tabla 86. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Concentración máxima (C máx)

Tratamientos Concentración máxima (Cmáx) Promedio


GLM Comercial 1861,11 722,11 1291,61 T1


Promedio 1108,05

Desv 259,59

% CV 23,43


Hipótesis:



Tabla 87. Análisis de Varianza (ADEVA) – Concentración máxima (C máx)

Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de los

cuadrados

F (calculada)

Probabilidad F

(tabulada)

Entre grupos

134773,849 1 134773,85 0,403 0,590 18,513


668299,414 2 334149,71

Total 803073,264 3


156



y se concluye que las concentraciones máximas (C máx) determinadas para los dos



Prueba de significancia t de student – Concentración máxima (C máx)

Tabla 88. Prueba de t – Concentración máxima (C máx)

T1 T2

Media 1291,61 924,50

Varianza 648657,75 19641,66

Observaciones 2 2


-1









nula y se concluye que las Concentraciones máximas (C máx) determinadas para los dos



157

4.3.6.6. Análisis estadístico del Área bajo la curva AUC

Tabla 89. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Área bajo la curva (AUC)

Tratamientos Área bajo la curva (AUC) Promedio


GLM Comercial 233848,74 195070,87 214459,81 T1


Promedio 209770,86

Desv 6631,18

% CV 3,16


Hipótesis:



Tabla 90. Análisis de Varianza (ADEVA) – Área bajo la curva (AUC)

Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de los

cuadrados

F (calculada)

Probabilidad F

(tabulada)

Entre grupos

87945012,6 1 87945012,61 0,234 0,676 18,513


752103356,6 2 376051678,28

Total 840048369,2 3




y se concluye que las áreas bajo la curva (AUC) determinadas para los dos tratamientos

no presentan diferencia significativa en los resultados obtenidos a un intervalo de

confianza del 95 %.

158

Prueba de significancia t de student – Área bajo la curva (AUC)

Tabla 91. Prueba de t – Área bajo la curva (AUC)

T1 T2

Media 214459,81 205081,91

Varianza 751861732,53 241624,02

Observaciones 2 2


-1









nula y se concluye que las Áreas bajo la curva (AUC) determinadas para los dos



159

CAPÍTULO V

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

5.1. CONCLUSIONES

Se realizó un estudio farmacocinético preclínico en ratas Wistar de una

formulación en Nanopartículas de liberación inmediata a base Glimepirida y de

una formulación de Glimepirida comercial, con lo cual se determinaron las

constantes farmacocinéticas para su posterior comparación estadística.

En base a la información recopilada de 3 artículos científicos se desarrolló un

método analítico por HPLC para la cuantificación de Glimepirida en plasma de

rata determinándose como método óptimo para la fase de extracción la

precipitación de proteínas y utilizando como estándar interno la Pioglitazona.

Una vez desarrollado el método analítico por HPLC se realizó la validación tanto

en método como en sistema en base a los criterios de aceptación de la FDA y la

NOM-177-SSA1-2013, el cual demostró ser lineal, exacto, preciso y confiable en

un rango de 800 ng/mL a 20000 ng/mL, para ser empleado en evaluaciones

farmacocinéticas.

La metodología desarrollada se aplicó en la realización de un estudio

farmacocinético preclínico, para lo cual se utilizaron un total de 32 ratas Wistar

divididas en dos grupos, uno correspondiente a la Glimepirida en Nanopartículas y

el otro a la Glimepirida comercial, los cuales a su vez de subdividieron en dos

grupos ya que el estudio se realizó en dos días para la obtención de dos

determinaciones para cada tiempo de toma de muestra, determinándose mediante

un ensayo preliminar la factibilidad de obtener un máximo de 4 muestra de sangre

por cada animal de experimentación siempre y cuando se cumpla con las normas

de bioética para el manejo de los mismos y el proceso de extracción se desarrolle

sin complicaciones.

Con los datos cromatográficos obtenidos de cada una de las muestras

procesadas se realizó la interpolación en su respectiva curva de calibración y con

los resultados obtenidos se calculó las siguientes constantes o parámetros

160

farmacocinéticos tanto para la Glimepirida en Nanopartículas como para la

Glimepirida comercial: constante de absorción (Ka), constante de eliminación

(Ke), tiempo medio de eliminación (t ½ e), tiempo máximo (t máx), concentración

máxima (C máx) y área bajo la curva de nivel plasmático (AUC), cuyos valores

guardan estrecha relación con lo observado en las gráficas realizadas para cada

tratamiento en cada día de determinación.

La comparación estadística entre las constantes farmacocinéticas obtenidas para

la Glimepirida en Nanopartículas y las obtenidas para la Glimepirida comercial se

realizó mediante un Diseño Completamente al Azar (DCA), realizando un análisis

de varianza (ADEVA) y aplicando una prueba de significancia al 95 % en este

caso la t de student, concluyendo que no existe diferencia estadísticamente

significativa entre los datos obtenidos para cada uno de los tratamientos, ya que

los valores calculados para F en el caso de ADEVA y P en el caso de t de student

son menores a los valores tabulados para cada una de las constantes

comparadas, por lo tanto se rechaza la hipótesis alternativa y se acepta la

hipótesis nula en la que se plantea que los parámetros o constantes

farmacocinéticas obtenidos para el medicamento nanopartículado de Glimepirida

son similares a los del medicamento de Glimepirida comercial.

161

5.2. RECOMENDACIONES

Debido a que al realizar la comparación estadística de los datos farmacocinéticos

obtenidos para la Glimepirida en Nanopartículas y la Glimepirida comercial se

determinó que no existe diferencia significativa se recomienda la revisión de la

formulación en Nanopartículas con el objetivo de mejorar la producción de las

mismas ya que los resultados obtenidos no satisfacen las expectativas de la

industria que actualmente desarrolla este medicamento.

Se recomienda la realización de un segundo estudio farmacocinético preclínico,

considerando otro intervalo de toma de muestra y una mayor uniformidad en

cuanto al peso de los animales con el objetivo de descartar errores de

determinación debido a la influencia de la variabilidad biológica sobre los

resultados de extracción al aplicar el método desarrollado.

Es importante el uso de una pre-columna en el cromatógrafo con el objetivo de

disminuir el ruido generado tanto por el plasma de rata como por los diferentes

reactivos que intervienen durante la extracción y cuantificación de los analitos de

interés.

Se recomienda por motivos experimentales el tratamiento de los datos

considerando al proceso como una reacción de primer orden, puesto que a nivel

bibliográfico el 90 % de los medicamentos se comportan de esta manera y los

estudios publicados, similares al presente, establecen en su mayoría que los

subprocesos del Sistema LADME se ajustan a una cinética de orden 1.

162

BIBLIOGRAFÍA

Aguilar A., C. M. (2008). Biofarmacia y Farmacocinética ejercicios y problemas resueltos.

Barcelona-España: Elsevier.

Alonso, I., & Avendaño, B. (2006). Nanotecnología. Correteando entre átomos.

Arias, T. D. (1999). Glosario de Medicamentos: Desarrollo, Evaluación y Uso. Washington

DC: OPS.

Backes, D. (2000). Strategy for the development of quantitative analytical procedures.

New York: Taylo / Francis.

Barona Vilar, J. L. (2004). Salud, Tecnología y Saber Médico. España: Centro de

Estudios Ramón Areces.

Barranco, G. L. (julio-agosto de 2011). La Farmacocinética Poblacional y su importancia

en la Terapéutica. Medicina Interna de México, 27(4).

Betés de Toro, M. (2008). Farmacología para Fisioterapéutas. Madrid: Editorial Médica

Panamericana.

Charles P. Jr. Poole, F. J. (2007). Introducción a la Nanotecnología. Barcelona:

REVERTÉ.

Cintas, I., & M, L. (2006). Nanotecnología: La revolución indistrial del siglo XXI.

FEUM. (2011). Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (Vol. I). México DF,

México: Secretaria de Salud.

Florez, J. A. (2008). Farmacología Humana (5ta edición ed.). España: MASSON.

García, A. (2001). El Ensayo Clínico en España. Farmaindustria.

Goodman, &. G. (2001). Las bases farmacológicas de la terapéutica (9 ed., Vol. 1).

Madrid-España: McGraw-Hill.

Google. (11 de Febrero de 2014). Obtenido de

http://www.stada.es/sites/default/files/productos/ficha/Ficha-tecnica-Glimepirida-

STADA-EFG_0.pdf

Harris, D. (2004). Quantitative chemical analysis (4 th ed.). New York: Freeman.

163

Hermida, L. (Diciembre de 2008). Nanotecnología Aplicada en la Industria Farmacéutica.

SABER COMO.

Kumari S, M. S. (2012). Eudragit-Based Nanosuspension of Poorly Water Soluble Drug:

Formulation and In Vivo In Vivo Evaluation. AAPS PharmSciTech.

Lopez, S. (2012). Estudio Farmacocinetico Preclínico de un Inhibidor de la Sulfatasa

Esteroidal (Tesis Doctoral). Barcelona, España.

Lorenzo, P. (2008). Farmacología: Básica y Clínica. Madrid: Panamericana.

Milena G, R. G. (2005). Validation of Analytical Method for the Determination of

Glimepiride in Human Plasma by HPLC/UV with addition standard using

Glibenclamide as an internal standard. Ars Pharm.

Paliwal, R., Babu, J., & Palakurthi, S. (2014). Nanomedicina Tecnologías a gran Escala:

Factibilidades y Desafíos. AAPS PharmSciTech, 15(6).

Prabu Lakshmana, S. T. (2012). Extraction of Drug fron the Biological Matrix. ISBN.

Quintilli, M. (2012). Nanociencia y Nanotecnología. Centro de Estudios de Diseño y

Comunicación.

Remington, A. (2003). Remington: FARMACIA. Buenos Aires: Médica Panamericana.

Sancén, C. F. (2010). Nanoética y Nanomedicina. Apuntes para una nueva érica de la

nanomedicina. Mundo Nano, 75-86.

Serena, D., & Pedro, A. (2010). La Nanotecnología. Madrid: Catarata.

Skoog, D. A; Holler, F. J; Nieman, T.A. (2001). Principios del Analisis Instrumental.

Madrid: Mc Graw-Hill/Interamericana.

USP-34-NF-29. (2011). United States Pharmacopeia National Formulary (34a ed ed.).

Villafuerte, L. (2013). Nanotecnología Farmacéutica. Razón y Palabra(68).

Wagner, J. G. (1983). Farmacocinética clínica. Barcelona: Reverté.

Watt AP, Morrison D, Evans DC. (2000). Approaches ti higher throughput

pharmacokinetics in drug discovery.

164

Wells, D. (2003). Liquid Liquid Extraction: Strategies for method development and

optimization, In: High Throughput Bioanalytical Sample Preparation - Methods and

Automation Strategies. Amsterdam: Elsevier.

Wells, D. (2003). Protein precipitation: High throughput techniques and strategies for

method development. Amsterdam: Elsevier.

Zief, M; Kiser, R. (2000). An overview of solid phase extraction for sample preparation.

American Laboratory.

165

ABREVIATURAS

ACN: Acetonitrilo

ADEVA: Análisis de varianza

AUC: Área bajo la curva de nivel plasmático

C máx: Concentración máxima

CV: Coeficiente de variación

DCA: Diseño completamente al azar

DEA: Desviación estándar absoluta

GLB: Glibenclamida

GLM: Glimepirida

HPLC: High performance liquid chromatography

Ka: Constante de absorción

Ke: Constante de eliminación

LLE: Extracción líquido-líquido

ng: Nanogramos

nm: Nanómetros

Pa: Principio activo

PGZ: Pioglitazona

S.I.: Estándar interno

SPE: Extracción en fase sólida

t máx: Tiempo máximo

t ½ e: Tiempo medio de eliminación

UV: Ultravioleta

166

ANEXOS

Anexo 1. Tablas de la estructura del Diseño Completamente al Azar para nanopartículas de GLM

y GLM comercial. Primer día de análisis.

Tratamientos Repeticiones Media

0 m

in

R9N R10N R11N R12N XN1A

TN0 TN0R9N TN0R10N TN0R11N TN0R12N TN0XN1A

R1C R2C R3C R4C XC1A

TC0 TC0R1C TC0R2C TC0R3C TC0R4C TC0XC1A

15 m

in

R13N R14N XN2

TN15 TN15R13N TN15R14N TN15XN2

R5C R6C XC2

TC15 TC15R5C TC15R6C TC15XC2

30 m

in

R15N R16N XN3


R7C R8C XC3


60 m

in

R9N R10N XN4


R1C R2C XC4


120 m

in

R11N R12N XN5


R3C R4C XC5


180 m

in

R13N R14N XN6


R5C R6C XC6


167

240 m

in

R9N R10N XN7


R1C R2C XC7


300 m

in

R15N R16N XN8


R7C R8C XC8


360 m

in

R13N R14N XN9


R5C R6C XC9


420 m

in

R15N R16N XN10


R7C R8C XC10


480 m

in

R11N R12N XN11


R3C R4C XC11


540 m

in

R13N R14N XN12


R5C R6C XC12


660 m

in

R15N R16N XN13


R7C R8C XC13


168

720 m

in

R11N R12N XN14


R3C R4C XC14


1440

min

R9N R10N XN15

TN1440 TN1440R9N TN1440R10N TN1440XN15

R1C R2C XC15

TC1440 TC1440R1C TC1440R2C TC1440XC15


Nota: Las concentraciones están en función del tiempo considerando para cada

tiempo la media de cada grupo de muestreo.

169

Anexo 2. Tablas de la estructura del Diseño Completamente al Azar para nanopartículas de GLM

y GLM comercial. Segundo día de análisis.

Tratamientos Repeticiones Media

0 m

in

R1N R2N R3N R4N XN1A

TN0 TN0R1N TN0R2N TN0R3N TN0R4N TN0XN1A

R9C R10C R11C R12C XC1A

TC0 TC0R9C TC0R10C TC0R11C TC0R12C TC0XC1A

15 m

in

R5N R6N XN2


R13C R14C XC2


30 m

in

R7N R8N XN3


R15C R16C XC3


60 m

in

R1N R2N XN4


R9C R10C XC4


120 m

in

R3N R4N XN5


R11C R12C XC5


180 m

in

R5N R6N XN6


R13C R14C XC6


170

240 m

in

R1N R2N XN7


R9C R10C XC7


300 m

in

R7N R8N XN8


R15C R16C XC8


360 m

in

R5N R6N XN9


R13C R14C XC9


420 m

in

R7N R8N XN10


R15C R16C XC10


480 m

in

R3N R4N XN11


R11C R12C XC11


540 m

in

R5N R6N XN12


R13C R14C XC12


660 m

in

R7N R8N XN13


R15C R16C XC13


171

720 m

in

R3N R4N XN14


R11C R12C XC14


1440

min

R1N R2N XN15

TN1440 TN1440R1N TN1440R2N TN1440XN15

R9C R10C XC15

TC1440 TC1440R9C TC1440R10C TC1440XC15


Nota: Las concentraciones están en función del tiempo considerando para cada

tiempo la media de cada grupo de muestreo.

172


Tiempo (min)

T. retención

S.I. Área S.I.

T. retención

GLM Área GLM

Relación de áreas

Conc. (ng/mL)

Promedio (ng/mL)

Desv. Est.

% C.V

0 - - - - - 0 - - -

15 3,708 238,3687 5,776 28,2097 0,1183 109,6788 107,1123 3,6296 3,4

15 3,650 297,0520 5,677 7,5341 0,0254 104,5457

30 3,707 221,7474 5,748 92,0500 0,4151 718,1920 727,2204 12,7680 1,8

30 3,686 205,5699 5,719 87,1448 0,4239 736,2487

60 3,680 203,1578 5,699 133,3359 0,6563 1212,7763 1121,1366 129,5982 11,6

60 3,697 238,8780 5,740 135,4278 0,5669 1029,4968

120 3,649 271,1430 5,645 78,5466 0,2897 573,2547 550,9329 31,5679 5,7

120 3,700 207,4598 5,741 66,9379 0,3227 528,6110

180 3,622 210,1758 5,607 65,2945 0,3107 504,0286 493,2924 15,1834 3,1

180 3,698 224,5973 5,735 67,4228 0,3002 482,5561

240 3,710 208,9463 5,752 62,6667 0,2999 481,9893 476,7298 7,4381 1,6

240 3,621 222,2430 5,604 65,5145 0,2948 471,4703

300 3,660 273,2400 5,662 62,2856 0,2280 463,7840 463,7840 - -

360 3,694 229,0788 5,724 64,2092 0,2803 441,7494 441,7494 - -

420 3,699 178,3329 5,687 37,4672 0,2101 297,8142 267,9560 42,2259 15,8

420 3,690 213,9725 5,746 38,7234 0,1810 238,0977

480 3,727 230,0231 5,799 34,7496 0,1511 176,7810 176,7810 - -

540 3,657 276,8470 5,561 6,8138 0,0246 103,2144 103,2144 - -


173


Tiempo (min)

T. retención

S.I. Área S.I.

T. retención

GLM

Área GLM

Relación de áreas

Conc. (ng/mL)

Promedio (ng/mL)

Desv. Est.

% C.V

0 - - - - - 0 - - -

15 3,654 290,7400 5,642 16,1037 0,0554 157,7885

156,6866 1,5584 1,0

15 3,656 292,1020 5,671 15,8161 0,0541 155,5846

30 3,657 270,0240 5,662 59,9073 0,2219 452,9800

435,1462 25,2208 5,8

30 3,653 256,3090 5,645 51,7090 0,2017 417,3124

60 3,697 230,3582 5,734 119,6869 0,5196 932,3777

775,7592 221,4921 28,6

60 3,703 233,1179 5,746 85,5089 0,3668 619,1406

120 3,634 277,4320 5,649 49,5388 0,1786 376,2038

344,2340 45,2121 13,1

120 3,664 276,3400 5,689 39,3795 0,1425 312,2642

180 3,648 283,7850 5,650 36,9420 0,1302 290,4041

268,9238 30,3777 11,3

180 3,651 275,4180 5,669 29,1802 0,1059 247,4435

240 3,648 255,5790 5,567 24,2020 0,0947 227,4875

211,8825 22,0689 10,4

240 3,656 272,1880 5,650 20,9841 0,0771 196,2774

300 3,652 282,4020 5,641 20,9267 0,0741 190,9726

188,4343 3,5898 1,9

300 3,677 253,7100 5,681 18,0742 0,0712 185,8959

360 3,642 279,9760 5,638 17,5497 0,0627 170,7228

169,3276 1,9731 1,2

360 3,649 282,1620 5,747 17,2427 0,0611 167,9324

420 3,663 265,8210 5,691 15,0562 0,0566 160,0080

162,0441 2,8794 1,8

420 3,670 265,2180 5,670 15,6311 0,0589 164,0801

480 3,660 282,8660 5,683 9,7557 0,0345 120,7280 120,7280 - -

540 3,669 290,0430 5,729 8,8206 0,0304 113,4978 111,9140 2,2398 2,0

540 3,644 290,9550 5,705 8,3286 0,0286 110,3302


174

Anexo 5. Datos cromatográficos y de concentración de GLM Nanopartículas 1° determinación

Tiempo (h)

T. retención

S.I. Área S.I.

T. retención

GLM

Área GLM

Relación de áreas

Conc. (ng/mL)

Promedio (ng/mL)

Desv. Est.

% C.V

0 - - - - - 0 - - -

15 3,671 280,7960 5,6980 19,6162 0,0699 183,4482

191,0881 10,8044 5,7

15 3,662 206,6601 5,6830 33,4322 0,1618 198,7279

30 3,648 262,6546 5,6390 60,7963 0,2315 341,6362

437,6005 135,7140 31,0

30 3,661 193,7120 5,9110 62,9701 0,3251 533,5648

60 3,689 231,4303 5,7150 145,0588 0,6268 1152,2380

1229,0529 108,6327 8,8

60 3,710 211,4679 5,7510 148,3906 0,7017 1305,8678

120 3,635 259,6490 5,6070 46,8190 0,1803 379,3150

376,2788 4,2939 1,1

120 3,629 280,0800 5,6050 49,5439 0,1769 373,2425

180 3,706 191,9515 5,7660 36,2194 0,1887 253,9195

308,1843 76,7419 24,9

180 3,693 184,9958 5,7570 44,6985 0,2416 362,4490

240 3,674 260,3470 5,6980 25,1672 0,0967 230,9863

217,2945 19,3631 8,9

240 3,667 285,8402 5,6850 23,2174 0,0812 203,6027

300 3,678 277,9790 5,6980 18,4340 0,0663 177,1623

169,1447 11,3387 6,7

300 3,690 212,0870 5,7210 88,5530 0,4175 161,1270

360 3,667 192,8782 5,7100 26,1815 0,1357 145,3495 145,3495 - -

420 3,658 223,0639 5,6670 29,6907 0,1331 139,9422 139,9422

480 3,628 266,7360 5,6070 9,2011 0,0345 120,7393 120,7393 - -

540 3,648 251,7326 5,6730 30,3113 0,1204 113,9149 113,9149 - -


175

Anexo 6. Datos cromatográficos y de concentración de GLM Nanopartículas 2° determinación

Tiempo (h)

T. retención

S.I. Área S.I.

T. retención

GLM

Área GLM

Relación de áreas

Conc. (ng/mL)

Promedio (ng/mL)

Desv. Est.

% C.V

0 - - - - - 0 - - -

15 3,674 253,3410 5,675 22,8588 0,0902 219,5693

243,6145 34,0050 14,0

15 3,679 269,4090 5,700 31,6150 0,1173 267,6596

30 3,637 229,8280 5,616 70,6897 0,3076 604,9771

573,9973 43,8121 7,6

30 3,686 281,5020 5,697 76,7473 0,2726 543,0175

60 3,676 214,1378 5,731 30,7150 0,1434 723,1536

746,8429 33,5017 4,5

60 3,633 241,3300 5,605 96,7588 0,4009 770,5322

120 3,686 244,4080 5,703 47,5202 0,1944 404,3413

466,1810 87,4545 18,8

120 3,683 260,8570 5,692 68,9126 0,2642 528,0207

180 3,622 277,5840 5,599 48,5052 0,1747 369,4277

336,6083 46,4136 13,8

180 3,638 287,7460 5,615 39,6296 0,1377 303,7889

240 3,681 262,7330 5,702 31,0030 0,1180 268,8166 268,8166 - -

300 3,622 270,2020 5,611 21,5770 0,0799 201,1732 201,1732 - -

360 3,630 289,3130 5,604 21,0325 0,0727 188,4822

177,0076 16,2276 9,2

360 3,672 294,4170 5,678 17,5932 0,0598 165,5329

420 3,681 269,7260 5,707 14,2926 0,0530 153,5339

144,9382 12,1562 8,4

420 3,671 256,6200 5,746 11,1102 0,0433 136,3424

480 3,630 286,3670 5,702 10,2369 0,0357 122,9600

122,4661 0,6986 0,6

480 3,643 292,4750 5,640 10,2923 0,0352 121,9721

540 3,678 261,2560 5,708 8,2597 0,0316 115,6328 115,6328 - -


176

Anexo 7. Carta de aceptación Universidad Nacional Autónoma de México

177

Anexo 8. Cromatogramas de la 1° Determinación de GLM Comercial

179

Anexo 9. Cromatogramas de la 2° Determinación de GLM Comercial

181

Anexo 10. Cromatogramas de la 1° Determinación de GLM en nanopartículas

183

Anexo 11. Cromatogramas de la 2° Determinación de GLM en nanopartículas

185

Anexo 12. Traducción de Resumen Documental

186

Anexo 13. Diagrama de Flujo Desarrollo del Método Analítico


187

Anexo 14. Diagrama de Flujo Validación del Método Analítico


188

Anexo 15. Diagrama de Flujo Aplicación del Método Analítico


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