UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
Estudio Farmacocinético Preclínico de una Formulación en
Nanopartículas de Liberación Inmediata a base de Glimepirida.
Autora: Wendy Sofía Chávez Naranjo
Tesis de Grado para optar por el Título Profesional de
QUÍMICA - FARMACÉUTICA
Tutora: Dra. Liliana del Rocío Naranjo Balseca
Co-Tutora: Dra. Inés Fuentes Noriega (UNAM)
Quito, Septiembre del 2015
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Chávez Naranjo Wendy Sofía (2015). Estudio
Farmacocinético Preclínico de una Formulación en
Nanopartículas de Liberación Inmediata a base de
Glimepirida. Trabajo de investigación para optar por el
grado de Química Farmacéutica. Carrera de Química
Farmacéutica. Quito: UCE. 211p.
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DEDICATORIA
Con todo mi amor para:
Camila, Inés, Benjas,
Fely y Antonio
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AGRADECIMIENTOS
El tiempo y el lugar de Dios son perfectos, gracias por darme finalmente la sabiduría para
comprender que todo llega en su momento y guiarme hasta la culminación de este
maravilloso sueño.
Gracias a mi gloriosa Universidad Central del Ecuador y por supuesto a mi querida
Facultad de Ciencias Químicas por todos los inolvidables momentos vividos y las
lecciones aprendidas a lo largo de mi paso por sus aulas, a mis maestros por todo el
conocimiento transmitido y los valores inculcados durante mi educación, en especial a la
Dra. Liliana Naranjo por creer en mí, por su paciencia y apoyo incondicional, a la Dra.
Janeth Montalvo y el Dr. Wilmer Narváez por dedicar un espacio de su tiempo a este
sueño, Dr. Fernando Novillo por su apoyo y amistad sincera y al Dr. Patricio Miño (+) por
sus consejos, su amistad y cada tirón de orejas que me ayudó en los momentos de
mayor debilidad para darme cuenta de lo que soy capaz.
Mi sincero agradecimiento a la Facultad de Química de la Universidad Nacional
Autónoma de México y a todo el equipo que conforma el Laboratorio 113 del Edificio E,
por ser protagonista en la realización de este proyecto, en especial a la Dra. Inés Fuentes
Noriega quien desde el inicio me apoyó en este hermoso viaje que emprendí y con su
paciencia, afecto y amistad supo guiarme en el desarrollo de esta tesis, a la Maestra
Kenneth Rubio por sus enseñanzas y a los médicos veterinarios del bioterio Hector y
Lucy por su confianza y apoyo sincero.
A mi maravillosa madre porque eres mi heroína, mi mejor amiga, mi motor, mi apoyo, mi
todo, gracias hermosa por tu amor TE AMO MÁS QUE EL CIELO, a mi papá por su
apoyo y todas las cosas buenas que me ha inculcado, a mis hermanos Benjas y Fely y a
mi hermana Camila que es la luz de mi vida porque este camino lo hemos recorrido
juntos y siempre contaremos el uno con el otro.
A Papá Lucho (+) porque sé que estás orgulloso de mi y es lo que con tu amor deseabas
para todos nosotros, a mi familia por su apoyo, preocupación y todo el empuje que me
han brindado, a mi Ángel porque llegaste a mi vida cuando menos lo esperaba pero
cuando más lo necesité y me entregaste tu amor puro y sincero, a mis amigos Pao, Vero,
Andrés, Magy, Vivi, Juanjo, Vane, Mary, Raquel, Mayrita, Geomy, Carlos, Marisol y Gaby
porque su amistad ha sido un pilar fundamental en mi desarrollo profesional y personal y
a ti David por todos los años que caminamos juntos solo puedo decirte GRACIAS.
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vi
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viii
LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN
El presente trabajo de investigación ESTUDIO FARMACOCINÉTICO PRECLÍNICO DE
UNA FORMULACIÓN EN NANOPARTÍCULAS DE LIBERACIÓN INMEDIATA A BASE
DE GLIMEPIRIDA, se desarrolló en el Laboratorio 113 del Edificio E de la Facultad de
Química de la Universidad Nacional Autónoma de México bajo la dirección de la Dra Inés
Fuentes Noriega y la supervisión técnica de la Maestra Kenneth Rubio Carrasco y en el
Bioterio de la Facultad de Química bajo la guía de los médicos veterinarios Lucía y
Héctor.
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CONTENIDO
CAPÍTULO I ................................................................................................................... 1
1.1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 1
1.2. EL PROBLEMA .............................................................................................. 2
1.2.1. Planteamiento del Problema .................................................................... 2
1.2.2. Formulación del Problema ....................................................................... 2
1.3. OBJETIVOS ................................................................................................... 3
1.3.1. Objetivo General ...................................................................................... 3
1.3.2. Objetivos Específicos ............................................................................... 3
1.4. IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN ............................................................... 3
1.5. HIPÓTESIS (Ho) .............................................................................................. 4
CAPÍTULO II .................................................................................................................. 5
MARCO TEÓRICO ........................................................................................................ 5
2.1. ANTECEDENTES ........................................................................................... 5
2.2. FUNDAMENTO TEÓRICO.............................................................................. 7
2.2.1. NANOTECNOLOGÍA ............................................................................... 7
2.2.1.1. Definición ............................................................................................. 7
2.2.1.2. Clasificación ......................................................................................... 8
2.2.2. NANOMEDICINA ....................................................................................11
2.2.2.1. Definición ............................................................................................11
2.2.2.2. Aplicaciones ........................................................................................12
2.2.2.3. Nanodiagnóstico ..................................................................................13
2.2.2.4. Nano-imagen .......................................................................................13
2.2.2.5. Nanomateriales y nanodispositivos .....................................................13
2.2.2.6. Sistemas terapéuticos y suministros de medicamentos .......................14
2.2.2.7. Aspectos clínicos, regulatorios y toxicológicos ....................................15
2.2.3. NANOFARMACIA ...................................................................................15
2.2.3.1. Definición ............................................................................................16
2.2.3.2. Importancia .........................................................................................16
2.2.3.3. Aplicaciones ........................................................................................17
2.2.4. NANOPARTÍCULAS ...............................................................................18
2.2.4.1. Definición ............................................................................................18
2.2.4.2. Métodos de elaboración de nanopartículas .........................................18
x
2.2.4.2.1. Nanopartículas Poliméricas .............................................................. 19
2.2.4.2.1.1. Nanocristalización ......................................................................... 19
2.2.4.2.1.2. Extrusión ....................................................................................... 21
2.2.4.2.1.3. Tecnología de fluidos supercríticos ................................................ 21
2.2.4.2.2. Nanopartículas Lipídicas .................................................................. 22
2.2.4.2.2.1. Homogeneización a alta presión .................................................... 22
2.2.4.2.2.2. Microemulsiones ............................................................................ 23
2.2.4.2.2.3. Membrana de contacto .................................................................. 24
2.2.4.2.2.4. Ultrasonidos .................................................................................. 24
2.2.4.3. Control de calidad de nanopartículas .................................................. 24
2.2.5. PROCESOS FARMACOCINÉTICOS. SISTEMA LADME ....................... 25
2.2.5.1. Liberación ........................................................................................... 25
2.2.5.2. Absorción ............................................................................................ 27
2.2.5.2.1. Estructura y Composición de las Membranas Absorbentes .............. 27
2.2.5.2.2. Tipos de Proteínas ........................................................................... 27
2.2.5.2.3. Mecanismos de Absorción ............................................................... 28
2.2.5.3. Distribución ......................................................................................... 32
2.2.5.3.1. Unión del fármaco a proteínas plasmáticas ...................................... 33
2.2.5.3.2. Tipos de Proteínas ........................................................................... 35
2.2.5.3.3. Unión del fármaco a componentes tisulares ..................................... 36
2.2.5.3.4. Irrigación tisular ................................................................................ 37
2.2.5.4. Metabolismo ....................................................................................... 37
2.2.5.4.1. Fase I ............................................................................................... 38
2.2.5.4.2. Fase II .............................................................................................. 40
2.2.5.5. Excreción ............................................................................................ 40
2.2.6. ANÁLISIS FARMACOCINÉTICO ............................................................ 41
2.2.6.1. Modelos farmacocinéticos compartimentales ...................................... 41
2.2.6.1.1. Modelo Monocompartimental ........................................................... 41
2.2.6.1.2. Modelo Bicompartimental ................................................................. 43
o Características ........................................................................................... 43
2.2.6.2. Modelos farmacocinéticos lineales ...................................................... 43
2.2.6.3. Modelos farmacocinéticos no lineales ................................................. 44
2.2.6.4. Análisis farmacocinético no compartimental ........................................ 44
2.2.6.5. Análisis farmacocinético poblacional ................................................... 44
2.2.7. CURVAS DE NIVEL PLASMÁTICO ........................................................ 45
2.2.7.1. Parámetros Farmacocinéticos ............................................................. 46
xi
2.2.7.2. C máx ..................................................................................................46
2.2.7.3. T máx ..................................................................................................46
2.2.7.4. Área bajo la curva (AUC) .....................................................................46
2.2.7.5. Volumen de distribución Vd .................................................................46
2.2.7.6. Clearance Cl........................................................................................46
2.2.7.7. Constante de eliminación Ke ...............................................................46
2.2.7.8. Constante de absorción Ka .................................................................47
2.2.7.9. Tiempo medio de eliminación (t ½) .......................................................47
2.2.8. GLIMEPIRIDA .........................................................................................47
2.2.8.1. Características físico-químicas ............................................................47
2.2.8.2. Farmacocinética ..................................................................................48
2.2.8.3. Farmacodinamia ..................................................................................49
2.2.8.4. Mecanismo de acción ..........................................................................49
2.2.8.5. Interacciones .......................................................................................50
2.2.8.6. Efectos secundarios ............................................................................50
2.2.8.7. Posología ............................................................................................51
2.2.9. MÉTODO DE CUANTIFICACIÓN HPLC/UV ...........................................51
2.2.9.1. Instrumentación para cromatografía de líquidos ..................................52
2.2.10. Métodos analíticos para extracción de fármacos de la matriz biológica ...53
2.2.10.1. Precipitación de proteínas .................................................................53
2.2.10.2. Extracción Líquido-líquido (LLE) ........................................................55
2.2.10.3. Extracción en Fase Sólido (SPE) .......................................................56
2.2.11. VALIDACIÓN DE MÉTODOS..................................................................56
2.2.11.1. Características del Desempeño Analítico ..........................................58
2.2.11.2. Verificación de Sistema .....................................................................58
2.2.11.3. Precisión del Sistema ........................................................................59
2.2.11.3.1. Repetibilidad ...................................................................................60
2.2.11.3.2. Reproductibilidad ............................................................................60
2.2.11.4. Linealidad del Sistema .......................................................................60
2.2.11.5. Exactitud ............................................................................................61
2.2.11.6. Intervalo .............................................................................................62
2.2.11.7. Robustez ...........................................................................................63
2.2.11.8. Límite de Detección ...........................................................................63
2.2.11.9. Límite de Cuantificación.....................................................................63
2.3. FUNDAMENTO LEGAL .................................................................................64
2.3.1. Ecuador ..................................................................................................64
xii
2.3.1.1.1. Constitución de la República de Ecuador ......................................... 64
2.3.1.1.2. Ley Orgánica de Salud ..................................................................... 64
2.3.1.1.3. Política Nacional de Medicamentos .................................................. 65
2.3.2. Normas ISO para productos Nanotecnológicos a nivel Mundial .............. 65
2.3.3. México .................................................................................................... 66
2.3.3.1. REGLAMENTO de la Ley General de Salud en Materia de
Investigación para la Salud ............................................................................... 66
2.3.3.2. Ley Protectora de Animales del Estado de México ............................. 67
2.3.3.3. Código de Nuremberg: ........................................................................ 68
2.3.3.4. Declaración de Helsinki ....................................................................... 68
2.3.4. España ................................................................................................... 68
2.3.4.1. Ley 29/2006, de 26 de julio, de garantías y uso racional de los
medicamentos y productos sanitarios. .............................................................. 68
CAPÍTULO III .............................................................................................................. 70
METODOLOGÍA.......................................................................................................... 70
3.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN ........................................................................... 70
3.2. POBLACION Y MUESTRA ........................................................................... 70
3.3. DISEÑO EXPERIMENTAL ............................................................................ 70
3.3.1. Primera etapa: Desarrollo del método .................................................... 70
3.3.2. Segunda etapa: Validación ..................................................................... 70
3.3.3. Tercera etapa: Aplicación del método desarrollado ................................ 71
3.4. VARIABLES .................................................................................................. 71
3.4.1. Independientes ....................................................................................... 71
3.4.2. Dependientes ......................................................................................... 71
3.5. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................... 71
3.5.1. Materiales, Reactivos e Instrumentos analíticos ..................................... 71
3.5.2. Preparación de Reactivos ....................................................................... 75
3.5.2.1. Fase móvil ACN:Buffer de acetato de amonio 20mM pH= 4.5 (50:50) 75
3.5.2.2. Solución Stock de Glimepirida 1000µg/mL .......................................... 76
3.5.2.3. Solución Stock de Glimepirida 100µg/mL ............................................ 76
3.5.2.4. Solución Stock de Pioglitazona 1000µg/mL ........................................ 76
3.5.2.5. Solución Stock de Pioglitazona 60µg/mL ............................................ 76
3.5.2.6. Preparación de soluciones stock para la curva de calibración y puntos
de control .......................................................................................................... 77
3.5.2.7. Preparación para puntos de curva de calibración y puntos control en
método 77
xiii
3.5.3. Métodos ..................................................................................................78
3.5.3.1. Primera etapa: Desarrollo del método .................................................78
3.5.3.2. Segunda etapa: Validación del método ...............................................80
3.5.3.3. Validación del Sistema ........................................................................81
3.5.3.3.1. Estandarización del equipo en Sistema ............................................81
3.5.3.3.2. Linealidad del Sistema ......................................................................81
3.5.3.4. Validación el Método ...........................................................................82
3.5.3.4.1. Selectividad ......................................................................................82
3.5.3.4.2. Linealidad .........................................................................................82
3.5.3.4.3. Límite de Detección ..........................................................................83
3.5.3.4.4. Límite de Cuantificación ....................................................................84
3.5.3.4.5. Recuperación Absoluta (Recobro) ....................................................84
3.5.3.4.6. Precisión ...........................................................................................85
3.5.3.4.6.1. Repetibilidad ..................................................................................85
3.5.3.4.6.2. Reproducibilidad ............................................................................86
3.5.3.4.7. Exactitud ...........................................................................................86
3.5.3.4.8. Estabilidad ........................................................................................87
3.5.3.4.8.1. Estabilidad a t = 0 ..........................................................................87
3.5.3.4.8.2. Estabilidad en muestras de refrigeración a las 24 horas ................87
3.5.3.4.8.3. Estabilidad de la muestra a temperatura ambiente .........................88
3.5.3.4.9. Tolerancia .........................................................................................89
3.5.3.5. Tercera etapa: Aplicación de la metodología .......................................90
3.5.3.5.1. Condiciones experimentales .............................................................90
3.5.3.5.2. Toma de muestras ............................................................................90
3.5.3.5.3. Administración de fármaco................................................................93
3.5.3.5.4. Obtención de muestras .....................................................................95
3.5.3.5.5. Tratamiento de las muestras: ............................................................96
3.5.3.5.6. Método de extracción por precipitación de proteínas ........................96
3.5.3.5.7. Estructura del DCA ...........................................................................97
3.5.3.5.8. Determinación del orden de reacción ................................................99
3.5.3.5.9. Cálculo de las constantes farmacocinéticas ......................................99
CAPÍTULO IV ............................................................................................................ 102
ANALISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS ............................................... 102
4.1. Desarrollo del método analítico ................................................................ 102
4.1.1. Condiciones cromatográficas ................................................................ 107
xiv
4.2. Validación del método analítico ............................................................... 108
4.2.1. Estandarización del equipo en sistema ................................................. 108
4.2.2. Linealidad del sistema .......................................................................... 108
4.2.3. Selectividad del método ........................................................................ 109
4.2.4. Linealidad del método ........................................................................... 113
4.2.5. Precisión ............................................................................................... 114
4.2.5.1. Repetibilidad ..................................................................................... 114
4.2.5.2. Reproducibilidad ............................................................................... 115
4.2.6. Exactitud ............................................................................................... 120
4.2.7. Límite de detección............................................................................... 121
4.2.8. Límite de cuantificación ........................................................................ 122
4.2.9. Recobro ................................................................................................ 123
4.2.10. Estabilidad ............................................................................................ 123
4.2.10.1. A tiempo cero t = 0 .......................................................................... 123
4.2.10.2. Temperatura ambiente por 24 horas ............................................... 125
4.2.10.3. Refrigeración por 24 horas .............................................................. 126
4.2.10.4. Dos ciclos de congelación ............................................................... 128
4.2.11. Tolerancia (Punto control medio 3600 ng/mL) ...................................... 129
4.2.11.1. Fase móvil ACN:Buffer acetato de amonio Proporción (58:42) ........ 129
4.2.11.2. Fase móvil ACN:Buffer acetato de amonio Proporción (52:48) ........ 130
4.3. Aplicación del método analítico ............................................................... 131
4.3.1. Primer día de análisis ........................................................................... 131
4.3.1.1. Estandarización del equipo en Método ............................................. 131
4.3.1.2. Curva de Calibración......................................................................... 131
4.3.2. Segundo día de análisis ....................................................................... 132
4.3.2.1. Estandarización del equipo en Método ............................................. 132
4.3.2.2. Curva de Calibración......................................................................... 133
4.3.3. Procesamiento de los Datos ................................................................. 134
4.3.4. Determinación del orden de reacción ................................................... 134
4.3.5. Cálculo de las Constantes Farmacocinéticas........................................ 136
4.3.5.1. Ejemplo de cálculo (Datos de GLM comercial 2° determinación) ...... 143
4.3.5.2. Constantes Farmacocinéticas ........................................................... 147
4.3.6. Análisis estadístico de los resultados ................................................... 148
4.3.6.1. Análisis estadístico de la Constante de Absorción ............................ 148
4.3.6.2. Análisis estadístico de la Constante de Eliminación .......................... 150
4.3.6.3. Análisis estadístico del Tiempo medio de Eliminación ....................... 152
xv
4.3.6.4. Análisis estadístico del Tiempo máximo (t máx) ................................ 153
4.3.6.5. Análisis estadístico de Cmáx ............................................................. 155
4.3.6.6. Análisis estadístico del Área bajo la curva AUC ................................ 157
CAPITULO V ............................................................................................................. 159
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................................. 159
5.1. Conclusiones.............................................................................................. 159
5.2. Recomendaciones ..................................................................................... 161
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................. 162
ANEXOS .................................................................................................................... 166
xvi
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Mecanismos de absorción de fármacos ............................................................ 31
Tabla 2. Afinidad a las proteínas .................................................................................... 34
Tabla 3. Componentes tisulares que fijan fármacos ........................................................ 37
Tabla 4. Modelos del Análisis Compartimental ................................................................ 41
Tabla 5. Datos requeridos para la validación .................................................................. 58
Tabla 6. Preparación de soluciones iniciales y puntos control para la curva ................... 77
Tabla 7. Preparación de puntos para la curva patrón y puntos control. ........................... 77
Tabla 8. Cuadro indicativo del desarrollo del método analítico. ....................................... 80
Tabla 9. Criterios de aceptación para la estandarización del equipo en sistema ............. 81
Tabla 10. Criterios de aceptación para la linealidad del sistema ..................................... 82
Tabla 11. Criterios de aceptación para la linealidad del método ...................................... 83
Tabla 12. Criterios de aceptación para estabilidad a tiempo cero ................................... 88
Tabla 13. Criterios de aceptación para la tolerancia del método ..................................... 89
Tabla 14. Tratamiento del animal y condiciones experimentales ..................................... 90
Tabla 15. Periodo de muestreo tras la administración de nanopartículas de Glimepirida.91
Tabla 16. Periodo de muestreo tras la administración de Glimepirida comercial. ............ 92
Tabla 17. Peso, dosis individual y volumen a administrar de Glimepirida comercial ........ 94
Tabla 18. Peso, dosis y volumen a administrar de nanopartículas de Glimepirida .......... 94
Tabla 19. Preparación de las muestras de la curva patrón y puntos control en plasma... 96
Tabla 20. Puntos de la gráfica Conc. vs Tiempo para la GLM en nanopartículas ............ 98
Tabla 21. Puntos de la gráfica Conc. vs Tiempo para la GLM comercial ......................... 98
Tabla 22. Condiciones cromatográficas finales determinadas para el método analítico. 107
Tabla 23. Resultados de la estandarización del equipo en sistema .............................. 108
Tabla 24. Repetibilidad del método punto control bajo. ................................................. 114
Tabla 25. Repetibilidad del método punto control medio. .............................................. 114
Tabla 26. Repetibilidad del método punto control alto. .................................................. 115
Tabla 27. Reproducibilidad del método punto control bajo, día 1. ................................. 115
Tabla 28. Reproducibilidad del método punto control medio, día 1. .............................. 116
Tabla 29. Reproducibilidad del método punto control alto, día 1. .................................. 116
Tabla 30. Reproducibilidad del método punto control bajo, día 2. ................................. 117
Tabla 31. Reproducibilidad del método punto control medio, día 2. .............................. 117
Tabla 32. Reproducibilidad del método punto control alto, día 2. ................................. 118
Tabla 33. Reproducibilidad del método punto control bajo, día 3. ................................. 118
xvii
Tabla 34. Reproducibilidad del método punto control medio, día 3. ............................... 119
Tabla 35. Reproducibilidad del método punto control alto, día 3. ................................... 119
Tabla 36. Exactitud del método punto control bajo. ....................................................... 120
Tabla 37. Exactitud del método punto control medio. .................................................... 120
Tabla 38. Exactitud del método punto control alto. ........................................................ 121
Tabla 39. Límite de detección del método analítico. ...................................................... 121
Tabla 40. Límite de cuantificación del método analítico. ................................................ 122
Tabla 41. Promedio de recobro del método analítico. .................................................... 123
Tabla 42. Estabilidad del método a tiempo cero. Punto control bajo. ............................. 123
Tabla 43. Estabilidad del método a tiempo cero. Punto control medio. .......................... 124
Tabla 44. Estabilidad del método a tiempo cero. Punto control alto. .............................. 124
Tabla 45. Estabilidad del método a temperatura ambiente por 24h. Punto control bajo . 125
Tabla 46. Estabilidad del método a temperatura ambiente por 24h. Punto control medio
...................................................................................................................................... 125
Tabla 47. Estabilidad del método a temperatura ambiente por 24h. Punto control alto .. 126
Tabla 48. Estabilidad del método en refrigeración por 24h. Punto control bajo. ............. 126
Tabla 49. Estabilidad del método en refrigeración por 24h. Punto control medio. .......... 127
Tabla 50. Estabilidad del método en refrigeración por 24h. Punto control alto. .............. 127
Tabla 51. Estabilidad del método tras dos ciclos de congelación. Punto control bajo. ... 128
Tabla 52. Estabilidad del método tras dos ciclos de congelación. Punto control medio . 128
Tabla 53. Estabilidad del método tras dos ciclos de congelación. Punto control alto. .... 129
Tabla 54. Resultados punto control medio tolerancia del método (58:42). ..................... 129
Tabla 55. Resultados punto control medio tolerancia del método (52:48). ..................... 130
Tabla 56. Estandarización del equipo en Método, primer día de análisis. ...................... 131
Tabla 57. Curva de calibración primer día de análisis. ................................................... 131
Tabla 58. Estandarización en Método, segundo día de análisis. ................................... 132
Tabla 59. Curva de calibración segundo día de análisis. ............................................... 133
Tabla 64. Regresión lineal GLM comercial 1° determinación. ........................................ 134
Tabla 65. Regresión lineal GLM comercial 2° determinación. ........................................ 135
Tabla 66. Regresión lineal Nanopartículas de GLM 1° determinación. .......................... 135
Tabla 67. Regresión lineal Nanopartículas de GLM 2° determinación. .......................... 136
Tabla 68. Concentración vs tiempo de GLM comercial 1° determinación. ..................... 137
Tabla 69. Concentración vs tiempo de GLM comercial 2° determinación. ..................... 138
Tabla 70. Concentración vs tiempo de Nanopartículas de GLM 1° determinación. ........ 140
Tabla 71. Concentración vs tiempo de Nanopartículas de GLM 2° determinación. ........ 141
Tabla 72. Método de los Residuales, fase de absorción. ............................................... 144
Tabla 73. Áreas determinadas por el Método de los trapecios, segmento A-B-C. ......... 146
xviii
Tabla 74. Constantes farmacocinéticas GLM Comercial 1° determinación ................... 147
Tabla 75. Constantes farmacocinéticas GLM Comercial 2° determinación ................... 147
Tabla 76. Constantes farmacocinéticas GLM Nanopartículas 1° determinación ............ 147
Tabla 77. Constantes farmacocinéticas GLM Nanopartículas 2° determinación ............ 148
Tabla 78. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Constante de absorción (Ka) ......... 148
Tabla 79. Análisis de Varianza (ADEVA) – Constante de absorción (Ka) ...................... 149
Tabla 80. Prueba de t – Constante de absorción (Ka) ................................................... 149
Tabla 81. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Constante de eliminación (Ke) ....... 150
Tabla 82. Análisis de Varianza (ADEVA) – Constante de eliminación (Ke) ................... 151
Tabla 83. Prueba de t – Constante de eliminación (Ke) ................................................ 151
Tabla 84. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Tiempo medio de eliminación (t ½ e)
...................................................................................................................................... 152
Tabla 85. Análisis de Varianza (ADEVA) – Tiempo medio de eliminación (t ½ e).......... 152
Tabla 86. Prueba de t – Tiempo medio de eliminación (t ½ e)....................................... 153
Tabla 87. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Tiempo máximo (t máx) ................. 153
Tabla 88. Análisis de Varianza (ADEVA) – Tiempo máximo (t máx).............................. 154
Tabla 89. Prueba de t – Tiempo máximo (t máx)........................................................... 154
Tabla 90. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Concentración máxima (C máx) ..... 155
Tabla 91. Análisis de Varianza (ADEVA) – Concentración máxima (C máx) ................. 155
Tabla 92. Prueba de t – Concentración máxima (C máx) .............................................. 156
Tabla 93. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Área bajo la curva (AUC) ............... 157
Tabla 94. Análisis de Varianza (ADEVA) – Área bajo la curva (AUC) ........................... 157
Tabla 95. Prueba de t – Área bajo la curva (AUC) ........................................................ 158
xix
LISTA DE ILUSTRACIONES
Ilustración 1. Clasificación de la Nanotecnología ..................................................................... 8
Ilustración 2. Nanoherramientas ............................................................................................... 11
Ilustración 3. Etapas de desarrollo de la Nanomedicina ....................................................... 12
Ilustración 4. Representación esquemática del desarrollo de una nanomedicina. ........... 18
Ilustración 5. Tecnología de fluidos supercríticos para la producción de nanopartículas 22
Ilustración 6. Sistema LADME ................................................................................................... 25
Ilustración 7. Ley de Fick ............................................................................................................ 28
Ilustración 8. Curva de Nivel Plasmático ................................................................................. 45
Ilustración 9. Estructura química de la glimepirida. ................................................................ 47
Ilustración 10. Cromatógrafo líquido de alta eficiencia HPLC .............................................. 52
Ilustración 11. Balanza analítica ............................................................................................... 72
Ilustración 12. Sistema HPLC................................................................................................... 73
Ilustración 13. Sistema HPLC .................................................................................................... 74
Ilustración 14. Agitador horizontal ........................................................................................... 74
Ilustración 15. Centrifuga ........................................................................................................... 74
Ilustración 16. Cámara de CO2 ................................................................................................ 75
Ilustración 17. Toma de pesos de las ratas. ........................................................................... 93
Ilustración 18. Administración intramuscular en rata ............................................................. 95
Ilustración 19. Obtención de muestra sanguínea del seno retro orbital de la rata ............ 95
Ilustración 20. Curva de nivel plasmático. Fase de absorción A-B-C. .............................. 100
Ilustración 21. Curva de nivel plasmático segmentada por trapecios ............................... 100
Ilustración 22. Glimepirida (10 µg/mL) en metanol. ............................................................. 102
Ilustración 23. Glimepirida con Glibenclamida como estándar interno (1 µg/mL). .......... 103
Ilustración 24. Cromatograma de pioglitazona (3 µg/mL) como estándar interno en
metanol. ........................................................................................................................................ 103
Ilustración 25. Cromatograma muestra Glimepirida con Pioglitazona como estándar
interno (Concentraciones: 12 µg/mL PGZ, 1 µg/mL GLM). .................................................. 104
Ilustración 26. Glimepirida con Pioglitazona (Concentraciones: 12 µg/mL PGZ, 1 µg/mL
GLM). Extracción éter:diclorometano (70:30). ........................................................................ 105
Ilustración 27. Glimepirida con Pioglitazona (Concentraciones: 3 µg/mL PGZ, 1 µg/mL
GLM). Extracción con éter (100 %). ......................................................................................... 105
Ilustración 28. Glimepirida con Pioglitazona (Concentraciones: 3 µg/mL PGZ, 1 µg/mL
GLM). Extracción por precipitación de proteínas con ACN. ................................................. 106
Ilustración 29. Cromatograma de muestra a las condiciones cromatográficas finales... 107
Ilustración 30. Linealidad del sistema. ................................................................................... 108
Ilustración 31. Selectividad del método. Blanco de plasma. .............................................. 109
Ilustración 32. Selectividad del método. Blanco de plasma con PGZ. .............................. 110
Ilustración 33. Selectividad del método. Fase móvil. ........................................................... 110
Ilustración 34. Selectividad del método. Metanol. ................................................................ 110
Ilustración 35. Selectividad del método. Sulfato de zinc. ................................................... 111
xx
Ilustración 36. Selectividad del método. Heparina. .............................................................. 111
Ilustración 37. Selectividad del método. S.I. Pioglitazona................................................... 111
Ilustración 38. Selectividad del método. Glimepirida. .......................................................... 112
Ilustración 39. Selectividad del método. Muestra de 800 ng/mL GLM + PGZ. ................ 112
Ilustración 40. Resultados de linealidad del método. ........................................................... 113
Ilustración 41. Curva de calibración primer día de análisis. ............................................... 132
Ilustración 42. Curva de calibración segundo día de análisis. ........................................... 133
Ilustración 43. Curva de nivel plasmático GLM comercial 1° determinación. .................. 137
Ilustración 44. Gráfica ln Conc. vs tiempo GLM comercial 1° determinación. ................. 138
Ilustración 45. Curva de nivel plasmático GLM comercial 2° determinación. .................. 139
Ilustración 46. Gráfica ln Conc. vs tiempo GLM comercial 2° determinación. ................. 139
Ilustración 47. Curva de nivel plasmático Nanopartículas de GLM 1° determinación. .. 140
Ilustración 48. Gráfica ln Conc. vs tiempo Nanopartículas de GLM 1° determinación. . 141
Ilustración 49. Curva de nivel plasmático Nanopartículas de GLM 2° determinación. .. 142
Ilustración 50. Gráfica ln Conc. Vs tiempo Nanopartículas de GLM 2° determinación. 142
Ilustración 51. Curva de nivel plasmático. Fase de absorción A-B-C. .............................. 143
LISTA DE ECUACIONES
Ecuación 1. Ley de Fick. Difusión pasiva ....................................................................... 29
Ecuación 2. Difusión por poros ....................................................................................... 30
Ecuación 3. Tiempo medio de eliminación ..................................................................... 99
Ecuación 4. Tiempo máximo .......................................................................................... 99
Ecuación 5. Concentración máxima ............................................................................... 99
Ecuación 6. Área de un trapecio .................................................................................. 101
Ecuación 7. Ecuación de Dost ...................................................................................... 101
xxi
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Tablas de la estructura del Diseño Completamente al Azar para nanopartículas
de GLM y GLM comercial. Primer día de análisis. ................................................................. 166
Anexo 2. Tablas de la estructura del Diseño Completamente al Azar para nanopartículas
de GLM y GLM comercial. Segundo día de análisis. ............................................................. 169
Anexo 3. Datos cromatográficos y de concentración de GLM comercial 1° determinación.
........................................................................................................................................................ 172
Anexo 4. Datos cromatográficos y de concentración de GLM comercial 2° determinación.
........................................................................................................................................................ 173
Anexo 5. Datos cromatográficos y de concentración de GLM Nanopartículas 1°
determinación ............................................................................................................................... 174
Anexo 6. Datos cromatográficos y de concentración de GLM Nanopartículas 2°
determinación ............................................................................................................................... 175
Anexo 7. Carta de aceptación Universidad Nacional Autónoma de México ..................... 176
Anexo 8. Cromatogramas de la 1° Determinación de GLM Comercial .............................. 177
Anexo 9. Cromatogramas de la 2° Determinación de GLM Comercial .............................. 179
Anexo 10. Cromatogramas de la 1° Determinación de GLM en nanopartículas .............. 181
Anexo 11. Cromatogramas de la 2° Determinación de GLM en nanopartículas .............. 183
Anexo 12. Traducción de Resumen Documental .................................................................. 185
Anexo 13. Diagrama de Flujo Desarrollo del Método Analítico ........................................... 186
Anexo 14. Diagrama de Flujo Validación del Método Analítico .......................................... 187
Anexo 15. Diagrama de Flujo Aplicación del Método Analítico ........................................... 188
xxii
RESUMEN DOCUMENTAL
Los estudios farmacocinéticos preclínicos permiten la evaluación de un medicamento en
desarrollo mediante la obtención de constantes farmacocinéticas que nos permiten
determinar la eficacia y seguridad del mismo tras la administración en animales de
experimentación previo a la evaluación clínica en pacientes, de manera que se logre la
disminución de posibles efectos tóxicos o letales que pueda causar el medicamento en
desarrollo.
La Glimepirida es un medicamento hipoglicemiante perteneciente al grupo de las
sulfonilureas de tercera generación que se utiliza en el tratamiento de la diabetes no
insulino-dependiente, la Industria Farmacéutica Mexicana Silanes desarrolló una
formulación de dicho medicamento en Nanopartículas para la cual no existen estudios
farmacocinéticos.
En el presente trabajo de tesis se desarrolló y validó un método para la cuantificación por
HPLC/UV de Glimepirida en plasma de rata y posteriormente se aplicó el método en un
estudio farmacocinético preclínico en el que se estableció un análisis comparativo entre
las constantes farmacocinéticas determinadas para la Glimepirida comercial y para la
Glimepirida en Nanopartículas.
Los resultados demostraron que no existe diferencia estadísticamente significativa entre
las constantes farmacocinéticas determinadas para las dos formulaciones motivo de
estudio, determinándose que a nivel farmacocinético las Nanopartículas desarrolladas y
la Glimepirida comercial son similares.
PALABRAS CLAVE: DESARROLLO, VALIDACIÓN, MÉTODO, CUANTIFICACIÓN,
NANOPARTÍCULAS, GLIMEPIRIDA, CONSTANTES FARMACOCINÉTICAS, ESTUDIO
FARMACOCINÉTICO PRECLÍNICO.
xxiii
ABSTRACT
Preclinical pharmacokinetic studies enable the evaluation of a developing drug through
the procurement of pharmacokinetic constants which allow us to determine the
effectiveness and safety of such drugs, achieved through the administration to
experimental animals before they are subject of clinical evaluation in patients; therefore
reducing the possible toxic or lethal side effects the drug may produce.
Glimepiride is a hypoglycemic drug which belongs to the group of third generation
sulphonylureas, used in the treatment of non-insulin dependent diabetes, The Mexican
Pharmaceutical Company Silanes developed a formulation of these drugs in
Nanoparticles, for which there is no supporting pharmacokinetic studies.
This graduation thesis study developed and validated a quantification method using
Glimepiride HPLC/UV in rat plasm, and subsequently applied the method in a preclinical
pharmacokinetic study in which a comparative analysis was established between the
pharmacokinetic constants determined for commercial Glimepiride and for Glimepiride in
Nanoparticles.
The results demonstrated that there is no statistically significant difference between the
pharmacokinetic constants determined for both formulations considered in this study,
therefore determining that on a pharmacokinetic level the developed Nanoparticles and
commercial Glimepiride are similar.
PALABRAS CLAVE: DEVELOPMENT, VALIDATION, METHOD, QUANTIFICATION,
NANOPARTICLES, GLIMEPIRIDE, PHARMACOKINETIC CONSTANTS, PRECLINICAL
PHARMACOKINETIC STUDY.
z
1
CAPÍTULO I
1.1. INTRODUCCIÓN
La simplicidad del entorno ha existido desde siempre, todo a nuestro alrededor está
compuesto por átomos y moléculas que son la base de toda estructura, sin embargo no
habíamos tenido con anterioridad los medios para poder explorar estos sistemas tan
pequeños de los cuales está compuesta toda materia.
Hoy en día esto es una realidad, con el apoyo de los microscopios electrónicos y equipo
de alta resolución el hombre ha sido capaz de adentrarse en este universo tan pequeño y
misterioso que conforma el origen de la vida misma, al cual se ha denominado “Mundo
Nano”, a partir de esto nace la era de la Nanotecnología, la cual abarca varios campos de
la investigación científica, tecnológica, industrial y financiera, generando productos
nanotecnológicos para un sinfín de aplicaciones, como, electrónica, metalúrgica,
construcción, alimentos, agroquímicos, cosméticos, medicamentos y demás.
Dentro de este conjunto de posibilidades se encuentran la Nanomedicina y la
Nanofarmacia, por medio de las cuales se busca aplicar esta gama de nuevos e
innovadores conocimientos en pro de satisfacer las necesidades de salud y vida
aceptable que el hombre ha buscado desde los inicios de la humanidad, para lo cual, el
enfoque va dirigido a tres áreas principales de desarrollo: el nanodiagnóstico, la liberación
dirigida y controlada de fármacos y la medicina regenerativa; siendo motivo del presente
estudio el área de liberación dirigida y controlada de fármacos.
Dentro de este contexto los estudios farmacocinéticos preclínicos de los medicamentos
desarrollados con nanotecnología se enfocan en el estudio del tránsito del fármaco en el
organismo vivo describiendo mediante modelos matemáticos los principales procesos
que ocurren tras la administración.
2
1.2. EL PROBLEMA
1.2.1. Planteamiento del Problema
De manera ideal se espera que el uso de medicamentos produzca un efecto beneficioso
para la salud sin causar riesgo alguno al paciente, sin embargo en la práctica esto no
ocurre ya que el uso de la mayoría de medicamentos produce un efecto benéfico y uno o
varios efectos secundarios.
Una de las preocupaciones más importantes de la industria farmacéutica se enfoca en la
producción de medicamentos seguros y eficaces así como la reducción al mínimo de los
efectos adversos causados tras la administración de fármacos.
Para esto, mediante la aplicación de la Nanotecnología, se busca la producción de
sistemas especializados de liberación de fármacos, que faciliten la acción farmacológica
del principio activo incorporándolo en un sistema que libere el fármaco de forma
controlada, tanto temporal como espacialmente, con acceso directo al sitio de acción, que
permanezca el tiempo que sea necesario para ejercer su acción terapéutica mejorando
su biodisponibilidad y potencial terapéutico y finalmente salga del organismo.
Los estudios farmacocinéticos preclínicos permiten evaluar el medicamento
nanoparticulado en desarrollo de manera que se obtengan constantes farmacocinéticas
que nos permitan determinar la eficacia y seguridad del mismo tras la administración en
animales de experimentación previo a la evaluación clínica en pacientes, de manera que
se logre la disminución de posibles efectos tóxicos o letales que pueda causar el
medicamento en desarrollo.
1.2.2. Formulación del Problema
No existen estudios farmacocinéticos de la formulación en nanopartículas de liberación
inmediata de Glimepirida ya que es un medicamento que se encuentra en fase de
desarrollo.
3
1.3. OBJETIVOS
1.3.1. Objetivo General
Realizar un estudio farmacocinético preclínico de una formulación en nanopartículas
de liberación inmediata a base Glimepirida.
1.3.2. Objetivos Específicos
Desarrollar un método analítico por HPLC para la cuantificación de Glimepirida en
plasma de rata
Validar la metodología analítica por HPLC para la cuantificación de Glimepirida en
plasma de rata.
Aplicar la metodología validada en el estudio farmacocinético preclínico de una
formulación de Glimepirida en nanopartículas de liberación inmediata.
Determinar y comparar los parámetros farmacocinéticos de la formulación de
nanopartículas de Glimepirida con los parámetros farmacocinéticos de la Glimepirida
comercial.
Analizar e Interpretar los resultados obtenidos para las dos formas farmacéuticas
1.4. IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN
La aplicación de la nanotecnología en la industria farmacéutica es de gran importancia
para la terapia farmacológica debido a la posibilidad de suministrar fármacos de bajo
peso molecular así como macromoléculas de manera localizada o dirigida, hacia un tejido
específico.
Por lo tanto la formulación de medicamentos en forma de nanopartículas representa una
nueva alternativa tecnológica capaz de mejorar la farmacocinética de muchos principios
activos, incluidos los péptidos, así como para mejorar la capacidad de estas sustancias
para atravesar las barreras biológicas de forma eficiente.
La importancia de realizar estudios farmacocinéticos preclínicos de un medicamento en
desarrollo radica en la necesidad de obtener información para evaluar de manera
preliminar la eficacia y seguridad de un fármaco y por medio de esto establecer si se
4
justifica continuar con la siguiente fase del proceso que son los estudios clínicos en
pacientes que por primera vez serán expuestos a nuevas formulaciones.
Así al igual que con cualquier medicina nueva el primer paso son los estudios preclínicos
farmacocinéticos y toxicológicos, donde se somete a la nueva formulación de
nanopartículas de Glimepirida a estudios en animales, para esto es importante desarrollar
y validar un método que nos permita cuantificar las concentraciones de fármaco en los
fluidos biológicos del animal para la obtención de las constantes farmacocinéticas.
Por lo tanto el propósito del presente estudio es la determinación de parámetros
farmacocinéticos para evaluar de manera preliminar, en animales de experimentación,
una formulación en nanopartículas de Glimepirida previa su evaluación en seres
humanos.
1.5. HIPÓTESIS (HO)
Los parámetros farmacocinéticos obtenidos para el medicamento nanopartículado de
Glimepirida son similares a los del medicamento de Glimepirida comercial.
5
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2.1. ANTECEDENTES
El nombre Nanotecnología aparece por primera vez el año de 1974 en un artículo
científico escrito por el Prof. Norio Taniguchi de la Universidad de Ciencias de Tokio, con
el siguiente título: “Nanotecnología consiste en el procedimiento de separación,
consolidación y deformación de materiales átomo por átomo o molécula por molécula”.
Sin embargo la tecnología a escala submicrónica surgió mucho antes en 1959 con el Dr.
Richard Feynman (Premio Nóbel de Física, 1965) quien en su famoso discurso del 29 de
Diciembre de 1959 titulado “There is plenty of room at the bottom” aseguraba que en un
futuro no muy lejano el hombre sería capaz de escribir los 24 tomos de la Enciclopedia
Británica en la punta de un alfiler, además observando el comportamiento de los
fenómenos naturales a escala nanométrica, concluyó que se podría manipular y controlar
objetos a escala molecular e incluso atómica.
El gran despertar de la nanotecnología comenzó en los años 80, a partir del desarrollo de
una amplia gama de microscopios de sonda de barrido, que logran imágenes a escala
atómica. (Alonso & Avendaño, 2006)
Los finlandeses dieron su gran colaboración a esta nueva ciencia cuando consiguieron
realizar un “proceso de camadas atómicas”. Este trabajo hizo que toda la comunidad
científica terminase por aceptar e instaurar definitivamente la nanotecnología como una
ciencia del futuro. Desde entonces el nombre Nanotecnología, viene siendo utilizado para
caracterizar los nuevos avances tecnológicos desenvueltos por la nanociencia, que tiene
por principio, controlar y manipular la materia en una escala menor que un micrómetro, es
decir, a nivel de átomos y moléculas. (Quintilli, 2012)
A partir de esto se han logrado un sinnúmero de importantes descubrimientos tales como
los nanotubos de carbono (NTC), nanobiosensores de excelentes propiedades
mecánicas y eléctricas, realizado en Japón por Sumio Iijima en 1991. Hoy existen cerca
de 3 mil productos generados con nanotecnología, la mayoría para usos industriales,
aunque las investigaciones más avanzadas se registran en el campo de la medicina y la
biología. (Cintas & M, 2006)
6
A nivel mundial los avances en Nanotecnología no solo representan una importante
contribución científica sino también una vía de inversión a la que actualmente muchos
países le apuntan, disponiendo una parte del presupuesto para este fin.
A este respecto, las inversiones públicas millonarias en Nanotecnología realizadas por
EE.UU., Japón, China y Europa ponen de manifiesto que la investigación del
“nanomundo” es considerada una macroárea estratégica por las potencias mundiales.
(Cintas & M, 2006)
Además, según se desprende de un estudio realizado por la Organización para la
Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE) y Allianz Group, el mercado de la
Nanotecnología generará en 2014 unos ingresos de 2,6 billones de dólares en todo el
mundo. (Euroresidentes.com)
Por otro lado, en América del norte, específicamente el gobierno canadiense invirtió
aproximadamente 32 millones de dólares canadienses en nanomedicina entre 2000 y
2006 a través de los institutos canadienses de investigación en salud, de igual manera en
EE.UU. se encuentran en comercialización (algunos de venta sin prescripción)
medicamentos desarrollados a base de nanotecnología.
La llamada explosión farmacológica posterior a la Segunda Guerra Mundial dió lugar, en
los años 70 a 90, a grandes avances en el tratamiento de enfermedades que antes eran
inexorablemente mortales o incapacitantes.
Este fenómeno de renovación tecnológica no se ha limitado a la terapéutica
farmacológica, sino también en otros campos de la medicina, este proceso no ha estado
exento de accidentes, por efectos adversos no detectados oportunamente, como los
atribuidos a la Talidomida a principios de los años 60.
Desde entonces la preocupación por la seguridad de los medicamentos ha contribuido al
desarrollo y aplicación de métodos clínicos y epidemiológicos para evaluar los beneficios
y los riesgos potenciales de cualquier tipo de intervención terapéutica, ya sea
farmacológica o no.
A partir de esto la farmacocinética se ha consolidado durante los últimos 30 años como
una disciplina de gran interés sanitario, cuya aplicación se centra en 2 áreas
7
principalmente: desarrollo de nuevos medicamentos y la optimización de regímenes de
dosificación de los tratamientos farmacológicos. (García, 2001)
En México el Plan Nacional de Desarrollo 2007-2012 considera a la nanotecnología como
sector estratégico y como tecnología precursora porque tiene una fuerte incidencia sobre
el desarrollo de muchas actividades productivas y porque se prevé que en el futuro su
utilización será determinante para el desarrollo en diversas áreas industriales influyendo
en la competitividad y productividad del país.
El presente es un proyecto INNOVA, Conacyt- Silanes, siendo esta última la empresa que
está desarrollando el medicamento y por lo tanto apoya económicamente la realización
del mismo para completar una línea prioritaria de fármacos ya que existe una demanda
de mercado no cubierta y la empresa tiene ya una presencia y canales de
comercialización en esta área de productos. (Información proporcionada por la Dra. Inés
Fuentes de la UNAM)
2.2. FUNDAMENTO TEÓRICO
2.2.1. NANOTECNOLOGÍA
“…El gran auge de las nanotecnologías aplicadas en el campo de la salud humana a lo
largo de la historia ha hecho [...] re-surgir en el imaginario colectivo, el sueño del dominio
técnico sobre la vida y la muerte...”.
(Barona Vilar, 2004).
2.2.1.1. Definición
La nanotecnología es la ciencia capaz de manipular directamente los átomos con el
objetivo de construir estructuras a escala nanométrica que puedan ejercer funciones
específicas, por lo tanto la nanotecnología se define como “la investigación científica y el
desarrollo tecnológico que permiten entender, a nivel atómico y molecular, todos los
fenómenos que ocurren en la nanoescala, con el fin de utilizar este conocimiento para
crear estructuras, materiales, dispositivos y sistemas de complejidad creciente que
posean nuevas propiedades y realicen nuevas funciones debido al pequeño tamaño de
sus componentes”. (Serena & Pedro, 2010)
8
2.2.1.2. Clasificación
La especificidad que caracteriza los campos de aplicación de la tecnología a escala nano
dependen directamente de las formas, procedimientos y fines para los que se da la
manipulación de la materia en la escala nano.
Con la intención de delimitar de forma específica cada uno de los campos de aplicación
nanoescalar, se plantea una clasificación particular a la nanotecnología, que la tipifica de
acuerdo al medio en el que se desarrolla y bajo el fin particular de cada campo de
aplicación:
Ilustración 1. Clasificación de la Nanotecnología Fuente. Cuadro adaptado de http://dawnanotecnologia.blogspot.com/
a. Según el medio en el que se desarrolla
HUMEDA
La nanotecnología húmeda va dirigida al desarrollo de sistemas biológicos para la
manipulación de material genético, membranas, enzimas y componentes celulares y todo
sistema que necesite un medio acuoso. También se basan en organismos vivientes
cuyas formas, funciones y evolución, son gobernados por las interacciones de estructuras
de escalas nanométricas.
CLASIFICACION DE LA NANOTECNOLOGÍA
Según el medio en que se desarrolla
Humeda
Seca
Según la técnica de aplicación
Bottom up
Top down
Computacional
9
SECA
Derivada de la ciencia de superficies y la físicoquímica, la nanotecnología seca se centra
en la fabricación de estructuras de carbón (por ejemplo fullerenos y nanotubos), silicio y
otros materiales inorgánicos. Permite el uso de metales y semiconductores, que poseen
electrones que proporcionan las propiedades físicas que resultan interesantes para
aparatos electrónicos, magnéticos y ópticos.
En el lenguaje de difusión, "Nanotecnología seca" se emplea frecuentemente al referirse
al diseño de dispositivos mecánicos diminutos pero tradicionales con pequeñas
cantidades de átomos.
b. Según la Técnica de Aplicación
BUTTON UP
Nanotecnología molecular, se centra en la construcción de estructuras y objetos a partir
de sus componentes atómicos y moleculares; este tipo de nanotecnología es acogida
como el enfoque principal de la nanotecnología ya que ha de permitir que la materia
pueda controlarse de manera precisa.
TOP DOWN
Se trata de diseñar y miniaturizar el tamaño de estructuras para obtener a nanoescala
sistemas funcionales, algunas de sus aplicaciones se presentan de forma clara en la
producción de nano electrónica (miniaturización de sistemas electrónicos a nano escala).
Dentro de las categorías de arriba hacia abajo y de abajo hacia arriba, hay un número
creciente de nuevos procesos que permiten la nanofabricación, entre ellas se encuentran:
- Deposición de vapor químico es un proceso en el que los productos químicos
reaccionan para producir películas de alto rendimiento muy puras.
- Epitaxia de haz molecular que es un método para depositar películas finas
altamente controladas.
10
- Epitaxia capa atómica es un proceso para depositar capas de un átomo de
espesor sobre una superficie.
- Dip pluma litografía es un proceso en el que la punta de un microscopio de
fuerza atómica se " sumerge " en un fluido químico y luego se usa para "escribir "
sobre una superficie, como una vieja pluma de tinta sobre el papel de moda.
- Litografía por nanoimpresión es un proceso para crear características a
nanoescala por " estampar " o " impresión " que sobre una superficie.
- Procesamiento de rollo a rollo es un proceso de alto volumen de producción de
dispositivos a nanoescala en un rollo de plástico o de metal ultrafino.
- El autoensamblaje describe el proceso en el que un grupo de componentes se
unen para formar una estructura ordenada sin dirección fuera.
COMPUTACIONAL
Con esta rama se puede trabajar en el modelado y simulación de estructuras complejas
de escala nanométrica. Se puede manipular átomos utilizando los nanomanipuladores
controlados por computadoras.
Analizando en detalle la cadena de valor implícita en el desarrollo de la nanotecnología,
se puede identificar los siguientes eslabones:
a. Nanomateriales: estructuras de la materia desarrolladas artificialmente con
dimensiones inferiores a los 100 nanómetros que exhiben propiedades
dependientes del tamaño y que han sido mínimamente procesadas.
Por ejemplo: nanopartículas; nanotubos; puntos cuánticos; fulerenos; dendrímeros y
materiales nanoporosos.
b. Nanointermediarios: productos intermedios que no caen en la categoría de
nanomateriales ni de productos de consumo final, que incorporan nanomateriales
o que han sido construidos con características nanométricas: revestimientos;
11
tejidos; memorias y chips lógicos; componentes ópticos; materiales ortopédicos;
entre otros.
c. Productos nanoenriquecidos: productos del final de la cadena de valor que
incorporan nanomateriales o nanointermediarios: autos; vestimenta; aviones;
computadoras; dispositivos electrónicos; alimentos procesados; productos
farmacéuticos; etc.
d. Nanoherramientas: instrumentos técnicos y software utilizados para visualizar,
manipular y modelar la materia a escala nanométrica. Por ejemplo: microscopios
de fuerza atómica; nanomanipuladores y equipamiento de nanolitografía.
Ilustración 2. Nanoherramientas Elaborado por: Wendy Chávez (2014)
Fuente: Cuadro adaptado de http://dawnanotecnologia.blogspot.com/
2.2.2. NANOMEDICINA
2.2.2.1. Definición
La Nanomedicina denota a la ciencia y a la tecnología que se ocupan de diagnosticar,
tratar y prevenir enfermedades y lesiones traumáticas mediante la aplicación de los
resultados obtenidos en la Nanociencia y Nanotecnología.
Con los dispositivos, estructuras, medicamentos, compuestos, etc., utilizándolos como
herramientas moleculares, la nanomedicina busca aliviar el dolor o preservar y mejorar la
salud humana. (Sancén, 2010)
12
El desarrollo de la nanomedicina se puede ubicar en periodos de tiempo que van desde
lo ya logrado y que está en uso, hasta las previsiones más difíciles siquiera de imaginar,
pero en cuya dirección ya se está trabajando, como podemos observar en el siguiente
cuadro de tiempo.
Ilustración 3. Etapas de desarrollo de la Nanomedicina Fuente: Revista Interdisciplinaria en Nanociencia y Nanotecnología Nano Mundo, Vol 3, 2010.
2.2.2.2. Aplicaciones
La Nanomedicina aplicada abarca una gran cantidad de posibilidades, se considera que
dentro de las aplicaciones de la Nanociencia y la Nanotecnología (NyN), la Nanomedicina
es una de las principales ramas de desarrollo, investigación y aplicación, sin embargo en
el presente trabajo consideraremos las 5 principales subdisciplinas:
a. Herramientas de análisis (Nanodiagnóstico)
b. Nano-imagen
c. Nanomateriales y nanodispositivos
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d. Nuevos sistemas terapéuticos y suministros de medicamentos
e. Aspectos clínicos, regulatorios y toxicológicos
2.2.2.3. Nanodiagnóstico
Las actuales pruebas de diagnóstico basadas en nanodispositivos están haciendo que el
diagnóstico sea realizado en la etapa presintomática de cualquier posible enfermedad.
Esto permitirá la introducción de medidas terapéuticas previas sin necesidad de utilizar
métodos curativos o de extracción, tal como sucede en la actualidad. En efecto, los
sistemas de diagnóstico basados en las nanotecnologías tendrán mayor eficiencia en
términos de resolución, sensibilidad, especificidad, confiabilidad, reproducibilidad e
integración, además de su disposición casi inmediata y permanente.
2.2.2.4. Nano-imagen
Las nuevas técnicas de diagnóstico basadas en las nanotecnologías que utilizan la
imagenología proporcionan información más precisa que las actuales vinculadas con la
imagen del organismo para detectar enfermedades.
En efecto, la imagenología derivada de la nanotecnología ofrece mejores resultados que
la tomografía, la resonancia magnética, o el ultrasonido, etc., actualmente en uso. Se
sabe, por ejemplo, que los óxidos de acero súperparamagnéticos con un diámetro menor
a 5 nanómetros, permite obtener imágenes nítidas su utilización ha sido exitosa para
detectar metástasis en su etapa inicial.
2.2.2.5. Nanomateriales y nanodispositivos
Las nanotecnologías aplicadas a los biomateriales mejoran los resultados actuales
obtenidos con base en aleaciones metálicas, cerámicas, polímeros, y compuestos. Los
nanobiomateriales permiten comprender e imitar las estructuras y rutas bioquímicas que
guían a la cicatrización natural, para inducir y apoyar la cicatrización más allá de las
capacidades normales.
Se trabaja también para obtener mejores propiedades mecánicas y compatibilidad
biológica en las prótesis e implantes dentales, catéteres, vendajes, y en todo el
instrumental médico.
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2.2.2.6. Sistemas terapéuticos y suministros de medicamentos
El suministro de fármacos es y será una de las más importantes aplicaciones de las
nanotecnologías a la medicina. Los fármacos incorporados a nanotransportadores
permiten mejorar su especificidad y su eficacia. Los nanofármacos se caracterizan por su
complejidad, y pueden hacer llegar moléculas curativas específicamente al sitio donde se
requieren atravesando las barreras biológicas que todo organismo posee. Al mismo
tiempo, pueden contener reactivos específicos, como anticuerpos que alcanzan objetivos
predefinidos como moléculas cancerígenas o células inflamadas y, una vez alcanzado su
objetivo, se desintegrarán ahí mismo. Esto hará posible también otras formas de terapia,
como la termoterapia que consiste en dotar de dispositivos a las nanopartículas para que
ellas mismas se alojen en células malignas y luego sean calentadas localmente mediante
radiaciones dirigidas especialmente a esos dispositivos para obtener efectos particulares
en la quimioterapia o la radiación.
Liberación dirigida y controlada de fármacos:
Los tratamientos habilitados con nanotecnología podrán ser dispositivos multifuncionales
capaces de detectar e identificar enfermedades particulares a nivel celular y, en el
momento propicio, suministrar la droga correcta en la dosis correcta, confeccionando el
tratamiento según el paciente individual, con información, en tiempo real; de tal modo que
se evalúe el estado de la enfermedad.
Medicina regenerativa
Además de las terapias antes y después del diagnóstico que actualmente se desarrollan
en las NyN, se trabaja en la medicina regenerativa mediante la activación de genes que
estimulan la regeneración de tejidos, con la producción de nanomembranas
biocompatibles; mediante el mejoramiento en el funcionamiento y duración de prótesis
neuronales, y mediante la creación de un nuevo linfocito que restablece la respuesta
inmune normal en el paciente. Además de esto, la manipulación de las relaciones
biológicas a escala nanométrica incrementará sensiblemente la funcionalidad y
longevidad de tejidos implantados. También las nanotecnologías se están desarrollando
en el campo de la terapia con células madre y esto ofrece posibilidades alentadoras para
la regeneración de tejidos dañados. Una aplicación nanotecnológica en el caso de los
implantes es la utilización de nanodispositivos electrónicos.
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Específicamente en el campo de la visión, se están utilizando dichos dispositivos en el ojo
en forma de nanovideocámara cuyas señales serán procesadas por una
microcomputadora que a su vez transmitirá la señal a una red de electrodos ubicados en
el ojo. Con esto se logrará restaurar la visión en los invidentes. Lo mismo se está
desarrollando para el caso de la audición
2.2.2.7. Aspectos clínicos, regulatorios y toxicológicos
La medicina no es la única forma en que se utilizan los avances obtenidos por las NyN.
Sus resultados se emplean en una amplia gama de aplicaciones que van desde la
industria automotriz hasta los textiles y cosméticos, pasando por los aparatos de la
electrónica, con frecuencia utilizados para diferentes diagnósticos y mediciones. Aunque
la mayor parte de las aplicaciones de las NyN no se ubican en la medicina, el uso de los
nanomateriales puede traer consecuencias a la salud si se dispersan en el entorno. En
estudios realizados en animales para detectar la presencia y la fuerza de las
nanopartículas en células, se ha demostrado la presencia de algunos efectos tóxicos
derivados de la presencia de nanopartículas en las células. Se sabe también que los
efectos de las nanopartículas en el cuerpo humano provenientes del entorno, pueden
tener efectos diferentes a las partículas normales que se encuentran en el medio
ambiente.
En consecuencia, las repercusiones tóxicas de la nanotecnología proyectan la necesidad
de ser contemplada como parte de la nanomedicina, y dado que esto entraña la
responsabilidad para cuidar, normar y desarrollar condiciones que la controlen, la
toxicología es un punto de unión de la nanomedicina con la ética. (Sancén, 2010)
2.2.3. NANOFARMACIA
Cuando un compuesto farmacéutico es formulado como nanopartícula, éste existe en una
escala más cercana a la escala en que ocurren los procesos biológicos y de esta manera
aumenta su nivel de disponibilidad biológica permitiendo que el cuerpo lo absorba más
pronto y fácil y como tal utilizarlo más eficazmente.
El nivel de disponibilidad biológica de una droga es uno de los elementos importantes
para determinar su eficacia.
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Las industrias farmacéuticas confían en sus formulaciones nanoparticuladas para mejorar
el valor terapéutico de “drogas de bajo desempeño”, pero también buscan mejorar sus
ganancias.
Es posible que viejos medicamentos, que ya no están en el mercado por su baja eficacia
o por sus efectos colaterales potencialmente adversos en ciertas poblaciones de
pacientes, puedan hacerse más eficaces o más seguros si se reformulan
nanoscópicamente, lo que reduciría significativamente el costo del proceso de desarrollo
de medicamentos. Las compañías farmacéuticas ya sacan ventaja de la expansión de la
protección de sus patentes, algo que es posible mediante sus formulaciones
nanoparticuladas. (Hermida, 2008)
2.2.3.1. Definición
Se define a la nanofarmacia como la aplicación de la nanotecnología para la prevención,
diagnóstico y tratamiento de enfermedades con el propósito de mejorar la salud y el
funcionamiento del cuerpo humano y otros sistemas vivos.
Las aplicaciones de la nanofarmacia incluirían el descubrimiento de nuevos agentes
farmacéuticos, el desarrollo de sistemas de liberación de fármacos con localización o
direccionamiento específico; además de la creación de “laboratorios en un chip” que
desempeñen múltiples funciones in Vitro e in Vivo así como implantes y plataformas para
tejidos. (Villafuerte, 2013)
2.2.3.2. Importancia
La importancia de la nanotecnología farmacéutica para la terapia con fármacos reside en
la posibilidad de suministrar tanto fármacos de bajo peso molecular así como
macromoléculas como los péptidos, proteínas y genes, de manera localizada o dirigida,
hacia un cierto tejido de interés. (Villafuerte, 2013)
La nanotecnología farmacéutica se enfoca al desarrollo de formulaciones de agentes
terapéuticos en nano-complejos biocompatibles entre los que se cuentan las nano-
partículas, las nano-cápsulas, los sistemas micelares, los dendrímeros, los fulerenos o
nanoestructuras de carbono, las huellas cuánticas, los nanocomponentes derivados de la
bioimitación o biomimética y los productos conjugados derivados de los anteriores. Estos
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sistemas se podrían utilizar para dar dirección al suministro de los fármacos, hacia un tipo
de células o tejido específicos.
También se podrían utilizar para mejorar la biodisponibilidad oral, para sostener el efecto
de fármacos o genes en un tejido seleccionado, para solubilizar fármacos para una
administración intravascular, y para mejorar la estabilidad de los agentes terapéuticos
contra la degradación enzimática de las nucleasas y proteasas, especialmente en el caso
de los fármacos en forma de proteínas, péptidos y ácidos nucleicos.
2.2.3.3. Aplicaciones
Entre las principales aplicaciones y líneas de estudio e investigación que se atribuyen a la
nanofarmacia se describen las siguientes:
El diseño de materiales estructurados, multifuncionales, capaces de atacar
enfermedades específicas.
El diseño de materiales conteniendo funciones que permitan el transporte a través
de las barreras biológicas.
El diseño de plataformas nanoestructuradas para la ingeniería de tejidos.
El diseño de dispositivos sensibles a estímulos para la liberación de fármacos.
El diseño de tratamientos orientados físicamente para la administración local de
productos terapéuticos (Vía pulmón, ojo o piel).
Transportadores de fármacos y sistemas de liberación de genes,
supramoleculares autoensamblables.
Nanopartículas y nanocápsulas.
Tecnologías de anticuerpos.
Conjugados de polímero-fármaco.
Conjugados de polímero-proteína y anticuerpo.
Nanoprecipitación y nanocristales.
Tecnologías de emulsificación.
Tecnología de los liposomas.
Polimerización in situ.
Reparación e ingeniería de los tejidos.
Tecnologías con dendrímeros.
Impresión molecular.
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2.2.4. NANOPARTÍCULAS
2.2.4.1. Definición
Se denomina Nanopartículas a todas aquellas partículas que cuyo rango de tamaño está
comprendido entre 1 – 100 nanómetros (nm).
2.2.4.2. Métodos de elaboración de nanopartículas
Los nanosistemas se sintetizan en el laboratorio usando diferentes técnicas que varían
significativamente de un caso a otro.
Por lo tanto, se hace necesario entender el método de producción de estos nanosistemas
y las cuestiones a gran escala de los diversos sistemas diseñados para llevar a cabo las
aplicaciones biomédicas específicas.
Ilustración 4. Representación esquemática del desarrollo de una nanomedicina. Fuente: (Paliwal, Babu, & Palakurthi, 2014)
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2.2.4.2.1. Nanopartículas Poliméricas
2.2.4.2.1.1. Nanocristalización
La nanocristalización convierte directamente medicamentos pobremente solubles en
agua en nanopartículas con propiedades físicas alteradas.
Varias formulaciones desarrolladas por el método de nanocristalización están disponibles
en el mercado, incluyendo aprepitant, fenofibrato, y sirolimus. La nanopartícula puede ser
cristalino o amorfa, dependiendo de la producción, la tecnología y el procesamiento del
material.
Los nanocristales de medicamentos son desarrollados por tres enfoques, es decir, la
precipitación, métodos de homogeneización (tales como la tecnología microfluidizador), y
fresado. (Paliwal, Babu, & Palakurthi, 2014)
a. Nanoprecipitación
Es una técnica sencilla que generalmente se adopta para los polímeros preformados,
brevemente, el polímero se disuelve en un disolvente orgánico miscible en agua y el
disolvente se difunde a continuación en el medio acuoso en presencia de un tensioactivo,
que conduce a la formación instantánea de una suspensión coloidal. Esto también se
conoce como técnica de desplazamiento del disolvente.
El método es útil para la preparación de nanocápsulas, que es un tipo de nanosistemas
de depósito.
Una alta carga útil de fármaco se puede lograr utilizando esta técnica en nanocápsulas;
sin embargo, su utilidad se limita a disolventes miscibles en agua (mejor para la
encapsulación del fármaco lipofílico) y no se pueden adoptar para disolventes inmiscibles
en agua (ineficiente encapsular fármacos hidrofílicos).
Los factores de control para el método de nanoprecipitación son cinéticas de nucleación y
crecimiento, que definen el tamaño y la distribución final del tamaño de la partícula. Del
mismo modo, la fase de la droga en forma de nanopartículas (es decir, cristalina o
amorfa) tiene importantes impacto en la estabilidad y la biodisponibilidad in vivo. (Paliwal,
Babu, & Palakurthi, 2014)
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b. Tecnología de Microfluidizador
Es bastante reciente y una de las tecnologías más emergentes adoptada para la
producción de nanopartículas (Microfluidizer®, Microfluídica Inc.). Una colisión frontal se
produce entre dos fluidos bajo condiciones de alta presión (hasta 1700 bar). Durante la
colisión de los fluidos, muchos cambios se llevan a cabo simultáneamente, tales como
fuerzas de cizallamiento y las fuerzas de cavitación.
Para estabilizar las nanopartículas desarrolladas, se añaden los tensioactivos en la
solución. Con el fin de obtener el tamaño deseado de las nanopartículas, son necesarios
varios ciclos (pueden variar de 50 a incluso 100) y esta es la limitación de este método.
Esta tecnología ofrece un número de ventajas sobre métodos más tradicionales de
preparación de liposomas, tales como extrusión y sonicación.
El enfoque hidrodinámico de los microfluidos se ha utilizado para sintetizar nanopartículas
y vesículas de varios lípidos. (Paliwal, Babu, & Palakurthi, 2014)
c. Método de fresado.
La molienda es un proceso tradicional de producción de nanocristales, esta tecnología
NanoCrystals® emplea en general, una perla o un molino de perlas a fin de obtener
nanopartículas de fármaco.
Uno puede desarrollar suspensiones ultrafinas de drogas usando un molino de bolas, el
principio de la reducción de tamaño es la generación de fuerzas de cizalla de impacto de
los medios de molienda, que conduce a nanopartículas.
Los factores que afectan el tamaño y la estabilidad física de las nanopartículas incluyen
medios de molienda, el medio de dispersión y el estabilizador.
Sin embargo, las posibilidades de contaminación del producto por la erosión del material
de molienda, un comparativamente largo tiempo de molienda en el caso de fármacos
cristalinos, son algunas de las características desfavorables de esta técnica. (Paliwal,
Babu, & Palakurthi, 2014)
21
2.2.4.2.1.2. Extrusión
La conversión de fármacos hidrófobos directamente en nanopartículas es un método
escalable y menos costoso. La extrusión manual utilizando jeringas herméticas de gas y
membranas de policarbonato es una técnica común, sin embargo, se puede desarrollar la
heterogeneidad especialmente cuando uno utiliza tamaños de poro de menos de 100 nm,
esto sucede debido a la variabilidad de la presión manual aplicada cada vez.
Recientemente, Guo et al., informó de un método de extrusión de membrana nanoporosa
para la producción de nanopartículas de medicamentos hidrófobos. Este método induce
la precipitación de nanopartículas fármaco-cargadas en las salidas de nanoporos.
Khinast et al. ha reportado un proceso novedoso de un solo paso para la conversión de
una nano-suspensión líquida estabilizada en una formulación sólida a través de la
extrusión de fusión en caliente combinado con un proceso de desvolatilización interna.
En este proceso, el polímero se alimenta a la extrusora y se deja fundir, posteriormente,
se añade una nano-suspensión estable a este a través de dispositivos de alimentación
secundarios, el agua se elimina por desvolatilización y se obtiene el polímero solidificado.
(Paliwal, Babu, & Palakurthi, 2014)
2.2.4.2.1.3. Tecnología de fluidos supercríticos
Una de las técnicas más prometedoras de la producción de nanopartículas es la
tecnología de fluidos supercríticos (SCF). Condiciones de temperatura suave y evitar el
uso de disolventes orgánicos en la producción de nanopartículas poliméricas son claros
beneficios de esta técnica sobre los demás. La presión y la temperatura son
simultáneamente más alta que aquellos en el punto crítico. SCF se puede utilizar para
diversos fines en la producción de nanopartículas como sigue:
solvente: rápida expansión en el proceso de soluciones supercriticas;
agente de hinchazón y plastificación: gas saturado en el proceso de soluciones;
antidisolvente: gas antidisolvente o antidisolvente supercrítico de proceso
un disolvente para la polimerización en medios disperos.
22
Con el fin de obtener las propiedades deseadas de nanopartículas tales como el tamaño
y distribución de tamaño, morfología, estructura de núcleo interno, y la concentración de
disolvente residual mínima, este método es el más adecuado.
La característica notable de la técnica de SCF es que las partículas tienen superficies
lisas, pequeño tamaño de partícula, buena distribución y flujo libre. Sin embargo, el pobre
poder disolvente del CO2, el costo y el uso de gran cantidad de CO2 son algunas de sus
limitaciones. (Paliwal, Babu, & Palakurthi, 2014)
En la figura 5 podemos observar que tanto el fármaco y el polímero (ejemplo: celulosa
microcristalina) se procesan juntos para lograr la estabilidad de las nanopartículas.
Ilustración 5. Tecnología de fluidos supercríticos para la producción de nanopartículas Fuente: (Paliwal, Babu, & Palakurthi, 2014)
2.2.4.2.2. Nanopartículas Lipídicas
2.2.4.2.2.1. Homogeneización a alta presión
La homogeneización a alta presión se puede clasificar en dos partes: homogeneización
en caliente y homogeneización en frío.
a. Homogeneización caliente
Esta se lleva a cabo a temperatura por encima del punto de fusión de los lípido y se
aplica a fármacos lipófilos.
23
Los lípidos cargados con las drogas (en forma fundida) y la fase acuosa se mezclan por
medio de un mezclador de alto cizallamiento, manteniendo a ambos a la misma
temperatura.
Es importante tener en cuenta que la forma final de las nanopartículas depende en gran
medida de la calidad de la pre-emulsión que a menudo es una nanoemulsión.
La fase dispersa en la nanoemulsión se congela tras el enfriamiento a temperatura
ambiente generando la formación de las nanopartículas lipídicas, pero este método no es
adecuado para medicamentos termolábiles.
b. Homogenización en frío
Este es un tipo de molienda de alta presión de la suspensión en la que los lípidos con el
fármaco se funden y se solidifican rápidamente para obtener las micropartículas lipídicas.
Las micropartículas se procesan posteriormente mediante la agitación a alta velocidad en
un surfactante acuoso frío, seguido de homogeneización por debajo de la temperatura
ambiente para convertirlas en nanopartículas. (Paliwal, Babu, & Palakurthi, 2014)
2.2.4.2.2.2. Microemulsiones
Las nanopartículas lipídicas se obtienen de una microemulsión caliente, a base de
lípidos de bajo punto de fusión, un emulsionante, un co-tensioactivo y agua.
A la microemulsión se añade exceso de agua fría con agitación que resulta en la
precipitación de la fase lipídica generando las nanopartículas.
Posteriormente, el exceso de agua se elimina por un método adecuado como
ultrafiltración o liofilización.
La característica notable de este método es que las nanopartículas pueden ser
producidas sin la necesidad de suministrar energía y por lo tanto es adecuado para
cargar medicamentos termolábiles en nanopartículas lipídicas. (Paliwal, Babu, &
Palakurthi, 2014)
24
2.2.4.2.2.3. Membrana de contacto
Se utiliza para la producción a gran escala de nanopartículas lipídicas, para esto se pasa
un lípido fundido a través de una membrana porosa que permite la formación de gotitas
nanométricas, en el interior del módulo de membrana, la fase acuosa se distribuye
barriendo la gota lejos de los puntos de salida de los poros, así las gotitas se enfrían lo
suficiente para conseguir solidificarse.
Factores como la temperatura tanto de la fase acuosa como de la fase lipídica, la
velocidad de flujo transversal de la fase acuosa, la presión de la fase lipídica y el tamaño
de poro de la membrana, determinan el tamaño de partícula de las nanopartículas
lipídicas.
Las características ventajosas de este método incluyen el uso de un aparato simple,
control sobre el tamaño de las nanopartículas mediante una cuidadosa selección de los
parámetros del proceso, y la ampliación de factibilidades.
2.2.4.2.2.4. Ultrasonidos
El tamaño de las nanopartículas puede controlarse variando la frecuencia y la intensidad
de ultrasonidos. Por otra parte, una combinación de agitación a alta velocidad y
ultrasonidos en mayor temperatura también puede se puede aplicar. Sin embargo, el
tamaño de partícula es una limitación importante junto con la contaminación potencial de
metal resultante de la sonda de sonicación. (Paliwal, Babu, & Palakurthi, 2014)
2.2.4.3. Control de calidad de nanopartículas
El tamaño, forma, morfología, distribución de tamaño y la funcionalidad de las
nanopartículas desarrolladas son los parámetros clave para sus aplicaciones biomédicas
eficaces, tales características deseadas deben ser reproducibles y escalables.
Se requiere un perfil de liberación del fármaco de nanopartículas reproducible para
establecer la uniformidad lote a lote y un rendimiento de calidad in vitro e in vivo.
En la actualidad, existen muy pocos datos disponibles para establecer los parámetros de
importancia crítica de control de calidad, incluso, hasta la fecha, el método de liberación
del fármaco no está establecido oficialmente y disponible para su evaluación.
25
Los métodos convencionales de disolución (oficiales establecidos para formas de
dosificación sólidas), tales como paleta o método de la cesta se utilizan generalmente.
El método de diálisis también se utiliza para estimar la liberación de fármaco de
nanopartículas de rotación; sin embargo, estos métodos necesitan validación.
A pesar de los importantes avances en la ciencia médica y la industria farmacéutica, la
selección del método y el material se ve afectada por las demandas del mercado
también.
Uno de los aspectos importantes para el aumento de la producción a gran escala de las
nanopartículas es el costo del producto acabado y también el mercado consumible.
(Paliwal, Babu, & Palakurthi, 2014)
2.2.5. PROCESOS FARMACOCINÉTICOS. SISTEMA LADME
El sistema LADME está constituido por una serie de etapas que sigue el fármaco en el
proceso de incorporación al organismo para llegar a ejercer su acción farmacológica,
profiláctica o de diagnóstico.
Ilustración 6. Sistema LADME
Fuente: (Betés de Toro, 2008)
2.2.5.1. Liberación
Todos los fármacos que se administran al organismo están contenidos en una forma
farmacéutica específica que permite la disposición individualizada de las sustancias
26
medicamentosas y facilita su administración, en base a lo anterior podemos entender a la
liberación como el proceso por el cual el fármaco se libera de la forma farmacéutica que
lo contiene y queda disponible para su absorción.
El proceso de liberación está constituido por 3 etapas:
a. Disgregación de la forma farmacéutica. En esta etapa el comprimido se
disgrega, convirtiéndose en gránulos pudiendo disgregarse aún más
(microdisgregación) hasta polvos y cristales.
En la formulación de comprimidos es importante la adición de un desintegrante para
facilitar este proceso, cuya acción se produce por la penetración de agua en forma capilar
que genera un hinchamiento de las moléculas de desintegrante facilitando la disgregación
de la forma farmacéutica para que de esta manera se incremente la superficie de
contacto con el medio de disolución.
b. Disolución del Principio Activo (PA). Es el subproceso más importante de la
liberación ya que puede ser un factor limitante en la absorción del fármaco el cual
debe estar disuelto en los fluidos acosos del lugar de absorción.
Cuanto mayor es la superficie que puede alcanzar el PA después de haberse disgregado,
mayor es la disolución. Los polvos y cristales son los que se disuelven más rápido (polvos
> gránulos > comprimidos).
Esta etapa es la más importante ya que ningún fármaco está en disposición de
absorberse si no se ha disuelto previamente.
c. Difusión del principio activo. La difusión consiste en llevar los componentes
hasta la membrana absorbente, pero no la atraviesan, lo que ocurre es un proceso
de absorción basado en la naturaleza del compuesto y su afinidad con los
componentes de la membrana.
Este proceso no se considera que influya directamente en la absorción ya que si el
fármaco esta disuelto difunde fácilmente a través de la membrana.
La difusión influye cuando en la formulación hay sustancias viscosantes o cuando se
administra con sustancias ricas en grasa.
27
2.2.5.2. Absorción
La absorción estudia la entrada de los fármacos en el organismo desde el lugar donde se
depositan cuando se administran. (Lorenzo, 2008)
El proceso de absorción consiste en la entrada del fármaco al organismo por las
diferentes vías y debe atravesar una serie de barreras según la vía de administración que
se utilice y esto influye en el inicio e intensidad de la actividad farmacológica.
Estudia el paso de los fármacos desde el exterior al medio interno, es decir, a la
circulación sistémica. Tanto este proceso como los restantes procesos a los que se
encuentra sometido el fármaco en el organismo requieren que éste sea capaz de
atravesar membranas biológicas. (Lorenzo, 2008)
2.2.5.2.1. Estructura y Composición de las Membranas Absorbentes
Son estructuras formadas por una bicapa lipídica en las que hay proteínas que actúan
como transportadores, la parte polar, que en su mayoría son fosfolípidos se encuentra en
la parte externa mientras que los ácidos grasos se encuentran en la parte interior,
dándole al núcleo características hidrofóbicas.
2.2.5.2.2. Tipos de Proteínas
a. Proteínas Integrales: Están unidas a los lípidos y constituyen parte importante de
la estructura de membrana ya que si estas se extraen se produce el rompimiento
de la bicapa lipídica, estas proteínas intervienen en los mecanismos de transporte.
b. Proteínas Periféricas: Se sitúan en el interior de la membrana y su extracción no
altera la estructura de la bicapa lipídica
La membrana también contiene carbohidratos y canales acuosos a través de los cuales
se absorben moléculas con determinadas características en cuanto a peso molecular y
pKa para que puedan absorberse.
28
2.2.5.2.3. Mecanismos de Absorción
Entre los diferentes mecanismos para la absorción de los fármacos los más importantes
son la difusión pasiva y el transporte mediado.
a. Difusión pasiva: Consiste en el paso de los componentes a través de la
membrana a favor del gradiente de concentración y sin consumo de energía, la
mayoría de los fármacos se absorben por medio de este mecanismo.
Los componentes polares o iónicos no se absorben o lo hacen de manera muy lenta a
través de la membrana, en cambio los compuestos no ionizados, no polares atraviesan
fácilmente la membrana celular, la mayoría de fármacos son ácidos o bases parcialmente
ionizados por lo que tienden atravesar fácilmente la membrana.
El paso a través de la membrana viene regido por leyes fisicoquímicas determinadas
como la Ley de Fick, según la cual existe un gradiente de concentraciones que se origina
por un flujo irreversible de materia desde un lugar de mayor concentración hacia uno de
menor concentración.
Ilustración 7. Ley de Fick Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
dQ
dt= DPS
dc
dx
dQ
dt=
DPS
δΔC
29
dQ
Vdt= −
dA
dt=
DPS
δ(𝐴 − 𝐶)
−𝒅𝑨
𝒅𝒕= 𝐊𝐚 (𝐦𝐞𝐦𝐛𝐫𝐚𝐧𝐚)𝐀
Ecuación 1. Ley de Fick. Difusión pasiva
Donde:
dQ
dt = Velocidad de difusión
DPS
δ = Ka (membrana)
D= Coeficiente de difusión
P= Coeficiente de reparto
S= Superficie de absorción
A= Cantidad de fármaco que queda en el lugar de absorción
dc
dx = Diferencia de concentración a ambos lados de la membrana
dA
dt = Velocidad con que desaparece el fármaco del lugar de absorción
Difusión por poros: Es un mecanismo que sirve para moléculas hidrofílicas de bajo
peso molecular como el agua y la úrea y el número y tamaño de los poros depende del
lugar de acción, los poros so estructuras móviles y dependiendo del peso molecular de
las moléculas estas atraviesan los poros ubicados en varios sitios.
La absorción por poros no tiene mayor influencia cuando la administración es por vía oral
sin embargo es un mecanismo que se aplica para otras formas de administración como
subcutánea e intramuscular y este mecanismo también está regido por la Ley de Fick.
dQ
dt= D´nMr2 dc
dt
dQ
dt=
D´nMr2
δΔC
dQ
Vdt= −
dA
dt=
D´nMr2
δ(A − C)
30
−𝐝𝐀
𝐝𝐭= 𝐊𝐚 (𝐩𝐨𝐫𝐨𝐬)𝐀
Ecuación 2. Difusión por poros
Donde:
dQ
dt = Velocidad de difusión
D´nMr2
δ = Ka (poros)
D´= Coeficiente de difusión (canales acuosos)
n = Número de poros
r = Radio de los poros
M = Peso molecular
dc
dt = Diferencia de concentración a ambos lados de la membrana
dA
dt = Velocidad con que desaparece el fármaco del lugar de absorción
b. Transporte activo: Existe un número de fármacos cuya polaridad es muy alta y
sui peso molecular elevado como para atravesar los poros, en estos casos la
absorción esta mediada por las proteínas integrales que actúan como
transportadores de la membrana.
En este mecanismo el fármaco primero se une a una zona específica de la molécula
transportadora formando un complejo fármaco-trasportador sufriendo así un cambio
conformacional que le permite atravesar la membrana para que se produzca la disolución
en su interior.
Existen dos aspectos importantes a considerar cuando se trata de este mecanismo:
i. Selectividad
Para que el fármaco sea transportado debe tener características conformacionales que le
permitan unirse al transportador de manera selectiva y específica.
31
El número de moléculas que se absorben por este mecanismo depende del número de
portadores existentes en la membrana y la cantidad máxima de moléculas que puedan
ser transportadas depende de la velocidad máxima de transporte.
ii. Saturabilidad
Se refiere a la capacidad del portador de llevar al fármaco al otro lado de la membrana,
es decir su capacidad de transporte.
Cuando se llega a la capacidad máxima de transporte se dice que el sistema está
saturado y por lo tanto ya no es capaz de trasportar más moléculas hacia el otro lado de
la membrana.
La siguiente tabla muestra algunos ejemplos de sustancias que se absorben por los
diferentes mecanismos antes mencionados:
Tabla 1. Mecanismos de absorción de fármacos
MECANISMO CARACTERÍSTICAS DEL
PROCESO EJEMPLOS
Difusión por membrana
- pKa fármaco
- pH del medio
- Coef. de reparto
- Gradiente de
concentración
- Coef. de difusión
Ácidos y bases débiles
Mayoría de los fármacos
Difusión por poros
- Diámetro del poro
- Número de poros
- Carga eléctrica
A nivel intestinal: Compuestos
polares con un tamaño de 250-
300 daltons como agua y urea
Endotelios: Fármacos de hasta
10000 daltons
Transporte activo
- Transportadores
- Contra el gradiente de
concentración
- Saturabilidad y
Selectividad
Sustancias fisiológicas y
naturales y fármacos como
Betalactámicos, Antitumorales,
Levodopa, entre otros
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
32
2.2.5.3. Distribución
Es un proceso reversible de transferencia del fármaco desde la sangre a los diferentes
espacios extravasculares, órganos, tejidos y fluidos.
Para que el fármaco alcance desde su lugar de absorción su lugar de acción debe
atravesar diversas membranas para llegar a la sangre y para pasar de esta al líquido
intersticial y, en su caso, al interior de las células e, incluso, de estructuras intracelulares.
El paso del fármaco de la sangre a los tejidos depende de la fijación del fármaco a las
proteínas del plasma, ya que solo el fármaco libre difunde libremente a los tejidos.
(Florez, 2008)
Existen una serie de mecanismos implicados en este proceso:
I. Convección: Consiste en el transporte del fármaco a través del torrente
sanguíneo por medio de la fracción acuosa de la sangre.
II. Dispersión: Proceso por el cual el fármaco se dispersa en los espacios
acuosos corporales.
III. Paso a través de las membranas: Proceso por el cual el fármaco atraviesa
las membranas vasculares o celulares.
IV. Unión a las proteínas plasmáticas: Unión del fármaco a las proteínas o
componentes tisulares de carácter proteico y lipídico.
El fármaco en el torrente circulatorio se fija a varios soportes:
Esquema de Shanker:
1.- Receptores: Responsables de la acción farmacológica
2.- Aceptores: Cumplen la función de almacenamiento o reserva del fármaco, el cual van
liberando lentamente para que se produzca la acción farmacológica
3.- Lugares enzimáticos: Responsables del metabolismo y excreción del fármaco.
33
El fármaco disuelto en la sangre pasa de los capilares a los tejidos a favor del gradiente
de concentración depende de los siguientes factores:
o Características del fármaco (tamaño de la molécula, liposolubilidad y grado de
ionización),
o Unión del fármaco a las proteínas plasmáticas,
o Flujo sanguíneo del órgano,
o Luz capilar,
o Grado de turgencia y
o Características del endotelio capilar.
Un fármaco muy liposoluble accederá más fácilmente a los órganos muy irrigados, como
el cerebro, el corazón, el hígado o los riñones, más despacio al músculo y con mayor
lentitud a la grasa y otros tejidos poco irrigados, como las válvulas cardíacas.
Incluso puede haber deferencias dentro de un órgano, por ejemplo, entre la corteza y la
médula renales, o entre el hueso cortical y esponjoso. Un fármaco menos liposoluble
llegará bien a los tejidos cuyos capilares son ricos en hendiduras intercelulares, como es
el caso de las sinusoides hepáticas cuyas abundantes fenestraciones y hendiduras
intercelulares permiten el paso de sustancias con elevado peso molecular, pero tendrá
dificultad para acceder a los tejidos que carecen de ellas, como el SNC.
La inflamación produce vasodilatación y aumento de la permeabilidad capilar, lo que
puede aumentar la concentración alcanzada en algunos tejidos. Cuando la concentración
plasmática disminuye, el fármaco pasa de nuevo a los tejidos a favor del gradiente de
concentración.
Dentro del proceso de distribución del fármaco en el organismo es importante considerar
los subprocesos que este sufre y que pueden afectar de manera significativa la
distribución optima del mismo, existen 3 subprocesos importantes a tomar en cuenta:
2.2.5.3.1. Unión del fármaco a proteínas plasmáticas
Las moléculas de un fármaco son transportadas en la sangre disueltas en el plasma,
fijadas a las proteínas plasmáticas o unidas a las células sanguíneas.
34
La unión de los fármacos a las proteínas del plasma es muy variable, haciendo que el
porcentaje de fármaco libre que pasa a los tejidos fluctúe desde el 100 % del atenolol al
0,1% del flurbiprofeno.
La fijación a la albúmina es la más frecuente e importante, aunque la carga de la
albúmina es negativa, fija tanto fármacos ácidos como bases mediante enlaces iónicos y
ocasionalmente enlaces covalentes. Los fármacos ácidos suelen fijarse a la albúmina en
el sitio I (tipo Warfarina) o II (tipo Diazepam).
Las bases débiles y las sustancias no ionizables liposolubles suelen unirse a las
lipoproteínas y las bases débiles, además, a la albúmina α-glucoproteína, no siendo
infrecuente que una base débil se una simultáneamente a varias proteínas. (Florez, 2008)
La unión del fármaco a proteínas puede condicionar la distribución y eliminación del
fármaco, esto debido a la afinidad específica de cada fármaco frente a las proteínas, así:
- Un fármaco con gran afinidad por las proteínas va a tener una fracción libre
pequeña por lo tanto un bajo volumen de distribución.
- Un fármaco con baja afinidad por las proteínas tendrá una fracción libre mayor y
por lo tanto mayor volumen de distribución.
La unión a proteínas plasmáticas también influye en la intensidad y duración del efecto
farmacológico de acuerdo a la siguiente tabla:
Tabla 2. Afinidad a las proteínas
AFINIDAD A PROTEINAS
Baja Alta
CARACTERÍSTICA
Fracción libre Mayor Menor
Intensidad Mayor Menor
Duración del efecto Menor Mayor
Volumen de distribución Mayor Menor
Elaborado por: Wendy Chávez (2014)
35
La fijación a proteínas es reversible y sigue la ley de acción de masas. La cantidad de
fármaco unido a proteínas (FP) depende de la concentración de fármaco libre (F), de la
constante de asociación (K1/K2), del número de sitios de fijación libres por mol de proteína
y de la concentración molar de proteína:
Habitualmente el porcentaje de la concentración total del fármaco que se encuentra unido
a proteínas permanece constante dentro de un intervalo amplio de concentraciones, pero
hay fármacos, como el valproato sódico, que, cuando se utilizan concentraciones altas,
saturan los puntos de fijación, aumentando la proporción de fármaco libre. (Florez, 2008)
También se puede unir de manera irreversible a las proteínas por uniones covalentes,
cuyo caso se necesita la activación química del fármaco para lograr esta unión con las
proteínas, como consecuencia de este proceso se genera toxicidad en el organismo.
2.2.5.3.2. Tipos de Proteínas
a. Albúmina
Constituye la proteína más abundante en el organismo, tiene un peso molecular PM de
69000 daltons, se ubica en el plasma en un 40 % y en varios órganos y tejidos, la
cantidad en el organismo va de 35 a 45 g/L.
Presenta en su estructura 4 sitios de fijación para los fármacos:
A esta proteína se unen fármacos de carácter neutro o ligeramente ácidos
b. Glicoproteínas
Proteína plasmática más pequeña que presenta un peso molecular de 41000 daltons,
tiene ácido siálico en su estructura y la cantidad en el organismo es de 0,4 a 1 g/L, siendo
esta una cantidad variable bajo ciertas condiciones fisiológicas, así por ejemplo, la
36
cantidad sube en casos inflamatorios, estrés y procesos malignos y disminuye cuando
existen problemas renales y hepáticos.
A esta proteína se unen fármacos de carácter básico como: metadona, lidocaína,
propanolol, betabloqueantes y antirrítmicos.
c. Lipoproteínas
Son proteínas de alto peso molecular 2,5 millones de daltons, presentan una cantidad
importante de lípidos en su estructura y su concentración en el organismo varía de
acuerdo a la edad, la dieta y la existencia de patologías.
A este grupo de proteínas se unen fármacos liposolubles como la imipramina,
diclofenaco, clorpromazina, quinidina y ciclosporinas A.
d. Globulina (α, β, δ)
Estas proteínas presentan gran afinidad por sustancias endógenas y exógenas, su peso
molecular es variable y la cantidad en el organismo varía de acuerdo a condiciones
fisiológicas específicas.
Se fijan a esta proteína esteroides como la prednisona, tiroxina y vitamina B12.
2.2.5.3.3. Unión del fármaco a componentes tisulares
Esta unión es de carácter proteínica – lipofílica formando complejos de adsorción que
liberan lentamente el fármaco, la formación de complejos depende de las características
fisicoquímicas del fármaco, ya que existen fármacos muy liposolubles que quedan
retenidos a nivel del tejido adiposo.
La velocidad de formación de los complejos es inversamente proporcional a la liberación
del fármaco.
37
Tabla 3. Componentes tisulares que fijan fármacos
MATERIAL FÁRMACO UNIDO
ADN Agentes antineoplásicos y antimaláricos
Melanina Cloroquina y fenotiazona
Tejido calcificado Tetraciclinas
Mucopolisacaridos Aminas
Fracciones celulares Sustancias lipofílicas
Dihidrofolato reductasa Metotrexato
Transcortinas Corticoides
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
2.2.5.3.4. Irrigación tisular
Existen fármacos que llegan fácilmente a todos los órganos y fármacos cuyo proceso es
más lento o no llegan; esto ocurre debido a que existen zonas altamente irrigadas y
zonas poco irrigadas a las que el fármaco puede o no llegar según sus características
fisicoquímicas.
Zonas altamente irrigadas: Cerebro, hígado, pulmón, riñón, en estas zonas la
dosis absorbida es del 70 %.
Zonas poco irrigadas: Piel y músculo esquelético (15 %), médula ósea y tejido
adiposo (10 %), huesos y cartílagos (5 %), en total la dosis absorbida en estas
zonas es del 30 %.
2.2.5.4. Metabolismo
Es un proceso irreversible de eliminación del fármaco cuyo objetivo es transformar un
fármaco lipofílico en hidrofílico para que pueda ser eliminado del organismo y además
conducir a un metabolito activo hacia el lugar donde ejercerá su actividad farmacológica.
En el proceso de metabolización existen dos fases importantes:
I. Creación de centros de conjugación, para lo cual se utilizan varias reacciones
químicas como hidroxilación, oxidación, reducción, hidrólisis y epoxidación.
38
II. La primera fase consiste en la conjugación con una molécula endógena formando
un compuesto inicial que posteriormente se une al ácido glucurónico dando lugar
al conjugado que es eliminado fácilmente.
2.2.5.4.1. Fase I
- Oxidación: Es la reacción metabólica más frecuente producida por el sistema
oxidativo del microsoma hepático, en este proceso intervienen dos enzimas:
Citocromo P-450 y NADH – citocromo P-450 reductasa.
Los procesos de oxidación ocurren por reacciones de hidroxilación arilo-alquilo, oxidación
de alcoholes, formación de sulfóxidos y apertura de anillos.
a. Hidroxilación alifática
b. Hidroxilación aromática
39
c. Desaminación oxidativa
d. Desalquilación
- Reducción: Es un proceso menos frecuente que la oxidación y se produce sobre
compuestos con grupos N en su estructura o compuestos azoicos.
Se aplica para compuestos azoicos, para el hidrato de cloral, reducción de alcoholes y
aldehídos.
40
- Hidrólisis: Es una reacción que se produce en ésteres y amidas, es menos
frecuente que la oxidación pero más común que la reducción, son reacciones que
ocurren por la acción enzimática de estearasas y amidasas.
2.2.5.4.2. Fase II
Una vez creado el centro de conjugación el fármaco se conjuga con el ácido glucurónico
para que pueda ser eliminado del organismo, la glucurono conjugación se produce con
hidroxilos, carboxilos, aminas o sulfhidrilos.
El 80 % de conjugación se produce con el ácido glucurónico, generalmente en el hígado
pero también ocurre a nivel de la piel, tejidos, intestinos y riñones.
2.2.5.5. Excreción
Una vez metabolizado el fármaco por medio de la conjugación, se elimina del organismo
por varios mecanismos, siendo el principal el mecanismo de excreción renal que a su vez
está dividido en 3 sub mecanismos:
a. Filtración glomerular: Se eliminan por esta vía fármacos iónicos o no iónicos de
bajo peso molecular y es un mecanismo de carácter pasivo.
b. Secreción tubular: Es un proceso de carácter activo, es decir, existe consumo de
energía, ya que ocurre en contra del gradiente de concentración, las moléculas
que se elimina por esta vía dependen del flujo sanguíneo.
c. Reabsorción tubular: Este proceso ocurre después de que el fármaco se filtró
por los glomérulos y puede ser de carácter activo o pasivo.
41
2.2.6. ANÁLISIS FARMACOCINÉTICO
Un modelo farmacocinético consiste en la representación simbólica de los diferentes
procesos que tienen lugar en un organismo vivo, conocidos en conjunto como sistema
LADME, cuyo objetivo es analizar el comportamiento del fármaco en el sistema mediante
un diseño matemático, fisicoquímico y/o fisiológico.
Tabla 4. Modelos del Análisis Compartimental
Modelo N° de
Compartimentos
Características Matemáticas
Compartimental 1-3 Ajuste de datos a los
parámetros del medio
No compartimental 0 Utilización de
momentos estadísticos
Elaborado por: Wendy Chávez (2014)
2.2.6.1. Modelos farmacocinéticos compartimentales
Es difícil establecer relaciones cuantitativas entre la dosis, vía de administración y la
concentración del fármaco en el organismo debido a la complejidad que presenta el
cuerpo humano, debido a esto para poder estudiar el tránsito del medicamento en el
organismo es necesario agrupar las diferentes zonas fisiológicas en compartimentos.
Compartimento: Se define como una fracción del material biológico en la que el fármaco
se encuentra uniformemente distribuido y presenta iguales propiedades fisicoquímicas.
2.2.6.1.1. Modelo Monocompartimental
En este modelo se considera al organismo como un compartimiento único constituido por
agua plasmática, fluido intersticial y agua intracelular en los tejidos altamente irrigados.
El equilibrio entre los tres componentes es instantáneo y no existe un proceso de
distribución como tal.
42
Este modelo agrupa la liberación y la absorción en un solo proceso al que denomina
Absorción y agrupa el metabolismo y la excreción en un solo proceso llamado
eliminación.
Si la administración es intravenosa (iv)
Ecuación:
−𝐝𝐐
𝐝𝐭= 𝐊𝐞𝐐
Donde:
−𝐝𝐐
𝐝𝐭 = Velocidad de eliminación del fármaco
Kel = Constante de eliminación
Qel = Cantidad de fármaco eliminado
Si la administración es extravasal (a)
Ecuación:
−𝐝𝐐
𝐝𝐭= 𝐐𝐚𝐊𝐚 − 𝐐𝐞𝐊𝐞
Donde:
−𝐝𝐐
𝐝𝐭 = Velocidad de eliminación del fármaco
Ka = Constante de absorción
Qa = Cantidad de fármaco absorbido
Kel = Constante de eliminación
Qel = Cantidad de fármaco eliminado
43
2.2.6.1.2. Modelo Bicompartimental
Este modelo existen ya que se considera que el organismo no es un todo homogéneo y
por lo tanto la distribución del fármaco no es homogénea ni instantánea debido a la
presencia de zonas altamente irrigadas a las que el fármaco accede rápidamente y zonas
poco irrigadas a las que accede lentamente, en este modelo se considera que el
organismo está constituido por dos compartimientos el central y el periférico.
o Características
I. El plasma, fluidos intersticiales y agua intracelular de los tejidos altamente
irrigados forman el compartimiento central donde la distribución del fármaco es
instantánea y por lo tanto el plasma se considera una alícuota del mismo.
II. El agua intracelular profunda de los tejidos poco irrigados y los depósitos acuosos
de carácter proteico y lipídico forman complejos de absorción con el fármaco y
constituyen el compartimiento periférico a donde el fármaco accede lentamente y
se demora en lograr el equilibrio.
III. En el compartimiento central se materializa el proceso de eliminación regido por la
constante de eliminación (ke) y el proceso de distribución hacia el compartimiento
periférico regido por la constante correspondiente.
IV. En el compartimiento periférico desprovisto de procesos de metabolismo y
excreción, facilita la materialización del proceso de retorno o distribución hacia el
compartimiento central.
2.2.6.2. Modelos farmacocinéticos lineales
Un modelo farmacocinético lineal es aquel cuyos procesos cinéticos corresponden a una
cinética de 1er orden.
En este modelo existe una proporción directa entre la velocidad y la concentración del
fármaco en el compartimento, al variar la dosis no cambian los parámetros
farmacocinéticos, la concentración del fármaco a un tiempo determinado es directamente
44
proporcional a la dosis administrada y el área bajo la curva de nivel plasmático está
relacionada con la dosis administrada. (Lopez, 2012)
2.2.6.3. Modelos farmacocinéticos no lineales
En este modelo no existe una relación entre la concentración y la dosis y la velocidad y la
concentración, los parámetros farmacocinéticos cambian según la dosis administrada y
son modelos que se ajustan a situaciones en las que puede existir una saturación.
2.2.6.4. Análisis farmacocinético no compartimental
En el análisis farmacocinético no compartimental se aplica un análisis de las curvas de
nivel plasmático para obtener parámetros farmacocinéticos basados en criterios
estadísticos.
Los valores que se obtienen se definen como “esperanza matemática” que es la media de
la variable aleatoria y se determina mediante densidad de probabilidad.
2.2.6.5. Análisis farmacocinético poblacional
La experiencia en estudios farmacológicos ha permitido apreciar la gran variabilidad que
presentan los parámetros farmacocinéticos en una población de pacientes; esto ha
originado la realización de estudios poblacionales orientados a cuantificar el efecto de
diferentes factores (edad, peso, género, enfermedades concomitantes, entre otros) en los
procesos farmacocinéticos, con el fin de minimizar la variabilidad que, en principio, era
inexplicable. (Barranco, 2011)
La farmacocinética poblacional puede ser definida como el estudio de variabilidad inter e
intraindividual en las concentraciones plasmáticas de los fármacos, así como de los
parámetros farmacocinéticos que las condicionan cuando se administran mediante
regímenes estándar de dosificación a un grupo amplio de individuos o animales con
características fisiopatológicas y clínicas definidas. (Lopez, 2012)
45
Dentro de la farmacocinética poblacional existen tres parámetros básicos:
1. Parámetros de efectos fijos: Cuantifican el comportamiento farmacocinético
medio de un fármaco en una población y la relación entre los parámetros
farmacocinéticos y factores fisiopatológicos.
2. Parámetros de efectos aleatorios interindividuales: Cuantifican la magnitud
típica de la variabilidad interindividual de los parámetros farmacocinéticos, es
decir, describen la distribución de las desviaciones de los valores de estos
parámetros en los individuos con respecto a los valores medios de la población.
Estos parámetros son las desviaciones estándar de dichas distribuciones.
3. Parámetros de efectos aleatorios intraindividuales: Cuantifican la magnitud
típica de la variabilidad intraindividual (error residual) que incluye la variabilidad
cinética intraindividual, el error analítico y el error de especificación del modelo.
2.2.7. CURVAS DE NIVEL PLASMÁTICO
Son las más usadas para el estudio del LADME, el medicamento de administra a un
tiempo inicial t = 0 y se toman muestras a diferentes intervalos de tiempo para realizar la
gráfica y obtener las constantes farmacocinéticas.
Ilustración 8. Curva de Nivel Plasmático
Fuente: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/farmacocinetica_1_4325.pdf
46
2.2.7.1. Parámetros Farmacocinéticos
Parámetros cuantitativos que permiten obtener información acerca de los fenómenos
implicados en los procesos de LADME. (Betés de Toro, 2008)
2.2.7.2. C máx
Representa la mayor concentración de droga alcanzada después de una administración
oral y se expresa como una cantidad por unidad de volumen. (Remington, 2003)
2.2.7.3. T máx
Es la medida del lapso necesario para alcanzar la concentración máxima después de la
administración de la droga. (Remington, 2003)
2.2.7.4. Área bajo la curva (AUC)
Es el área bajo la curva de concentración en suero, sangre o plasma en función del
tiempo (ABC) y se expresa en peso/volumen por unidad de tiempo y puede considerarse
representativa de la cantidad de droga absorbida luego de la administración de una sola
dosis del fármaco. (Remington, 2003)
2.2.7.5. Volumen de distribución Vd
Es una constante de proporcionalidad que relaciona la concentración de la droga en un
líquido de referencia, típicamente plasma, con la cantidad de droga distribuida en todo el
organismo. (Remington, 2003)
2.2.7.6. Clearance Cl
Es el volumen de plasma que queda libre de fármaco por unidad de tiempo, y se expresa
en ml/min o ml/hora.
2.2.7.7. Constante de eliminación Ke
Expresa el porcentaje de fármaco eliminado por unidad de tiempo y principalmente se
expresa en horas.
47
Esta constante rige la velocidad de eliminación del proceso ya que se encuentra en la
pendiente de la ecuación exponencial y de la recta semilogarítimica y determina la
persistencia o fugacidad del efecto farmacológico.
2.2.7.8. Constante de absorción Ka
Expresa el porcentaje de fármaco que ha pasado al torrente sanguíneo por unidad de
tiempo.
2.2.7.9. Tiempo medio de eliminación (t ½)
Tiempo necesario para que la concentración plasmática del fármaco se reduzca al 50 %,
generalmente se expresa en horas.
2.2.8. GLIMEPIRIDA
2.2.8.1. Características físico-químicas
Ilustración 9. Estructura química de la glimepirida. Fuente: (FEUM, 2011)
Nombre: Trans- 3- Etil- 2,5- dihidro– 4- metil- N- [2-[4 [[[[( 4- metilciclohexil)amino]
carbonilamino] sulfonil] fenil] etil]- 2- oxo- 1H- pirrol- 1- carboxamida.
Fórmula Molecular: C24H34N4O5S
Peso Molecular: 490.62 g/mol
Punto de Fusión: 207° C
Características: Polvo cristalino blanco a blanco amarillento soluble en Metanol,
acetonitrilo y cloroformo. Insoluble en agua, 0.0012 mg/mL en agua a pH de 7.
48
Además de tener una solubilidad de 0.00087 mg/mL en una solución buffer con
pH de 6,8.
Clasificación Biofarmacéutica: Clase II.
2.2.8.2. Farmacocinética
Absorción
La biodisponibilidad de la glimepirida tras su administración oral es completa. Las
concentraciones máximas en suero (Cmáx) se alcanzan alrededor de las 2,5 horas
después de la toma oral (media de 0,3 mg/ml durante dosis múltiples de 4 mg diarios),y
hay una relación lineal entre la dosis y ambos, la Cmáx y el AUC (área bajo la curva
tiempo/concentración).
Distribución
La glimepirida tiene un volumen de distribución muy reducido (aproximadamente 8,8
litros), semejante al espacio de distribución de la albúmina, una alta capacidad de unión a
proteínas (99 %) y una baja tasa de aclaramiento (aprox. 48 ml/min).
Biotransformación y eliminación
La semivida media sérica dominante, que es relevante para las concentraciones séricas
en condiciones de dosis múltiple, es de 5-8 horas aproximadamente. Después de dosis
más altas, se han encontrado valores de semivida ligeramente superiores.
Tras una dosis única de glimepirida marcada radiactivamente, el 58 % de la radiactividad
se recuperó en la orina y el 35 % en las heces. No se detectó sustancia sin metabolizar
en la orina.
Se detectaron dos metabolitos en orina y heces, procedentes muy probablemente del
metabolismo hepático (la enzima mayoritaria es CYP2C9): el hidroxiderivado y el
carboxiderivado. (Goodman, 2001)
49
2.2.8.3. Farmacodinamia
Grupo farmacoterapéutico: Hipoglucemiantes orales: Sulfonamidas, derivados
de urea.
Código ATC: A10BB12.
La glimepirida es una sustancia con actividad hipoglucemiante por vía oral, que pertenece
al grupo de las sulfonilureas que puede utilizarse en la diabetes mellitus no insulino-
dependiente.
La glimepirida actúa principalmente estimulando la liberación de insulina por las células
beta-pancreáticas. Este efecto se basa, al igual que en otras sulfonilureas, en el
incremento de la respuesta de las células beta pancreáticas al estímulo fisiológico de la
glucosa. (Google, 2014)
El efecto de la glimepirida es reproducible y dependiente de la dosis y no existen
diferencias significativas en su efecto, independientemente de que el medicamento se
administre 30 minutos o inmediatamente antes de una comida.
A pesar de que el metabolito hidroxilado de la glimepirida causa disminuciones pequeñas
pero significativas de la glucosa sérica en personas sanas, este hecho representa
solamente una pequeña parte del efecto total del medicamento.
2.2.8.4. Mecanismo de acción
La glimepirida disminuye la concentración de glucosa en sangre, al estimular la liberación
de insulina desde las células beta-pancreáticas, tanto en sujetos sanos como en
pacientes con diabetes mellitus tipo 2.
Regula la secreción de insulina al interactuar con el canal de potasio sensible al ATP en
la membrana de las células beta uniéndose específicamente a una proteína de 65 kDa.
La glimepirida cierra los canales de potasio, lo que induce la despolarización de las
células beta, que resulta en la apertura de los canales de calcio sensibles al voltaje y el
influjo de calcio hacia la célula. Finalmente, el incremento en la concentración intracelular
de calcio activa la liberación de insulina a través de exocitosis.
50
Se asume que por su alto grado de intercambio con la proteína de unión, produce una
pronunciada sensibilización a la glucosa y protege a las células beta de la
desensibilización y del agotamiento temprano. (Goodman, 2001)
2.2.8.5. Interacciones
- Potenciación, que aumentará la actividad hipoglicemiante por:
a. Incrementar la fracción libre al desplazarlas de proteínas plasmáticas: fibratos,
salicilatos.
b. Inhibir su biotransformación hepática: dicumarínicos, antihistamínicos anti-H2-.
c. Reducir su excreción urinaria: salicilatos, probenacida.
d. Interacción farmacodinámica: etanol, salicilatos, bloqueantes β.
- Antagonismo, al disminuir su actividad hipoglicemiante mediante:
a. Supresión de la secreción insulínica por las células β pancreáticas: tiacidas,
furosemida, fenitoína, diazóxido.
b. Interferencia con la insulina liberada: corticoides, estrógenos, simpaticomiméticos.
c. Inducción enzimática de su metabolismo hepático: etanol, barbitúricos,
rifampicina. (Lorenzo, 2008)
2.2.8.6. Efectos adversos
La frecuencia de reacciones adversas en los pacientes que reciben sulfonilureas es baja
(2-5 %); dichas reacciones suelen ser de carácter leve y reversible tras retirar la
medicación casual.
La hipoglucemia es la complicación más frecuente, que se verá favorecida en caso de
interacciones medicamentosas que potencien sus efectos de aspectos relacionados con
la cinética del preparado usado u otras circunstancias.
Los resultados del University Group Diabetes Program (UGDP) sugeríasn que las
sulfonilureas podían facilitar la aparición de afecciones cardiovasculares. Sin embargo,
las conclusiones del amplio estudio de cohortes realizado por el United Kingdom
Prospective Diabetes Study (UKPDS) indican claramente que, después de un
51
seguimiento de 14 años, los diabéticos de tipo 2 tratados con sulfonilureas no
presentaron mayor incidencia de mortalidad atribuible a cardiopatía isquémica.
Con menor frecuencia pueden observarse manifestaciones por hipersensibilidad de tipo
cutáneo (exantema, prurito, fotosensibilidad, eritema nudoso, eritema multiforme,
síndrome de Stevens-Jonhson, púrpura) y, más raramente, reacciones anafilácticas.
Con clorpropamida se ha descrito hiponatremia por secreción inapropiada de ADH y
reacción vasomotora tipo efecto Antabús. La glipicida puede ocasionar manifestaciones
digestivas (epigastralgia, pirosis, nauseas, vómitos y alteración de las pruebas de función
hepática).
A pesar de la escasa experiencia con glimepirida, se ha comunicado púrpura
trombocitopénica asociada a su utilización. (Lorenzo, 2008)
2.2.8.7. Posología
Al iniciar el tratamiento con sulfonilureas debe prescribirse la mínima dosis efectiva e
incrementarla progresivamente (cada 2 semanas) hasta alcanzar un control glucémico
óptimo.
Se administra por vía oral, preferentemente, 15 – 30 minutos antes de las comidas
principales y repartiendo la dosis diaria total para mantener niveles de glucemia
aceptables.
Aunque no se dispone de datos clínicos que indiquen la superioridad de algún fármaco en
particular, lo cierto es que la glimepirida presenta la ventaja de una sola administración
diaria. (Lorenzo, 2008)
2.2.9. MÉTODO DE CUANTIFICACIÓN HPLC/UV
La cromatografía líquida de alta eficacia es actualmente la técnica de separación más
utilizada debido a su versatilidad y amplio campo de aplicación.
Los componentes de la muestra, previamente disueltos en un disolvente adecuado (fase
móvil), son forzados a atravesar la columna cromatográfica gracias a la aplicación de
altas presiones, el material interno de la columna conocido como fase estacionaria, está
52
constituido por un relleno capaz de retener de forma selectiva los componentes de la
mezcla.
La resolución de esta separación depende de la interacción entre la fase estacionaria y la
fase móvil, pudiendo ser manipulada a través de la elección de diferentes mezclas de
disolventes y distintos tipo de rellenos como resultado final los componentes de la
mezcla salen de la columna separados en función de sus tiempos de retención en lo que
constituye el cromatograma a través del cual se puede realizar la identificación cualitativa
y cuantitativa de las especies separadas.
Los disolventes más usados en HPLC son: agua, disoluciones tampón acuosas y
disolventes orgánicos como el metanol estos deben ser espectroscópicamente puros,
exentos de partículas sólidas y desgasificados, esto se lleva a cabo con un gas inerte
muy poco soluble como el helio.
Como fase estacionaria lo más común es usar partículas microporosas esféricas de sílice
muy puro que son permeables al disolvente. (Skoog, Holler, & Nieman, 2001)
2.2.9.1. Instrumentación para cromatografía de líquidos
Como consecuencia de las elevadas presiones que se utiliza en este tipo de
cromatografía, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser más sofisticado y caro que
el que se utiliza en otros tipos de cromatografía, la figura muestra un esquema de los
componentes fundamentales de un cromatógrafo de líquidos de alta eficacia típico.
Ilustración 10. Cromatógrafo líquido de alta eficiencia HPLC Fuente: (Skoog, Holler, & Nieman, 2001)
53
2.2.10. Métodos analíticos para extracción de fármacos de la matriz biológica
El objetivo del proceso de preparación de la muestra es proporcionar una muestra
adecuada, por lo general para el análisis cromatográfico, que no se contamine la
instrumentación y donde la concentración en la muestra preparada es un reflejo de la que
se encuentra en el original. (Watt, Morrison, & Evans, 2000)
El método de preparación de la muestra seleccionada está dictado generalmente por la
técnica analítica disponible y las características físicas de los analitos investigados. Los
dos métodos principales de preparación de muestras son la limpieza de la matriz o de
inyección directa. En un procedimiento de limpieza de la matriz, el objetivo es eliminar la
mayor cantidad de material endógeno como sea posible de la muestra de drogas. (Watt,
Morrison, & Evans, 2000)
Preparación de la muestra se lleva a cabo tradicionalmente (a) por extracción líquido-
líquido, (b) extracción en fase sólida o (c) por precipitación de las proteínas del plasma,
mientras que el análisis final en la mayoría de los casos se lleva a cabo por cromatografía
líquida de interfaz con espectrometría de masas o espectrometría de masas o
cromatografía de gases con columna capilar. (Prabu & Suriyaprakash, 2012)
Este método muy utilizado en los análisis bioanalíticos, es una técnica muy sencilla para
la extracción del analito de la matriz. Si se sospecha de una unión de proteína con el
fármaco, entonces la precipitación de proteínas como método de extracción de la muestra
puede ser considerado. Reactivos para realizar la precipitación pueden ser perclórico,
tricloroacético y ácidos túngstico, y disolventes orgánicos tales como acetonitrilo o
metanol. Con todo esto, es necesario tener en cuenta la capacidad de los analitos y los
requisitos para llevar a cabo el procedimiento de extracción de la matriz biológica.
2.2.10.1. Precipitación de proteínas
El requisito principal de esta técnica es que el analito debe ser libremente soluble en la
reconstitución de disolvente. La preparación de la muestra a través de la precipitación de
proteínas logra la separación por conversión de proteínas solubles a un estado insoluble
por desplazamiento salino o mediante la adición de algún disolvente de precipitación
miscible o disolventes orgánicos tales como acetona, etanol, acetonitrilo o metanol.
(Backes, 2000)
54
Los resultados de la precipitación se utilizan a menudo en la secuencia de purificación de
muestras, ya que reducen el volumen y el aumentan la pureza de la proteína antes de
cualquier análisis por cromatografía. Las proteínas pueden pegarse entre sí a través de
una de las tres fuerzas: electrostática, hidrofóbica, y Van Der Waals. El último es difícil de
distinguir del hidrófobo y opera en un rango muy corto. Las fuerzas electrostáticas operan
a larga distancia, pero entre las moléculas son fuerzas de repulsión en vez de atracción.
(Wells D. , 2003)
Las proteínas pueden volverse insolubles mediante la alteración de sus propiedades
superficiales, características de carga o cambiar las características de disolvente, el
cambio de las características de disolventes siendo los preferidos. Las proteínas son
menos solubles cuando su punto isoeléctrico (pI) oscila entre el 4 - 10. Se recomienda la
selección de un buffer en o cerca del punto isoeléctrico de la proteína. Sin embargo,
algunas proteínas pueden desnaturalizarse a su pI y por encima de su pI. (Backes, 2000)
La solubilidad de una proteína aumenta con la adición de la sal y alcanza un máximo
después de lo cual hay una disminución lineal en la solubilidad rápida. Hay varios
métodos para reducir la solubilidad de proteínas, que son iónica precipitación, con
compuestos como sulfato de amonio, cloruro de sodio; iones metálicos, como Cu +2, Zn+2
y Fe +2. (Wells D. , 2003)
En la práctica, la precipitación se realiza generalmente a baja temperatura. La condición
para la proteína es que se manejen en un medio frío, por ejemplo en un baño de hielo,
porque las proteínas tienden a desnaturalizarse a temperaturas más altas, aunque si el
control se puede conseguir suficiente y su proteína es más estable que otras, esto puede
ser selectivo y lograr una mayor purificación. (Wells D. , 2003)
Comúnmente la muestra se centrifuga a alta velocidad durante un tiempo suficiente,
todos los componentes precipitados de plasma se liquidarán en el fondo del
sobrenadante.
El líquido sobrenadante obtenido se puede inyectar directamente en la HPLC o puede ser
evaporado y se reconstituye con la fase móvil para tener más limpia la muestra. Puede
llevarse a cabo mediante el uso de micro centrífuga a muy alta velocidad para mejorar la
limpieza de muestra. (Wells D. , 2003)
55
2.2.10.2. Extracción Líquido-líquido (LLE)
Una de las técnicas más útiles para el aislamiento de los componentes deseados de una
mezcla es la extracción líquido-líquido (LLE). LLE es un método utilizado para la
separación de una mezcla utilizando dos disolventes inmiscibles. En la mayoría de LLEs,
una de las fases es acuosa y el otro es un disolvente orgánico inmiscible.
La capacidad para separar los compuestos en una mezcla utilizando la técnica de LLE
depende cómo interactúan los componentes de la muestra a analizar entre los dos
disolventes inmiscibles. La partición selectiva del compuesto de interés en una de las dos
fases no miscibles o parcialmente miscibles se produce por la adecuada elección del
disolvente de extracción. (Harris, 2004)
En esta técnica la muestra se distribuye en dos fases, en donde una fase es inmiscible a
otra. LLE separa los analitos de interferencias partiendo la muestra entre dos líquidos o
fases inmiscibles.
En primer lugar, la mezcla de componentes se disuelve en un disolvente adecuado y se
añade un segundo disolvente que es inmiscible con el primer disolvente. A continuación,
los contenidos se mezclan a fondo (agitación) y los dos disolventes inmiscibles permiten
separar en capas las diferentes fases. (Harris, 2004)
Generalmente después de la extracción los compuestos hidrófilos se encuentran en la
fase acuosa polar y compuestos hidrofóbicos se encuentran principalmente en los
disolventes orgánicos.
El analito que se extrae en la fase orgánica es fácilmente recuperado por evaporación del
disolvente, el residuo se reconstituye con un pequeño volumen de un disolvente
apropiado fase de preferencia móvil mientras analito extraído en la fase acuosa puede
ser inyectado directamente en una columna RP. (Harris, 2004)
LLE técnica es simple, rápida es costo relativo efectiva por muestra, en comparación con
otras técnicas y se puede tener un porcentaje de recuperación alto que permite ser
cuantitativo (90 %).
56
2.2.10.3. Extracción en Fase Sólido (SPE)
Los objetivos de la SPE son reducir el nivel de interferencias, minimizar el volumen de la
muestra final para maximizar la sensibilidad del analito y proporcionar la fracción de
analito en un disolvente que es compatible con las técnicas de medición analíticos. Como
un beneficio adicional, la SPE sirve como un filtro para eliminar partículas de la muestra.
(Zief & Kiser, 2000)
El grado de enriquecimiento alcanzable para una muestra particular depende de:
La selectividad de la fase unida para el analito
La fuerza relativa de la interacción
Con la SPE se puede preparar múltiples muestras en paralelo (normalmente 12-24
muestras) y utiliza relativamente bajas cantidades de disolventes y los procedimientos se
pueden automatizar con facilidad. Como su nombre indica el principio de SPE es una
técnica de extracción similar a la de LLE, que implica una partición de los solutos entre
dos fases. Sin embargo, en lugar de dos fases líquidas inmiscibles, como en LLE, SPE
implica la partición entre un líquido (matriz de la muestra o disolvente con los analitos) y
una fase sólida (absorbente). (Zief & Kiser, 2000)
SPE es un proceso de separación más eficiente que LLE, se obtiene fácilmente una
mayor recuperación de analito mediante el empleo de una pequeña columna de plástico
desechable o cartucho, a menudo el barril de una jeringa médica con una cantidad de 0,1
a 0,5 g de sorbente que es comúnmente un material de sílice-C18.
Los componentes de interés pueden adsorber preferentemente al sólido, o pueden
permanecer en la segunda fase no sólida. Una vez que se ha alcanzado el equilibrio, las
dos fases se separan físicamente por decantación, filtración, centrifugación o un proceso
similar. (Zief & Kiser, 2000)
2.2.11. VALIDACIÓN DE MÉTODOS
La validación de un método es el proceso que establece, mediante estudios de
laboratorio; que las características de desempeño del método, satisfacen los requisitos
para su aplicación analítica. (FEUM, 2011)
57
El proceso de validación de los métodos analíticos puede comprender, pero no está
limitado al estudio de las características de desempeño recomendadas para la validación
de los métodos analíticos que se describen a continuación:
Verificación del sistema
Precisión del sistema
Linealidad del sistema
Especificidad/Selectividad del método
Exactitud del método
Linealidad e intervalo del método
Precisión del método
Límite de detección del método
Límite de cuantificación del método
Robustez del método
Tolerancia del método
Fuente: (FEUM, 2011)
Los métodos analíticos para fines de validación se clasifican en cuatro categorías, ya que
requieren de diferentes esquemas de estudio:
Categoría I. Métodos analíticos para cuantificar a un componente específico en muestra
de producto terminado o en pruebas de estabilidad, ya sea en fármacos, aditivos o
preparados farmacéuticos u otros analitos de interés.
Categoría II. Métodos analíticos para la determinación de impurezas (productos de
degradación, sustancias relacionadas, isómeros ópticos, etc.) en muestras de fármacos,
preparados farmacéuticos y aditivos.
Estos métodos pueden incluir determinaciones cuantitativas o pruebas límite. En estas
últimas, el interés es establecer si el analito, excede o no, un valor límite. Los métodos de
pureza quedan incluidos en esta categoría.
Categoría III. Métodos analíticos utilizados en la determinación de un analito en una
muestra con el objeto de evaluar una característica de desempeño del preparado
farmacéutico (disolución de cápsulas, liberación controlada de tabletas, entre otras).
58
Categoría IV. Pruebas de identificación de un analito en muestras de fármacos, aditivos o
preparados farmacéuticos, cuyo propósito es establecer la presencia del analito de
interés.
En términos del estudio de laboratorio, los requisitos mínimos de las características de
desempeño, deben documentarse en un protocolo, ejecutarse, y al término de éste,
elaborar un informe donde se establezca su validez. (FEUM, 2011)
Tabla 5. Datos requeridos para la validación
Fuente: (USP-34-NF-29, 2011)
2.2.11.1. Características del Desempeño Analítico
Características Analíticas Típicas Utilizadas para la Validación de Métodos:
Exactitud
Precisión
Especificidad
Límite de Detección
Límite de Cuantificación
Linealidad
Intervalo
Robustez
Fuente: (USP-34-NF-29, 2011)
2.2.11.2. Verificación de Sistema
Son pruebas utilizadas para verificar que el sistema funciona correctamente, con base en
criterios establecidos previamente. (FEUM, 2011)
59
Se determina en base a características del equipo definidas en función de la respuesta
analítica como sus propiedades, su variabilidad, su forma, tiempos de respuesta,
indicadores de separación, indicadores de eficiencia, respuesta de blancos, entre otros.
2.2.11.3. Precisión del Sistema
Es el grado de concordancia relativa de la respuesta analítica de soluciones de referencia
de concentración o magnitud conocida.
Para su determinación el analista prepara a partir de una sustancia de referencia, por lo
menos seis soluciones que representen 100 % de la calidad o concentración del analito
en la muestra y medir la respuesta dentro de una misma corrida analítica. (FEUM, 2011)
La precisión de un procedimiento analítico es el grado de concordancia entre los
resultados de las pruebas individuales cuando se aplica el procedimiento repetidamente a
múltiples muestreos de una muestra homogénea. (USP-34-NF-29, 2011)
La precisión habitualmente se expresa como la desviación estándar o la desviación
estándar relativa (coeficiente de variación) de una serie de mediciones. La precisión
puede ser una medida del grado de reproducibilidad o de repetitibilidad del procedimiento
analítico en condiciones normales de operación. En este contexto, la reproducibilidad se
refiere al uso del procedimiento analítico en diferentes laboratorios, como por ejemplo en
un estudio en colaboración.
La precisión intermedia expresa la variación dentro de un laboratorio, por ejemplo en
diferentes días, con diferentes analistas o con equipos diferentes dentro del mismo
laboratorio.
La repetitibilidad se refiere a la utilización del procedimiento analítico en un laboratorio
durante un período corto por el mismo analista con el mismo equipo. (USP-34-NF-29,
2011)
La precisión se determina mediante el análisis de un número suficiente de alícuotas de
una muestra homogénea que permita calcular estadísticamente estimaciones válidas de
la desviación estándar o la desviación estándar relativa (coeficiente de variación).
60
Los análisis en este contexto son análisis independiente de muestras que se han llevado
a cabo mediante el procedimiento analítico completo, desde la preparación de las
muestras hasta el resultado final de las pruebas. (USP-34-NF-29, 2011)
Desviación Estándar:
Coeficiente de Variación:
Los documentos de ICH recomiendan que se evalúe la repetibilidad utilizando un mínimo
de 9 determinaciones que cubran el intervalo especificado para el procedimiento (es
decir, tres concentraciones y tres determinaciones de cada concentración) o usando un
mínimo de seis determinaciones al 100 % de la concentración de prueba. (USP-34-NF-
29, 2011)
2.2.11.3.1. Repetibilidad
Se define como la precisión de un método analítico, que expresa la variación dentro de
un mismo laboratorio, obtenida entre determinaciones independientes, pero bajo las
mismas condiciones.
2.2.11.3.2. Reproductibilidad
Este parámetro se define como la precisión de un método analítico, que expresa la
variación obtenida entre determinaciones independientes, en el mismo laboratorio, pero
bajo diferentes condiciones de análisis.
2.2.11.4. Linealidad del Sistema
Es la verificación de que la respuesta analítica y la concentración del analito se ajustan al
modelo matemático, en un intervalo de concentraciones pertinentes a la aplicación
analítica, este concepto se denomina generalmente “curva de calibración”
61
La determinación se basa en investigar la relación concentración-respuesta en un
intervalo que incluya al menos cinco niveles, por triplicado de la concentración del analito.
La linealidad de un procedimiento analítico es su capacidad para obtener resultados de
prueba que sean proporcionales ya sea directamente, o por medio de una transformación
matemática bien definida, a la concentración de analito en muestras dentro de un
intervalo dado. La linealidad se refiere a la relación entre la concentración y la medida de
valoración.
Debe establecerse inicialmente mediante examen visual de un gráfico de señales en
función de la concentración de analito del contenido. Si parece existir una relación lineal,
los resultados de la prueba deberían establecerse mediante métodos estadísticos
adecuados (p. ej., método de mínimos cuadrados).
Los datos obtenidos a partir de la línea de regresión pueden ser útiles para proporcionar
estimaciones matemáticas del grado de linealidad. Se deberían presentar el coeficiente
de correlación, la intersección con el eje de ordenadas, la pendiente de la línea de
regresión y la suma de los cuadrados residuales. (USP-34-NF-29, 2011)
La ICH recomienda que, para establecer la linealidad, se utilicen normalmente un mínimo
de cinco concentraciones, y en la valoración de un fármaco puede estar en un rango de
80 % a 120 % de la concentración de prueba.
2.2.11.5. Exactitud
La exactitud de un procedimiento analítico es la proximidad entre los resultados de la
prueba obtenidos mediante ese procedimiento y el valor verdadero. (USP-34-NF-29,
2011)
En la valoración de un fármaco, la exactitud puede determinarse mediante la aplicación
del procedimiento analítico con respecto a un analito de pureza conocida (p.ej., un
Estándar de Referencia), o comparando los resultados del procedimiento con los de un
segundo procedimiento bien caracterizado, cuya exactitud se haya comprobado o
definido. (USP-34-NF-29, 2011)
62
En la valoración de un fármaco en un producto formulado, la exactitud puede
determinarse mediante la aplicación del procedimiento analítico a mezclas sintéticas de
los componentes del producto farmacéutico al que se hayan añadido cantidades
conocidas de un analito dentro del intervalo del procedimiento. (USP-34-NF-29, 2011)
La exactitud se calcula como el porcentaje de recuperación de la cantidad valorada con
respecto a la cantidad conocida de analito añadida a la muestra, o como diferencia entre
la media de valoración y el valor verdadero aceptado, considerando los intervalos de
confianza. (USP-34-NF- 29, 2011)
La exactitud puede determinarse de varias maneras, mediante la evaluación de la
recuperación del analito (porcentaje de recuperación) en todo el intervalo de valoración, o
evaluando la linealidad de la relación entre las concentraciones estimadas y las reales.
(USP-34-NF-29, 2011)
Los documentos de ICH recomiendan que se evalúe la exactitud utilizando un mínimo de
nueve determinaciones sobre un mínimo de tres niveles de concentración, cubriendo el
intervalo especificado (es decir, tres concentraciones y tres determinaciones repetidas de
cada concentración). (USP-34-NF-29, 2011)
2.2.11.6. Intervalo
El intervalo es la amplitud entre la concentración inferior y superior del analito en la cual
se puede determinar al analito con un nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad
utilizando el procedimiento según se describe por escrito.
El intervalo se expresa normalmente en las mismas unidades que los resultados de la
prueba obtenidos mediante el procedimiento analítico.
El intervalo se valida verificando que el procedimiento analítico proporciona precisión,
exactitud y linealidad aceptables cuando se aplica a muestras que contienen el analito en
los extremos del intervalo, al igual que dentro del intervalo. (USP-34-NF-29, 2011)
63
2.2.11.7. Robustez
Es una medida de la capacidad del método analítico para no ser afectado por variaciones
pequeñas, aunque deliberadas, en los parámetros del procedimiento indicados en la
documentación, y provee una indicación de su aptitud durante condiciones normales de
uso. (USP-34-NF-29, 2011)
2.2.11.8. Límite de Detección
Es una característica de las pruebas de límite. Es la cantidad mínima de analito que
puede detectarse en una muestra, aunque no necesariamente cuantificarse, en las
condiciones experimentales indicadas. Las pruebas de límite simplemente comprueban
que la cantidad de un analito se encuentra por encima o por debajo de un nivel
determinado.
El límite de detección puede expresarse como concentración de analito en la muestra.
(USP-34-NF-29, 2011)
En el caso de procedimientos presentados para su consideración como procedimientos
farmacopeicos oficiales, casi nunca es necesario determinar el límite de detección real.
Más bien debe demostrarse que el límite de detección es lo suficientemente bajo
mediante el análisis de muestras con concentraciones conocidas de analito superiores e
inferiores al nivel de detección requerido. (USP-34-NF-29, 2011)
2.2.11.9. Límite de Cuantificación
Es una característica de las valoraciones cuantitativas de compuestos que se encuentran
en baja concentración en la matriz de una muestra, tales como: impurezas en fármacos a
granel y productos de degradación en productos farmacéuticos terminados.
Es la mínima cantidad de analito en una muestra que se puede determinar con precisión
y exactitud aceptables en las condiciones experimentales indicadas. El límite de
cuantificación se aplica habitualmente como concentración de analito en la muestra.
64
En el caso de procedimientos presentados para su consideración como procedimientos
farmacopeicos oficiales casi nunca resulta necesario determinar el límite de cuantificación
real.
Más bien debe demostrarse que el límite de cuantificación es lo suficientemente bajo
mediante el análisis de muestras con concentraciones conocidas de analito superiores e
inferiores al nivel de cuantificación. (USP-34-NF-29, 2011)
2.3. FUNDAMENTO LEGAL
2.3.1. Ecuador
2.3.1.1.1. Constitución de la República de Ecuador
TITULO VII: RÉGIMEN DEL BUEN VIVIR
Artículo 363: El estado será responsable de garantizar la disponibilidad y acceso a
medicamentos de calidad, seguros y eficaces, regular su comercialización y promover la
producción nacional y la utilización de medicamentos genéricos que respondan a las
necesidades epidemiológicas de la población.
2.3.1.1.2. Ley Orgánica de Salud
CAPÍTULO II: De la autoridad sanitaria nacional, sus competencias y responsabilidades.
Artículo 6.
Numeral 18: Regular y realizar el control sanitario de la producción, importación,
distribución, almacenamiento, transporte, comercialización, dispensación y expendio de
alimentos procesados, medicamentos y otros productos para uso y consumo humano; así
como los sistemas y procedimientos que garanticen su inocuidad, seguridad y calidad, a
través del Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical Dr. Leopoldo Izquieta Pérez y
otras dependencias del Ministerio de Salud Pública.
CAPÍTULO VI.
LIBRO TERCERO.- Vigilancia y control sanitario. Disposiciones comunes.
65
Artículo 131: El cumplimiento de la Normas de Buenas Prácticas de Manufactura,
Almacenamiento, Distribución, Dispensación y Farmacia será controlado y certificado por
la Autoridad Sanitaria Nacional.
CAPÍTULO XI.- De los medicamentos
Artículo 154: El Estado garantizará el acceso y disponibilidad de medicamentos de
calidad y su uso racional, priorizando los intereses de la salud pública sobre los
económicos y comerciales.
Artículo 157: La Autoridad Sanitaria Nacional garantizará la calidad de los medicamentos
en general y desarrollará programas de fármacovigilancia y estudios de utilización de
medicamentos, entre otros, para precautelar la seguridad de su uso y consumo.
2.3.1.1.3. Política Nacional de Medicamentos
Objetivo
Garantizar que las especialidades farmacéuticas disponibles en el mercado respondan a
las exigencias internacionales en cuanto a eficiencia terapéutica, seguridad fármaco-
clínica, contenido cuantitativo, costo-beneficio derivado de su utilización, eficacia y
seguridad en la dispensación; para lo cual, el país deberá disponer de la tecnología
necesaria que permita aplicar adecuados controles de calidad.
2.3.2. Normas ISO para productos Nanotecnológicos a nivel Mundial
ISO/TC 229 Nanotechnologies
Alcance
Normalización en el campo de las nanotecnologías que incluye uno o ambos de los
siguientes aspectos:
1. La comprensión y el control de la materia y los procesos a escala nanométrica, por
lo general, aunque no exclusivamente, por debajo de 100 nanómetros de una o más
66
dimensiones, donde la aparición de fenómenos dependientes del tamaño por lo general
permite nuevas aplicaciones
2. La utilización de las propiedades de los materiales a nanoescala que difieren de las
propiedades de los átomos individuales, moléculas, y la materia a granel, para crear
materiales mejorados, los dispositivos y sistemas que explotan estas nuevas
propiedades.
Las tareas específicas incluyen la elaboración de normas para: la terminología y la
nomenclatura, la metrología e instrumentación, incluidas las especificaciones para los
materiales de referencia, metodologías de prueba, modelado y simulaciones, y la salud
basadas en la ciencia, la seguridad y prácticas ambientales.
2.3.3. México
2.3.3.1. REGLAMENTO de la Ley General de Salud en Materia de Investigación
para la Salud
TÍTULO SEGUNDO
De los Aspectos Éticos de la Investigación en Seres Humanos
CAPÍTULO I
Disposiciones Comunes
ARTÍCULO 14.- La Investigación que se realice en seres humanos deberá desarrollarse
conforme a las siguientes bases:
II.- Se fundamentará en la experimentación previa realizada en animales, en laboratorios
o en otros hechos científicos.
TÍTULO SÉPTIMO
De la Investigación que incluya a la utilización de animales de experimentación.
CAPÍTULO ÚNICO
ARTÍCULO 121.- En las investigaciones experimentales con animales, referidas a la
salud humana, se deberán llenar los requisitos que establezcan las normas de las propias
67
instituciones de salud, autorizadas por la Secretaría y satisfacer lo señalado en este
Capítulo.
ARTÍCULO 122.- Las investigaciones se diseñarán a modo de evitar al máximo el
sufrimiento de los animales.
ARTÍCULO 123.- Cuando sea necesario sacrificar a un animal de experimentación, se
empleará un procedimiento que asegure en lo posible su muerte sin sufrimiento.
ARTÍCULO 124.- Los bioterios deberán estar de acuerdo con la especie, conformación
corporal, hábitos, preferencias posturales y características locomotoras de los animales,
para proporcionarles comodidad, excepto cuando las variables experimentales justifiquen
otras situaciones.
ARTÍCULO 125.- Los bioterios de producción o mantenimiento crónico serán
supervisados por profesionales calificado y competente en la materia y deberán permitir
el crecimiento, maduración, reproducción y comportamiento normal de los animales, de
conformidad con las normas que la propia institución emita.
ARTÍCULO 126.- El titular de la institución de salud en donde se realice investigación a la
que se refiere este Capítulo, deberá establecer y vigilar el cumplimiento de las medidas
de seguridad para el cuidado y manejo de los animales, así como las medidas de
profilaxis y vacunación necesarias para la protección del personal ocupacionalmente
expuesto.
2.3.3.2. Ley Protectora de Animales del Estado de México
CAPÍTULO QUINTO
DE LOS EXPERIMENTOS CON ANIMALES
Artículo 23.- Para realizar algún experimento con animales los interesados deberán
justificar ante las autoridades correspondientes, que la naturaleza del acto por realizar, es
en beneficio de la investigación científica, y que para ello cuentan con la autorización de
experimentación en animales, que se expidan por la Autoridades Sanitarias del Estado, y
demostrar los siguientes requisitos:
68
a) Que los experimentos no pueden realizarse con otras alternativas;
b) Que son necesarios para el control, prevención y diagnóstico, para el tratamiento de
enfermedades que afecten al hombre y a los animales;
c) Que los animales no pueden ser substituidos por esquemas, dibujos, películas,
fotografías, videocintas o cualquier otro procedimiento análogo.
Al experimentador que no cumpla con algunos de los requisitos anteriores, se le aplicará
la sanción respectiva de acuerdo a lo dispuesto por esta Ley o reglamentos.
Artículo 24.- Los animales que vayan a ser utilizados en experimentos de disección,
deberán previamente ser insensibilizados y al término de la operación, curados y
alimentados en forma debida, si las heridas causadas son considerables o implican
mutilación grave, el animal será sacrificado bajo los medios más adecuados que eviten
sufrimiento.
2.3.3.3. Código de Nuremberg:
“cualquier experimento hecho en seres humanos debe ser diseñado y basado en los
resultados de investigación animal”
2.3.3.4. Declaración de Helsinki
“la investigación médica en sujetos humanos debe estar basada en pruebas de
laboratorio adecuadamente realizadas y en experimentación con animales”
2.3.4. España
2.3.4.1. Ley 29/2006, de 26 de julio, de garantías y uso racional de los
medicamentos y productos sanitarios.
Artículo 13. Garantías de eficacia.
1. La eficacia de los medicamentos para cada una de sus indicaciones deberá
establecerse con base en la realización previa de estudios preclínicos y ensayos clínicos
que se ajustarán a las exigencias normativas y a las que se deriven de los avances en el
conocimiento científico de la materia.
69
2. Los estudios en animales deberán diseñarse y realizarse de forma que permitan
conocer el perfil farmacológico global de la sustancia. En todo caso, se cumplirá la
normativa en materia de protección de animales utilizados para fines científicos.
70
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA
3.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN
La presente investigación es de tipo analítica-experimental cuantitativa, preclínica “in
vivo” para la recolección de datos en el laboratorio los mismos que fueron analizados e
interpretados de manera numérica por medio del análisis estadístico.
3.2. POBLACION Y MUESTRA
La población está constituida por 32 ratas Wistar de las cuales se obtuvo la muestra
individual de plasma para la cuantificación del fármaco.
La muestra está constituida por la población en su totalidad, que de manera aleatoria se
dividió en 4 grupos de muestreo de 4 ratas cada uno, es decir, 16 ratas para la
formulación en nanopartículas y 16 ratas para la formulación comercial.
3.3. DISEÑO EXPERIMENTAL
El desarrollo experimental del presente proyecto de investigación se llevó a cabo en tres
etapas:
3.3.1. Primera etapa: Desarrollo del método
Para el desarrollo del método analítico se buscaron condiciones óptimas para la
extracción del analito desde su matriz biológica, en este caso plasma de rata, así como
los mejores resultados en sistema.
3.3.2. Segunda etapa: Validación
Se realizó la validación de la metodología analítica para la cuantificación de Glimepirida
desde su matriz biológica, en este caso plasma de rata por HPLC/UV.
71
3.3.3. Tercera etapa: Aplicación del método desarrollado
Se procedió a la aplicación de la metodología validada en un estudio farmacocinético
preclínico en ratas en el que se realizó la comparación de los parámetros
farmacocinéticos de una formulación de nanopartículas de Glimepirida con una
formulación comercial de Glimepirida mediante un diseño completamente al azar DCA.
3.4. VARIABLES
3.4.1. Independientes
Forma farmacéutica
Tiempo de muestreo
3.4.2. Dependientes
Concentraciones de fármaco en plasma
Constantes farmacocinéticas
3.5. MATERIALES Y MÉTODOS
3.5.1. Materiales, Reactivos e Instrumentos analíticos
a. Materiales
Balones volumétricos de 250 mL, 100 mL, 50 ml y 25 mL
Cofia
Espátulas de acero
Frascos para fase móvil de 500 y 1000 mL
Gradilla
Guantes
Mascarilla
Matraces Erlenmeyer de 250 mL
Micropipeta BRAND 100 – 1000 µL No. Serie 02Z6359
Micropipeta Science MED 1000 – 5000 µL No. Serie DP03854
Cápsulas de pesado
Pipetas Pasteur
Probetas de 25 mL y 1000 mL
Tubos eppendorf de 1 mL
72
b. Reactivos
Acetato de amonio (cristales) J.T Baker
Acetonitrilo HPLC TECNOLAB
Ácido acético glacial J.T Baker
Agua HPLC Milli-Q
Capilares con heparina 75 mm
Duralágrima lubricante ocular ungüento Grin Medicamentos
Estándar de Glimepirida 99 % BH
Estándar de Pioglitazona 98.3 % BH
Éter anhidro J.T Baker
Glimepirida (Comercial) Lote: 1205006212
Heparina 1000 UI/mL PiSA Farmaceútica
Metanol HPLC Tecsiquim
Sistemas especializados de Glimepirida (Nanopartículas) Lote: DFF1303-36
Solución isotónica
Reactivo biológico
Ratas wistar
c. Equipos e Instrumentos
Balanza analítica Sartorius A9
Modelo: A210P
No. Serie: 40040065
Ilustración 11. Balanza analítica Fotografiado por: Wendy Chávez (2013)
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Sistema HPLC Agilent 1100
i. Detector
Modelo: G1315B
No. Serie: DE11113489
ii. Termostato
Modelo: G1316A
No. Serie: DE43650359
iii. Desgasificador
Modelo: G1322A
No. Serie: JP05030769
iv. Bomba
Modelo: G1311A
No. Serie: DE11115898
v. Sistema de Inyección
Modelo: G1313A
No. Serie: DE11116471
Ilustración 12. Sistema HPLC Fotografiado por: Wendy Chávez (2013)
74
Sonicador BRANSON
Modelo: 3510R-MTH
No. Serie: CPN-952-317R
Ilustración 13. Sistema HPLC Fotografiado por: Wendy Chávez (2013)
Agitador Heidolph
Modelo: Multi reax
No. Serie: 031001361
Ilustración 14. Agitador horizontal Fotografiado por: Wendy Chávez (2013)
Centrifuga EPPENDORF
Modelo: Centrifuge 5416
No. Serie: 5416B01202
Ilustración 15. Centrifuga Fotografiado por: Wendy Chávez (2013)
75
Cámara de CO2
CBIN-UNIPREC-01
Ilustración 16. Cámara de CO2 Fotografiado por: Wendy Chávez (2013)
3.5.2. Preparación de Reactivos
3.5.2.1. Fase móvil ACN:Buffer de acetato de amonio 20 mM pH= 4.5 (50:50)
a. Acetonitrilo
- Colocar 1000 mL de acetonitrilo (ACN) HPLC en un frasco de vidrio para fase
móvil.
- Filtrar al vacio el ACN HPLC por una membrana de nitrocelulosa de 0.45 µm.
- Colocar el ACN HPLC filtrado en el sonicador por 25 minutos.
b. Buffer de acetato de amonio 20 mM pH= 4.5
- Pesar en una cápsula 1.54 g de acetato de amonio
- Disolver en 800 mL de agua desionizada
- Ajustar el pH a 4.5 con ácido acético (1:9)
- Aforar la solución a 1000 mL con agua desionizada
- Filtrar la mezcla al vacío por una membrana de nitrocelulosa de 45 µm.
- Colocar la mezcla filtrada en el ultrasonido por 25 minutos.
76
3.5.2.2. Solución Stock de Glimepirida 1000 µg/mL
- Pesar en una cápsula 0.0100 g de estándar de Glimepririda (GLM)
- Transferir el contenido a un matraz de 10 mL
- Añadir aproximadamente 5 mL de metanol
- Agitar la solución por 5 minutos en vortex
- Colocar la solución en el ultrasonido por 5 minutos
- Aforar la solución con metanol y mezclar hasta disolución.
3.5.2.3. Solución Stock de Glimepirida 100 µg/mL
- Tomar una alícuota de 10 µL de la solución estándar de GLM de 1000 µg/mL
- Trasferir cuantitativamente a un matraz de 10 mL
- Aforar la solución con metanol y mezclar.
3.5.2.4. Solución Stock de Pioglitazona 1000 µg/mL
- Pesar en una cápsula 0.0100 g de estándar de Pioglitazona (PTZ)
- Transferir el contenido a un matraz de 10 mL
- Añadir aproximadamente 5 mL de metanol
- Agitar la solución por 5 minutos en vortex
- Colocar la solución en el ultrasonido por 5 minutos
- Aforar la solución con metanol y mezclar hasta disolución.
3.5.2.5. Solución Stock de Pioglitazona 60 µg/mL
- Tomar una alícuota de 600 µL de la solución estándar de PTZ de 1000 µg/mL.
- Trasferir cuantitativamente a un matraz de 10mL
- Aforar la solución con metanol y mezclar.
77
3.5.2.6. Preparación de soluciones stock para la curva de calibración y puntos de
control
Tabla 6. Preparación de soluciones iniciales y puntos control para la curva
Soluc. Stock GLM
1000µg/mL
(µL)
Soluc. Stock GLM
100µg/mL
(µL)
Aforo
(mL)
Conc. Stock
(µg/mL)
- 400 5.0 8
- 800 5.0 16
- 1200 5.0 24*
- 1600 5.0 32
- 2000 5.0 40
360 5.0 72*
400 5.0 80**
800 5.0 160
1200 5.0 240*
1600 5.0 320
2000 5.0 400
Elaborado por: Wendy Chávez (2014) *Puntos control Bajo, Medio y Alto ** Muestra para estandarización del equipo en sistema
3.5.2.7. Preparación para puntos de curva de calibración y puntos control en
método
Tabla 7. Preparación de puntos para la curva patrón y puntos control.
Conc. Stock
(µg/mL)
Alicuota
(µL)
Aforo
(mL)
Conc. Final
(µg/mL)
8 50 950 0.4
16 50 950 0.8
24 50 950 1.2*
32 50 950 1.6
40 50 950 2.0
72 50 950 3.6*
80 50 950 4.0**
160 50 950 8.0
240 50 950 12.0*
320 50 950 16.0
400 50 950 20.0
Elaborado por: Wendy Chávez (2014) *Puntos control Bajo, Medio y Alto ** Muestra para estandarización del equipo en método
78
3.5.3. Métodos
3.5.3.1. Primera etapa: Desarrollo del método
Para esto se partió de diferentes métodos ya desarrollados que utilizan HPLC y una
detección por UV para la cuantificación de glimepirida, por ejemplo los estudios de Sarita
Kumari Y. et. al. y Milena G et. al. La fase móvil que utilizan son similares tanto en
compuestos como en proporción, al igual que las columnas cromatográficas utilizadas.
(Milena G, 2005) (Kumari, Mishra, & Mishra, 2012)
La primera parte del desarrollo consistió en establecer las mejores condiciones de
separación cromatográfica en sistema (metanol) para lo cual las condiciones iniciales de
prueba se basaron en los trabajos antes mencionados, pero una vez que se realizó las
corridas cromatográficas no se obtuvo los resultados esperados en cuanto a selectividad
del método y resolución de los picos por lo que se realizó varias correcciones con el
objetivo de optimizar las condiciones ya probadas.
Inicialmente se trabajó con la Glibenclamida como estándar interno, como se observa en
los estudios de Milena G et. al., ya que esta sustancia presenta similares características a
la Glimepirida en su estructura y propiedades fisicoquímicas, sin embargo una vez
realizadas las pruebas no se obtuvo resultados adecuados principalmente en cuanto a
selectividad ya que se observó que los picos de Glibenclamida y Glimepirida no se
separaban completamente por lo tanto se dificultaba la integración de los mismos para la
determinación de las áreas respectivas.
Por esta razón se procedió a buscar otro compuesto que cumpla con las características
necesarias tanto en estructura como propiedades fisicoquímicas, respecto de la
Glimepirida, así como para la obtención de buenos resultados de separación
cromatográfica.
De esta manera en base a estudios anteriores realizados por Karthik y col., se realizaron
pruebas usando Pioglitazona como estándar interno obteniéndose muy buenos
resultados se separación en sistema, picos con buena resolución y muy buena
selectividad respecto de la Glimepirida, por lo tanto se estableció a al Pioglitazona como
estándar interno del método analítico.
79
La segunda etapa del desarrollo consistió en establecer las condiciones óptimas para la
cuantificación de Glimepirida en método, es decir, la extracción del analito desde la matriz
biológica que lo contiene y para esto se partió de condiciones reportadas por Milena y
col., que utilizan la extracción líquido-líquido, de esta manera se realizaron las pruebas
respectivas en base a las condiciones descritas pero los resultados no fueron adecuados,
los picos no tuvieron buena resolución y la separación entre el estándar y la muestra se
vio comprometida por lo que fue necesario buscar otro método de extracción.
El método establecido para la extracción fue la precipitación de proteínas, debido a que
tras realizar las pruebas correspondientes se obtuvo buenos resultados de separación y
resolución de los picos así como buen porcentaje de recuperación y selectividad del
método además este método resultó ser más sencillo y con menor tiempo para la
preparación de muestra. Así después de una larga búsqueda se logró obtener una buena
cuantificación y una buena recuperación de glimepirida y del estándar interno, por lo que
se procedió a la validación del método.
Karthik et al., T. Rajesh. et al., reportan en sus estudios con Glimepirida y Pioglitazona
rangos de concentraciones que van de los 20 ng/mL hasta una máxima concentración de
5000 ng/mL. En la mayoría teniendo un límite de cuantificación entre 100-200 ng/mL.
Todo esto, debido a que la concentración máxima plasmática (Cmax) en humanos está
entre 1800 ng/mL hasta 4000 ng/mL, dependiendo del peso de los individuos.
80
Tabla 8. Cuadro indicativo del desarrollo del método analítico.
Parámetros Condiciones iniciales Condiciones modificadas
Fase móvil ACN:Agua acidificada pH=3.3
con ácido acético glacial
ACN:Buffer acetato de
amonio 20 mM pH=4.5
Proporción fase
móvil
70:30
45:55
50:50
55:45
Columna Agilent Eclipse Plus C18
3.0x100 mm 3.5 µm
Agilent Zorbax C18
4.6x150 mm 3.5 mm
Agilent Eclipse XDB C18
4.6x150 mm 5 mm
Precolumna Eclipse XDB C18 4.6x12.5 mm
5 µm
Phenomenex C18
4.0x3.0 mm
Velocidad de flujo 1.5 mL/min
1.0 mL/min
0.5 mL/min
Volumen de
inyección 20 µL
30 µL
50 µL
100 µL
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
3.5.3.2. Segunda etapa: Validación del método
Se realizó la validación de la metodología analítica para la cuantificación de Glimepirida
en plasma de rata por HPLC/UV, para lo cual se llevaron a cabo los siguientes ensayos:
81
3.5.3.3. Validación del Sistema
3.5.3.3.1. Estandarización del equipo en Sistema
o Procedimiento:
Para realizar esta prueba se debe considerar el punto medio de la curva de calibración y
en base a esto preparar una solución que se inyecta en el equipo por lo menos seis
veces consecutivamente antes de realizar la corrida de una curva de calibración.
Para este caso se determinó una concentración media de la curva de calibración que
corresponde a 4000 ng/mL.
Criterio de aceptación:
Tabla 9. Criterios de aceptación para la estandarización del equipo en sistema
Parámetro Criterio
Repetibilidad (área del analito y su estándar interno) C.V. ≤ 2.0 %
Repetibilidad (tiempo de retención) C.V. ≤ 2.0 %
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
3.5.3.3.2. Linealidad del Sistema
o Procedimiento:
Se prepara dos curvas de calibración en base a las tablas 6 y 7 utilizando metanol para el
respectivo aforo.
Las curvas se corren en el HPLC el mismo día y se obtiene los cromatogramas para la
tabulación y gráfica de los datos obtenidos contra la concentración utilizada.
Determinar la regresión lineal para cada curva, la relación entre la concentración y la
respuesta, verificando la reproducibilidad y la continuidad a lo largo de todo el periodo de
trabajo.
82
Criterio de Aceptación:
Tabla 10. Criterios de aceptación para la linealidad del sistema
Parámetro Criterio
Coeficiente de correlación r ≥ 0.98
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
3.5.3.4. Validación el Método
3.5.3.4.1. Selectividad
o Procedimiento:
Se prepara una muestra control de 800 ng/mL, un blanco de plasma y un blanco de
plasma con estándar interno, en base a las tablas 6 y 7 y el Proceso de Extracción.
En un vial se coloca 500 µL de metanol HPLC 100 %, en otro vial se coloca 500 µL de
ACN HPLC 100 % y finalmente en otro vial se coloca 500 µL de Heparina.
Las muestras se inyectan en el HPLC y se observa en las respuestas cromatográficas
obtenidas que no haya interferencia de estas sustancias con la señal obtenida para el
fármaco analizado en su tiempo específico de retención.
Criterio de Aceptación:
Ninguna de las sustancias debe presentar interferencia en el tiempo de retención del
analito de interés. Si hay alguna señal debe ser menor a 20 % de la respuesta obtenida
para la concentración más baja de la curva.
3.5.3.4.2. Linealidad
o Procedimiento:
Se prepara tres curvas de calibración en base a las tablas 6 y 7 utilizando plasma para
los aforos respectivos.
83
Las curvas se corren el HPLC el mismo día y se obtiene los cromatogramas para la
tabulación y gráfica de los datos obtenidos contra la concentración utilizada.
Determinar la regresión lineal para cada curva, la relación entre la concentración y la
respuesta, verificando la reproducibilidad y la continuidad a lo largo de todo el periodo de
trabajo.
Criterio de Aceptación:
Tabla 11. Criterios de aceptación para la linealidad del método
Parámetro Criterio
Coeficiente de correlación r ≥ 0.98
Desviación estándar absoluta
Concentración adicionada vs recuperada
Cada nivel de concentración
Nivel más bajo de concentración
DEA ≤ 15 %
DEA ≤ 20 %
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
3.5.3.4.3. Límite de Detección
o Procedimiento:
Preparar por quintuplicado una muestra que corresponde a un punto control de
concentración conocida en este caso 400 ng/mL. Preparar una curva de calibración en
base a las tablas 6 y 7 utilizando plasma para los aforos respectivos. La curva se corre el
HPLC y se obtiene los cromatogramas para la tabulación y gráfica de los datos obtenidos
contra la concentración utilizada y después se inyecta las cinco muestras preparadas el
mismo día.
Se calcula el coeficiente de variación, la concentración recuperada y la desviación
estándar relativa a todos los puntos.
84
Criterio de Aceptación:
Los resultados deben cumplir con un coeficiente de variación de menor a 15 %. Si la
desviación estándar relativa de todos los puntos es menor a 20 %, cumple con el
parámetro de exactitud.
3.5.3.4.4. Límite de Cuantificación
o Procedimiento:
Preparar por quintuplicado una muestra de concentración conocida, para este caso se
utiliza como punto control que para este caso será de 800 ng/mL.
Preparar una curva de calibración en base a las tablas 6 y 7 utilizando plasma para los
aforos respectivos.
La curva se corre el HPLC y se obtiene los cromatogramas para la tabulación y gráfica de
los datos obtenidos contra la concentración utilizada y después se inyectan las cinco
muestras preparadas el mismo día.
Criterio de aceptación:
Los resultados deben cumplir con un coeficiente de variación menor a 15 %. La
desviación estándar relativa de todos los puntos es menor a 20 %, con esto cumple con
el parámetro de exactitud y precisión.
3.5.3.4.5. Recuperación Absoluta
o Procedimiento:
Preparar por triplicado tres puntos control de concentración conocida, en metanol y
plasma, para este caso se utilizan las siguientes concentraciones:
- Punto bajo: 1200 ng/mL
- Punto medio: 3600 ng/mL
- Punto alto: 12000 ng/mL
85
Las muestras preparadas se inyectan en el equipo por triplicado y se obtienen los
cromatogramas respectivos.
Calcular el promedio, la desviación estándar y el coeficiente de variación de la respuesta
obtenida para cada concentración.
Determinar el parámetro mediante la siguiente fórmula:
% 𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑎 =𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑚é𝑡𝑜𝑑𝑜
𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑠𝑖𝑠𝑡𝑒𝑚𝑎𝑥100
Criterio de aceptación:
La diferencia de recuperación entre los tres niveles de concentración, no debe ser mayor
a 15 %.
La recuperación no necesariamente debe ser de un 100 % pero si preciso para cada
concentración.
3.5.3.4.6. Precisión
o Procedimiento:
Este parámetro está relacionado con la dispersión de las medidas alrededor de un valor,
corresponde al valor de concordancia entre diferentes ensayos.
La precisión se evalúa con la repetibilidad y reproducibilidad intralaboratorio.
3.5.3.4.6.1. Repetibilidad
o Procedimiento:
Preparar en un mismo día una curva de calibración y tres puntos control (alto, medio y
bajo), los cuales se inyectan por quintuplicado, todas las muestras se analizan en una
misma corrida analítica.
Calcular la concentración recuperada en cada nivel de concentración, interpolando los
datos obtenidos para los puntos control.
86
Calcular el promedio, la desviación estándar y el coeficiente de variación en cada una de
las concentraciones analizadas.
Criterio de aceptación:
El método es repetible si el coeficiente de correlación para cada una de las tres
concentraciones no es mayor a 15 %.
3.5.3.4.6.2. Reproducibilidad
o Procedimiento:
Preparar una curva de calibración y tres puntos control (alto, medio y bajo), los cuales se
inyectan por triplicado, durante tres días.
Calcular la concentración recuperada y tabular los resultados obtenidos para cada uno de
los puntos control.
Determinar el promedio, la desviación estándar y el coeficiente de variación en cada una
de las concentraciones analizadas.
Criterio de aceptación:
El método es reproducible si el coeficiente de variación para cada concentración no es
mayor a 15 %.
3.5.3.4.7. Exactitud
o Procedimiento:
Con los datos obtenidos de repetibilidad y reproducibilidad, se calcula el porcentaje de la
desviación absoluta de por lo menos seis datos para cada nivel de concentración.
Determinar el parámetro con la siguiente fórmula:
% 𝐷𝑒𝑠𝑣𝑖𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑎 =𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑛𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎𝑙 − 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜
𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑛𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎𝑙𝑥100
87
Criterio de aceptación:
El método es exacto si el porcentaje de la desviación absoluta para cada concentración
no es mayor al 15 %.
3.5.3.4.8. Estabilidad
3.5.3.4.8.1. Estabilidad a t = 0
o Procedimiento:
Preparar tres muestras correspondientes a los puntos de control (alto, medio y bajo), de
cada muestra tomar un volumen determinado e inyectar por quintuplicado en el equipo
para realizar el primer análisis que corresponde a t=0.
Se toma un volumen de aproximadamente 1 mL de cada muestra y se almacena por 24
horas en refrigeración (2-3 °C), otro volumen igual de cada muestra se almacena por 24
horas a temperatura ambiente y por último un tercer volumen igual de cada muestra se
somete a congelación durante 15 días (este último se descongela a la semana y se
vuelve a congelar para posteriormente descongelar para su análisis respectivo una vez
que se ha cumplido el tiempo establecido).
El día del análisis se prepara una curva de calibración y los puntos de control respectivos
por triplicado.
3.5.3.4.8.2. Estabilidad en muestras de refrigeración a las 24 horas
o Procedimiento:
Preparar puntos control (alto, medio y bajo) por triplicado y analizar a tiempo cero, otra
serie de muestras procesarlas hasta antes de la reconstitución y almacenarlas en
refrigeración por 24 horas.
El día del análisis preparar por triplicado puntos control y una curva de calibración.
Calcular la concentración recuperada interpolando los valores en la curva de calibración,
calcular la % DEA y comparar con los resultados obtenidos a tiempo cero
88
3.5.3.4.8.3. Estabilidad de la muestra a temperatura ambiente
o Procedimiento:
Preparar puntos control (alto, medio y bajo) por triplicado y analizar a tiempo cero, otra
serie de muestras procesarlas hasta antes de la reconstitución y almacenarlas a
temperatura ambiente por 24 horas.
El día del análisis preparar por triplicado puntos control y una curva de calibración.
Calcular la concentración recuperada interpolando los valores en la curva de calibración,
calcular la % DEA y comparar con los resultados obtenidos a tiempo cero.
Para todas las pruebas de estabilidad se utilizó la siguiente fórmula para determinar la
desviación absoluta y el mismo criterio de aceptación.
% 𝐷𝑒𝑠𝑣𝑖𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑎 =𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑛𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎𝑙 − 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜
𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑛𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎𝑙𝑥100
Criterio de aceptación:
Tabla 12. Criterios de aceptación para estabilidad a tiempo cero
Parámetro Criterio
Cumple criterio de precisión CV ˂ 15 %
Valor de la desviación estándar absoluta DEA ˂ 15 %
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
89
3.5.3.4.9. Tolerancia
o Procedimiento:
Preparar por triplicado un punto control en este caso medio (3600 ng/mL) y preparar una
curva de calibración en base a las tablas 3.3-1 y 3.3-2 utilizando plasma para los aforos
respectivos.
Se debe modificar la composición de la fase móvil en un 5% obteniendo de esta manera
dos condiciones de trabajo a las que se someterán las muestras:
a) 58 % ACN : 42 % Buffer de acetatos
b) 52 % ACN : 58 % Buffer de acetatos
En un mismo día se analiza en el HPLC por triplicado el punto control preparado y una
curva de calibración a cada una de las condiciones establecidas y se obtiene los
cromatogramas respectivos.
Criterio de aceptación
Tabla 13. Criterios de aceptación para la tolerancia del método
Parámetro Criterio
Cumple criterio de precisión CV ˂ 15 %
Valor de la desviación estándar absoluta DEA ˂ 15 %
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
% 𝐷𝑒𝑠𝑣𝑖𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑎 =𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑛𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎𝑙 − 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜
𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑛𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎𝑙𝑥100
90
3.5.3.5. Tercera etapa: Aplicación de la metodología
La metodología validada se aplicó en un estudio farmacocinético preclínico en ratas en el
que se realizó la comparación estadística de los parámetros farmacocinéticos de Cmáx,
Tmáx, AUC, constante de eliminación (Kel), constante de absorción (Ka), y tiempo medio
de eliminación (t ½ e) de la formulación de Glimepirida en nanopartículas con los
parámetros obtenidos para la formulación comercial de Glimepirida.
3.5.3.5.1. Condiciones experimentales
Tabla 14. Tratamiento del animal y condiciones experimentales
Tratamientos
Condiciones
experimentales
Glimepirida en
Nanopartículas
Glimepirida
comercial
Especie Rata Rata
Variedad Wistar Wistar
Peso 250-300 g 250-300 g
n = 16 16
Dosis 4 mg/kg 4 mg/kg
Vía Administración intramuscular intramuscular
Alimento y agua ad libitum ad libitum
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Los cuidados de los animales cumplirán con las guías de NIH Guide for Care and Use of
Laboratory Animals.
3.5.3.5.2. Toma de muestras
La toma de muestras se realizó en base a los periodos de muestreo establecidos
considerando que el estudio se llevó a cabo en dos días, así para la formulación
comercial el primer día se muestreo las ratas de la 1 a la 8 y el segundo día las ratas de
la 9 a la 16, del mismo modo para la formulación en nanopartículas el primer día se
realizó el muestreo de las ratas de la 9 a la 16 y el segundo día las ratas de la 1 a la 8, de
esta manera se obtuvo 4 datos para cada tiempo de muestreo.
91
Tabla 15. Periodo de muestreo tras la administración de nanopartículas de Glimepirida.
Tiempos de toma de
muestras (min)
Cantidad
de muestra
GR
UP
O N
1
Rata 1
(R1N) 0 ; 60 ; 240 ; 1440 0,5 ml
Rata 2
(R2N) 0 ; 60 ; 240 ; 1440 0,5 ml
Rata 9
(R9N) 0 ; 60 ; 240 ; 1440 0,5 ml
Rata 10
(R10N) 0 ; 60 ; 240 ; 1440 0,5 ml
GR
UP
O N
2
Rata 3
(R3N) 0 ; 120 ; 480 ; 720 0,5 ml
Rata 4
(R4N) 0 ; 120 ; 480 ; 720 0,5 ml
Rata 11
(R11N) 0 ; 120 ; 480 ; 720 0,5 ml
Rata 12
(R12N) 0 ; 120 ; 480 ; 720 0,5 ml
GR
UP
O N
3
Rata 5
(R5N) 15 ; 180 ; 360 ; 540 0,5 ml
Rata 6
(R6N) 15 ; 180 ; 360 ; 540 0,5 ml
Rata 13
(R13N) 15 ; 180 ; 360 ; 540 0,5 ml
Rata 14
(R14N) 15 ; 180 ; 360 ; 540 0,5 ml
GR
UP
O N
4
Rata 7
(R7N) 30 ; 300 ; 420 ; 660 0,5 ml
Rata 8
(R8N) 30 ; 300 ; 420 ; 660 0,5 ml
Rata 15
(R15N) 30 ; 300 ; 420 ; 660 0,5 ml
Rata 16
(R16N) 30 ; 300 ; 420 ; 660 0,5 ml
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
92
Tabla 16. Periodo de muestreo tras la administración de Glimepirida comercial.
Tiempos de toma de
muestras (min)
Cantidad de
muestra
GR
UP
O C
1
Rata 1
(R1C) 0 ; 60 ; 240 ; 1440 0,5 ml
Rata 2
(R2C) 0 ; 60 ; 240 ; 1440 0,5 ml
Rata 9
(R9C) 0 ; 60 ; 240 ; 1440 0,5 ml
Rata 10
(R10C) 0 ; 60 ; 240 ; 1440 0,5 ml
GR
UP
O C
2
Rata 3
(R3C) 0 ; 120 ; 480 ; 720 0,5 ml
Rata 4
(R4C) 0 ; 120 ; 480 ; 720 0,5 ml
Rata 11
(R11C) 0 ; 120 ; 480 ; 720 0,5 ml
Rata 12
(R12C) 0 ; 120 ; 480 ; 720 0,5 ml
GR
UP
O C
3
Rata 5
(R5C) 15 ; 180 ; 360 ; 540 0,5 ml
Rata 6
(R6C) 15 ; 180 ; 360 ; 540 0,5 ml
Rata 13
(R13C) 15 ; 180 ; 360 ; 540 0,5 ml
Rata 14
(R14C) 15 ; 180 ; 360 ; 540 0,5 ml
GR
UP
O C
4
Rata 7
(R7C) 30 ; 300 ; 420 ; 660 0,5 ml
Rata 8
(R8C) 30 ; 300 ; 420 ; 660 0,5 ml
Rata 15
(R15C) 30 ; 300 ; 420 ; 660 0,5 ml
Rata 16
(R16C) 30 ; 300 ; 420 ; 660 0,5 ml
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
93
3.5.3.5.3. Administración de fármaco
Se preparó una solución de Glimepirida comercial de 1,7 mg/mL y una solución de
nanopartículas de Glimepirida de 2,5 mg/mL, en ambos casos se disolvió las sustancias
en solución isotónica, se agitó por 10 minutos en vortex y se mantuvo en refrigeración
hasta el momento de la administración.
Las ratas previamente colocadas en las jaulas metabólicas desde el día anterior, se
pesaron para realizar el cálculo de volumen de las soluciones de fármaco a administrar
en base a una dosis de 4 mg/kg de peso.
Ilustración 17. Toma de pesos de las ratas. Fotografiado por: Wendy Chávez (2013)
Para cada rata se realizó el cálculo de la dosis individual en base a su peso obteniéndose
la siguiente tabla de datos:
94
Tabla 17. Peso, dosis individual y volumen a administrar de Glimepirida comercial
GLM COMERCIAL
RATA PESO (g) Dosis (mg) VOLUMEN
(mL)
1C 284,6 1,1 0,7
2C 265,5 1,1 0,6
3C 264,2 1,1 0,6
4C 263,6 1,1 0,6
5C 253,2 1,0 0,6
6C 253,1 1,0 0,6
7C 251,3 1,0 0,6
8C 255,7 1,0 0,6
9C 325,8 1,3 0,8
10C 302,7 1,2 0,7
11C 294,3 1,2 0,7
12C 292,2 1,2 0,7
13C 270,7 1,1 0,6
14C 272,1 1,1 0,7
15C 270,0 1,1 0,6
16C 265,6 1,1 0,6
Elaborado por: Wendy Chávez (2014)
Tabla 18. Peso, dosis y volumen a administrar de nanopartículas de Glimepirida
GLM NANOPARTICULAS
RATA PESO (g) Dosis (mg) VOLUMEN
(mL)
1C 327,3 1,3 0,5
2C 378,6 1,5 0,6
3C 298,8 1,2 0,5
4C 302,9 1,2 0,5
5C 298,1 1,2 0,5
6C 297,3 1,2 0,5
7C 282,4 1,1 0,5
8C 290,2 1,2 0,5
9C 260,0 1,0 0,4
10C 270,0 1,1 0,4
11C 263,1 1,1 0,4
12C 263,3 1,1 0,4
13C 261,1 1,0 0,4
14C 261,5 1,0 0,4
15C 256,2 1,0 0,4
16C 254,7 1,0 0,4
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
95
Una vez que las ratas fueron pesadas y agrupadas en parejas considerando la
homogeneidad de pesos se colocó el número de identificación en la cola y se realizó la
administración de las soluciones de Glimepirida comercial y nanopartículas de
Glimepirida respectivamente por vía intramuscular.
Ilustración 18. Administración intramuscular en rata Fotografiado por: Wendy Chávez (2013)
3.5.3.5.4. Obtención de muestras
La muestra de sangre se extrajo del seno retro-orbital de la rata y se colectó en un tubo
eppendorf con heparina debidamente rotulado, el procedimiento fue el siguiente:
a. En un recipiente con cierre hermético se coloca una cama de algodón y luego se
añade 4 mL de éter etílico (mantener correctamente cerrado el recipiente).
b. Se coloca la rata en el interior del recipiente y se cierra de manera adecuada para
evitar fugas de éter.
c. Una vez que la rata no presenta movimientos reflejos es retirada del recipiente y
se coloca sobre la mesa de manera lateral.
d. Con un capilar heparinizado se procede a la obtención de la muestra sanguínea
colocando este de manera suave pero firme en el canto medial de la órbita ocular
de la rata y con movimientos lentos y rotativos avanzar con el capilar hacia la
parte dorsal hasta que la sangre empiece a fluir a través del mismo, como se
observa en la siguiente ilustración:
Ilustración 19. Obtención de muestra sanguínea del seno retro orbital de la rata Fotografiado por: Wendy Chávez (2013)
96
e. Colectar en el tubo eppendorf un volumen de 0.5 mL, homogenizar con la
heparina y tapar correctamente.
f. Retirar el capilar y con una torunda de algodón hacer presión sobre el ojo para
detener la salida de sangre, finalmente aplicar el lubricante ocular y colocar a la
rata en la jaula para su recuperación.
3.5.3.5.5. Tratamiento de las muestras:
Centrifugar la muestra durante 15 minutos, separar cuidadosamente el plasma
con una pipeta Pasteur y colocarlo en otro tubo eppendorf debidamente rotulado.
Mantener las muestras en congelación a -23 °C hasta el día del análisis.
Las muestras se analizaron según el método validado por HPLC con detector UV.
3.5.3.5.6. Método de extracción por precipitación de proteínas
Preparación de puntos para curva de calibración y puntos control en método.
Tabla 19. Preparación de las muestras de la curva patrón y puntos control en plasma.
Conc. Final
(ng/mL)
Alicuota
(µL)
S.I. 3 µg/mL
(µL)
ACN
(µL)
Aforo
(mL)
400 100 20 280 400
800 100 20 280 400
1200* 100 20 280 400
1600 100 20 280 400
2000 100 20 280 400
3600* 100 20 280 400
4000** 100 20 280 400
8000 100 20 280 400
12000* 100 20 280 400
16000 100 20 280 400
20000 100 20 280 400
Elaborado por: Wendy Chávez (2015) *Puntos control Bajo, Medio y Alto ** Muestra para estandarización del equipo en sistema *** S.I.: Estándar interno Pioglitazona
97
Tomar 100 µL de muestra (plasma) y colocar en un tubo eppendorf debidamente
rotulado.
Agregar 20 µL de estándar interno (Pioglitazona).
Añadir 280 µL de Acetonitrilo ACN
Colocar 2 gotas de solución al 10 % de ZnSO4
Agitar en el vortex horizontal durante 60 segundos a nivel 10.
Centrifugar a 10000 rpm durante 10 minutos y posteriormente decantar el
sobrenadante.
Colocar el sobrenadante en tubo para muestra, tapar y colocar en el equipo
Inyectar un volumen de 50 µL para el análisis cromatográfico.
3.5.3.5.7. Estructura del DCA
En el presente estudio se utilizó un diseño de bloques completamente al azar (DCA)
considerando 2 tratamientos (dosis de nanopartículas de Glimepirida y dosis de
medicamento comercial de Glimepirida), utilizando 16 ratas para cada formulación
divididas en 4 grupos de manera aleatoria según las horas de toma de muestra. Ver
Anexo 1 y 2.
A continuación se determinó los puntos de la gráfica Concentración vs Tiempo para cada
forma farmacéutica combinando el tiempo con la media de las dos repeticiones
correspondientes.
Donde:
TN(t): TN es la dosis de 4 mg de nanopartículas de Glimepirida a los diferentes
intervalos de toma de muestra y t es el tiempo asignado en minutos.
XN(t): XN es la media de las concentraciones plasmáticas de nanopartículas de
Glimepirida de cada uno de los grupos de muestreo para este tratamiento.
TC(t): TC es la dosis de 4 mg de Glimepirida comercial a los diferentes intervalos de
toma de muestra y t es el tiempo asignado en minutos.
XC(t): XC es la media de las concentraciones plasmáticas de Glimepirida comercial de
cada uno de los grupos de muestreo para este tratamiento.
98
Tabla 20. Puntos de la gráfica Conc. vs Tiempo para la GLM en nanopartículas
Tiempo min
(x)
XN
(y)
0 TN0XN1
15 TN15XN2
30 TN30XN3
60 TN60XN4
120 TN120XN5
180 TN180XN6
240 TN240XN7
300 TN300XN8
360 TN360XN9
420 TN420XN10
480 TN480XN11
540 TN540XN12
660 TN660XN13
720 TN720XN14
1440 TN1440XN15
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Tabla 21. Puntos de la gráfica Conc. vs Tiempo para la GLM comercial
Tiempo min
(x)
XC
(y)
0 TC0XC1
15 TC15XC2
30 TC30XC3
60 TC60XC4
120 TC120XC5
180 TC180XC6
240 TC240XC7
300 TC300XC8
360 TC360XC9
420 TC420XC10
480 TC480XC11
540 TC540XC12
660 TC660XC13
720 TC720XC14
1440 TC1440XC15
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
99
Nota: El tiempo se grafica en el eje X y la media de la concentración de las dos
repeticiones en el eje Y.
3.5.3.5.8. Determinación del orden de reacción
Posteriormente se determina el orden de la reacción para lo cual se realiza la regresión
lineal de los datos considerando 3 posibilidades y se grafica de la siguiente manera:
Orden 0: Concentración vs tiempo
Orden 1: ln Concentración vs tiempo
Orden 2: 1 / Concentración vs tiempo
Para la determinación del orden de reacción se toma como criterio de aceptación el
coeficiente de correlación cuyo valor sea el más cercano a la unidad.
3.5.3.5.9. Cálculo de las constantes farmacocinéticas
Para el cálculo de las constantes farmacocinéticas se usaron las siguientes ecuaciones:
Tiempo medio de eliminación
t ½ e =0,693
Ke
Ecuación 3. Tiempo medio de eliminación
Tiempo máximo t máx
𝑡𝑚á𝑥 =2,303
Ka− Ke𝑙𝑜𝑔
𝐾𝑎
𝐾𝑒
Ecuación 4. Tiempo máximo
Concentración máxima C máx
𝐶𝑚á𝑥 = Co𝐾𝑎
Ka−Ke(
𝑒−𝐾𝑒(𝑡𝑚á𝑥)
1−𝑒−𝐾𝑒𝜏−
𝑒−𝐾𝑎(𝑡𝑚á𝑥)
1−𝑒−𝐾𝑎𝜏)
Ecuación 5. Concentración máxima
100
Área bajo la curva (AUC)
El cálculo del área total bajo la curva de nivel plasmático resulta de la suma de dos áreas,
el área bajo el segmento A-B-C de la curva y el área que comprende el segmento C-D,
como se observa en la siguiente figura:
Ilustración 20. Curva de nivel plasmático. Fase de absorción A-B-C. Fase de eliminación C-D.
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
- Cálculo del Área del segmento A-B-C
Ilustración 21. Curva de nivel plasmático segmentada por trapecios Fuente:http://sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/cide02/capitulo02/09a.html
101
Para el cálculo del área consideramos a la curva como un conjunto de trapecios como se
observa en la ilustración 21, de los cuales calculamos el área individual utilizando la
siguiente fórmula:
𝐀𝐫𝐞𝐚 𝐝𝐞𝐥 𝐭𝐫𝐚𝐩𝐞𝐜𝐢𝐨 =𝐲𝟏 + 𝐲𝟐
𝟐(∆𝐱)
Ecuación 6. Área de un trapecio
El área total del segmento ABC es el resultado de la sumatoria de las áreas individuales
de los trapecios comprendidos entre los tres puntos que delimitan este segmento.
- Cálculo del Área del segmento C-D
Para el cálculo del área de este segmento consideramos a la curva como administración
intravenosa I.V, para lo cual aplicamos el Método de Dost con la siguiente ecuación:
(Aguilar A., 2008)
𝐴𝑟𝑒𝑎 𝐶𝐷 =𝐶𝑜
Ke
Ecuación 7. Ecuación de Dost
Donde:
Co = Valor de concentración del punto C
Ke = Constante de eliminación
102
CAPÍTULO IV
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
4.1. DESARROLLO DEL MÉTODO ANALÍTICO
La obtención de las condiciones cromatográficas adecuadas se realizó en base a dos
artículos científicos S. Kumari et. al 2012 y Milena G. et. al 2005, sin embargo los picos
obtenidos no tenían buena resolución por lo que se realizó una modificación en la
proporción de la fase móvil considerando un tercer artículo científico Karthik A., et. al,
2008, hasta que finalmente se obtuvo la resolución adecuada.
Posteriormente se detectó un segundo problema con la cuantificación de Glimepirida ya
que a pesar de que las muestras se preparaban de manera adecuada, los resultados
obtenidos de concentración no eran los correctos por lo que en base a los artículos
consultados, en los que se indicaba que para obtener el área y altura adecuadas para los
picos era necesaria la inyección de mayor volumen de muestra, se probaron tres
volúmenes de inyección hasta que se obtuvo el resultado óptimo de concentración,
además se realizaron varias pruebas con la columna y la velocidad de flujo para la
determinación del mejor tiempo de retención de analito de interés.
Para el desarrollo del método se dividió el estudio en dos fases, inicialmente se debió
establecer las condiciones cromatográficas ideales para el método y la segunda fase
consistió en obtener las condiciones óptimas para la extracción del analito desde su
matriz biológica, para esto lo primero que se estableció fue el compuesto que se utilizó
como estándar interno.
a. Prueba de condiciones cromatográficas para la cuantificación de glimepirida.
Ilustración 22. Glimepirida (10 µg/mL) en metanol.
Glimepirida
103
En este cromatograma se muestra una prueba realizada para determinar el tiempo de
retención de la Glimepirida que es el analito de interés, obteniendo un resultado de 5.7 a
partir de lo cual podemos determinar si existe interferencia con la sustancia que será
utilizada como estándar interno.
b. Prueba de condiciones cromatográficas que pudieran separar las señales y
mejorar la cuantificación de ambos analitos.
Ilustración 23. Glimepirida con Glibenclamida como estándar interno (1 µg/mL).
En base la información obtenida de varios artículos la primera opción a considerar para
estándar interno fue la Glibenclamida debido a sus características similares con el analito
de interés, es decir, la Glimepirida, sin embargo no se obtuvo las características
adecuadas de altura y resolución de los picos, en este cromatograma podemos observar
que no se obtuvieron condiciones para separar y tener buena resolución en las
respuestas de los compuestos, por lo que se probó con otra sustancia
c. Identificación del tiempo de retención del estándar interno Pioglitazona a las
condiciones cromatográficas desarrolladas hasta ese momento.
Ilustración 24. Cromatograma de pioglitazona (3 µg/mL) como estándar interno en metanol.
Glibenclamida
Glimepirida
Pioglitazona
104
La Pioglitazona es un hipoglicemiante de características estructurales y fisicoquímicas
similares a la Glimepirida por lo que fue una excelente opción a usar como estándar
interno, dando resultados adecuados de tiempo de retención, altura y resolución del pico,
lo que permite una buena cuantificación tanto del analito como del estándar interno.
d. Para probar el nuevo estándar interno se analizó a altas concentraciones y
posteriormente se ajustó la concentración.
Ilustración 25. Cromatograma muestra Glimepirida con Pioglitazona como estándar interno
(Concentraciones: 12 µg/mL PGZ, 1 µg/mL GLM).
Las pruebas con el nuevo estándar interno Pioglitazona fueron buenas ya que como se
puede observar en la Ilustración 25 el tiempo de retención es de 3.6 minutos lo cual no
interfiere con el tiempo de retención de la Glimepirida, además se observa una
separación adecuada entre las dos sustancias y el ruido generado por el plasma de rata
no afecta los tiempos de retención de las mismas, en base a estos resultados se decide
trabajar con la Pioglitazona como estándar interno para el método.
Para la determinación del método de extracción se probó dos opciones: extracción
líquido-líquido para la que se usaron dos solventes, éter etílico al 100 % y una mezcla de
éter etílico y diclorometano (70:30),
e. Se utilizó la mezcla éter:diclorometano para el proceso de extracción líquido-
líquido
Pioglitazona
Glimepirida
105
Ilustración 26. Glimepirida con Pioglitazona (Concentraciones: 12 µg/mL PGZ, 1 µg/mL GLM).
Extracción éter:diclorometano (70:30).
Como se puede observar en el cromatograma con este método no se obtuvo buenos
resultados de resolución y separación de los picos por lo que se realizó una serie de
modificaciones como aumento del tiempo de agitación, evaporación con nitrógeno,
congelación de las muestras a -70°C antes de la evaporación, pero aun así no se logró
resultados óptimos, ya que el estándar interno no logró ser cuantificado, por lo que se
realizó una prueba con otro solvente.
f. La cuantificación de Glimepirida con el método de extracción éter 100 % fue
buena, sin embargo la cuantificación de Pioglitazona no dio buenos resultados.
Ilustración 27. Glimepirida con Pioglitazona (Concentraciones: 3 µg/mL PGZ, 1 µg/mL GLM).
Extracción con éter (100 %).
Pioglitazona
Pioglitazona
Glimepirida
Glimepirida
106
En el cromatograma se puede observar que la resolución del pico de Glimepirida mejora
con respecto al cromatograma anterior sin embargo, el área y altura no son óptimas,
además la Pioglitazona sigue causando dificultad para su cuantificación.
g. Finalmente se probó la extracción por el método de precipitación de proteínas con
ACN, obteniéndose buenos resultados de separación y resolución de las señales
cromatográficas para la GLM y la PGZ.
Ilustración 28. Glimepirida con Pioglitazona (Concentraciones: 3 µg/mL PGZ, 1 µg/mL GLM). Extracción por precipitación de proteínas con ACN.
Tiempo de retención PGZ: 3.6 minutos. Tiempo de retención GLM: 5.7 minutos.
El cromatograma muestra la segunda prueba realizada para la extracción que es la
precipitación de proteínas, para lo cual se utilizó inicialmente el metanol como disolvente
considerando que las muestras se prepararon en dicho disolvente, sin embargo la
precipitación no fue adecuada y los picos no tuvieron buena resolución por lo que se optó
por usar como disolvente el acetonitrilo.
La extracción resultante fue bastante satisfactoria sin embargo la recuperación promedio
fue menor a 50 % por lo que se utilizó Sulfato de Zinc para mejorar la precipitación de las
proteínas y de esta manera mejoró la resolución de los picos y la recuperación aumentó a
valores por encima de 80 %.
Una vez determinado el estándar interno y el método de extracción se procedió a realizar
las pruebas para establecer el tiempo de agitación adecuado para las muestras, para lo
cual se probaron 3 tiempos: 30, 60 y 90 segundos; no se observó una diferencia
altamente significativa sin embargo se determinó que el mejor tiempo de agitación es 60
Pioglitazona
Glimepirida
107
segundos con lo cual se obtienen picos con mejor altura que a 30 segundos y se optimiza
el proceso en términos de reducción de tiempo con relación a los 90 segundos.
De este cromatograma se partió para corregir detalles en las condiciones
cromatográficas y de extracción y obtener la resolución adecuada.
4.1.1. Condiciones cromatográficas
Las condiciones cromatográficas finales que se utilizaron para la validación del método
analítico y su aplicación fueron las siguientes:
Tabla 22. Condiciones cromatográficas finales determinadas para el método analítico.
Parámetro Condición
Fase móvil ACN:Buffer acetato de amonio 20 mM pH=4.5
(55:45)
Columna cromatográfica Agilent Eclipse XDB C18 4.6x150 mm
Precolumna Phenomenex C18 4.0x3.0 mm
Temperatura 40 °C
Velocidad de flujo 1.0 mL/min
Volumen de inyección 50 µL
Longitud de onda 230 nm
Tiempo de retención Pioglitazona 3.7 minutos
Tiempo de retención Glimepirida 5.7 minutos
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Ilustración 29. Cromatograma de muestra a las condiciones cromatográficas finales
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
108
4.2. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO
4.2.1. Estandarización del equipo en sistema
Tabla 23. Resultados de la estandarización del equipo en sistema
Datos Pioglitazona Glimepirida
(400 ng/mL)
Relación
de áreas
Área T.
Retención Área
T.
Retención
1 304,50 3,696 109,50 5,737 0,3596
2 305,90 3,697 108,90 5,734 0,3560
3 306,50 3,635 109,20 5,731 0,3563
4 307,10 3,695 109,52 5,728 0,3566
5 306,40 3,688 106,20 5,721 0,3466
Promedio 306,0800 3,6822 108,6640 5,7302 0,3550
Desv. Est. 0,9808 0,0266 1,4005 0,0061 0,0049
% C.V. 0,3 0,7 1,3 0,1 1,4
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
4.2.2. Linealidad del sistema
Ilustración 30. Linealidad del sistema. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
y = 0,0001x - 0,0299r² = 0,9997
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 5000 10000 15000 20000 25000
Re
laci
ón
de
Áre
as
Concentración (ng/mL)
Linealidad del Sistema
109
La estandarización del equipo en sistema es un parámetro que se analiza para cada
inyección o corrida de muestras con el objetivo de asegurar que el equipo funciona de
manera adecuada y bajo las mismas condiciones arrojando resultados similares durante
todo el estudio, en la tabla 26 podemos observar los resultados para esta prueba, donde
el CV no fue mayor al 2 % durante todo el estudio por lo que al igual que en la curva de
calibración para este parámetro con un coeficiente de correlación de 0,9997 cumple con
el criterio de aceptación establecido por la farmacopea.
En consecuencia a partir de estos criterios se establece que el sistema es lineal y preciso
en un rango de 800 ng/mL a 20000 ng/mL.
4.2.3. Selectividad del método
Para establecer la selectividad del método se consideraron todas las sustancias que se
utilizan como reactivos para la extracción del fármaco desde su matriz biológica (plasma),
los componentes de la fase móvil así como las sustancias necesarias para la
conservación de las muestras y extracción de muestras sanguíneas.
Una vez que se obtuvieron los cromatogramas respectivos se observa que ninguna de las
sustancias anteriores presenta interferencia en el tiempo de retención de los analitos de
interés.
a. Blanco de Plasma
Ilustración 31. Selectividad del método. Blanco de plasma.
110
b. Blanco de plasma con estándar interno (Pioglitazona)
Ilustración 32. Selectividad del método. Blanco de plasma con PGZ.
c. Fase Movil
Ilustración 33. Selectividad del método. Fase móvil.
d. Metanol
Ilustración 34. Selectividad del método. Metanol.
111
e. Sulfato de Zinc
Ilustración 35. Selectividad del método. Sulfato de zinc.
f. Heparina
Ilustración 36. Selectividad del método. Heparina.
g. Estándar interno (Pioglitazona) en metanol
Ilustración 37. Selectividad del método. S.I. Pioglitazona.
112
h. Glimepirida en metanol
Ilustración 38. Selectividad del método. Glimepirida.
i. Muestra de 4000 ng/mL
Ilustración 39. Selectividad del método. Muestra de 800 ng/mL GLM + PGZ.
En los cromatogramas comprendidos entre la Ilustración 30 a la 38, se puede observar
que no existe interferencia entre los tiempos de retención de todas estas sustancias con
los analitos de interés como son la Pioglitazona y la Glimepirida, además no existe
interferencia a causa del ruido generado por las muestras de blanco de plasma y plasma
hemolizado, ya que a pesar de que existen pequeñas señales debido al plasma y a la
fase móvil, estas no superan el 20 % de respuesta por lo que la extracción y
cuantificación no se ven afectadas.
A partir de esto se establece que el método desarrollado es selectivo para los analitos de
interés.
113
4.2.4. Linealidad del método
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
400 0,03434
800 0,06914
1600 0,14732
2000 0,17374
4000 0,41743
8000 0,86140
16000 1,75240
20000 2,22785
m = 0,0001
b = 0,0299
r = 0,99999
r2 = 0,999976
Ilustración 40. Resultados de linealidad del método. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
En la gráfica de linealidad del método podemos observar un coeficiente correlación de
0,999976 por lo que cumple con el criterio de aceptación y podemos establecer que el
método desarrollado para la cuantificación de Glimepirida en plasma de rata es lineal y
preciso en el rango de 400 ng/mL a 20000 ng/mL.
y = 0.0001x + 0.0299R² = 0.999976
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 5000 10000 15000 20000 25000
Re
laci
ón
de
Áre
as
Concentración (ng/mL)
Linealidad del Método
114
4.2.5. Precisión
4.2.5.1. Repetibilidad
Para la prueba de Repetibilidad se realizó el análisis por quintuplicado de los tres puntos
control bajo 1200 ng/mL, medio 3600 ng/mL y alto 12000 ng/mL obteniéndose los
siguientes resultados:
Punto control bajo 1200 ng/mL
Tabla 24. Repetibilidad del método punto control bajo.
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL)
1200 0,1685 1235,8
1200 0,1763 1305,7
1200 0,1845 1351,1
1200 0,1738 1282,4
1200 0,1701 1249,2
Promedio 1284,7
Desv. Est. 46,0
% C.V. 3,6
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Punto control medio 3600 ng/mL
Tabla 25. Repetibilidad del método punto control medio.
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL)
3600 0,4616 3848,2
3600 0,4334 3596,8
3600 0,3990 3290,1
3600 0,4199 3476,4
3600 0,3975 3276,8
Promedio 3497,7
Desv. Est. 237,2
% C.V. 6,8
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
115
Punto control alto 12000 ng/mL
Tabla 26. Repetibilidad del método punto control alto.
Concentración
(ng/mL)
Relación
de áreas
Concentración
recuperada
(ng/mL)
12000 1,4650 12792,9
12000 1,5043 13143,3
12000 1,7263 15122,3
12000 1,4706 12842,9
12000 1,4913 13027,4
Promedio 13385,8
Desv. Est. 980,9
% C.V. 7,3
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
En los tres casos podemos observar que el CV no supera el 15 % por lo tanto cumple con
el criterio de aceptación establecido y podemos determinar que el método desarrollado es
repetible a las condiciones de estudio.
4.2.5.2. Reproducibilidad
Día 1
Punto control bajo 1200 ng/mL
Tabla 27. Reproducibilidad del método punto control bajo, día 1.
Concentración
(ng/mL)
Relación
de áreas
Concentración
recuperada
(ng/mL)
1200 0,1685 1235,8
1200 0,1763 1305,2
1200 0,1845 1377,8
Promedio 1306,3
Desv. Est. 71,0
% C.V. 5,4
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
116
Punto control medio 3600 ng/mL
Tabla 28. Reproducibilidad del método punto control medio, día 1.
Concentración
(ng/mL)
Relación
de áreas
Concentración
recuperada
(ng/mL)
3600 0,4616 3848,2
3600 0,4334 3596,8
3600 0,3990 3290,1
Promedio 3578,4
Desv. Est. 279,5
% C.V. 7,8
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Punto control alto 12000 ng/mL
Tabla 29. Reproducibilidad del método punto control alto, día 1.
Concentración
(ng/mL)
Relación
de áreas
Concentración
recuperada
(ng/mL)
12000 1,4650 12792,9
12000 1,5043 13143,3
12000 1,7263 13339,4
Promedio 13091,9
Desv. Est. 276,8
% C.V. 2,1
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Los resultados obtenidos para el CV en el primer día de análisis para los tres puntos
control por triplicado no superan el 15 % por lo que cumplen con el criterio de aceptación
establecido para este parámetro.
117
Día 2
Punto control bajo 1200 ng/mL
Tabla 30. Reproducibilidad del método punto control bajo, día 2.
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL)
1200 0,1738 1282,4
1200 0,1701 1249,2
1200 0,1638 1193,1
Promedio 1241,6
Desv. Est. 45,1
% C.V. 3,6
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Punto control medio 3600 ng/mL
Tabla 31. Reproducibilidad del método punto control medio, día 2.
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL)
3600 0,4199 3476,5
3600 0,3975 3276,8
3600 0,4806 3839,3
Promedio 3530,8
Desv. Est. 285,2
% C.V. 8,1
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
118
Punto control alto 12000 ng/mL
Tabla 32. Reproducibilidad del método punto control alto, día 2.
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL)
12000 1,4706 12842,9
12000 1,4913 13027,4
12000 1,5703 13107,6
Promedio 12992,6
Desv. Est. 135,8
% C.V. 1,1
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Los resultados obtenidos para el CV en el segundo día de análisis para los tres puntos
control por triplicado no superan el 15 % por lo que cumplen con el criterio de aceptación
establecido para este parámetro.
Día 3
Punto control bajo 1200 ng/mL
Tabla 33. Reproducibilidad del método punto control bajo, día 3.
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL)
1200 0,1646 1200,4
1200 0,1635 1190,7
1200 0,1644 1198,9
Promedio 1196,7
Desv. Est. 5,2
% C.V. 0,4
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
119
Punto control medio 3600 ng/mL
Tabla 34. Reproducibilidad del método punto control medio, día 3.
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL)
3600 0,4805 3838,4
3600 0,4871 3897,2
3600 0,4820 3851,8
Promedio 3862,4
Desv. Est. 30,8
% C.V. 0,8
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Punto control alto 12000 ng/mL
Tabla 35. Reproducibilidad del método punto control alto, día 3.
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL)
12000 1,3803 12037,9
12000 1,4891 13007,8
12000 1,4432 12598,6
Promedio 12548,1
Desv. Est. 486,9
% C.V. 3,9
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Los resultados obtenidos para el CV en el tercer día de análisis para los tres puntos
control por triplicado no superan el 15 % por lo que cumplen con el criterio de aceptación
establecido para este parámetro.
En consecuencia se establece que el método desarrollado es reproducible dentro de las
condiciones de trabajo determinadas.
120
4.2.6. Exactitud
Para la prueba de exactitud se realizó el cálculo de la DEA con seis datos obtenidos de
las pruebas de reproducibilidad y repetibilidad para cada punto control.
Punto control bajo 1200 ng/mL
Tabla 36. Exactitud del método punto control bajo.
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL) % DEA
1200 0,1685 1235.8 2,9
1200 0,1763 1305.2 8,8
1200 0,1845 1287.9 7,3
1200 0,1738 1282.4 6,9
1200 0,1701 1249.2 4,1
1200 0,1646 1200.4 0,1
Promedio 1260,2
Desv. Est. 38,9
% C.V. 3,1
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Punto control medio 3600 ng/mL
Tabla 37. Exactitud del método punto control medio.
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL) % DEA
3600 0,1685 3848,2 6,9
3600 0,1763 3596,8 0,1
3600 0,1845 3290,1 8,6
3600 0,1738 3476,5 3,4
3600 0,1701 3276,8 8,9
3600 0,1646 4016,7 11,6
Promedio 3584,2
Desv. Est. 299,8
% C.V. 8,4
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
121
Punto control alto 12000 ng/mL
Tabla 38. Exactitud del método punto control alto.
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL) % DEA
12000 0,1685 12792,9 6,6
12000 0,1763 13143,3 9,5
12000 0,1845 13339,4 11,1
12000 0,1738 12842,9 7,0
12000 0,1701 13027,4 8,6
12000 0,1646 12598,6 4,9
Promedio 12957,4
Desv. Est. 266,2
% C.V. 2,6
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Como se observa en las tablas de la 36 a la 38, para cada caso la desviación estándar
absoluta no superó un valor de 15 % por lo que cumple con el criterio de aceptación y
podemos establecer que el método desarrollado es exacto a las condiciones de trabajo
determinadas.
4.2.7. Límite de detección
Tabla 39. Límite de detección del método analítico.
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL) % DEA
400 0,0876 514,2 28,5
400 0,0820 464,3 16,0
400 0,0832 474,9 18,7
400 0,0924 556,9 39,2
400 0,0964 592,5 48,1
Promedio 520,6
Desv. Est. 54,3
% C.V. 10,4
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
122
La tabla 39 muestra los resultados obtenidos para la determinación del límite de
detección y en base a esto se establece un valor de 400 ng/mL como límite de detección
para el método desarrollado, ya que cumple con el criterio de aceptación de precisión con
un coeficiente de variación inferior a 15 %, sin embargo no cumple con el parámetro de
exactitud ya que para tres de los puntos analizados la desviación estándar absoluta es
superior al 20 % y están fuera del criterio de aceptación.
4.2.8. Límite de cuantificación
Tabla 40. Límite de cuantificación del método analítico.
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL) % DEA
800 0,1190 794,1 0,7
800 0,1174 779,8 2,5
800 0,1102 715,2 10,6
800 0,1253 850,3 6,2
800 0,1302 893,9 11,7
Promedio 806,7
Desv. Est. 68,5
% C.V. 8,5
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
En la tabla 40 se muestra los resultados para la determinación del límite de
cuantificación, el punto utilizado para esta prueba es de 800 ng/mL y como podemos
observar cumple con el criterio de aceptación establecido ya que tiene un coeficiente de
variación menor a 15 % y todos sus puntos tienen una desviación estándar absoluta
menor a 20 %.
123
4.2.9. Recuperación
Tabla 41. Promedio de recuperación del método analítico.
Conc. Relación de áreas
Conc. recuperada
(ng/mL) % C.V
Relación de áreas
Conc. recuperada
(ng/mL) % C.V
% Recuperación (ng/mL)
Sistema Método
1200 0,1737 1281,7 9,9 0,1685 304,40 8,2 96,677
3600 0,3460 2817,7 5,4 0,3986 833,90 6,8 103,777
12000 1,5043 13143,3 3,8 1,4913 2948,60 2,4 99,122
Promedio 99,859
Desv. Est. 3,6069
% C.V. 3,6
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
La recuperación se analizó con los tres puntos control por triplicado en sistema y en
método, la tabla 41 muestra los resultados promedio de recuperación para cada punto,
que como podemos observar son valores por encima de 90 % y donde el CV es inferior a
15 %, por lo tanto el método desarrollado cumple con el criterio de aceptación establecido
para este parámetro.
4.2.10. Estabilidad
4.2.10.1. A tiempo cero t = 0
Punto control bajo 1200 ng/mL
Tabla 42. Estabilidad del método a tiempo cero. Punto control bajo.
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL) % DEA
1200 0,1685 1235,4 2,9
1200 0,1763 1304,9 8,7
1200 0,1845 1287,9 7,3
Promedio 1276,1
Desv. Est. 36,3
% C.V. 2,8
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
124
Punto control medio 3600 ng/mL
Tabla 43. Estabilidad del método a tiempo cero. Punto control medio.
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL) % DEA
3600 0,4616 3848,2 6,9
3600 0,4334 3596,8 0,1
3600 0,3990 3290,1 8,6
Promedio 3578,4
Desv. Est. 279,5
% C.V. 7,8
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Punto control alto 12000 ng/mL
Tabla 44. Estabilidad del método a tiempo cero. Punto control alto.
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL) % DEA
12000 1,4650 12792,9 6,6
12000 1,5043 13143,3 9,5
12000 1,7263 13339,4 11,1
Promedio 13091,9
Desv. Est. 276,8
% C.V. 2,1
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
En las tablas de la 42 a la 44 correspondientes a los resultados del ensayo de estabilidad
a tiempo cero se observa que el CV al igual que la DEA para cada punto de estudio
nunca superan el 15 % por lo que establecemos que al analizar las muestras el día de la
preparación el método desarrollado es estable, exacto y preciso.
125
4.2.10.2. Temperatura ambiente por 24 horas
Punto control bajo 1200 ng/mL
Tabla 45. Estabilidad del método a temperatura ambiente por 24 h. Punto control bajo
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas Concentración
recuperada (ng/mL)
% DEA
1200 0,1858 1300.7 8.4
1200 0,1686 1236.6 3.0
1200 0,1740 1284.0 7.0
Promedio 1273,8
Desv. Est. 33,2
% C.V. 2,6
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Punto control medio 3600 ng/mL
Tabla 46. Estabilidad del método a temperatura ambiente por 24 h. Punto control medio
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL) % DEA
3600 0,5610 4026.5 11.8
3600 0,5003 3953.4 9.8
3600 0,5003 3316.0 7.9
Promedio 3765,3
Desv. Est. 390,8
% C.V. 10,4
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
126
Punto control alto 12000 ng/mL
Tabla 47. Estabilidad del método a temperatura ambiente por 24 h. Punto control alto
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL) % DEA
12000 1,4975 13082.7 9.0
12000 1,4571 12722.5 6.0
12000 1,4081 12285.7 2.4
Promedio 12696,9
Desv. Est. 399,1
% C.V. 3,1
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Al igual que para la prueba de estabilidad a tiempo cero, en las tablas de la 45 a la 47
correspondientes a los resultados del ensayo de estabilidad a las 24 horas a temperatura
ambiente se observa que el CV al igual que la DEA para cada punto de estudio nunca
superan el 15 % por lo que establecemos que el método desarrollado es estable, exacto y
preciso al analizar las muestras después de 24 horas a temperatura ambiente.
4.2.10.3. Refrigeración por 24 horas
Punto control bajo 1200 ng/mL
Tabla 48. Estabilidad del método en refrigeración por 24 h. Punto control bajo.
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL) % DEA
1200 0,1725 1270.8 5.9
1200 0,1762 1304.1 8.7
1200 0,1964 1305.6 8.8
Promedio 1293,5
Desv. Est. 19,7
% C.V. 1,5
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
127
Punto control medio 3600 ng/mL
Tabla 49. Estabilidad del método en refrigeración por 24 h. Punto control medio.
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL) % DEA
3600 0,4809 3931.1 9.2
3600 0,4582 3817.9 6.1
3600 0,4582 3817.9 6.1
Promedio 3855,6
Desv. Est. 65,4
% C.V. 1,7
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Punto control alto 12000 ng/mL
Tabla 50. Estabilidad del método en refrigeración por 24 h. Punto control alto.
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL) % DEA
12000 1,4866 12985.5 8.2
12000 1,7294 13367.0 11.4
12000 1,6925 13038.1 8.7
Promedio 13130,2
Desv. Est. 206,5
% C.V. 1,6
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
En las tablas de la 48 a la 50 correspondientes a los resultados del ensayo de estabilidad
a refrigeración por 24 horas se observa que el CV al igual que la DEA para cada punto de
estudio nunca supera el 15 % por lo que establecemos que el método desarrollado es
estable, exacto y preciso bajo las condiciones mencionadas.
128
4.2.10.4. Tres ciclos de congelación
Punto control bajo 1200 ng/mL
Tabla 51. Estabilidad del método tras dos ciclos de congelación. Punto control bajo.
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL) % DEA
1200 0,2050 1293.6 7.8
1200 0,1780 1320.3 10.0
1200 0,1827 1362.2 13.5
Promedio 1325,4
Desv. Est. 34,6
% C.V. 2,6
Punto control medio 3600 ng/mL
Tabla 52. Estabilidad del método tras dos ciclos de congelación. Punto control medio
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL) % DEA
3600 0,4703 3926.1 9.1
3600 0,4635 3864.8 7.4
3600 0,4329 3592.3 0.2
Promedio 3794,4
Desv. Est. 177,7
% C.V. 4,7
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
129
Punto control alto 12000 ng/mL
Tabla 53. Estabilidad del método tras dos ciclos de congelación. Punto control alto.
Concentración (ng/mL)
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL) % DEA
12000 1,4194 12386.1 3.2
12000 1,6263 13338.9 11.1
12000 1,3872 12099.3 0.8
Promedio 12608,1
Desv. Est. 648,9
% C.V. 5,1
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Al igual que en los ensayos anteriores los resultados tras dos ciclos de congelación
muestran que el CV al igual que la DEA para cada punto de estudio nunca superan el 15
% cumpliendo con los criterios de aceptación, por lo que establecemos que al analizar las
muestras bajo las condiciones mencionadas el método desarrollado es estable, exacto y
preciso.
4.2.11. Tolerancia (Punto control medio 3600 ng/mL)
4.2.11.1. Fase móvil ACN:Buffer acetato de amonio Proporción (58:42)
Tabla 54. Resultados punto control medio tolerancia del método (58:42).
Concentración (ng/mL)
T. Retención SI T.
Retención GLM
Relación de áreas
Concentración recuperada
(ng/mL) % DEA
3600 3.205 4.537 0.46548 3882.8 7.9
3600 3.218 4.557 0.45839 3819.6 6.1
3600 3.207 4.545 0.44473 3697.8 2.7
Promedio 3800,1
Desv. Std 94,2
% C.V. 2,5
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
130
4.2.11.2. Fase móvil ACN:Buffer acetato de amonio Proporción (52:48)
Tabla 55. Resultados punto control medio tolerancia del método (52:48).
Concentración
(ng/mL)
T.
Retención
SI
T. Retención
GLM
Relación
de áreas
Concentración
recuperada
(ng/mL)
% DEA
3600 4.269 6.986 0.4543 3783.1 5.0
3600 4.269 6.986 0.4334 3596.8 0.1
3600 4.268 6.985 0.4784 3997.9 11.0
Promedio 3792,6
Desv. Std 200,7
% C.V. 5,2
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Al analizar los resultados del ensayo de tolerancia del método para la primera proporción
ACN:Buffer acetato de amonio (58:42), observamos como varía el tiempo de retención de
ambos analitos pero aun así cumple con el criterio de aceptación cuando se utiliza la fase
móvil en dicha proporción, posteriormente observamos que de igual manera la segunda
variación de proporción de fase móvil ACN:Buffer acetato de amonio (52:48), cumple con
su criterio de aceptación, en base a lo cual establecemos que el método desarrollado es
preciso y exacto aun con variaciones de 5 % en la proporción de la fase móvil.
131
4.3. APLICACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO
4.3.1. Primer día de análisis
4.3.1.1. Estandarización del equipo en Método
Tabla 56. Estandarización del equipo en Método, primer día de análisis.
Datos Pioglitazona Glimepirida (400 ng/mL) Relación de áreas
Área T. Retención Área T. Retención
1 237,882 3,682 143,757 5,726 0,604
2 234,185 3,683 139,623 5,729 0,596
3 236,832 3,684 138,925 5,729 0,587
4 237,053 3,684 138,597 5,726 0,585
5 237,636 3,684 138,549 5,730 0,583
Promedio 236,718 3,683 139,890 5,728 0,591
Desv. Est. 1,478 0,001 2,204 0,002 0,009
% C.V. 0,6 0,02 1,6 0,03 1,5
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
4.3.1.2. Curva de Calibración
Tabla 57. Curva de calibración primer día de análisis.
Concentración (ng/mL)
T. retención S.I. Área S.I. T. retención
GLM Área GLM
Relación de áreas
100 3,6380 216,2869 5,6950 15,1428 0,0700
200 3,6440 198,1404 5,6900 35,3010 0,1782
400 3,6370 207,0275 5,6760 55,4885 0,2680
500 3,6310 220,7652 5,6570 71,1458 0,3223
1000 3,6370 218,1838 5,6770 129,8668 0,5952
2000 3,6360 222,5149 5,6710 225,5890 1,0138
4000 3,6300 246,2078 5,6490 483,5401 1,9640
5000 3,6170 234,7825 5,6310 597,5046 2,5449
m = 0,0005
b = 0,0649
r = 0,9992
r2 = 0,9984 Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
132
Ilustración 41. Curva de calibración primer día de análisis. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
4.3.2. Segundo día de análisis
4.3.2.1. Estandarización del equipo en Método
Tabla 58. Estandarización en Método, segundo día de análisis.
Datos Pioglitazona Glimepirida (400ng/mL) Relación de áreas
Área T.
Retención Área
T. Retención
1 246,952 3,675 145,911 5,628 0,591
2 244,556 3,705 155,030 5,685 0,634
3 248,647 3,707 158,207 5,682 0,636
4 252,695 3,691 152,054 5,657 0,602
5 246,444 3,702 153,531 5,688 0,623
Promedio 247,859 3,696 152,947 5,668 0,617
Desv. Est. 3,072 0,013 4,546 0,026 0,020
% C.V. 1,2 0,6 3,0 0,4 3,3
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
y = 0,0005x + 0,0649r² = 0,9984
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
Rela
ció
n d
e á
rea
s
Concentración (ng/mL)
Curva de Calibración
133
4.3.2.2. Curva de Calibración
Tabla 59. Curva de calibración segundo día de análisis.
Concentración (ng/mL)
T. retención
S.I. Área S.I.
T. retención GLM
Área GLM Relación de áreas
100 3,6380 273,5400 5,6470 13,8907 0,0508
200 3,6460 266,6200 5,6690 35,4000 0,1328
400 3,6290 277,8730 5,6550 55,8000 0,2008
500 3,6370 274,1500 5,6690 73,2408 0,2672
1000 3,6340 274,0660 5,6670 140,0950 0,5112
2000 3,6330 276,5350 5,6650 273,6980 0,9897
4000 3,6400 276,4450 5,6640 578,6210 2,0931
5000 3,6400 270,8470 5,6860 793,5130 2,9297
m = 0,0006
b = -0,0336
r = 0,9933
r2 = 0,9967 Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Ilustración 42. Curva de calibración segundo día de análisis. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
y = 0,0006x - 0,0336r² = 0,9933
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
Rela
ció
n d
e á
rea
s
Concentración (ng/mL)
Curva de Calibración
134
4.3.3. Procesamiento de los Datos
Los datos de área obtenidos de los cromatogramas tanto de Nanopartículas de GLM
como de GLM comercial se procesaron en base a las curvas de calibración para cada día
de estudio, así, mediante una interpolación de la relación de áreas en la curva de
calibración respectiva se obtuvo la Concentración en ng/mL, posteriormente realizamos el
cálculo de la concentración promedio para cada tiempo de toma de muestra y con esto
obtenemos los puntos para la gráfica de Conc. (ng/mL) vs tiempo.
Además se realizó el cálculo de la desviación estándar y el coeficiente de variación entre
los datos de un mismo tiempo para determinar que la variabilidad biológica no afecta de
manera significativa los resultados, para esto manejamos un criterio de aceptación de %
CV < 30 % para este tipo de estudios. Ver anexos 3, 4, 5 y 6.
4.3.4. Determinación del orden de reacción
Una vez que se obtuvo el promedio de concentración para cada tiempo de toma de
muestra para los dos tratamientos, Nanopartículas de GLM y GLM comercial, se realizó la
determinación del orden de reacción, para lo cual realizamos la regresión lineal de Conc.
vs tiempo, ln Conc. vs tiempo y 1/Conc. vs tiempo, obtenemos el coeficiente de
correlación y aquel que se acerque a la unidad determina el orden de reacción del
presente estudio.
Tabla 60. Regresión lineal GLM comercial 1° determinación.
tiempo (min) Conc. ng/mL ln Conc 1/Conc
15 107,1123 4,6739 0,0093
30 727,2204 6,5892 0,0014
60 1121,1299 7,0221 0,0009
120 550,9329 6,3116 0,0018
180 493,2924 6,2011 0,0020
240 476,7298 6,1669 0,0021
300 463,7840 6,1394 0,0022
360 441,7494 6,0907 0,0023
420 267,9560 5,5908 0,0037
480 176,7810 5,1749 0,0057
540 103,2144 4,6368 0,0097
r2 0,1096 0,2487 0,1259
r 0,3311 0,4987 0,3549
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
135
El coeficiente de correlación que más se acerca a la unidad es el que se obtuvo de la
regresión lineal de ln Conc. vs tiempo, con un valor de r = 0,4987 por lo tanto el proceso
corresponde a una reacción de primer orden.
Tabla 61. Regresión lineal GLM comercial 2° determinación.
tiempo (h) Conc. ng/mL ln 1/C
15 156,6866 5,0542 0,0064
30 435,1462 6,0757 0,0023
60 775,7592 6,6538 0,0013
120 344,2340 5,8413 0,0029
180 268,9239 5,5944 0,0037
240 211,8825 5,3560 0,0047
300 188,4348 5,2388 0,0053
360 169,3276 5,1318 0,0059
420 162,0441 5,0879 0,0062
480 120,7280 4,7935 0,0083
540 111,9140 4,7177 0,0089
r2 0,4011 0,5543 0,6400
r 0,6333 0,7445 0,8000
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
El coeficiente de correlación que más se acerca a la unidad es el que se obtuvo de la
regresión lineal de 1/Conc. vs tiempo, con un valor de r = 0,8000 por lo tanto el proceso
corresponde a una reacción de segundo orden, sin embargo por motivos experimentales
y en vista de que la diferencia entre las dos constantes no es alta se trabajó considerando
a este proceso como una reacción de primer orden.
Tabla 62. Regresión lineal Nanopartículas de GLM 1° determinación.
tiempo (h) Conc. ng/mL ln Conc 1/Conc
15 191,0881 5,2527 0,0052
30 437,6005 6,0813 0,0023
60 1229,0529 7,1140 0,0008
120 376,2788 5,9303 0,0027
180 308,1843 5,7307 0,0032
240 217,2945 5,3813 0,0046
300 169,1447 5,1308 0,0059
360 145,3495 4,9412 0,0071
420 139,9422 4,7936 0,0083
480 120,7393 4,7936 0,0083
540 113,9149 4,7355 0,0088
r2 0,3193 0,5924 0,7808
r 0,5651 0,7697 0,8836
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
136
De la misma manera en este caso al determinar el coeficiente de correlación observamos
que el que más se acerca a la unidad es el que se obtuvo de la regresión lineal de
1/Conc. vs tiempo, con un valor de r = 0,8836 por lo tanto el proceso corresponde a una
reacción de segundo orden, sin embargo por motivos experimentales y en vista de que la
diferencia entre las dos constantes no es alta se trabajó considerando a este proceso
como una reacción de primer orden.
Tabla 63. Regresión lineal Nanopartículas de GLM 2° determinación.
tiempo (min) Conc. ng/mL ln 1/C
15 243,6145 5,4956 0,0041
30 573,9973 6,3526 0,0017
60 746,8429 6,6159 0,0013
120 466,1810 6,1446 0,0021
180 336,6083 5,8189 0,0030
240 268,8166 5,5940 0,0037
300 201,1732 5,3042 0,0050
360 177,0076 5,1762 0,0056
420 144,9382 4,9763 0,0069
480 122,4661 4,8078 0,0082
540 115,6328 4,7504 0,0086
r2 0,6030 0,7682 0,8528
r 0,7766 0,8765 0,9235
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Al determinar el coeficiente de correlación observamos que el que más se acerca a la
unidad es el que se obtuvo de la regresión lineal de 1/Conc. vs tiempo, con un valor de r
= 0,9235 por lo tanto el proceso corresponde a una reacción de segundo orden, sin
embargo por motivos experimentales y en vista de que la diferencia entre las dos
constantes no es alta se trabajó considerando a este proceso como una reacción de
primer orden.
4.3.5. Cálculo de las Constantes Farmacocinéticas
Una vez determinado el orden de la reacción realizamos el cálculo de las constantes
farmacocinéticas para cada tratamiento y para cada determinación considerando las
ecuaciones que corresponden a una cinética de primer orden, además realizamos las
gráficas curva de nivel plasmático Conc. ng/mL vs tiempo y la gráfica que corresponde a
la cinética de primer orden ln Conc vs tiempo, obteniendo de esta manera la ecuación en
base a la cual realizaremos los cálculos respectivos.
137
Tabla 64. Concentración vs tiempo de GLM comercial 1° determinación.
tiempo (min) Conc. ng/mL ln Conc.
0 0 -
15 107,1123 4,6739
30 727,2204 6,5892
60 1121,1299 7,0221
120 550,9329 6,3116
180 493,2924 6,2011
240 476,7298 6,1669
300 463,7840 6,1394
360 441,7494 6,0907
420 267,9560 5,5908
480 176,7810 5,1749
540 103,2144 4,6368
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Ilustración 43. Curva de nivel plasmático GLM comercial 1° determinación. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
0
200
400
600
800
1000
1200
0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600
Co
nc
. n
g/m
L
Tiempo (min)
Concentración vs Tiempo
138
Ilustración 44. Gráfica ln Conc. vs tiempo GLM comercial 1° determinación. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Tabla 65. Concentración vs tiempo de GLM comercial 2° determinación.
tiempo (min) Conc. ng/mL ln Conc.
0 0 -
15 156,6866 5,0542
30 435,1462 6,0757
60 775,7592 6,6538
120 344,2340 5,8413
180 268,9239 5,5944
240 211,8825 5,3560
300 188,4348 5,2388
360 169,3276 5,1318
420 162,0441 5,0879
480 120,7280 4,7935
540 111,9140 4,7177
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
4,0000
4,5000
5,0000
5,5000
6,0000
6,5000
7,0000
7,5000
0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600
ln C
on
c. n
g/m
L
Tiempo (min)
ln Concentración vs Tiempo
139
Ilustración 45. Curva de nivel plasmático GLM comercial 2° determinación. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Ilustración 46. Gráfica ln Conc. vs tiempo GLM comercial 2° determinación. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600
Co
nc
. n
g/m
L
Tiempo (min)
Concentración vs tiempo
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600
ln C
on
c. n
g/m
L
Tiempo (min)
ln Concentración vs Tiempo
140
Tabla 66. Concentración vs tiempo de Nanopartículas de GLM 1° determinación.
tiempo (min) Conc. ng/mL
ln Conc.
0 0 -
15 191,0881 5,2527
30 437,6005 6,0813
60 1229,0529 7,1140
120 376,2788 5,9303
180 308,1843 5,7307
240 217,2945 5,3813
300 169,1447 5,1308
360 145,3495 4,9412
420 139,9422 4,7936
480 120,7393 4,7936
540 113,9149 4,7355
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Ilustración 47. Curva de nivel plasmático Nanopartículas de GLM 1° determinación. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600
Co
nc
. n
g/m
L
Tiempo (min)
Concentración vs Tiempo
141
Ilustración 48. Gráfica ln Conc. vs tiempo Nanopartículas de GLM 1° determinación. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Tabla 67. Concentración vs tiempo de Nanopartículas de GLM 2° determinación.
Tiempo (min)
Conc. ng/mL
ln Conc.
0 0 -
15 243,6145 5,4956
30 573,9973 6,3526
60 746,8429 6,6159
120 466,1810 6,1446
180 336,6083 5,8189
240 268,8166 5,5940
300 201,1732 5,3042
360 177,0076 5,1762
420 144,9382 4,9763
480 122,4661 4,8078
540 115,6328 4,7504
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600
ln C
on
c. n
g/m
L
Tiempo (min)
ln Concentración vs Tiempo
142
Ilustración 49. Curva de nivel plasmático Nanopartículas de GLM 2° determinación. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Ilustración 50. Gráfica ln Conc. Vs tiempo Nanopartículas de GLM 2° determinación. Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600
Co
nc
. n
g/m
L
Tiempo (min)
Concentración vs Tiempo
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600
ln C
on
c. n
g/m
L
Tiempo (min)
ln Concentración vs Tiempo
143
4.3.5.1. Ejemplo de cálculo (Datos de GLM comercial 2° determinación)
Para el cálculo de las constantes farmacocinéticas primeramente separamos los datos
considerando una fase de absorción y una fase de eliminación, la fase de absorción está
comprendida entre los puntos A hasta B, donde A es cero y B es el punto con el valor
más alto de concentración, mientras que la fase de eliminación está comprendida entre
los puntos C hasta D, donde C es el punto después de B y de es el último punto de curva
de nivel plasmático.
Ilustración 51. Curva de nivel plasmático. Fase de absorción A-B-C. Fase de eliminación C-D.
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Posteriormente realizamos la regresión lineal entre ln Conc. vs tiempo con los datos de la
fase eliminación para obtener la ecuación de la recta y la constante de eliminación.
Tiempo (min) Conc ng/mL ln Conc
120 344,2340 5,8413 C
180 268,9239 5,5944
240 211,8825 5,3560
300 188,4348 5,2388
360 169,3276 5,1318
420 162,0441 5,0879
480 120,7280 4,7935
540 111,9140 4,7177 D
144
Datos de la regresión lineal fase de eliminación:
a = 6,0570
Ke = b -0,0025 min-1
r = 0,9839
Con estos datos calculamos el tiempo medio de eliminación utilizando la siguiente
formula:
t ½ =0,693
Ke
t ½ =0,693
0,0025
t ½ = 𝟐𝟕𝟑, 𝟐𝟕 𝐦𝐢𝐧
Para la fase de absorción utilizamos la ecuación de la resta de la regresión lineal de la
fase de eliminación.
Ecuación de la recta:
y = 6,0570-0,0025x
En base a esta ecuación interpolamos los datos de tiempo de la fase de absorción y
obtenemos los datos de Concentración residual con los que realizamos la regresión lineal
y obtenemos la constante de absorción, este procedimiento se denomina Método de los
Residuales.
Tabla 68. Método de los Residuales, fase de absorción.
tiempo (min)
Conc. ng/L Conc.
estimada
Antilog Conc.
estimada
Conc. Residual
ln Conc. Residual
0 0 6,0570 427,1087 427,1087 6,0570
15 156,6866 6,0190 411,1672 254,4806 5,5392
30 435,1462 5,9810 395,8207 -39,3255 -
60 775,7592 5,9049 366,8247 -408,9345 -
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
145
Debido a que los datos obtenidos para 30 y 60 minutos son valores negativos de los
cuales no podemos obtener el logaritmo natural para realizar la regresión lineal, estos
datos se descartan y se trabaja con los valores para 0 y 15 minutos.
Datos de la regresión lineal fase de absorción:
a = 6,0570
Ka = b -0,0345 min-1
r = 1,0000
Con estos datos calculamos el tmáx utilizando la siguiente formula:
𝑡𝑚á𝑥 =2,303
Ka − Ke𝑙𝑜𝑔
𝐾𝑎
𝐾𝑒
𝑡𝑚á𝑥 =2,303
0,0345 − 0,0025𝑙𝑜𝑔
0,0345
0,0025
𝒕𝒎á𝒙 = 𝟖𝟏, 𝟔𝟓 𝐦𝐢𝐧
Para el cálculo de Cmáx utilizamos la siguiente fórmula:
𝐶𝑚á𝑥 = Co𝐾𝑎
Ka−Ke(
𝑒−𝐾𝑒(𝑡𝑚á𝑥)
1−𝑒−𝐾𝑒𝜏 −𝑒−𝐾𝑎(𝑡𝑚á𝑥)
1−𝑒−𝐾𝑎𝜏 )
Donde:
Co = Concentración a tiempo 0 calculada tras la interpolación de datos en la
regresión lineal de la fase de eliminación.
Ka = Constante de absorción
Ke = Constante de eliminación
𝜏 = Tiempo medio de eliminación t ½ e
𝐶𝑚á𝑥 = 427,10870,0345
0,0345−0,0025(
𝑒−0,0025∗(81,65)
1−𝑒−(0,0025)∗273,27−
𝑒−0,0345∗(81,65)
1−𝑒−(0,0345)∗273,27)
𝑪𝒎á𝒙 = 𝟕𝟐𝟐, 𝟏𝟏𝟐𝟏 𝐧𝐠/𝐦𝐋
146
Realizamos el cálculo del Área bajo la curva (AUC) considerando dos segmentos: el
segmento A-B-C y el segmento C-D.
Segmento A-B-C
Se calculó por el método de los trapecios y se obtuvo los siguientes resultados:
Tabla 69. Áreas determinadas por el Método de los trapecios, segmento A-B-C.
Tiempo (min)
Área del trapecio (ng/mL)
0 1175,14913
15 4438,74563
30 18163,5803
60 33599,7945
∑ = 57377,2695 ng/mL
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Segmento C-D
Se calculó por el método de Dost y se obtuvo el siguiente resultado:
𝐴𝑟𝑒𝑎 𝐶𝐷 =𝐶𝑜
Ke
𝐴𝑟𝑒𝑎 𝐶𝐷 =344,2340(ng/mL)
0,0025(𝑚𝑖𝑛−1)
𝑨𝒓𝒆𝒂 𝑪𝑫 = 𝟏𝟑𝟕𝟔𝟗𝟑, 𝟔 (𝐧𝐠
𝐦𝐋) ∗ 𝐦𝐢𝐧
Por lo tanto:
Área total (AUC) = Área (A-B-C) + Área (C-D)
Área total (AUC) = 57377,2695 (ng/mL)*min + 137693,6 (ng/mL)*min
Área total (AUC) = 195070,87 (ng/mL)*min
147
4.3.5.2. Constantes Farmacocinéticas
Tabla 70. Constantes farmacocinéticas GLM Comercial 1° determinación
Constante farmacocinética
Dato Unidades
Ka 0,0479 min-1
Ke 0,0037 min-1
t 1/2 187,50 min
t máx 57,98 min
C máx 1861,11 ng/mL
AUC 233848,74 (ng/mL)*min
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Tabla 71. Constantes farmacocinéticas GLM Comercial 2° determinación
Constante farmacocinética
Dato Unidades
Ka 0,0345 min-1
Ke 0,0025 min-1
t 1/2 273,27 min
t máx 81,65 min
C máx 722,11 ng/mL
AUC 195070,87 (ng/mL)*min
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Tabla 72. Constantes farmacocinéticas GLM Nanopartículas 1° determinación
Constante farmacocinética
Dato Unidades
Ka 0,0546 min-1
Ke 0,0030 min-1
t 1/2 232,82 min
t máx 56,36 min
C máx 825,40 ng/mL
AUC 204734,33 (ng/mL)*min
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
148
Tabla 73. Constantes farmacocinéticas GLM Nanopartículas 2° determinación
Constante farmacocinética
Dato Unidades
Ka 0,0393 min-1
Ke 0,0033 min-1
t 1/2 208,00 min
t máx 68,67 min
C máx 1023,60 ng/mL
AUC 205429,49 (ng/mL)*min
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
4.3.6. Análisis estadístico de los resultados
El diseño estadístico utilizado es un Diseño de Bloques Completamente al Azar con 2
tratamientos y 2 repeticiones dando un total de 4 datos procesados mediante un análisis
de varianza y una prueba de significancia en este caso la prueba t de student.
4.3.6.1. Análisis estadístico de la Constante de Absorción
Tabla 74. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Constante de absorción (Ka)
Tratamientos Constante de Absorción (Ka) Promedio
Nomenclatura
asignada (T) R1 R2
GLM Comercial 0,0479 0,0345 0,0412 T1
GLM Nanopatículas 0,0546 0,0393 0,0469 T2
Promedio 0,0441
Desv 0,0040
% CV 9,18
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Hipótesis:
Ho = Hipótesis nula = GLM Comercial = GLM Nanopartículas
Ha = Hipótesis alternativa = GLM Comercial ≠ GLM Nanopartículas
149
Tabla 75. Análisis de Varianza (ADEVA) – Constante de absorción (Ka)
Origen de
las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados
de
libertad
Promedio
de los
cuadrados
F(calculada) Probabilidad F(tabulada)
Entre
grupos 0,000033 1 0,000033 0,316 0,631 18,513
Dentro de
los grupos 0,000207 2 0,000104
Total 0,000240 3
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Interpretación de los resultados
Debido a que F calculada (0,3157) es < a F tabulada (18,513) se acepta la hipótesis
nula y se concluye que las constantes de absorción (Ka) determinadas para los dos
tratamientos no presentan diferencia significativa en los resultados obtenidos a un
intervalo de confianza del 95 %.
Adicionalmente se realiza una prueba de significancia en este caso la prueba de t (t de
student) para verificar si existe o no diferencia significativa entre los datos determinados
para los dos tratamientos.
Prueba de significancia t de student – Constante de absorción (Ka)
Tabla 76. Prueba de t – Constante de absorción (Ka)
T1 T2
Media 0,0412 0,0469
Varianza 0,00009 0,00012
Observaciones 2 2
Coeficiente de correlación de Pearson
1
Diferencia hipotética de las medias 0
Grados de libertad 1
Estadístico t -5,792
P(T<=t) dos colas 0,109
Valor crítico de t (dos colas) 12,706
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
150
Criterio de significancia:
Si el resultado de P es mayor al valor crítico de t (determinado en tablas) se
rechaza la hipótesis nula y por lo tanto GLM Comercial ≠ GLM Nanopartículas, es
decir, que los resultados obtenidos para los dos tratamientos presentan una
diferencia estadísticamente significativa.
Si el resultado de P es menor al valor crítico de t (determinado en tablas) se
rechaza la hipótesis alternativa y por lo tanto GLM Comercial = GLM
Nanopartículas, es decir, que los resultados obtenidos para los dos tratamientos
no presentan una diferencia estadísticamente significativa.
Interpretación de los resultados
Debido a que el valor de P (0,109) es < al Valor crítico de t (12,706) se acepta la hipótesis
nula y se concluye que las constantes de absorción (Ka) determinadas para los dos
tratamientos no presentan diferencia significativa en los resultados obtenidos a un
intervalo de confianza del 95 %.
4.3.6.2. Análisis estadístico de la Constante de Eliminación
Tabla 77. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Constante de eliminación (Ke)
Tratamientos Constante de Eliminación (Ke) Promedio
Nomenclatura asignada (T) R1 R2
GLM Comercial 0,0037 0,0025 0,0031 T1
GLM Nanopartículas 0,0030 0,0033 0,0032 T2
Promedio 0,0031
Desv 0,00004
% CV 1,13
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Hipótesis:
Ho = Hipótesis nula = GLM Comercial = GLM Nanopartículas
Ha = Hipótesis alternativa = GLM Comercial ≠ GLM Nanopartículas
151
Tabla 78. Análisis de Varianza (ADEVA) – Constante de eliminación (Ke)
Origen de las
variaciones
Suma de cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de los
cuadrados
F (calculada)
Probabilidad F
(tabulada)
Entre grupos
0,0000000025 1 0,0000000025 0,0065 0,943 18,513
Dentro de los grupos
0,0000007650 2 0,0000003825
Total 0,0000007675 3
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Interpretación de los resultados
Debido a que F calculada (0,0065) es < a F tabulada (18,513) se acepta la hipótesis
nula y se concluye que las constantes de eliminación (Ke) determinadas para los dos
tratamientos no presentan diferencia significativa en los resultados obtenidos a un
intervalo de confianza del 95 %.
Prueba de significancia t de student – Constante de eliminación (Ke)
Tabla 79. Prueba de t – Constante de eliminación (Ke)
T1 T2
Media 0,0031 0,0032
Varianza 0,00000072 0,00000005
Observaciones 2 2
Coeficiente de correlación de Pearson
-1
Diferencia hipotética de las medias 0
Grados de libertad 1
Estadístico t -0,067
P(T<=t) dos colas 0,958
Valor crítico de t (dos colas) 12,706
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Interpretación de los resultados
Debido a que el valor de P (0,958) es < al Valor crítico de t (12,706) se acepta la hipótesis
nula y se concluye que las constantes de eliminación (Ke) determinadas para los dos
152
tratamientos no presentan diferencia significativa en los resultados obtenidos a un
intervalo de confianza del 95 %.
4.3.6.3. Análisis estadístico del Tiempo medio de Eliminación
Tabla 80. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Tiempo medio de eliminación (t ½ e)
Tratamientos Tiempo medio de eliminación (t ½ e) Promedio
Nomenlatura asignada (T) R1 R2
GLM Comercial 187,50 273,27 230,39 T1
GLM Nanopartículas 232,82 208,00 220,41 T2
Promedio 225,40
Desv 7,06
% CV 3,13
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Hipótesis:
Ho = Hipótesis nula = GLM Comercial = GLM Nanopartículas
Ha = Hipótesis alternativa = GLM Comercial ≠ GLM Nanopartículas
Tabla 81. Análisis de Varianza (ADEVA) – Tiempo medio de eliminación (t ½ e)
Origen de las
variaciones
Suma de cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de los
cuadrados
F (calculada)
Probabilidad F
(tabulada)
Entre grupos
99,556 1 99,556 0,050 0,844 18,513
Dentro de los grupos
3986,648 2 1993,324
Total 4086,204 3
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Interpretación de los resultados
Debido a que F calculada (0,050) es < a F tabulada (18,513) se acepta la hipótesis nula
y se concluye que los tiempos medios de eliminación (t ½ e) determinados para los dos
153
tratamientos no presentan diferencia significativa en los resultados obtenidos a un
intervalo de confianza del 95 %.
Prueba de significancia t de student – Tiempo medio de eliminación (t ½ e)
Tabla 82. Prueba de t – Tiempo medio de eliminación (t ½ e)
T1 T2
Media 230,39 220,41
Varianza 3678,65 308,00
Observaciones 2 2
Coeficiente de correlación de Pearson
-1
Diferencia hipotética de las medias 0
Grados de libertad 1
Estadístico t 0,180
P(T<=t) dos colas 0,886
Valor crítico de t (dos colas) 12,706
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Interpretación de los resultados
Debido a que el valor de P (0,886) es < al Valor crítico de t (12,706) se acepta la hipótesis
nula y se concluye que los Tiempos medios de eliminación (t ½ e) determinados para los
dos tratamientos no presentan diferencia significativa en los resultados obtenidos a un
intervalo de confianza del 95 %.
4.3.6.4. Análisis estadístico del Tiempo máximo (t máx)
Tabla 83. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Tiempo máximo (t máx)
Tratamientos Tiempo máximo (t máx) Promedio
Nomenlatura asignada (T) R1 R2
GLM Comercial 57,98 81,65 69,82 T1
GLM Nanoparticulas 56,36 68,67 62,52 T2
Promedio 66,17
Desv 5,16
% CV 7,80
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
154
Hipótesis:
Ho = Hipótesis nula = GLM Comercial = GLM Nanopartículas
Ha = Hipótesis alternativa = GLM Comercial ≠ GLM Nanopartículas
Tabla 84. Análisis de Varianza (ADEVA) – Tiempo máximo (t máx)
Origen de las
variaciones
Suma de cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de los
cuadrados
F (calculada)
Probabilidad F
(tabulada)
Entre grupos
53,290 1 53,290 0,299 0,639 18,513
Dentro de los grupos
355,903 2 177,951
Total 409,193 3
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Interpretación de los resultados
Debido a que F calculada (0,299) es < a F tabulada (18,513) se acepta la hipótesis nula
y se concluye que los tiempos máximos (t máx) determinados para los dos tratamientos
no presentan diferencia significativa en los resultados obtenidos a un intervalo de
confianza del 95 %.
Prueba de significancia t de student – Tiempo máximo (t máx)
Tabla 85. Prueba de t – Tiempo máximo (t máx)
T1 T2
Media 69,82 62,52
Varianza 280,13 75,77
Observaciones 2 2
Coeficiente de correlación de Pearson
1
Diferencia hipotética de las medias 0
Grados de libertad 1
Estadístico t 1,285
P(T<=t) dos colas 0,421
Valor crítico de t (dos colas) 12,706
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
155
Interpretación de los resultados
Debido a que el valor de P (0,421) es < al Valor crítico de t (12,706) se acepta la hipótesis
nula y se concluye que los Tiempos máximos (t máx) determinados para los dos
tratamientos no presentan diferencia significativa en los resultados obtenidos a un
intervalo de confianza del 95 %.
4.3.6.5. Análisis estadístico de Cmáx
Tabla 86. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Concentración máxima (C máx)
Tratamientos Concentración máxima (Cmáx) Promedio
Nomenlatura asignada (T) R1 R2
GLM Comercial 1861,11 722,11 1291,61 T1
GLM Nanopartículas 825,40 1023,60 924,50 T2
Promedio 1108,05
Desv 259,59
% CV 23,43
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Hipótesis:
Ho = Hipótesis nula = GLM Comercial = GLM Nanopartículas
Ha = Hipótesis alternativa = GLM Comercial ≠ GLM Nanopartículas
Tabla 87. Análisis de Varianza (ADEVA) – Concentración máxima (C máx)
Origen de las
variaciones
Suma de cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de los
cuadrados
F (calculada)
Probabilidad F
(tabulada)
Entre grupos
134773,849 1 134773,85 0,403 0,590 18,513
Dentro de los grupos
668299,414 2 334149,71
Total 803073,264 3
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
156
Interpretación de los resultados
Debido a que F calculada (0,403) es < a F tabulada (18,513) se acepta la hipótesis nula
y se concluye que las concentraciones máximas (C máx) determinadas para los dos
tratamientos no presentan diferencia significativa en los resultados obtenidos a un
intervalo de confianza del 95 %.
Prueba de significancia t de student – Concentración máxima (C máx)
Tabla 88. Prueba de t – Concentración máxima (C máx)
T1 T2
Media 1291,61 924,50
Varianza 648657,75 19641,66
Observaciones 2 2
Coeficiente de correlación de Pearson
-1
Diferencia hipotética de las medias 0
Grados de libertad 1
Estadístico t 0,549
P(T<=t) dos colas 0,680
Valor crítico de t (dos colas) 12,706
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Interpretación de los resultados
Debido a que el valor de P (0,680) es < al Valor crítico de t (12,706) se acepta la hipótesis
nula y se concluye que las Concentraciones máximas (C máx) determinadas para los dos
tratamientos no presentan diferencia significativa en los resultados obtenidos a un
intervalo de confianza del 95 %.
157
4.3.6.6. Análisis estadístico del Área bajo la curva AUC
Tabla 89. Diseño Completamente al Azar (DCA) – Área bajo la curva (AUC)
Tratamientos Área bajo la curva (AUC) Promedio
Nomenlatura asignada (T) R1 R2
GLM Comercial 233848,74 195070,87 214459,81 T1
GLM Nanopartículas 204734,33 205429,49 205081,91 T2
Promedio 209770,86
Desv 6631,18
% CV 3,16
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Hipótesis:
Ho = Hipótesis nula = GLM Comercial = GLM Nanopartículas
Ha = Hipótesis alternativa = GLM Comercial ≠ GLM Nanopartículas
Tabla 90. Análisis de Varianza (ADEVA) – Área bajo la curva (AUC)
Origen de las
variaciones
Suma de cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de los
cuadrados
F (calculada)
Probabilidad F
(tabulada)
Entre grupos
87945012,6 1 87945012,61 0,234 0,676 18,513
Dentro de los grupos
752103356,6 2 376051678,28
Total 840048369,2 3
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Interpretación de los resultados
Debido a que F calculada (0,234) es < a F tabulada (18,513) se acepta la hipótesis nula
y se concluye que las áreas bajo la curva (AUC) determinadas para los dos tratamientos
no presentan diferencia significativa en los resultados obtenidos a un intervalo de
confianza del 95 %.
158
Prueba de significancia t de student – Área bajo la curva (AUC)
Tabla 91. Prueba de t – Área bajo la curva (AUC)
T1 T2
Media 214459,81 205081,91
Varianza 751861732,53 241624,02
Observaciones 2 2
Coeficiente de correlación de Pearson
-1
Diferencia hipotética de las medias 0
Grados de libertad 1
Estadístico t 0,475
P(T<=t) dos colas 0,718
Valor crítico de t (dos colas) 12,706
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Interpretación de los resultados
Debido a que el valor de P (0,718) es < al Valor crítico de t (12,706) se acepta la hipótesis
nula y se concluye que las Áreas bajo la curva (AUC) determinadas para los dos
tratamientos no presentan diferencia significativa en los resultados obtenidos a un
intervalo de confianza del 95 %.
159
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1. CONCLUSIONES
Se realizó un estudio farmacocinético preclínico en ratas Wistar de una
formulación en Nanopartículas de liberación inmediata a base Glimepirida y de
una formulación de Glimepirida comercial, con lo cual se determinaron las
constantes farmacocinéticas para su posterior comparación estadística.
En base a la información recopilada de 3 artículos científicos se desarrolló un
método analítico por HPLC para la cuantificación de Glimepirida en plasma de
rata determinándose como método óptimo para la fase de extracción la
precipitación de proteínas y utilizando como estándar interno la Pioglitazona.
Una vez desarrollado el método analítico por HPLC se realizó la validación tanto
en método como en sistema en base a los criterios de aceptación de la FDA y la
NOM-177-SSA1-2013, el cual demostró ser lineal, exacto, preciso y confiable en
un rango de 800 ng/mL a 20000 ng/mL, para ser empleado en evaluaciones
farmacocinéticas.
La metodología desarrollada se aplicó en la realización de un estudio
farmacocinético preclínico, para lo cual se utilizaron un total de 32 ratas Wistar
divididas en dos grupos, uno correspondiente a la Glimepirida en Nanopartículas y
el otro a la Glimepirida comercial, los cuales a su vez de subdividieron en dos
grupos ya que el estudio se realizó en dos días para la obtención de dos
determinaciones para cada tiempo de toma de muestra, determinándose mediante
un ensayo preliminar la factibilidad de obtener un máximo de 4 muestra de sangre
por cada animal de experimentación siempre y cuando se cumpla con las normas
de bioética para el manejo de los mismos y el proceso de extracción se desarrolle
sin complicaciones.
Con los datos cromatográficos obtenidos de cada una de las muestras
procesadas se realizó la interpolación en su respectiva curva de calibración y con
los resultados obtenidos se calculó las siguientes constantes o parámetros
160
farmacocinéticos tanto para la Glimepirida en Nanopartículas como para la
Glimepirida comercial: constante de absorción (Ka), constante de eliminación
(Ke), tiempo medio de eliminación (t ½ e), tiempo máximo (t máx), concentración
máxima (C máx) y área bajo la curva de nivel plasmático (AUC), cuyos valores
guardan estrecha relación con lo observado en las gráficas realizadas para cada
tratamiento en cada día de determinación.
La comparación estadística entre las constantes farmacocinéticas obtenidas para
la Glimepirida en Nanopartículas y las obtenidas para la Glimepirida comercial se
realizó mediante un Diseño Completamente al Azar (DCA), realizando un análisis
de varianza (ADEVA) y aplicando una prueba de significancia al 95 % en este
caso la t de student, concluyendo que no existe diferencia estadísticamente
significativa entre los datos obtenidos para cada uno de los tratamientos, ya que
los valores calculados para F en el caso de ADEVA y P en el caso de t de student
son menores a los valores tabulados para cada una de las constantes
comparadas, por lo tanto se rechaza la hipótesis alternativa y se acepta la
hipótesis nula en la que se plantea que los parámetros o constantes
farmacocinéticas obtenidos para el medicamento nanopartículado de Glimepirida
son similares a los del medicamento de Glimepirida comercial.
161
5.2. RECOMENDACIONES
Debido a que al realizar la comparación estadística de los datos farmacocinéticos
obtenidos para la Glimepirida en Nanopartículas y la Glimepirida comercial se
determinó que no existe diferencia significativa se recomienda la revisión de la
formulación en Nanopartículas con el objetivo de mejorar la producción de las
mismas ya que los resultados obtenidos no satisfacen las expectativas de la
industria que actualmente desarrolla este medicamento.
Se recomienda la realización de un segundo estudio farmacocinético preclínico,
considerando otro intervalo de toma de muestra y una mayor uniformidad en
cuanto al peso de los animales con el objetivo de descartar errores de
determinación debido a la influencia de la variabilidad biológica sobre los
resultados de extracción al aplicar el método desarrollado.
Es importante el uso de una pre-columna en el cromatógrafo con el objetivo de
disminuir el ruido generado tanto por el plasma de rata como por los diferentes
reactivos que intervienen durante la extracción y cuantificación de los analitos de
interés.
Se recomienda por motivos experimentales el tratamiento de los datos
considerando al proceso como una reacción de primer orden, puesto que a nivel
bibliográfico el 90 % de los medicamentos se comportan de esta manera y los
estudios publicados, similares al presente, establecen en su mayoría que los
subprocesos del Sistema LADME se ajustan a una cinética de orden 1.
162
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Wells, D. (2003). Protein precipitation: High throughput techniques and strategies for
method development. Amsterdam: Elsevier.
Zief, M; Kiser, R. (2000). An overview of solid phase extraction for sample preparation.
American Laboratory.
165
ABREVIATURAS
ACN: Acetonitrilo
ADEVA: Análisis de varianza
AUC: Área bajo la curva de nivel plasmático
C máx: Concentración máxima
CV: Coeficiente de variación
DCA: Diseño completamente al azar
DEA: Desviación estándar absoluta
GLB: Glibenclamida
GLM: Glimepirida
HPLC: High performance liquid chromatography
Ka: Constante de absorción
Ke: Constante de eliminación
LLE: Extracción líquido-líquido
ng: Nanogramos
nm: Nanómetros
Pa: Principio activo
PGZ: Pioglitazona
S.I.: Estándar interno
SPE: Extracción en fase sólida
t máx: Tiempo máximo
t ½ e: Tiempo medio de eliminación
UV: Ultravioleta
166
ANEXOS
Anexo 1. Tablas de la estructura del Diseño Completamente al Azar para nanopartículas de GLM
y GLM comercial. Primer día de análisis.
Tratamientos Repeticiones Media
0 m
in
R9N R10N R11N R12N XN1A
TN0 TN0R9N TN0R10N TN0R11N TN0R12N TN0XN1A
R1C R2C R3C R4C XC1A
TC0 TC0R1C TC0R2C TC0R3C TC0R4C TC0XC1A
15 m
in
R13N R14N XN2
TN15 TN15R13N TN15R14N TN15XN2
R5C R6C XC2
TC15 TC15R5C TC15R6C TC15XC2
30 m
in
R15N R16N XN3
TN30 TN30R15N TN30R16N TN30XN3
R7C R8C XC3
TC30 TC30R7C TC30R8C TC30XC3
60 m
in
R9N R10N XN4
TN60 TN60R9N TN60R10N TN60XN4
R1C R2C XC4
TC60 TC60R1C TC60R2C TC60XC4
120 m
in
R11N R12N XN5
TN120 TN120R11N TN120R12N TN120XN5
R3C R4C XC5
TC120 TC120R3C TC120R4C TC120XC5
180 m
in
R13N R14N XN6
TN180 TN180R13N TN180R14N TN180XN6
R5C R6C XC6
TC180 TC180R5C TC180R6C TC180XC6
167
240 m
in
R9N R10N XN7
TN240 TN240R9N TN240R10N TN240XN7
R1C R2C XC7
TC240 TC240R1C TC240R2C TC240XC7
300 m
in
R15N R16N XN8
TN300 TN300R15N TN300R16N TN300XN8
R7C R8C XC8
TC300 TC300R7C TC300R8C TC300XC8
360 m
in
R13N R14N XN9
TN360 TN360R13N TN360R14N TN360XN9
R5C R6C XC9
TC360 TC360R5C TC360R6C TC360XC9
420 m
in
R15N R16N XN10
TN420 TN420R15N TN420R16N TN420XN10
R7C R8C XC10
TC420 TC420R7C TC420R8C TC420XC10
480 m
in
R11N R12N XN11
TN480 TN480R11N TN480R12N TN480XN11
R3C R4C XC11
TC480 TC480R4C TC480R5C TC480XC11
540 m
in
R13N R14N XN12
TN540 TN540R13N TN540R14N TN540XN12
R5C R6C XC12
TC540 TC540R5C TC540R6C TC540XC12
660 m
in
R15N R16N XN13
TN660 TN660R15N TN660R16N TN660XN13
R7C R8C XC13
TC660 TC660R7C TC660R8C TC660XC13
168
720 m
in
R11N R12N XN14
TN720 TN720R11N TN720R12N TN720XN14
R3C R4C XC14
TC720 TC720R4C TC720R5C TC720XC14
1440
min
R9N R10N XN15
TN1440 TN1440R9N TN1440R10N TN1440XN15
R1C R2C XC15
TC1440 TC1440R1C TC1440R2C TC1440XC15
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Nota: Las concentraciones están en función del tiempo considerando para cada
tiempo la media de cada grupo de muestreo.
169
Anexo 2. Tablas de la estructura del Diseño Completamente al Azar para nanopartículas de GLM
y GLM comercial. Segundo día de análisis.
Tratamientos Repeticiones Media
0 m
in
R1N R2N R3N R4N XN1A
TN0 TN0R1N TN0R2N TN0R3N TN0R4N TN0XN1A
R9C R10C R11C R12C XC1A
TC0 TC0R9C TC0R10C TC0R11C TC0R12C TC0XC1A
15 m
in
R5N R6N XN2
TN15 TN15R5N TN15R6N TN15XN2
R13C R14C XC2
TC15 TC15R13C TC15R14C TC15XC2
30 m
in
R7N R8N XN3
TN30 TN30R7N TN30R8N TN30XN3
R15C R16C XC3
TC30 TC30R15C TC30R16C TC30XC3
60 m
in
R1N R2N XN4
TN60 TN60R1N TN60R2N TN60XN4
R9C R10C XC4
TC60 TC60R9C TC60R10C TC60XC4
120 m
in
R3N R4N XN5
TN120 TN120R3N TN120R4N TN120XN5
R11C R12C XC5
TC120 TC120R11C TC120R12C TC120XC5
180 m
in
R5N R6N XN6
TN180 TN180R5N TN180R6N TN180XN6
R13C R14C XC6
TC180 TC180R13C TC180R14C TC180XC6
170
240 m
in
R1N R2N XN7
TN240 TN240R1N TN240R2N TN240XN7
R9C R10C XC7
TC240 TC240R9C TC240R10C TC240XC7
300 m
in
R7N R8N XN8
TN300 TN300R7N TN300R8N TN300XN8
R15C R16C XC8
TC300 TC300R15C TC300R16C TC300XC8
360 m
in
R5N R6N XN9
TN360 TN360R5N TN360R6N TN360XN9
R13C R14C XC9
TC360 TC360R13C TC360R14C TC360XC9
420 m
in
R7N R8N XN10
TN420 TN420R7N TN420R8N TN420XN10
R15C R16C XC10
TC420 TC420R15C TC420R16C TC420XC10
480 m
in
R3N R4N XN11
TN480 TN480R3N TN480R4N TN480XN11
R11C R12C XC11
TC480 TC480R11C TC480R12C TC480XC11
540 m
in
R5N R6N XN12
TN540 TN540R5N TN540R6N TN540XN12
R13C R14C XC12
TC540 TC540R13C TC540R14C TC540XC12
660 m
in
R7N R8N XN13
TN660 TN660R7N TN660R8N TN660XN13
R15C R16C XC13
TC660 TC660R15C TC660R16C TC660XC13
171
720 m
in
R3N R4N XN14
TN720 TN720R3N TN720R4N TN720XN14
R11C R12C XC14
TC720 TC720R11C TC720R12C TC720XC14
1440
min
R1N R2N XN15
TN1440 TN1440R1N TN1440R2N TN1440XN15
R9C R10C XC15
TC1440 TC1440R9C TC1440R10C TC1440XC15
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
Nota: Las concentraciones están en función del tiempo considerando para cada
tiempo la media de cada grupo de muestreo.
172
Anexo 3. Datos cromatográficos y de concentración de GLM comercial 1° determinación.
Tiempo (min)
T. retención
S.I. Área S.I.
T. retención
GLM Área GLM
Relación de áreas
Conc. (ng/mL)
Promedio (ng/mL)
Desv. Est.
% C.V
0 - - - - - 0 - - -
15 3,708 238,3687 5,776 28,2097 0,1183 109,6788 107,1123 3,6296 3,4
15 3,650 297,0520 5,677 7,5341 0,0254 104,5457
30 3,707 221,7474 5,748 92,0500 0,4151 718,1920 727,2204 12,7680 1,8
30 3,686 205,5699 5,719 87,1448 0,4239 736,2487
60 3,680 203,1578 5,699 133,3359 0,6563 1212,7763 1121,1366 129,5982 11,6
60 3,697 238,8780 5,740 135,4278 0,5669 1029,4968
120 3,649 271,1430 5,645 78,5466 0,2897 573,2547 550,9329 31,5679 5,7
120 3,700 207,4598 5,741 66,9379 0,3227 528,6110
180 3,622 210,1758 5,607 65,2945 0,3107 504,0286 493,2924 15,1834 3,1
180 3,698 224,5973 5,735 67,4228 0,3002 482,5561
240 3,710 208,9463 5,752 62,6667 0,2999 481,9893 476,7298 7,4381 1,6
240 3,621 222,2430 5,604 65,5145 0,2948 471,4703
300 3,660 273,2400 5,662 62,2856 0,2280 463,7840 463,7840 - -
360 3,694 229,0788 5,724 64,2092 0,2803 441,7494 441,7494 - -
420 3,699 178,3329 5,687 37,4672 0,2101 297,8142 267,9560 42,2259 15,8
420 3,690 213,9725 5,746 38,7234 0,1810 238,0977
480 3,727 230,0231 5,799 34,7496 0,1511 176,7810 176,7810 - -
540 3,657 276,8470 5,561 6,8138 0,0246 103,2144 103,2144 - -
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
173
Anexo 4. Datos cromatográficos y de concentración de GLM comercial 2° determinación.
Tiempo (min)
T. retención
S.I. Área S.I.
T. retención
GLM
Área GLM
Relación de áreas
Conc. (ng/mL)
Promedio (ng/mL)
Desv. Est.
% C.V
0 - - - - - 0 - - -
15 3,654 290,7400 5,642 16,1037 0,0554 157,7885
156,6866 1,5584 1,0
15 3,656 292,1020 5,671 15,8161 0,0541 155,5846
30 3,657 270,0240 5,662 59,9073 0,2219 452,9800
435,1462 25,2208 5,8
30 3,653 256,3090 5,645 51,7090 0,2017 417,3124
60 3,697 230,3582 5,734 119,6869 0,5196 932,3777
775,7592 221,4921 28,6
60 3,703 233,1179 5,746 85,5089 0,3668 619,1406
120 3,634 277,4320 5,649 49,5388 0,1786 376,2038
344,2340 45,2121 13,1
120 3,664 276,3400 5,689 39,3795 0,1425 312,2642
180 3,648 283,7850 5,650 36,9420 0,1302 290,4041
268,9238 30,3777 11,3
180 3,651 275,4180 5,669 29,1802 0,1059 247,4435
240 3,648 255,5790 5,567 24,2020 0,0947 227,4875
211,8825 22,0689 10,4
240 3,656 272,1880 5,650 20,9841 0,0771 196,2774
300 3,652 282,4020 5,641 20,9267 0,0741 190,9726
188,4343 3,5898 1,9
300 3,677 253,7100 5,681 18,0742 0,0712 185,8959
360 3,642 279,9760 5,638 17,5497 0,0627 170,7228
169,3276 1,9731 1,2
360 3,649 282,1620 5,747 17,2427 0,0611 167,9324
420 3,663 265,8210 5,691 15,0562 0,0566 160,0080
162,0441 2,8794 1,8
420 3,670 265,2180 5,670 15,6311 0,0589 164,0801
480 3,660 282,8660 5,683 9,7557 0,0345 120,7280 120,7280 - -
540 3,669 290,0430 5,729 8,8206 0,0304 113,4978 111,9140 2,2398 2,0
540 3,644 290,9550 5,705 8,3286 0,0286 110,3302
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
174
Anexo 5. Datos cromatográficos y de concentración de GLM Nanopartículas 1° determinación
Tiempo (h)
T. retención
S.I. Área S.I.
T. retención
GLM
Área GLM
Relación de áreas
Conc. (ng/mL)
Promedio (ng/mL)
Desv. Est.
% C.V
0 - - - - - 0 - - -
15 3,671 280,7960 5,6980 19,6162 0,0699 183,4482
191,0881 10,8044 5,7
15 3,662 206,6601 5,6830 33,4322 0,1618 198,7279
30 3,648 262,6546 5,6390 60,7963 0,2315 341,6362
437,6005 135,7140 31,0
30 3,661 193,7120 5,9110 62,9701 0,3251 533,5648
60 3,689 231,4303 5,7150 145,0588 0,6268 1152,2380
1229,0529 108,6327 8,8
60 3,710 211,4679 5,7510 148,3906 0,7017 1305,8678
120 3,635 259,6490 5,6070 46,8190 0,1803 379,3150
376,2788 4,2939 1,1
120 3,629 280,0800 5,6050 49,5439 0,1769 373,2425
180 3,706 191,9515 5,7660 36,2194 0,1887 253,9195
308,1843 76,7419 24,9
180 3,693 184,9958 5,7570 44,6985 0,2416 362,4490
240 3,674 260,3470 5,6980 25,1672 0,0967 230,9863
217,2945 19,3631 8,9
240 3,667 285,8402 5,6850 23,2174 0,0812 203,6027
300 3,678 277,9790 5,6980 18,4340 0,0663 177,1623
169,1447 11,3387 6,7
300 3,690 212,0870 5,7210 88,5530 0,4175 161,1270
360 3,667 192,8782 5,7100 26,1815 0,1357 145,3495 145,3495 - -
420 3,658 223,0639 5,6670 29,6907 0,1331 139,9422 139,9422
480 3,628 266,7360 5,6070 9,2011 0,0345 120,7393 120,7393 - -
540 3,648 251,7326 5,6730 30,3113 0,1204 113,9149 113,9149 - -
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
175
Anexo 6. Datos cromatográficos y de concentración de GLM Nanopartículas 2° determinación
Tiempo (h)
T. retención
S.I. Área S.I.
T. retención
GLM
Área GLM
Relación de áreas
Conc. (ng/mL)
Promedio (ng/mL)
Desv. Est.
% C.V
0 - - - - - 0 - - -
15 3,674 253,3410 5,675 22,8588 0,0902 219,5693
243,6145 34,0050 14,0
15 3,679 269,4090 5,700 31,6150 0,1173 267,6596
30 3,637 229,8280 5,616 70,6897 0,3076 604,9771
573,9973 43,8121 7,6
30 3,686 281,5020 5,697 76,7473 0,2726 543,0175
60 3,676 214,1378 5,731 30,7150 0,1434 723,1536
746,8429 33,5017 4,5
60 3,633 241,3300 5,605 96,7588 0,4009 770,5322
120 3,686 244,4080 5,703 47,5202 0,1944 404,3413
466,1810 87,4545 18,8
120 3,683 260,8570 5,692 68,9126 0,2642 528,0207
180 3,622 277,5840 5,599 48,5052 0,1747 369,4277
336,6083 46,4136 13,8
180 3,638 287,7460 5,615 39,6296 0,1377 303,7889
240 3,681 262,7330 5,702 31,0030 0,1180 268,8166 268,8166 - -
300 3,622 270,2020 5,611 21,5770 0,0799 201,1732 201,1732 - -
360 3,630 289,3130 5,604 21,0325 0,0727 188,4822
177,0076 16,2276 9,2
360 3,672 294,4170 5,678 17,5932 0,0598 165,5329
420 3,681 269,7260 5,707 14,2926 0,0530 153,5339
144,9382 12,1562 8,4
420 3,671 256,6200 5,746 11,1102 0,0433 136,3424
480 3,630 286,3670 5,702 10,2369 0,0357 122,9600
122,4661 0,6986 0,6
480 3,643 292,4750 5,640 10,2923 0,0352 121,9721
540 3,678 261,2560 5,708 8,2597 0,0316 115,6328 115,6328 - -
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
176
Anexo 7. Carta de aceptación Universidad Nacional Autónoma de México
177
Anexo 8. Cromatogramas de la 1° Determinación de GLM Comercial
178
179
Anexo 9. Cromatogramas de la 2° Determinación de GLM Comercial
180
181
Anexo 10. Cromatogramas de la 1° Determinación de GLM en nanopartículas
182
183
Anexo 11. Cromatogramas de la 2° Determinación de GLM en nanopartículas
184
185
Anexo 12. Traducción de Resumen Documental
186
Anexo 13. Diagrama de Flujo Desarrollo del Método Analítico
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
187
Anexo 14. Diagrama de Flujo Validación del Método Analítico
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
188
Anexo 15. Diagrama de Flujo Aplicación del Método Analítico
Elaborado por: Wendy Chávez (2015)
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