1 BIOTECNOLOGIA

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1 BIO “ bios ” BIOLOGIA: Ciencia que estudia la vida TECNOLOGIA: “Estudia las técnicas, herramientas y materiales en un proceso” BIOTECNOLOGIA + BIOTECNOLOGIA Uso integrado de la microbiología, bioquímica y la ingeniería para obtener aplicaciones tecnológicas de los microorganismos, células animales, células vegetales y de las fracciones derivadas. Consiste en la explotación industrial de microorganismos, células animales, células vegetales y de las fracciones sub-celulares. La utilización de moléculas obtenidas biológicamente, estructuras celulares, células u organismos para llevar a cabo procesos específicos B I O T E C N O L O G I A NUMEROSAS APLICACIONES NUMEROSAS APLICACIONES •Industria de fermentación •Industria agroalimentaria •Industria química y farmacéutica •Tratamiento y valorización de sub-productos agroindustriales y de efluentes •Producción de alcohol •Producción de biogas ALGUNAS DEFINICIONES ALGUNAS DEFINICIONES

Transcript of 1 BIOTECNOLOGIA

  • 1BIO bios

    BIOLOGIA:Ciencia que estudia la vida

    TECNOLOGIA:Estudia las tcnicas,

    herramientasy materiales en un

    proceso

    BIOTECNOLOGIA

    +

    BIOTECNOLOGIA

    Uso integrado de la microbiologa, bioqumica y la ingeniera para obtener aplicaciones tecnolgicas de los microorganismos, clulas animales, clulas vegetales y de las fracciones derivadas.

    Consiste en la explotacin industrial de microorganismos, clulas animales, clulas vegetales y de las fracciones sub-celulares.

    La utilizacin de molculas obtenidas biolgicamente, estructuras celulares, clulas u organismos para llevar a cabo procesos especficos

    B I O T E C N O L O G I A

    NUMEROSAS APLICACIONES NUMEROSAS APLICACIONES

    Industria de fermentacinIndustria agroalimentariaIndustria qumica y farmacutica

    Tratamiento y valorizacin de sub-productos agroindustriales y de efluentes

    Produccin de alcoholProduccin de biogas

    ALGUNAS DEFINICIONESALGUNAS DEFINICIONES

  • 2QumicaIngeniera enzimticaIngeniera genticaIngeniera

    matemticasInformticaAutomatizacinEconoma

    SE CARACTERIZA POR SU CARCTER INTERDISCIPLINARIO

    ADEMAS:

    MICR

    OBIO

    LOGI

    A

    INGENIERIA

    BIO

    QU

    IMIC

    ABIOLOGIAMOLECULAR

    BIOTECNOLOGIA

    ALGUNOS ACONTECIMIENTOS IMPORTANTES EN EL DESARROLLO HISTORICO DE LA BIOTECNOLOGIA

    AO ACONTECIMIENTO

    AC Cerveza, pan, vino, lcteos fermentados, pescado fermentado, kojiS XVII Produccin de vinagre y cido actico(inmovilizacin de clulas)1857 Fermentacin lctica (L. Pasteur)1908 Enzimas inmovilizadas sobre carbn1916 -D-fructofuranosidasa inmovilizada sobre almina1917 Karl Ereki acua el trmino biotecnologa1928 Primer transplante de nucleo en clulas embrionarias de salamandra1935 Cultivo in vitro de tejidos vegetales1940 Se crea la escuela de ingeniera biolgica en el MIT1943 Produccin industrial de penicilina1952 Clonacin de sapos mediante transplante de ncleos1953 Se determina la estructura del DNA (Watson y Crick)1958 Regeneracin de plantas a partir del cultivo de tejidos 1961 Publicacin de Biotechnology and Bioengineering1961-6 Se descifra el cdigo gentico .....

  • 3AO ACONTECIMIENTO

    1963 J.B.S. Haldane acuo el trmino CLON1964 Transformacin de esteroides por clulas inmovilizadas1967 Uso industrial de glucosa isomerasa inmovilizada1967 Se asla la DNA ligasa1969 James Shapiero y Johnathan Beckwith aislaron el primer gen1970 Howard Remin y David Baltimore, aislaron la primera enzima de restriccin

    (transcriptas inversa)1972 Khorana y col. Sintetizan un gen de RNAt1972 Paul Berg crea la primera molcula de DNA recombinante1973 Stanley y Cohen y Herbert Boyer crean el primer organismo

    recombinante (E. Coli)1975 Kholer y Milnstein describen la produccin de anticuerpos monoclonales1976 Se desarrollan tcnicas para secuenciar el DNA1978 Genentech produce insulina humana en E. coli1979 Sciences de la vie et socit (Gros, Jacob & Royer)1980 Se presenta el informe Spink1980 La corte suprema de EE. UU. Acepta patentar microorganismos manipulados

    genticamente .....

    AAOO ACONTECIMIENTOACONTECIMIENTO

    1981 La federacin europea de biotecnologa da la definicin de trmino

    Biotecnologa)

    1982 Se aprueba en Europa el uso de la primera vacuna recombinante para

    animales

    1983 Transformacin en plantas con plasmidio Ti recombinado

    1984 Kary B. Mulis desarroll la reaccin en cadena de la polimerasa: PCR

    1985 S. Willadsen clona una oveja mediante transplante de ncleo

    1986 S. Willadsen clona una vaca

    S. Willadsen clona una vaca usando clulas embrionarias diferenciadas

    1988 Se patenta en EE.UU. un ratn recombinado susceptible a cncer.// Se

    publica el mtodo PCR

    1990 Se aprueba una terapia gnica en humanos

    1996 Ian Wilmut y Keith Cambell clonan a Dolly usando clulas mamarias

    1997 Se clona Polly, una oveja, usando clulas de piel

  • 4GRANDES ETAPAS EN EL DESARROLLO DE LA BIOTECNOLOGIA GRANDES ETAPAS EN EL DESARROLLO DE LA BIOTECNOLOGIA

    BIOTECNOLOGIA DE SEGUNDA Y TERCERA GENERACION: AISLAMIENTO Y USO DE ALGUNOS MICROORGANISMOS,

    EXTRACCION Y PURIFICACION DE ALGUNAS ENZIMAS Y LA ERA DE LOS ANTIBIOTICOS

    BIOTECNOLOGIA DE CUARTA GENERACION: UTILIZACION OPTIMA DE MICROORGANISMOS Y ENZIMAS, CULTIVO DE TEJIDOS Y ANTICUERPOS MONOCLONALES, MEJORAMIENTO DE CELULAS, TECNOLOGIA DEL ADN

    RECOMBINANTE

    BIOTECNOLOGIA DE PRIMERA GENERACION: USO EMPIRICO DE MICROORGANISMOS Y ENZIMAS PARA PRODUCIR BEBIDAS ALCOHOLICAS,

    LACTEOS, VINAGRE, FERMENTADOS TRADICIONALES

    BIOTECNOLOGIA ALIMENTARIABIOTECNOLOGIA ALIMENTARIA

    SE USA TECNICAS BIOLGICAS PARA LA PRODUCCIN, TRANSFORMACIN Y/O PRESERVACIN DE ALIMENTOS:

    Produccin de bebidas alcoholicas, productos fermentados (yogourt, queso, embutidos)

    protena unicelular, fermentacin de cacao, caf y t.

    PRODUCCION DE MATERIAS PRIMAS, ADITIVOS Y COADYUVANTES EMPLEADOS EN LA INDUSTRIA ALIMENATRIA:

    Produccin de aminocidos, vitaminas, enzimas, cidos orgnicos biopolmeros,

    colorantes, potenciadosres de sabor, etc.

    ES UTILIZADA EN ASPECTOS ANALTICOS Y DE CONTROL DE CALIDAD:Enzimas empleadas en la determinacin de componentes especficos, micoorga-nismos

    empleados en evaluacin nutricional (vitaminas, aminocidos, coles-terol, etc.) y

    biosensores enzimticos.

  • 5LA BIOTECNOLOGIA TIENE VENTAJAS COMPARATIVAS, LA BIOTECNOLOGIA TIENE VENTAJAS COMPARATIVAS, RESPECTO A LA QUIMICA TRADICIONAL:RESPECTO A LA QUIMICA TRADICIONAL:

    Se aprovecha las propiedades funcionales de los microorganismos.

    Los microorganismos se multiplican rpidamente y tienen un metabolismo extremadamente activo.

    Bajo ciertas condiciones producen grandes cantidades de sustancias (metabolitos), en relacin a su tamao.

    Las bioconversiones son altamente especificas. Ejem. Transformacin de lactosa.

    Las bioconversiones se realizan en un medio poco desnaturante, a temperaturas biolgicas, emplean agua como solvente y no tiene necesidad de catalizadores poluentes.

    ALGUNOS APORTES IMPORTANTES DE LA BIOTECNOLOGIA EN DIFERENTES SECTORES

    SSEECCTTOORR EEJJEEMMPPLLOOSS

    AGRICULTURASeleccin de variedades, plantas y animales obtenidos pordiversas tcnicas incluyendo clonacin

    ENERGETICO Produccin de biogas, produccin de etanol

    MEDIO AMBIENTEDesarrollo de mtodos y procedimientos de monitoreoDesarrollo de tcnicas de tratamiento de desechos industriales

    ALIMENTARIO

    Nuevos mtodos de tratamiento y preservacin de alimentosProduccin de aditivosEnzimas utilizadas en el procesamiento de alimentosProduccin de protena unicelular

    MEDICO

    Desarrollo de mtodos de diagnstico utilizando enzimas,sensores enzimticosUso de microorganismos y enzimas en la elaboracin de drogascomplejas (ejemplo esteroides)Nuevos antibiticosUso de enzimas en terapias

    MINERIA Extraccin de minerales (lixiviacin microbiana)QUIMICO Produccin de cidos orgnicos (ctrico, actico)

  • 6ETAPA QUESO CERVEZA

    Primera

    generacin

    Uso emprico de bacterias lcticas

    Uso emprico de quimosina

    Uso emprico de levaduras

    Proceso emprico de malteado

    Segunda

    generacin

    Aislamiento y uso de bacterias lcticas

    Extraccin, purificacin y caracterizacin de quimosina

    Uso de cultivos puros de levaduras

    Esclarecimiento de la naturaleza enzimtica del malteado

    Uso de papana para la clarificacin en fro

    Tercera

    generacin

    Propagacin masiva de bacterias lcticas

    Seleccin de cultivos lcticos mejorados

    Sustitucin de quimosina por proteasa microbiana

    producida en gran escala

    Mejor control de la fermentacin

    Fermentacin continua para la produccin de cerveza

    Produccin y uso de amilasas y -glucanasas

    Uso de enzimas para la produccin de cervezas ligeras

    Cuarta

    generacin

    Tecnologa del ADN recombinante para la produccin de

    quimosina y mejoramiento de bacterias lcticas

    Utilizacin optima de enzimas y microorganismos para la

    maduracin acelerada y generacin de sabores

    Ingeniera gentica para la obtencin de levaduras amilolticas

    Cultivo de tejidos e ingeniera gentica para el mejoramiento de

    cebada

    Procesos con microorganismos yenzimas inmovilizadas

    IMPACTO DEL DESARROLLO DE LA BIOTECNOLOGIAEN LA PRODUCCION DE QUESO Y DE CERVEZA

    ESQUEMA DE LA PRODUCCION E INTEGRACION DE LAS TECNICAS BIOTECNOLOGICAS

    Man

    ipu

    laci

    ng

    ent

    ica

    Cultivo de clulas animalesClulas vegetalesMicroorganismos, etc...

    Optimizacin de los fenmenos de transferencia AutomatizacinDesarrollo de nuevos sensores

    TECNICAS DE ANALISISCromatografa:HPLC, CPG SondasAnticuerposElectroforsis

    Microfiltracin tangencialUltrafiltracinCromatografa

    liquida preparativa, HPLC.

    PRODUCTOS AlimentariosFarmacuticos EnergaQumicos

    Cl

    ula

    s y

    enzi

    mas

    in

    mov

    iliza

    das

    CELULASPRE-CULTIVO

    BIO-REACTOREXTRACCION Y

    PURIFICACION

    FERMENTADOR

    Opt

    imiz

    aci

    n

  • 7ESQUEMA OPTIMO DE UNA PRODUCCION BIOTECNOLOGICAY DE LA UTILIZACION DE ENZIMAS

    MANIPULACIONGENETICA

    CELULASPRE-CULTIVO

    BIO-REACTOR

    EXTRA / INTRACELULAR

    CELULAS(Biomasa)

    INMOVILIZACION

    METABOLITOAcido orgnicoAminocidoAntibitico

    ENZIMA ENZIMA

    REACTOR

    PRODUCTOFINAL

    EXTRACCION Y/OPURIFICACION

    REACTOR INMOVILIZACIONINMOVILIZACION

    EJEMPLOS DE PRODUCCION Y APLICACIONES DE BIOMASA

    S. CerevisiaeS. Carlsbergensis

    Chorela sp.Spirulina sp.Pseudomonas sp.Methalomonas sp.Candida sp.Aspergillus sp.Trichoderma sp.Lactobacillus sp.Pediococcus sp.Leuconostoc spLactobacillus sp.Bifidobacterias spStreptococcus sp.Bacillus sp.

    Bacillus turingensisBcillus sphearicusSeudomonas fluorescensBacillus subtilisTrichoderma sp

    Levadura de panificacinLevadura de cevecera

    Algas

    Bacterias

    LevadurasHongos

    Fermentos lcticos

    Probiticos

    Activadores de degradacin

    Insecticidas

    Fungicidas

    Panadera y cervecera

    Protena unicelular (SCP)

    Starters

    Biopesticidas

    MICROORGANISMO EJEMPLOS APLICACIONES

  • 8EJEMPLOS DE PRODUCCION DE METABOLLITOS POR EJEMPLOS DE PRODUCCION DE METABOLLITOS POR FERMENTACIONFERMENTACION

    TIPO DE METABOLITO PRODUCTOS MICROORGANISMO

    Aminocidos

    - Acido glutmico- Leucina- Lisina- Triptofano

    - Brevibacterium sp.- Corinebacterium sp.- Corinebacterium sp.- Corinebacterium sp.

    Antibiticos

    - Bacitracina- Cefalosporina- Cloranfenicol- Gramicidina- Mitomicina- Monensina- Neomicinas- Penicilinas- Polimixina- Streptomicina- Virginiamicina

    - Bacillus subtilis- Cefaslosporium sp.- Streptomices venezuelae- Bacillus brvis- Streptomices caespitosus- Streptomices cinnamonensis- Streptomices fradiae- Penicilium crisogenum- Bacillus polimixa- Streptomices griseus- Streptomices virginiae

    Alcoholes - Etanol

    - Butanodiol/acetoina

    - Sacharomices cerevisiae- Zymomonas movilis- Leuconostoc sp- Aerobacter aerogenes- Bacillus subtilis- Serratia marcenscens

    Enzimas - Alfa-amilasa

    - Celulasas

    - Pectinasas

    - Beta-galactosidasa

    - Proteasas

    - Lipasas

    - Bacillus licheniformis- Aspergillus oryzae- Aspergillus niger- Trichoderma viride- Aspergillus niger- Aspergillus foetidus- Aspergillus niger- Kluyveromices marxianus

    - Bacillus subtilis- Bacillus licheniformis

    - Mucor miehi- Aspergillus niger,- Rhizopus oryzae

    Acidos orgnicos - Acido actico- Acido ctrico

    - Acido lctico- Acido mlico- Acido pirvico- Acido succnico

    - Acetobacter sp.- Aspergillus niger- Candida lipolitica- Lactobacillus sp..- Lactobacillus brevis- Pseudomonas aeruginosa- Bacilluis sp

    Polisacaridos - Dextrana

    - Alginato- Xantana

    - Acetobacter sp.- Leuconostoc mesenteroides- Pseudomonas, sp- Xantomonas sp.

    Vitaminas - Caroteno (pro vita. A)

    - B6- B12

    - Choanefora sp.- Rhodotora sp.- Aspergillus sp.- Propionibacterium sp.

  • 9MERCADO MUNDIAL DE PRODUCTOS BIOTECNOLOGICOS

    INDUSTRIAALIMENTARIA (48 %)

    AGRICULTURA(2%)

    QUIMICA Y ENERGIA (8 %)

    FAR

    MA

    CIA

    (42

    %)

    Otros (6 %)Vitaminas (3%)Hormonas (9%)

    VacunasReactivosde diagntico (30%)

    Antibiticos (52%)

  • 10

    MERCADO MUNDIAL DE PRODUCTOS BIOTECNOLOGICOS MERCADO MUNDIAL DE PRODUCTOS BIOTECNOLOGICOS EN 1995EN 1995

    1500

    3100

    900 800 7001000

    3000

    0

    500

    1000

    1500

    2000

    2500

    3000

    3500

    Mill

    ones

    de

    dola

    res

    ETA

    NO

    L

    FR

    UC

    TOSA

    A. C

    ITR

    ICO

    GLU

    TAM

    ATO

    MO

    NO

    SOD

    ICO

    LISI

    NA

    EN

    ZIM

    AS

    QU

    IMIC

    OS

    FIN

    OS

    ORGANISMOS UNICELULARES, CENOCITICOS O ORGANISMOS UNICELULARES, CENOCITICOS O MULTICELULARES SIN DIFERENCIACIONMULTICELULARES SIN DIFERENCIACION

    BACTERIAS

    PROCARIOTAS

    ALGAS AZUL-VERDE

    MOHOS, LEVADURAS

    EUCARIOTAS

    PROTOZOARIOS, ALGAS

  • 11

    PROCARIOTA EUCARIOTA

    Estructuras genticas:

    nmero de cromosomas membrana nuclear DNA nuclear unido a histonas DNA en organelos

    Estructura citoplasmica:

    naturaleza de los ribosomas citoplsmicos naturaleza de los ribosomas de los organelos mitocondrias cloroplastos

    Cantidades relativas de DNA

    1

    -

    -

    -

    70s*

    ninguna

    -

    -

    -5 x 10-15 g(1)

    >1

    +

    +

    +

    80s

    70s

    +

    + o -

    3 x 10-12 0.5 x 10-12

    *S=UNIDADES SVEDBERG

    DIFERENCIAS ENTRE CELULAS EUCARIOTAS Y PROCARIOTAS

    COMPARACION DE LAS CARACTERISTICAS DE CELULAS ECUCARIOTAS Y PROCARIOTAS

    (1) Indica el tamao del RIBOSOMA, medido por la velocidad de sedimentacion en ultracentrifugacion.S = Valor Svedberg

    (2) La reproduccin parasexual incluye conjugacin, transduccin y transformacin.

    1

    2

  • 12

    EUCARIOTAS:

    Protistas superiores

    PROCARIOTAS:

    Protistas inferiores

    NU

    CLE

    O- Membrana nuclear

    - Constituido de ADN asociado a protenas (Histonas)

    - Organizado en muchos cromo-somas, visibles al microscopio

    al momento de la divisin

    - La forma y nmero de cromosomas son caractersticos de la

    especie

    - Sin membrana nuclear

    - Nucleo difuso en el citoplas-ma

    - Constituido de ADN Casi la totalidad

    del ADN celular

    - Cromosoma nico

    CIT

    OPL

    ASM

    A

    - Estructura compleja: retculo endoplasmtico

    - Movimiento continuo

    - Numerosos ribosomas, libres o sobre los sitemas membranarios

    - Sin retculo endoplsmatico

    - Sin movimiento

    - Numerosos ribosomas, lugar de

    sntesis de protenas

    PAR

    ED

    - No est presente en todos los protistas superiores

    - Rol de proteccin

    - Compuesta de una red macromolecular que asegura su rigidez

    y resistencia

    - No contiene mucopptidos parietales: en Algas Celulosa;Hongos quitina.

    - Constante en todos los protistas

    inferiores

    - Rol de proteccin

    - Red macromolecular

    - Mucopptidos o glicopep-tidos

    parietales

    CARACTERSTICAS DIFERENCIALES ENTRE LAS CELULAS EUCARIOTAS Y PROCARIOTAS

    RE

    SPIR

    AC

    IN - Organos especializados: Mitocondrias - No tienen mitocondrias

    - Las enzimas necesarias estn localizadas a nivel de la

    membrana citoplsmica y de los mesosomas

    RE

    PRO

    DU

    CC

    ION

    - Divisin binaria de la clula

    - Divisin nuclear: mitosis

    - Posible reproduccin sexual por fusin de dos

    clulas, con:

    - Fusin nuclear, formacin de un zigote

    - Divisin nuclear: meiosi

    - Divisin binaria de la clula

    - Divisin nuclear: amitosis

    - Fenmenos sexuales raros y diferentes:

    - Conjugacin sin fusin celular

    - Transferencia de material gentico de una clula a otra

    - No hay divisin nuclear

    FOT

    OSI

    NT

    ESI

    S

    - Algas eucariotas

    - Transforman la energa solar en energa qumica, en

    los cloroplastos

    - Algas azul-verde

    - Bacterias fotosintticas

    - Sin cloroplastos

    - Cromatoforos

    MO

    VIM

    IEN

    TO

    - Ameboide sobre un soporte rgido para eucariotas sin

    pared

    - Contraccin de flagelos en el medio lquido

    (protozoaris-algas)

    - No tienen movimiento ameboide (Pared rgida)

    - Posible movimiento por contraccin de flagelos (estructura

    diferencial y simple)

  • 13

    G R U P O T IP O

    1

    2

    3

    4

    5

    6

    7

    8

    9

    1 0

    1 1

    1 2

    1 3

    1 4

    1 5

    1 6

    1 7

    1 8

    1 9

    B a c te rias fo to s in t ticas

    B a c te rias d es lizan tes

    B a c te rias con re ve s tim ien to

    B a c te rias con ye m a s o ap n d ices

    E sp iro q u e ta s

    B a c te rias e sp ira le s o cu rva d as

    B a c ilo s y co co s G ra m -ne g a tivo s ae rob io s

    B a c ilo s G ra m -n e g a tivo s a na e ro b ios fa cu lta tivo s

    B a c ilo s G ra m -n e g a tivo s a na e ro b ios

    C o cos y co co ba c ilo s G ra m -ne ga tivo s

    C o cos G ra m -ne ga tivo s an ae ro b io s

    B a c te rias G ra m -n ega tiva s q u im io lito tro fa s

    B a c te rias p ro d uc to ra s d e m e ta no

    C o cos G ra m -po s itivo s

    C o cos y b a c ilos fo rm ad ores de e sp o ra s

    B a c te rias d e m o rfo lo g a b a c ila r G ra m -p os itiva s no fo rm a d oras d e e sp o ras

    A c tin o m ice tos y o rga n ism os re la c io n ado s

    R iq u e ts ia s

    M icop lasm a s

    FAMILIAS DE BACTERIAS IMPORTANTES EN LOS PROCESOS BIOTECNOLOGICOS

    Fuente: Adaptado de Bergey,s Manual of Systeniatic Bacteriology, Vol 3. J.T. Staley, Ed. Baltimore: Williams & Wilkins, (1989)

    GRUPO Y FAMILIA GENERO PROCESO7. Cocos y bacilos Gram-negativos aerobiosPseudomonaceae Pseudomonas Protena de origen unicelular (SCP) a partir de

    metanol, oxidacin de esteroides / hidrocarburos,polisacridos (alginatos), oxidacin de alcoholes

    Mythilomonadaceae MethilomonasMethylococcus

    SCP a partir de metanolOxidacin del metano

    Azotobacteriaceae Azotobacter Fijacin no simbitica del nitrgeno8. Bacilos Gram-negativos anaerobios facultativosEnterobacteriaceae Escherichia Muchos procesos diferentes, produccin de

    aminocidos (lisina)Aerobacter Nucletidos, cido 2-cetoglutrico, pululanasa, cido

    6-aminopenicilnico, quimosina recombinante12. Bacterias Gram-negativas quimiolitotrofas

    Thiobacillus Lavado de cobre, cinc, hierro, manganeso, otrossulfuros

    13. Bacterias metangenasMethanenobacteriaceae

    Nocardiaceae

    MethanobacteriumMethanococcusNocardia

    Metano a partir de afluentes

    Oxidacin de hidrocarburos, esteroides

    ALGUNAS BACTERIAS DE IMPORTANCIA BIOTECNOLOGICA DE ENTRE LOS 19 GRUPOS BACTERIANOS

  • 14

    14. Cocos Gram-positivosMicrococcaceae Micrococcus Oxidacin de hidrocarburos, cultivos iniciadores para

    productos crnicosStreptococcaceae Streptococcus

    (Lactococcus)Produccin de cido lctico, diacetilo; cultivosiniciadores de quesos y otros productos lcteosfermentados

    Pediococcaceae PediococcusLeuconostoc

    Cultivos iniciadores para productos crnicosProduccin de dextrano; cultivos iniciadores paraquesos y vino (heterofermentacin)

    15. Bacilos y cocos formadores de esporasBacillaceae Bacillus Antibiticos, enzimas, aminocidos y vitaminas (B2,

    B12)Clostridium Butanol, acetona, cido butrico, toxina botulnica

    16. Bacterias de morfologa bacilar Gram-positivas no formadoras de esporasLactobacillaceae Lactobacillus

    Bifidobacterium

    cido lctico, productos lcteos fermentados,embutidos y productos vegetales fermentados;ensilado, alteracin de alimentosBifidoyogur, bifidotabletas

    17. Actinomicetos y organismos relacionadosGrupo Corineforme Corynebacterium

    ArthrobacterCellulomonas

    Oxidacin de hidrocarburos, aminocidosTransformacin de esteroidesFermentacin de la celulosa

    Propionibacteriaceae Propionibacteria Vitamina B12; cido propinico, fermentacin delqueso

    Mycobacteriaceae Mycobacterium Oxidacin de hidrocarburos y esteroides

    GENERO PRODUCTOS

    MucorRhizopusBlakesleaChoanephoraAshbyaCryptococcusCandidaRhodotorulaSaccharomycesSaccharomycopsisTorulopsisAspergillusCephalosporiumPenicilliumFusariumGibberella

    Acidos orgnicos, enzimas Acidos orgnicos, enzimas -Caroteno -Caroteno Riboflavina Riboflavina cido ctrico Lpidos Etanol, vino, cerveza Protenas cido ctrico Enzimas, antibiticos, cidos orgnicos Antibiticos Antibiticos, cidos orgnicos, enzimas Protena, grasa Sustancias semejantes a hormonas, giberelinas

    ALGUNOS HONGOS DE IMPORTANCIA BIOTECNOLOGICA

  • 15

    Cultivo puro, libre de otros microorganismos y de fagos Capaz de producir fcilmente clulas vegetativas y esporas u otras unidades

    de propagacin

    Que crezca vigorosamente en el medio, una vez inoculado en los fermentadores

    Que permita obtener el producto de inters en corto tiempo Que permita obtener el producto deseado, preferiblemente slo, libre de

    contaminantes txicos o no, y que sea de sea de fcil purificacin

    En lo posible que se proteja de la contaminacin, por ejemplo creciendo a pH cido o a alta temperatura o que produzca inhibidores de otros

    microorganismos

    Capaz de ser modificado con agentes mutagnicos, pero estables en ausencia de estos

    Fciles de conservar durante largos periodos de tiempo

    CARACTERISTICAS ESENCIALES DE LOS CARACTERISTICAS ESENCIALES DE LOS MICROORGANISMOS DE USO INDUSTRIALMICROORGANISMOS DE USO INDUSTRIAL

    Representa la evolucin de la poblacin celular durante el cultivo. Permite caracterizar la actividad de la poblacin celular.

    La velocidad de divisin de las celular.Los cambios en estado fisiolgico.

    Considerando un cultivo de microorganismo realizado en condiciones ideales:

    EL cultivo es de tipo discontinuo (Batch).El fermentador es infinitamente mezclado, lo que permite

    obtener un sistema homogneo.

    Las condiciones de cultivo (pH, Temperatura, aireacin,...) son constantes y favorables al desarrollo del microorganismo.

    En estas condiciones se obtiene las curvas de crecimiento siguientes:

    CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANOCURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

  • 16

    N = Nmero de clulas por unidad de volumen. t= Tiempo.

    ESQUEMA DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE UN MICROORGANISMO EN FERMENTACION BATCH

    La curva de crecimiento puede ser dividida en seis perodos, cuatro de los cuales (I,

    III, V, VI) constituyen fases en las que el microorganismo se encuentra en un estado

    fisiolgico particular. Los estados II y IV constituyen transiciones entre dos fase

    diferentes.

    I II III IV V VI

    t

    Log

    N

    A

    I II III IV V VI

    t

    N

    B

    I. FASE DE LATENCIA Ocurre inmediatamente despus de la inoculacin y constituye

    un periodo de adaptacin de las clulas al sustrato presente en el medio.

    No hay divisin celular. La duracin del perodo de latencia depende de varios factores,

    naturaleza del medio, tamao del inoculo. Si el cultivo que se va a utilizar como inoculo se encuentra

    en fase logartmica, puede no existir un perodo de latencia, sin embargo si el inoculo se toma de un cultivo que se ha detenido por limitacin de un sustrato el perodo de latencia puede ser grande

    II. FASE DE ACELERACION Cuando la fase de adptacin se termina, se inicia el crecimiento

    y aumenta la velocidad especfica de divisin.

  • 17

    III. FASE LOGARITMICA

    La fase de crecimiento logartmica o exponencial es el perodo durante el cual la velocidad especfica (o tasa) de crecimiento exponencial alcanza un mximo y permanece constante.

    La concentracin de las clulas aumenta exponencialmente. La composicin y fisiologa de las clulas permanecen invariables. Desde un punto de vista industrial es importante, ya que esta fase est

    asociada a la produccin de protenas celulares, enzimas que intervienen en la hidrlisis de macromolculas (proteasas, celulasas, amilasa, pectinasas, .....) y otros productos asociados al metabolismo primario

    IV. FASE DESACELERACIN

    Hay disminucin de la divisin celular por agotamiento del medio de cultivo. En efecto desaparecen una serie de compuestos necesarios para el crecimiento y eventualmente hay acumulacin de inhibidores resultantes del metabolismo microbiano (alcohol, antibiticos, ....)

    V. FASE ESTACIONARIA La concentracin de las clulas alcanza su nivel mximo El crecimiento celular se detiene pero conserva buena actividad metablica Se dan cambios fisiolgicos importantes y modificaciones en la estructura

    bioqumica de las clulas. El desequilibrio en la composicin del medio, conduce a la acumulacin de

    productos del metabolismo (metabolitos primarios). Tambin hay produccin de metabolitos secundarios (cidos orgnicos,

    antibiticos,....). Las condiciones de cultivo durante esta fase son propicias para la

    diferenciacin celular, es decir la formacin de clulas con estructuras particulares (espora, conidias, .....); esta diferenciacin puede tener gran inters en bio-industrias en la produccin de clulas resistentes (Bacillus, Clostridium, Streptomyces, hongos,....).

    VI. FASE DE MORTALIDAD Esta fase resulta de una autlisis de las clulas vegetativas por accin de

    las propias enzimas de la clula. Siempre existe una divisin celular por consumo de la materia orgnica

    liberada por las propias clulas, sin embargo la velocidad de crecimiento es inferior a la de mortalidad.

  • 18

    t

    Log NPS S

    N

    P

    REPRESENTACION ESQUEMATICA DE LA CURVA DE CRECIMIENTO (N), CONSUMO DE SUSTRATO (S) Y

    FORMACION DE PRODUCTO (P)

    Considerando un cultivo discontinuo (batch) en un reactor infinitamente mezclado, durante la fase de crecimiento exponencial se tiene:

    X = Cantidad de biomasa en g de materia seca /LN = Nmero de clulas / mL = Velocidad especfica de crecimiento (h-1)T = Tiempo (h)

    Con la ecuaciones anteriores se define la velocidad o tasa de crecimiento ()

    d X X Xd N N Nd T

    d T=

    =

    X X 1

    dTdX

    =

  • 19

    De la ecuaciones anteriores se deduce que:

    Integrando esta ecuacin entre el tiempo T0 y T, se tiene:

    La velocidad especfica de crecimiento se puede calcular grficamente a travs de la pendiente de la recta ( /2.303) o tambin usando las ecuaciones:

    La tasa de crecimiento, determinada en fase exponencial donde ningn elemento nutritivo es limitante, nos da la tasa de crecimiento mxima: =max.

    d X X

    d T=

    L n X - L n X 0 = ( T - T 0 )

    L o g X - L o g X 0 ( T - T 0 )

    2 .3 0 3

    X = X 0 e ( T - T 0 ) =

    2 . 3 0 3 ( L o g X - L o g X 0 ) T

    (L n X - L n X 0 ) T=

    =

    La tasa de crecimiento depende del tipo de microorganismo

    Depende adems de las condiciones de cultivo

    Naturaleza y concentracin de sustrato. Las condiciones aireacin (microorganismos aerobios).Temperatura y pH (en ciertos casos el potencial redox y la fuerza

    inica).

    Las condiciones de mezcla, cuando la transferencia de materia es un factor limitante.

    La presencia de inhibidores.El tiempo de generacin, que representa el tiempo necesario para que

    la poblacin microbiana se duplique (ejem. de X a 2X), est dado por:

    (Ln2X - Ln X)=g T = 0.693

    =

  • 20

    Microorganismo max (h-1) g (h)Bacilus subtilisPseudomonas putidaEscherichia coliNitrosomonas spCandida tropicalisSacaromices cerevisiaeAspergillus sp.

    1.701.002.300.070.700.350.53

    0.40.700.3010.01.002.001.30

    TASAS DE CRECIMIENTO Y TIEMPO DE TASAS DE CRECIMIENTO Y TIEMPO DE GENERACIGENERACIN DE ALGUNOS MICROORGANISMOSN DE ALGUNOS MICROORGANISMOS

    Por analoga a la ecuacin de MICHAELIS MENTEN, se estableci la ecuacin de MONOD en 1949.

    Suponiendo que todos los elementos nutritivos son adicionados almedio en exceso, salvo el sustrato (S) considerado factor limitante, se tiene:

    = max SKS + S = Tasa o velocidad especfica de crecimiento (h-1).max = Tasa de crecimiento mxima (h-1).S = Concentracin de sustrato limitante (g/L).Ks = Constante de saturacin (g/L). Concentracin de sustrato necesaria para obtener de la tasa de crecimiento mxima

    CINETICA MICROBIANA

  • 21

    S

    max

    max/2

    Ks depende del microorganismo y de la naturaleza del sustrato limitante

    Un valor alto de Ksindica poca afinidad por el sustrato

    Un valor bajo de Ksindica alta afinidad por el sustrato

    A una concentracin determinada de sus-trato: a medida que Ksaumenta, disminuye la tasa de crecimiento

    S

    max

    max/2

    Los valores de Ks son pequeos para los compuestos normalmente usados en medios de cultivo. Estos valores son del orden de 10-5-10-6 M en el caso de azcares (como glucosa) e inferiores a 10-6

    M para los aminocidos y vitaminas.

    VALORES DE Ks PARA DIFERENTES MICROORGANISMOSMicroorganismo Sustrato limitante Ks (M)

    Echerichia sp.

    Aspergillus sp.

    Candida sp.

    Sacharomices sp.

    Pseudomonas sp.

    Aspergillus sp.

    Glucosa

    glucosa

    glicerol

    glucosa

    metanol

    arginina

    2.2 . 10-5

    2.8 . 10-5

    4.9 . 10-5

    14.0 . 10-5

    2.0 . 10-5

    2.9 . 10-6

    De manera general los valores de Ks explican porque los microorganismos son capaces de

    purificar rpidamente los medios en un determinado compuesto. por ejemplo alcanzando

    concentraciones tan bajas, del orden de 10-5 M la velocidad de crecimiento (y por tanto la

    velocidad de consumo de este) disminuyen a la mitad con respecto a las condiciones de sustrato no

    limitantes (generalmente del orden de 0.05 m en sustrato). Las aplicaciones en el campo de la

    contaminacin se basan en esta propiedad de asimilacin de los microorganismos.

  • 22

    Combinando las ecuaciones de la velocidad de produccin declulas y la cintica de crecimiento

    d X Xd T

    =r X =

    Reemplazando por la ecuacin de MONOD:rX = m a x SK S + S X

    En el caso microorganismos aerobios, el oxigeno es unelemento esencial que es considerado como sustrato, por tanto

    se aplica la ley de Monod.

    = max [O2]K + [O2][O2 ][O2] = Concentracin de oxgeno disuelto en el medio.

    K[O2] = Constante de afinidad por el oxigeno.

    rX = Velocidad de produccin de clulas (g/Lh)

    CINETICA DE MONOD EN SISTEMAS PARTICULARES

    Inhibicin del crecimiento por el sustrato

    Inhibicin del crecimiento por productos del

    metabolismo

    Transferencia de masa limitante

  • 23

    La ecuacin de Monod considera que la tasa de crecimiento es mxima ( = max) cuando el sustrato S se aporta al medio de cultivo en exceso.

    Sin embargo si se aporta sustrato a altas concentraciones, principalmente azcares, molculas orgnicas (alcoholes, cidos....) y sales, puede disminuir o detenerse la divisin celular.

    S

    r x1 /K i C re c ie n te

    CASO DE INHIBICION DEL CRECIMIENTO POR EL SUSTRATO

    La siguiente ecuacin es una variante de la ecuacin de Monod que tiene en cuenta el efecto inhibidor de ciertos sustratos.

    = m ax SK S + S + S n +1K i

    n

    Ki = Constante de inhibicin del sustrato (g/L).n, en la mayora de casos es igual a 1.

    Ki es menor cuando el efecto inhibidor del sustrato es altoCuando se utilizan sustratos con un alto efecto inhibidor como

    etanol, cidos orgnicos ....., es necesario realizar procesos

    particulares como el cultivo fed batch..

    El efecto inhibidor es importante en procesos de desconta-minacin microbiolgica como en:

    Degradacin bacteriana de hidrocarburos que contaminan aguas y suelos.

    Destruccin de sustancias txicas presentes en zonas contaminadas.

    Tratamiento de aguas de granjas pisccolas, reduccin del contenido de amoniaco y nitrito

  • 24

    La divisin celular es acompaada de la sntesis de metabolitos

    que son excretados y acumulados en el medio de cultivo. Algunos

    de estos metabolitos que se acumulan en el medio pueden tener

    un efecto inhibidor y reducir la tasa de crecimiento, este es el caso

    del etanol, los cidos orgnicos, los antibiticos......

    La variante de la ecuacin de Monod en este caso es:

    INHIBICION DEL CRECIMIENTO POR PRODUCTOS DEL METABOLISMO

    = SK S + S

    = m a x f (P )D o n d e

    Segn el caso de inhibicin, la funcin f, puede ser:

    Lineal

    Exponencial

    Hiperblica

    = m a x (1 - K i P )

    = m ax e ( -Ki P)

    = m a x 11 +

    P K i

    = m a x K i + P

    K i

    P = Concentracin del producto responsable de la inhibicin (g/L)

    Ki = Constante de inhibicin asociada al producto

    El caso de las fermentaciones lcticas y

    alcohlicas, son dos casos tpicos de

    inhibicin por los productos formados

    (cido lctico y etanol). En estos casos

    se da un tipo de inhibicin hiperblica:

    = SK S + S m a x K i + P K i ( () )

  • 25

    La transferencia de materia puede constituir un factor limitante para el crecimiento y desarrollo de un microorganismo, principalmente cuando las condiciones de mezcla en el fermentador son poco eficaces (alta viscosidad, fermentadores grandes..)En condiciones de transferencia ineficiente la velocidad especfica de crecimiento () depende de:t, relacionado con la transferencia del sustrato hacia la clula.max, relacionado con el metabolismo del sustrato en la clula.

    TRANSFERENCIA DE MASA LIMITANTETRANSFERENCIA DE MASA LIMITANTE

    La ecuacin general de transferencia de masa est dada por:

    S = Flujo de sustrato por unidad de superficie (Kg/m2 s)S = Concentracin de sustrato en el medio (Kg/m3 )SC = Concentracin de sustrato alrededor de la clula (Kg/m3 )hS = Coeficiente de transferencia de masa entre el medio de cultivo y la superficie

    de la clula (m/s)

    +

    = 1 +

    1 =

    1

    tmax

    maxt

    tmax

    )S-(S h = csS

    La velocidad de consumo de sustrato (rs = -(dS/dT)), es funcin del flujo de transferencia de masa (S) y la superficie de transferencia entre las clulas y el medio (AC m2/m3 ):

    CSS Ar = (Kg/m3 s)

    Reemplazando S en la ecuacin anterior, se tiene la ecuacin global de transferencia de sustrato entre el medio y la clula:

    )SS(hAr CSCS =

    La superficie celular por unidad de volumen de clulas se determina de la

    siguiente manera:- Para los microorganismos esfricos (cocos y levadura....): 6/dc- Para los microorganismos bastonados (Bacillus y Clostridium....): 1/0.22dc- Para los microorganismos miceliares (hongos y Streptomyces....): 1/0.25dc

    Donde dC es el dimetro medio de las clulas

    En el primer caso AC est dado por: CCC

    Xd

    6A =Donde:

    Ac= Superficie celular por unidad de volumen de cultivo (m2/m3)X = Concentracin de clulas en el medio (Kg/m3)c= Densidad de las clulas (Kg/m3)

  • 26

    Reemplazando Ac en la ecuacin de transferencia de masa se obtiene el consumo de sustrato:

    )SS(Xd

    h6Ar C

    CC

    SCSS ==

    = rX

    YS X / Sr X =

    rr = Y

    SS

    Xx/s

    )S-(S Y d

    h 6 = C /SXCC

    ST

    La tasa de crecimiento puede representarse tambin por:

    Donde YX/S, es el coeficiente de transformacin de sustrato (S) en

    biomasa (X) (Kg de clulas formadas/Kg de sustrato consumido).

    Reemplazando rs en la ecuacin anterior se tiene el componente

    t:

    )S-(S ]Y d

    h 6[ +

    )S-(S ]Y d h 6[

    = C /SX

    CC

    Smax

    C /SXCC

    Smax

    Reemplazando t en la ecuacinglobal de la tasa de crecimientose tiene:

    +

    = 1 +

    1 =

    1

    tmax

    maxt

    tmax

    Si se supone que Sc

  • 27

    La temperatura ejerce una influencia determinante sobre el metabolismo celular.

    El crecimiento microbiano , al igual que las reacciones enzimticas, se bloquea a baja temperatura y se acelera por el aumento de este parmetro, a temperaturas altas se perturba dicho crecimiento por la alteracin de ciertos componentes (enzimas, cidos nucleicos) o estructuras celulares (membrana citoplsmica).

    La tasa de crecimiento es optima en un rango estrecho de temperatura, segn esta se distingue tres categoras de microorganismos:

    Sicrfilos: Tiene una temperatura optima de crecimiento prxima a los 5 C. No crecen a temperaturas mayores a los 25 C.

    Mesfilos: Temperatura optima de crecimiento prxima a los 30 C. No crece a temperaturas < a 15 C y > a 45 C.

    Termfilos: Se desarrollan favorablemente a temperatura prximas a los 55 C no crecen a temperaturas < a 37 C y >65 C.

    INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA DEL MEDIO SOBRE EL INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA DEL MEDIO SOBRE EL CRECIMIENTOCRECIMIENTO

    EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO DE DIVERSOS MICROORGANISMOSDE DIVERSOS MICROORGANISMOS

    TEMPERATURA (C)MICROORGANISMO

    Mnima Optima Mxima

    Bacillus subtilis

    Escherichia coli

    Lactobacillus casei

    L. termfilus

    Nitrobacter sp.

    Pseudomonas aeruginosa

    Streptococus pirogenes

    Streptomices termofilus

    Candida parapsilosis

    Sacaromices cerevisiae

    Aspergillus niger

    Btritis cinera

    Rizopus sp.

    15

    10

    10

    30

    -

    0

    15

    20

    0

    0-5

    -

    0

    7

    30-37

    30-37

    28-30

    50-63

    25-28

    37

    37

    40-45

    20-25

    28-36

    37

    20-25

    25-30

    55

    45

    40

    65

    -

    42

    40

    50

    30

    40-42

  • 28

    max = A exp H1* ER ( )

    LA ECUACILA ECUACIN DE ARRHENIUSN DE ARRHENIUSEl crecimiento microbiano es debido a un conjunto de reacciones enzimticas, donde una de ellas limita al complejo. Esta reaccin limitante determina la tasa de crecimiento mxima. La dependencia de la tasa de crecimiento de la temperatura se establece por analoga a la cintica enzimtica a travs de la relacin de ARRHENIUS:

    E = Fraccin msica de la enzima especfica referida a la biomasa H1* = Entalpa de activacin de la reaccin limitante (Kj / mol)A = Constante (h-1)R = Constante universal de los gases ( 0.00831 Kj K / mol)T = Temperatura absoluta (K)

    Esta expresin es valida en una rango estrecho de temperatura, prximo a la temperatura optima de crecimiento.

    Diferentes modelos se han propuesto para evaluar la influencia dDiferentes modelos se han propuesto para evaluar la influencia de e la temperatura sobre el crecimiento de las cla temperatura sobre el crecimiento de las clulas. A continuacilulas. A continuacin n

    dos de ellosdos de ellos

    K exp H 2R ( )I = A

    A = 1 + K e x p

    H 2 R ( )

    1

    m a x = A ex p H 1* E R ( ) A

    m a x = A e x p H 1 * E

    R ( )1 + K e x p

    H 2 R ( )

    La ecuacin de Arrhnius se puede modificar, de manera que se pueda aplicar a un rango muy grande de temperatura. Para esto se supone que la enzima que limita el crecimiento puede existir sobre dos configuraciones distintas: una forma activa y otra inactiva. El equilibrio de estas dos formas depende de la temperatura y puede ser formulado como sigue:

    I = Fraccin de la enzima inactivaA = Fraccin de la enzima activaK = ConstanteH2 = Entalpa de inactivacin (Kj / mol)

    Por definicin: A + I = 1, considerando esto enla ecuacin anterior queda:

    Considerando la fraccin de enzima activa enla ecuacin de Arrhnius, se tiene:

    Reemplazando A en la ecuacin precedente setiene la expresin general de tasa de crecimientomxima:

    GENERALIZACION DE LA ECUACION DE ARRHENIUS

  • 29

    Esta ltima relacin se representa en la siguiente figura:

    EFECTO DE LA TEMPERATURA DE INCUBACION SOBRE LA TASA DE CRECIMIENTO MAXIMA DE UN MICROORGANISMO MESOFILO

    10 20 30 40 50

    maxCurva de activacin

    Curva de inactivacin

    T (C)

    T1

    R*H)AE(LnLn 1max

    =

    A =1 + K exp H2

    R ( )1

    max = A exp H1 * E

    R ( )1 + K exp H2

    R ( )

    =

    1*H

    H.KLn.R

    H)optima(T

    1

    2

    2

    Linearizando la ecuacin de Arrhenius,se tiene:Donde -H1*/ R representa la pendiente de la recta semilogartmica.

    Los valores de H1 * encontrados en la literatura estn comprendidos entre 45 y 130 Kj/mol.

    Los valores de H2 se puedencalcular a partir de la ecuacin:

    Los valores de H2 reportados en laliteratura, se encuentran entre 188 y388 Kj/mol

    Encontrados los valores de cambioen las entalpas se puede encontrarla temperatura optima de crecimientode la siguiente manera:

    (dmax/dT) = 0, se obtiene

  • 30

    La tasa de crecimiento de un microorganismo dado, en ciertas condiciones toma un valor mximo para un pH o una zona de pH optima.

    Las bacterias son generalmente neutrfilas, es decir crecen mejor a pH prximo a 7. Algunas de ellas que tienen metabolismo acidgeno (produccin

    de cidos orgnicos por vas metablicas: cido lctico, actico,...) crecen

    bien a pH 3. Algunas de ellas que oxidan los compuestos azufrados en

    sulfatos (thiobacillus) bajan el pH a 1.

    Las levaduras y hongos se desarrollan bien en una amplia zona de pH comprendida entre 3 y 8

    La constante Ks no es afectada significativamente por el pH ni la temperatura.

    INFLUENCIA DEL pH DEL MEDIO DE CULTIVO SOBRE EL CRECIMIENTO INFLUENCIA DEL pH DEL MEDIO DE CULTIVO SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANOMICROBIANO

    EVOLUCION DE LA TASA DE CRECIMIENTO EN FUNCION DEL pH PARA LA MAYORA DE BACTERIAS

    4 7 1 0 p H

    m a x

    En la literatura se reportan diversas ecuaciones que relacionan la tasa de crecimiento con el pH. La ms utilizada es la ecuacin polinomial siguiente:

    max = a (pH)2 + b (pH) + c.

    En la figura se representa dicha ecuacin

    Donde a, b y c son constantes

    Las constantes a, b y c se encuentran con medidas experimentales. El pH optimo se encuentra igualando la primera derivada de la ecuacin

    anterior a 0:

    d(max/pH) = 0 pH (optimo) = -b / 2a

  • 31

    dTdPr P =

    En muchos procesos de fermentacin nos interesa la produccin de un metabolito determinado.

    El seguimiento de estos procesos se hace a travs de la evolucin de la concentracin del producto formado.

    En paralelo a la determinacin de la curva de crecimiento celular se traza la curva del producto formado (P, en g/L).

    La velocidad de produccin se determina, en cualquier momento a partir dicha curva:

    rp = Velocidad de produccin (g/L de medio . h)P = Producto formado (g/L)T = Tiempo (h)

    CINETICA DE PRODUCCION DE METABOLITOS

    dTdP

    X1

    Xr

    ..........XdTdPr pP ====

    TtotalP=DADPRODUCTIVI f

    De la misma manera que la velocidad especfica de crecimiento (), se define la velocidad especfica de produccin del metabolito como:

    = Velocidad especfica de produccin del metabolito (g/g de biomasa . h)

    En industria de fermentacin se utiliza la nocin de productividad orendimiento horario, que se define como la relacin entre la cantidad de producto obtenido y la duracin total del ciclo de produccin.

    Donde:Pf = Concentracin de producto final (g/L de medio)Ttotal = Duracin total del proceso (h).

    En un proceso batch la duracin total (Ttotal) se determina como:Ttotal = TN + TR + TS +TC +TV

    TN = tiempo de lavado del fermentadorTR = tiempo de llenado de fermentadorTS = tiempo de esterilizacinTC = tiempo de cultivoTV = tiempo de vaciado del fermentador

  • 32

    La productividad permite evaluar el proceso de fermentacin: sirve para estudiar la rentabilidad y dimensionamiento de la instalacin.

    La tendencia de la curva de produccin de metabolitos depende de la curva de crecimiento. La relacin existente entre las dos curvas vara de un metabolito a otro segn:

    Su naturaleza Su lugar en la actividad bioqumica celular Los mecanismos de las reacciones metablicas que lo

    originan.

    La clasificacin de Gaden de 1955 distingue tres tipos de metabolitos

    Metabolitos de primer tipoMetabolitos de segundo tipometabolitos de tercer tipo

    t

    Log XX

    P

    PS S

    t

    Log XX

    P

    PS S

    t

    Log XX

    P

    PS S

    Metabolitos de primer tipo: la sntesis est ligada directamente al crecimiento de las clulas y por lo tanto al metabolismo del sustrato principal (S).

    Metabolitos de segundo tipo: tambin estn ligados al crecimiento celular, pero son diferentes en el tiempo con respecto a la degradacin del sustrato.

    Metabolitos de tercer tipo: No estn ligados al crecimiento ni al catabolismo del sustrato principal.

  • 33

    dTdXY

    dTdP

    dTdX

    dTdP

    S/P==

    Los productos del primer y segundo tipo provienen del metabolismo primario, estn constituidos por compuestos esenciales al metabolismo de sntesis de

    los constituyentes de la clula:Ejemplos: Primer tipo produccin de etanol (Fermentacin alcohlica)

    Segundo tipo produccin de cido lctico (fermentacin lctica)

    Primer o segundo tipo, excrecin de enzimas

    Primer tipo produccin de aminocidos

    Los productos del tercer tipo provienen del metabolismo secundario y no son esenciales para el crecimiento celular.

    El estudio de la cintica de produccin de metabolitos consiste en establecer las relaciones matemticas (modelos) que caracterizan la curva de produccin.

    La velocidad produccin de metabolitos de primer tipo ligada al crecimiento microbiano:

    YP/x = Cantidad de metabolito producido por unidad de biomasa

    (g de producto / g de clulas).

    X+dTdX

    dTdP =

    P-X+dTdX

    dTdP n=

    La velocidad de produccin de metabolitosde segundo tipo, parcialmente ligado

    al crecimiento , se representa por:

    Cuando hay inhibicin como conse-cuencia del aumento de metabolitosen el medio se utiliza:

    , y son parmetros que dependen de las condiciones de cultivo es decir:Son parmetros que dependen de las condiciones de cultivo:

    = 1 (pH, T, [O2 ],......) = 2 (pH, T, [O2 ],......) = 3 (pH, T, [O2 ],......)

    En lo que concierne a los metabolitos del tercer tipo (metabolitos secundarios), las ecuaciones muy complejas y establecidas empricamente.

  • 34

    El aumento de la poblacin microbiana resulta de la reproduccin de las clulas.

    Los organismos unicelulares como las bacterias y levaduras se reproducen por fisin celular (reproduccin asexual).

    Las dos clulas bacterianas resultantes de la fisin son idnticas. sin embargo algunas levaduras pueden dar lugar a dos clulas diferentes (clula madre y clula hija), lo que conduce a una poblacin heterognea.

    Los hongos, bacterias y levaduras filamentosas, crecen alargamiento y ramificacin. de acuerdo a las condiciones del medio se puede formar micelio difuso o pellet.

    El comportamiento de la poblacin microbiana debe considerarse para seleccionar una tcnica de medicin de la biomasa.

    TECNICAS PARA DETERMINAR POBLACION TECNICAS PARA DETERMINAR POBLACION MICROBIANAMICROBIANA

    Existen diversas tcnicas para determinar biomasa, sin embargo ninguna de ellas es aplicable a todos los casos y los resultados que se obtienen no son totalmente satisfactorios ya que probablemente estn sujetos a errores

    y posibles interferencias.

    Los mtodos se clasifican en dos categoras:

    DIRECTOS: Determinan la concentracin de clulas presentes en el medio, se aplican en el caso de levaduras y bacterias no filamentosas.

    INDIRECTOS: Utilizan indicadores bioqumicos relacionados con el aumento de la biomasa (constituyentes celulares) o propiedades asociadas al crecimiento (consumo de oxigeno, aumento de la viscosidad.....).

    Se emplean cuando los mtodos directos no son aplicables (microorg. filamentosos) o cuando se desea simplificar la determinacin con el objetivo de una automatizacin. Es necesario establecer una correlacin adecuada entre la biomasa y el parmetro considerado.

  • 35

    Las clulas se cuentan en un microscopio con la ayuda de una clula de numeracin. Existen diferentes tipos de clulas de numeracin:

    La eleccin de un tipo de clula de numeracin depender del tamao de microorganismo. Entre los tamaos promedio de los diferentes microorganismos se tiene:

    Algas unicelulares....................> 20 m.Levaduras................................. 8 10 mBacterias....................................1 4 m

    RECUENTO EN MICROSCOPIORECUENTO EN MICROSCOPIO

    Ventajas y desventajas del recuento en Ventajas y desventajas del recuento en microscmicroscpiopioVentajas Desventajas

    Mtodo simple y rpido Resultados inmediatos

    Difcil de utilizar en caso de clulas pequeas(

  • 36

    La suspensin celular se inocula sobre placas Petri que contienen un medio cuya composicin tiene agar y otros elementos que favorecen

    el desarrollo de los microorganismos.

    Se incuba a la temperatura optima de crecimiento del microorganismo y se cuentan las colonias despus de 24 48 horas.

    RECUENTO EN AGARRECUENTO EN AGAR

    VENTAJAS DESVENTAJAS

    Solo se enumera las clulasvivas

    No hay problema por slidossolubles en el medio

    Puede ser utilizada para toda lagama de concentraciones

    celulares (a condicin de utilizar

    diluciones adecuadas)

    Requiere de tiempo prolongado ygran cantidad de material (placas con

    agar, tubos de dilucin,...)

    Resultados por defecto cuandoexisten clulas asociadas

    Riesgo de imprecisin por lapreparacin de numerosas diluciones

    No utilizable para microorganismosfilamentosos

    La biomasa se recupera por centrifugacin o filtracin, se lava con agua destilada para eliminar los slidos retenidos entre las clulas y se seca a 105 C hasta peso constante.

    DETERMINACION DE LA MATERIA SECADETERMINACION DE LA MATERIA SECA

    VENTAJAS DESVENTAJAS

    Mtodo riguroso

    Tcnica simple y fcil de utilizar

    Utilizable para microorganismosfilamentosos

    No permite distinguir clulas vivas declulas muertas

    Poco reproducible a bajasconcentraciones celulares

    No utilizable en para medios conmaterial insoluble

    No permite un resultado inmediato(secado +- 24h)

    Resultados por defecto debido aperdidas durante la separacin y

    secado

  • 37

    Se basa en la dispersin de un rayo luminosos debido a las partculas en suspensin.

    En este caso se establece una relacin entre la DO y la materia seca (g/l).

    En la zona lineal se puede escribir la siguiente ecuacin:

    DO= densidad ptica = coeficiente de turbidez(l/g cm)l = ancho de la clula de medicin (cm)X = concentracin de biomasa (g/l)

    El coeficiente de turbidez depende de: La longitud de onda elegida (generalmente

    se trabaja entre 500 y 700 nm). De la forma y la talla (estado fisiolgico)

    del microorganismo.

    TURBIDIMETRIA (DETERMINACION OPTICA)TURBIDIMETRIA (DETERMINACION OPTICA)

    DO= l X

    DO

    X(g/L)

    CORRELALINEAL.

    PARA UNA LOGINTUDDE ONDA DETERMINADA

    VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA TURBIDIMETRIATURBIDIMETRIA

    Ventajas Desventajas

    Tcnica simple y fcilde utilizar

    Mtodo rpido y deresultados inmediatos

    Posible uso enautomatizacin

    Mtodo no destructivo

    No permite diferenciar clulas muertas declulas vivas

    Las medidas son sensibles a los cambiosfisiolgicos del las clulas

    Es necesario establecer una curva decalibracin de materia seca

    No utilizable en medios que contienenmaterial insoluble o emulsiones

    Es necesario suspensiones homogneas No utilizable para microorganismos

    filamentosos

  • 38

    Dentro y fuera de un tubo, que contiene un orificio calibrado, se encuentran dos electrodos de platino inmersos en un electrolito.

    Se aplica una tensin continua en los bornes de los electrodos. Las clulas pasan a travs del orificio, gracias a una aspiracin, y desplazan

    un volumen de electrolito igual a su propio volumen.

    RECUENTO ELECTRONICORECUENTO ELECTRONICO

    Esto genera un impulso elctrico cuya amplitud es proporcional al volumen de la clula.

    Permite numerar hasta 5000 clulas /s, adems permite diferenciarlas segn su volumen. los resultados se presentan en una curva de distribucin de tamaos

    Es importante para las levaduras ya que adems de numerarlas permite dimensionarlas

    Electrodos

    Clulas

    Dispositivode medida

    Electroltos

    Vaco

    VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL RECUENTO VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL RECUENTO ELECTRONICOELECTRONICO

    Ventajas Desventajas

    Mtodo rpido Resultados instant-

    neos

    Tcnica sofisticada No permite diferenciar clulas vivas de

    clulas muertas

    Resultados por defecto cuando hay clulasasociadas

    No aplicable en medios con partculasinsolubles

    Riesgos de obstruccin del orificiocalibrado

  • 39

    VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS METODOS VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS METODOS INDIRECTOS INDIRECTOS

    Mtodo Ventajas Desventajas

    Determinacin de

    protenas Se utiliza para todos los microorganismos Tcnica simple y rpida

    No permite diferenciar clulasvivas de clulas muertas

    Interferencia con las protenas delmedio

    Determinacin de

    ADN Se utiliza para todos los microorganismos Est ausente en el medio de cultivo

    Tcnica difcil y costosa No permite diferenciar clulas

    vivas de clulas muertas

    ATP- Se utiliza para todos los microorganismos Ningn riesgo de interferencia con el medio de

    cultivo

    Mtodo rpido y simple Se distingue clulas muertas de clulas viva

    Tcnica costosa Resultados influenciados por el

    estado fisiolgico de las clulas*

    NADH por fluorimetra Se utiliza para todos los microorganismos

    Ningn riesgo de interferencia con el medio

    de cultivo

    Mtodo rpido y simple

    Se puede utilizar para medidas en lnea

    Se distingue clulas muertas de clulas viva

    Tcnica sofisticada

    Resultados influenciados por el estado

    fisiolgico de las clulas*

    Determinacin de una

    actividad enzimtica

    Se utiliza para todos los microorganismos

    Ningn riesgo de interferencia con el medio

    de cultivo

    Mtodo rpido y simple

    Mtodo aproximado y poco

    reproducible

    Algunas interferencias debido a las

    clulas muertas

    Resultados influenciados por el estado

    fisiolgico*

    Consumo de sustrato y

    variacin Parmetros

    del cultivo

    Utilizable para determinaciones en lnea. Mtodo de estimaciones groseras

  • 40

    Se puede distinguir , sobre la base de la tcnica de

    alimentacin de sustrato, diferentes principios de cultivo en

    fermentador.

    Cultivo "Batch" (Sistema cerrado): Es la tcnica ms simple

    donde la totalidad de elementos nutritivos estn presentes en

    el medio de cultivos antes de la inoculacin. Ningn elemento

    MODELIZACION DE CULTIVOS EN MODELIZACION DE CULTIVOS EN FERMENTADOR FERMENTADOR FERMENTADORFERMENTADOR

    esencial es adicionado durante el cultivo.

    Las clulas se desarrollan hasta agotar

    completamente los sustratos del medio o

    sufrir inhibicin por los productos de

    reaccin.

    El ciclo de produccin en el cultivo discontinuo o "batch" consta de las siguientes etapas:

    Llenado del fermentador con el medio de cultivo completo Esterilizacin del fermentador y del medio Inoculacin del fermentador Perodo de cultivo con agotamiento del medio Recoleccin de la biomasa y/o del medio conteniendo uno o ms metabolitos Lavado del fermentador

    Cultivo "Feed batch" (Sistema semi-abierto) : Se procede a un aporte progresivo de sustrato al medio de cultivo, con el objetivo de mantener constante la concentracin de un sustrato esencial (ejemplo : fuente de carbono) o fragmentar el aporte de este de manera que se evite riesgos de inhibicin.

    Cultivo contnuo (Sistema abierto) : Se aade solucin nutritiva estril continuamente al bioreactor y se retira una cantidad estril equivalente de solucin utilizada de los nutrientes con microorganismos. Se mantiene constante el volumen en el reactor.

  • 41

    SKS

    Smax +=

    XSK

    Sr ......SK

    S........XdTdX

    dTdXr

    dTVr=VdX dTdXr

    SmaxX

    SmaxX

    XX

    +=+===

    =

    V, S, X

    Hiptesis:El fermentador es infinitamente mezclado (homogneo)No hay mortalidad celular.No hay formacin de producto.El nico sustrato limitante es la fuente de carbono.Se aporta oxgeno en exceso.

    En estas condiciones se aplica la ecuacin de Monod:

    V = Volumen de cultivo (m3)S = Concentracin de sustrato limitante (g/L), con una variacin de S0 a SfX = Concentracin de biomasa (g/L), con una variacin de X0 a Xf.

    X y S son medidos durante el cultivo; mientras max y Ksson parmetros caractersticos de las cepas. Estos sonconstantes si las condiciones no se alteran durante la fermentacin.

    MODELO DE CULTIVO EN MODELO DE CULTIVO EN BATCHBATCH

    S

    XS/XS

    S/X

    XS r

    rY ..Siendo,..........XmY

    rdTdSr =+==

    El consumo de sustrato se expresa de la siguientes manera:

    rS = Velocidad de consumo de sustrato (g/L h)

    rX = Velocidad de produccin de biomasa (g/L h)

    YX/S = Coeficiente o rendimiento de conversin de sustrato

    en biomasa (g de biomasa/ g de sustrato).

    mS = Constante de mantenimiento (g de sustrato/g clulas.h)

    mS =Representa la velocidad de consumo de sustrato que proporciona la energa indispensable para mantener una actividad metablica mnima de las clulas cuya divisin se ha detenido.

    mSx =Representa el consumo total de sustrato para mantener la biomasa (g de sustrato/L.)

  • 42

    Es un cultivo discontinuo que es alimentado en elementos nutritivos durante la fermentacin (sistema semi-abierto).

    Estos elementos nutritivos pueden ser la fuente de carbono, ciertos precursores o el medio completo, ..... .

    La alimentacin puede ser intermitente o continua y de flujo constante o variable.

    El cultivo fed batch se utiliza en la produccin de biomasa, aminocidos, cidos orgnicos, alcoholes y algunas enzimas

    Es importante en el caso de sustratosinhibidores, cuando hay represincatablica o efecto glucosa

    MODELO DE CULTIVO MODELO DE CULTIVO FED BATCHFED BATCH

    V PS X

    Q, Sa

    VoVF

    V=Volumen de cultivo en el fermentador (L)

    Q= Flujo o caudal de alimentacin (L/h)

    Sa=Concentracin de sustrato limi-tante en la alimentacin (g/L).

    EMPLEO DE LA FERMENTACION EMPLEO DE LA FERMENTACION FED BATCHFED BATCH EN LA EN LA PRODUCCION DE METABOLITOSPRODUCCION DE METABOLITOS

    Se utiliza en el caso de metaboltos no asociados al crecimiento de las clulas (segundo y tercer tipo)

    Las condiciones de sntesis del producto no son compatibles con el crecimiento de las clulas

    Sin embargo se requiere alta concertacin de biomasa para lograr la sntesis de gran cantidad de producto

    Una solucin frecuentementeutilizada consiste en realizar

    la fermentacin en dos perodos:

    primero un perodo de crecimiento

    seguido de un periodo de produccin

    del metabolto

    PERIODO DE CRECIMIENTO PERIODO DE PRODUCCION

    X

    PV

    T(h)

    X, P

    , V

    Batch Fed-batch

    XP

  • 43

    XmY

    r =r rdTdS

    X+SK

    S= r rdTdX

    SS/X

    XSS

    S

    maxXX

    +=

    =

    HIPOTESIS:

    No hay mortalidad celular. Se aporta oxgeno en exceso La fuente de carbono es el sustrato limitante Los otros nutrientes se aportan en cantidades suficientes

    La mayor parte de las ecuaciones utilizadas para los cultivos batch, se aplican al periodo fed-batch.

    Periodo de crecimiento (batch): V= cteSe utiliza las siguientes ecuaciones

    Periodo de produccin del metabolto (fed batch)

    0dTdV ConstanteV >

    La poblacin total de clulas en el fermentador permanece constante:V X = Constante (g)

    El incremento en clulas es nulo:

    La variacin de la concentracin de biomasa depende de la dilucin por adicin de sustrato:

    Balances de masa en el proceso:S 0 : Durante el cultivo fed-batch el sustrato es completamente consumido a

    medida que se va adicionando.V0 (V = V0 ) : Volumen del medio de cultivo al inicio de la produccinVF (V < VF ) :Volumen al final de la produccin XP: Concentracin de las clulas al inicio del periodo de produccin

    o)crecimient hay (no 0=r con .... 0dT

    )VX(dX=

    VX

    dTdV

    dTdX =

    BALANCE DE BIOMASA:

  • 44

    )VS

    dTdV(

    )VSaQ(

    VSaQ

    VS

    dTdVr

    dTdS

    S +=

    La variacin de la concentracin de sustrato en el fermentador depende de:La velocidad de consumo de sustrato por la clula (rS)La dilucin del medio por la adicin de sustrato:El aporte de sustrato al fermentador: Con estas consideraciones la variacin en la concentracin de sustrato est

    dada por:

    Considerando que la concentracin en sustrato permanece constante y prxima a 0 (S 0), la ecuacin anterior se reduce a :

    BALANCE DE SUSTRATOBALANCE DE SUSTRATO

    )VP

    dTdV(

    Xr con VP

    dTdVr

    dTdP

    PP ==

    La variacin en la concentracin del metabolito depende de:La velocidad de produccin est dada por rpLa dilucin del producto por la adicin de sustrato, est dada por

    BALANCE DE PRODUCTOBALANCE DE PRODUCTO

    Constante)=(Q QdTdV =Adems ,

    VSaQ

    VS

    dTdVr

    dTdS

    S +=

    CONSIDERANDO LA MORTALIDAD CELULAR:

    Kd: Es la tasa de mortalidad celular (h-1)

    La mortalidad celular tiene un efecto sobre la amplitud de la fase de produccin, pero no afecta la concentracin final de producto. Por tanto slo la productividad global del proceso es afectada.

    En resumen:Las ecuaciones del periodo de

    produccin de metabolitos de uncultivo fed batch son:

    En el periodo de crecimiento(correspondiente al cultivo batch),se tiene:

    En el periodo de produccin se tiene:YP/S: Rendimiento de conversin de sustrato en producto (g de

    producto/g de sustrato)

    VXQXKr

    dTdX

    dX ==

    ( )XrPVPQr

    dtdP

    0dtdS

    VSaQr

    0dtdX0r

    P

    S

    X

    ==

    ==

    ==

    XmY

    rr SS/P

    PS +=

    XmY

    rr SS/X

    XS +=

  • 45

    EMPLEO DE LA FERMENTACIN FED BATCH EN LA PRODUCCION DE BIOMASA

    Las hiptesis son similares a las mencionadas para la produccin de metabolitos:

    Presenta tambin dos perodos: Perodo de cultivo batch que corresponde a la constitucin celular (pie de cuva) Perodo de cultivo fed-batch donde se procede al aporte progresivo de sustrato.

    Las ecuaciones para el periodo batch se vieron anteriormente y para el periodo fed batch son las siguientes:

    PARA LA BIOMASA

    La variacin de la concentracin de clulas depende de lo siguiente:

    Velocidad de divisin celular (rX)

    La dilucin de las clulas en el medio

    PARA EL SUSTRTATO

    PARA EL VOLUMEN

    VX

    dTdV

    XVQX

    VX

    dTdVr

    dTdX

    X ==

    VSa

    dTdV

    VS

    dTdVr

    dTdS

    S += [ ] SS rSSaVQ

    VSaQ

    VSQr

    dTdS =+=

    QdTdV = Variacin del volumen de V0 a VfCaudal variable de Qmin a Qmax

    Caso de un sustrato inhibidorLa alimentacin (Q) se efecta de tal manera que se mantenga la concentracin en sustrato (S) por debajo de un valor crtico. La instalacin consta de un sistema de medicin en lnea de dicho sustrato. El equipo ajusta continuamente el flujo de alimentacin (Q) de manera que la concentracin (S) se mantenga por debajo del valor crtico. [ ]

    SKSyX

    VQX

    dtdX

    biomasalaPara

    XmY

    rr

    rSSaVQ.........0

    dTdS.......constante. =S

    Smax

    SS/X

    XS

    S

    +==

    +=

    ==

    INICIO DE LAALIMENTACION

    S=CONSTANTE

    PIE

    DE

    CU

    VA

    S

    T0 T0

    INICIO DE LAALIMENTACION

    X

    T0 T0

    PIE

    DE

    CU

    VA

  • 46

    Caso de una levadura (ejm. Sacharomices cerevisiae) sensible al efecto glucosa:En este caso el fermentador es alimentado por una solucin concentrada de glucosa (Sa) en funcin de un parmetro que caracteriza el estado fisiolgico de la levadura. El parmetro elegido es el cociente respiratorio (QR), que se define como la cantidad de CO2 producido por la levadura y la cantidad de oxgeno consumido. QR debe estar prximo a 1 para un buen funcionamiento del fermentador

    Si QR > 1... El regulador disminuye la alimentacin de glucosa

    Si QR = 1... El regulador mantiene constante la alimentacin de glucosa

    Si QR < 1... El regulador aumenta la alimentacin de glucosa

    VENTAJAS DEL CULTIVO VENTAJAS DEL CULTIVO FEDFED--BATCHBATCH

    Permite la utilizacin de sustratos que a cierta concentracin inhiben el crecimiento celular. Ejemplo hidrocarburos, etanol, ....

    Aumenta la concentracin de biomasa y la productividad, respecto a la produccin batch.

    Favorece un metabolismo en detrimento de otro (fermentacin o respiracin).

    La produccin de metaboltos asociados a la fase estacionaria gracias a la modulacin del aporte de un sustrato (antibiticos, hormonas, enzimas).

    Un cultivo fed-batch presenta menos riesgos de contaminacin y mutacin que el cultivo continuo.

    Un cultivo fed-batch necesita de un sistema de regulacin y de control ms costoso que en modo batch y adems es ms difcil de poner a punto.

  • 47

    PRODUCTO TIPO DE ADICION

    LevaduraGlicerolAcetona y butanolRiboflavinaPenicilinaProteasasNovobiocinaAcido glutmicoGriseofulvinaRifamicinaGiberelinaVitamina B12TetraciclinaAcido ctricoLisinaProtena unicelularEstreptomicina

    Melaza, fuente de N, P y MgAzcar, carbonato de NaMostoCarbohidratosGlucosa y amonioGlucosa e hidrolizado de caseinaVarias fuentes de C y NAmonioCarbohidratosGlucosa, cidos grasosGlucosaGlucosaGlucosaCarbohidrato y amonioEtanol y urea; etanol y amonioMetanolGlucosa y amonio

    PROCESOS EN LOS QUE SE HA UTILIZADO LA PROCESOS EN LOS QUE SE HA UTILIZADO LA FERMENTACION FERMENTACION FEDFED--BATCHBATCH

    Se trata de un sistema abierto donde se aade continuamente solucin de nutrientes y se retira una cantidad equivalente de suspensin celular (medio utilizado + clulas). De esta manera el volumen de medio en el fermentador permanece constante.

    Se caracteriza por establecer un estado estacionario (estable) permaneciendo todas las condiciones constantes (medio en que se encuentran las clulas, poblacin celular y estado fisiolgico).

    CULTIVO CONTINUOCULTIVO CONTINUO

    V: Volumen de cultivo en el fermentador (L)Q: Caudal de alimentacin (L/h)Sa: Concentracin en sustrato limitante (g/L).

    Generalmente (dV/dt)=0Qa = Qs = Q

    V

    P

    S

    X

    Qa, Sa

    V

    Qs, X,S, P

  • 48

    Ejemplo:Ejemplo: si D = 0.5 h-1, significa que el caudal de alimentacin es tal que en una hora se renueva la mitad del volumen del fermentador. En este caso el tiempo de permanencia es de 2 horas.

    La concentracin de biomasa (X), de sustrato (S) y de producto (P) dependen del caudal de alimentacin (Q) y por tanto de la tasa de dilucin (D):

    BALANCE DE BIOMASACambio neto en la biomasa = Crecimiento - salida

    X)D(DXXDXrdTdX

    X ===

    La tasa de dilucin est dada por:

    El tiempo de permanencia del medio en el fermentador est dado por:

    (h) D1

    QV ==

    )(h VQ D 1-=

    Una fermentacin continua se inicia con un cultivo en batch, el que continua hasta que las clulas alcancen una concentracin o estado fisiolgico dado. Luego se empieza la fermentacin continua propiamente dicha.

    El cultivo continuo se diferencia del cultivo batch o fed-batch por una alimentacin continua de sustrato y retiro de una cantidad equivalente de suspencin celular, manteniendo constante el volumen en el fermentador

    BALANCE DE SUSTRATO

    Cambio neto en la concentracin de sustrato = Entra - Sale - Consumo

    BALANCE DE PRODUCTO

    SS rD)SSa(rDSDSadTdS ==

    DPrdTdP

    P =

  • 49

    DDcDmax

    DX

    S

    X

    g

    Sa

    00

    En un cultivo continuo la evolucin de la biomasa, sustrato y

    producto depende de la tasa de

    dilucin D.Dmax: Tasa de dilucin correspondiente a la productividad mxima.Dc: Tasa de dilucin crtica. Dc=max

    S

    XX 0

    S S a

    B AT CH CO N T IN U A D > D C

    SX

    T

    Siempre D < Dc.

    En efecto si D >Dc o D > D max

    La concentracin de cae hasta desaparecer y ser

    reemplazada por medio fresco. Entonces se

    dice que se ha lavado completamente el

    cultivo.

    ( ) 0dTdX........XD

    dTdX...max.......>D >>=

    So)D(SartantoloPor

    SaSoconrSo)D(SadTdS

    S

    S

    >>=

    (dX/dt) >>> 0, que significa que la biomasa

    aumenta rpidamente

    (dS/dt)

  • 50

    LnX

    T

    Xeq

    Seq

    Batch Quimiostato

    Inicio de laalimentacin

    < max

    En el caso del quimiostato la tasa de crecimiento alcanzada en el equilibrio eq < max, es el resultado de una concentracin limitante en sustrato Seq. Es entonces la concentracin en sustrato limitante en el equilibrio lo que controla el cultivo continuo.

    El nombre quimiostato se debe a que el estado estacionario resulta de la accin limtante de un elemento qumico

    QUIMIOSTATOQUIMIOSTATO

    ( )D < max... .. . . . . . dXdT

    = >D X dXdT

    ...... . . 0

    SE INCREMENTA LA BIOMASA: XXeq; SSeq eq

    ESTABLECIMIENTO DEL EQUILIBRIO EN UN CULTIVO CONTINUO TIPO

    QUIMIOSTATO

    El Cultivo es controlado por la concentracin en sustrato. En efecto la estabilidad del sistema se basa en la limitacin de la tasa de

    crecimiento por la concentracin en sustrato limitante (C, N, P, S,

    O2.....).

    Al iniciar el quimiostato los parmetros de cultivo varan hasta alcanzar el estado estacionario (equilibrio).

    El estado estacionario resulta de la accin limitante de un elemento qumico del medio de cultivo (sustrato limitante).

    Consideremos un modelo simple con un slo sustrato limitante (fuente de carbono) el oxgeno se aporta en exceso y la mortalidad celular es despreciable. En estas

    condiciones:

    X = Xeq (concentracin de biomasa en el equilibrio)

    S = Seq (concentracin de sustrato en el equilibrio)

  • 51

    En equilibrio se aplican las siguientes ecuaciones:En equilibrio se aplican las siguientes ecuaciones:

    0DSaDSrdTdS

    0DXXdTdX

    S =+=

    ==

    +

    =+=+=

    +=

    SX/S

    SX/S

    SX/S

    X

    SX/S

    XS

    S

    mY

    DXeq

    XeqmYDXeqXeqm

    Yr

    Seq)D(Sa

    XeqmY

    r=r

    rSeq)D(Sa

    XeqY D

    D m YSa SeqX S

    S X S

    = + /

    /

    ( )

    DmaxDK

    Seq..........SeqK

    SeqmaxD

    D= .....equilibrio el ........en SK

    Smax

    S

    S

    S

    =+=

    +=

    La concentracin de sustrato limitante en el equilibrio, depende nicamente de la tasa de dilucin {Seq = KS (D/max-D)}. Es independiente de la concentracin del sustrato limitante en la alimentacin (Sa). Como KS, es muy pequea, Seq ser muy pequea cuando D

  • 52

    Considerando que Seq es muy pequea (Seq

  • 53

    La tasa de dilucin se puede elegir de tal manera que se igual a a tasa de crecimiento

    mxima : D = max

    .cteXoXquePuesto0X)D(dTdX

    max ====

    En estas condiciones el sustrato no es un factor limitante y la concentracin de clulas en el equilibrio puede elegirse

    arbitrariamente.

    En trminos generales, en el quimiostato la tasa de crecimiento () es controlada por la tasa de dilucin (D) que mantiene la concentracin

    en sustrato limitante constante.

    En el turbidostato, la concentracin en biomasa (X) es con frecuencia controlada a travs de la regulacin de la tasa de dilucin.

    TURBIDOSTATOTURBIDOSTATO

    Se basa en mantener constante la concentracin celular (turbidez).

    Las variaciones en la turbidez indican modificacin de la biomasa y se miden gracias a un dispositivo ptico alimentado por una bomba..

    De esta forma al biomasa requerida se mantiene constante regulando la tasa de dilucin (D).

    El turbidostato contiene en exceso todos los elementos nutritivos y el microorganismo crece con una tasa prxima a max.

    El turbidostato es menos empleado que el quimiostato, debido a la dificultad de medir la turbidez en fermentadores de paredes opacas. Actualmente se

    emplean mtodos indirectos como la produccin de CO2 el consumo de O2que responden a los cambios ocurridos en la poblacin microbiana.

  • 54

    LnX

    T

    X

    Batch

    INICIO DE LAALIMENTACION

    3 TU

    RB

    IDO

    STA

    TOS

    DIF

    EREN

    TES

    =max1

    2

    3

    Como el cultivo est en fase de crecimiento exponencial:

    La tasa de dilucin se elige de tal manera que esta sea igual igual a max

    ( )

    D= =

    0=D-

    xma

    max

    == 0XD

    dTdX

    TASA DE

    DILUCION

    TIPO DE CULTIVO

    CONTINUO

    EVOLUCION DE LOS

    PARAMETROS

    D > max LavadoX--0S--Sa

    D < max Quimiostato

    X ---- XeqS----- Seq

    -- eq = D

    D = max TurbidostatoX = Cte

    = max

    EN RESUMEN LOS DIFERENTES MODELOS DE FERMENTACION CONTINUA SON

  • 55

    Contaminacin e inestabilidad gentica La contaminacin es un serio problema principalmente cuando la fermentacin

    se realiza por largos perodos.

    La contaminacin y aparicin de mutantes depender de la tasa de crecimiento de estos (c) respecto al microorganismo original (o) .Hay tres posibilidades:

    o < c: La poblacin de microorganismo mutante o contaminante aumenta rpidamente y reemplaza progresivamente al microorganismo original. Es un problema del cultivo continuo de pequea tasa de crecimiento.

    o = c: La poblacin de microorganismo mutante o contaminante tiene una tasa de crecimiento igual a la del microorganismo original. Se puede controlar si la velocidad de entrada del contaminante o de mutacin son bajas mutante Es un problema del cultivo continuo de pequea tasa de crecimiento.

    o > c: La poblacin de microorganismo mutante o contaminante es baja. No ocasiona problemas salvo que la velocidad de entrada del mutante o velocidad de mutacin sean altas.

    La contaminacin en el cultivo continuo es un problema difcil de resolver a escala industrial. Sin embargo ciertos medios o condiciones de cultivo (pH cido o alcalino, medio mineral, sustratos especficos,....) limitan considerablemente las infecciones.

    Las mutaciones espontneas son muy difciles de controlar.

    PROBLEMAS ASOCIADOS AL CULTIVO CONTINUOPROBLEMAS ASOCIADOS AL CULTIVO CONTINUO

    PRODUCCIN DE VINAGRE (FERMENTACIN ACTICA) Produccin de cido actico a partir de soluciones de etanol y otros

    nutrientes. La presencia de etanol y el pH bajo durante la produccin limitan el

    riesgo de infecciones.

    TRATAMIENTO BIOLOGICO DE AGUAS RESIDUALES

    APLICACIN DEL CULTIVO CONTINUO

    REACTORREACTORAEROBIOAEROBIO

    DECANTACIONDECANTACION

    RECIRCULACION DE BIOMASARECIRCULACION DE BIOMASA

    AGUA TRATADAAGUA TRATADA

  • 56

    PRODUCCIN DE PROTENA UNICELULAR (SINGLE-CELL PROTEIN)

    Secado

    Centrifugacin

    Reciclaje

    Preparacindel medio

    Esterilizacincontinua

    Fermentacincontinua

    MetanolAguaNaKMg

    Single-cell protein

    EL PROCESO BIOTECNOLOGICOEL PROCESO BIOTECNOLOGICO

    RE

    CU

    PER

    AC

    ION

    , EX

    TR

    AC

    CIO

    NPU

    RIF

    ICA

    CIO

    N

    PRIMERA ETAPA DE MULTIPLICACIONSOBRE MEDIO LIQUIDO

    (15 a 24 h)

    SEGUNDA ETAPA DE MULTIPLICACIONEN FERMENTADOR

    24 a 36 h

    PRODUCCION EN FERMENTADOR PRINCIPAL

    (24 a 150 h)

    CONSERVACION AMPOLLALIOFILIZADA

    (VARIOS MESES)

    REGENERACION SOBRE CALDO NUTRITIVO Y REPIQUE EN AGAR

    INCLINADO (24 h-10 DIAS)

  • 57

    ESQUEMA DE UNA INSTALACION AUTOMATIZADA DE FERMENTACIONESQUEMA DE UNA INSTALACION AUTOMATIZADA DE FERMENTACION

    PREPARACION DEL INOCULO

    BIO-REACTORESTERILIZACION

    PREPARACION DELMEDIO DE CULTIVO

    COMPRESOR

    FILTRO DE ACEITE

    FILTRO ESTERILIZANTE

    GAS

    CONTROLESTPpHCaudal de gasEspumaAgitacin,.....

    MEDIDASCO2O2T cultivoT esterilizacinVelocidad de agitacinPotencia consumidapHViscosidadPotencial redox

    BASES TECNOLOGICAS Y MICROBIOLOGICAS EN LA CONCEPCION DE BASES TECNOLOGICAS Y MICROBIOLOGICAS EN LA CONCEPCION DE BIORREACTORESBIORREACTORES

    FenFenmenos de menos de transferenciatransferencia

    N, P/V; TN, P/V; TMM, K, KTT, , QQaa, , KKLLaa

    CinCinticatica

    rrXX, , rrSS, r, r00

    PP P,XP,X

    SustratoSustratoReactivosReactivos

    AgitaciAgitacinn--aireaciaireacinn

    rrPP

    XX

    MedioMediopH, pH, TT, , CCLL,,,,

  • 58

    BIORREACTORBIORREACTOR

    MANTIENE EN CONTACTO: CELULAS-LIQUIDO (S)-GAS

    TRANSFERENCIA DE MASA:

    SUSTRATOS: MEDIO CELULAS

    PRODUCTOS: CELULAS MEDIO

    REACTIVOS: MEDIO MEDIO

    O2: GAS MEDIO CELULAS

    TRANSFERENCIA DECALOR

    MEDIO INTERCAMBIADOR

    CLULAS MEDIO INTERCAMBIADOR

    ASEPTICOMANTENER LA INTEGRIDAD DE LAS CLULAS

    Addition de Addition de base et/ou acidebase et/ou acide

    Broyeur de mousseBroyeur de mousse

    Sortie dSortie dairair

    PrPrllvementsvements

    Milieu de cultureMilieu de culture

    ArrivArrive de dair filtrair filtr

    MoteurMoteur

    Circuit de Circuit de refroidissement refroidissement et maintien de et maintien de temptempraturerature

    Sonde tempSonde temprature rature Sonde OSonde O2 2 et/ou pHet/ou pH

    SystSystme dme dagitation agitation palettespalettes

    ArrivArrive de le de linoculuminoculum

    schschma gma gnnral dral dune une cuve de fermentationcuve de fermentation

  • 59

    Es esencial en el metabolismo aerobio productor de energa: aceptor final de elctrones y protones producidos por las reacciones de oxidacin.

    Ciertas bacterias (Clostridium), no poseen las enzimas necesarias para el metabolismo aerobio. De otra parte el H2O2 que ciertas ciertas bacterias producen y no pueden eliminar inhibe su crecimiento.

    El oxgeno interviene en mecanismos de regulacin del metabolismo de manera directa, como inductor o represor de las enzimas respiratorias. Pero tambin de manera indirecta por su rol en le metabolismo energtico

    La demanda de oxgeno es representada por Qo2 que se define como la cantidad de oxgeno consumida por unidad de tiempo, volumen y por unidad de biomasa.

    QO2X (mmoles de O2/L h)

    Igualmente la cantidad de Co2 producida durante la fermentacin se representa por:

    QCO2X (mmoles de CO2/L h)

    TRANSFERENCIA DE OXIGENO

    QO2X

    QO2

    CL

    KLaC*

    X

    EVOLUCION DEL CONSUMO DE OXIGENO DURANTE EL EVOLUCION DEL CONSUMO DE OXIGENO DURANTE EL CRECIMIENTO MICROBIANOCRECIMIENTO MICROBIANO

    22O

    2m OK

    O+=La tasa de crecimiento se puede escribir:

    Se puede deducir que si concentracin de O2 es inferior a la concentracin crtica (O2), la tasa de crecimiento es inferior a la tasa de crecimiento mxima y proporcional a la concentracin de oxgeno.

  • 60

    Etapas en la transferencia de oxgenoEtapa 1

    Pelcula gaseosa

    ClulaEtapa 2

    Pelcula lquida

    Etapa 4

    Etapa 5BURBUJABURBUJAGASEOSAGASEOSA

    MODALIDADES DE LA TRANSFERENCIA DE OXIGENOMODALIDADES DE LA TRANSFERENCIA DE OXIGENO

    Las teorias ms importantes para establecer la ecuacin de transferencia de oxgeno son:

    La teora de las pelculas laminaresLa teoria de la difusin continua

    Etapa 3

    Al interior de la burbuja de gas se establece un gradiente de presin parcial de oxgeno debido a la presencia de la pelcula gaseosa

    La prsein parcial de oxgeno en la interfase Pi, esta en equilibrio con la concentracin Ci de oxgeno disuelto

    En el lquido se establece un gradiente de concentracin de oxgeno disuelto debido a la pelcula liquida.

    TEORIA DE LAS PELICULAS LAMINARES

    FASE LIQUIDA

    FASE GASEOSA

    INTERESA GAS-LIQUIDO

    Pelculagaseosa

    Pelculalquida

    P

    Pi CL

    Ci

  • 61

    Para establecer la ecuacin de transferencia se supone que:

    Que el regimen es estacionario (independiente del tiempo) y que equilibrio

    entre Pi y Ci se alcanza instantaneamente cuando el gas y el lquido se

    ponene en contacto.

    La ecuacin de transferencia es: )C*(CaKP*)(PaKdtdC

    LLGL ==

    Donde:

    dCL/dt = Velocidad de transferencia de oxgeno (mmoles de O2/L h)KG = Coeficiente global de trnasferencia de masa respecto a la pelcula gaseosa

    (Cm/h)KL = Coeficiente global de trnasferencia de masa respecto a la pelcula lquida

    (Cm/h)a = Superficie especfica de transferencia (Cm2/Cm3)P* = Presin parcial de oxgeno (atm) en equilibrio con CLC* = Concentracin de oxgeno disuelto (mmoles de O2/L) en equilibrio con la

    presin parcial de oxgeno en la fase gaseosa (P)

    e

    BURBUJADE GAS

    LIQUIDO

    C*

    CL

    La transferencia de oxgeno se da a travs de una pelcula nica de pequeo espesor y en regimenestacionario

    TRANSFERENCIA DE OXIGENO SEGUN LA TEORIA DE DIFUSION CONTINUA

    )C*C( a K d

    dCLL

    t

    L =

    Suponiendo un mecanismo de transferencia unidireccional, la ley de Fick se escribe:

    Donde:

    dCL/dt = Velocidad de transferencia de oxgeno (mmol O2/Lh)

    KL = Coeficiente de transferencia de masa (cm/h)

    a = Superficie especfica de transferencia (Cm2/Cm3)

    CL = Concentracin de O2 disuelto en el lquido (mmolO2/L)

    C* = Concentracin de O2 disuelto, en equilibrio con la burbuja de gas (mmolO2/L)

    En todas las ecuaciones C*, representa la concentracin de oxgeno disuelto correspondiente a la saturacin.

  • 62

    XQo)C*(CaKdt

    dC2LL

    L =

    )C*(CaKdt

    dCLL

    L =

    XQodt

    dC2

    L =

    0dt

    dCL =L

    2L C*C

    XQoaK =

    Durante la ferementacin:

    Donde Qo2X representa la cantidad de O2 consumido por unidad de volumen (mmoles/Lh)

    En ausencia de microorganismos se tiene:

    Si la transferencia de O2 es cero (no hay agitacin aireacin):

    Si no hay variacin en la concentracin de O2 disuelto (CL, cte):

    METODOS PARA DETERMINAR KLa

    La medicin de KLa (h-1), denominado tambin coeficiente volumterico, permite determinar la capacidad de transferencia de oxgeno del reactor

    Los factores sobre los que se puede actuar para influir en la velocidad de transferencia son: KLa y C* -CL

    Reemplazando el air por oxgeno puro se aumenta el potencial de transferencia C* -CL

    Para aumentar KLa es necesario trabajar sobre la agitacin

    Mtodo del sufito Mtodo de la glucosa oxidasa Mtodo microbiolgico Mtodos de determinacin con sensores

    Mtodo esttico Mtodo dinmico

  • 63

    OXIDACION DEL SULFITOOXIDACION DEL SULFITO Se basa en la oxidacion del sulfito a sulfato en presencia de un catalizador. Se aade al medio de fermentacion Na2SO3 (1N) y catalizador (10-3 M Cu2+ o Co2+) y se

    inicia la aireacin en las condicones que se quiere determinar Kla. La reaccin de oxido reduccin es la siguiente es la siguiente:

    SO3 -- + H2O SO4-- + 2 H + + 2 e -

    1/2 O2 + H2O + 2 e - 2 OH -

    La velocidad de la reaccin es limitada por la velocidad de disolucin del oxgeno A diferentes intervalos de tiempo se toma una muestra y se determina el sulfito residual

    por yodometriaSO3 -- + n I2 + H2O SO4-- + 2 I - + 2 H + + (n-1) I2

    El yodo en exceso se determina por :2 S2O3 -- S4O6 --- + 2 e - I2 + 2 e -

    2 I -

    Siempre que se tenga sulfito CL es cero (reaccin rpida)

    sulfito deloxidacion de Velocidad *CaK L =Pendiente de la recta concen. de sultifo vs tiempo

    Es un metodo simple y poco costoso. Es necesario evitar que las muestras tomadas esten expuesta al aire

    Tiene la desventaja de que la solucin de sulfito no reacciona de la misma manera que el cultivo

    XQo)C*(CaKdt

    dC2LL

    L =

    En ausencia microorganismos y en las condiciones en que se desarrollar la fermentacin se determina el KLa.

    Despus de saturar el medio en oxgeno disuelto, se detiene la aireacin y se inyecta N2 en la solucin.

    La concentracin de O2 disuelto tiende a cero

    Despus de retomar la aireacin, la concentracin de O2 disuelto aumenta; este aumento depende de la capacidad de transferencia del equipo.

    METODOS ESTATICOS (EN AUSENCIA DE MICROORGANISMOS) O DE DESGASIFICACION ESTATICA

    t

    CL

    0

    Detener laaireacin einyectar N2

    Retomar laaireacin

  • 64

    XQo)C*(CaKdt

    dC2LL

    L =

    )C*(CaKdt

    dCLL

    L =

    )C*(CaKdt

    dCLL

    L =

    = dtaKC*CdC LLLtaK

    -C*C*CLn L

    L=

    Mtodo 1:

    Considerando que:

    Pero Qo2X=0

    Mtodo 2:

    Integrando la ecuacin:

    Al momento de retomar la aireacin t0 y CL = 0, para un tiempo t el valor CL

    Luego grficamente se obtiene

    De dos maneras se puede determinar KLa

    dtdCL

    = KLa)

    C*-CL

    Ln

    C*/

    (C*-

    CL

    )

    t

    ) = KLa

    XQo-)C*(CaK0dt

    dC2LL

    L ==

    aKXQo*CC

    L

    2L =

    XQo-dt

    dC2

    L =

    *C1CL ++= )XQodtdC(

    aK 2L

    L

    Tiene la gran ventaja de determinar el KLa durante el desarrollo de la fermentacin. Consta de las siguientes etapas:

    En primer lugar se debe llegar alequilibrio entre la transferencia yconsumo de oxgeno (CL=cte).

    Despejando se obtiene:

    En segundo lugar se detiene laaireacin y por tanto KLa = 0; luego

    En tercer lugar se reestablecelas condiciones de aireacin yla ecucin se puede escribir :

    METODO DINAMICO (DESGASIFICACION DINAMICA)

    t

    CL

    0

    CL

    Detener laaireacin

    Retomar laaireacin

    (Qo2X

  • 65

    Para diferentes intervalos de tiempo se determina CL a travs del sensor y los clculos se realizan segn la grfica siguiente:

    CL

    XQodt

    dC2

    L +

    1/KLa (

    El problema tambin se puede resolver matemticamente

    *C1CL ++= )XQodtdC(

    aK 2L

    L

    Es un mtodo interesante ya que permite la determinacin del KLa en linea y su siguimiento durante la fermentacin. Se basa en la ecuacin global de transferencia de oxgeno.

    Puesto que en el equilibrio CL es constante, se tiene:

    A travs del balance gaseoso, se determina el consumo de oxgeno:

    XQo-)C*(CaKdt

    dC2LL

    L =

    L

    2L C*C

    XQoaK =

    =

    1

    111

    0

    0005

    2 TYQP

    TYQP

    V10.31,7XQo

    METODO DEL BALANCE GASEOSO

    VCL

    Q1 (L/min)P1 (atm)T1 (K)F1 (molO2)

    Qo (L/min)Po (atm)To (K)Fo (molO2)

    Midiendo a travs de sensores CL y conociendo C*, se puede determinar KLa

  • 66

    Cuando se emplea grandes fermentadores, es necesario

    tener en cuenta ciertas precauciones. En efecto el aire que

    es introducido en la base del


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